JPWO2011058994A1 - ２型糖尿病モデル非ヒト動物 - Google Patents

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Abstract

日本人に多い非肥満型の２型糖尿病と類似の病態を自然発症する新しい２型糖尿病モデル非ヒト動物を提供する。Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物とした。具体的には、Cdkal1遺伝子の１又は複数のエキソンを含む所定領域の３’側非翻訳領域と５’側非翻訳領域とに部位特異的組み換え酵素認識配列を有する非ヒト動物と、前記部位特異的組み換え酵素認識配列を認識して前記所定領域を切り出し可能な部位特異的組み換え酵素の遺伝子が、膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータの下流に発現可能に挿入された非ヒト動物と、を交配させることにより作製してもよい。

Description

本発明は、Cdkal1遺伝子の機能が染色体上で欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物、及び同２型糖尿病モデル非ヒト動物を用いた糖尿病の予防・治療剤のスクリーニング方法に関する。
従来より糖尿病は、糖代謝の異常によって血糖値が病的に高まり、様々な合併症を生じる病気として知られている。
特に、インスリン分泌低下と感受性低下を原因とする２型糖尿病は、本邦の全糖尿病患者の大部分を占めると考えられており、遺伝的素因に、過食、食事内容、ストレス、運動不足といった多くの環境因子が加わって発症、進行するという複雑な多因子疾患である。
そのため、今日に至るまで多くの研究者により、２型糖尿病の病態を呈すると考えられる非ヒト動物を用いて、２型糖尿病の研究が行われている。
このような非ヒト動物としては、例えば、米国のジャクソン研究所で見いだされたob/obマウスやdb/dbマウスが挙げられる。
これらのマウスは、過食によるエネルギー摂取の増加に加え、エネルギー消費の低下をきたし、高血糖、高インスリン血症、インスリン抵抗性、白色脂肪細胞の重量増加などの表現型が認められる。
そして、１９９４年にはob/obの責任遺伝子がポジショナルクローニングにより同定され、レプチンと命名された（例えば、非特許文献１参照。）。そして１９９５年には、レプチン受容体遺伝子がクローニングされdb/dbマウスの責任遺伝子であることが明らかにされた（例えば、非特許文献２参照。）。現在、この両マウスは、レプチンの生理機能、薬理機能を含めた糖尿病、肥満の研究に広く用いられているモデルである。
これらの発生工学的手法を用いて開発された動物の応用研究は、インスリン分泌や作用の分子機構の詳細な解明に役立つだけでなく、幾つかの遺伝因子や環境因子の負荷により、多因子疾患としての２型糖尿病の病態解明を可能にするものと期待されている。また、糖尿病の発症や病態の解明に留まらず、遺伝子治療／再生医療を含む新しい治療法、治療薬の開発に応用されることが期待されるため、不可欠といえる研究分野であるといえる。
Zhang Y.et al., Nature 1994; 372(6505):425-432 Tartaglia LA.et al., Cell 1995; 83(7): 1263-1271
しかしながら、上記従来の２型糖尿病の研究に用いられてきたob/obマウスやdb/dbマウス等の非ヒト動物は、レプチンやその受容体の欠損による極端な肥満が起こるため、肥満を伴わない２型糖尿病患者の病態を代表しているものとは言い難い。
すなわち、レプチンやレプチン受容体に変異をもつ糖尿病患者は極めて希であり、一般的な２型糖尿病の研究に用いる非ヒト動物としては必ずしも好適ではなかった。
また、KKマウスやAyマウスなどといったその他の非ヒト動物が２型糖尿病の研究に用いられることもあるが、これらの非ヒト動物も肥満を伴う上、原因遺伝子が未だ不明であり、実用研究での使用は困難であるという問題があった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、日本人に多い非肥満型の２型糖尿病と類似の病態を自然発症する新しい２型糖尿病モデル非ヒト動物を提供することを課題としている。
また本発明は、非ヒト動物を２型糖尿病モデル非ヒト動物として使用する方法、及び、Cdkal1異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することも課題としている。
上記従来の課題を解決するために、請求項１に係る本発明では、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物とした。
また、請求項２に係る本発明では、請求項１に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物において、Cdkal1遺伝子の１又は複数のエキソンを含む所定領域の３’側非翻訳領域と５’側非翻訳領域とに部位特異的組み換え酵素認識配列を有する非ヒト動物と、前記部位特異的組み換え酵素認識配列を認識して前記所定領域を切り出し可能な部位特異的組み換え酵素の遺伝子が、膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータの下流に発現可能に挿入された非ヒト動物と、を交配させることにより作製されたことに特徴を有する。
また、請求項３に係る本発明では、請求項２に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物において、前記所定領域は、少なくともエキソン５を含むことに特徴を有する。
また、請求項４に係る本発明では、請求項１〜３いずれか１項に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物において、前記非ヒト動物が、齧歯目動物であることに特徴を有する。
また、請求項５に係る本発明では、請求項４に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物において、前記齧歯目動物が、マウスであることに特徴を有する。
