JP5516197B2 - Plasmon excitation sensor and assay method using the sensor - Google Patents
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Description
本発明は、プラズモン励起センサ，該センサを用いたアッセイ法，アッセイ用装置およびアッセイ用のキットに関する。さらに詳しくは、本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ〕の原理に基づき、表面プラズモンを利用するプラズモン励起センサ，該センサを用いたアッセイ法，アッセイ用装置およびアッセイ用のキットに関する。 The present invention relates to a plasmon excitation sensor, an assay method using the sensor, an assay device, and an assay kit. More specifically, the present invention is based on the principle of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy [SPFS: Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy], a plasmon excitation sensor using surface plasmon, an assay method using the sensor, and an assay. It relates to a device and a kit for an assay.
ＳＰＦＳ〔表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰〔ＡＴＲ〕する条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。 SPFS (surface plasmon excitation-enhanced fluorescence spectroscopy) is a method of generating a dense wave (surface plasmon) on the surface of a metal thin film in contact with a dielectric under the condition that the irradiated laser light is attenuated by total reflection [ATR] on the surface of the gold thin film. As a result, the amount of photons of the irradiated laser light is increased to several tens to several hundreds times (electric field enhancement effect of surface plasmons), thereby exciting the fluorescent dye near the metal thin film efficiently, Alternatively, it is a method capable of detecting an extremely low concentration of analyte.
このようなＳＰＦＳを利用したバイオセンサとして、特許文献１には、結合型プラズモン導波路共鳴〔Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｗａｖｅｇｕｉｄｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＣＰＷＲ〕に用いられる、金などからなる金属層を、ＳｉＯ2などからなる固体誘電体層で被覆することによって、さらに広範囲の電磁スペクトルにも対応できる表面プラズモン共鳴分光装置が開示されている。
As a biosensor using such SPFS,
しかしながら、このような装置は、励起光の散乱光などの迷光や部材の自家蛍光などによるノイズが発生しＳ／Ｎが低減する問題があることから改良の余地が認められる。
また、特許文献２には、ガラスと、その上に被覆した反射膜と、さらに該反射膜の上に誘電体材料または半導体材料によって形成された光導波路層と、該光導波路層の表面に化学修飾することによって固定化した分子認識基とを有する光導波モードセンサが提案されている。該光導波路層に細孔などの不規則な構造を形成することで、該光導波路層内に誘起される高い電場増強効果による誘電率変化を基本測定原理とする高感度な分子認識方法へ応用することも記載されている。
However, there is room for improvement in such an apparatus because there is a problem that noise due to stray light such as scattered light of excitation light or auto-fluorescence of a member is generated and S / N is reduced.
しかしながら、このようなセンサは、増強電場を大きく乱す構造、一般的には数１００ｎｍ以上の構造体となった時には、構造体形状が電場増強効果に影響を与えることから、構造体サイズとして極微小であることが求められる。そのため構造体形成が極めて難しく、特別な技術・装置が必要となる。また、細孔など構造体形状によっては測定分子の補足の障害となるという問題を孕んでいる。 However, such a sensor has a structure that greatly disturbs the enhanced electric field, generally, when the structure has a structure of several hundred nm or more, because the structure shape affects the electric field enhancement effect. It is required to be. Therefore, it is extremely difficult to form a structure, and a special technique / device is required. Further, there is a problem that depending on the shape of the structure such as pores, it may be an obstacle to supplement the measurement molecule.
特許文献３に記載の分子分析検出方法は、被分析物質を含む試料と接触する試料接触面の微小な所定領域に、所定の励起光が照射された場合に、該所定領域上において該試料接触面の他の領域上と比較して該被分析物質から生じる光を増幅させる増強場を生じさせる増強部材を備えたサンプルプレートを用い、増強場により増強された光を検出する方法が提案されている。図２において、該サンプルプレートは、ガラス板などの透明支持体(1)の一表面の微小な所定領域を含む一部領域に金属薄膜(2)が設けられており、さらに金属薄膜(2)上の微小な所定領域に対応する箇所に被覆層(4)が設けられている。被覆層(4)は消光を防止するために設け、ＳｉＯ2からなっていてもよく、その膜厚は１０〜１００ｎｍである。不撓性膜の表面には抗体等を配置することができる。
In the molecular analysis detection method described in
また、特許文献３には、ガラス基板などの誘電体プレートの一表面上に互いに異なる大きさ（面積）の２つの所定領域にそれぞれ該所定領域に応じた大きさの増強部材（金属膜）を設けたサンプルプレートも開示されている。
このように同一基板上に誘電体層を形成し、その膜厚・大きさ（面積）によって電場増強を制御している。 In this way, a dielectric layer is formed on the same substrate, and the electric field enhancement is controlled by the film thickness and size (area).
本発明は、ＳＰＦＳによる蛍光シグナルを向上させることができる高感度かつ高精度なプラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法，アッセイ用装置ならびにアッセイ用のキットを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a highly sensitive and accurate plasmon excitation sensor capable of improving the fluorescence signal by SPFS, an assay method using the same, an assay device, and an assay kit.
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、（ｉ）金属薄膜の表面の一部に誘電体からなる被覆層をパターニングすることによって、該被覆層内に均一な電場増強場を制御することができ、その結果、ＳＰＦＳ測定の際にノイズを低減することができること，（ｉｉ）誘電体からなる被覆層がパターニングされている領域と該領域以外の金属薄膜とでは電場増強度が異なるため、該領域の電場増強度が著しく向上し、検出シグナルを増幅すること，（ｉｉｉ）誘電体層を２層設けた場合、電場増強度を制御し、よりシグナル向上・ノイズ低減ができること，（ｉｖ）誘電体からなる被覆層をパターニングした領域と金属薄膜領域とで異なるリガンドを使用することで、特異性が向上し、かつ測定対象物外のノイズが低減することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above problems, the inventors of the present invention (i) patterning a coating layer made of a dielectric on a part of the surface of the metal thin film, thereby enhancing a uniform electric field in the coating layer. The field can be controlled, and as a result, noise can be reduced during SPFS measurement. (Ii) Electric field enhancement between the region where the coating layer made of a dielectric is patterned and a metal thin film other than the region The degree of electric field enhancement in this region is significantly improved and the detection signal is amplified. (Iii) When two dielectric layers are provided, the electric field enhancement is controlled, and signal improvement and noise reduction are further improved. (Iv) By using different ligands for the region where the coating layer made of dielectric is patterned and the metal thin film region, the specificity is improved and the noise outside the measurement object is reduced. The heading, which resulted in the completion of the present invention.
すなわち、本発明のプラズモン励起センサは、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体層と；該誘電体層の、該薄膜とは接していないもう一方の表面（Ｓ）のうち、その一部の領域（Ｓa）に形成された誘電体からなる被覆層と；該被覆層の、該誘電体層とは接していないもう一方の表面（Ｔ）に固定化されたリガンドとを含み、該誘電体層の厚さが、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下であり、該誘電体層と該被複層との合計の厚さが、１００ｎｍを超えて１μｍ以下であることを特徴とする。 That is, the plasmon excitation sensor of the present invention is formed on a transparent support; a metal thin film formed on one surface of the support; and the other surface of the thin film that is not in contact with the support. A dielectric layer; a coating layer made of a dielectric formed in a partial region (Sa) of the other surface (S) of the dielectric layer that is not in contact with the thin film; and the coating A ligand immobilized on the other surface (T) of the layer not in contact with the dielectric layer, the thickness of the dielectric layer being 5 nm or more and 100 nm or less, The total thickness with the multilayer is more than 100 nm and 1 μm or less.
本発明のプラズモン励起センサ（Ｉ），（ＩＩ）において、上記被覆層は、二酸化ケイ素〔ＳｉＯ2〕，二酸化チタン〔ＴｉＯ2〕または酸化アルミニウム〔Ａｌ2Ｏ3〕を含むものが好ましい。 In the plasmon excitation sensors (I) and (II) of the present invention, the coating layer preferably contains silicon dioxide [SiO 2 ], titanium dioxide [TiO 2 ] or aluminum oxide [Al 2 O 3 ].
本発明のプラズモン励起センサ（ＩＩ）において、上記誘電体層は、二酸化ケイ素〔ＳｉＯ2〕，二酸化チタン〔ＴｉＯ2〕または酸化アルミニウム〔Ａｌ2Ｏ3〕を含むものが好ましい。 In the plasmon excitation sensor (II) of the present invention, the dielectric layer preferably contains silicon dioxide [SiO 2 ], titanium dioxide [TiO 2 ] or aluminum oxide [Al 2 O 3 ].
本発明のプラズモン励起センサ（Ｉ），（ＩＩ）において、上記金属薄膜は、金，銀，アルミニウム，銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されていることが好ましく、該金属は、金からなることが好ましい。 In the plasmon excitation sensors (I) and (II) of the present invention, the metal thin film is preferably formed of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper and platinum. The metal is preferably made of gold.
本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする。
工程（ａ）：本発明のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程，
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程，
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，および
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライトの量を算出する工程。
The assay method of the present invention includes the following steps (a) to (d).
Step (a): a step of bringing a specimen into contact with the plasmon excitation sensor of the present invention,
Step (b): a conjugate of a ligand and a fluorescent dye, which may be the same as or different from the ligand contained in the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) Reacting
Step (c): irradiating the plasmon excitation sensor obtained through the step (b) with a laser beam via a prism from the other surface of the transparent support on which the metal thin film is not formed, A step of measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye, and a step (d): a step of calculating the amount of the analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (c).
上記アナライトとは異なるアナライトであって、上記アナライトと競合するアナライトが、上記コンジュゲートと予め結合していてもよい。
上記検体は、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液であることが好ましい。
An analyte that is different from the analyte and that competes with the analyte may be previously bound to the conjugate.
The specimen is preferably at least one body fluid selected from the group consisting of blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva.
上記アナライトは、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原であってもよい。
また、本発明のアッセイ用装置は、少なくとも、上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサ，レーザ光の光源，光学フィルタ，プリズム，カットフィルタ，集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍光検出部を含み、上記工程（ｃ）に用いられることを特徴とする。
The analyte may be a tumor marker or carcinoembryonic antigen.
