JPWO2010090271A1 - 電気化学センサーおよびその作製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、基材と、該基材上に配置された、炭素粒子からなる導電性層と、該導電性層上に配置された、内部および界面の少なくとも１つに酵素を含む細胞膜類似構造層と、から構成される電気化学センサーを提供する。

Description

本発明は、特にグルコースを測定するための電気化学センサーと、その作製方法に関する。

酵素電極（以下、バイオセンサと呼称することもある）は、酵素の反応特異性を利用して、種々の生理活性物質を特異的に検出するセンサとして広く使用されている。このような酵素電極としては、電気化学的手法あるいは光学的手法により試料の分析を行えるように構成されたものが汎用されている。電気化学的手法により試料の分析を行うための酵素電極は、通常、金電極、白金電極、カーボン電極等の電極表面上に酵素が固定化された電極のことを言い、特に、糖尿病に重要なマーカーとして血中のグルコース濃度を測定するためのグルコースセンサとして多用されている。

基礎的なグルコースセンサの構造と作製方法は周知であるが、特許文献１には、特殊なグルコースセンサの作製が挙げられている。すなわち、電極基板等の担体上に、細胞膜類似構造（リン脂質：2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine （ＭＰＣ））を形成して表面を修飾する技術である。当該担体の構造は、フィルム状、キャピラリー管内壁、流路溝や粒子など、形状は問わない。

このＭＰＣ修飾表面の細胞膜類似構造層に、膜結合性タンパク質（酵素や抗体）を自己組織的に固定化させることで、基板や流路壁や担体表面上にタンパク質（酵素や抗体）を、配向性を持たせた状態で固定化することが可能になる。

このような特許文献１に記載の手法は、従来からある種々のタンパク質固定化法と比較すると、生体内の挙動を模倣した点で従来とは異なる手法であり、膜結合性を有するタンパク質であれば問わない、タンパク質自身の自己組織化による固定法とも言うべき、これまでにない新しいカテゴリーに属する新規な固定化方法である。この方法により、様々なアプリケーション（製品）の性能向上が可能となる。

上記先行特許文献１の発明は、酵素の配向固定化という視点では、タンパク質内の電子移動は極めて効率的な技術である。しかしながら、膜結合性酸化還元酵素を固定化して酵素電極を構築した場合においては、膜結合性酵素から電極への電子伝達経路の効率化を、「酵素の固定化のみ」で達成しようとする試みであり、実施例では下地として汎用カーボンのみが挙げられており、下地である電極材料の電子授受能力向上のアプローチまでは踏み込まれていなかった。また、酵素電極は一般的に、下地電極の作製方法や形状においても、そのセンサ性能が大きく影響するため、より作製効率が良好で、安定性の高い、さらには使い勝手のよいセンサとしての最適化の点では改良の余地がある。

特開２００６−３２２８８９号公報

本発明は、作製効率が良好であり、応答性も高く、且つ長期安定性の高い、使い勝手の良いセンサを提供することを目的とする。目的を達成するために、本発明は、
基材と、
該基材上に配置された、炭素粒子からなる導電性層と、
該導電性層上に配置された、内部および界面の少なくとも１つに酵素を含む細胞膜類似構造層と、
から構成される電気化学センサーである。

本発明を用いることで、酸化還元酵素などのタンパク質を配向性良く固定化できるために、少ない酵素量で活性にバラつきを生じさせることなく、適切かつコスト的に有利に目的とする活性を発現させることが出来ると同時に、酵素−電極間の電子移動効率が上がることにより、酵素電極のシグナルをより増加することが可能になった。それだけでなく、生体内の挙動を模倣した膜結合性を有するように酵素を固定化することで、より強固に電極表面上へ固定化でき、意外なことに、センサーとしての長期安定性も向上する。

また、本発明を用いることで、炭素粒子（カーボンブラック）をバインダーおよび溶剤を含有したスクリーン印刷対応インクとして使用し、スクリーン印刷手法にて樹脂等の基材にパターンニング印刷を行い電極形成することにより、電気化学センサーの作製効率を格段に向上することができ、それによりセンサ間差を小さくすることが可能になる。

