JPWO2013042581A1

JPWO2013042581A1 - 新規シアロ糖鎖の製造方法

Info

Publication number: JPWO2013042581A1
Application number: JP2013534668A
Authority: JP
Inventors: 真範山口
Original assignee: WAKAYAMA UNIVERSITY
Current assignee: WAKAYAMA UNIVERSITY
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2015-07-30
Anticipated expiration: 2032-09-11
Also published as: JP6095571B2; WO2013042581A1; EP2759548A4; EP2759548A1; EP3009441B1; US9290532B2; EP3009441A1; US20160160163A1; US10975346B2; EP2759548B1; US20140235839A1

Abstract

新規シアロ糖鎖、該シアロ糖鎖の製造方法、及び該シアロ糖鎖の製造装置を提供する。アルキニル基で水酸基を置換した糖（以下、アルキニル基導入糖と示すこともある）と、特定のシアル酸供与体とを、シアル酸導入酵素の存在下で反応させることにより、簡便且つ効率的に、新規シアロ糖鎖を大量に製造することができる

Description

本発明は、新規シアロ糖鎖、その製造方法、及びその製造装置に関する。

シアロ糖鎖は、シアル酸をその非還元末端にもつ糖鎖の総称であり、糖脂質、ガングリオシドや様々な糖タンパク質糖鎖の重要な構成成分である。シアロ糖鎖の機能は多岐にわたり、細胞間認識、分化、及び増殖などの生命活動において必須の現象を司ると共に、ガン化、ウィルスの感染などにも関係している。例えば、ガン関連糖鎖抗原において、シアロ糖鎖が多く存在することが解明されており、またインフルエンザウィルスが宿主細胞表面に発現されているシアリルガラクトース部分（シアル酸とガラクトースが結合した２糖）を足場として感染することが解明されている。

このように、シアロ糖鎖は多様な現象に関わっているが故に、その応用範囲も非常に多分野に及び得る。そこで、多分野において利用できる構造を有するシアロ糖鎖の開発が求められている。

また、通常、シアロ糖鎖の製造・精製方法は複雑であるため、シアロ糖鎖の製造・精製においては、極めて高度な技術、高価な機器及び試薬、並びに有害な試薬を必要とする。そこで、簡便且つ効率的に、シアロ糖鎖を大量に製造する方法の開発が求められている。

シアロ糖鎖の製造例としては、ラクトースとシアル酸を、Arthrobacter ureafaciens由来のノイラミニダーゼの存在下で反応させて製造した例が知られている（非特許文献１）。しかしながら、この製造例は、簡便且つ効率的にシアロ糖鎖を製造するには不十分な点がある。具体例としては、シアロ糖鎖中のシアル酸が結合する、ラクトース中の非還元末端が異なる、複数のシアロ糖鎖が製造される点である。また、この製造例によって製造されたシアロ糖鎖は、単にシアル酸とラクトースを連結したものであり、多分野に応用することが困難である。

Biosci. Biotech. Biochem., 56(10), 1557-1561, 1992

本発明は、新規シアロ糖鎖、該シアロ糖鎖の製造方法、及び該シアロ糖鎖の製造装置を提供することを課題とする。

本発明者等は、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、アルキニル基で水酸基を置換した糖（以下、「アルキニル基導入糖」と示すこともある）と、特定のシアル酸供与体とを、シアル酸導入酵素の存在下で反応させることにより、簡便且つ効率的に、シアロ糖鎖を大量に製造することができることを見出した。

さらに、上記製造方法によって製造されたシアロ糖（以下、アルキニル基導入シアロ糖鎖と示すこともある）は、多分野において非常に容易に利用できることを見出した。

また更に、シアル酸導入酵素を固定化した担体を含むカラムを使用することによって、アルキニル基導入シアロ糖鎖をより容易に製造できることを見出した。

即ち、本発明は、下記の構成を包含するものである。

項１．一般式（５）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物。

項２．一般式（５）において、Ｘがラクトースの還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基である項１に記載の化合物。

項３．一般式（７ａ）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒ^１は有機基を示す］
、又は一般式（７ｂ）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒ^１は有機基を示す］
で表される化合物。

項４．一般式（５）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物の製造方法であって、
シアル酸供与体と、
一般式（３）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物とを、
シアル酸導入酵素の存在下で反応させることを特徴とする製造方法。

項５．一般式（５）；

［式中、Ｘ、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びｎは前記に同じ］
で表される化合物の項４に記載の製造方法であって、
（工程１）一般式（１）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示す］
で表される化合物と、
一般式（２）；

［式中、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物とを、
グリコシダーゼの存在下で反応させ、一般式（３）；

［式中、Ｘ及びｎは前記に同じ］
で表される化合物を得る工程、及び
（工程２）シアル酸供与体と、
一般式（３）；

［式中、Ｘ及びｎは前記に同じ］
で表される化合物とを、
シアル酸導入酵素の存在下で反応させる工程を含むことを特徴とする製造方法。

項６．前記シアル酸導入酵素が担体に固定化されたシアル酸導入酵素である項４又は５に記載の製造方法。

項７．前記シアル酸導入酵素がシアリダーゼであり、
前記シアル酸供与体が、一般式（４）；

［式中、Ｒ^２は同一又は異なって置換基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｍは１〜３の整数である。］
で表される化合物及びコロミン酸からなる群から選択される少なくとも１種である
項４〜６のいずれかに記載の製造方法。

項８．前記シアリダーゼがVibrio属に属する生物に由来する項７に記載の製造方法。

項９．前記シアル酸導入酵素がシアリルトランスフェラーゼであり、
前記シアル酸供与体が一般式（８）；

［式中、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示す。］
で表される化合物である
項４〜６のいずれかに記載の製造方法。

項１０．供給口及び排出口を有する、担体に固定化されたグリコシダーゼを含むカラム（以下、カラムＡと示す）を備えることを特徴とする装置。

項１１．（Ａ）カラムＡ、及び
（Ｂ）供給口及び排出口を有する逆相カラム（以下、カラムＢと示す）を備え、
カラムＡの排出口とカラムＢの供給口が流路ｂで連結され、
流路ｂは流路切替え装置ｂ’を備えることを特徴とする項１０に記載の装置。

項１２．一般式（３）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物の製造装置である項１０又は１１に記載の装置。

項１３．供給口及び排出口を有する、担体に固定化されたシアル酸導入酵素を含むカラムを備えることを特徴とする装置。

項１４．前記シアル酸導入酵素がシアリダーゼである項１３に記載の装置。

項１５．前記シアル酸導入酵素がシアリルトランスフェラーゼである項１３に記載の装置。

項１６．（Ｃ）供給口及び排出口を有する、担体に固定化されたシアル酸導入酵素を含むカラム（以下、カラムＣと示す）、
（Ｄ）供給口及び排出口を有する逆相カラム（以下、カラムＤと示す）、及び
（Ｅ）供給口及び排出口を有するイオン交換カラム（以下、カラムＥと示す）を備え、
カラムＣの排出口とカラムＤの供給口が流路ｄで連結され、
カラムＤの排出口とカラムＥの供給口が流路ｅで連結され、
流路ｄは流路切替え装置ｄ’を備え、
流路ｅは流路切替え装置ｅ’を備えることを特徴とする項１３に記載の装置。

項１７．前記シアル酸導入酵素がシアリダーゼである項１６に記載の装置。

項１８．前記シアル酸導入酵素がシアリルトランスフェラーゼである項１６に記載の装置。

項１９．項１０に記載の装置（以下、装置１と示す）、及び項１３〜１５のいずれかに記載の装置（以下、装置２と示す）を備え、
装置１の排出口と装置２の供給口が流路ｃで連結されていることを特徴とする装置。

項２０．項１１に記載の装置（以下、装置１ａと示す）、及び項１６〜１８のいずれかに記載の装置（以下、装置２ａと示す）を備え、
装置１ａの排出口と装置２ａの供給口が流路ｃで連結され、
流路ｃは流路切替え装置ｃ’を備えることを特徴とする装置。

項２１．一般式（５）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物の製造装置である項１３〜２０のいずれかに記載の装置。

項２２．項１０に記載の装置（以下、装置１と示す）を用いた、一般式（３）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物の製造方法であって、
（工程ａ）一般式（１）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示す］
で表される化合物、及び
一般式（２）；

［式中、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物を
カラムＡの供給口からカラムＡに導入してカラムＡ内で反応させる工程
を含むことを特徴とする製造方法。

項２３．項１１に記載の装置（装置１ａ）を用いた、一般式（３）；

［式中、Ｘ及びｎは前記に同じ］
で表される化合物の項２２に記載の製造方法であって、
（工程ａ）一般式（１）；

［式中、Ｘは前記に同じ］
で表される化合物、及び
一般式（２）；

［式中、ｎ前記に同じ］
で表される化合物を
カラムＡの供給口からカラムＡ内に導入してカラムＡ内で反応させる工程、
（工程ｂ）カラムＡ中の反応物を、カラムＢの供給口に導入する工程、並びに
（工程ｃ）カラムＢから一般式（３）で表される化合物を精製する工程
を含むことを特徴とする製造方法。

項２４．項１３に記載の装置（以下、装置２と示す）を用いた、一般式（５）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物の製造方法であって、
（工程ｄ）シアル酸供与体、及び
一般式（３）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物を、
カラムＣの供給口からカラムＣ内に導入してカラムＣ内で反応させる工程
を含むことを特徴とする製造方法。

項２５．項１４に記載の装置を用いた、一般式（５）で表される化合物の項２４に記載の製造方法であって、前記シアル酸供与体が一般式（４）；

［式中、Ｒ^２は同一又は異なって置換基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｍは１〜３の整数である。］
で表される化合物及びコロミン酸からなる群から選択される少なくとも１種である製造方法。

項２６．項１５に記載の装置を用いた、一般式（５）で表される化合物の項２４に記載の製造方法であって、前記シアル酸供与体が一般式（８）；

［式中、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示す。］
で表される化合物である製造方法。

項２７．項１６に記載の装置（以下、装置２ａと示す）を用いた、一般式（５）；

［式中、Ｘ、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びｎは前記に同じ］
で表される化合物の項２４に記載の製造方法であって、
（工程ｄ）シアル酸供与体、及び
一般式（３）；

