JPWO2010123073A1 - Assay method using plasmon excitation sensor with stimulus-responsive polymer - Google Patents
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Abstract
[課題]本発明は、SPRのシグナルを向上させるのみならずSPFSによる蛍光シグナルを向上させることができる高感度かつ高精度なアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットを提供することを目的とする。[解決手段]下記工程(a)〜(e)を含むことを特徴とするアッセイ法;工程(a):特定のプラズモン励起センサに検体を接触させる工程,工程(b):工程(a)のセンサに、第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程,工程(c):工程(b)のセンサに、外部刺激を加える工程,工程(d):工程(c)のセンサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面からプリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程,および工程(e):工程(d)で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。[PROBLEMS] To provide a high-sensitivity and high-accuracy assay method capable of improving not only the SPR signal but also the fluorescence signal by SPFS, the assay device, and the assay kit. And [Solution] An assay method comprising the following steps (a) to (e); step (a): contacting a specimen with a specific plasmon excitation sensor, step (b): step (a) A step of reacting a conjugate of a second ligand and a fluorescent dye to the sensor, step (c): a step of applying an external stimulus to the sensor of step (b), step (d): a sensor of step (c) Irradiating a laser beam from a surface opposite to the surface on which the metal thin film is formed of the transparent flat substrate having a laser beam via a prism and measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye; and Step (e): A step of calculating the amount of analyte contained in the sample from the measurement result obtained in step (d).
Description
本発明は、刺激応答性ポリマーを有するプラズモン励起センサを用いたアッセイ法に関する。より詳細には、本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔SPFS;Surface Plasmon−field enhanced Fluorescence Spectroscopy〕および表面プラズモン共鳴〔SPR;Surface Plasmon Resonance〕の原理に基づいた該センサを用いるアッセイ法,該アッセイ用装置ならびに該アッセイ用キットに関する。 The present invention relates to an assay method using a plasmon excitation sensor having a stimulus-responsive polymer. More particularly, the present invention relates to an assay using the sensor based on the principle of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) and surface plasmon resonance [SPR]. The present invention relates to the assay device and the assay kit.
SPR〔表面プラズモン共鳴〕とは、照射したレーザ光が金属薄膜表面で全反射減衰〔ATR〕する条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に発生させた粗密波(表面プラズモン)と、誘電率(または屈折率)の差異による影響を受け易いエバネッセント波との波数が一致したとき両者が共鳴して反射光が減衰する現象であって、センサ表面においてリガンドとアナライトとが相互作用することによって誘電体の誘電率(または屈折率)に差異が生じ、その結果、表面プラズモン共鳴が変化することによって、リガンドとアナライトとの相互作用を定量することができる。 SPR (Surface Plasmon Resonance) is a condition in which the applied laser beam is subjected to total reflection attenuation [ATR] on the surface of the metal thin film [ATR]. (Or refractive index) is a phenomenon in which when the wave number of the evanescent wave, which is easily affected by the difference in refractive index, coincides, the reflected light attenuates, and the interaction between the ligand and the analyte on the sensor surface A difference occurs in the dielectric constant (or refractive index) of the dielectric, and as a result, the surface plasmon resonance is changed, whereby the interaction between the ligand and the analyte can be quantified.
SPRを利用したバイオセンサとして、図2に示すように、金属膜が形成された基板11と、該基板に結合されているポリN−イソプロピルアクリルアミドなどの刺激応答性高分子13と、該高分子に結合されている生体物質認識分子(リガンド)14とを有するバイオセンサ用測定チップが、特許文献1に開示されており、アナライトが該高分子に結合することによる屈折率変化に加え、該高分子の相転移変化による屈折率変化によってシグナルを増強させる旨記載されている。 As a biosensor using SPR, as shown in FIG. 2, a substrate 11 on which a metal film is formed, a stimulus-responsive polymer 13 such as poly-N-isopropylacrylamide bonded to the substrate, and the polymer A measurement chip for a biosensor having a biological substance recognition molecule (ligand) 14 bonded to is disclosed in Patent Document 1, and in addition to a change in refractive index caused by binding of an analyte to the polymer, It is described that the signal is enhanced by a change in refractive index due to a phase transition change of the polymer.
しかしながら、特許文献1に記載のバイオセンサ用測定チップは、外部刺激の加え方が非効率的であり、相転移の現象を有効に利用していないことから改良の余地が認められる。 However, the measurement chip for biosensor described in Patent Document 1 is inefficient in applying external stimuli, and there is room for improvement because it does not effectively use the phenomenon of phase transition.
さらに、特許文献2には、加熱や電場の印加等による刺激応答性を示す誘電体試料を、金属薄膜の一方の面に接触させるとともに表面プラズモン共鳴を誘起させ、該誘電体試料の状態(結晶−液晶相転移、相分離や配向変化など)を測定することができる測定装置が提案されている。 Further, in Patent Document 2, a dielectric sample that exhibits stimulus responsiveness due to heating, application of an electric field, or the like is brought into contact with one surface of a metal thin film and surface plasmon resonance is induced, and the state of the dielectric sample (crystal -Measurement devices capable of measuring liquid crystal phase transition, phase separation, orientation change, etc.) have been proposed.
しかしながら、特許文献2に、該誘電体試料の相転移を有効に利用するという技術的思想はない。 However, Patent Document 2 does not have a technical idea of effectively using the phase transition of the dielectric sample.
本発明は、SPFSによる蛍光シグナルを向上させるのみならず、SPRのシグナルを向上させることができる高感度かつ高精度なアッセイ法,該アッセイ用装置および該アッセイ用キットを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a high-sensitivity and high-accuracy assay method, the assay device, and the assay kit that can improve not only the fluorescence signal by SPFS but also the SPR signal. .
なお、SPFS〔表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕とは、照射したレーザ光が金属薄膜表面で全反射減衰〔ATR〕する条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に粗密波(表面プラズモン)を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし(表面プラズモンの電場増強効果)、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および/または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。 Note that SPFS (surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy) means that a dense wave (surface plasmon) is applied to the surface of the metal thin film in contact with the dielectric under the condition that the irradiated laser light is attenuated by total reflection [ATR] on the surface of the metal thin film. By increasing the photon amount of the irradiated laser light by several tens to several hundreds (the surface plasmon electric field enhancement effect), the fluorescent dye in the vicinity of the gold thin film is efficiently excited, thereby making a trace amount. And / or a method that can detect very low concentrations of analyte.
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、刺激応答性高分子に対して効率的に外部刺激を加えることによって、測定したい蛍光色素と金属薄膜との距離を短縮させ、SPFSおよびSPRの蛍光シグナルが向上することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of earnest research to solve the above problems, the present inventors have effectively reduced the distance between the fluorescent dye to be measured and the metal thin film by efficiently applying an external stimulus to the stimulus-responsive polymer, The inventors have found that the fluorescence signals of SPFS and SPR are improved, and have completed the present invention.
すなわち、本発明のアッセイ法は、少なくとも下記工程(a)〜(e)を含むことを特徴とする。
工程(a):透明平面基板と;該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と;該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層と;該層に固定化された第1のリガンドとを含むプラズモン励起センサに検体を接触させる工程,
工程(b):上記工程(a)を経て得られたプラズモン励起センサに、第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程,
工程(c):上記工程(b)を経て得られたプラズモン励起センサに、該刺激応答性ポリマーが応答し得る外部刺激を加える工程,
工程(d):上記工程(c)を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程,および
工程(e):上記工程(d)で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。That is, the assay method of the present invention includes at least the following steps (a) to (e).
Step (a): a transparent flat substrate; a metal thin film formed on one surface of the substrate; and a layer containing a stimulus-responsive polymer formed on the other surface of the thin film that is not in contact with the substrate And contacting the analyte with a plasmon excitation sensor comprising a first ligand immobilized on the layer;
Step (b): a step of reacting the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) with a conjugate of a second ligand and a fluorescent dye,
Step (c): adding an external stimulus to which the stimulus-responsive polymer can respond to the plasmon excitation sensor obtained through the step (b),
Step (d): Laser light is irradiated from the surface opposite to the surface on which the metal thin film is formed on the transparent flat substrate of the plasmon excitation sensor obtained through the step (c) via a prism. A step of measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye, and step (e): calculating the amount of analyte contained in the sample from the measurement result obtained in step (d) Process.
上記刺激応答性ポリマーは、ポリN−イソプロピルアクリルアミド,ポリメタクリレート,ポリビニルメチルエーテル,ポリアクリル酸,ポリメタクリル酸,ポリ(2−エチルアクリル酸),ポリ(2−プロピルアクリル酸),ポリ(2−ジメチルアミノ)メチルメタクリレート,ポリ(2−ジエチルアミノ)メチルメタクリレートおよびポリ(2−メトキシアニリン−5−スルホネート)からなる群から選択される少なくとも1種のポリマーであることが好ましい。 The stimuli-responsive polymer includes poly N-isopropylacrylamide, polymethacrylate, polyvinyl methyl ether, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, poly (2-ethylacrylic acid), poly (2-propylacrylic acid), poly (2- It is preferably at least one polymer selected from the group consisting of (dimethylamino) methyl methacrylate, poly (2-diethylamino) methyl methacrylate and poly (2-methoxyaniline-5-sulfonate).
上記外部刺激は、温度変化および/またはpH変化であることが好ましい。
上記金属薄膜は、金,銀,アルミニウム,銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属から形成されていることが好ましく、特に金から形成されていることが好ましい。The external stimulus is preferably a temperature change and / or a pH change.
The metal thin film is preferably formed of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper and platinum, and particularly preferably formed of gold.
上記金属薄膜の、上記透明平面基板とは接していないもう一方の表面にSAM〔自己組織化単分子膜〕が形成され、上記刺激応答性ポリマーが該SAMに固定化されていることが好ましい。 It is preferable that a SAM [self-assembled monolayer] is formed on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the transparent flat substrate, and the stimuli-responsive polymer is immobilized on the SAM.
上記検体は、血液,血清,血漿,尿,鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも1種の体液であることが好ましい。
本発明の装置は、少なくとも上記プラズモン励起センサを含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。The specimen is preferably at least one body fluid selected from the group consisting of blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva.
The apparatus of the present invention includes at least the plasmon excitation sensor and is used in the assay method.
また、本発明のキットは、透明平面基板と;該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と;該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層とを含むプラズモン励起センサ用基板を少なくとも含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。 The kit of the present invention also comprises a transparent flat substrate; a metal thin film formed on one surface of the substrate; and a stimulus-responsive polymer formed on the other surface of the thin film that is not in contact with the substrate. And a layer for containing a plasmon excitation sensor, and is used in the assay method.