The assay device of the present invention includes at least a plasmon excitation sensor, a laser light source, an optical filter, a prism, a cut filter, a condensing lens, and a surface plasmon excitation enhanced fluorescence detection unit obtained through the step (b). It is used for the said process (c).
そして、本発明のアッセイ用のキットは、少なくとも、透明支持体と上記金属薄膜と上記の誘電体からなる被覆層とを含むセンサおよび蛍光色素を含み、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とする。 The assay kit of the present invention comprises at least a sensor including a transparent support, the metal thin film, and a coating layer made of the dielectric, and a fluorescent dye, and is used for the assay method of the present invention. And
本発明は、
（Ａ）誘電体層〔誘電体層（１）〕の表面（Ｓ：例えば２ｍｍ×１４ｍｍ；ＳaとＳbとの和）に、数百μｍ2程度の一部の領域（Ｓa）に渡って誘電体からなる被覆層〔誘電体層（２）〕をパターニングすることによって、誘電体層（２）からなる領域（Ｔ；ＳaとＴとの面積は等しい。）内に均一な電場増強場を設けることができ、その結果、ＳＰＦＳ測定の際にノイズを低減することができる；
（Ｂ）誘電体層（２）がパターニングされている領域（Ｔ）と、該領域（Ｔ）以外の誘電体層（１）（Ｓb）とでは電場増強度が著しく異なるため、該領域（Ｔ）の電場増強度が著しく向上し、検出シグナルを増幅することができる；
（Ｃ）同一の誘電体層（１）の表面（Ｓ）に、誘電体層（２）がパターニングされている領域（Ｔ）を１個または複数個形成し、それら領域（Ｔ）の総面積および誘電体層（２）の厚さ（屈折率〔ｎD〕）をそれぞれ制御すること（すなわち、電場増強度を適宜選択すること）によって、検出シグナルの強度をコントロールでき、測定のダイナミックレンジの調整が可能となる；
（Ｄ）領域（Ｔ）の誘電体の厚さが１００ｎｍを超えて１μｍ以下であり、領域（Ｓb）の誘電体の厚さが５〜１００ｎｍであるから、領域（Ｔ）では電場増強効果が著しく向上しているのに対して、領域（Ｓb）では電場増強度が抑制されているため、測定のダイナミックレンジが広がり（すなわち、アナライト濃度の低い検体にも対応でき）、シグナル増幅・ノイズ低減により優れる；ならびに
（Ｅ）領域（Ｔ）および領域（Ｓb）においてそれぞれ異なるリガンドを用いる（例えば、領域（Ｔ）にアナライト（標的抗原）に対する抗体を固定化し、領域（Ｓb）に夾雑物に対する抗体を固定化する）ことで、特異性が向上し、かつ測定対象物外に起因するノイズが低減する、
プラズモン励起センサおよびそれを用いたアッセイ法、アッセイ用装置ならびにアッセイ用のキットを提供することができる。
The present invention
(A) On the surface of the dielectric layer [dielectric layer (1)] (S: for example 2 mm × 14 mm; the sum of Sa and Sb), the dielectric is applied over a partial region (Sa) of about several hundred μm 2. By patterning the covering layer [dielectric layer (2)] made of a body, a uniform electric field enhancement field is provided in a region (T; the area of Sa and T is equal) made of the dielectric layer (2). As a result, noise can be reduced during SPFS measurement;
(B) Since the electric field enhancement is significantly different between the region (T) where the dielectric layer (2) is patterned and the dielectric layer (1) (Sb) other than the region (T), the region (T ) Is significantly improved and the detection signal can be amplified;
(C) One or a plurality of regions (T) in which the dielectric layer (2) is patterned are formed on the surface (S) of the same dielectric layer (1), and the total area of these regions (T) And the thickness of the dielectric layer (2) (refractive index [n D ]) can be controlled (ie, the electric field enhancement can be appropriately selected) to control the intensity of the detection signal, and the dynamic range of the measurement Can be adjusted;
(D) Since the thickness of the dielectric in the region (T) exceeds 100 nm and is 1 μm or less, and the thickness of the dielectric in the region (Sb) is 5 to 100 nm, the electric field enhancing effect is exerted in the region (T). In contrast to the significant improvement, the field (Sb) suppresses the electric field enhancement, thus expanding the dynamic range of the measurement (that is, it can handle samples with low analyte concentration), and signal amplification and noise. (E) Using different ligands in the region (T) and the region (Sb), respectively (for example, immobilizing an antibody against the analyte (target antigen) in the region (T) and contaminating the region (Sb) By immobilizing the antibody against), the specificity is improved and noise caused by the outside of the measurement object is reduced.
A plasmon excitation sensor and an assay method, an assay device, and an assay kit using the plasmon excitation sensor can be provided.
次に、本発明のプラズモン励起センサ，該センサを用いたアッセイ法，アッセイ用装置およびアッセイ用のキットについて、詳細に説明する。
＜プラズモン励起センサ＞
本発明のプラズモン励起センサは、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体層と；該誘電体層の、該薄膜とは接していないもう一方の表面（Ｓ）のうち、その一部の領域（Ｓa）に形成された誘電体からなる被覆層と；該被覆層の、該誘電体層とは接していないもう一方の表面（Ｔ）に固定化されたリガンドとを含み、該誘電体層の厚さが、５〜１００ｎｍであり、該誘電体層と該被複層との合計の厚さが、１００ｎｍを超えて１μｍであることを特徴とする。例えば、リガンドを固定化する前のプラズモン励起センサとしては、図１（ａ）に示すように、透明支持体(1)と金属薄膜(2)と誘電体層(3)とがこの順序で積層し、誘電体層(3)の、金属薄膜(2)とは接していない一方の表面の一部に、誘電体からなる被覆層(4)が形成されている態様であってもよい。
Next, the plasmon excitation sensor of the present invention, the assay method using the sensor, the assay device, and the assay kit will be described in detail.
<Plasmon excitation sensor>
The plasmon excitation sensor of the present invention comprises: a transparent support; a metal thin film formed on one surface of the support; and a dielectric formed on the other surface of the thin film that is not in contact with the support A coating layer made of a dielectric formed in a partial region (Sa) of the other surface (S) of the dielectric layer that is not in contact with the thin film; and A ligand immobilized on the other surface (T) not in contact with the dielectric layer, the dielectric layer having a thickness of 5 to 100 nm, and the dielectric layer and the coating The total thickness with the layer is more than 100 nm and 1 μm. For example, as a plasmon excitation sensor before immobilizing a ligand, as shown in FIG. 1A, a transparent support (1), a metal thin film (2), and a dielectric layer (3) are laminated in this order. The dielectric layer (3) may have a coating layer (4) made of a dielectric material on a part of one surface not in contact with the metal thin film (2).
なお、ＳはＳaとＳbとの和に相当し、ＳaとＴとは同じ大きさの面積を有する。また、「誘電体層」および「誘電体からなる被覆層」を、それぞれ「誘電体層（１）」および「誘電体層（２）」ともいう。
すなわち、本発明のプラズモン励起センサは、少なくとも、透明支持体，金属薄膜，誘電体層（１），誘電体層（２）およびリガンドを含むものである。
Note that S corresponds to the sum of Sa and Sb, and Sa and T have the same area. The “dielectric layer” and the “coating layer made of a dielectric” are also referred to as “dielectric layer (1)” and “dielectric layer (2)”, respectively.
That is, the plasmon excitation sensor of the present invention includes at least a transparent support, a metal thin film, a dielectric layer (1), a dielectric layer (2), and a ligand.
〔透明支持体〕
本発明において、プラズモン励起センサの構造を支持する基板として透明支持体が用いられる。本発明において、基板として透明支持体を用いるのは、後述する金属薄膜への光照射をこの透明支持体を通じて行うからである。
(Transparent support)
In the present invention, a transparent support is used as a substrate for supporting the structure of the plasmon excitation sensor. In the present invention, the transparent support is used as the substrate because light irradiation to the metal thin film described later is performed through the transparent support.
本発明で用いられる透明支持体について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明支持体が、ガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート〔ＰＣ〕，シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよい。 The material for the transparent support used in the present invention is not particularly limited as long as the object of the present invention is achieved. For example, the transparent support may be made of glass, or may be made of plastic such as polycarbonate [PC] or cycloolefin polymer [COP].
また、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。 The refractive index at the d-line (588 nm) [n d] is preferably from 1.40 to 2.20, is preferably thick 0.01 to 10 mm, more preferably if 0.5 to 5 mm, The size (vertical x horizontal) is not particularly limited.
なお、ガラス製の透明支持体は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎd〕１．５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎd〕１．８５），（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎd〕１．８４），「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎd〕１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎd〕１．９０），ならびに（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎd〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。 In addition, the transparent support made of glass is “BK7” (refractive index [n d ] 1.52) and “LaSFN9” (refractive index [n d ] 1.85) manufactured by Shot Japan Co., Ltd. as commercially available products. “K-PSFn3” (refractive index [n d ] 1.84), “K-LaSFn17” (refractive index [n d ] 1.88) and “K-LaSFn22” (refractive index) manufactured by Sumita Optical Glass Co., Ltd. Ratio [n d ] 1.90) and “S-LAL10” (refractive index [n d ] 1.72) manufactured by OHARA INC. Are preferred from the viewpoint of optical properties and detergency.
透明支持体は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
The transparent support is preferably cleaned with acid and / or plasma before forming a metal thin film on the surface.
As the cleaning treatment with an acid, it is preferable to immerse in 0.001 to 1N hydrochloric acid for 1 to 3 hours.
Examples of the plasma cleaning treatment include a method of immersing in a plasma dry cleaner (“PDC200” manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd.) for 0.1 to 30 minutes.
〔金属薄膜〕
本発明のプラズモン励起センサでは、上記透明支持体の一方の表面に金属薄膜を形成する。この金属薄膜は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させ、蛍光色素の発光をもたらす役割を有する。
[Metal thin film]
In the plasmon excitation sensor of the present invention, a metal thin film is formed on one surface of the transparent support. This metal thin film has a role of generating surface plasmon excitation by light irradiated from a light source, generating an electric field, and causing emission of a fluorescent dye.