また、請求項６に係る本発明では、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した非ヒト動物を、２型糖尿病モデル非ヒト動物として使用する方法とした。
また、請求項７に係るCdkal1異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法では、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物に被験物質を投与して、該非ヒト動物の２型糖尿病の程度を評価することとした。
また、請求項８に係る本発明では、請求項７に記載のCdkal1異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法において、前記被験物質を、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した非ヒト動物と、野生型非ヒト動物とに投与して、両非ヒト動物を比較・評価することに特徴を有する。
また、請求項９に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物の作製方法では、Cdkal1遺伝子の機能を、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損させることとした。
請求項１に係る本発明では、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物としたため、日本人に多い非肥満型の２型糖尿病と類似の病態を自然発症する新しい２型糖尿病モデル非ヒト動物を提供することができる。
また、膵臓において、臓器特異的にCdkal1遺伝子がノックアウトされることとなるため、膵臓以外の部位でのCdkal1遺伝子の発現に影響を及ぼすおそれがない。それゆえ、本発明に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物を例えば試験・研究等に供した場合には、対照となる野生型の非ヒト動物と比較する際に、膵臓以外の部位でのCdkal1遺伝子の発現の差異について考慮する必要がなく、前記野生型の非ヒト動物を対照としてより正確な比較実験を行うことができる。
また、請求項２に係る本発明では、Cdkal1遺伝子の１又は複数のエキソンを含む所定領域の３’側非翻訳領域と５’側非翻訳領域とに部位特異的組み換え酵素認識配列を有する非ヒト動物と、前記部位特異的組み換え酵素認識配列を認識して前記所定領域を切り出し可能な部位特異的組み換え酵素の遺伝子が、膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータの下流に発現可能に挿入された非ヒト動物と、を交配させることにより作製したため、膵臓で臓器特異的に部位特異的組み換え酵素が発現して前記所定領域を切り出し、正常なCdkal1遺伝子の発現を妨げることができる。
また、請求項３に係る本発明では、前記所定領域は、少なくともエキソン５を含むこととしたため、膵臓で臓器特異的に、正常なCdkal1遺伝子の発現をより確実に妨げることができる。
また、請求項４に係る本発明では、前記非ヒト動物が、齧歯目動物であることとしたため、実験等に広く使用される動物でありながら、２型糖尿病の病態を表す２型糖尿病モデル非ヒト動物を提供することができる。
また、請求項５に係る本発明では、前記齧歯目動物が、マウスであることとしたため、実験等に広く使用され、また、多くの知見が得られている動物でありながら、２型糖尿病の病態を表す２型糖尿病モデル非ヒト動物を提供することができる。
また、請求項６に係る本発明では、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した非ヒト動物を、２型糖尿病モデル非ヒト動物として使用する方法としたため、非ヒト動物を２型糖尿病モデル非ヒト動物として使用する方法を提供することができる。
また、請求項７に係る本発明では、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物に被験物質を投与して、該非ヒト動物の２型糖尿病の程度を評価することとしたため、Cdkal1異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
また、請求項８に係る本発明では、前記被験物質を、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した非ヒト動物と、野生型非ヒト動物とに投与して、両非ヒト動物を比較・評価することとしたため、発症した２型糖尿病の病態を野生型非ヒト動物と比較できるCdkal1異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
また、請求項９に係る本発明では、Cdkal1遺伝子の機能を、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損させる２型糖尿病モデル非ヒト動物の作製方法としたため、日本人に多い非肥満型の２型糖尿病と類似の病態を自然発症する新しい２型糖尿病モデル非ヒト動物を作出可能な方法を提供することができる。
Cdkal1遺伝子の構造を示した説明図である。 本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物を作製するための概念を示した説明図である。
本発明は、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物を提供するものである。
Cdkal1遺伝子は、２型糖尿病の危険因子であることが知られている。（Science (2007) 316, 1331; Science (2007) 316, 1336; Science (2007) 316, 1341; Nat Genet (2007) 39, 770）