本発明は、測定したい蛍光色素と金属薄膜との距離を、刺激応答性高分子に外部刺激を加え短縮させることによって、SPFSにおける蛍光シグナルを向上させるだけでなく、SPRのシグナル向上にも寄与できるアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットを提供することができる。 The present invention not only improves the fluorescence signal in SPFS but also contributes to the improvement of the SPR signal by shortening the distance between the fluorescent dye to be measured and the metal thin film by applying an external stimulus to the stimulus-responsive polymer. An assay method, the assay device and the assay kit can be provided.
以下、本発明のアッセイ法について具体的に説明する。
<アッセイ法>
本発明のアッセイ法は、少なくとも下記工程(a)〜(e)を含むことを特徴とするものであり、さらに洗浄工程を含むことが好ましい。Hereinafter, the assay method of the present invention will be specifically described.
<Assay method>
The assay method of the present invention is characterized by including at least the following steps (a) to (e), and preferably further includes a washing step.
工程(a):透明平面基板と;該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と;該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層と;該層に固定化された第1のリガンドとを含むプラズモン励起センサに検体を接触させる工程。 Step (a): a transparent flat substrate; a metal thin film formed on one surface of the substrate; and a layer containing a stimulus-responsive polymer formed on the other surface of the thin film that is not in contact with the substrate And contacting the analyte with a plasmon excitation sensor comprising a first ligand immobilized on the layer.
工程(b):上記工程(a)を経て得られたプラズモン励起センサに、第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程。
工程(c):上記工程(b)を経て得られたプラズモン励起センサに、該刺激応答性ポリマーが応答し得る外部刺激を加える工程。Step (b): A step of causing the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) to react with a conjugate of a second ligand and a fluorescent dye.
Step (c): A step of applying an external stimulus to which the stimulus-responsive polymer can respond to the plasmon excitation sensor obtained through the step (b).
工程(d):上記工程(c)を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程。 Step (d): Laser light is irradiated from the surface opposite to the surface on which the metal thin film is formed on the transparent flat substrate of the plasmon excitation sensor obtained through the step (c) via a prism. And measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye.
工程(e):上記工程(d)で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。
洗浄工程:上記工程(a)を経て得られたプラズモン励起センサの表面、および上記工程(b)を経て得られるプラズモン励起センサの表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程。Step (e): A step of calculating the amount of the analyte contained in the sample from the measurement result obtained in the step (d).
Cleaning step: a step of cleaning at least one of the surface of the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) and the surface of the plasmon excitation sensor obtained through the step (b).
[工程(a)]
工程(a)とは、透明平面基板と;該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と;該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層と;該層に固定化された第1のリガンドとを含むプラズモン励起センサに検体を接触させる工程である。[Step (a)]
Step (a) includes: a transparent flat substrate; a metal thin film formed on one surface of the substrate; and a stimulus-responsive polymer formed on the other surface of the thin film that is not in contact with the substrate. A step of bringing the analyte into contact with a plasmon excitation sensor including a layer containing; and a first ligand immobilized on the layer.
(プラズモン励起センサ)
本発明で用いるプラズモン励起センサは、透明平面基板と;該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と;該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層と;該層に固定化された第1のリガンドとを含み、さらに金属薄膜の、透明平面基板とは接していないもう一方の表面に形成されたSAM〔Self−Assembled Monolayer;自己組織化単分子膜〕を含むことが好ましく、刺激応答性ポリマーを該SAMに固定化することができる。(Plasmon excitation sensor)
The plasmon excitation sensor used in the present invention includes a transparent flat substrate; a metal thin film formed on one surface of the substrate; and a stimulus responsiveness formed on the other surface of the thin film that is not in contact with the substrate A SAM [Self-Assembled Monolayer; self comprising a layer containing a polymer; a first ligand immobilized on the layer; and a metal thin film on the other surface not in contact with the transparent flat substrate. Preferably, the stimuli-responsive polymer can be immobilized on the SAM.
また、金属薄膜による蛍光色素の金属消光を防止することを目的として、誘電体からなるスペーサ層を適宜形成してもよい。このスペーサ層は、金属薄膜の、透明平面基板と接していないもう一方の表面に形成されることが望ましい。 In addition, a spacer layer made of a dielectric may be appropriately formed for the purpose of preventing metal quenching of the fluorescent dye by the metal thin film. The spacer layer is preferably formed on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the transparent flat substrate.
(透明平面基板)
本発明において、プラズモン励起センサの構造を支持する平面基板として透明平面基板が用いられる。本発明において、平面基板として透明平面基板を用いるのは、後述する金属薄膜への光照射をこの平面基板を通じて行うからである。(Transparent flat substrate)
In the present invention, a transparent flat substrate is used as a flat substrate that supports the structure of the plasmon excitation sensor. In the present invention, the transparent flat substrate is used as the flat substrate because light irradiation to a metal thin film described later is performed through the flat substrate.
本発明で用いられる透明平面基板について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明平面基板が、ガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート〔PC〕,シクロオレフィンポリマー〔COP〕などのプラスチック製であってもよい。 As for the transparent flat substrate used in the present invention, the material is not particularly limited as long as the object of the present invention is achieved. For example, the transparent flat substrate may be made of glass, or may be made of plastic such as polycarbonate [PC] or cycloolefin polymer [COP].
また、d線(589.3nm)における屈折率〔nd〕が好ましくは1.40〜2.20であり、厚さが好ましくは0.01〜10mm、より好ましくは0.5〜5mmであれば、大きさ(縦×横)は特に限定されない。Further, the refractive index [n d] is preferably from 1.40 to 2.20 at the d-line (589.3 nm), is preferably thick if 0.01 to 10 mm, more preferably 0.5~5mm For example, the size (vertical × horizontal) is not particularly limited.
なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、ショット日本(株)製の「BK7」(屈折率〔nd〕1.52)および「LaSFN9」(屈折率〔nd〕 1.85),(株)住田光学ガラス製の「K−PSFn3」(屈折率〔nd〕1.84),「K−LaSFn17」(屈折率〔nd〕1.88)および「K−LaSFn22」(屈折率〔nd〕1.90),ならびに(株)オハラ製の「S−LAL10」(屈折率〔nd〕1.72)などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。In addition, the transparent transparent substrate made of glass is “BK7” (refractive index [n d ] 1.52) and “LaSFN9” (refractive index [n d ] 1.85) manufactured by Shot Japan Co., Ltd. as commercially available products. “K-PSFn3” (refractive index [n d ] 1.84), “K-LaSFn17” (refractive index [n d ] 1.88) and “K-LaSFn22” (refractive index) manufactured by Sumita Optical Glass Co., Ltd. Ratio [n d ] 1.90) and “S-LAL10” (refractive index [n d ] 1.72) manufactured by OHARA INC. Are preferred from the viewpoint of optical properties and detergency.
透明平面基板は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および/またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、0.001〜1Nの塩酸中に、1〜3時間浸漬することが好ましい。The transparent flat substrate is preferably cleaned with acid and / or plasma before forming a metal thin film on the surface.
As the cleaning treatment with an acid, it is preferable to immerse in 0.001 to 1N hydrochloric acid for 1 to 3 hours.
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー(ヤマト科学(株)製の「PDC200」)中に、0.1〜30分間浸漬させる方法が挙げられる。
(金属薄膜)
本発明に係るプラズモン励起センサでは、上記透明平面基板の一方の表面に金属薄膜を形成する。この金属薄膜は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させ、蛍光色素の発光をもたらす役割を有する。Examples of the plasma cleaning treatment include a method of immersing in a plasma dry cleaner (“PDC200” manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) for 0.1 to 30 minutes.
(Metal thin film)
In the plasmon excitation sensor according to the present invention, a metal thin film is formed on one surface of the transparent flat substrate. This metal thin film has a role of generating surface plasmon excitation by light irradiated from a light source, generating an electric field, and causing emission of a fluorescent dye.
上記透明平面基板の一方の表面に形成された金属薄膜としては、金,銀,アルミニウム,銅,および白金からなる群から選ばれる少なくとも1種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、その合金の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。 The metal thin film formed on one surface of the transparent flat substrate is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, and more preferably made of gold. preferable. These metals may be in the form of their alloys. Such metal species are preferable because they are stable against oxidation and increase in electric field due to surface plasmons increases.
なお、透明平面基板としてガラス製平面基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム,ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。 When a glass flat substrate is used as the transparent flat substrate, it is preferable to form a chromium, nickel chromium alloy or titanium thin film in advance in order to bond the glass and the metal thin film more firmly.
透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法,蒸着法(抵抗加熱蒸着法,電子線蒸着法等),電解メッキ,無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および/または金属薄膜を形成することが好ましい。 Examples of the method for forming a metal thin film on a transparent flat substrate include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like. Since it is easy to adjust the thin film formation conditions, it is preferable to form a chromium thin film and / or a metal thin film by sputtering or vapor deposition.
金属薄膜の厚さとしては、金:5〜500nm,銀:5〜500nm,アルミニウム:5〜500nm,銅:5〜500nm,白金:5〜500nm,およびそれらの合金:5〜500nmが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、1〜20nmが好ましい。 The thickness of the metal thin film is preferably gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and alloys thereof: 5 to 500 nm. The thickness of the thin film is preferably 1 to 20 nm.
電場増強効果の観点から、金:20〜70nm,銀:20〜70nm,アルミニウム:10〜50nm,銅:20〜70nm,白金:20〜70nm,およびそれらの合金:10〜70nmがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、1〜3nmがより好ましい。 From the viewpoint of the electric field enhancing effect, gold: 20-70 nm, silver: 20-70 nm, aluminum: 10-50 nm, copper: 20-70 nm, platinum: 20-70 nm, and alloys thereof: 10-70 nm are more preferable, and chromium The thickness of the thin film is more preferably 1 to 3 nm.
金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ(縦×横)は特に限定されない。 When the thickness of the metal thin film is within the above range, surface plasmons are easily generated, which is preferable. Moreover, if it is a metal thin film which has such thickness, a magnitude | size (length x width) will not be specifically limited.
(誘電体からなるスペーサ層)
誘電体からなるスペーサ層の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性,製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素〔SiO2〕または二酸化チタン〔TiO2〕を含むことが好ましい。(Spacer layer made of dielectric)
As the dielectric used for forming the spacer layer made of a dielectric, various optically transparent inorganic substances, natural or synthetic polymers can be used. Among them, it is preferable to contain silicon dioxide [SiO 2 ] or titanium dioxide [TiO 2 ] because it is excellent in chemical stability, production stability and optical transparency.
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常10nm〜1mmであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは30nm以下、より好ましくは10〜20nmである。一方、電場増強の観点から、好ましくは200nm〜1mmであり、さらに電場増強の効果の安定性から、400nm〜1,600nmがより好ましい。 The thickness of the spacer layer made of a dielectric is usually 10 nm to 1 mm, and preferably 30 nm or less, more preferably 10 to 20 nm from the viewpoint of resonance angle stability. On the other hand, it is preferably 200 nm to 1 mm from the viewpoint of electric field enhancement, and more preferably 400 nm to 1,600 nm from the stability of the effect of electric field enhancement.