上記透明支持体の一方の表面に形成された金属薄膜としては、金，銀，アルミニウム，銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、その合金の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。 The metal thin film formed on one surface of the transparent support is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper and platinum, and more preferably made of gold. . These metals may be in the form of their alloys. Such metal species are preferable because they are stable against oxidation and increase in electric field due to surface plasmons increases.
なお、透明支持体としてガラス製の支持体を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム，ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。 When a glass support is used as the transparent support, it is preferable to form a chromium, nickel chromium alloy or titanium thin film in advance in order to more firmly bond the glass and the metal thin film.
透明支持体上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法等），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。 Examples of the method for forming a metal thin film on the transparent support include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like. Since it is easy to adjust the thin film formation conditions, it is preferable to form a chromium thin film and / or a metal thin film by sputtering or vapor deposition.
金属薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ，銀：５〜５００ｎｍ，アルミニウム：５〜５００ｎｍ，銅：５〜５００ｎｍ，白金：５〜５００ｎｍ，およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。 The thickness of the metal thin film is preferably gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and alloys thereof: 5 to 500 nm. The thickness of the thin film is preferably 1 to 20 nm.
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ，銀：２０〜７０ｎｍ，アルミニウム：１０〜５０ｎｍ，銅：２０〜７０ｎｍ，白金：２０〜７０ｎｍ，およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。 From the viewpoint of the electric field enhancing effect, gold: 20-70 nm, silver: 20-70 nm, aluminum: 10-50 nm, copper: 20-70 nm, platinum: 20-70 nm, and alloys thereof: 10-70 nm are more preferable, and chromium The thickness of the thin film is more preferably 1 to 3 nm.
金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。 When the thickness of the metal thin film is within the above range, surface plasmons are easily generated, which is preferable. Moreover, if it is a metal thin film which has such thickness, a magnitude | size (length x width) will not be specifically limited.
〔誘電体層〕（＝誘電体層（１））
本発明のプラズモン励起センサで用いる誘電体層（１）は、上記金属薄膜の、上記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成されたものである。
[Dielectric layer] (= Dielectric layer (1))
The dielectric layer (1) used in the plasmon excitation sensor of the present invention is formed on the other surface of the metal thin film that is not in contact with the transparent support.
誘電体層（１）の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物，天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（シリカ）〔ＳｉＯ2〕，二酸化チタン（チタニア）〔ＴｉＯ2〕または酸化アルミニウム（アルミナ）〔Ａｌ2Ｏ3〕を含むことが好ましい。 As the dielectric used for forming the dielectric layer (1), various optically transparent inorganic substances, natural or synthetic polymers can be used. Among them, since it is excellent in chemical stability, production stability and optical transparency, silicon dioxide (silica) [SiO 2 ], titanium dioxide (titania) [TiO 2 ] or aluminum oxide (alumina) [ Al 2 O 3 ] is preferably included.
誘電体層（１）は、所定の波長で観察可能な範囲内の入射角で、または所定の入射角で観察可能な範囲内の波長で、共鳴を発生させるための屈折率および厚さの要件を満たす場合、このような誘電体層（１）は本発明の実施に用いることができる。誘電体層（１）の形成に用いられる上記誘電体以外の材料としては、例えば、フッ化マグネシウム〔ＭｇＦ2〕，フッ化ランタン〔ＬａＦ3〕，氷晶石（クリオライト）〔Ｎａ3ＡｌＦ6〕，硫化亜鉛〔ＺｎＳ〕，酸化ジルコニウム（ジルコニア）〔ＺｉＯ2〕，酸化イットリウム〔Ｙ2Ｏ3〕，酸化ハフニウム〔ＨｆＯ2〕，五酸化タンタル〔Ｔａ3Ｏ5〕，酸化インジウムスズ〔ＩＴＯ〕，ケイ素〔Ｓｉ〕，アルミニウムの亜硝酸塩またはオキシ亜硝酸塩などが挙げられ、これらはすべて光学的用途で一般的に用いられ、誘電体層（１）の形成に用いることができる。 The dielectric layer (1) has a refractive index and thickness requirement for generating resonance at an incident angle within a range observable at a predetermined wavelength or at a wavelength within a range observable at a predetermined incident angle. Such a dielectric layer (1) can be used in the practice of the present invention. Examples of materials other than the dielectric used for forming the dielectric layer (1) include magnesium fluoride [MgF 2 ], lanthanum fluoride [LaF 3 ], cryolite (Na 3 AlF 6 ). ], zinc sulfide [ZnS], zirconium oxide (zirconia) [ZiO 2], yttrium oxide [Y 2 O 3], hafnium oxide [HfO 2], tantalum pentoxide [Ta 3 O 5], indium tin oxide [ITO] , Silicon [Si], aluminum nitrites or oxynitrites, etc., all of which are commonly used in optical applications and can be used to form the dielectric layer (1).
誘電体層（１）の厚さは、５〜１００ｎｍであることが好ましい。誘電体層（１）の厚さが上記範囲内であると、電場増強が小さく測定エリア外の蛍光シグナルを低減できるため好適である。 The thickness of the dielectric layer (1) is preferably 5 to 100 nm. When the thickness of the dielectric layer (1) is within the above range, it is preferable because the electric field enhancement is small and the fluorescence signal outside the measurement area can be reduced.
誘電体層（１）の形成方法としては、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，化学反応による形成方法，またはリソグラフィー，スピンコータによる塗布などが挙げられる。これらのうち、膜厚制御の観点からスパッタリング法が好ましい。 Examples of the method for forming the dielectric layer (1) include a sputtering method, an electron beam evaporation method, a thermal evaporation method, a formation method using a chemical reaction, or a lithography method and a coating method using a spin coater. Of these, sputtering is preferred from the viewpoint of film thickness control.
〔誘電体からなる被覆層〕（＝誘電体層（２））
本発明のプラズモン励起センサで用いる誘電体層（２）は、誘電体層（１）の、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面（Ｓ）のうち、その一部の領域（Ｓa）に形成されたものである。
[Coating layer made of dielectric] (= dielectric layer (2))
The dielectric layer (2) used in the plasmon excitation sensor of the present invention is a partial region (Sa) of the other surface (S) of the dielectric layer (1) not in contact with the metal thin film. It is formed.
誘電体層（１），（２）のそれぞれの屈折率は異なっていても同じであってもよい。
誘電体層（２）の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物，天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性に優れていることから、ＳｉＯ2，ＴｉＯ2またはＡｌ2Ｏ3を含むことが好ましい。
The refractive indexes of the dielectric layers (1) and (2) may be different or the same.
As the dielectric used for forming the dielectric layer (2), various optically transparent inorganic substances, natural or synthetic polymers can be used. Among them, it is preferable to contain SiO 2 , TiO 2, or Al 2 O 3 because it is excellent in chemical stability, production stability, and optical transparency.
誘電体層（２）または誘電体層（１）と（２）との組み合わせが、所定の波長で観察可能な範囲内の入射角で、または所定の入射角で観察可能な範囲内の波長で、共鳴を発生させるための屈折率および厚さの要件を満たす場合、誘電体層（２）および誘電体層（１）と（２）との組み合わせは本発明の実施に用いることができる。誘電体層（２）の形成に用いられる上記誘電体以外の材料としては、例えば、誘電体層（１）の場合と同様、ＭｇＦ2，ＬａＦ3，Ｎａ3ＡｌＦ6，ＺｎＳ，ＺｉＯ2，Ｙ2Ｏ3，ＨｆＯ2，Ｔａ3Ｏ5，ＩＴＯ，Ｓｉ，アルミニウムの亜硝酸塩またはオキシ亜硝酸塩が挙げられ、これらはすべて光学的用途で一般的に用いられ、誘電体層（２）の形成に用いることができる。 The dielectric layer (2) or the combination of the dielectric layers (1) and (2) at an incident angle within a range observable at a predetermined wavelength, or at a wavelength within a range observable at a predetermined incident angle. The dielectric layer (2) and the combination of the dielectric layers (1) and (2) can be used in the practice of the present invention if the refractive index and thickness requirements for generating resonance are met. As a material other than the dielectric used for forming the dielectric layer (2), for example, as in the case of the dielectric layer (1), MgF 2 , LaF 3 , Na 3 AlF 6 , ZnS, ZiO 2 , Y 2 O 3 , HfO 2 , Ta 3 O 5 , ITO, Si, aluminum nitrites or oxynitrites, all of which are commonly used in optical applications and are used to form the dielectric layer (2). Can be used.
誘電体層（２）の面積（Ｔ）は、本発明において特に限定されるものではないが、レーザ照射面積より小さく、上記金属薄膜の表面（Ｓ）が２ｍｍ×１４ｍｍ＝２８ｍｍ2＝２．８×１０7μｍ2であるとすると、１μｍ2〜１．５×１０7μｍ2が好ましい。誘電体層（２）の面積（Ｔ）が１μｍ2未満であると、誘電体層（２）上のリガンドを介して捕捉されるアナライト数が少なくなるため、シグナルを得ることが困難な場合がある。また、誘電体層（２）の面積（Ｔ）が１．５×１０7μｍ2を超えると、測定個所によるムラの影響を受けるという問題を生じることがある。 The area (T) of the dielectric layer (2) is not particularly limited in the present invention, but is smaller than the laser irradiation area, and the surface (S) of the metal thin film is 2 mm × 14 mm = 28 mm 2 = 2.8. When it is × 10 7 μm 2 , 1 μm 2 to 1.5 × 10 7 μm 2 is preferable. When the area (T) of the dielectric layer (2) is less than 1 μm 2 , the number of analytes captured via the ligand on the dielectric layer (2) is reduced, and thus it is difficult to obtain a signal. There is. Further, if the area (T) of the dielectric layer (2) exceeds 1.5 × 10 7 μm 2 , there may be a problem that it is affected by unevenness due to the measurement location.