さらに、本電気化学センサーは、スクリーン印刷手法によりセンサパターンニングが可能であることより、より微小な電気化学センサーの作製が可能であることと、生物にとって有毒なメディエータを別途使用しないことで生体への安全性が向上することより、長期安定性も相まって、体内埋め込み型の連続計測センサへの高適応が期待できる。
本電気化学センサーは、炭素粒子の充填により導電性層を作製することも可能であり、グルコースに対する応答感度を簡易的に評価できる。
本方法により膜結合性酸化還元酵素を電極上に固定化して電気化学センサーを構築した場合、膜結合性酵素の生体内の挙動を模倣しながらも膜結合性酵素の電子伝達経路を効率化させることが可能になる。

図１は、炭素粒子としてBLACK PEARLS 2000を使用し、スクリーン印刷により炭素粒子を含む導電性層を製造した場合の、本発明に係る電気化学センサーを用いてグルコースの定量を行った際の応答感度を示したグラフである。 図２は、炭素粒子としてBLACK PEARLS 2000を使用し、スクリーン印刷により炭素粒子を含む導電性層を製造した場合の、本発明に係る電気化学センサーを連続使用した際の安定性を評価したグラフである。 図３は、炭素粒子としてケッチェンブラックを使用し、スクリーン印刷により炭素粒子を含む導電性層を製造した場合の、本発明に係る電気化学センサーを用いてグルコースの定量を行った際の応答感度を示したグラフである。 図４は、炭素粒子としてケッチェンブラックを使用し、炭素粒子の充填により導電性層を製造した場合の、本発明に係る電気化学センサーを連続使用した際の安定性を評価したグラフである。

本発明は、カーボンブラックの利用と、細胞膜類似構造を用いた酵素の固定化を、その骨子とする。詳細は以下である。

本発明の電気化学センサーは、上記細胞膜類似構造層がリン脂質膜であることが好ましい。細胞膜類似構造層は、生体内の挙動を模倣しつつ酵素を固定化するためのものである。当該酵素は、細胞膜類似構造層の内部および細胞膜類似構造層の界面の少なくとも１つに存在する。

また、本発明の電気化学センサーは、上記細胞膜類似構造層としてのリン脂質膜が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）重合体であることが好ましい。ＭＰＣ重合体としては、ＭＰＣを単独で重合させ、あるいはＭＰＣをメタクリル酸エステル（たとえばブチルメタクリレート）などの疎水性モノマーと共重合させたものを使用することができる。また、ＭＰＣ重合体は、ＭＰＣをアニオン性モノマーまたはカチオン性モノマーと共重合させたものでもよい。この細胞膜類似構造層は、上記リン脂質ポリマーを含んだ溶液を、例えば作用極および対極などの基板における任意の部分（絶縁膜で囲まれた露出部など）に点着した後に、乾燥させることにより配置することができる。なお、本発明において、細胞膜類似構造層の配置とは、形成を含むものである。

また、本発明の電気化学センサーは、酵素がグルコース脱水素酵素であることが好ましい。グルコース脱水素酵素は、グルコース酸化酵素と異なり、反応時に酸素を介在させないため、例えば検体試料中の酸素分圧などによる干渉を受けないというメリットがある。

また、本発明の電気化学センサーは、上記グルコース脱水素酵素が、チトクロムをサブユニットとするグルコース脱水素酵素（以下、Ｃｙ−ＧＤＨと呼称することがある）であることが好ましい。チトクロムをサブユニットとするグルコース脱水素酵素を用いると、フェリシアン化アルカリ金属のようなメディエータを別途使用する必要が無い。ここで、本発明において使用されるＣｙ−ＧＤＨは、少なくともグルコース脱水素活性を有するαサブユニット、および電子伝達機能を有するチトクロムＣを含むものをさし、αサブユニットおよびチトクロムＣ以外のサブユニットをさらに有するものも含まれる。このようなＣｙ−ＧＤＨの例は、国際公開第ＷＯ０２／３６７７９号パンフレットに開示されている。先の国際出願に記載のＣｙ−ＧＤＨは、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来するものであり、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであり、かつＦＡＤを補欠因子としてもつとともに、グルコース脱水素活性を有するαサブユニット（還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａ）と、電子伝達機能を有するチトクロムＣと、を含むものである。また、本発明のＣｙ−ＧＤＨには、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物から採取したＣｙ−ＧＤＨをコードする遺伝子が移入された形質転換体を利用して得られるものも含まれる。