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法,電子線蒸着法,熱蒸着法,ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。 Examples of the method for forming a spacer layer made of a dielectric include a sputtering method, an electron beam evaporation method, a thermal evaporation method, a formation method by a chemical reaction using a material such as polysilazane, or an application by a spin coater.
(SAM)
SAM〔Self−Assembled Monolayer;自己組織化単分子膜〕は、金属薄膜の透明平面基板とは反対側の面に形成されることが好ましい。本発明のプラズモン励起センサでは、検体および蛍光色素を、リガンドを介して金属薄膜に捕捉した状態で蛍光測定を行うが、このとき、刺激応答性ポリマーを、SAMを介して金属薄膜に固定することが望ましい。すなわち、SAMは、刺激応答性ポリマーを金属薄膜に固定する際の土台としての役割を有する。(SAM)
SAM [Self-Assembled Monolayer] is preferably formed on the surface of the metal thin film opposite to the transparent flat substrate. In the plasmon excitation sensor of the present invention, the fluorescence measurement is performed in a state where the specimen and the fluorescent dye are captured on the metal thin film via the ligand. At this time, the stimulus-responsive polymer is fixed to the metal thin film via the SAM. Is desirable. That is, the SAM has a role as a foundation when the stimulus-responsive polymer is fixed to the metal thin film.
本発明において、このSAMが含む単分子としては、通常、炭素原子数4〜20程度のカルボキシアルカンチオール(例えば、(株)同仁化学研究所,シグマ アルドリッチ ジャパン(株)などから入手可能)、特に好ましくは10−カルボキシ−1−デカンチオールが用いられる。炭素原子数4〜20のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたSAMの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。 In the present invention, the SAM contained in the SAM is usually a carboxyalkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms (for example, available from Dojindo Laboratories Co., Ltd., Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.), in particular. Preferably 10-carboxy-1-decanethiol is used. Carboxyalkanethiol having 4 to 20 carbon atoms has properties such as little optical influence of SAM formed using it, that is, high transparency, low refractive index, and thin film thickness. Therefore, it is preferable.
SAMの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
具体例として、金属薄膜がその表面に形成されたガラス製透明平面基板を、10−カルボキシ−1−デカンチオール((株)同仁化学研究所製)を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、10−カルボキシ−1−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、SAMを形成する。The method for forming the SAM is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
As a specific example, there is a method of immersing a transparent glass substrate on which a metal thin film is formed in an ethanol solution containing 10-carboxy-1-decanethiol (manufactured by Dojindo Laboratories). . In this way, the thiol group of 10-carboxy-1-decanethiol binds to the metal and is immobilized, and self-assembles on the surface of the gold thin film to form a SAM.
(刺激応答性ポリマーを含む層)
本発明に係る刺激応答性ポリマーとしては、一般的な刺激応答性ポリマー、すなわち、熱や光、pH等の外部刺激に対して高次構造を変化させるポリマーが用いられる。なかでも、熱またはpHの変化により、高次構造を可逆的に変化させることが可能な温度応答性ポリマーまたはpH応答性ポリマーを用いることが好ましい。(Layer containing stimulus-responsive polymer)
As the stimulus-responsive polymer according to the present invention, a general stimulus-responsive polymer, that is, a polymer that changes a higher-order structure in response to external stimuli such as heat, light, and pH is used. Among them, it is preferable to use a temperature-responsive polymer or a pH-responsive polymer that can reversibly change the higher order structure by changing heat or pH.
また、刺激応答性ポリマーを含む層は、該刺激応答性ポリマーとリガンドを固定化するためのカルボキシデキストランなどの高分子とを含むことが好ましく、このような高分子としては、例えば、カルボキシメチルデキストラン等のデキストラン,グリコーゲン,デンプン(アミロース,アミロペクチン),セルロース,グルカン(β1,3−グルカン)など、グルコースを重合してなる多糖類等が挙げられるが、本発明においては、水溶性であり、リガンドを固定化するための反応性官能基を有するものであれば、特に限定されない。 The layer containing the stimulus-responsive polymer preferably contains the stimulus-responsive polymer and a polymer such as carboxydextran for immobilizing the ligand. Examples of such a polymer include carboxymethyldextran. Such as dextran, glycogen, starch (amylose, amylopectin), cellulose, glucan (β1,3-glucan) and the like, and polysaccharides obtained by polymerizing glucose. As long as it has a reactive functional group for immobilizing, there is no particular limitation.
図1に示すように、この刺激応答性ポリマーを含む層3は、下限臨界溶液温度〔LCST〕またはある特定のpHを境に、(A)から(B)へ相転移による体積変化を生じさせるものであるため、捕捉された蛍光色素と第2のリガンドとのコンジュゲート4が有する蛍光色素が、金属薄膜により近接することにより、効率良く励起される。なお、本発明におけるポリマーの「体積変化」とは、収縮を意味する。 As shown in FIG. 1, the layer 3 containing the stimulus-responsive polymer causes a volume change due to a phase transition from (A) to (B) at the lower critical solution temperature [LCST] or a specific pH. Therefore, the fluorescent dye included in the conjugate 4 of the captured fluorescent dye and the second ligand is efficiently excited by being closer to the metal thin film. The “volume change” of the polymer in the present invention means shrinkage.
温度応答性ポリマーとしては、ポリ(N−置換アクリルアミド),ポリ(N−置換メタクリルアミド),ポリ(N,N−二置換アクリルアミド),ポリビニルエーテル類などを用いることができる。具体的には、ポリ(N−エチルアクリルアミド),ポリ(N−シクロプロピルアクリルアミド),ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド),ポリ(N−n−プロピルアクリルアミド),ポリ(N−シクロプロピルメタクリルアミド),ポリ(N−イソプロピルメタクリルアミド),ポリ(N−n−プロピルメタクリルアミド),N−メチル−N−エチルアクリルアミド,N−メチル−N−イソプロピルアクリルアミド,N−メチル−N−n−プロピルアクリルアミド,N,N−ジメチルアクリルアミド,ポリビニルメチルエーテルなどが挙げられる。これらのうち、相転移温度が30℃前後と比較的体温に近いことから、ポリN−イソプロピルアクリルアミドが好ましい。 As the temperature-responsive polymer, poly (N-substituted acrylamide), poly (N-substituted methacrylamide), poly (N, N-disubstituted acrylamide), polyvinyl ethers, and the like can be used. Specifically, poly (N-ethylacrylamide), poly (N-cyclopropylacrylamide), poly (N-isopropylacrylamide), poly (Nn-propylacrylamide), poly (N-cyclopropylmethacrylamide), Poly (N-isopropylmethacrylamide), poly (Nn-propylmethacrylamide), N-methyl-N-ethylacrylamide, N-methyl-N-isopropylacrylamide, N-methyl-Nn-propylacrylamide, N , N-dimethylacrylamide, polyvinyl methyl ether and the like. Of these, poly N-isopropylacrylamide is preferred because the phase transition temperature is relatively close to body temperature, around 30 ° C.
pH応答性ポリマーとしては、例えば、ポリアクリル酸,ポリメタクリル酸,ポリ(2−エチルアクリル酸),ポリ(2−プロピルアクリル酸),ポリ(2−ジメチルアミノ)メチルメタクリレート,ポリ(2−ジエチルアミノ)メチルメタクリレート,ポリ(2−メトキシアニリン−5−スルホネート)などが挙げられる。これらのうち、相転移pHがpH7.4前後と比較的生体のpHに近いことから、ポリアクリル酸が好ましい。 Examples of the pH-responsive polymer include polyacrylic acid, polymethacrylic acid, poly (2-ethylacrylic acid), poly (2-propylacrylic acid), poly (2-dimethylamino) methyl methacrylate, and poly (2-diethylamino). ) Methyl methacrylate, poly (2-methoxyaniline-5-sulfonate) and the like. Of these, polyacrylic acid is preferred because the phase transition pH is relatively close to the pH of a living body, around pH 7.4.
また、これらの単独ポリマーのみならず、これらポリマーを構成するモノマー単位の2種以上を組み合わせた共重合体や、他の重合性モノマーとの共重合体も含まれる。
これら刺激応答性ポリマーは、1種単独でも2種以上併用してもよい。Moreover, not only these single polymers but the copolymer which combined 2 or more types of the monomer unit which comprises these polymers, and the copolymer with another polymerizable monomer are also contained.
These stimuli-responsive polymers may be used alone or in combination of two or more.
刺激応答性ポリマーの重量平均分子量は、1,000〜1,000,000であることが好ましい。重量平均分子量が上記範囲内であると、刺激応答性ポリマーが外部刺激を加えられた際、該ポリマーに捕捉された蛍光色素と金属薄膜との距離が約200nm以内となるので好適である。 The weight average molecular weight of the stimulus-responsive polymer is preferably 1,000 to 1,000,000. When the weight average molecular weight is within the above range, when the stimulus-responsive polymer is subjected to an external stimulus, the distance between the fluorescent dye captured by the polymer and the metal thin film is preferably within about 200 nm.
本発明における刺激応答性ポリマーは、該刺激応答性ポリマーを構成するモノマーを溶媒に溶解させ、公知の重合方法により得られる。具体的には、N−イソプロピルアクリルアミドを、開始剤を用いて共重合させる。開始剤としては、ラジカル重合では、アゾビスイソブチロニトリル〔AIBN〕、2,2−アゾビス(2−アミジノプロパン)ジヒドロクロライド〔ABAH〕,2−[N−(2−ヒドロキシエチル)カルバモイル]プロピル−2−ジチオベンゾエートを用いることが好ましい。 The stimulus-responsive polymer in the present invention can be obtained by a known polymerization method by dissolving a monomer constituting the stimulus-responsive polymer in a solvent. Specifically, N-isopropylacrylamide is copolymerized using an initiator. As the initiator, in radical polymerization, azobisisobutyronitrile [AIBN], 2,2-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride [ABAH], 2- [N- (2-hydroxyethyl) carbamoyl] propyl It is preferable to use 2-dithiobenzoate.
なお、得られたポリN−イソプロピルアクリルアミドを用いてゲルを製造する際には架橋剤を用いることが好ましい。架橋剤としては、具体的にはN,N’−メチレンビスアクリルアミド,エチレングリコールジメタクリレート等が挙げられる。 In addition, when manufacturing gel using the obtained poly N-isopropylacrylamide, it is preferable to use a crosslinking agent. Specific examples of the crosslinking agent include N, N′-methylenebisacrylamide, ethylene glycol dimethacrylate, and the like.