なお、本発明において、誘電体層（１）の表面（Ｓ）は、上記金属薄膜の表面および上記透明支持体の表面と同じ面積を有し、流路の底面積と同じであっても、流路の底面積より小さくてもよい。 In the present invention, the surface (S) of the dielectric layer (1) has the same area as the surface of the metal thin film and the surface of the transparent support, and the same as the bottom area of the flow path, It may be smaller than the bottom area of the flow path.
誘電体層（２）の厚さは、１００ｎｍを超えることが好ましく、レーザ光の波長以上がより好ましい。誘電体層（２）の厚さが、１００ｎｍ以下であると、得られる電場増強効果が小さい場合がある。 The thickness of the dielectric layer (2) is preferably more than 100 nm, and more preferably not less than the wavelength of the laser beam. When the thickness of the dielectric layer (2) is 100 nm or less, the obtained electric field enhancing effect may be small.
誘電体層（２）の形成方法としては、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，化学反応による形成方法，またはリソグラフィー，スピンコータによる塗布などが挙げられる。これらのうち、膜厚制御の観点からスパッタリング法が好適である。 Examples of the method for forming the dielectric layer (2) include a sputtering method, an electron beam evaporation method, a thermal evaporation method, a formation method by a chemical reaction, or application by lithography and a spin coater. Of these, sputtering is preferred from the viewpoint of film thickness control.
また、誘電体層（２）は同一の金属薄膜表面上に複数個所設けることが好ましい。膜厚および屈折率をそれぞれ同じ条件で複数個の誘電体層（２）を形成した場合であっても、膜厚または屈折率が異なる複数個の誘電体（２）を形成した場合であっても、同様にマルチ検出ができ、さらにダイナミックレンジを広域化（例えば、検体に含まれるアナライト濃度が高い場合に、より狭い面積の誘電体層（２）を用い、アナライト濃度が低い場合に、より広い面積の誘電体層（２）を用いることによって、低濃度から高濃度の検体に対応）できるため好適である。例えば、リガンドを固定化する前のプラズモン励起センサとしては、図１（ｂ）に示すように、透明支持体(1)と金属薄膜(2)と誘電体層(3)とがこの順序で積層し、誘電体層(3)の、金属薄膜(2)とは接していない一方の表面の一部に、屈折率ｎ１の誘電体からなる被覆層(4a)と屈折率ｎ２の誘電体からなる被覆層(4b)とが形成されている態様であってもよく、図１（ｃ）に示すように、該誘電体層(3)の、金属薄膜(2)とは接していない一方の表面の一部に、屈折率ｎ１の誘電体からなる被覆層(4a)と、該被覆層(4b)とは厚さが異なる屈折率ｎ２の誘電体からなる被覆層(4c)とが形成されている態様であってもよい。 Moreover, it is preferable to provide a plurality of dielectric layers (2) on the same metal thin film surface. Even when a plurality of dielectric layers (2) are formed under the same conditions of film thickness and refractive index, a plurality of dielectrics (2) having different film thicknesses or refractive indexes are formed. Similarly, multi-detection can be performed and the dynamic range is expanded (for example, when the analyte concentration contained in the specimen is high, the dielectric layer (2) having a smaller area is used and the analyte concentration is low). It is preferable to use a dielectric layer (2) having a larger area because it can cope with a specimen having a low concentration to a high concentration. For example, as a plasmon excitation sensor before immobilizing a ligand, a transparent support (1), a metal thin film (2), and a dielectric layer (3) are laminated in this order as shown in FIG. The dielectric layer (3) is formed of a coating layer (4a) made of a dielectric having a refractive index n1 and a dielectric having a refractive index n2 on a part of one surface not in contact with the metal thin film (2). The coating layer (4b) may be formed, and as shown in FIG. 1 (c), one surface of the dielectric layer (3) not in contact with the metal thin film (2) A coating layer (4a) made of a dielectric material having a refractive index n1 and a coating layer (4c) made of a dielectric material having a refractive index n2 having a thickness different from that of the coating layer (4b) are formed. It may be a mode.
誘電体層（２）の屈折率は、誘電体層（２）を構成する誘電体の材料を適宜選択する、例えば、ＳｉとＳｉＯ2との混合物等にすることによって屈折率を制御することができる。 The refractive index of the dielectric layer (2) can be controlled by appropriately selecting a dielectric material constituting the dielectric layer (2), for example, by using a mixture of Si and SiO 2 or the like. it can.
誘電体層（１）と誘電体層（２）との合計の厚さは、１００ｎｍを超えて１μｍであり、好ましくは１５０〜１μｍである。誘電体層（１）と（２）との合計の厚さが上記範囲内であると、電場増強度が極めて大きくなり、シグナル強度を大きくすることができるため好適である。 The total thickness of the dielectric layer (1) and the dielectric layer (2) is more than 100 nm and 1 μm, preferably 150 to 1 μm. When the total thickness of the dielectric layers (1) and (2) is within the above range, it is preferable because the electric field enhancement becomes extremely large and the signal strength can be increased.
電場増強度は誘電体層（１）＋（２）の厚さに対して厳密であり、その分布はある間隔をもって電場増強のピーク(極大値)を有する。種々の材料に依存する電場増強ピークはいずれも１５０〜１０００ｎｍの範囲で複数点ある。誘電体層を構成する材料の屈折率条件のうち、本発明の作用効果を奏する範囲内で好適な厚さを適宜調整することができる。種々の材料を検討した結果、いずれの材料であっても１００ｎｍ以下の厚さでは電場増強が極めて小さくなることがわかった。 The electric field enhancement is strict with respect to the thickness of the dielectric layer (1) + (2), and the distribution has a peak (maximum value) of electric field enhancement at a certain interval. There are multiple electric field enhancement peaks depending on various materials in the range of 150 to 1000 nm. Of the refractive index conditions of the material constituting the dielectric layer, a suitable thickness can be appropriately adjusted within the range where the effects of the present invention are exhibited. As a result of examining various materials, it was found that the electric field enhancement is extremely small at a thickness of 100 nm or less for any material.
〔リガンド〕
本発明で用いられるリガンドは、誘電体層（１）の、金属薄膜とは接していないもう一方の表面（Ｓ）のうち、該領域（Ｓa）以外の領域（Ｓb）にリガンド（Ｙ）が任意に固定化され、さらに上記誘電体層（２）の、誘電体層（１）とは接していないもう一方の表面（Ｔ）にリガンド（Ｘ）が固定化されている。
[Ligand]
The ligand used in the present invention is the ligand (Y) in the region (Sb) other than the region (Sa) in the other surface (S) of the dielectric layer (1) not in contact with the metal thin film. The ligand (X) is immobilized on the other surface (T) of the dielectric layer (2) which is arbitrarily fixed and is not in contact with the dielectric layer (1).
本発明で用いられるリガンド（Ｘ）は、本発明のプラズモン励起センサを本発明のアッセイ法に用いた際に、検体中のアナライトを固定（捕捉）させる目的で用いられるものである。また、リガンド（Ｙ）は、本発明のプラズモン励起センサを本発明のアッセイ法に用いた際に、検体中の特定の夾雑物を固定（捕捉）させる目的で用いられるものである。 The ligand (X) used in the present invention is used for the purpose of immobilizing (capturing) an analyte in a specimen when the plasmon excitation sensor of the present invention is used in the assay method of the present invention. The ligand (Y) is used for the purpose of fixing (capturing) specific contaminants in the specimen when the plasmon excitation sensor of the present invention is used in the assay method of the present invention.
本明細書において、本発明のアッセイ法に用いる「リガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」のリガンドと区別するために、本発明のプラズモン励起センサで用いるリガンド（Ｘ）を以下「第１のリガンド」とし、本発明のアッセイ法に用いるリガンドを以下「第２のリガンド」とする。なお、第１のリガンドと第２のリガンドは同じであっても異なっていてもよい。 In this specification, in order to distinguish from the ligand of “conjugate of ligand and fluorescent dye” used in the assay method of the present invention, the ligand (X) used in the plasmon excitation sensor of the present invention is hereinafter referred to as “first ligand”. The ligand used in the assay method of the present invention is hereinafter referred to as “second ligand”. The first ligand and the second ligand may be the same or different.
本発明において、第１のリガンドとは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片をいう。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ〔ペプチド核酸〕等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 In the present invention, the first ligand refers to a molecule or molecular fragment that can specifically recognize (or be recognized) and bind to an analyte contained in a specimen. Examples of such “molecules” or “molecular fragments” include nucleic acids (DNA, RNA, polynucleotides, oligonucleotides, PNA [peptide nucleic acids], which may be single-stranded or double-stranded, etc.) Alternatively, nucleosides, nucleotides and their modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modifications thereof Examples include, but are not limited to, molecules and complexes.
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能），抗ガン胎児性抗原〔ＣＥＡ〕モノクローナル抗体，抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体，抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。 Examples of the “protein” include antibodies and the like, specifically, anti-α-fetoprotein [AFP] monoclonal antibody (available from Nippon Medical Laboratory, Inc.), anti-carcinoembryonic antigen [CEA Monoclonal antibodies, anti-CA19-9 monoclonal antibodies, anti-PSA monoclonal antibodies, and the like.
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体，遺伝子組換えにより得られる抗体，および抗体断片を包含する。
この第１のリガンドの固定化方法としては、例えば、カルボキシメチルデキストランなどの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕等）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、第１のリガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；下記ＳＡＭが有するカルボキシル基を、上述のようにして第１のリガンドが有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
In the present invention, the term “antibody” includes a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, an antibody obtained by gene recombination, and an antibody fragment.
As a method for immobilizing the first ligand, for example, a carboxyl group possessed by a polymer having a reactive functional group such as carboxymethyldextran is converted into a water-soluble carbodiimide [WSC] (for example, 1-ethyl-3- (3 -Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride [EDC] and the like and active esterification with N-hydroxysuccinimide [NHS], and the thus obtained active esterified carboxyl group and the amino group of the first ligand Examples include a method of dehydrating and immobilizing using a water-soluble carbodiimide; a method of dehydrating and immobilizing the carboxyl group of the following SAM with the amino group of the first ligand as described above.