しかしながら、このCdkal1遺伝子から発現するCdkal1の機能は未だ解明されておらず、何故にCdkal1遺伝子と２型糖尿病とが関連するのかは不明の状態であった。
一方、本発明者らは、このCdkal1遺伝子と２型糖尿病との関連性について鋭意研究を行うことにより、Cdkal1遺伝子領域に特異的な変異（一塩基多型）を持つ人は、変異を持たない人と比べて膵臓β細胞からのインスリン分泌が有意に低下しており、これに基づき２型糖尿病が発症しやすくなっていることを新たに見出した。
具体的には、Cdkal1は、tRNAを化学修飾する酵素であって、インスリンを翻訳する際に、tRNAを修飾することによって翻訳を促進する機能が推定されている。
そして、この新たな発見に着想を得た本発明者らは、膵臓β細胞特異的にCdkal1遺伝子を欠損させたノックアウト非ヒト動物の作製を行い、本発明を完成させたのである。
以下に説明する本実施形態において、Cdkal1遺伝子の機能が膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物とは、Cdkal1をコードする非ヒト動物の膵臓のβ細胞における内在性遺伝子が破壊、欠損、置換等の遺伝子変異により不活性化され、Cdkal1を発現する機能を失った非ヒト動物をいう。
ここで非ヒト動物は、哺乳類に属する非ヒト動物、例えば、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。すなわち、Cdkal1をコードする内在性遺伝子を備えた非ヒト動物であって、実験用に用いられるものであれば、特に限定されるものではない。
また、本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物は、Cdkal1遺伝子の１又は複数のエキソンを含む所定領域の３’側非翻訳領域と５’側非翻訳領域とに部位特異的組み換え酵素認識配列を有する非ヒト動物と、前記部位特異的組み換え酵素認識配列を認識して前記所定領域を切り出し可能な部位特異的組み換え酵素の遺伝子が、膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータの下流に発現可能に挿入された非ヒト動物と、を交配させることにより作製されたものであっても良い。
本実施形態において、部位特異的組換え酵素とは、部位特異的組換えの過程、即ちＤＮＡの分子内あるいは分子間の特定部位で起こる組換えの過程を触媒する酵素を意味する。また、部位特異的組み換え酵素認識配列とは、部位特異的組み換え酵素の認識配列である所定の塩基配列を意味する。部位特異的組換え酵素は認識配列に挟まれたＤＮＡ断片を切り出し環状化させる機能を持つが、逆の反応（環状分子を認識配列を介して挿入する）も行う。
ここで、本実施形態における部位特異的組換え酵素や、部位特異的組み換え酵素認識配列としては、特に制限はないが、例えばFRT配列を認識する出芽酵母由来のFLP recombinase、味噌醤油酵母(Zygosaccharomyces rouxii)由来のＲ／ＲＳシステムにおけるRS配列を認識する酵素R(Onouchi H et al. (1995) Mol． Gen． Genet． 247, 653-660、Onouchi H et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 6373-6378)、bacteriophage P1由来のCre/lox(Cre/loxP)システムにおけるlox(loxP)配列を認識する酵素Cre(Albert H et al. (1995) Plant J. 7, 649-659、Liu Q et al. (1998) Current Biol. 8, 1300-1309、Abmemski K et al. (1983) Cell 32, 1301-1311)などが例示できる。
また、部位特異的組み換え酵素の遺伝子の上流側に配置されるプロモータは、例えば、インスリンのプロモータや、PDX1のプロモータなど、２型糖尿病モデルとする非ヒト動物の膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータであれば特に限定されるものではない。
また、本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物は、前述の部位特異的組み換え酵素により切り出される２以上の部位特異的組み換え酵素認識配列によって囲まれた所定領域は、少なくともエキソン５を含むこととするのが好ましい。
図１にも示すように、Cdkal1遺伝子は、27のエキソンを有している。なお、図１では、右側を５’側、左側３’側として示している。図１中において、白抜きで示したエキソンは、少なくともβ細胞においてスプライシングにより翻訳されないエキソンである。また、図１中の数値は、各エキソン間の塩基数を示している。
Cdkal1遺伝子中に複数あるエキソンのうち、エキソン１〜エキソン３は、前述のように、タンパク質をコードしていないエキソンであることが明らかとなっているため、このエキソン１〜エキソン３を欠損させた場合であっても、Cdkal1の発現を阻止することは不可能である。また、エキソン４は、タンパク質をコードしているエキソンであるが、本発明者らの研究により、このエキソン４を欠損させても、さらに下流域のエキソンが、正しい読み枠で翻訳されてしまう可能性があると考えられる。
また、エキソン６以降のエキソンを欠損させた場合であっても、Cdkal1の発現を阻止することは可能であると考えられるが、前述の部位特異的組み換え酵素の切り出し長さに限界があり、良好な切り出しが行われない可能性も考えられる。
併せて、欠損させるエキソンは、できるだけ上流側である方が、翻訳産物がCdkal1様の機能を発現してしまう可能性を低くすることができる。
そこで、Cdkal1遺伝子の少なくともエキソン５を欠損させることにより、Cdkal1の発現を確実に阻止することができ、しかも、部位特異的組み換え酵素による前記所定領域の切り出しを良好とすると共に、翻訳産物がCdkal1様の機能を発現してしまうのを防ぐことができる。