このような刺激応答性ポリマーは、金属薄膜(好ましくはSAM)に、好ましくは1〜100ng/mm2という密度で、より好ましくは1〜10ng/mm2という密度で結合する。刺激応答性ポリマーの密度が上記範囲内であると、粗密のバランスが良好である、すなわち、流路中のアナライトと刺激応答性ポリマーに固定化されているリガンドとが充分に接触できるほど密であり、かつ流路中のアナライト以外の物質を滞留させないほど粗であることから好適である。Such stimuli-responsive polymer, thin metal film (preferably SAM), preferably at a density of 1-100 ng / mm 2, more preferably binds at a density of 1-10 ng / mm 2. When the density of the stimulus-responsive polymer is within the above range, the balance between the density and the density is good, i.e., the analyte in the channel and the ligand immobilized on the stimulus-responsive polymer are sufficiently dense to contact each other. It is preferable because it is so coarse that substances other than the analyte in the flow path are not retained.
刺激応答性ポリマーを含む層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法,電子線蒸着法,熱蒸着法,ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。 Examples of the method for forming the layer containing the stimulus-responsive polymer include a sputtering method, an electron beam evaporation method, a thermal evaporation method, a formation method by a chemical reaction using a material such as polysilazane, or a spin coater coating.
(リガンド)
本発明では、上記刺激応答性ポリマーを含む層に第1のリガンドを固定化させる。このリガンドは、プラズモン励起センサに、検体中のアナライトを固定(捕捉)させる目的で用いられるものである。なお、本発明において、工程(a)で用いられるリガンドを「第1のリガンド」と称するのは、後述する工程(b)で用いられるリガンド(「第2のリガンド」)と区別するためである。(Ligand)
In the present invention, the first ligand is immobilized on the layer containing the stimulus-responsive polymer. This ligand is used for the purpose of immobilizing (capturing) the analyte in the specimen on the plasmon excitation sensor. In the present invention, the ligand used in step (a) is referred to as “first ligand” in order to distinguish it from the ligand (“second ligand”) used in step (b) described later. .
本発明において、「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し(または、認識され)結合し得る分子または分子断片をいう。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA,RNA,ポリヌクレオチド,オリゴヌクレオチド,PNA(ペプチド核酸)等、またはヌクレオシド,ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子),タンパク質(ポリペプチド,オリゴペプチド等),アミノ酸(修飾アミノ酸も含む。),糖質(オリゴ糖,多糖類,糖鎖等),脂質,またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 In the present invention, “ligand” refers to a molecule or molecular fragment capable of specifically recognizing (or recognizing) and binding to an analyte contained in a specimen. Examples of such “molecules” or “molecular fragments” include nucleic acids (DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), which may be single-stranded or double-stranded, etc., Alternatively, nucleosides, nucleotides and their modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modifications thereof Examples include, but are not limited to, molecules and complexes.
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔AFP〕モノクローナル抗体((株)日本医学臨床検査研究所などから入手可能),抗ガン胎児性抗原〔CEA〕モノクローナル抗体,抗CA19−9モノクローナル抗体,抗PSAモノクローナル抗体などが挙げられる。 Examples of the “protein” include antibodies and the like, specifically, anti-α-fetoprotein [AFP] monoclonal antibody (available from Nippon Medical Laboratory, Inc.), anti-carcinoembryonic antigen [CEA Monoclonal antibodies, anti-CA19-9 monoclonal antibodies, anti-PSA monoclonal antibodies, and the like.
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
このリガンドの固定化方法としては、例えば、刺激応答性ポリマーを含む層に含まれることが好ましいカルボキシメチルデキストランなどの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔WSC〕(例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩〔EDC〕など)とN−ヒドロキシコハク酸イミド〔NHS〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、上記リガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法;上記SAMを形成するシランカップリング剤などが有するカルボキシル基を、上述のようにして上記リガンドが有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。In the present invention, the term “antibody” includes polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, antibodies obtained by gene recombination, and antibody fragments.
As a method for immobilizing this ligand, for example, a carboxyl group possessed by a polymer having a reactive functional group such as carboxymethyldextran, preferably contained in a layer containing a stimulus-responsive polymer, is converted into a water-soluble carbodiimide [WSC] ( For example, active esterification with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride [EDC] and the like and N-hydroxysuccinimide [NHS], and thus the active esterified carboxyl group, A method of dehydrating and immobilizing an amino group possessed by the ligand using a water-soluble carbodiimide; a carboxyl group possessed by a silane coupling agent or the like that forms the SAM, and an amino group possessed by the ligand as described above Examples include a method of dehydrating and immobilizing.
なお、後述する検体等がプラズモン励起センサに非特異的に吸着することを防止するため、上記リガンドを固定化させた後に、プラズモン励起センサの表面を牛血清アルブミン〔BSA〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。 In order to prevent non-specific adsorption of a specimen or the like, which will be described later, to the plasmon excitation sensor, after immobilizing the ligand, the surface of the plasmon excitation sensor is treated with a blocking agent such as bovine serum albumin [BSA]. It is preferable to do.
(第1のリガンド)
本発明において、工程(a)で用いられるリガンドを「第1のリガンド」と称するのは、下記工程(b)で用いられるリガンド(「第2のリガンド」)と区別するためである。(First ligand)
In the present invention, the ligand used in step (a) is referred to as “first ligand” in order to distinguish it from the ligand (“second ligand”) used in the following step (b).
第1のリガンドは、上述した「リガンド」と同様である。
(検体)
本発明において、「検体」とは、本発明のアッセイ法による測定対象となる種々の試料をいう。The first ligand is the same as the “ligand” described above.
(Sample)
In the present invention, “specimen” refers to various samples to be measured by the assay method of the present invention.
「検体」としては、例えば、血液(血清・血漿),尿,鼻孔液,唾液,便,体腔液(髄液,腹水,胸水等)などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液,血清,血漿,尿,鼻孔液および唾液が好ましい。これらは1種単独で用いてもよく、また、2種以上を併用してもよい。 Examples of the “specimen” include blood (serum / plasma), urine, nasal fluid, saliva, stool, body cavity fluid (spinal fluid, ascites, pleural effusion, etc.), etc., and appropriately diluted in a desired solvent, buffer, etc. May be used. Of these samples, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva are preferred. These may be used alone or in combination of two or more.
(接触)
本発明において、「接触」とは、プラズモン励起センサのリガンド等が固定化されている面が送液中に浸漬されている状態で、この送液中に含まれる対象物をこのプラズモン励起センサと接触させることをいう。工程(a)では、上記検体とプラズモン励起センサとの「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。(contact)
In the present invention, “contact” means that a surface on which a ligand or the like of a plasmon excitation sensor is immobilized is immersed in the liquid supply, and an object contained in the liquid supply is referred to as the plasmon excitation sensor. To contact. In the step (a), the “contact” between the specimen and the plasmon excitation sensor means that the specimen is included in the liquid feed circulating in the flow path, and only the one surface on which the ligand of the plasmon excitation sensor is immobilized is the liquid feed. A mode in which the plasmon excitation sensor and the specimen are brought into contact with each other in a state of being immersed therein is preferable.
上記「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる角筒状または円筒(管)状のものである。また、この流路の形状として、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は角筒状構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は円筒(管)状を有することが好ましい。 The above-mentioned “flow path” is a rectangular tube or cylinder (tube) that can efficiently deliver a small amount of drug solution and can change or circulate the solution feeding speed in order to promote the reaction. ). Further, as the shape of this flow path, the vicinity of the place where the plasmon excitation sensor is installed preferably has a rectangular tube structure, and the vicinity of the place where the drug solution is delivered preferably has a cylindrical (tube) shape.
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート,スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体;ポリエチレン等のポリオレフィンなどの光透過性の材質からなり、薬液送達部ではシリコーンゴム,テフロン(登録商標),ポリエチレン,ポリプロピレン等のポリマーを用いる。 The material is a homopolymer or copolymer containing methyl methacrylate, styrene or the like as a raw material in the plasmon excitation sensor part; a light-transmitting material such as polyolefin such as polyethylene, and a silicone rubber, Teflon ( (Registered trademark), polyethylene, polypropylene, and other polymers are used.
ただし、プラズモン励起センサ部については、蛍光測定時に流路が一定の形状に保たれ、かつプラズモン励起により発生した蛍光の検出が妨げられない限り、必ずしもその流路造のすべてを光透過性の材質のみから構成する必要はない。すなわち、プラズモン励起センサ部の流路のうち、プラズモン励起により発生した蛍光を透過させて検出部に導くために必要な部分、具体的には蛍光の集光に必要な透光窓を含む部分については、光透過性の材質で構成する必要があるが、その他の部分については、その一部または全部を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、金属薄膜(または、好ましくはSAM)が表面に存在するプラズモン励起センサの面を底面としたときに、例えば、この底面と対向する位置にある天井面を光透過性の材質で構成し、側面を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。 However, for the plasmon excitation sensor, all of the channel structure is not necessarily made of a light-transmitting material unless the channel is kept in a fixed shape during fluorescence measurement and the detection of fluorescence generated by plasmon excitation is not hindered. There is no need to consist only of. That is, of the flow path of the plasmon excitation sensor part, a part necessary for transmitting the fluorescence generated by plasmon excitation and guiding it to the detection part, specifically, a part including a transparent window necessary for collecting the fluorescence. However, other parts may be partially or entirely made of a chemically stable material other than the light transmissive material. When the flow path of the plasmon excitation sensor unit has a rectangular parallelepiped structure, when the surface of the plasmon excitation sensor on which the metal thin film (or preferably SAM) exists is defined as the bottom surface, for example, the surface is opposed to the bottom surface. The ceiling surface may be made of a light transmissive material, and the side surface may be made of a chemically stable material other than the light transmissive material.
ここで、上記その他の部分、例えば側面は、蛍光測定時に一定の形状が保たれる限り、必ずしも剛体である必要はなく、シール性を確保するために適度な弾性を有していてもよい。例えば、プラズモン励起センサ部の流路について、天井面をポリメチルメタクリレート〔PMMA〕で構成し、側面をシリコーンゴムで構成してもよい。 Here, the other parts, for example, the side surfaces are not necessarily rigid bodies as long as a certain shape is maintained at the time of fluorescence measurement, and may have an appropriate elasticity to ensure a sealing property. For example, regarding the flow path of the plasmon excitation sensor unit, the ceiling surface may be composed of polymethyl methacrylate [PMMA] and the side surface may be composed of silicone rubber.
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に100nm〜1mm程度が好ましい。 In the plasmon excitation sensor unit, from the viewpoint of increasing the contact efficiency with the specimen and shortening the diffusion distance, it is preferable that the cross section of the channel of the plasmon excitation sensor unit is independently about 100 nm to 1 mm in length and width.