［式中、Ｘ及びｎは前記に同じ］
で表される化合物を、
装置２中のカラムＣの供給口に導入して反応させる工程、
（工程ｅ）カラムＣ中の反応物を、カラムＤの供給口に導入する工程、
（工程ｆ）カラムＤ中の内容物を、カラムＥの供給口に導入する工程
（工程ｇ）カラムＥから一般式（５）で表される化合物を精製する工程
を含むことを特徴とする製造方法。

項２８．項１７に記載の装置を用いた、一般式（５）で表される化合物の項２７に記載の製造方法であって、前記シアル酸供与体が一般式（４）；

項２９．項１８に記載の装置を用いた、一般式（５）で表される化合物の項２７に記載の製造方法であって、前記シアル酸供与体が一般式（８）；

本発明によれば、新規シアロ糖鎖、該シアロ糖鎖の製造方法、及び該シアロ糖鎖の製造装置を提供することができる。

本発明の新規シアロ糖鎖は、一般式（５）で表されるように、糖がアルキニル基で置換されている。従って、このアルキニル基を介して、多分野、例えば生化学分野や医療分野等において利用し得る様々な素材又はプローブなどに連結することができる。

また、本発明の製造方法は、一般式（３）で表される、アルキニル基で水酸基が置換された糖と、特定のシアル酸供与体とを、シアル酸導入酵素の存在下で反応させることにより、保護及び脱保護等の複雑な工程を要さず、且つ高価な試薬類や危険な試薬類を使用することなく、簡便且つ効率的に、シアロ糖鎖を大量に製造することができる。

更に、担体に固定化されたシアル酸導入酵素を含むカラムを使用することにより、より容易に、且つ低コストで、シアロ糖鎖を製造することができる。

装置１ａの該略図を示す。装置２ａの該略図を示す。装置３ａの該略図を示す。実施例７で製造した装置（装置１ａに相当）の該略図を示す。実施例８で製造した装置（装置２ａに相当）の該略図を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。

１．シアロ糖鎖、及び有機基を連結したシアロ糖鎖
本発明の化合物は、一般式（５）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物である。

Ｘは、単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示す。

Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示す。Ｒ^９として具体的には、水素、アセチル基、グリコリル基、レブリノイル基、クロロアセチル基、ブロモアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、又はトロック基等を挙げることができる。これらの中でもアセチル基、又はグリコリル基が好ましく挙げられ、アセチル基がより好ましく挙げられる。

Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示す。Ｒ^１０として具体的には、水素、硫酸基、又はリン酸基等を挙げることができる。これらの中でも水素、又は硫酸基が好ましく挙げられ、水素がより好ましく挙げられる。

ｎは１〜１０の整数である。好ましくは１〜５であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１又は２であり、特に好ましくは１である。

単糖としては、特に限定されず、公知の単糖を採用することができる。例えば、七炭糖、六炭糖、五炭糖、四炭糖、又は三炭糖等が挙げられ、これらの中でも六炭糖が好ましく挙げられる。六炭糖としては、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フルクトース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、イドース、プシコース、ソルボース、又はタガトースが挙げられ、これらの中でも、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンが好ましく挙げられ、ガラクトース又はグルコースがさらに好ましく挙げられる。これらはＤ体又はＬ体のいずれでもよい。また、これらは一部の水酸基が還元されて水素原子に置換されていてもよいし、一部の水酸基が公知の保護基で保護されていても、硫酸基等の官能基で置換されていてもよい。

オリゴ糖は、２分子以上の単糖がグリコシド結合により１分子に連結された糖である。オリゴ糖を構成する単糖の分子数としては、例えば２〜２０が挙げられ、好ましくは２〜１０が挙げられ、より好ましくは２〜５が挙げられ、更に好ましくは２〜３が挙げられる。オリゴ糖を構成する単糖の種類としては、特に限定されず、上記に示した単糖を採用することができる。またオリゴ糖を構成する単糖の組み合わせも特に限定されない。オリゴ糖の具体例としては、構成する単糖の分子数が２であるオリゴ糖（例えばラクトース、Galβ(1→3)GalNAc、Galβ(1→4)GlcNAc、Galβ(1→6)GlcNAc、スクロース、マルトース、トレハロース、ツラノース、又はセロビオース等）、構成する単糖の分子数が３であるオリゴ糖（例えばラフィノース、メレジトース、又はマルトトリオース等）、構成する単糖の分子数が４であるオリゴ糖（例えばアカルボース、又はスタキオース）、構成する単糖の分子数が５以上であるオリゴ糖が挙げられ、これらの中でも構成する単糖の分子数が２であるオリゴ糖が好ましく挙げられ、ラクトース、Galβ(1→3)GalNAc、Galβ(1→4)GlcNAc、又はGalβ(1→6)GlcNAcがより好ましく挙げられ、ラクトースが更に好ましく挙げられる。

糖残基とは、上記に示した単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる、２価の基である。

※１で示される炭素原子は、Ｘの非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる酸素原子と結合している炭素原子であり、※２で示される酸素原子は、Ｘのアノマー性炭素原子と結合している酸素原子である。

※１で示される炭素原子と結合している、Ｘの水素が除かれた非還元末端としては、たとえば６位又は３位が挙げられ、６位が好ましく挙げられる。

このような糖残基の具体例としては、
一般式（８ａ）；

［式中、Ｒ^５は水酸基、又はアセチルアミノ基を示す。］
で表される糖残基、
一般式（８ｂ）；

［式中、Ｒ^６は水酸基、又はアセチルアミノ基を示す。］
で表される糖残基、
一般式（８ｃ）；

［式中、Ｒ^７は水酸基、又はアセチルアミノ基を示す。］
で表される糖残基、又は
一般式（８ｄ）；

［式中、Ｒ^８は水酸基、又はアセチルアミノ基を示す。］
で表される糖残基、
などを挙げることができる。

一般式（８ａ）及び（８ｂ）において、（３）及び（６）は、異なって水素又は一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示す。好ましくは（３）が水素を示し、（６）が一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示す。

一般式（８ｃ）において、（３）、（６）、及び（６’）の内の１つは一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示し、他の２つは水素原子を示す。例えば、（３）が一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示す場合、（６）及び（６’）は水素原子を示す。好ましくは（３）及び（６’）が水素を示し、（６）が一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示す。

一般式（８ｄ）において、（３）、（６）、及び（６’）の内の１つは一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示し、他の２つは水素原子を示す。例えば、（３）が一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示す場合、（６）及び（６’）は水素原子を示す。好ましくは（３）及び（６’）が水素を示し、（６）が一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示す。

一般式（８ａ）、（８ｂ）、（８ｃ）、及び（８ｄ）において、（※２）は、一般式（５）における※２で示される炭素原子との結合部位を示す。

一般式（５）中、Ｘ、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びｎの組み合わせとしては、
例えば、Ｘがラクトース、Galβ(1→3)GalNAc、Galβ(1→4)GlcNAc、Galβ(1→6)GlcNAc、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、又はＮ−アセチルガラクトサミンであり、Ｒ^９がアセチル基、又はグリコリル基であり、Ｒ^１０が同一又は異なって水素、又は硫酸基であり、ｎが１〜３であるという組み合わせが挙げられ、
好ましくは、Ｘがラクトース、ガラクトース、又はグルコースであり、Ｒ^９がアセチル基、であり、Ｒ^１０が水素であり、ｎが１であるという組み合わせが挙げられる。

また、一般式（５）中、Ｘ、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びｎの別の組み合わせとしては、
例えば、Ｘが一般式（８ａ）で表される糖残基、一般式（８ｂ）で表される糖残基、一般式（８ｃ）で表される糖残基、又は一般式（８ｄ）で表される糖残基であり、一般式（８ａ）及び一般式（８ｂ）において（３）が水素を示し、且つ（６）が一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示し、一般式（８ｃ）及び一般式（８ｄ）において（３）及び（６’）が水素を示し、且つ（６）が一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示し、Ｒ^９がアセチル基、又はグリコリル基であり、Ｒ^１０が同一又は異なって水素、又は硫酸基（好ましくは全て水素）であり、ｎが１〜３であるという組み合わせが挙げられる。

さらに、本発明の化合物、すなわち一般式（５）で表される化合物の、他の好ましい態様として、一般式（５’）；

［式中、Ｘ’は単結合、又はＸから単糖を除いて得られる基を示し、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びｎは前記に同じである］
で表される化合物が挙げられる。

Ｘ’は、単結合、又はＸから単糖を除いて得られる基を示す。

※３で示される炭素原子は、Ｘの非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる酸素原子と結合している炭素原子である。

一般式（５’）で表される化合物は、シアル酸の２番目の炭素（一般式（５’）中、「２」で示される炭素）と、ガラクトースの６番目の炭素（一般式（５’）中、「６」で示される炭素）とが、グリコシド結合によって連結している構造、すなわちNeu5Acα（2→6）Galという構造を有している。ここで、ヒトインフルエンザウィルスは、ヒトの細胞膜の外側に存在している、Neu5Acα（2→6）Gal構造を有するシアロ糖鎖と特異的に結合することが知られている。従って、Neu5Acα（2→6）Gal構造を有する一般式（５’）で表される化合物は、ヒトインフルエンザウィルスと特異的に結合するという性質を有する点で優れている。

上記した一般式（５）で表される化合物はアルキニル基を有している。アルキニル基は、アジド基と１，３‐双極子付加環化反応することにより、テトラゾール環を形成することが知られている。そして、この性質を利用して、アルキニル基を有する一般式（５）で表される化合物と、アジド基を有する化合物とを、テトラゾール環を介して容易に連結させることができる。このように、一般式（５）で表される化合物は、アジド基を有する化合物であればどのような化合物とも連結させることができる。

一般式（５’）中、Ｘ’、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びｎの組み合わせとしては、
例えば、Ｘ’がグルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、又はＮ−アセチルガラクトサミンであり、Ｒ^９がアセチル基、又はグリコリル基であり、Ｒ^１０が同一又は異なって水素、又は硫酸基であり、ｎが１〜３であるという組み合わせが挙げられ、
好ましくは、Ｘがグルコースであり、Ｒ^９がアセチル基、であり、Ｒ^１０が水素であり、ｎが１であるという組み合わせが挙げられる。