なお、後述する検体等がプラズモン励起センサに非特異的に吸着することを防止するため、上記リガンドを固定化させた後に、プラズモン励起センサの表面を牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。 In order to prevent non-specific adsorption of a specimen or the like, which will be described later, to the plasmon excitation sensor, after immobilizing the ligand, the surface of the plasmon excitation sensor is treated with a blocking agent such as bovine serum albumin [BSA]. It is preferable to do.
（ＳＡＭ）
ＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕は、アッセイエリア（誘電体層（２）（Ｔ）に相当する。）に形成されることが望ましいが、誘電体層（１）の、金属薄膜とは接していないもう一方の表面（Ｓ）のうちの領域（Ｓb）に形成されていてもよい。
(SAM)
The SAM (Self-Assembled Monolayer) is preferably formed in the assay area (corresponding to the dielectric layer (2) (T)), but the dielectric layer (1) You may form in the area | region (Sb) of the other surface (S) which is not in contact with the metal thin film.
このＳＡＭが含む単分子としては、加水分解でシラノール基〔Ｓｉ-ＯＨ〕を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にチオール基，アミノ基，グリシジル基，カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。
このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
The SAM contains a ethoxy group (or methoxy group) that gives a silanol group [Si-OH] by hydrolysis, and a reactive group such as a thiol group, amino group, glycidyl group, or carboxyl group at the other end. If it is a silane coupling agent which has this, it will not specifically limit, A conventionally well-known silane coupling agent can be used.
A method for forming such a SAM is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｄ）、好ましくはさらに洗浄工程を含むことを特徴とするものである。
<Assay method>
The assay method of the present invention comprises the following steps (a) to (d), preferably further comprising a washing step.
工程（ａ）：本発明のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程；
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程；
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程；
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライトの量を算出する工程；ならびに
洗浄工程：上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面および／または上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程。
Step (a): A step of bringing a specimen into contact with the plasmon excitation sensor of the present invention;
Step (b): a conjugate of a ligand and a fluorescent dye, which may be the same as or different from the ligand contained in the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) Reacting;
Step (c): The plasmon excitation sensor obtained through the step (b) is irradiated with laser light via a prism from the other surface of the transparent support on which the metal thin film is not formed. Measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye;
Step (d): a step of calculating the amount of the analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (c); and a washing step: a plasmon excitation sensor obtained through the step (a) And / or the surface of the plasmon excitation sensor obtained through the step (b).
〔工程（ａ）〕
工程（ａ）は、本発明のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程である。
[Step (a)]
Step (a) is a step of bringing a specimen into contact with the plasmon excitation sensor of the present invention.
（検体）
検体としては、例えば、血液（血清・血漿），尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液および唾液が好ましい。
(Sample)
Examples of specimens include blood (serum / plasma), urine, nasal fluid, saliva, stool, body cavity fluid (spinal fluid, ascites, pleural effusion, etc.), etc. It may be used. Of these samples, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid and saliva are preferred.
（接触）
接触としては、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサの第１のリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。
(contact)
As the contact, in the state where the specimen is contained in the liquid supply circulating in the flow path and only one surface on which the first ligand of the plasmon excitation sensor is immobilized is immersed in the liquid supply, the plasmon excitation sensor An embodiment in which the sample and the specimen are brought into contact with each other is preferable.
「流路」の材料としては、プラズモン励起センサ部または流路天板ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、薬液送達部ではシリコンゴム，テフロン（登録商標），ポリエチレン，ポリプロピレン等のポリマーを用いる。 The material of the “flow path” is a homopolymer or copolymer containing methyl methacrylate, styrene or the like as a raw material in the plasmon excitation sensor section or the flow path top plate; polyolefin such as polyethylene, and silicon rubber in the drug delivery section. , Teflon (registered trademark), polyethylene, polypropylene and other polymers are used.
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。 In the plasmon excitation sensor unit, from the viewpoint of increasing the contact efficiency with the specimen and shortening the diffusion distance, it is preferable that the cross section of the channel of the plasmon excitation sensor unit is independently about 100 nm to 1 mm in length and width.
流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートとプラズモン励起センサとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。 As a method of fixing the plasmon excitation sensor to the flow path, in a small-scale lot (laboratory level), first, polydimethyl having a flow path height of 0.5 mm on the surface where the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed. A sheet made of siloxane [PDMS] is pressure-bonded so as to surround a portion where the metal thin film of the plasmon excitation sensor is formed, and then the sheet made of polydimethylsiloxane [PDMS] and the plasmon excitation sensor are closed with a fastener such as a screw. A fixing method is preferred.
工業的に製造される大規模ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に銀基板を形成、または別途作製した銀基板を固定し、金属薄膜表面に誘電体層（１）および誘電体層（２）または誘電体層（２）のみおよびリガンド固定化を行った後、流路天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。 In industrially manufactured large-scale lots (factory level), the plasmon excitation sensor can be fixed to the flow path by forming a silver substrate on an integrally molded plastic product or fixing a separately manufactured silver substrate, After the dielectric layer (1) and the dielectric layer (2) or only the dielectric layer (2) and the ligand are immobilized on the thin film surface, the lid is covered with an integrally molded plastic product corresponding to the channel top plate. Can be manufactured. If necessary, the prism can be integrated into the flow path.
「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕，トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕，Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。 The “liquid feeding” is preferably the same as the solvent or buffer in which the specimen is diluted. For example, phosphate buffered saline [PBS], Tris buffered saline [TBS], Hepes buffered saline [HBS] However, it is not particularly limited.
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。 The temperature and time for circulating the liquid supply vary depending on the type of specimen and are not particularly limited, but are usually 20 to 40 ° C. × 1 to 60 minutes, preferably 37 ° C. × 5 to 15 minutes.
送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、０．００１ｐｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍＬである。
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。
The initial concentration of the analyte contained in the specimen being sent may be 0.001 pg / mL to 100 μg / mL.
The total amount of liquid feeding, that is, the volume of the flow path is usually 0.001 to 20 mL, preferably 0.1 to 1 mL.
The flow rate of liquid feeding is usually 1 to 2,000 μL / min, preferably 5 to 500 μL / min.
（洗浄工程）
洗浄工程とは、上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面および／または下記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程である。
(Washing process)
The cleaning step is a step of cleaning the surface of the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) and / or the surface of the plasmon excitation sensor obtained through the following step (b).
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に、Ｔｗｅｅｎ２０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１５０〜５００ｍＭ含有するものが望ましい。あるいは、低ｐＨの緩衝液、例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ ＨＣｌでｐＨが１．５〜４．０のものであってもよい。 As the washing solution used in the washing step, for example, a surfactant such as Tween 20, Triton X100 is dissolved in the same solvent or buffer solution used in the reaction of steps (a) and (b), What contains 00001-1 weight% or what contains 150-500 mM of salts, such as sodium chloride and potassium chloride, is desirable. Alternatively, it may be a low pH buffer solution, for example, 10 mM Glycine HCl having a pH of 1.5 to 4.0.
洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ａ）の送液を循環させる温度および流速と同じであることが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
The temperature and flow rate at which the cleaning liquid is circulated are preferably the same as the temperature and flow rate at which the liquid feed in step (a) is circulated.
The time for circulating the cleaning liquid is usually 0.5 to 180 minutes, preferably 5 to 60 minutes.
〔工程（ｂ）〕
工程（ｂ）とは、上記工程（ａ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンド（第１のリガンド）とは同じであっても異なっていてもよいリガンド（第２のリガンド）と蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程である。
[Step (b)]
The step (b) is the same as the plasmon excitation sensor obtained through the step (a), preferably the washing step, and the ligand (first ligand) contained in the plasmon excitation sensor. And a conjugate of a fluorescent dye and a ligand (second ligand) which may be different from each other.
（蛍光色素）
蛍光色素とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該蛍光は、燐光など各種の発光も包含する。
(Fluorescent dye)
In the present invention, the fluorescent dye is a general term for substances that emit fluorescence by irradiating with predetermined excitation light or exciting using electric field effect, and the fluorescence includes various kinds of light emission such as phosphorescence. .
本発明で用いられる蛍光色素は、金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。 The fluorescent dye used in the present invention is not particularly limited as long as it is not quenched due to light absorption by the metal thin film, and may be any known fluorescent dye. In general, fluorescent dyes with large Stokes shifts that allow the use of a fluorometer with a filter rather than a monochromator and also increase the efficiency of detection are preferred.
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製），ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製），シアニン・ファミリーの蛍光色素，インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素，オキサジン・ファミリーの蛍光色素，チアジン・ファミリーの蛍光色素，スクアライン・ファミリーの蛍光色素，キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素，ピレン・ファミリーの蛍光色素，トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。 Examples of such fluorescent dyes include fluorescein family fluorescent dyes (Integrated DNA Technologies), polyhalofluorescein family fluorescent dyes (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), hexachlorofluorescein family fluorescent dyes. (Applied Biosystems Japan), Coumarin family fluorescent dye (Invitrogen), Rhodamine family fluorescent dye (GE Healthcare Biosciences), Cyanine family fluorescent dye, Indocarbocyanine family fluorescent dye, Oxazine family fluorescent dye, Thiazine family fluorescent dye, Squalene family fluorescent dye, Chelated lanthanide family Fluorescent dyes, BODIPY (registered trademark) family fluorescent dyes (manufactured by Invitrogen), naphthalenesulfonic acid family fluorescent dyes, pyrene family fluorescent dyes, triphenylmethane family fluorescent dyes, Alexa Fluor (Registered trademark) dye series (manufactured by Invitrogen Corp.) and the like, and further, U.S. Patent Nos. 6,406,297, 6,221,604, 5,994,063, The fluorescent dyes described in 5,808,044, 5,880,287, 5,556,959, and 5,135,717 can also be used in the present invention.
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。 Table 1 shows the absorption wavelength (nm) and emission wavelength (nm) of typical fluorescent dyes included in these families.