流路において、薬物送達部からプラズモン励起センサ部に送液を導入する送液導入口、およびその送液をプラズモン励起センサ部から排出する送液排出口の位置は、いずれも、蛍光測定の妨げとならない限り特に限定されない。例えば、プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、前記送液導入口及び送液排出口とも天井面に設けるのが流路の作製上簡便であるが、この送液導入口と送液排出口とのうちいずれか一方、あるいはその両方を側面に設けてもよい。 In the flow path, the position of the liquid feeding inlet for introducing the liquid feeding from the drug delivery section to the plasmon excitation sensor section and the position of the liquid feeding outlet for discharging the liquid feeding from the plasmon excitation sensor section are both obstructing the fluorescence measurement. Unless it becomes, it will not specifically limit. For example, when the flow path of the plasmon excitation sensor section has a rectangular parallelepiped structure, it is convenient to prepare the flow path for the liquid feed inlet and the liquid feed outlet on the ceiling surface. Either one or both of the liquid discharge ports may be provided on the side surface.
流路にプラズモン励起センサを固定する方法は、流路が一定の形状に保たれ、かつ蛍光測定が妨げられない限り特に限定されない。
このような固定方法の例としては、小規模ロット(実験室レベル)では、まず、プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面上に、一定の厚さを有するシリコーンゴム製シートまたはOリングを載せることによって流路の側面構造を形成し、次いで、その上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板(例えば、PMMA基板など)を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定する方法などが挙げられる。このとき、側面構造を構成する材料として、その中央部に任意の形状および大きさを有する穴を開けてある、適当な厚さを有するシリコーンゴム製シートを用いると、この穴の内周がプラズモン励起センサ部の流路の側面構造となることから、所要の形状および大きさを有する流路を容易に形成することができるので好ましい。例えば、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ0.5mmを有する穴あきポリジメチルシロキサン〔PDMS〕製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして配置し、次いで、このポリジメチルシロキサン〔PDMS〕製シートの上に、予め送液導入口および送液排出口を設けてあるPMMA基板を配置し、その後、該PMMA基板と該ポリジメチルシロキサン〔PDMS〕製シートと該プラズモン励起センサとを圧着し、ビス等の留め具により固定する方法が好ましい。また、プラズモン励起センサに、シリコーンゴム製シートまたはOリングと光透過性の天板とを圧着し、固定するにあたっては、必要に応じて、シリコーンゴムまたはステンレスなどの材質でできた適当なスペーサを併用してもよい。The method for fixing the plasmon excitation sensor to the flow path is not particularly limited as long as the flow path is maintained in a certain shape and the fluorescence measurement is not hindered.
As an example of such a fixing method, in a small lot (laboratory level), first, a silicone rubber sheet or O-ring having a certain thickness is formed on the surface on which the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed. Is formed by placing a light-transmitting top plate (for example, a PMMA substrate) provided with a liquid feeding inlet and a liquid feeding outlet thereon. Examples include a method of forming a ceiling surface of a road, and then crimping and fixing them with an appropriate fastener. At this time, if a silicone rubber sheet having an appropriate thickness and having a hole having an arbitrary shape and size is used as a material constituting the side surface structure, the inner periphery of the hole has a plasmon. Since it becomes the side structure of the flow path of an excitation sensor part, since the flow path which has a required shape and a size can be formed easily, it is preferable. For example, a perforated polydimethylsiloxane (PDMS) sheet having a flow path height of 0.5 mm is first formed on the surface on which the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed. Next, a PMMA substrate on which a liquid feeding inlet and a liquid feeding outlet are provided in advance is placed on the polydimethylsiloxane [PDMS] sheet, and then the PMMA substrate and the PMMA substrate are placed on the polydimethylsiloxane [PDMS] sheet. A method in which a polydimethylsiloxane [PDMS] sheet and the plasmon excitation sensor are pressure-bonded and fixed with a fastener such as a screw is preferred. In addition, when a silicone rubber sheet or O-ring and a light-transmitting top plate are pressure-bonded and fixed to the plasmon excitation sensor, an appropriate spacer made of a material such as silicone rubber or stainless steel is attached as necessary. You may use together.
また、工業的に製造される大ロット(工場レベル)では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に直接金基板を形成するかあるいは別途作製した金基板を固定し、金表面に(好ましくはSAM)金コロイドを基点とする高分子からなる層の形成およびリガンドの固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。 Also, in large lots (factory level) manufactured industrially, as a method of fixing the plasmon excitation sensor to the flow path, a gold substrate is directly formed on a plastic integrally molded product or a separately prepared gold substrate is fixed. Then, after forming a layer made of a polymer based on gold colloid (preferably SAM) and immobilizing the ligand on the gold surface, the lid is covered with an integrally molded plastic product corresponding to the top plate of the flow path. Can be manufactured. If necessary, the prism can be integrated into the flow path.
このような「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔PBS〕,トリス緩衝生理食塩水〔TBS〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。 Such “liquid feeding” is preferably the same as the solvent or buffer in which the specimen is diluted, and examples thereof include phosphate buffered saline [PBS] and Tris buffered saline [TBS]. It is not particularly limited.
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常20〜40℃×1〜60分間、好ましくは37℃×5〜15分間である。 The temperature and time for circulating the liquid supply vary depending on the type of specimen and are not particularly limited, but are usually 20 to 40 ° C. × 1 to 60 minutes, preferably 37 ° C. × 5 to 15 minutes.
送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、100μg/mL〜0.0001pg/mLであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常0.0001〜20mL、好ましくは0.01〜1mLである。The initial concentration of the analyte contained in the sample being sent may be 100 μg / mL to 0.0001 pg / mL.
The total amount of liquid feeding, that is, the volume of the flow path is usually 0.0001 to 20 mL, preferably 0.01 to 1 mL.
送液の流速は、通常1〜2,000μL/min、好ましくは5〜500μL/minである。
[洗浄工程]
洗浄工程とは、工程(a)を経て得られたプラズモン励起センサの表面、および後述する工程(b)を経て得られるプラズモン励起センサの表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程である。この洗浄工程は、工程(b)の前後のうち少なくともいずれか一方に含まれることが好ましい。The flow rate of liquid feeding is usually 1 to 2,000 μL / min, preferably 5 to 500 μL / min.
[Washing process]
The cleaning step is a step of cleaning at least one of the surface of the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) and the surface of the plasmon excitation sensor obtained through the step (b) described later. This washing step is preferably included in at least one of before and after step (b).
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Tween20,TritonX100などの界面活性剤を、工程(a)および(b)の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは0.00001〜1重量%含有するものが望ましい。 As the washing solution used in the washing step, for example, a surfactant such as Tween 20 or Triton X100 is dissolved in the same solvent or buffer solution used in the reaction of steps (a) and (b), What contains 00001-1 weight% is desirable.
洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程(a)の「送液を循環させる温度および流速」と同じであることが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常0.5〜180分間、好ましくは5〜60分間である。The temperature and flow rate at which the cleaning liquid is circulated are preferably the same as the “temperature and flow rate at which the liquid feed is circulated” in step (a).
The time for circulating the cleaning liquid is usually 0.5 to 180 minutes, preferably 5 to 60 minutes.
[工程(b)]
工程(b)とは、上記工程(a)を経て得られたプラズモン励起センサに、第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程である。[Step (b)]
The step (b) is a step of reacting the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) with a conjugate of the second ligand and the fluorescent dye.
(蛍光色素)
「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。(Fluorescent dye)
The “fluorescent dye” is a general term for substances that emit fluorescence by irradiating predetermined excitation light in the present invention, or excited by using an electric field effect. Including luminescence.
本発明で用いられる蛍光色素は、金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔monochromometer〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。 The fluorescent dye used in the present invention is not particularly limited as long as it is not quenched due to light absorption by the metal thin film, and may be any known fluorescent dye. In general, fluorescent dyes with large Stokes shifts that allow the use of a fluorometer with a filter rather than a monochromator and also increase the efficiency of detection are preferred.
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素(Integrated DNA Technologies社製),ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素(アプライドバイオシステムズジャパン(株)製),ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素(アプライドバイオシステムズジャパン(株)製),クマリン・ファミリーの蛍光色素(インビトロジェン(株)製),ローダミン・ファミリーの蛍光色素(GEヘルスケア バイオサイエンス(株)製),シアニン・ファミリーの蛍光色素,インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素,オキサジン・ファミリーの蛍光色素,チアジン・ファミリーの蛍光色素,スクアライン・ファミリーの蛍光色素,キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素,BODIPY(登録商標)・ファミリーの蛍光色素(インビトロジェン(株)製),ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素,ピレン・ファミリーの蛍光色素,トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素,Alexa Fluor(登録商標)色素シリーズ(インビトロジェン(株)製)などが挙げられ、さらに米国特許番号第6,406,297号、同第6,221,604号、同第5,994,063号、同第5,808,044号、同第5,880,287号、同第5,556,959号および同第5,135,717号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。 Examples of such fluorescent dyes include fluorescein family fluorescent dyes (Integrated DNA Technologies), polyhalofluorescein family fluorescent dyes (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), hexachlorofluorescein family fluorescent dyes. (Applied Biosystems Japan), Coumarin family fluorescent dye (Invitrogen), Rhodamine family fluorescent dye (GE Healthcare Biosciences), Cyanine family fluorescent dye, Indocarbocyanine family fluorescent dye, Oxazine family fluorescent dye, Thiazine family fluorescent dye, Squalene family fluorescent dye, Chelated lanthanide family Fluorescent dyes, BODIPY (registered trademark) family fluorescent dyes (manufactured by Invitrogen), naphthalenesulfonic acid family fluorescent dyes, pyrene family fluorescent dyes, triphenylmethane family fluorescent dyes, Alexa Fluor (Registered trademark) dye series (manufactured by Invitrogen Corp.) and the like, and further, U.S. Patent Nos. 6,406,297, 6,221,604, 5,994,063, The fluorescent dyes described in 5,808,044, 5,880,287, 5,556,959, and 5,135,717 can also be used in the present invention.
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長(nm)および発光波長(nm)を表1に示す。 Table 1 shows the absorption wavelength (nm) and emission wavelength (nm) of typical fluorescent dyes included in these families.
また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばEu,Tb等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長(310〜340nm程度)と発光波長(Eu錯体で615nm付近、Tb錯体で545nm付近)との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ATBTA−Eu3+が挙げられる。The fluorescent dye is not limited to the organic fluorescent dye. For example, rare earth complex fluorescent dyes such as Eu and Tb can also be used as fluorescent dyes in the present invention. In general, rare earth complexes have a large wavelength difference between an excitation wavelength (about 310 to 340 nm) and an emission wavelength (about 615 nm for an Eu complex and 545 nm for a Tb complex), and a long fluorescence lifetime of several hundred microseconds or more. is there. An example of a commercially available rare earth complex-based fluorescent dye is ATBTA-Eu 3+ .