また、一般式（５’）中、Ｘ’、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びｎの別の組み合わせとしては、
例えば、Ｘ’が一般式（８ａ）で表される糖残基、又は一般式（８ｂ）で表される糖残基であり、一般式（８ａ）及び一般式（８ｂ）において（３）が水素を示し、且つ（６）が一般式（５）における※１で示される炭素原子との結合部位を示し、Ｒ^９がアセチル基、又はグリコリル基であり、Ｒ^１０が水素、又は硫酸基（好ましくは全て水素）であり、ｎが１〜３であるという組み合わせが挙げられる
有機基と連結した一般式（５）で表される化合物としては、例えば一般式（７ａ）；

［式中、Ｒ^１は有機基を示し、Ｘ、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びｎは前記に同じである］
、又は一般式（７ｂ）；

［式中、Ｒ^１は有機基を示し、Ｘ、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びｎは前記に同じである］
で表される化合物が挙げられる。

※４で示される酸素原子は、Ｘのアノマー性炭素原子と結合している酸素原子である。

Ｒ^１で示される有機基は、有機化合物から１つの水素が除かれた基であれば特に限定されない。有機化合物としては、アジド基を有するものであれば特に限定されず、例えば、置換基を有していてもよい炭化水素、合成高分子、天然高分子等が挙げられる。

置換基を有していてもよい炭化水素としては、直鎖又は分枝鎖のいずれでも挙げることができ、例えば炭素数１〜４０、好ましくは炭素数５〜３０、より好ましくは炭素数８〜２５、さらに好ましくは炭素数１０〜２０の置換基を有していてもよい炭化水素が挙げられる。炭化水素としては、例えば、飽和炭化水素、不飽和炭化水素、鎖式炭化水素、環式炭化水素、芳香族炭化水素、複素芳香族炭化水素等が挙げられる。置換基としては、例えば、アルキル基、ビニル基、アリル基、アリール基、フェニル基、ナフチル基、アラアルキル基、ベンジル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、メトキシ基、又はエトキシ基等が挙げられる。

合成高分子としては、ポリエチレングリコール、ポリ塩化ビニル、フェノール樹脂、シリコンゴム、シリコンオイル、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、又はポリエチレンテレフタラートビスコース繊維、銅アンモニア繊維、アセテート繊維、プロミックス繊維、ナイロン繊維、ビニロン繊維、ポリ塩化ビニリデン系合成繊維、ポリ塩化ビニル系合成繊維、ポリエステル系合成繊維、ポリアクリロニトリル系合成繊維、ポリエチレン系合成繊維、ポリプロピレン系合成繊維、ポリウレタン系合成繊維、ポリクラール系合成繊維、炭素繊維等が挙げられる。

天然高分子としては、タンパク質、核酸、脂質、糖類、木綿、麻、リンネル、絹、毛等が挙げられる。なお、タンパク質及び核酸には、公知の遺伝子工学的手法により人工的に合成されたものも含まれる。例えば、宿主細胞に外来性DNAを導入し、該DNAから宿主細胞内で発現させたタンパク質等が挙げられる。

Ｒ^１で示される有機基の具体例としては、例えば一般式（９）；

［式中、ｑは１〜４０の整数である］
で表される基が挙げられる。一般式（９）で表される基は、直鎖又は分枝鎖でもよい。

ｑは、好ましくは５〜３０、より好ましくは８〜２５であり、更に好ましくは１０〜２０である。

一般式（９）の好ましい態様としては、例えば一般式（９ａ）；

［式中、ｒは１〜３９の整数である］
で表される基が挙げられる。

ｒは、好ましくは４〜２９、より好ましくは７〜２４であり、更に好ましくは９〜１９である。

Ｒ^１で示される有機基の別の具体例としては、例えば一般式（１０）；

［式中、Ｗは式（１１ａ）；

（式中、Ｒ^４は置換基を示し、ｕは１〜３の整数である）
で表される基、式（１１ｂ）；

（式中、Ｒ^４及びｕは前記に同じ）
で表される基、又は式（１１ｃ）；

（式中、ｖは１〜８の整数である）
で表される基であり、ｓは１〜４の整数であり、ｔは１〜３０の整数であり、Ｒ^３は置換基である。］
で表される基が挙げられる。

Ｒ^３は置換基であり、例えばメチル基、アセチル基、エチル基、アリル基、フェニル基、ベンゾイル基、ベンジル基、アシル系保護基、エーテル系保護基、メタクリル基が挙げられる。

Ｒ^４は置換基であり、例えばメチル基若しくはエチル基などのアルキル基、ヒドロキシ基、メトキシル基、又はエトキシル基が挙げられる。

ｓは１〜４の整数であり、好ましくは２〜３の整数である。

ｔは１〜３０の整数であり、好ましくは４〜２０、より好ましくは８〜１６である。

ｕは１〜３の整数である。

ｖは１〜８の整数であり、好ましくは１〜３である。

上記した一般式（７ａ）又は（７ｂ）で表される化合物は、有機基の種類に従って、非常に多分野において利用することが出来る。例えば、生化学分野、又は医療分野等、より具体的には糖鎖ワクチン、モノクローナル抗体の作成、ドラッグデリバリーシステム、ＴＬＣ／ｖｉｒｕｓｂｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙ、分子間相互作用解析、空気洗浄機フィルター、又はマスク等に利用することができる。

有機基が、ナイロン、_ビスコース繊維、銅アンモニア繊維、アセテート繊維、プロミックス繊維、ナイロン繊維、ビニロン繊維、ポリ塩化ビニリデン系合成繊維、ポリ塩化ビニル系合成繊維、ポリエステル系合成繊維、ポリアクリロニトリル系合成繊維、ポリエチレン系合成繊維、ポリプロピレン系合成繊維、ポリウレタン系合成繊維、ポリクラール系合成繊維、炭素繊維、木綿、麻、リンネル、絹、若しくは毛から１つの水素が除かれた基、又は一般式（１０）で表される基のように、繊維状の素材の材料となる基である場合は、例えばシアロ糖鎖に結合する性質を有する物質（例えば、インフルエンザウィルスなどのウィルス）を除去することを目的とした、空気洗浄フィルター又はマスク等に利用することができる。また、有機基が適当な有機化合物から一つの水素が除かれた基である場合にも、シアロ糖鎖を連結した有機基を繊維に付着させ（具体的には例えばシアロ糖鎖を連結した有機基を含む水溶液を、繊維に吹き付け、その後乾燥する）ことにより、シアロ等差が付着した空気洗浄フィルターやマスク等）を製造することができる。

有機基が、一般式（９）で表される化合物のように、炭化水素基である場合は、例えば炭化水素基付加によるシアロ糖鎖の免疫原性向上を利用して、糖鎖ワクチン、モノクローナル抗体の作成等に利用することができる。

一般式（７ａ）及び（７ｂ）中、Ｘ、Ｒ^９、Ｒ^１０、ｎ、及びＲ^１の組み合わせとしては、
例えば、Ｘがラクトース、Galβ(1→3)GalNAc、Galβ(1→4)GlcNAc、Galβ(1→6)GlcNAc、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、又はＮ−アセチルガラクトサミンであり、Ｒ^９がアセチル基、又はグリコリル基であり、Ｒ^１０が同一又は異なって水素、又は硫酸基であり、ｎが１〜３であり、Ｒ^１が炭化水素、合成高分子、又は天然高分子１つの水素が除かれた基であるという組み合わせが挙げられ、
好ましくは、Ｘがラクトース、ガラクトース、又はグルコースであり、Ｒ^９がアセチル基、であり、Ｒ^１０が水素であり、ｎが１であり、Ｒ^１がナイロン、_ビスコース繊維、銅アンモニア繊維、アセテート繊維、プロミックス繊維、ナイロン繊維、ビニロン繊維、ポリ塩化ビニリデン系合成繊維、ポリ塩化ビニル系合成繊維、ポリエステル系合成繊維、ポリアクリロニトリル系合成繊維、ポリエチレン系合成繊維、ポリプロピレン系合成繊維、ポリウレタン系合成繊維、ポリクラール系合成繊維、炭素繊維、木綿、麻、リンネル、絹、若しくは毛から１つの水素が除かれた基であるという組み合わせが挙げられる。

２．シアロ糖鎖、及び有機基を連結したシアロ糖鎖の製造方法
本発明のシアロ糖鎖、及び有機基を連結したシアロ糖鎖は、例えば下記反応式に示される、工程１、工程２、及び工程３によって製造することができる。

［式中、Ｘ、ｎ、Ｒ^１、Ｒ^９、及びＲ^１０は前記に同じである］
以下に、工程１〜３について説明する。

２‐１．工程１（（１）＋（２）→（３））
工程１は、一般式（３）で表される化合物の製造方法であって、一般式（１）で表される化合物と、一般式（２）で表される化合物とを、グリコシダーゼの存在下で反応させる工程である。

※５で示される水素原子は、Ｘの非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる酸素原子と結合している水素原子であり、※６で示される酸素原子は、Ｘのアノマー性炭素原子と結合している酸素原子である。

グリコシダーゼとして使用し得るものとしては、特に限定されず、エキソ型またはエンド型を問わず公知のグリコシダーゼが挙げられ、好ましくはエキソ型のグリコシダーゼが挙げられる。例えば、セルラーゼ、グルコシダーゼ、ラクターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、キシラナーゼ、マルターゼ、インベルターゼ、又はヒアルロニダーゼ等が挙げられる。

グリコシダーゼは、一般式（１）で表される化合物において、※６で示される酸素原子が結合するアノマー性炭素原子を有する糖残基の種類によって選択される。なお、Ｘが単糖残基である場合は、Ｘを認識する酵素を選択する。具体例としては、一般式（１）で表される化合物において、末端がグルコース残基である場合は、※６で示される酸素原子が結合するアノマー性炭素原子を有する糖残基はグルコース残基であるから、グルコース残基を認識するグリコシダーゼ、例えばセルラーゼ、又はグルコシダーゼ等、好ましくはセルラーゼを選択する。また、別の具体例としては、還元末端側の糖残基がガラクトース残基の場合はガラクトシダーゼを選択し、マンノース残基の場合はマンノシダーゼを選択し、キシロース残基の場合はキシラナーゼを選択し、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の場合はＮ−アセチルグルコサミニダーゼを選択し、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の場合はＮ−アセチルガラクトサミニダーゼを選択し、Ｎ−アセチルラクトサミン残基の場合はセルラーゼを選択する。