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜として金を用いる場合には、金薄膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属薄膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
In the present invention, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in a wavelength region where light absorption by the metal contained in the metal thin film is small when performing fluorescence measurement described later. For example, when gold is used as the metal thin film, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 600 nm or more in order to minimize the influence of light absorption by the gold thin film. Therefore, in this case, it is particularly desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in the near-infrared region, such as Cy5, Alexa Fluor (registered trademark) 647. The use of a fluorescent dye having the maximum fluorescence wavelength in the near-infrared region can minimize the influence of light absorption by iron derived from blood cell components in the blood. Is also useful. On the other hand, when silver is used as the metal thin film, it is desirable to use a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 400 nm or more.
These fluorescent dyes may be used alone or in combination of two or more.
（第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート）
本発明のプラズモン励起センサに含まれるリガンド（第１のリガンド）とは同じであっても異なっていてもよいリガンド（第２のリガンド）と蛍光色素とのコンジュゲートは、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。
(Conjugate of second ligand and fluorescent dye)
The conjugate of a ligand (second ligand) that may be the same as or different from the ligand (first ligand) contained in the plasmon excitation sensor of the present invention and a fluorescent dye comprises a secondary antibody as a ligand. When used, an antibody capable of recognizing and binding to the analyte (target antigen) contained in the specimen is preferable.
本発明のアッセイ法において、第２のリガンドは、アナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、第１のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンドとして用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２のリガンドとして用いる２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。 In the assay method of the present invention, the second ligand is a ligand used for the purpose of labeling the analyte with a fluorescent dye, and may be the same as or different from the first ligand. However, when the primary antibody used as the first ligand is a polyclonal antibody, the secondary antibody used as the second ligand may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but the primary antibody is monoclonal. In the case of an antibody, the secondary antibody is preferably a monoclonal antibody that recognizes an epitope that the primary antibody does not recognize, or a polyclonal antibody.
さらに、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）と競合する第２のアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）と２次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。 In addition, a complex in which a second analyte that competes with an analyte (target antigen) contained in a specimen (competitive antigen; however, different from the target antigen) and a secondary antibody are bound in advance. The embodiment to be used is also preferable. Such an embodiment is preferable because the amount of fluorescent signal (fluorescent signal) and the amount of target antigen can be proportional.
第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートの作製方法としては、第２のリガンドとして２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕等）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。 As a method for preparing a conjugate of a second ligand and a fluorescent dye, when a secondary antibody is used as the second ligand, for example, first, a carboxyl group is added to the fluorescent dye, and the carboxyl group is converted into a water-soluble carbodiimide [ WSC] (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride [EDC] and the like) and N-hydroxysuccinimide [NHS], and then active esterified carboxyl group Method of dehydrating and immobilizing an amino group possessed by a secondary antibody using water-soluble carbodiimide; Method of immobilizing by reacting a secondary antibody and a fluorescent dye each having an isothiocyanate and amino group; Sulfonyl halide and amino group Reacting and immobilizing secondary antibody and fluorescent dye each having Method: a method of reacting and immobilizing a secondary antibody and a fluorescent dye each having iodoacetamide and a thiol group; a biotinylated fluorescent dye and a streptavidinized secondary antibody (or a streptavidinized fluorescent dye and And a method of immobilizing it by reacting with a biotinylated secondary antibody).
このように作製された第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートの送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
The concentration of the conjugate of the second ligand and the fluorescent dye produced in this manner during feeding is preferably 0.001 to 10,000 μg / mL, and more preferably 1 to 1,000 μg / mL.
The temperature, time, and flow rate at which the liquid is circulated are the same as in step (a).
〔工程（ｃ）〕
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
[Step (c)]
In step (c), the plasmon excitation sensor obtained through step (b) is irradiated with laser light from the other surface of the transparent support on which the metal thin film is not formed via a prism. This is a step of measuring the amount of fluorescence emitted from the irradiated and excited fluorescent dye.
（光学系）
本発明のアッセイ法で用いる光源は、金属薄膜にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
(Optical system)
The light source used in the assay method of the present invention is not particularly limited as long as it can cause plasmon excitation in a metal thin film, but in terms of unity of wavelength distribution and intensity of light energy, laser light is used. Is preferably used as the light source. It is desirable to adjust the energy and photon amount immediately before the laser light enters the prism through the optical filter.
レーザ光の照射により、全反射減衰条件〔ＡＴＲ〕において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明支持体の屈折率，金属薄膜の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。 Irradiation with laser light generates surface plasmons on the surface of the metal thin film under the total reflection attenuation condition [ATR]. Due to the electric field enhancement effect of the surface plasmon, the fluorescent dye is excited by photons increased to several tens to several hundred times the amount of photons irradiated. In addition, although the photon increase amount by this electric field enhancement effect depends on the refractive index of the transparent support, the metal species of the metal thin film, and the film thickness, the increase amount is usually about 10 to 20 times for gold.
蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。 In the fluorescent dye, electrons in the molecule are excited by light absorption, move to the first electron excited state in a short time, and when returning from this state (level) to the ground state, the wavelength of the wavelength corresponding to the energy difference Fluoresce.
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。 As the “laser light”, for example, an LD having a wavelength of 200 to 900 nm, an LD of 0.001 to 1,000 mW, a wavelength of 230 to 800 nm (resonance wavelength is determined by the metal species used in the metal thin film), and a semiconductor of 0.01 to 100 mW A laser etc. are mentioned.
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が上記透明支持体と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明支持体」の市販品と同様のものが挙げられる。 The “prism” is intended to allow laser light through various filters to efficiently enter the plasmon excitation sensor, and preferably has the same refractive index as that of the transparent support. In the present invention, various prisms for which total reflection conditions can be set can be selected as appropriate, and therefore, there is no particular limitation on the angle and shape. For example, a 60-degree dispersion prism may be used. Examples of such commercially available prisms include those similar to the above-mentioned commercially available “glass-made transparent support”.
「光学フィルタ」としては、例えば、減光〔ＮＤ〕フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光〔ＮＤ〕フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。 Examples of the “optical filter” include a neutral density [ND] filter and a diaphragm lens. The “darkening [ND] filter” (or neutral density filter) is intended to adjust the amount of incident laser light. In particular, when a detector with a narrow dynamic range is used, it is preferable to use it for carrying out a highly accurate measurement.
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズ、および蛍光色素の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。
The “polarizing filter” is used to make the laser light P-polarized light that efficiently generates surface plasmons.
“Cut filters” are: external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), plasmon scattering light (excitation light originated from plasmon A filter that removes optical noise (such as scattered light generated by the influence of structures or deposits on the surface of the excitation sensor) and autofluorescence of the fluorescent dye, such as an interference filter and a color filter.
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。 The “collecting lens” is intended to efficiently collect the fluorescent signal on the detector, and may be an arbitrary condensing system. As a simple condensing system, a commercially available objective lens (for example, manufactured by Nikon Corporation or Olympus Corporation) used in a microscope or the like may be used. The magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。 As the “SPFS detection unit”, a photomultiplier (a photomultiplier manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) is preferable from the viewpoint of ultrahigh sensitivity. Also, although the sensitivity is lower than these, a CCD image sensor capable of multipoint measurement is also suitable because it can be viewed as an image and noise light can be easily removed.
〔工程（ｄ）〕
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライトの量を算出する工程である。
[Step (d)]
The step (d) is a step of calculating the amount of the analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (c).
より具体的には、工程（ｄ）は、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト（標的抗原量もしくは標的抗体）量を測定シグナルから算出する工程である。 More specifically, in the step (d), a calibration curve is created by performing measurement with a target antigen or target antibody at a known concentration, and an analyte in the sample to be measured (based on the created calibration curve) This is a step of calculating the amount of target antigen or target antibody) from the measurement signal.
（アナライト）
アナライトとしては、第１のリガンドに特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ〔ペプチド核酸〕等，またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ〔αフェトプロテイン〕等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
(Analyte)
An analyte is a molecule or molecular fragment that can be specifically recognized (or recognized) and bound to a first ligand. Such a “molecule” or “molecular fragment” includes, for example, a nucleic acid ( DNA, RNA, polynucleotide, oligonucleotide, PNA [peptide nucleic acid] etc., which may be single-stranded or double-stranded, or nucleoside, nucleotide and their modified molecules), protein (polypeptide, oligopeptide) Etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules and complexes thereof. Specifically, AFP [α-fetoprotein ], Such as carcinoembryonic antigens, tumor markers, signaling substances, hormones, and the like, and are not particularly limited.
（アッセイシグナル変化量）
さらに、工程（ｄ）は、上記工程（ｂ）の前に測定したシグナルを“ブランクシグナル”としたとき、下記式で表されるアッセイシグナル変化量を算出することができる。
シグナル変化量＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜
(Assay signal change)
Further, in the step (d), when the signal measured before the step (b) is “blank signal”, the amount of assay signal change represented by the following formula can be calculated.
Signal change amount = | (assay fluorescence signal) − (blank fluorescence signal) |
＜アッセイ用装置＞
本発明のアッセイ用装置は、少なくとも、上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサ，レーザ光の光源，光学フィルタ，プリズム，カットフィルタ，集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍光検出部を含み、上記工程（ｃ）に用いられることを特徴とするものである。
<Assay device>
The assay device of the present invention includes at least a plasmon excitation sensor obtained through the step (b), a laser light source, an optical filter, a prism, a cut filter, a condensing lens, and a surface plasmon excitation enhanced fluorescence detection unit. Used in the step (c).
すなわち、本発明の装置は、本発明のプラズモン励起センサを用いて、本発明のアッセイ法を実施するためのものである。
このような装置としては、少なくともレーザ光の光源，各種光学フィルタ，プリズム，カットフィルタ，集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍光〔ＳＰＦＳ〕検出部を含むものとし、検体液，洗浄液または標識抗体液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、例えば、送液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
That is, the apparatus of the present invention is for carrying out the assay method of the present invention using the plasmon excitation sensor of the present invention.
Such a device includes at least a laser light source, various optical filters, a prism, a cut filter, a condensing lens, and a surface plasmon excitation enhanced fluorescence [SPFS] detector, and includes a sample liquid, a cleaning liquid, a labeled antibody liquid, and the like. When handling, it is preferable to have a liquid delivery system combined with a plasmon excitation sensor. As the liquid feeding system, for example, a microchannel device connected to a liquid feeding pump may be used.