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜として金を用いる場合には、金薄膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が600nm以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Cy5,Alexa Fluor(登録商標)647等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属薄膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が400nm以上である蛍光色素を使用することが望ましい。 In the present invention, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in a wavelength region where light absorption by the metal contained in the metal thin film is small when performing fluorescence measurement described later. For example, when gold is used as the metal thin film, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 600 nm or more in order to minimize the influence of light absorption by the gold thin film. Therefore, in this case, it is particularly desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in the near-infrared region, such as Cy5, Alexa Fluor (registered trademark) 647. The use of a fluorescent dye having the maximum fluorescence wavelength in the near-infrared region can minimize the influence of light absorption by iron derived from blood cell components in the blood. Is also useful. On the other hand, when silver is used as the metal thin film, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 400 nm or more.
これら蛍光色素は1種単独でも、2種以上併用してもよい。
(第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート)
「第2のリガンドと蛍光色素からなるコンジュゲート」は、リガンドとして2次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト(標的抗原)を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。These fluorescent dyes may be used alone or in combination of two or more.
(Conjugate of second ligand and fluorescent dye)
The “conjugate comprising the second ligand and the fluorescent dye” is preferably an antibody capable of recognizing and binding to the analyte (target antigen) contained in the specimen when a secondary antibody is used as the ligand.
本発明のアッセイ法において、第2のリガンドは、アナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、上記第1のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第1のリガンドとして用いる1次抗体がポリクローナル抗体である場合、第2のリガンドとして用いる2次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該1次抗体がモノクローナル抗体である場合、2次抗体は、該1次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。 In the assay method of the present invention, the second ligand is a ligand used for the purpose of labeling the analyte with a fluorescent dye, and may be the same as or different from the first ligand. However, when the primary antibody used as the first ligand is a polyclonal antibody, the secondary antibody used as the second ligand may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but the primary antibody is monoclonal. In the case of an antibody, the secondary antibody is preferably a monoclonal antibody that recognizes an epitope that the primary antibody does not recognize, or a polyclonal antibody.
さらに、検体中に含有されるアナライト(標的抗原)と競合する第2のアナライト(競合抗原;ただし、標的抗原とは異なるものである。)と2次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号(蛍光シグナル)量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。 In addition, a complex in which a second analyte that competes with an analyte (target antigen) contained in a specimen (competitive antigen; however, different from the target antigen) and a secondary antibody are bound in advance. The embodiment to be used is also preferable. Such an embodiment is preferable because the amount of fluorescent signal (fluorescent signal) and the amount of target antigen can be proportional.
「第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」の作製方法としては、第2のリガンドとして2次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔WSC〕(例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩〔EDC〕など)とN−ヒドロキシコハク酸イミド〔NHS〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と2次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法;イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する2次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法;スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する2次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法;ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する2次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法;ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された2次抗体(あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された2次抗体)とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。 As a method for producing a “conjugate of a second ligand and a fluorescent dye”, when a secondary antibody is used as the second ligand, for example, a carboxyl group is first given to the fluorescent dye, and the carboxyl group is converted into a water-soluble substance. Carboxyimide [WSC] (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride [EDC] etc.) and N-hydroxysuccinimide [NHS] and then esterified carboxyl A method of dehydrating and immobilizing a group and an amino group of a secondary antibody using water-soluble carbodiimide; a method of reacting and immobilizing a secondary antibody and a fluorescent dye each having an isothiocyanate and an amino group; a sulfonyl halide and Reacting with secondary antibody and fluorescent dye each having amino group A method of reacting and immobilizing a secondary antibody and a fluorescent dye each having iodoacetamide and a thiol group; a biotinylated fluorescent dye and a streptavidinized secondary antibody (or streptavidinated fluorescence) And a method of immobilizing the dye by reacting with a biotinylated secondary antibody).
このように作製された「第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」の送液中の濃度は、0.001〜10,000μg/mLが好ましく、1〜1,000μg/mLがより好ましい。 The concentration of the thus-prepared “conjugate of the second ligand and the fluorescent dye” during feeding is preferably 0.001 to 10,000 μg / mL, and more preferably 1 to 1,000 μg / mL.
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程(a)の場合と同様である。
[工程(c)]
工程(c)とは、上記工程(b)を経て得られたプラズモン励起センサに、上記刺激応答性ポリマーが応答し得る外部刺激を加える工程である。The temperature, time, and flow rate at which the liquid is circulated are the same as in step (a).
[Step (c)]
The step (c) is a step of applying an external stimulus to which the stimulus-responsive polymer can respond to the plasmon excitation sensor obtained through the step (b).
(外部刺激)
本発明において、外部刺激は、用いる刺激応答性ポリマーの種類によって適宜選択される。例えば、温度応答性ポリマーであるポリN−イソプロピルアクリルアミド〔NIPAM〕を室温(25℃程度)で用いている場合、NIPAMの相転移温度が30℃前後であるので、外部刺激としては37℃程度以上まで温度を上げることに相当する。その際、プラズモン励起センサおよび流路に付属している温度制御装置を用い、送液の温度を制御する。また、pH応答性ポリマーであるポリアクリル酸をpH7.4程度で用いている場合、ポリアクリル酸の相転移pHがpH4前後であるので、外部刺激としてはpH3.0程度以下までpHを下げることに相当する。(External stimulus)
In the present invention, the external stimulus is appropriately selected depending on the type of stimulus-responsive polymer used. For example, when poly N-isopropylacrylamide [NIPAM], which is a temperature-responsive polymer, is used at room temperature (about 25 ° C.), the phase transition temperature of NIPAM is around 30 ° C. Is equivalent to raising the temperature to At that time, the temperature of the liquid feeding is controlled using a plasmon excitation sensor and a temperature control device attached to the flow path. In addition, when polyacrylic acid, which is a pH-responsive polymer, is used at a pH of about 7.4, the phase transition pH of polyacrylic acid is around pH 4, so the pH is lowered to about 3.0 or less as an external stimulus. It corresponds to.
[工程(d)]
工程(d)とは、上記工程(c)を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。[Step (d)]
Step (d) refers to laser light from the surface opposite to the surface on which the metal thin film is formed of the transparent flat substrate of the plasmon excitation sensor obtained through the step (c) via a prism. , And the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye is measured.
(光学系)
本発明のアッセイ法で用いる光源は、金属薄膜にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。(Optical system)
The light source used in the assay method of the present invention is not particularly limited as long as it can cause plasmon excitation in a metal thin film, but in terms of unity of wavelength distribution and intensity of light energy, laser light is used. Is preferably used as the light source. It is desirable to adjust the energy and photon amount immediately before the laser light enters the prism through the optical filter.
レーザ光の照射により、全反射減衰条件〔ATR〕において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明平面基板の屈折率、金属薄膜の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約10〜20倍の増加量となる。 Irradiation with laser light generates surface plasmons on the surface of the metal thin film under the total reflection attenuation condition [ATR]. Due to the electric field enhancement effect of the surface plasmon, the fluorescent dye is excited by photons increased to several tens to several hundred times the amount of photons irradiated. In addition, although the photon increase amount by this electric field enhancement effect depends on the refractive index of the transparent flat substrate, the metal species and the film thickness of the metal thin film, the increase amount is usually about 10 to 20 times in gold.
蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態(準位)から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。 In the fluorescent dye, electrons in the molecule are excited by light absorption, move to the first electron excited state in a short time, and when returning from this state (level) to the ground state, the wavelength of the wavelength corresponding to the energy difference Fluoresce.
「レーザ光」としては、例えば、波長200〜900nm、0.001〜1,000mWのLD、波長230〜800nm(金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。)、0.01〜100mWの半導体レーザなどが挙げられる。 As the “laser light”, for example, an LD having a wavelength of 200 to 900 nm, an LD of 0.001 to 1,000 mW, a wavelength of 230 to 800 nm (resonance wavelength is determined by the metal species used in the metal thin film), and a semiconductor of 0.01 to 100 mW. A laser etc. are mentioned.
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明平面基板と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、60度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。 The “prism” is intended to allow the laser light through various filters to efficiently enter the plasmon excitation sensor, and preferably has the same refractive index as that of the transparent flat substrate. In the present invention, various prisms for which total reflection conditions can be set can be selected as appropriate, and therefore, there is no particular limitation on the angle and shape. For example, a 60-degree dispersion prism may be used. Examples of such commercially available prisms include those similar to the above-mentioned commercially available “glass-made transparent flat substrate”.
「光学フィルタ」としては、例えば、減光〔ND〕フィルタ,ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光(ND)フィルタ」(または、中性濃度フィルタ)は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。 Examples of the “optical filter” include a neutral density [ND] filter and a diaphragm lens. The “darkening (ND) filter” (or neutral density filter) is intended to adjust the amount of incident laser light. In particular, when a detector with a narrow dynamic range is used, it is preferable to use it for carrying out a highly accurate measurement.
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるP偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光(装置外の照明光),励起光(励起光の透過成分),迷光(各所での励起光の散乱成分),プラズモンの散乱光(励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光),酵素蛍光基質の自家蛍光,などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。The “polarizing filter” is used to make the laser light P-polarized light that efficiently generates surface plasmons.
“Cut filters” are: external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), plasmon scattering light (excitation light originated from plasmon A filter that removes various types of noise light such as scattered light generated by the influence of structures or deposits on the surface of the excitation sensor), autofluorescence of the enzyme fluorescent substrate, and examples thereof include interference filters and color filters. It is done.
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ(例えば、(株)ニコン製またはオリンパス(株)製等)を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、10〜100倍が好ましい。 The “collecting lens” is intended to efficiently collect the fluorescent signal on the detector, and may be an arbitrary condensing system. As a simple condensing system, a commercially available objective lens (for example, manufactured by Nikon Corporation or Olympus Corporation) used in a microscope or the like may be used. The magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.
「SPFS検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管(浜松ホトニクス(株)製のフォトマルチプライヤー)が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なCCDイメージセンサも好適である。 As the “SPFS detection unit”, a photomultiplier (a photomultiplier manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) is preferable from the viewpoint of ultrahigh sensitivity. Also, although the sensitivity is lower than these, a CCD image sensor capable of multipoint measurement is also suitable because it can be viewed as an image and noise light can be easily removed.
[工程(e)]
工程(e)とは、上記工程(d)で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程である。[Step (e)]
Step (e) is a step of calculating the amount of analyte contained in the sample from the measurement result obtained in step (d).