また、本発明者らが本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物（Cdkal1ノックアウトマウス）及び野生型マウスを用いて糖負荷試験を行った結果、後に詳述するが、Cdkal1ノックアウトマウスの血糖値が野生型マウスより有意に高く、Cdkal1ノックアウトマウスに耐糖機能の異常が見られた。一方、Cdkal1ノックアウトマウスでは１型糖尿病に特徴的な体重の増加が認められなかった。
このように、本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物は、ヒト２型糖尿病の病態を有するの２型糖尿病の病態を極めて良好に再現するものである。
また、本実施形態に係る２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法としては、本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物に被験物質を投与して、該非ヒト動物の２型糖尿病の程度を評価する方法であれば特に制限されるものではなく、被験物質の投与方法としては、例えば、経口投与、静脈内投与、経腹投与、など様々な投与方法を挙げることができる。
また、２型糖尿病の程度を評価する方法としては、非ヒト動物の空腹時の血糖値や糖負荷時の血糖値を調べたり、血中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）濃度の値を調べる方法を挙げることができる。
また、２型糖尿病の程度を評価するに際しては、前記被験物質を、Cdkal1遺伝子の機能が膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した非ヒト動物と、野生型非ヒト動物とに投与して、両非ヒト動物を比較・評価するのが好ましい。
なお、本実施形態における野生型の非ヒト動物とは、上記Cdkal1遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物を好適に例示することができる。また上記Cdkal1遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるものが、Cdkal1欠損型と同腹の野生型を得ることができ、これらを用いて正確な比較実験をすることができる点で好ましい。そして上記のように、Cdkal1遺伝子の２型糖尿病モデル非ヒト動物の好適例としては、Cdkal1ノックアウトマウスを、野生型マウスとしては該ノックアウトマウスと同腹の野生型マウスを、それぞれ具体的に挙げることができる。
このように、本実施形態に係る２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法は、糖尿病治療薬の開発に貢献できるものであると言える。
また、本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物の作製方法によれば、非ヒト動物のCdkal1遺伝子の機能を、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損させることとしている。
この作製方法における非ヒト動物は、特に限定されるものではないが、一般に実験等で使用される系統が明確な非ヒト動物であるのが好ましい。例えば、野生で捕獲した非ヒト動物を用いて、本実施形態に係る作製方法にて２型糖尿病モデル非ヒト動物を作出することも可能であるが、遺伝的に不明な部分や、系統的に不明な部分が多くあるため、系統が明確な非ヒト動物を用いる方が、２型糖尿病の研究や２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニングに好適である。
以下、本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物について、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって、作製手順に従いながら具体的に説明する。
〔ターゲッティングベクターの調製〕
本実施形態において使用するターゲッティングベクターは、図２に示すストラテジーに基づいて作製した。
具体的には、まず、Bac clone からCdkal断片(2856-8800)（配列番号１）のPCR産物を得て、以下の制限酵素サイトを利用してpBSIISKにサブクローニングを行った。
PspOMI - Cdkal1(2856-8800) - XhoI……（１）
次に、loxP配列を含むように設計したプライマーを用い、Bac clone からCdkal断片(8801-9800)（配列番号２）の5'上流側にloxP配列（配列番号３）を含むPCR産物を得て、以下の制限酵素サイトを利用してpBSIISKにサブクローニングした。
XhoI - loxP-Cdkal1(8801-9800) - NotI……（２）
次に、loxP配列を含むように設計したプライマーを用い、Bac cloneからCdkal1断片(9801-12500)（配列番号４）の3'下流側にloxP配列を含むPCR産物を得て、以下の制限酵素サイトを利用してpBSIISKにサブクローニングした。
NotI - Cdkal1(9801-12500) - SacII……（３）
次に、下記の通りNeomycin耐性遺伝子（配列番号５）やFRT配列（配列番号６）を含む予め作製しておいたベクター(pBS-FRT-Neor-FRT-loxP)に、（３）のCdkal1の断片を挿入した。
Vector: pBS-FRT-Neor-FRT-loxP NotI-SacII digest
Insert: pBSIISK + Cdkal1(9801-12500) NotI-SacII digest
Construct1: pBS-FRT-Neor-FRT-loxP-Cdkal1(9801-12500)
次に、下記の通りCdkal1断片（１）及び（２）を連結した。
Vector: pBSIISK+ Cdkal1(2856-8800) XhoI-NotI digest