また、本発明の電気化学センサーは、上記酵素が、細胞膜類似構造層に対して自己組織化した状態で上記細胞膜類似構造層に形成されていることが好ましい。例えば、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来のＣｙ−ＧＤＨは膜結合タンパク質であり、すなわち、本来は細胞膜に存在するものであるため、そのようなＣｙ−ＧＤＨを膜上へ適用した場合には、細胞膜類似構造層に対して自己組織的に、かつ細胞膜に存在する場合と同様に配向性をもった状態でＣｙ−ＧＤＨを固定化することで形成することができる。このような酵素の自己組織的固定化は、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来のＣｙ−ＧＤＨに限るものではなく、本来、細胞膜に存在する膜結合性酵素を用いた場合に達成することができる。

また、本発明の電気化学センサーは、上記導電性層へ、炭素粒子の他にバインダーを含有することができる。これらの構成により、製造工程においては、炭素粒子（カーボンブラック）をバインダーおよび溶剤を含有したスクリーン印刷対応インクとして調製することができ、そのため、スクリーン印刷手法にて樹脂等の基材にパターンニング印刷を行い電極形成することにより、酵素電極の作製効率を格段に向上することができ、センサ間差を小さくすることが可能になる。製造工程で含まれる溶剤は、乾燥によって揮発し、酵素電極の構成には含まれない。

上記導電性層を炭素粒子と共に配置するためのバインダーとしては、製造工程で溶剤に溶解又は分散することができる各種樹脂バインダーを用いることができ、特にブチラール樹脂系、ポリエステル樹脂系のバインダーが好ましく使用できる。また、溶剤としては、カルビトールアセテート（ジエチレングリコールモノエチルエーテルアセテート）、イソホロンやシクロヘキサノンが好ましく使用できる。なお、本発明において、導電性層の配置とは、形成を含むものである。

また、本発明の電気化学センサーでは、上記導電性層と上記細胞膜類似構造層が一体化されていてもよい。つまり、炭素粒子含有の導電性層を形成するためのスクリーン印刷対応インクと、細胞膜類似構造層を形成するためのリン脂質ポリマーを含んだ溶液を、予め混合調製しておき、当該混合溶液を、例えば作用極および対極などの基板上へ点着および乾燥することで、上記導電性層と上記細胞膜類似構造層を一体化した層を形成することが出来る。このように一体化した層は、製造面において大きな利点を有する。

さらに、上記スクリーン印刷対応インクとリン脂質ポリマーの混合調製液へ、予め膜結合性酵素を混合させておき、スクリーン印刷手法にて基材上へパターンニング印刷を行うことで、最終的な酵素電極を１ステップで作製することも可能である。

本発明に係る電気化学センサーの作製方法は、
基材上に、炭素粒子からなる導電性層を配置するステップと、
該導電性層上に、細胞膜類似構造層を配置するステップと、
該細胞膜類似構造層に、酵素を固定するステップ
から構成される。

細胞膜類似構造層に対する膜結合性酵素の固定（すなわち、自己組織的固定化）は、たとえば露出部分に細胞膜類似構造層を形成した基板を、膜結合性酵素を含んだ酵素溶液中に浸漬した後に、あるいは細胞膜類似構造層に上記酵素溶液を噴霧した後に乾燥させることにより行うことができる。細胞膜類似構造層に対して膜結合性酵素を自己組織的に固定化した場合には、膜結合性酵素が配向性をもった状態で細胞膜類似構造層の内部および／又は界面に形成される。酵素がＣｙ−ＧＤＨ、すなわちチトクロムをサブユニットとするグルコース脱水素酵素である場合は、グルコース脱水素酵素としての活性を有するαサブユニットの活性部位が酵素電極の表層、つまり検体試料と最も近い位置に固定化された状態となる一方で、チトクロムが電極部に最も近い位置もしくは接触した状態で、細胞膜類似構造層上へ固定化される。

ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来のＣｙ−ＧＤＨは、膜結合タンパク質である。すなわち、先の微生物由来のＣｙ−ＧＤＨは、本来、細胞膜に存在するものであるため、そのようなＣｙ−ＧＤＨを用いた場合には、細胞膜類似構造層に対して自己組織的に、かつ細胞膜に存在する場合と同様に配向性をもった状態でＣｙ−ＧＤＨを固定化することができる。このような酵素の自己組織的固定化は、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来のＣｙ−ＧＤＨに限らず、本来、細胞膜に存在する膜結合性酵素を用いた場合に達成することができる。

また、本発明に係る電気化学センサーの作製方法において、リン脂質ポリマーとして、シランカップリング剤を導入したものを使用することも出来る。このように細胞膜類似物質がシランカップリング剤を導入されている場合は、導電性層上に、細胞膜類似構造層を配置するステップにおいて、導電性層上のＯＨ基と反応させることで該導電性層上へ細胞膜類似構造層を形成することができ、このとき、導電性層上の露出部分に対するリン脂質ポリマーの結合性を高めることができる。

また、本発明に係る電気化学センサーの作製方法において、リン脂質ポリマーとして、シランカップリング剤を導入したものを使用する際には、導電性層へ予め親水処理を施し、当該親水部位にシランカップリング剤が導入された細胞膜類似構造層を形成することで、この親水基がシランカップリング剤と結合することによって、より強固に露出部分へリン脂質ポリマーを固定化することができる。
また、導電性層の表面へＶＵＶ処理を施して親水化処理した後に、細胞膜類似構造層を形成することにより、より強固にリン脂質ポリマーを固定化することもできる。

ここで、リン脂質ポリマーにおけるシランカップリング剤の量は、たとえばポリマー成分１００重量部に対して、１０〜５００重量部とされる。シランカップリング剤としては、たとえばテトラエトキシシラン、ビニルトリクロロシラン、ビニルトリス（２−メトキシエトキシ）シラン、γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、γ−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、β−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、γ−グリシドキプロピルトリエトキシシラン、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−フェニル−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、γ−クロロプロピルトリメトキシシラン、あるいはγ−メルカプトプロピルトリメトキシシランを挙げることができ、これらのシランカップリング剤は、単独で使用しても、複数種を併用してもよい。

（導電性層材料の選定）
本発明者らは、酵素からの電極への電子の授受の効率を上げるための好ましい材料を探索した結果、導電性粒子の粒径および比表面積を考慮し、一次粒径のみならず、会合した状態である二次粒径粒径もまた小さく、且つ密度が小さく、且つ表面積が極めて大きい材料（炭素粒子）からなる導電性層と細胞膜類似構造層との組み合わせが好ましいことを見出した。特に、一次粒径３０ｎｍ〜１００ｎｍでかつ比表面積が２００ｍ²／ｇ〜１，４００ｍ²／ｇである炭素粒子がバイオセンサの製造において好ましいことが判明し、例としてカーボンブラックが挙げられ、入手し易いカーボンブラックの代表例として、BLACK PEARLS（商標：キャボット社製）、ケッチェンブラック（商標：アクゾノーベルケミカルズ社製）等が挙げられる。なお、粒径および比表面積の測定方法としては、透過型電子顕微鏡による測定およびＢＥＴ比表面積法が挙げられる。

（導電性層材料のスクリーンインク化によるセンサ製法の最適化）
上記のカーボン材料を用いる際には、粉体であるカーボン材料へミネラルオイル等を混合しペースト化することも可能であるが、密着性が悪くセンサ構造が不安定になりがちである。そこで、本発明では、上記カーボン粒子にバインダーおよび溶剤を含有させることで、スクリーン印刷対応インクを作製することが好ましい。本インクをスクリーン印刷手法にて樹脂等の基材にパターンニング印刷を行い、印刷で電極を形成することで、作製工程における効率性が格段に向上する。

（カーボン材料の充填によるセンサ製法の最適化）
本発明では、上記カーボン粒子に流動パラフィンを添加して得たペーストを電極に充填することにより導電性層を作製し、これを電気化学センサーにおいて使用することにより、グルコースに対する応答感度を簡易的に評価することもできる。