(アナライト)
アナライトとしては、上記高分子に固定化された第1のリガンドを特異的に認識され(または、認識し)結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA,RNA,ポリヌクレオチド,オリゴヌクレオチド,PNA(ペプチド核酸)等、またはヌクレオシド,ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子),タンパク質(ポリペプチド,オリゴペプチド等),アミノ酸(修飾アミノ酸も含む。),糖質(オリゴ糖,多糖類,糖鎖等),脂質,またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、AFP〔αフェトプロテイン〕などのがん胎児性抗原や腫瘍マーカー,シグナル伝達物質,ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。(Analyte)
The analyte is a molecule or molecular fragment capable of specifically recognizing (or recognizing and binding) the first ligand immobilized on the polymer, and the “molecule” or “molecular fragment” Examples of nucleic acids include, for example, nucleic acids (DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA (peptide nucleic acids), etc., which may be single-stranded or double-stranded, or nucleosides, nucleotides and modified molecules thereof). , Proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or their modified molecules, complexes, etc. Specifically, it may be an oncofetal antigen such as AFP [α-fetoprotein], a tumor marker, a signal transmitter, a hormone, etc. There.
(アッセイS/N比)
さらに、工程(d)は、上記工程(c)の前に測定した"ブランク蛍光シグナル"、上記工程(c)で得られた"アッセイ蛍光シグナル"、および何も修飾していない金基板を流路に固定し、超純水を流しながらSPFSを測定して得られたシグナルを"初期ノイズ"としたとき、下記式(1a)で表されるアッセイS/N比を算出することができる:
アッセイS/N比=|Ia/Io|/In …(1a)
(上記式(1a)において、Iaはアッセイ蛍光シグナル、Ioはブランク蛍光シグナル、Inは初期ノイズである)。(Assay S / N ratio)
Further, in the step (d), the “blank fluorescent signal” measured before the step (c), the “assay fluorescent signal” obtained in the step (c), and the gold substrate not modified at all are flowed. Assuming that the signal obtained by measuring SPFS while flowing ultrapure water while being fixed to the road as “initial noise”, the assay S / N ratio represented by the following formula (1a) can be calculated:
Assay S / N ratio = | Ia / Io | / In (1a)
(In the above formula (1a), Ia is the assay fluorescence signal, Io is the blank fluorescence signal, and In is the initial noise).
ただし、アッセイS/N比を算出するにあたっては、実用上、上記式(1a)に代えて、検体中に含まれるアナライトの濃度が0の場合における"アッセイノイズシグナル"を基準として、下記式(1b)にしたがって算出してもよい:
アッセイS/N比=|Ia|/|Ian| …(1b)
(上記式(1b)において、Ianはアッセイノイズシグナル、Iaは上記式(1a)の場合と同様にアッセイ蛍光シグナルである)。However, in calculating the assay S / N ratio, instead of the above formula (1a), the following formula is used on the basis of “assay noise signal” when the concentration of the analyte contained in the sample is 0. You may calculate according to (1b):
Assay S / N ratio = | Ia | / | Ian | (1b)
(In the above formula (1b), Ian is an assay noise signal, and Ia is an assay fluorescence signal as in the case of the above formula (1a)).
<装置>
本発明の装置は、少なくとも、上記プラズモン励起センサを含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とするものであり、本発明のアッセイ法を実施するためのものである。<Device>
The apparatus of the present invention includes at least the plasmon excitation sensor and is used for the assay method, and is for carrying out the assay method of the present invention.
「装置」としては、該プラズモン励起センサ以外に、例えば、光源,各種光学フィルタ,プリズム,カットフィルタ,集光レンズ,表面プラズモン励起増強蛍光検出部,温度変更部(ヒーター)などを含むものとする。なお、検体液,洗浄液,標識抗体液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、本発明の目的が達せられる限り、その種類を問わない。例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。 In addition to the plasmon excitation sensor, the “apparatus” includes, for example, a light source, various optical filters, a prism, a cut filter, a condenser lens, a surface plasmon excitation enhanced fluorescence detection unit, a temperature change unit (heater), and the like. It is preferable to have a liquid feeding system combined with a plasmon excitation sensor when handling sample liquid, washing liquid, labeled antibody liquid and the like. The type of liquid feeding system is not limited as long as the object of the present invention can be achieved. For example, a microchannel device connected to a liquid pump may be used.
また、表面プラズモン共鳴〔SPR〕検出部、すなわちSPR専用の受光センサとしてのフォトダイオード,SPRおよびSPFSの最適角度を調製するための角度可変部(サーボモータで全反射減衰〔ATR〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、45〜85°の角度変更を可能とする。分解能は0.01°以上が好ましい。)、表面プラズモン励起増強蛍光検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。 In addition, the surface plasmon resonance [SPR] detector, that is, the angle variable unit for adjusting the optimum angle of the photodiode, SPR and SPFS as a light receiving sensor dedicated to SPR (in order to obtain the total reflection attenuation [ATR] condition by the servomotor) The angle of 45 to 85 ° can be changed by synchronizing the photodiode and the light source, and the resolution is preferably 0.01 ° or more.) The information input to the surface plasmon excitation enhanced fluorescence detection unit is processed. A computer for the purpose may also be included.
光源、光学フィルタ,カットフィルタ,集光レンズおよびSPFS検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。Preferred embodiments of the light source, the optical filter, the cut filter, the condensing lens, and the SPFS detection unit are the same as those described above.
As the “liquid feed pump”, for example, a micro pump suitable for a small amount of liquid feed, a syringe pump with high feed accuracy and low pulsation, which is preferable but cannot be circulated, a simple and excellent handleability but a small amount of liquid feed For example, a tube pump may be difficult.
<キット>
本発明のキットは、少なくとも、透明平面基板と;該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と;薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層とを含むプラズモン励起センサ用基板を含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。<Kit>
The kit of the present invention comprises at least a transparent flat substrate; a metal thin film formed on one surface of the substrate; and a stimulus-responsive polymer formed on the other surface of the thin film that is not in contact with the substrate. And a plasmon excitation sensor substrate including the layer to be used. The substrate is used in the assay method.
本発明のキットは、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、該プラズモン励起センサ用基板以外に、第1のリガンドと第2のリガンドと検体とを除き必要とされるすべてのもの、例えば、1次抗体、抗原などのリガンド(すなわち、検体中に含まれるアナライトは、抗原とは限らず、抗体であってもよい。)と検体と2次抗体とを除き必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。 In carrying out the assay method of the present invention, the kit of the present invention, except for the substrate for the plasmon excitation sensor, except for the first ligand, the second ligand and the sample, for example, 1 All necessary substances except ligands such as secondary antibodies and antigens (that is, the analyte contained in the sample is not limited to antigens and may be antibodies), and samples and secondary antibodies. It is preferable to include.
例えば、本発明のキットと、検体として血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌(上皮内癌)の存在も高精度で予測することができる。 For example, by using the kit of the present invention, blood or serum as a specimen, and an antibody against a specific tumor marker, the content of the specific tumor marker can be detected with high sensitivity and high accuracy. From this result, the presence of a preclinical noninvasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by palpation or the like can be predicted with high accuracy.
このような「キット」としては、具体的に、該プラズモン励起センサ用基板;SAMを形成するための炭素原子数4〜20程度のカルボキシアルカンチオール;蛍光色素;検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液;プラズモン励起センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「装置」を含めることもできる。 Specifically, such a “kit” includes the plasmon excitation sensor substrate; a carboxyalkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms for forming a SAM; a fluorescent dye; and a dissolution for dissolving or diluting a specimen. Liquid or diluent; various reaction reagents and washing reagents for reacting a plasmon excitation sensor with a specimen, and various equipment or materials necessary for carrying out the assay method of the present invention and the above-mentioned “device” It can also be included.
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質,説明書,多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。 Further, the kit element may include a standard material for preparing a calibration curve, a manual, a necessary set of equipment such as a microtiter plate capable of simultaneously processing a large number of samples, and the like.
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
[作製例1](Alexa Fluor(登録商標)647標識2次抗体の作製)
2次抗体として、抗αフェトプロテイン〔AFP〕モノクローナル抗体(6D2;2.5mg/mL,(株)日本医学臨床検査研究所製)を、市販のビオチン化キット((株)同仁化学研究所製)を用いてビオチン化した。その手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited by these.
[Preparation Example 1] (Preparation of Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled secondary antibody)
As a secondary antibody, an anti-α-fetoprotein [AFP] monoclonal antibody (6D2; 2.5 mg / mL, manufactured by Nippon Medical Laboratory), a commercially available biotinylation kit (manufactured by Dojindo Laboratories) Was biotinylated. The procedure followed the protocol attached to the kit.
次に、得られたビオチン化抗AFPモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Alexa Fluor(登録商標)647(Molecular Probes社製)溶液とを混合し、4℃で60分間、攪拌混合することで反応させた。 Next, the solution of the obtained biotinylated anti-AFP monoclonal antibody and the streptavidin-labeled Alexa Fluor (registered trademark) 647 (Molecular Probes) solution are mixed and reacted by stirring at 4 ° C. for 60 minutes. It was.
最後に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ(日本ミリポア(株)製)を用いて精製することで、Alexa Fluor(登録商標)647標識抗AFPモノクローナル抗体溶液を得た。 Finally, the unreacted antibody and the unreacted enzyme were purified using a molecular weight cut filter (manufactured by Nippon Millipore) to obtain an Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled anti-AFP monoclonal antibody solution.
[作製例2](刺激応答性ポリマーが温度応答性ポリマーであるプラズモン励起センサの作製)
まず、金からなる金属薄膜の厚さが50nmになるように、透明平面基板として光学ガラスである「BK7」(ショット日本(株)製)の一方の表面に金を蒸着することによって金薄膜を形成した。[Production Example 2] (Production of plasmon excitation sensor in which the stimulus-responsive polymer is a temperature-responsive polymer)
First, the gold thin film is deposited by vapor-depositing gold on one surface of “BK7” (manufactured by Shot Japan Co., Ltd.), which is an optical glass, as a transparent flat substrate so that the thickness of the metal thin film made of gold becomes 50 nm. Formed.
得られた金基板を、金薄膜を形成した表面が露出するようにスピンコータにセットし、基板の中央付近にポリN−イソプロピルアクリルアミドのエタノール溶液(1mg/mL)を100μL滴下して、1,000rpmにて1分間回転させる。 The obtained gold substrate was set on a spin coater so that the surface on which the gold thin film was formed was exposed, and 100 μL of poly N-isopropylacrylamide ethanol solution (1 mg / mL) was dropped near the center of the substrate, and 1,000 rpm Rotate for 1 minute.
さらに、その上からカルボキシメチルデキストラン(名糖産業(株)製;分子量100万)のアセトン溶液(2mg/mL)を1mL滴下し、1,000rpmにて1分間回転させる。常温で充分に乾燥させることによって、金薄膜の、透明平面基板とは接していないもう一方の表面に刺激応答性ポリマー(温度応答性ポリマー)を含む層を形成する。 Further, 1 mL of an acetone solution (2 mg / mL) of carboxymethyl dextran (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd .; molecular weight 1 million) is dropped from above and rotated at 1,000 rpm for 1 minute. By sufficiently drying at room temperature, a layer containing a stimulus-responsive polymer (temperature-responsive polymer) is formed on the other surface of the gold thin film that is not in contact with the transparent flat substrate.