Insert: pBSIISK+ loxP-Cdkal1(8801-9800) XhoI-NotI digest
Construct2: pBSIISK+ Cdkal1(2856-8800)- loxP-Cdkal1(8801-9800)
次に、下記の通りネガティブ選択マーカーとしてジフテリア毒素フラグメント(DTA)（配列番号７）をConstruct2に入れた。
Vector: Construct2 PspOMI digest
Insert: pBS-DTA NotI-PspOMI digest
Construct3: pBSIISK+ DTA- Cdkal1(2856-8800)- loxP-Cdkal1(8801-9800)
そして、下記の通り完全なターゲッティングベクター（配列番号８）を構築した。
Vector: Construct3 NotI-SacII digest
Insert: Construct1 PspOMI-SacII digest
Construct4: pBSIISK+DTA-Cdkal1(2856-8800)-loxP-Cdkal1(8801-9800)- FRT-Neor-FRT-loxP-Cdkal1(9801-12500)
〔マウスES細胞への導入及び組換細胞のスクリーニング〕
上述のようにして得られたターゲッティングベクターを線状化したのち、エレクトロポレーション（電気穿孔）法によってマウスES細胞に導入し、G418（ネオマイシン）に抵抗性を持つES細胞の中から相同組み替えにより、内在性Cdkal1遺伝子がターゲッティングベクターに含まれる外来Cdkal1遺伝子に置き換わったES細胞を選択した。なお、マウスES細胞は、C57BL6由来のES細胞を用いた。
〔キメラマウスの作製〕
スクリーニングされたES細胞をマウス（C57BL6）の胚盤胞中にインジェクションし、胚盤胞を仮親のマウス子宮に戻し、キメラマウスを作製した。
〔２型糖尿病モデル非ヒト動物（マウス）の作製〕
次に、得られたキメラマウスを用いて、２型糖尿病モデル非ヒト動物（マウス）の作製を行った。なお、各マウスの遺伝子型等の検証については、それぞれのマウスの尻尾等から組織を採取し、ＤＮＡを精製してＰＣＲ法により行っている。
まず、得られたキメラマウスを野生型マウスと交配させ、ヘテロ接合体マウス(Cdkalflox/+,neomycin/+)を得た。
次に、このヘテロ接合体マウス(Cdkalflox/+,neomycin/+)を、FLP発現マウスと交配させ、ネオマイシン遺伝子が除去されたヘテロ接合体マウス(Cdkalflox/+)を得た。
次に、得られたネオマイシン遺伝子が除去されたヘテロ接合体マウス(Cdkalflox/+)同士を交配させ、ネオマイシン遺伝子が除去されたホモ接合体マウス(Cdkalflox/flox)を得た。
次いで、得られたホモ接合体マウス(Cdkalflox/flox)と、ラットインスリンプロモーター配列をもつCreリコンビナーゼ遺伝子を有するRIP-Creマウスと交配させ、RIP-Cre遺伝子を有するヘテロ接合体マウス（Cdkal1flox/+, RIP-Cre/0）を得る。なお、このヘテロ接合体マウス（Cdkal1flox/+, RIP-Cre/0）は、本実施形態において、膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータの下流に発現可能に挿入された非ヒト動物としての役割を担うものである。
次に、このヘテロ接合体マウス（Cdkal1flox/+, RIP-Cre/0）と、ネオマイシン除去ホモ接合体マウス(Cdkalflox/flox)を交配させる。ここで、このホモ接合体マウス(Cdkalflox/flox)は、Cdkal1遺伝子の１又は複数のエキソンを含む所定領域の３’側非翻訳領域と５’側非翻訳領域とに部位特異的組み換え酵素認識配列を有する非ヒト動物としての役割を担うものである。
そして、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物としての、Cdkal1欠損マウス（Cdkal1flox/flox, RIP-Cre/0）を得た。
次に、野生型のマウスと、上述の方法により作出した本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物（マウス）（以下、「ノックアウトマウス」ともいう。）とを用い、体重及び血糖値の経時変化について検証を行った。
〔体重の経時変化の検証〕
雄マウス（野生型４匹、ノックアウトマウス６匹）、雌マウス（野生型９匹、ノックアウトマウス７匹）を用いて、３週齢から７週齢までの体重の変化を測定した。その結果を表１に示す。
Figure 2011058994
 表１にも示すように、雄マウス及び雌マウスともに、野生型とノックアウトマウスとの間に、顕著な体重経時変化の差異は見られず、また、反復測定2元配置分散分析(Two- way repeated measure ANOVA)による有意差検定においても、有意差はなかった。すなわち、ノックアウトマウスでは、１型糖尿病に特徴的な体重の増加が認められなかった。
〔血糖値の経時変化の検証〕
５週齢の雄マウス（野生型４匹、ノックアウトマウス６匹）、及び、雌マウス（野生型９匹、ノックアウトマウス７匹）を用いて、血糖値の経時変化について検証を行った。
試験方法は、一晩絶食させたそれぞれのマウスに対して、0.1g/mlのグルコース溶液を体重１ｇ辺り１mg経腹投与し、投与直後から90分後までの血糖値の変化を採血して測定した。その結果を表２に示す。
Figure 2011058994
 表２にも示すように、雄マウス及び雌マウスともに、野生型とノックアウトマウスとの間に、顕著な血糖値変化の差異が認められた。すなわち、雄雌にかかわらず、ノックアウトマウスは、野生型に比して、血糖値のピークを迎えた後の低下割合が鈍化する傾向が見られた。
また、反復測定2元配置分散分析(Two- way repeated measure ANOVA)による有意差検定においても、野生型とノックアウトマウスとの間に、有意な差が認められた（雄マウス：p<0.01、雌マウス：p<0.0001）。すなわち、ノックアウトマウスでは、体重の増加が認められず、高血糖状態が持続するという２型糖尿病に特徴的な病態が観察された。