Ｘがオリゴ糖の場合、グリコシダーゼを作用させることにより糖鎖の途中で切断が起こらないように、還元末端側以外の糖は、該糖を含まないことが好ましい。

グリコシダーゼは、担体に固定化されたグリコシダーゼであることが好ましい。グリコシダーゼを担体に固定化する方法は、公知の方法を採用することができる。担体は、グリコシダーゼを固定化できる限りにおいて特に限定されず、例えばグリコシダーゼに含まれるアミノ基とアミド結合できるカルボキシル基を有する担体が挙げられる。具体例としては、カルボキシル基をＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でエステル化したセファロース（担体）の活性化エステル基と、グリコシダーゼのアミノ基とをアミド結合させることにより、担体にグリコシダーゼを固定化することができる。また、他の具体例としては、担体を臭化シアンで活性化して、グリコシダーゼのアミノ基とアミド結合させる固定化方法等が挙げられる。

反応は、適当な溶媒中で行う。溶媒としては、一般式（１）で表される化合物及び一般式（２）で表される化合物を溶解させることができ、且つグリコシダーゼが失活しない溶媒であれば特に限定されない。このような溶媒としては、例えば、水、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、及び／又はリン酸緩衝生理食塩水などが挙げられ、好ましくは酢酸緩衝液が挙げられる。

反応温度は、グリコシダーゼが失活しない温度であれば特に限定されず、グリコシダーゼの反応至適温度に従って適宜選択される。例えば、５℃〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃、より好ましくは３４〜４０℃が挙げられる。

反応時間は、グリコシダーゼ活性が十分に発揮できる限り特に限定されない。例えば、１〜１００時間、好ましくは５０〜８０時間、より好ましくは６５〜７５時間が挙げられる。

反応ｐＨは、グリコシダーゼの活性が十分に発揮される限り特に限定されない。例えば、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ４〜６、より好ましくはｐＨ４．５〜５．５が挙げられる。

反応における、一般式（１）で表される化合物と一般式（２）で表される化合物のモル比は、グリコシダーゼによる反応が起こる限り特に限定されないが、例えば、一般式（１）で表される化合物１モル対して、一般式（２）で表される化合物０.１〜１００、好ましくは１〜５０、より好ましくは３〜３０、さらに好ましくは５〜１５モルが挙げられる。

上記反応は、担体に固定化されたグリコシダーゼの存在下で行うことが好ましい。この場合は、一般式（１）で表される化合物及び一般式（２）で表される化合物が、担体に固定化されたグリコシダーゼと接触できる状態にし、カラムを適当な温度条件下に置くことによって反応を行えばよい。

担体に固定化されているグリコシダーゼの量としては、担体１mLに対して0.1-10 mg好ましくは、0.5-3 mgが挙げられる。

上記反応後、反応によって得られた、一般式（３）で表される化合物を含む溶液を、さらに精製工程に供してもよい。精製手段は、公知の方法（分液、蒸留、クロマトグラフィー、再結晶等）を採用できる。

上記工程１により、簡便且つ効率的に、一般式（３）で表される化合物を大量に製造することができる。

このようにして得られた一般式（３）で表される化合物は、下記工程２において使用することができる。

２‐２．工程２（（３）＋シアル酸供与体→（５））
工程２は、一般式（５）で表される化合物の製造方法であって、一般式（３）で表される化合物と、シアル酸供与体とを、シアル酸導入酵素の存在下で反応させる工程である。

シアル酸導入酵素は糖にシアル酸を導入することができる酵素、換言すると糖とシアル酸との結合を促進する酵素である。より具体的には、糖の非還元末端にシアル酸を結合させることができる酵素である。シアル酸導入酵素としてはシアリダーゼ又はシアリルトランスフェラーゼが挙げられ、好ましくはシアリダーゼが挙げられる。

シアリダーゼとしては特に限定されず、エキソ型またはエンド型を問わず公知のシアリダーゼが挙げられ、好ましくはエキソ型のシアリダーゼが挙げられる。また、シアリダーゼとしては、種々の生物由来のシアリダーゼを使用することができる。例えば、Vibrio属に属する生物、Arthrobacter属に属する生物、又はClostridiumに属する生物由来のシアリダーゼが挙げられ、好ましくはVibrio属に属する生物由来のシアリダーゼが挙げられ、より好ましくはVibrio cholerae由来のシアリダーゼが挙げられる。

シアリルトランスフェラーゼとしては特に限定されず、公知のシアリルトランスフェラーゼを用いることができる。好ましくはα（２−６）シアリルトランスフェラーゼ、又はα（２−３）シアリルトランスフェラーゼが挙げられる。また、シアリルトランスフェラーゼとしては、種々の生物由来、例えば牛由来、鶏由来、豚由来、マウス由来等のシアリルトランスフェラーゼを用いることができる。

シアル酸導入酵素は、担体に固定化されたシアル酸導入酵素であることが好ましい。シアル酸導入酵素を担体に固定化する方法は、上記したグリコシダーゼを担体に固定化する場合と同様である。

シアル酸供与体は、シアル酸骨格を有する化合物であり、例えば一般式（４）：

［式中、Ｒ^２は同一又は異なって置換基を示し、ｍは１〜３の整数であり、Ｒ^９及びＲ^１０は前記に同じである。］
で表される化合物、コロミン酸、一般式（８）：

［式中、Ｒ^９及びＲ^１０は前記に同じである。］
で表される化合物、又は一般式（１２）：

［式中、Ｒ^９及びＲ^１０は前記に同じである。］
が挙げられる。

Ｒ^２は同一又は異なって置換基を示す。置換基としては、特に限定されず、公知の置換基を採用することができる。例えば、ニトロ基、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ヒドロキシ基、アルコキシ基、又は低級アルキル基（炭素数１〜６）が挙げられ、ニトロ基、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素がより好ましく挙げられる。

ｍは置換されているＲ^２の数を表しており、１〜３の整数であり、好ましくは１である。

Ｒ^２の置換位置は、ベンゼン環に結合している酸素原子に対して、パラ、オルト、又はメタのいずれでもよいが、好ましくはパラである。

一般式（４）中、Ｒ^２、ｍ、Ｒ^２の置換位置、Ｒ^９及びＲ^１０の組み合わせとしては、
例えば、Ｒ^２がニトロ基、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素であり、ｍが１であり、Ｒ^２の置換位置がベンゼン環に結合している酸素原子に対してパラであり、Ｒ^９がアセチル基、又はグリコリル基であり、Ｒ^１０が同一又は異なって水素、又は硫酸基であるという組み合わせが挙げられ、
好ましくは、Ｒ^２がニトロ基であり、ｍが１であり、Ｒ^２の置換位置がベンゼン環に結合している酸素原子に対してパラであり、Ｒ^９がアセチル基であり、Ｒ^１０が水素であるという組み合わせが挙げられる。一般式（８）中、Ｒ^９及びＲ^１０の組み合わせとしては、
例えば、Ｒ^９がアセチル基、又はグリコリル基であり、Ｒ^１０が同一又は異なって水素、又は硫酸基であるという組み合わせが挙げられ、
好ましくは、Ｒ^９がアセチル基であり、Ｒ^１０が水素であるという組み合わせが挙げられる。

一般式（１２）中、Ｒ^９及びＲ^１０の組み合わせとしては、
例えば、Ｒ^９がアセチル基、又はグリコリル基であり、Ｒ^１０が同一又は異なって水素、又は硫酸基であるという組み合わせが挙げられ、
好ましくは、Ｒ^９がアセチル基であり、Ｒ^１０が水素であるという組み合わせが挙げられる。

コロミン酸は、シアル酸又はその塩が重合した高分子化合物であり、特に限定されるものではない。シアル酸としては、ノイラミン酸のアミノ基やヒドロキシ基が置換された物質を広く採用することができる。具体的なシアル酸としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸等が挙げられる。シアル酸の塩としては、特に限定されず、例えば、シアル酸ナトリウム、シアル酸カリウムが挙げられる。コロミン酸の具体例としては、下記式；

［式中、ｗは５０〜１００である］
に示すコロミン酸ナトリウムが挙げられる。

用いるシアル酸導入酵素とシアル酸供与体の組み合わせとして好ましい組み合わせは、シアリダーゼと一般式（４）で表される化合物及びコロミン酸からなる群から選択される少なくとも１種との組み合わせ、又はシアリルトランスフェラーゼと一般式（８）で表される化合物との組み合わせが挙げられ、より好ましい組み合わせとしては、シアリダーゼと一般式（４）で表される化合物及びコロミン酸からなる群から選択される少なくとも１種との組み合わせが挙げられる。

反応は、適当な溶媒中で行う。溶媒としては、一般式（３）で表される化合物、並びにシアル酸供与体を溶解させることができ、且つシアル酸導入酵素が失活しない溶媒であれば特に限定されない。溶媒は、工程１と同様のものを使用できる。

反応温度は、シアル酸導入酵素が失活しない温度であれば特に限定されず、シアル酸導入酵素の反応至適温度に従って適宜選択される。例えば、５〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは２７〜３３℃が挙げられる。

反応時間は、シアル酸導入酵素活性が十分に発揮できる限り特に限定されない。例えば、１〜４８時間、好ましくは１２〜３６時間、より好ましくは２０〜２８時間が挙げられる。

反応ｐＨは、シアル酸導入酵素の活性が十分に発揮される限り特に限定されない。例えば、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ５〜６が挙げられる。

反応における、一般式（３）で表される化合物と、シアル酸供与体とのモル比は、による反応が起こる限り特に限定されないが、例えば、一般式（３）で表される化合物のモル数１モルに対して、シアル酸供与体に含まれるシアル酸残基（シアル酸から２つの水酸基を除いて得られる基）０．１モル〜３モル、好ましくは０．１モル〜１モル、より好ましくは０．１５〜０．２５モルが挙げられる。

上記反応は、担体に固定化されたシアル酸導入酵素の存在下で行うことが好ましい。この場合は、一般式（３）で表される化合物、並びにシアル酸供与体が、担体に固定化されたシアル酸導入酵素と接触できる状態にし、カラムを適当な温度条件下に置くことによって反応を行えばよい。この反応は、バッチ処理でもよいし、連続処理でもよい。