また、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード，ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰〔ＡＴＲ〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。さらに、誘電体層（２）を複数個設けたプラズモン励起センサを用いる場合、スプリッタも含むことができる。 In addition, the surface plasmon resonance [SPR] detector, that is, the angle variable unit for adjusting the optimum angle of the photodiode, SPR and SPFS as a light receiving sensor dedicated to SPR (in order to obtain the total reflection attenuation [ATR] condition by the servomotor) The angle of 45 to 85 ° can be changed by synchronizing the photodiode and the light source with a resolution of preferably 0.01 ° or more.), A computer for processing information input to the SPFS detector May also be included. Furthermore, when a plasmon excitation sensor provided with a plurality of dielectric layers (2) is used, a splitter can also be included.
光源，光学フィルタ，カットフィルタ，集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ，送り精度が高く脈動が少ないが循環することができないシリンジポンプ，簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
Preferred embodiments of the light source, the optical filter, the cut filter, the condensing lens, and the SPFS detection unit are the same as those described above.
“Liquid feeding pump” is, for example, a micro pump suitable for a small amount of liquid feeding, a syringe pump with high feeding accuracy and little pulsation but cannot be circulated, and simple and excellent in handling but difficult to feed in a small amount There are tube pumps etc.
＜アッセイ用のキット＞
本発明のアッセイ用のキットは、少なくとも、上記透明支持体と上記金属薄膜と上記の誘電体からなる被覆層（誘電体層（２））とを含むセンサおよび蛍光色素を含み、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とするものであって、アッセイ法を実施するにあたり、１次抗体，抗原などのリガンド，検体および２次抗体以外に必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
<Assay kit>
The assay kit of the present invention comprises at least a sensor comprising the transparent support, the metal thin film, and the coating layer (dielectric layer (2)) made of the dielectric and a fluorescent dye, and the assay of the present invention. It is characterized by being used in a method, and it is preferable to include everything necessary other than a primary antibody, a ligand such as an antigen, a specimen, and a secondary antibody in performing the assay method.
本発明のアッセイ用のキットと、検体として、例えば、血液，血漿または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。 By using, for example, blood, plasma, or serum as an assay kit of the present invention and an antibody against a specific tumor marker as a specimen, the content of the specific tumor marker is detected with high sensitivity and high accuracy. be able to. From this result, the presence of a preclinical noninvasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by palpation or the like can be predicted with high accuracy.
このようなキットとしては、具体的に、透明支持体と，該支持体の一方の表面に形成された上記金属薄膜と，該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された上記の誘電体からなる被覆層（誘電体層（２））とを含むセンサ；ＳＡＭを形成するためのシランカップリング剤；蛍光色素；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；プラズモン励起センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記アッセイ用装置を含めることもできる。 As such a kit, specifically, a transparent support, the metal thin film formed on one surface of the support, and the other surface of the thin film not in contact with the support are formed. And a coating layer (dielectric layer (2)) made of the above-mentioned dielectric; a silane coupling agent for forming SAM; a fluorescent dye; a solution or a diluent for dissolving or diluting a specimen Various reaction reagents and washing reagents for reacting the plasmon excitation sensor with the specimen, and various devices or materials required for carrying out the assay method of the present invention and the above-described assay device can be included. .
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質，説明書，多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。 Further, the kit element may include a standard material for preparing a calibration curve, a manual, a necessary set of equipment such as a microtiter plate capable of simultaneously processing a large number of samples, and the like.
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。 Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited by these.
［作製例１］（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体の作製）
２次抗体として、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（６Ｄ２，２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を、市販のビオチン化キット（（株）同仁化学研究所製）を用いてビオチン化した。その手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。
[Preparation Example 1] (Preparation of Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled secondary antibody)
As a secondary antibody, an anti-α-fetoprotein [AFP] monoclonal antibody (6D2, 2.5 mg / mL, manufactured by Nippon Medical Laboratory, Inc.), a commercially available biotinylation kit (manufactured by Dojindo Laboratories) Was biotinylated. The procedure followed the protocol attached to the kit.
次に、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液とを混合し、４℃で６０分間、攪拌混合することで反応させた。 Next, the solution of the obtained biotinylated anti-AFP monoclonal antibody and the streptavidin-labeled Alexa Fluor (registered trademark) 647 (Molecular Probes) solution are mixed and reacted by stirring at 4 ° C. for 60 minutes. It was.
最後に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。 Finally, the unreacted antibody and the unreacted enzyme were purified using a molecular weight cut filter (manufactured by Nippon Millipore) to obtain an Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled anti-AFP monoclonal antibody solution.
（プラズモン励起センサの製造）
［実施例１］
透明支持体（ＢＫ７；屈折率１．５１，厚さ１ｍｍ，２ｍｍ×１４ｍｍ）に、スパッタリング法により金からなる薄膜を形成した。このようにして得られた金薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面にＳｉＯ2をスパッタリング法にて蒸着することによって誘電体層(１)を形成した。誘電体層（１）の厚さは５ｎｍであった。該支持体とは接していないもう一方の表面（Ｓ）の上に、誘電体層（２）を形成するその一部の領域（Ｓa）以外の領域（Ｓb）に遮光板を置き、誘電体層（２）に用いる誘電体の材料としてＳｉＯ2をスパッタリング法にて蒸着を行った。このときの誘電体層（１）＋（２）の厚さは１０００ｎｍ、誘電体層（２）の面積は１．３×１０5μｍ2、屈折率〔ｎD〕は１．５４であった。
(Manufacture of plasmon excitation sensor)
[Example 1]
A thin film made of gold was formed on a transparent support (BK7; refractive index 1.51,
このようにして得られた支持体を、（Ｍｅ）2ＳｉＣｌ−（ＣＨ2）3-ＣＯＮＨＳ（アルテック（株）製）を１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、誘電体薄膜の片面にＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕を形成した。支持体を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。 The support thus obtained was immersed in an ethanol solution containing 1 mM (Me) 2 SiCl- (CH 2 ) 3 -CONHS (manufactured by Altec Co., Ltd.) for at least 24 hours, and SAM was placed on one side of the dielectric thin film. [Self Assembled Monolayer; self-assembled monolayer] was formed. The support was removed from the solution, washed with ethanol and isopropanol, and then dried with an air gun.
ＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを設け、ＳＡＭ表面が流路の内側となるように支持体を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から圧着し、ビスで流路シートと該支持体とを固定した。 A polydimethylsiloxane [PDMS] sheet having a flow path height of 0.5 mm is provided on the surface of the SAM, and a support is disposed so that the SAM surface is inside the flow path (however, the silicon rubber spacer is not fed). It was made into the state which does not touch a liquid.), It crimped | bonded from the outer side of the flow path, and fixed the flow path sheet | seat and this support body with the bis | screw.
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５，２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液２.５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。なお、１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。 Subsequently, 5 mL of PBS containing 50 mM N-hydroxysuccinimide [NHS] and 100 mM water-soluble carbodiimide [WSC] was fed and circulated for 20 minutes, followed by anti-α-fetoprotein [AFP] monoclonal. The primary antibody was solid-phased on the SAM by circulating 2.5 mL of an antibody (1D5, 2.5 mg / mL, manufactured by Japan Medical Clinical Laboratory Laboratories) solution for 30 minutes. In addition, the nonspecific adsorption | suction prevention process was performed by circulating 30 minutes by PBS buffer physiological saline containing 1 weight% bovine serum albumin [BSA].
［実施例２］
実施例１において、誘電体層（１）＋（２）の厚さを４００ｎｍに変更した以外は実施例１と同様にしてプラズモン励起センサを製造した。
[Example 2]
A plasmon excitation sensor was manufactured in the same manner as in Example 1 except that the thickness of the dielectric layers (1) + (2) was changed to 400 nm.
［実施例３］
実施例２において、誘電体層（２）としてＴｉＯ2を用いて屈折率〔ｎD〕を１．８に変更した以外は実施例２と同様にしてプラズモン励起センサを製造した。
(複数個の誘電体層（２）を有するプラズモン励起センサの製造)
[Example 3]
In Example 2, a plasmon excitation sensor was manufactured in the same manner as in Example 2 except that TiO 2 was used as the dielectric layer (2) and the refractive index [n D ] was changed to 1.8.
(Manufacture of a plasmon excitation sensor having a plurality of dielectric layers (2))
［実施例４］
実施例１において、金薄膜の形成後かつ誘電体層（２）の形成前に、厚さのみが異なる誘電体層（２）を２個形成した以外は実施例１と同様にしてプラズモン励起センサを製造した。
[Example 4]
In Example 1, a plasmon excitation sensor was formed in the same manner as in Example 1 except that two dielectric layers (2) having different thicknesses were formed after the gold thin film was formed and before the dielectric layer (2) was formed. Manufactured.
２個の誘電体層（２）の形成方法として、具体的には、金薄膜の表面に、誘電体層（２）を形成する領域以外の領域に遮光板を置き、１つはＳｉＯ2をスパッタリング法にて蒸着し、さらにもう１つはＳｉ／ＳｉＯ2＝３０重量％にしてスパッタリングを行い、誘電体層（２）を２個形成した。これら誘電体層（２）形成時のスパッタリング時間をそれぞれ３０分間，６０分間とすることによって、厚さを４００ｎｍ，１０００ｎｍとする誘電体層（１）＋（２）が２個得られた。なお、面積はともに１．０×１０6μｍ2であった。 As a method of forming the two dielectric layers (2), specifically, a light shielding plate is placed on the surface of the gold thin film in a region other than the region where the dielectric layer (2) is formed, and one is made of SiO 2 . Vapor deposition was performed by sputtering, and the other was sputtered with Si / SiO 2 = 30% by weight to form two dielectric layers (2). By setting the sputtering time for forming these dielectric layers (2) to 30 minutes and 60 minutes, respectively, two dielectric layers (1) + (2) having thicknesses of 400 nm and 1000 nm were obtained. Both areas were 1.0 × 10 6 μm 2 .