〔高脂肪食を与えた時の体重変化の検証〕
次に、ノックアウトマウス（KO）及び野生型マウス(WT)に対し、総カロリーのうち脂肪由来のカロリーが４５％となるような高脂肪食(HFD)、又は総カロリーのうち脂肪由来のカロリーが１０％となるような低脂肪食(LFD)を９週間にわたり与え、体重変化を測定した。その結果を表３に示す。
Figure 2011058994
 表３にも示すように、高脂肪食を摂取したKOマウスの体重と、高脂肪食を摂取したWTマウスの体重とを比較しても、両者の体重に顕著な差は認められなかった。また、分散分析(ANOVA)による有意差検定においても、有意な差は認められなかった。
〔高脂肪食を３週間与えた後の血糖値の経時的変化の検証〕
次に、KOマウス及びWTマウスを午前８時から７時間絶食させた後、１ｇブドウ糖／ｋｇ体重となるようにマウスにブドウ糖液を経腹投与し、経時的に尾より血液を採取し、血糖値を測定した。その結果を表４に示す。
Figure 2011058994
 分散分析(ANOVA)による有意差検定の結果、高脂肪食を３週間摂取したKOマウスは他のすべての実験群よりピークの血糖値が有意に高かった。一方、３週間高脂肪食を摂取したWTマウスにおいては、血糖値の変化は低脂肪食を摂取したWTマウスと比して差異が認められなかった。すなわち、高脂肪食を摂取したKOマウスは、体重の増加が認められず、高脂肪による血糖値コントロールの悪化という２型糖尿病に見られる病態が観察された。
〔高脂肪食を９週間与えた後の血糖値の経時的変化の検証〕
次に、KOマウス及びWTマウスを午前８時から７時間絶食させた後、１ｇブドウ糖／ｋｇ体重となるようにマウスにブドウ糖液を経腹投与し、経時的に尾より血液を採取し、血糖値を測定した。その結果を表５に示す。
Figure 2011058994
 高脂肪食を９週間摂取したKOマウスでは、高脂肪食又は低脂肪食を摂取したWTマウスと比して、ピーク時の血糖値のみならず、２時間後の血糖値も著しく高かった。すなわち、高脂肪食を９週間にわたり摂取したＫOマウスでは、高脂肪の長期摂取による２型糖尿病の悪化という病態が見られた。
〔高脂肪食を８週間与えた後の血中インスリン量の経時的変化の検証〕
次に、高脂肪食を摂取したKOマウス又はWTマウスを午前８時から７時間絶食させた後、１ｇブドウ糖／ｋｇ体重となるようにマウスにブドウ糖液を経腹投与し、経時的に尾より血液を採取し、血中インスリン量をELIZA法により測定した。その結果を表６に示す。
Figure 2011058994
 高脂肪食を摂取したKOマウスでは、WTマウスと比して、ブドウ糖投与後のインスリン分泌が有意に低下した（p<0.05）。すなわち、高脂肪食を摂取したKOマウスでは、インスリン分泌能の低下という２型糖尿病の病態が見られた。
〔高脂肪食を３週間与えた後の空腹時血糖値の検証〕
次に、高脂肪食又は低脂肪食を３週間摂取した時点で、マウスを午前８時から７時間絶食させたのち、尾より血液を採取し、空腹時血糖値を測定した。その結果を表７に示す。
Figure 2011058994
 高脂肪食を摂取したKOマウスでは、高脂肪食を摂取したWTマウスと比して、空腹時血糖値が有意に高かった。一方、低脂肪食を摂取したKOマウスでは、WTマウスと比して差異が認められなかった。すなわち、高脂肪を摂取したKOマウスでは、空腹時血糖値の上昇という２型糖尿病の病態が見られた。
〔高脂肪食を３週間与えた後の随時血糖値の検証〕
次に、高脂肪食又は低脂肪食を３週間摂取した時点で、午前１０時に尾より血液を採取し、随時血糖値を測定した。その結果を表８に示す。
Figure 2011058994
 高脂肪食を摂取したKOマウスでは、高脂肪食を摂取したWTマウスと比して、随時血糖値が有意に高かった。一方、低脂肪食を摂取したKOマウスでは、WTマウスと比して差異が認められなかった。すなわち、高脂肪を摂取したKOマウスでは、随時血糖値の上昇という２型糖尿病の病態が見られた。
〔高脂肪食を８週間与えた後のインスリン感受性の検証〕
次に、高脂肪食を摂取したKOマウス又はWTマウスを１U／ｋｇ体重となるようにインスリンを経腹投与し、経時的に尾より血液を採取し、血糖値を測定した。その結果を表９に示す。
Figure 2011058994
 すべての実験群において、インスリン投与による血糖値の低下度合いに差異が認められなかった。すなわち、高脂肪食を摂取したKOマウスは、インスリン抵抗性を有する２型糖尿病ではなく、インスリン分泌不全による２型糖尿病の病態が見られた。
〔Cdkal1異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング〕
上記〔血糖値の経時変化の検証〕に用いたノックアウトマウスに対し、２型糖尿病治療薬として知られているGlucagon-like peptide-1受容体のアゴニストであるExendin-4を被験物質として経腹投与し、ノックアウトマウスの２型糖尿病の程度を評価することで、Cdkal1異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニングを模擬的に行った。
２型糖尿病の程度を評価する方法としては、野生型とノックアウトマウスの空腹時の血糖値や糖負荷時の血糖値を調べ、両者を比較・評価することにより行った。また、Exendin-4は、体重１ｋｇ当たり0.1mgを一日２回、２週間投与した。その結果を表１０に示す。
Figure 2011058994
 表１０にも示すように、Exendin-4の投与前後においてグルコース負荷１５分後の血糖値は、KOがWTマウスより有意に高かった（*p<0.05, **p<0.01)。一方、Exendin-4を投与して１週間後及び２週間後の結果を参照すると、WT及びKOマウスともにExendin-4投与による耐糖能の改善が有意に見られた(ANOVAによる検定p=0.02)。