担体に固定化されたシアル酸導入酵素の存在下で反応を行うことによって、反応終了後シアル酸導入酵素の分離を、担体を遠心分離などにより除くことにより、容易に行うことができ、且つシアル酸導入酵素の安定性が向上し、担体に固定化されたシアル酸導入酵素を再利用することが出来る。このように、担体に固定化されたシアル酸導入酵素を用いることにより、一般式（５）で表される化合物の製造がより簡便且つ効率的に、低コストで行うことができる。

担体に固定化されているシアル酸導入酵素の量としては、担体１ｍＬに対して０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ好ましく挙げられる範囲は０．１〜３ｍｇが挙げられる。

上記反応後、反応によって得られた、一般式（５）で表される化合物を含む溶液を、さらに精製工程に供してもよい。精製手段は、公知の方法（分液、蒸留、クロマトグラフィー、再結晶等）を採用できる。

上記工程２のように、糖と、シアル酸骨格を有する化合物との縮合反応おいて、糖として一般式（３）で示される化合物を採用し、シアル酸導入酵素の存在下で反応を行うことにより、簡便且つ効率的に、一般式（５）で表される化合物を大量に製造することができる。

一般式（５）で表される化合物に包含される、一般式（５’）で表される化合物は、一般式（３’）；

［式中、Ｘ’及びｎは前記に同じ］
で表される化合物と、シアル酸供与体とを用いて、一般式（５）で表される化合物と同様に製造することができる。

一般式（３’）で表される化合物を用いることにより、シアル酸の２番目の炭素（一般式（５’）中、「２」で示される炭素）と、ガラクトースの６番目の炭素（一般式（５’）中、「６」で示される炭素）とが連結した、一般式（５’）で表される化合物を、効率的に製造することができる。

２‐３．工程３（（５）＋（６）→（７ａ）及び（７ｂ））
工程３は、一般式（７ａ）及び（７ｂ）で表される化合物の製造方法であって、一般式（５）で表される化合物と、一般式（６）で表される化合物とを反応させる工程である。

一般式（６）で表される化合物は、公知の方法で製造することができる。

反応は、１，３‐双極子付加反応である。反応は溶媒存在下でも非存在下でも行うことができるが、溶媒存在下で行う場合、溶媒は、反応に悪影響を与えない限り特に限定されない。例えば、蒸留水、メタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、及び／又はジメチルスルフォキシドを使用することができる。好ましくは適当な触媒の存在下で反応を行うことが好ましい。触媒としては、例えば銅（Ｉ）触媒が挙げられる。銅（Ｉ）触媒を使用する場合は、例えば、硫酸銅などの２価の銅と、還元剤（例えばアスコルビン酸ナトリウム）を系内に導入し、一価の銅を反応させる方法が挙げられる。

反応温度は、溶媒の沸点以下であれば特に限定されないが、例えば１５〜８０℃、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは２７〜３３℃が挙げられる。

反応時間は、特に限定されないが、例えば、１〜２４時間、好ましくは６〜２０時間、より好ましくは１０〜１４時間が挙げられる。

反応における、一般式（５）で表される化合物と、一般式（６）で表される化合物とのモル比は、特に限定されないが、例えば、一般式（５）で表される化合物１モルに対して、一般式（６）で表される化合物１モル〜５モル、好ましくは１モル〜３モル、より好ましくは１．２５〜１．７５モルが挙げられる。

３．製造装置
本発明は、装置１（供給口及び排出口を有する、担体に固定化されたグリコシダーゼを含むカラム（以下、カラムＡと示す）を備えることを特徴とする装置）、装置２（供給口及び排出口を有する、担体に固定化されたシアル酸導入酵素を含むカラム（以下、カラムＣと示す）を備えることを特徴とする装置）、及び装置３（装置１及び装置２を備え、装置１の排出口と装置２の供給口が流路ｃで連結されていることを特徴とする装置）を提供する。以下に具体的に説明する。

３‐１．装置１
装置１は、必須の構成として、供給口及び排出口を有する、担体に固定化されたグリコシダーゼを含むカラム（カラムＡ）を備えることを特徴とする装置である。従って、装置１は、グリコシダーゼの存在下で反応を行う、前述工程１による一般式（３）で表される化合物の製造に適している。すなわち、装置１は、好ましくは一般式（３）で表される化合物の製造用装置である。

カラムＡの供給口側には、流路切替え装置ａ’、例えば三方コック、又はインジェクターが備えられていてもよい。

さらに、装置１は、供給口及び排出口を有する逆相カラム（以下、カラムＢと示す）を備えていることが好ましい。また、カラムＡの排出口とカラムＢの供給口は、流路ｂで連結されていることが好ましく、流路ｂは、流路切替え装置ｂ’を備えることがより好ましい。カラムＢ及び流路切替え装置ｂ’を備える装置１を、装置１ａと示す（図１）。

流路切替え装置ｂ’は、流路ｂにおける流路を、カラムＡ側（図１中、「１」側）、カラムＢ側（図１中、「２」側）、装置１ａ外側（図１中、「３」側）の三方向に切替えできる機能、すなわち、３側の流路を閉じて１側の流路と２側の流路をつなぐ機能、２側の流路を閉じて１側の流路と３側の流路をつなぐ機能、及び１側の流路を閉じて２側の流路と３側の流路をつなぐ機能を有している。

流路ｂ及びカラムＢの排出口側には、流路切替え装置ｂ’以外にも、種々の検出器、例えば吸光度検出器、旋光度検出器、又は蛍光検出器等が備えられていてもよい。

装置１を用いて、一般式（１）で表される化合物及び一般式（２）で表される化合物を、カラムＡの供給口からカラムＡに導入してカラムＡ内で反応させる工程（以下、工程ａと示す）を行うことによって、一般式（３）で表される化合物を製造することができる。この場合、カラムＡ内では、一般式（１）で表される化合物及び一般式（２）で表される化合物が、カラムＡに含まれる、担体に固定化されたグリコシダーゼの存在下で反応することにより、上述工程１が行われる。従って、工程ａの反応温度等の条件は、上述工程１と同様に設定することができる。カラムＡ内の反応生成物、すなわち一般式（３）で表される化合物を含む反応生成物は、適当な溶媒、例えば工程（ａ）の反応を行った溶媒で溶出することにより、カラムＡから溶出することができる。

さらに、工程ａによる、一般式（３）で表される化合物を含む反応生成物を、カラムＡの排出口側に連結されたカラム（例えばカラムＢ）によって精製することが好ましい。例えば、工程ａに続いて、カラムＡ中の反応物をカラムＢの供給口に導入する工程（以下、工程ｂと示す）、及びカラムＢから一般式（３）で表される化合物を精製する工程（以下、工程ｃと示す）を行うことにより、精製を行うことが好ましい。

カラムＡ中の反応物をカラムＢの供給口に導入する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。例えば、カラムＡの供給口から、溶媒（好ましくは、工程（ａ）の反応を行った溶媒が例示される）を供給することにより、カラムＡ内に存在する、工程（ａ）による反応溶液を、カラムＡの排出口から押出し、カラムＡの排出口に流路ｂを介して連結されているカラムＢの供給口に導入する方法が挙げられる。

カラムＢから一般式（３）で表される化合物を精製する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法に従って、溶媒の種類及び混合比を変えて、必要なものを精製することができる。例えば、カラムＡの供給口から、又はカラムＢの供給口から、好ましくは装置１の外側から流路切替え装置ｂ’を介して、溶媒をカラムＢ内に通すことにより、カラムＢ内に存在している一般式（３）で表される化合物を溶出し、該化合物が含まれる画分を分画することにより行われる。この際に使用する溶媒としては、一般式（３）で表される化合物をカラムＢから溶出することができる限り特に限定されないが、例えば水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、及び／又はテトラヒドロフラン等が挙げられる。

この際、カラムＢ中には、主に、未反応の一般式（１）で表される化合物と、一般式（３）で表される化合物が存在している。そして、溶媒として水を使用した場合、未反応の一般式（１）で表される化合物が先に溶出され、その後に一般式（３）で表される化合物が溶出される。

装置１を用いて得られた、一般式（３）で表される化合物は、更に、公知の精製手段（クロマトグラフィー等）、乾燥工程（凍結乾燥等）に供してもよい。

このように、装置１を用いることにより、一般式（３）で表される化合物を、簡便且つ効率的に、大量に製造することができるという優れた効果が奏される。具体的には、担体に固定化されたグリコシダーゼを含むカラム（カラムＡ）を用いることにより、グリコシダーゼの酵素活性の低下が起こりにくくなり、酵素を再利用することが出来る点、及びカラムＡを用いることにより、反応後の酵素の除去が必要なくなる点において優れている。さらにカラムＢを採用した場合は、反応後の精製が極めて容易に行うことができる点、及びカラムＢによる精製で得られた一般式（１）で表される化合物を、再度、一般式（３）で表される化合物の製造に再利用できる点において優れている。

３‐２．装置２
装置２は、必須の構成として、供給口及び排出口を有する、担体に固定化されたシアル酸導入酵素を含むカラム（カラムＣ）を備えることを特徴とする装置である。従って、装置２は、シアル酸導入酵素の存在下で反応を行う、前述工程２による一般式（５）で表される化合物の製造に適している。すなわち、装置２は、好ましくは一般式（５）で表される化合物の製造用装置である。

カラムＣの供給口側には、流路切替え装置ｃ’、例えば三方コック、又はインジェクターが備えられていてもよい。

装置２は、供給口及び排出口を有する逆相カラム（以下、カラムＤと示す）、及び／又は供給口及び排出口を有するイオン交換カラム（以下、カラムＥと示す）を備えていることが好ましい。また、カラムＣの排出口とカラムＤの供給口は、流路ｄで連結されていることが好ましく、流路ｄは、流路切替え装置ｄ’を備えることがより好ましい。さらに、カラムＤの排出口とカラムＥの供給口は、流路ｅで連結されていることが好ましく、流路ｅは流路切替え装置ｅ’を備えることがより好ましい。カラムＤ、カラムＥ、流路切替え装置ｄ’、及び流路切替え装置ｅ’を備える装置２を、装置２ａと示す（図２）。

流路切替え装置ｄ’は、流路ｄにおける流路を、カラムＣ側（図２中、「４」側）、カラムＤ側（図２中、「５」側）、装置２ａ外側（図２中、「６」側）の三方向に切替えできる機能、すなわち、６側の流路を閉じて４側の流路と５側の流路をつなぐ機能、５側の流路を閉じて４側の流路と６側の流路をつなぐ機能、及び４側の流路を閉じて５側の流路と６側の流路をつなぐ機能を有している。