（導電性層材料への酵素の配向固定化）
上記導電性層上へ、ＭＰＣ等を用いて細胞膜類似構造（リン脂質）を形成し、電極表面を修飾する。更に、上記修飾電極を膜結合性酵素溶液に浸漬、もしくは修飾電極表面へ膜結合性酵素溶液を分注すること等により、上記修飾電極上への酵素を固定化することで作用極とし、酵素電極（電気化学センサー）を作製する。
なお、電極系は、通常には、作用極、対極、および参照極を備えるものである。

実施例１に、炭素粒子にBLACK PEARLSを使用し、また基材の表面にこのBLACK PEARLSを含むスクリーン印刷手法により導電性層を形成した電気化学センサーについて、その応答感度と、安定性の検討を行った。なお、本発明の電気化学センサーへの応用による効果を、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来のシトクロムをサブユニットとするグルコース脱水素酵素（Ｃｙ−ＧＤＨ）を一例として用いたデータとして示す。

電極系は
作用極：酵素固定化電極
対極：白金電極
参照極：銀／塩化銀電極
を使用した。
上記作用極である酵素固定化電極においては、本発明に係る細胞膜類似構造層を使用した電気化学センサーと、比較例として、ＭＰＣを介在させていない、導電性層に直接酵素を物理吸着させる従来の吸着方式の酵素固定化電極による電気化学センサーを用いた。

本実施例では、ポリイミド基材の表面に、本発明に従って導電性層（カーボン電極）、細胞膜類似構造層（リン脂質ポリマー層）および固定化酵素膜（Ｃｙ−ＧＤＨ層）を形成した。

炭素粒子として、粒径５０ｎｍ、比表面積１４００ｍ²／ｇ、空隙率６０ｖｏｌ％のBLACK PEARLS 2000（以下、ＢＰと呼称）を用意した。重量比換算で、ＢＰを４０％と、バインダーとしてポリエステル樹脂を４０％と、溶剤としてイソホロンを２０％とを混合し、印刷用インクを得た。当該インクを、ポリイミド基材の表面へ、厚みが１０μｍになるように印刷し、１５０℃の環境下で３０分間乾燥させ、導電性層を得た。

リン脂質ポリマー層は、前記導電性層の表面へＶＵＶ処理を施して親水化処理した後に、該導電性層の表面にＭＰＣ重合体溶液を塗布して乾燥させることにより形成した。なお、ＶＵＶ処理は、「ＭＥＣＬ−Ｍ３−７５０」（エム・ディ・エキシマ社製）を用いて、大気中において、波長が１７２ｎｍのエキシマレーザ光を、照射距離を１ｍｍとして、前記導電性層の表面に１８０秒間照射することにより行った。リン脂質ポリマー溶液としては、シランカップリング剤が導入されたＭＰＣ重合体（商品名「リピジュアＣＲ−１７０２」；日油社製）を使用した。

Ｃｙ−ＧＤＨ層は、リン脂質ポリマー層が形成された導電性層を、Ｃｙ−ＧＤＨ溶液に１０分間含浸することにより形成した。Ｃｙ−ＧＤＨ溶液におけるＣｙ−ＧＤＨの濃度は、活性基準において１００Ｕ／μＬとした。作製した酵素電極を作用極、Ｐｔを対極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を参照極とし、本発明に係る細胞膜類似構造層を使用した酵素電極系を構築した。

他方、リン脂質ポリマー層を作用極上へ形成しなかった点を除いては実施例１での電極系と同様にして形成したものを比較例１とし、細胞膜類似構造層を介在させていない、導電性層に直接酵素を物理吸着させる従来の酵素吸着方式の酵素固定化電極系として使用した。

これらの電極系を用いて、追加的なメディエータを使用せずに、６００ｍＶの電位差を電極系に印加するクロノアンペロメトリー法により、グルコースに対する応答感度について検討した。応答感度の測定方法として、実施例１、比較例１のそれぞれの酵素電極系（作用極・対極・参照極）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）中に浸漬した。そしてそれぞれの酵素電極系に定電圧（６００mV vs.Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加しながら、この緩衝液中に２．０Ｍグルコース水溶液を滴下し続け、グルコースの終濃度が１００ｍｇ／ｄｌ、及び６００mｇ／ｄｌにおける定常電流密度（ｎＡ／ｍｍ²）を測定した。定常電流密度が応答感度に相当する。その結果を図１に示す。図１からも判るように、酵素固定化電極において、本発明に係る細胞膜類似構造であるＭＰＣを介在させた酵素固定化電極による電気化学センサーは、比較例であるＭＰＣを介在させていない吸着方式の酵素固定化電極による電気化学センサーより、応答感度が高いことが確認された。