これらの結果より、本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物では、Exendin-4の投与により、耐糖能が改善されることが示された。
すなわち、２型糖尿病予防・治療剤としての機能が未知の被験物質を、本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物に投与することにより、２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニングが可能であることが示唆された。
上述してきたように、本実施形態に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物では、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物としたため、日本人に多い非肥満型の２型糖尿病と類似の病態を自然発症する新しい２型糖尿病モデル非ヒト動物を提供することができる。
しかも、膵臓において、臓器特異的にCdkal1遺伝子がノックアウトされることとなるため、膵臓以外の部位でのCdkal1遺伝子の発現に影響を及ぼすおそれがない。それゆえ、本発明に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物を例えば試験・研究等に供した場合には、対照となる野生型の非ヒト動物と比較する際に、膵臓以外の部位でのCdkal1遺伝子の発現の差異について考慮する必要がなく、前記野生型の非ヒト動物を対照としてより正確な比較実験を行うことができる。
また、特開2006-034132号公報に記載の２型糖尿病発症マウスのように、野生で捕獲したマウスを交配させて作製したものと異なり、系統が明確であることから、より正確な２型糖尿病の研究や、２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニングに寄与することができるものと言える。
最後に、上述した各実施の形態の説明は本発明の一例であり、本発明は上述の実施の形態に限定されることはない。このため、上述した各実施の形態以外であっても、本発明に係る技術的思想を逸脱しない範囲であれば、設計等に応じて種々の変更が可能であることは勿論である。
【０００３】
グ方法を提供することも課題としている。
課題を解決するための手段
［００１５］
上記従来の課題を解決するために、請求項１に係る本発明では、Ｃｄｋａｌ１遺伝子のエキソン５の３’側非翻訳領域と５’側非翻訳領域とに部位特異的組み換え酵素認識配列を有する非ヒト動物と、前記部位特異的組み換え酵素認識配列を認識して前記所定領域を切り出し可能な部位特異的組み換え酵素の遺伝子が、膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータの下流に発現可能に挿入された非ヒト動物と、を交配させることにより作製された、Ｃｄｋａｌ１遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物とした。
［００１６］
また、請求項２に係る本発明では、Ｃｄｋａｌ１遺伝子の少なくともエキソン５を含む所定領域の３’側非翻訳領域と５’側非翻訳領域とに部位特異的組み換え酵素認識配列を有する非ヒト動物と、前記部位特異的組み換え酵素認識配列を認識して前記所定領域を切り出し可能な部位特異的組み換え酵素の遺伝子が、膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータの下流に発現可能に挿入された非ヒト動物と、を交配させることにより作製された、Ｃｄｋａｌ１遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物とした。
［００１７］
また、請求項３に係る本発明では、Ｃｄｋａｌ１遺伝子のエキソン５のみが膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠失され、Ｃｄｋａｌ１遺伝子産物におけるｔＲＮＡを修飾することによってインスリンの翻訳を促進する機能を膵臓のβ細胞において特異的に欠損させた２型糖尿病モデル非ヒト動物とした。
［００１８］
また、請求項４に係る本発明では、高脂肪食を施餌した場合には２型糖尿病の病態が発現し、低脂肪食を施餌した場合には、前記病態が発現しないことを特徴とする請求項３に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物とした。
［００１９］
また、請求項５に係る本発明では、Ｃｄｋａｌ１遺伝子のエキソン５の３’側非翻訳領域と５’側非翻訳領域とに部位特異的組み換え酵素認識配列を有する非ヒト動物と、前記部位特異的組み換え酵素認識配列を認識して前記所定領
【０００４】
域を切り出し可能な部位特異的組み換え酵素の遺伝子が、膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータの下流に発現可能に挿入された非ヒト動物と、を交配させることにより作製された、ｔＲＮＡを修飾することによってインスリンの翻訳を促進するＣｄｋａｌ１遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物とした。
［００２０］
また、請求項６に係る本発明では、請求項１〜５いずれか１項に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物において、前記非ヒト動物が、齧歯目動物であることに特徴を有する。
［００２１］
また、請求項７に係る本発明では、請求項６に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物において、前記齧歯目動物が、マウスであることに特徴を有する。
［００２２］