流路切替え装置ｅ’は、流路ｅにおける流路を、カラムＤ側（図２中、「７」側）、カラムＥ側（図２中、「８」側）、装置２ａ外側（図２中、「９」側）の三方向に切替えできる機能、すなわち、９側の流路を閉じて７側の流路と８側の流路をつなぐ機能、８側の流路を閉じて７側の流路と９側の流路をつなぐ機能、及び７側の流路を閉じて８側の流路と９側の流路をつなぐ機能を有している。

カラムＣの供給口側には、流路切替え装置ｃ、例えばインジェクターが備えられていてもよい。また、流路ｄ、流路ｅ、及びカラムＥの排出口側には、種々の検出器、例えば吸光度検出器、旋光度検出器、又は蛍光検出器等が備えられていてもよい。

装置２を用いて、一般式（３）で表される化合物、並びにシアル酸供与体を、カラムＣの供給口からカラムＣに導入してカラムＣ内で反応させる工程（以下、工程ｄと示す）を行うことによって、一般式（５）で表される化合物を製造することができる。この場合、カラムＣ内では、一般式（３）で表される化合物及びシアル酸供与体が、カラムＣに含まれる、担体に固定化されたシアル酸導入酵素の存在下で反応することにより、上述工程２が行われる。従って、工程ｄの反応温度等の条件は、上述工程１と同様に設定することができる。カラムＣ内の反応生成物、すなわち一般式（５）で表される化合物を含む反応生成物は、適当な溶媒、例えば工程（ｄ）の反応を行った溶媒で溶出することにより、カラムＣから溶出することができる。

さらに、工程ｄによる、一般式（５）で表される化合物を含む反応生成物を、カラムＡの排出口側に連結されたカラム（例えばカラムＤ、又はカラムＥ）によって精製することが好ましい。例えば、工程ｄに続いて、カラムＣ中の反応物をカラムＤの供給口に導入する工程（以下、工程ｅと示す）、カラムＤ中の内容物をカラムＥの供給口に導入する工程（以下、工程ｆと示す）、及びカラムＥから一般式（５）で示される化合物を精製する工程（以下、工程ｇと示す）を行うことにより、精製を行うことが好ましい。

カラムＣ中の反応物をカラムＤの供給口に導入する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。例えば、カラムＣの供給口から、溶媒（好ましくは、工程（ｄ）の反応を行った溶媒が例示される）を供給することにより、カラムＣ内に存在する、工程（ｄ）による反応溶液を、カラムＣの排出口から押出し、カラムＣの排出口に流路ｄを介して連結されているカラムＤの供給口に導入する方法が挙げられる。

カラムＤ中の内容物をカラムＥの供給口に導入する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。例えば、カラムＤの供給口から、溶媒（例えば、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、及び／又はテトラヒドロフランを供給することにより、カラムＤ内に存在する、工程（ｄ）による内容物を、カラムＤから溶出し、カラムＤの排出口に流路ｅを介して連結されているカラムＥの供給口に導入する方法が挙げられる。カラムＤを用いて精製することにより、未反応の一般式（３）で表される化合物、及び一般式（５）で表される化合物を、一般式（４）で表される化合物を使用した場合に生じるパラニトロフェノールと分離することができる（パラニトロフェノールはカラムＤ内に残る）。

カラムＥから一般式（５）で表される化合物を精製する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法に従って、溶媒の種類及び混合比を変えて、必要なものを精製することができる。公知の方法を採用することができる。例えば、カラムＣの供給口から、カラムＤの供給口から、又はカラムＢの供給口から、好ましくは装置２の外側から流路切替え装置ｅ’を介して、溶媒をカラムＥ内に通すことにより、カラムＥ内に存在している一般式（Ｅ）で表される化合物を溶出し、該化合物が含まれる画分を分画することにより行われる。この際に使用する溶媒としては、一般式（５）で表される化合物をカラムＥら溶出することができる限り特に限定されないが、例えば塩化ナトリウム水溶液、塩化カリウム水溶液、及び／又は塩化カルシウム水溶液等が挙げられる。これらの溶媒を使用する場合は、その塩濃度は例えば０．５〜２Ｍ程度に設定することが好ましい。

好ましくは、水をカラムＥ内に導入することにより、カラムＥ内の一般式（３）で表される化合物を溶出し、その後、上記溶媒で溶出することにより一般式（５）で表される化合物を精製するとよい。得られた一般式（３）で表される化合物は、再度、一般式（５）で表される化合物の製造に再利用できる
装置１を用いて得られた、一般式（５）で表される化合物は、更に、公知の精製手段（クロマトグラフィー等）、乾燥工程（凍結乾燥等）に供してもよい。

このように、装置２を用いることにより、一般式（５）で表される化合物を、簡便且つ効率的に、大量に製造することができるという優れた効果が奏される。具体的には、担体に固定化されたシアル酸導入酵素を含むカラム（カラムＣ）を用いることにより、シアル酸導入酵素の酵素活性の低下が起こりにくくなり、酵素を再利用することが出来る点、及びカラムＣを用いることにより、反応後の酵素の除去が必要なくなる点において優れている。さらにカラムＤ及び／又はカラムＥを採用した場合は、反応後の精製が極めて容易に行うことができる点、及びカラムＥによる精製で得られた一般式（３）で表される化合物を、再度、一般式（３）で表される化合物の製造に再利用できる点において優れている。

３‐３．装置３
装置３は、前述のように、装置１及び装置２を備え、装置１の排出口と装置２の供給口が流路ｃで連結されていることを特徴とする装置（以下、装置３と示す）である。従って、装置３は、一般式（５）で表される化合物の製造に適している。すなわち、装置３は、好ましくは一般式（５）で表される化合物の製造用装置である。

装置１の排出口とは、装置１の最も排出口側に備えられるカラム又は装置の排出口を意味し、例えば装置１がカラムＡのみからなる場合は、装置１の排出口はカラムＡの排出口であり、装置１が、カラムＡ、カラムＢ、及び流路切替え装置ｂ’を備える装置１ａである場合は、装置１の排出口はカラムＢの排出口を意味する。

装置２の供給口とは、装置２の最も供給口側に備えられるカラム、すなわちカラムＣの供給口を意味する。

流路ｃは、流路切替え装置ｃ’、例えば三方コックを備えることが好ましい。

装置３としては、装置１ａ及び装置２ａを備えることが好ましい。

装置１ａ、装置２ａ、及び流路切替え装置ｃ’を備える装置３を、装置３ａと示す（図３）。

流路切替え装置ｃ’は、流路ｃにおける流路を、カラムＢ側（図３中、「１０」側）、カラムＣ側（図３中、「１１」側）、装置３ａ外側（図３中、「１２」側）の三方向に切替えできる機能、すなわち、１２側の流路を閉じて１０側の流路と１１側の流路をつなぐ機能、１１側の流路を閉じて１０側の流路と１２側の流路をつなぐ機能、及び１０側の流路を閉じて１１側の流路と１２側の流路をつなぐ機能を有している。

流路ｃには、種々の検出器、例えば吸光度検出器、旋光度検出器、又は蛍光検出器等が備えられていてもよい。

上記「３‐１.装置１」に記載のように装置１を用いることにより、一般式（３）で表される化合物を得て、上記「３‐２．装置２」に記載のように装置２を用いることにより、一般式（５）で表される化合物を製造することができる。例えば、装置３に包含される装置３ａを用いて、上述工程（ａ）〜（ｇ）を行うことによって、一般式（５）で表される化合物を製造することができる。

このように、装置３を用いることにより、装置１及び装置２をそれぞれ単独で用いるよりも簡便且つ効率的に、一般式（５）で表される化合物を大量に製造することができるという優れた効果が奏される。

以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

実施例１．担体に固定化されたセルラーゼを含むカラムの調製
下記ステップ（１）〜（１０）により、HiTrap NHS-activated HPカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)中の担体に、セルラーゼ（和光社製、商品名：Cellulase、Aspergillus niger由来）を固定化した。

（１）氷冷した1mM HCl (5 mL)をシリンジポンプを用いて流速0.5 ml/minにてカラムに通じた。

（２） 1.8 U（ユニット）のセルラーゼ溶液 [50 mM 酢酸ナトリウムバッファー、pH = 5 (1 mL)にセルラーゼを溶解したもの] をシリンジポンプを用いて流速0.5 ml/minにてカラムに通じた。次にカラムを4℃で12時間放置した。

（３） 0.2 M炭酸水素ナトリウム溶液、0.5 M NaCl含有、pH = 8.3 (3 mL) シリンジポンプを用いて流速0.5 ml/minにてカラムに通じた。

（４） 0.5 Mモノエタノールアミン溶液、0.5 M NaCl含有、pH = 8.3 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

（５） 0.1 M 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 M NaCl含有、pH = 4 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

（６） 0.5 Mモノエタノールアミン溶液、0.5 M NaCl含有、pH = 8.3 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。そのあとカラムを４℃で4時間放置した。

（７） 0.1 M 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 M NaCl含有、pH = 4 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

（８） 0.5 Mモノエタノールアミン溶液、0.5 M NaCl含有、pH = 8.3 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

（９） 0.1 M 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 M NaCl含有、pH = 4 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

（１０） 50 mM 酢酸ナトリウムバッファー、pH = 5 (2 mL) をシリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

以上のステップ（１）〜（１０）で得られたカラムを、「担体に固定化されたセルラーゼを含むカラム」として、「実施例３．プロパルギル基導入ラクトースの製造」及び「実施例７．アルキニル基導入糖製造装置の製造」において使用した。

実施例２．担体に固定化されたシアリダーゼを含むカラムの調製
下記のステップ（１１）〜（２０）により、HiTrap NHS-activated HPカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)中の担体に、シアリダーゼ（Roche社製、Vibrio cholerae Acylneuraminyl hydrolase）を固定化した。

（１１）氷冷した1mM HCl (5 mL)をシリンジポンプを用いて流速0.5 ml/minにてカラムに通じた。

（１２）１Ｕ（ユニット）のシアリダーゼ溶液（市販調整済みのもの）(1 mL)をシリンジポンプを用いて流速0.5 ml/minにてカラムに通じた。次にカラムを4℃で12時間放置した。