次に本発明に係る電極系の安定性を評価した。安定性の評価方法として、実施例１、比較例１のそれぞれの酵素電極系における初期の応答感度を測定した。次に、室温下において０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に実施例１、比較例１のそれぞれの酵素電極系を３日間浸漬した後の応答感度を測定した。なお応答感度の測定方法は、上記の応答感度の検討と同じ条件である。その結果を図２に示す。図２におけるグラフは、初期値に対する相対活性（グルコースの終濃度は１００ｍｇ／ｄｌ）を示している。この結果、ＭＰＣを介在した酵素固定化電極による電気化学センサーは、ＭＰＣを介在していない吸着方式の酵素固定化電極による電気化学センサーよりも、安定性が高いことが確認された。

実施例２に、炭素粒子にケッチェンブラックを使用し、また基材の表面にこのケッチェンブラックを含むスクリーン印刷手法により導電性層を形成した電気化学センサーについて、安定性の検討を行った。なお、本発明の電気化学センサーへの応用による効果を、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来のシトクロムをサブユニットとするグルコース脱水素酵素を一例として用いたデータとして示す。

電極系は
作用極：酵素固定化電極
対極：白金電極
参照極：銀／塩化銀電極
を使用した。
上記作用極である酵素固定化電極においては、本発明に係る細胞膜類似構造層を使用した電気化学センサーと、比較例として、ＭＰＣを介在させていない、導電性層に直接酵素を物理吸着させる従来の吸着方式の酵素固定化電極による電気化学センサーを用いた。

本実施例では、ポリイミド基材の表面に、本発明に従って導電性層（カーボン電極）、細胞膜類似構造層（リン脂質ポリマー層）および固定化酵素膜（Ｃｙ−ＧＤＨ層）を形成した。

炭素粒子として、粒径３４ｎｍ、比表面積１２７０ｍ²／ｇ、空隙率８０ｖｏｌ％のケッチェンブラックＥＣ６００ＪＤ（以下、KBと呼称）を用意した。重量比換算で、ＫＢを４０％と、バインダーとしてポリエステル樹脂を４０％と、溶剤としてイソホロンを２０％とを混合し、印刷用インクを得た。当該インクを、ポリイミド基材の表面へ、厚みが１０μｍになるように印刷し、１５０℃の環境下で３０分間乾燥させ、導電性層を得た。

リン脂質ポリマー層は、前記導電性層の表面にＭＰＣ重合体溶液（０．０５％ＭＰＣ水溶液（溶媒として０．１Ｍリン酸緩衝液を使用））中に、前記導電性層を６時間浸漬することで形成した。リン脂質ポリマー溶液としては、シランカップリング剤が導入されたＭＰＣ重合体（商品名「リピジュアＣＲ−１７０２」；日油社製）を使用した。

Ｃｙ−ＧＤＨ層は、リン脂質ポリマー層が形成された導電性層を、蒸留水でリンスした後、Ｃｙ−ＧＤＨ溶液（１ｍｇ／ｍｌのＣｙ−ＧＤＨ水溶液）に一晩浸漬することで形成した。Ｃｙ−ＧＤＨ溶液におけるＣｙ−ＧＤＨの濃度は、活性基準において１００Ｕ／μＬとした。作製した酵素電極を作用極、Ｐｔを対極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を参照極とし、本発明に係る細胞膜類似構造層を使用した酵素電極系を構築した。

他方、リン脂質ポリマー層を作用極上へ形成しなかった点を除いては実施例２での電極系と同様にして形成したものを比較例２とし、細胞膜類似構造層を介在させていない、導電性層に直接酵素を物理吸着させる従来の酵素吸着方式の酵素固定化電極系として使用した。