また、請求項８に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物の飼育方法では、Ｃｄｋａｌ１遺伝子の少なくともエキソン５を含む所定領域の３’側非翻訳領域と５’側非翻訳領域とに部位特異的組み換え酵素認識配列を有する非ヒト動物と、前記部位特異的組み換え酵素認識配列を認識して前記所定領域を切り出し可能な部位特異的組み換え酵素の遺伝子が、膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータの下流に発現可能に挿入された非ヒト動物と、を交配させることにより作製された、Ｃｄｋａｌ１遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物に低脂肪食を施餌して２型糖尿病の発現を抑制しながら飼育することとした。
［００２３］
また、請求項９に係る本発明では、Ｃｄｋａｌ１遺伝子産物におけるｔＲＮＡを修飾することによってインスリンの翻訳を促進する機能が、膵臓のβ細胞で特異的に欠損した非ヒト動物を、２型糖尿病モデル非ヒト動物として使用することとした。
また、請求項１０に係るＣｄｋａｌ１異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法では、Ｃｄｋａｌ１遺伝子産物におけるｔＲＮＡを修飾することによってインスリンの翻訳を促進する機能が、膵臓のβ細胞で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物に被験物質を投与して、該非ヒト動物の２型糖尿病の程度を評価することとした。
【０００５】
また、請求項１１に係る本発明では、請求項１０に記載のＣｄｋａｌ１異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法において、Ｃｄｋａｌ１遺伝子産物におけるｔＲＮＡを修飾することによってインスリンの翻訳を促進する機能が膵臓のβ細胞で特異的に欠損した非ヒト動物と、野生型非ヒト動物と、に前記被験物質を投与して、両非ヒト動物を比較・評価することとした。
また、請求項１２に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物の作製方法では、Ｃｄｋａｌ１遺伝子産物がｔＲＮＡを修飾することによってインスリンの翻訳を促進する機能を、膵臓のβ細胞で特異的に欠損させることとした。
発明の効果
［００２４］
請求項１〜７に係る本発明によれば、日本人に多い非肥満型の２型糖尿病と類似の病態を自然発症する新しい２型糖尿病モデル非ヒト動物を提供することができる。
［００２５］
また、膵臓において、臓器特異的にＣｄｋａｌ１遺伝子がノックアウトされることとなるため、膵臓以外の部位でのＣｄｋａｌ１遺伝子の発現に影響を及ぼすおそれがない。それゆえ、本発明に係る２型糖尿病モデル非ヒト動物を例えば試験・研究等に供した場合には、対照となる野生型の非ヒト動物と比較する際に、膵臓以外の部位でのＣｄｋａｌ１遺伝子の発現の差異について考慮する必要がなく、前記野生型の非ヒト動物を対照としてより正確な比較実験を行うことができる。
［００２６］
また、請求項８に係る本発明によれば、低脂肪食を摂取した場合の影響を観察することができる。
［００２７］
また、請求項９に係る本発明によれば、非ヒト動物を２型糖尿病モデル非ヒト動物として使用する方法を提供することができる。
［００２８］
また、請求項１０及び１１に係る本発明では、Ｃｄｋａｌ１異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
［００２９］
また、請求項１２に係る本発明では、日本人に多い非肥満型の２型糖尿病と類似の病態を自然発症する新しい２型糖尿病モデル非ヒト動物を作出可能な方法を提供することができる。
［００３０］
［００３１］
［００３２］
［００３３］

Claims (9)

  1. Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物。
  2. Cdkal1遺伝子の１又は複数のエキソンを含む所定領域の３’側非翻訳領域と５’側非翻訳領域とに部位特異的組み換え酵素認識配列を有する非ヒト動物と、
    前記部位特異的組み換え酵素認識配列を認識して前記所定領域を切り出し可能な部位特異的組み換え酵素の遺伝子が、膵臓で特異的に発現する遺伝子のプロモータの下流に発現可能に挿入された非ヒト動物と、を交配させることにより作製されたことを特徴とする請求項１に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物。
  3. 前記所定領域は、少なくともエキソン５を含むことを特徴とする請求項２に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物。
  4. 前記非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物。
  5. 前記齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項４に記載の２型糖尿病モデル非ヒト動物。
  6. Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した非ヒト動物を、２型糖尿病モデル非ヒト動物として使用する方法。
  7. Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した２型糖尿病モデル非ヒト動物に被験物質を投与して、該非ヒト動物の２型糖尿病の程度を評価することを特徴とする、Cdkal1異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法。
  8. 前記被験物質を、Cdkal1遺伝子の機能が、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損した非ヒト動物と、野生型非ヒト動物とに投与して、両非ヒト動物を比較・評価することを特徴とする請求項７に記載のCdkal1異常に起因する２型糖尿病予防・治療剤のスクリーニング方法。
  9. Cdkal1遺伝子の機能を、膵臓のβ細胞の染色体上で特異的に欠損させる２型糖尿病モデル非ヒト動物の作製方法。
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