（１３） 0.2 M炭酸水素ナトリウム溶液、0.5 M NaCl含有、pH = 8.3 (3 mL) シリンジポンプを用いて流速0.5 ml/minにてカラムに通じた。

（１４） 0.5 Mモノエタノールアミン溶液、0.5 M NaCl含有、pH = 8.3 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

（１５） 0.1 M 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 M NaCl含有、pH = 4 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

（１６） 0.5 Mモノエタノールアミン溶液、0.5 M NaCl含有、pH = 8.3 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。そのあとカラムを４℃で4時間放置した。

（１７） 0.1 M 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 M NaCl含有、pH = 4 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

（１８） 0.5 Mモノエタノールアミン溶液、0.5 M NaCl含有、pH = 8.3 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

（１９） 0.1 M 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 M NaCl含有、pH = 4 (6 mL) シリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

（２０） 100 mM 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 mM, CaCl₂含有, pH = 5.5 (2 mL) をシリンジポンプを用いて流速1 ml/minにてカラムに通じた。

以上のステップ（１１）〜（２０）で得られたカラムを、「担体に固定化されたシアリダーゼを含むカラム」として、「実施例４．プロパルギル基導入シアリルラクトースの製造」及び「実施例８．アルキニル基導入シアロ糖製造装置の製造」において使用した。

実施例３．プロパルギル基導入ラクトースの製造
下記反応式に従って、プロパルギル基導入ラクトース（化合物３）を製造した。詳細を以下に説明する。

ラクトース（化合物１）（1 M, 500 μL）、プロパルギルアルコール（化合物２）(250 μＬ)、及び酢酸ナトリウムバッファー(50 mM, pH = 5.0, 250 μＬ)の混合溶液を、実施例１で製造した担体に固定化されたセルラーゼを含むカラムへ通じた。

カラムの両端をキャップし、カラムを37℃に加温した恒温槽に入れ、70時間インキュベートした。

次いで酢酸ナトリウムバッファー(50 mM, pH = 5.0) (2 mL)をカラムに通液して反応液をカラムより流出させた。

その反応液を逆相カラム(BONDESIL-C18, L= 6 cm)に供し水で溶出することにより化合物３(49.5 mg)を得た。NMRデータを下記に示す。

¹H-NMR (D₂O)δ4.96 (d, 1 H, J= 3.6 Hz), 4.54 (d, 1 H, J = 8.4 Hz), 4.34 (s, 2 H), 4.32 (d, 1 H, J= 8.0 Hz), 3.86 (d, 1 H, J= 11.6 Hz), 3.69‐3.52 (m, 4 H), 3.42 (dd, 1 H, J= 8.4, J = 9.2 Hz), 3.22 (br-t, 1 H), 2.78 (s, 1 H)。

実施例４．プロパルギル基導入シアリルラクトースの製造
下記反応式に従って、プロパルギル基導入シアリルラクトース（化合物５）を製造した。詳細を以下に説明する。

化合物３ (101 mg, 0.26 mmol)とVolker Eschenfelderらの文献(Cabohydr. Res. 162, 294-297, 1987)に従って調製したパラニトロフェニルシアル酸（化合物４）(15.7 mg 0.05 mmol) もしくはコロミン酸（10 mg）（平均重合度：100）を、酢酸ナトリウムバッファー(100 mM 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 mM, CaCl₂含有, pH = 5.5, 1 mL)に溶解し、その混合溶液をシアリダーゼを固定化したカラムへ通じた。

カラムの両端をキャップし、カラムを30℃に加温した恒温槽に入れ、24時間インキュベートした。

次いで100 mM 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 mM, CaCl₂含有, pH = 5.5 (2 mL)をカラムに通液して反応液をカラムより流出させた。

その反応液を逆相カートリッジカラムSep pack C18に供し、水画分(4 mL)にて未反応の化合物３、シアル酸、及び化合物５を混合物として得た（※コロミン酸をドナーとして用いた場合、この逆相カラムのステップは省いた）。

ついでその水画分をイオン交換カートリッジカラム（アクロセップQ Ceramic Hyper DF）に供し水画分(5 mL)にて化合物３を回収し、2 M NaCl画分(1 mL)にてシアル酸と目的とした化合物５を混合物として得た。NMRデータを下記に示す。

¹H-NMR (D₂O)δ 4.35 (s, 2 H), 4.32 (d, 1 H, J= 8.0 Hz), 2.68 (d, 1 H), 2.50 (dd, 1 H, J = 4.4, J= 12.4 Hz), 1.44 (t, 1 H, J= 12.4 Hz)。

実施例５．ポリエチレングリコールを導入したプロパルギル基導入シアリルラクトースの製造
下記反応式に従ってポリエチレングリコールを導入したプロパルギル基導入シアリルラクトース（化合物７ａ）を製造した。詳細を以下に説明する。

K. B. Sharplessらの文献（Angew. Chem.. Int. Ed. 41, 2596-2599, 2002)に従い、窒素気流下において化合物５の水溶液(50 μL)に、M. Yamaguchiらの文献(Tetrahedron Lett. 47, 7455-7458, 2006)に従って調製した化合物６ａ(30 μL; 90 μM in DMSO)、10 mM硫酸銅水溶液(50 μL)、10 mMアスコルビン酸ナトリウム水溶液(50 μL)を順に加え、30℃にて12時間インキュベートした。

反応液を減圧濃縮し、その残渣を蒸留水に溶解し、逆相カートリッジカラムSep pack C18に供し、水(2 mL)を用いてシアル酸、未反応の化合物５を溶出させて除去した後、溶出溶媒として水：メタノール＝１：１の混合溶媒(2 mL)を用いて目的とした化合物７ａを含む溶出液を得、これを減圧濃縮することにより目的化合物７ａを得た。NMRデータを下記に示す。

¹H-NMR (D₂O)データ δ 8.30 (s, 1 H), 8.18 (d, 1 H), 7.90 (d, 2 H, J = 8.8 Hz), 7.04 (d, 2 H, J = 8.8 Hz), 4.31 (m), 3.73 (m), 3.58 (m), 3.49-3.43 (m), 3.18 (s), 2.50 (dd, 1 H, J= 4.8, J= 12.4 Hz), 1.83 (s, 3 H), 1.54 (t, 1 H, J = 12.4 Hz)。

製造例１．アジド基を有する脂質の製造
下記反応式に従ってアジド基を有する脂質（化合物６ａ）を製造した。詳細を以下に説明する。

ｌ-テトラデカノール (1 g, 4.66 mmol)をピリジン(3 mL)に溶解した。そこにp-トルエンスルホニルクロリド(1.3 g, 6.82 mmol)を添加し室温にて4時間撹拌しながら反応を行った。

その後反応液をクロロホルムで抽出し、2 Mの塩酸水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムを加えて乾燥してから減圧濃縮した。

得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出溶媒として酢酸エチル：ヘキサン＝１：１０にて精製し、パラトルエンスルホニルテトラデカノール（1.7 g, 収率99 ％）を得た。

次いで、得られたパラトルエンスルホニルテトラデカノール(1.7 g, 4.61 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(3 mL)に溶解した。

そこにアジ化ナトリウム(1.4 g, 21.5 mmol)を室温にて添加し、40℃にて24時間撹拌しながら反応を行った。

その後反応液をクロロホルムで抽出し、蒸留水で洗浄し、硫酸マグネシウムを加えて乾燥してから減圧濃縮した。

得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出溶媒として酢酸エチル：ヘキサン＝１：１０にて精製し、化合物６ｂ（1.1 g）を定量的に得た。NMRデータを下記に示す。

¹H-NMR (CDCl₃) δ3.25 (t), 1.63-1.56 (m), 1.37-1.26 (m), 0.88 (t)。

実施例６．アジド基を有する脂質を導入したプロパルギル基導入シアリルラクトースの製造
下記反応式に従ってアジド基を有する脂質を導入したプロパルギル基導入シアリルラクトース（化合物７ｂ）を製造した。詳細を以下に説明する。

K. B. Sharplessらの文献(Angew. Chem.. Int. Ed. 41, 2596-2599, 2002)に従い、窒素気流下において化合物５水溶液(50 μL)に、化合物６ｂ(30 μL; 90 μM in DMSO)、10 mM硫酸銅水溶液(50 μL)、10 mMアスコルビン酸ナトリウム水溶液(50 μL)を順に加え、30℃にて12時間インキュベートした。

反応液を減圧濃縮し、その残渣を蒸留水に溶解し、逆相カートリッジカラムSep pack C18に供し、水(2 mL)を用いてシアル酸、未反応の化合物５を溶出させて除去した後、溶出溶媒として水：メタノール＝１：１の混合溶媒(2 mL)を用いて目的とした化合物７ｂを含む溶出液を得、これを減圧濃縮することにより目的化合物７ｂを得た。

¹H-NMR (DMSO-D6) δ8.22(s, 1 H), 4.77 (d, 1 H, J =5.6 Hz), 4.59 (d, 1 H, J = 5.2 Hz), 4.22 (t, 1 H), 4.16 (d, 1 H, J = 5.6 Hz), 3.98 (m), 3.66-3.38 (m), 2.18 (dd, 1 H, J = 4.8, J =12.0 Hz), 1.87 (s, 3 H), 1.37 (t, 1 H, J= 12.0 Hz), 1.01 (m), 0.81 (t, 3 H, J = 8.8 Hz)。

実施例７．装置の製造（１）
実施例３において製造された化合物３に代表される、一般式（３）；

［式中、Ｘ及びｎは前記に同じ］
で表される化合物の製造に適した装置を製造した。この装置の全体像を示した図４を参照して、詳細を以下に示す。

実施例１で製造された、担体に固定化されたセルラーゼを含むカラム（セルラーゼ固定化カラムＡ）の供給口側（上流側）に三方コックａを、排出口側（下流側）に三方コックｂを取り付けた。

更に、三方コックｂの下流側に逆相カラム(BONDESIL-C18, L= 6 cm)（逆相カラムＢ）を取り付けた。

実施例８．装置の製造（２）
実施例４において製造された、化合物５に代表される、一般式（５）；

［式中、Ｘ及びｎは前記に同じ］
で表される化合物の製造に適した装置を製造した。この装置の全体像を示した図５を参照して、詳細を以下に示す。

実施例２で製造された、担体に固定化されたシアリダーゼを含むカラム（シアリダーゼ固定化カラムＣ）の供給口側（上流側）に三方コックｃを、排出口側（下流側）に三方コックｄを取り付けた。