次に、得られる金基板を流路に固定し、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC;(株)同人化学研究所製)400mMと、N−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS;Thermo Scientific製)100mMとの混合液を、10μL/minにて10分間フローして、カルボキシメチルデキストランの活性エステル化を行う。 Next, the obtained gold substrate was fixed to the flow path, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC; manufactured by Dojin Chemical Laboratory) 400 mM, and N-hydroxysuccinic acid An active esterification of carboxymethyldextran is performed by flowing a mixed solution with 100 mM of imide (NHS; manufactured by Thermo Scientific) at 10 μL / min for 10 minutes.
続いて、抗αフェトプロテイン〔AFP〕モノクローナル抗体(1D5;2.5mg/mL,(株)日本医学臨床検査研究所製)を、10mM酢酸バッファー(pH5.0)にて20μg/mLに希釈して得られる溶液を、10μL/minにて10分間フローして、該抗体をカルボキシメチルデキストランに固定化する。 Subsequently, an anti-α-fetoprotein [AFP] monoclonal antibody (1D5; 2.5 mg / mL, manufactured by Japan Medical Laboratory) was diluted to 20 μg / mL with 10 mM acetate buffer (pH 5.0). The resulting solution is flowed at 10 μL / min for 10 minutes to immobilize the antibody on carboxymethyldextran.
最後に、1Mエタノールアミン塩酸塩(SIGMA社製;pH8.5)水溶液を10μL/minにて10分間フローすることによってブロッキング処理を行い、刺激応答性ポリマーとして温度応答性ポリマーを用いたプラズモン励起センサを作製する。 Finally, a plasmon excitation sensor using a temperature-responsive polymer as a stimulus-responsive polymer was subjected to blocking treatment by flowing an aqueous solution of 1M ethanolamine hydrochloride (manufactured by SIGMA; pH 8.5) at 10 μL / min for 10 minutes. Is made.
[作製例3](刺激応答性ポリマーがpH応答性ポリマーであるプラズモン励起センサの作製)
作製例2において、ポリN−イソプロピルアクリルアミドのエタノール溶液(1mg/mL)の代わりにポリアクリル酸メチルのエチルメチルケトン溶液(1mg/mL)を用いた以外は作製例2と同様にしてプラズモン励起センサを作製する。[Production Example 3] (Production of plasmon excitation sensor in which the stimulus-responsive polymer is a pH-responsive polymer)
In Preparation Example 2, a plasmon excitation sensor was prepared in the same manner as in Preparation Example 2, except that an ethyl methyl ketone solution (1 mg / mL) of methyl polyacrylate was used instead of an ethanol solution (1 mg / mL) of poly N-isopropylacrylamide. Is made.
なお、作製例3で得られるプラズモン励起センサは、刺激応答性ポリマーとしてpH応答性ポリマーを用いたものである。
[実施例1]
工程(a)として、作製例2で得られるプラズモン励起センサに、検体として、αフェトプロテイン(AFP;2.0mg/mL,Acris Antibodies GmbH製)をPBSバッファー(pH7.4)にて10ng/mLに希釈調製した溶液を、10μL/minにて、20分間フローすることによって接触させる。The plasmon excitation sensor obtained in Production Example 3 uses a pH responsive polymer as a stimulus responsive polymer.
[Example 1]
As a step (a), α-fetoprotein (AFP; 2.0 mg / mL, manufactured by Acris Antibodies GmbH) was added to the plasmon excitation sensor obtained in Production Example 2 to 10 ng / mL with PBS buffer (pH 7.4). The diluted solution is contacted by flowing at 10 μL / min for 20 minutes.
工程(b)として、作製例1で得られた標識2次抗体を、1%BSA PBSバッファー(pH7.4)にて2.5μg/mLに調製した希釈溶液を、10μL/minにて、さらに20分間フローすることによって反応させる。 As a step (b), a diluted solution prepared by adjusting the labeled secondary antibody obtained in Preparation Example 1 to 2.5 μg / mL with 1% BSA PBS buffer (pH 7.4) was further added at 10 μL / min. React by flowing for 20 minutes.
洗浄工程として、0.005%Tween20を含んだTBS溶液(pH7.4)を10μL/minにて、10分間フローする。
工程(c)として、プラズモン励起センサおよび流路に付属している温度制御装置により温度設定を25℃から37℃に変更することによって外部刺激を加える。As a washing step, a TBS solution (pH 7.4) containing 0.005% Tween 20 is flowed at 10 μL / min for 10 minutes.
As a step (c), an external stimulus is applied by changing the temperature setting from 25 ° C. to 37 ° C. by the temperature control device attached to the plasmon excitation sensor and the flow path.
工程(d)および(e)として、プリズムを経由してレーザ光を照射し、装置に付属しているCCDカメラより蛍光シグナルを測定する。なお、蛍光シグナルは、外部刺激を加えて1分後のCCDから観察したときのSPFSシグナル値を計測したものである。 In steps (d) and (e), laser light is irradiated via a prism, and a fluorescence signal is measured from a CCD camera attached to the apparatus. In addition, a fluorescence signal measures SPFS signal value when it observes from CCD 1 minute after adding external stimulus.
予測される結果を表2に示す。
[実施例2]
実施例1において、工程(a)で用いるプラズモン励起センサを作製例2で得られるものの代わりに作製例3で得られるものを用い、さらに工程(c)の外部刺激として温度変更の代わりに10mMグリシン塩酸水溶液(pH3.0)を10μL/minにて10分間フローするというpH変更を加える以外は、実施例1と同様にしてアッセイ法を実施し、蛍光シグナルを測定する。The predicted results are shown in Table 2.
[Example 2]
In Example 1, the plasmon excitation sensor used in step (a) was obtained in Preparation Example 3 instead of that obtained in Preparation Example 2, and 10 mM glycine was used as an external stimulus in Step (c) instead of temperature change. The assay method is carried out in the same manner as in Example 1 except that a pH change of flowing an aqueous hydrochloric acid solution (pH 3.0) at 10 μL / min for 10 minutes is performed, and the fluorescence signal is measured.
予測される結果を表2に示す。
[比較例1]
実施例1において工程(c)を実施しない、すなわち、実施例1の全工程を25℃で実施する以外は実施例1と同様にしてアッセイ法を実施し、蛍光シグナルを測定する。The predicted results are shown in Table 2.
[Comparative Example 1]
In Example 1, the step (c) is not carried out, that is, the assay method is carried out in the same manner as in Example 1 except that all the steps of Example 1 are carried out at 25 ° C., and the fluorescence signal is measured.
予測される結果を表2に示す。
[比較例2]
実施例1において、工程(c)を実施せず、かつ全工程を37℃で実施する以外は実施例1と同様にしてアッセイ法を実施し、蛍光シグナルを測定する。The predicted results are shown in Table 2.
[Comparative Example 2]
In Example 1, the assay method is carried out in the same manner as in Example 1 except that step (c) is not carried out and all steps are carried out at 37 ° C., and the fluorescence signal is measured.
予測される結果を表2に示す。
[比較例3]
実施例2において工程(c)を実施しない、すなわち、実施例2の全工程をpH7.4で実施する以外は実施例2と同様にしてアッセイ法を実施し、蛍光シグナルを測定する。The predicted results are shown in Table 2.
[Comparative Example 3]
The assay method is performed in the same manner as in Example 2 except that step (c) is not performed in Example 2, that is, all steps of Example 2 are performed at pH 7.4, and the fluorescence signal is measured.
予測される結果を表2に示す。
[比較例4]
実施例2において、工程(c)を実施せず、かつ全工程をpH3.0で実施する以外は実施例2と同様にしてアッセイ法を実施し、蛍光シグナルを測定する。The predicted results are shown in Table 2.
[Comparative Example 4]
In Example 2, the assay method is carried out in the same manner as in Example 2 except that step (c) is not carried out and all steps are carried out at pH 3.0, and the fluorescence signal is measured.
予測される結果を表2に示す。 The predicted results are shown in Table 2.
表2から、外部刺激をアッセイ法の工程に加えることによって、相転移を効率的に利用することができ、プラズモン励起センサの高感度化が優れることがわかる。 From Table 2, it can be seen that by adding an external stimulus to the assay process, the phase transition can be used efficiently and the sensitivity enhancement of the plasmon excitation sensor is excellent.
本発明のアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌(上皮内癌)の存在も高精度で予測することができる。 Since the assay method of the present invention can be detected with high sensitivity and high accuracy, for example, even a very small amount of tumor marker contained in blood can be detected. The presence of pre-clinical non-invasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by, for example, can be predicted with high accuracy.
1・・・・・・透明平面基板
2・・・・・・金属薄膜
3・・・・・・刺激応答ポリマーを含む層
4・・・・・・蛍光色素と第2のリガンドとのコンジュゲート
11・・・・・・金属膜が形成された基板
13・・・・・・刺激応答性高分子
14・・・・・・生体物質認識分子1 .... Transparent flat substrate 2 .... Metal thin film 3 .... Layer containing stimuli-responsive polymer 4 .... Conjugate of fluorescent dye and second ligand 11 .... Substrate 13 with metal film formed ... Stimulus responsive polymer 14 .... Biological substance recognition molecule
Claims (9)
工程(a):透明平面基板と;該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と;該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層と;該層に固定化された第1のリガンドとを含むプラズモン励起センサに検体を接触させる工程,
工程(b):上記工程(a)を経て得られたプラズモン励起センサに、第2のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程,
工程(c):上記工程(b)を経て得られたプラズモン励起センサに、該刺激応答性ポリマーが応答し得る外部刺激を加える工程,
工程(d):上記工程(c)を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程,および
工程(e):上記工程(d)で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。An assay method comprising at least the following steps (a) to (e);
Step (a): a transparent flat substrate; a metal thin film formed on one surface of the substrate; and a layer containing a stimulus-responsive polymer formed on the other surface of the thin film that is not in contact with the substrate And contacting the analyte with a plasmon excitation sensor comprising a first ligand immobilized on the layer;
Step (b): a step of reacting the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) with a conjugate of a second ligand and a fluorescent dye,
Step (c): adding an external stimulus to which the stimulus-responsive polymer can respond to the plasmon excitation sensor obtained through the step (b),
Step (d): Laser light is irradiated from the surface opposite to the surface on which the metal thin film is formed on the transparent flat substrate of the plasmon excitation sensor obtained through the step (c) via a prism. A step of measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye, and step (e): calculating the amount of analyte contained in the sample from the measurement result obtained in step (d) Process.
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