（製造したプラズモン励起センサを用いたアッセイ法の実施）
［実施例５］
工程（ａ）として、まず、実施例１で得られたプラズモン励起センサに標的抗原としてＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を０．５ｍＬ添加し、２５分間循環させた。
(Implementation of assay using manufactured plasmon excitation sensor)
[Example 5]
As step (a), first, 0.5 mL of a PBS solution containing 1 ng / mL of AFP as a target antigen was added to the plasmon excitation sensor obtained in Example 1 and circulated for 25 minutes.
工程（ｂ）として、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むトリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕を送液として１０分間循環させることによって洗浄した後、作製例１で得られたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体（１,０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製したＰＢＳ溶液）を２．５ｍＬ添加し、２０分間循環させた。 As a step (b), the Tris buffered saline [TBS] containing 0.05% by weight of Tween 20 was washed by circulating for 10 minutes as a solution, and then Alexa Fluor (registered trademark) 647 obtained in Preparation Example 1 was used. 2.5 mL of labeled secondary antibody (PBS solution prepared to be 1,000 ng / mL) was added and circulated for 20 minutes.
工程（ｃ）として、まず、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。プラズモン励起センサに、ガラス製の透明支持体の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６４０ｎｍ，４０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイシグナル」とした。 As the step (c), first, washing was performed by circulating TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 for 10 minutes. The plasmon excitation sensor is irradiated with laser light (640 nm, 40 μW) from the other surface of the glass transparent support, on which the gold thin film is not formed, via a prism (manufactured by Sigma Koki Co., Ltd.). The signal value when the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye was observed from the CCD was measured and used as an “assay signal”.
なお、ＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬの場合におけるＳＰＦＳシグナルを「アッセイノイズシグナル」とした。
工程（ｄ）として、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、アッセイＳ／Ｎ比を以下の式を用いて算出し、各条件での感度に関して、マスクしない測定結果（比較例１）を基準とした規格値（Ｓ／Ｎ増倍率）により評価した。
The SPFS signal when AFP was 0 ng / mL was defined as “assay noise signal”.
As a step (d), an assay S / N ratio is calculated from the measurement results obtained in the above step (c) using the following formula, and the measurement results without masking for sensitivity under each condition (Comparative Example 1) It was evaluated by a standard value (S / N multiplication factor) based on.
アッセイＳ／Ｎ比＝｜（アッセイ蛍光シグナル）｜／｜（アッセイノイズシグナル）｜
すなわち、規格値（Ｓ／Ｎ増倍率）が大きければアッセイＳ／Ｎ比が向上していることを意味し、イムノアッセイ測定の信頼性が高いことがわかる。
得られた結果を表２にまとめた。
Assay S / N ratio = | (assay fluorescence signal) | / | (assay noise signal) |
That is, if the standard value (S / N multiplication factor) is large, it means that the assay S / N ratio is improved, and it can be seen that the reliability of the immunoassay measurement is high.
The results obtained are summarized in Table 2.
［実施例６］
実施例５において、実施例１で得られたプラズモン励起センサを用いる代わりに、実施例２で得られたプラズモン励起センサを用いた以外は実施例５と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表２にまとめた。
[Example 6]
In Example 5, instead of using the plasmon excitation sensor obtained in Example 1, the assay method was carried out in the same manner as in Example 5 except that the plasmon excitation sensor obtained in Example 2 was used. The results obtained are summarized in Table 2.
［実施例７］
実施例５において、実施例１で得られたプラズモン励起センサを用いる代わりに、実施例３で得られたプラズモン励起センサを用いた以外は実施例５と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表２にまとめた。
[Example 7]
In Example 5, instead of using the plasmon excitation sensor obtained in Example 1, the assay method was carried out in the same manner as in Example 5 except that the plasmon excitation sensor obtained in Example 3 was used. The results obtained are summarized in Table 2.
[実施例８]
実施例５において、実施例１で得られたプラズモン励起センサを用いる代わりに、実施例４で得られたプラズモン励起センサを用いた以外は実施例５と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表２にまとめた。
[Example 8]
In Example 5, instead of using the plasmon excitation sensor obtained in Example 1, the assay method was carried out in the same manner as in Example 5 except that the plasmon excitation sensor obtained in Example 4 was used. The results obtained are summarized in Table 2.
（プラズモン励起センサの製造）
［比較例１］
実施例１において、誘電体層（２）を形成しなかった以外は実施例１と同様にしてプラズモン励起センサを製造した。
(Manufacture of plasmon excitation sensor)
[Comparative Example 1]
In Example 1, a plasmon excitation sensor was manufactured in the same manner as in Example 1 except that the dielectric layer (2) was not formed.
［比較例２］
実施例２において、誘電体層（２）を、金薄膜の表面全部に形成した以外は実施例２と同様にしてプラズモン励起センサを製造した。
[Comparative Example 2]
In Example 2, a plasmon excitation sensor was manufactured in the same manner as in Example 2 except that the dielectric layer (2) was formed on the entire surface of the gold thin film.
［比較例３］
比較例２において、誘電体層（１）＋（２）の厚さを５０ｎｍに変更した以外は比較例２と同様にしてプラズモン励起センサを製造した。
[Comparative Example 3]
In Comparative Example 2, a plasmon excitation sensor was manufactured in the same manner as in Comparative Example 2 except that the thickness of the dielectric layers (1) + (2) was changed to 50 nm.
［比較例４］
実施例３において、誘電体層（１）の厚さを１５０ｎｍに変更した以外は実施例３と同様にしてプラズモン励起センサを製造した。
[Comparative Example 4]
In Example 3, a plasmon excitation sensor was manufactured in the same manner as in Example 3 except that the thickness of the dielectric layer (1) was changed to 150 nm.
（製造したプラズモン励起センサを用いたアッセイ法の実施）
［比較例５］
実施例５において、実施例１で得られたプラズモン励起センサを用いる代わりに、比較例１で得られたプラズモン励起センサを用いた以外は実施例５と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表２にまとめた。
(Implementation of assay using manufactured plasmon excitation sensor)
[Comparative Example 5]
In Example 5, instead of using the plasmon excitation sensor obtained in Example 1, the assay method was carried out in the same manner as in Example 5 except that the plasmon excitation sensor obtained in Comparative Example 1 was used. The results obtained are summarized in Table 2.
［比較例６］
実施例５において、実施例１で得られたプラズモン励起センサを用いる代わりに、比較例２で得られたプラズモン励起センサを用いた以外は実施例５と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表２にまとめた。
[Comparative Example 6]
In Example 5, instead of using the plasmon excitation sensor obtained in Example 1, the assay method was carried out in the same manner as in Example 5 except that the plasmon excitation sensor obtained in Comparative Example 2 was used. The results obtained are summarized in Table 2.
［比較例７］
実施例５において、実施例１で得られたプラズモン励起センサを用いる代わりに、比較例３で得られたプラズモン励起センサを用いた以外は実施例５と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表２にまとめた。
[Comparative Example 7]
In Example 5, instead of using the plasmon excitation sensor obtained in Example 1, the assay method was carried out in the same manner as in Example 5 except that the plasmon excitation sensor obtained in Comparative Example 3 was used. The results obtained are summarized in Table 2.
［比較例８］
実施例５において、実施例１で得られたプラズモン励起センサを用いる代わりに、比較例４で得られたプラズモン励起センサを用いた以外は実施例５と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表２にまとめた。
[Comparative Example 8]
In Example 5, instead of using the plasmon excitation sensor obtained in Example 1, the assay method was carried out in the same manner as in Example 5 except that the plasmon excitation sensor obtained in Comparative Example 4 was used. The results obtained are summarized in Table 2.
本発明のプラズモン励起センサを用いたアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。 Since the assay method using the plasmon excitation sensor of the present invention is a method that can be detected with high sensitivity and high accuracy, for example, even a very small amount of tumor marker contained in blood can be detected. From this result, it is possible to predict with high accuracy the presence of a preclinical noninvasive cancer (carcinoma in situ) that cannot be detected by palpation or the like.
１・・・・・・透明支持体
２・・・・・・金属薄膜
３・・・・・・誘電体層
４・・・・・・誘電体からなる被覆層
４ａ・・・・・屈折率ｎ１の誘電体からなる被覆層
４ｂ・・・・・屈折率ｎ２の誘電体からなる被覆層
４ｃ・・・・・被覆層４ｂとは厚さが異なる屈折率ｎ２の誘電体からなる被覆層
DESCRIPTION OF
Claims (13)
該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；
該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体層と；
該誘電体層の、該薄膜とは接していないもう一方の表面（Ｓ）のうち、その一部の領域（Ｓa）に形成された誘電体からなる被覆層と；
該被覆層の、該誘電体層とは接していないもう一方の表面（Ｔ）に固定化されたリガンドと
を含み、
該誘電体層の厚さが、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下であり、
該誘電体層と該被覆層との合計の厚さが、１００ｎｍを超えて１μｍ以下であることを特徴とするプラズモン励起センサ。 A transparent support;
A metal thin film formed on one surface of the support;
A dielectric layer formed on the other surface of the thin film not in contact with the support;
A coating layer made of a dielectric formed on a partial region (Sa) of the other surface (S) of the dielectric layer not in contact with the thin film;
A ligand immobilized on the other surface (T) of the coating layer not in contact with the dielectric layer,
The dielectric layer has a thickness of 5 nm to 100 nm,
Plasmon excitation sensor, wherein the total thickness of the dielectric material layer and the該被covering layer is 1μm or less beyond 100 nm.
工程（ａ）：請求項１〜４のいずれかに記載のプラズモン励起センサに、検体を接触させる工程，
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、さらに、該プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程，
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，および
工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライトの量を算出する工程。 An assay method comprising the following steps (a) to (d);
Step (a): a step of bringing a specimen into contact with the plasmon excitation sensor according to claim 1,
Step (b): a conjugate of a ligand and a fluorescent dye, which may be the same as or different from the ligand contained in the plasmon excitation sensor obtained through the step (a) Reacting
Step (c): irradiating the plasmon excitation sensor obtained through the step (b) with a laser beam via a prism from the other surface of the transparent support on which the metal thin film is not formed, A step of measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent dye, and a step (d): a step of calculating the amount of the analyte contained in the specimen from the measurement result obtained in the step (c).
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