そして、三方コックｄの下流側に逆相カートリッジカラム（Sep pack C18）2つ（上流側から逆相カラムＤ１、逆相カラムＤ２と示す）連結したもの（逆相カラムＤ１と逆相カラムＤ２を連結したものを逆相カラムＤと示す）を取り付けた。

さらに、逆相カラムＤ２の下流側に三方コックｅを取り付けた。

そしてさらに、三方コックｅの下流側にイオン交換カートリッジカラム（アクロセップQ Ceramic Hyper DF）（イオン交換カラムＥ）を取り付けた。

実施例９．アルキニル基導入糖製造装置１を使用した、プロパルギル基導入ラクトース（化合物３）の製造
下記反応式に従って、プロパルギル基導入ラクトース（化合物３）を、実施例７で製造した装置（図４）を用いて製造した。詳細を以下に説明する。

ラクトース（化合物１）水溶液（1 M, 500 μL）、プロパルギルアルコール（化合物２）(250 μＬ)、及び酢酸ナトリウムバッファー(50 mM, pH = 5.0, 250 μＬ)の混合溶液をシリンジを用いて三方コックａを介してセルラーゼ固定化カラムＡに通じた。

その際、セルラーゼ固定化カラムＡの排出口から溶出してくる溶液が、三方コックｂを通じて逆相カラムＢを通らずに装置外に排出されるように、三方コックｂの流路を装置外に通じておいた。

セルラーゼ固定化カラムＡの供給口及び排出口を閉じて、セルラーゼ固定化カラムＡ部分を37℃に加温した恒温槽に入れ、70時間インキュベートした（カラム内での糖転移反応の実施）。

三方コックａから酢酸ナトリウムバッファー(50 mM, pH = 5.0)を2 mL通じた。この時の溶出液は反応物をカラム内から押し出す役割と、セルラーゼが安定化するバッファーでカラム内を置換する意味をもつ。

その際、セルラーゼ固定化カラムＡカラムから溶出されてくる溶液が逆相カラムＢへ導入されるように、三方コックｂの流路を逆相カラムＢに通じておいた。

三方コックｂより逆相カラムＢへ蒸留水(6 mL)を通じ、未反応のラクトース（化合物１）とプロパルギル基導入ラクトース（化合物３）を分離する。通じた蒸留水の前半(3 mL)で未反応のラクトース（化合物１）が溶出された。これは減圧濃縮の後に次回の反応に再利用できる。後半の(3 mL)でプロパルギル基導入ラクトース（化合物３）が回収された。化合物３の水溶液を減圧濃縮した。

目的物回収後、逆相カラムは三方コックから順に、水：メタノール＝１：１溶液（5 mL）、メタノール（5 mL）、蒸留水(5 mL)を順に通じ再生して次回の反応に備えることができる。

NMRデータ：¹H-NMR (D₂O) δ4.96 (d, 1 H, J= 3.6 Hz), 4.54 (d, 1 H, J = 8.4 Hz), 4.34 (s, 2 H), 4.32 (d, 1 H, J= 8.0 Hz), 3.86 (d, 1 H, J= 11.6 Hz), 3.69‐3.52 (m, 4 H), 3.42 (dd, 1 H, J= 8.4, J = 9.2 Hz), 3.22 (br-t, 1 H), 2.78 (s, 1 H)。

実施例１０．アルキニル基導入シアロ糖鎖製造装置２を使用した、プロパルギル基導入シアリルラクトース（化合物５）の製造
下記反応式に従って、プロパルギル基導入シアリルラクトース（化合物５）を、実施例８で製造した装置（図５）を用いて製造した。詳細を以下に説明する。

化合物３ (101 mg, 0.26 mmol)とパラニトロフェノールシアル酸（化合物４）(15.7 mg 0.05 mmol)もしくは下記式で表されるコロミン酸ナトリウム（10 mg）（平均重合度：100）を酢酸ナトリウムバッファー(100 mM 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 mM, CaCl₂含有, pH = 5.5, 1 mL)に溶解しシリンジを用いて三方コックｃを介してシアリダーゼ固定化カラムＣに通じる。その際、シアリダーゼ固定化カラムＣの排出口から溶出してくる溶液が、三方コックｄを通じて逆相カラムＤを通らずに装置外に排出されるように、三方コックｄの流路を装置外に通じておいた。

シアリダーゼ固定化カラムＣの供給口及び排出口を閉じて、三方コックｃ及び三方コックｄの流路をシアリダーゼ固定化カラムＣ側に向け、シアリダーゼ固定化カラムＣ部分を30℃に加温した恒温槽に入れ、24時間インキュベートした。（カラム内での糖転移反応の実施）
三方コックｃから100 mM 酢酸ナトリウムバッファー、0.5 mM, CaCl₂含有, pH = 5.5 (2 mL)を通じた。この時の溶出液は反応物をカラム内から押し出す役割と、シアリダーゼが安定化するバッファーでカラム内を置換する意味をもつ。その際、シアリダーゼ固定化カラムＣから溶出されてくる溶液が逆相カラムＤへ導入されるように、三方コックｄの流路を逆相カラムＤに通じておいた。

三方コックｄより逆相カラムＤへ蒸留水(3 mL)を通じ、糖鎖を疎水性成分（反応の際に遊離したパラニトロフェノール）から分離した（※コロミン酸をドナーとして用いた場合は逆相カラムのステップは省くことができる）。通じた蒸留水 (3 mL)で目的物を含む糖鎖は逆相カラムＤから完全に溶出された。その際この溶出液が次に連結されているイオン交換カラムＥへ直接流れ込むように逆相カラムの下方に設置した三方コックｅの流路をイオン交換カラムＥに通じておいた。

三方コックｄから順に、水：メタノール＝１：１溶液（10 mL）、メタノール（10 mL）、蒸留水(10 mL)を順に通じ逆相カラムＤを再生して次回の反応に備えることができる。その際、逆相カラムＤから溶出される溶液が全て三方コックｅより装置外へ排出されるように、三方コックｅの流路を装置外に通じておいた。

三方コックｅよりイオン交換カラムＥへ蒸留水（5 mL）を通じ、化合物３を回収した。これは、減圧濃縮の後、次回の反応に再利用できる。ついで、三方コックｅよりイオン交換カラムＥへ2 Mの塩化ナトリウム水溶液（2 mL）を通じ、プロパルギル基導入シアリルラクトース（化合物５）と遊離のシアル酸を混合物として得た。

イオン交換カラムは、三方コックｅより蒸留水(10 mL)を通じることにより、再生して次回の反応に備えることができる。

NMRデータ：¹H-NMR (D₂O) δ4.35 (s, 2 H), 4.32 (d, 1 H, J= 8.0 Hz), 2.68 (d, 1 H), 2.50 (dd, 1 H, J = 4.4, J= 12.4 Hz), 1.44 (t, 1 H, J= 12.4 Hz)。

実施例１１．シアリルトランスフェラーゼとＣＭＰ−シアル酸を用いた、プロパルギル基導入シアリルラクトース（化合物５）の製造
シアリダーゼに代えてシアリルトランスフェラーゼを用い、パラニトロフェノールシアル酸及びコロミン酸ナトリウムに代えてＣＭＰ−シアル酸を用いて、上記実施例と同様に製造する。

Claims

一般式（５）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物。
一般式（５）において、Ｘがラクトースの還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基である請求項１に記載の化合物。
一般式（７ａ）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒ^１は有機基を示す］
、又は一般式（７ｂ）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒ^１は有機基を示す］
で表される化合物。
一般式（５）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物の製造方法であって、
シアル酸供与体と、
一般式（３）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物とを、
シアル酸導入酵素の存在下で反応させることを特徴とする製造方法。
一般式（５）；

［式中、Ｘ、Ｒ^９、Ｒ^１０、及びｎは前記に同じ］
で表される化合物の請求項４に記載の製造方法であって、
（工程１）一般式（１）；

［式中、Ｘは単糖又はオリゴ糖の還元末端の水酸基から水酸基を除き、非還元末端の水酸基から水素を除いて得られる糖残基を示し、Ｘの左側が非還元末端側を示し、Ｘの右側が還元末端側を示す］
で表される化合物と、
一般式（２）；

［式中、ｎは１〜１０の整数である］
で表される化合物とを、
グリコシダーゼの存在下で反応させ、一般式（３）；

［式中、Ｘ及びｎは前記に同じ］
で表される化合物を得る工程、及び
（工程２）シアル酸供与体と、
一般式（３）；

［式中、Ｘ及びｎは前記に同じ］
で表される化合物とを、
シアル酸導入酵素の存在下で反応させる工程を含むことを特徴とする製造方法。
前記シアル酸導入酵素が担体に固定化されたシアル酸導入酵素である請求項４又は５に記載の製造方法。
前記シアル酸導入酵素がシアリダーゼであり、
前記シアル酸供与体が、一般式（４）；

［式中、Ｒ^２は同一又は異なって置換基を示し、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示し、ｍは１〜３の整数である。］
で表される化合物及びコロミン酸からなる群から選択される少なくとも１種である
請求項４〜６のいずれかに記載の製造方法。
前記シアリダーゼがVibrio属に属する生物に由来する請求項７のいずれかに記載の製造方法。
前記シアル酸導入酵素がシアリルトランスフェラーゼであり、
前記シアル酸供与体が一般式（８）；

［式中、Ｒ^９は水素、又はアミノ基をアシル化する基を示し、Ｒ^１０は同一又は異なって水素又は水酸基の保護基を示す。］
で表される化合物である
請求項４〜６のいずれかに記載の製造方法。
供給口及び排出口を有する、担体に固定化されたシアリダーゼを含むカラム（以下、カラムＣと示す）を備えることを特徴とする装置。
（Ａ）カラムＣ、
（Ｂ）供給口及び排出口を有する逆相カラム（以下、カラムＤと示す）、及び
（Ｃ）供給口及び排出口を有するイオン交換カラム（以下、カラムＥと示す）を備え、
カラムＣの排出口とカラムＤの供給口が流路ｄで連結され、
カラムＤの排出口とカラムＥの供給口が流路ｅで連結され、
流路ｄは流路切替え装置ｄ’を備え、
流路ｅは流路切替え装置ｅ’を備えることを特徴とする請求項１０に記載の装置。