これらの電極系を用いて、追加的なメディエータを使用せずに、６００ｍＶの電位差を電極系に印加するクロノアンペロメトリー法により、グルコースに対する応答感度について検討した。応答感度の測定方法として、実施例２、比較例２のそれぞれの酵素電極系（作用極・対極・参照極）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）中に浸漬した。そしてそれぞれの酵素電極系に定電圧（６００mV vs.Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加しながら、この緩衝液中に２．０Ｍグルコース水溶液を滴下し続け、グルコースの終濃度が２５ｍｇ／ｄｌ、１００ｍｇ／ｄｌ、及び６００mｇ／ｄｌにおける定常電流密度（ｎＡ／ｍｍ²）を測定した。定常電流密度が応答感度に相当する。その結果を図３に示す。図３からも判るように、酵素固定化電極において、本発明に係る細胞膜類似構造であるＭＰＣを介在させた酵素固定化電極による電気化学センサーは、比較例２であるＭＰＣを介在させていない吸着方式の酵素固定化電極による電気化学センサーより、応答感度が高いことが確認された。

実施例３に、炭素粒子にケッチェンブラックを使用し、また基材の表面にこのケッチェンブラックの充填手法により導電性層を形成した電気化学センサーについて、安定性の検討を行った。なお、本発明の電気化学センサーへの応用による効果を、ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物に由来のシトクロムをサブユニットとするグルコース脱水素酵素を一例として用いたデータとして示す。

電極系は
作用極：酵素固定化電極
対極：白金電極
参照極：銀／塩化銀電極
を使用した。
上記作用極である酵素固定化電極においては、本発明に係る細胞膜類似構造層を使用した電気化学センサーと、比較例として、ＭＰＣを介在させていない、導電性層に直接酵素を物理吸着させる従来の吸着方式の酵素固定化電極による電気化学センサーを用いた。

本実施例では、ポリイミド基材の表面に、本発明に従って導電性層（カーボン電極）、細胞膜類似構造層（リン脂質ポリマー層）および固定化酵素膜（Ｃｙ−ＧＤＨ層）を形成した。

炭素粒子として、粒径３４ｎｍ、比表面積１２７０ｍ²／ｇ、空隙率８０ｖｏｌ％のケッチェンブラックＥＣ６００ＪＤ（以下、KBと呼称）を用意した。この粉体６０ｍｇに、流動パラフィンを１００μL添加し、よく混合してペースト状とした。このペーストを、直径３ｍｍのペースト電極作成用ベース電極（ビー・エー・エス社製 ＣＰＥカーボンペースト電極）に充填し、厚みが２ｍｍとなるように圧縮し、導電性層とした。

リン脂質ポリマー層は、前記導電性層の表面にＭＰＣ重合体溶液（０．０５％ＭＰＣ水溶液（溶媒として０．１Ｍリン酸緩衝液を使用））中に、前記導電性層を６時間浸漬することで形成した。リン脂質ポリマー溶液としては、シランカップリング剤が導入されたＭＰＣ重合体（商品名「リピジュアＣＲ−１７０２」；日油社製）を使用した。

Ｃｙ−ＧＤＨ層は、リン脂質ポリマー層が形成された導電性層を、蒸留水でリンスした後、Ｃｙ−ＧＤＨ溶液（１ｍｇ／ｍｌのＣｙ−ＧＤＨ水溶液）に一晩浸漬することで形成した。Ｃｙ−ＧＤＨ溶液におけるＣｙ−ＧＤＨの濃度は、活性基準において１００Ｕ／μＬとした。作製した酵素電極を作用極、Ｐｔを対極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を参照極とし、本発明に係る細胞膜類似構造層を使用した酵素電極系を構築した。

他方、リン脂質ポリマー層を作用極上へ形成しなかった点を除いては実施例３での電極系と同様にして形成したものを比較例３とし、細胞膜類似構造層を介在させていない、導電性層に直接酵素を物理吸着させる従来の酵素吸着方式の酵素固定化電極系として使用した。

本発明に係る電極系の安定性を評価した。安定性の評価方法として、実施例３、比較例３のそれぞれの酵素電極系における初期の応答感度を測定した。次に、室温下において０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に実施例３、比較例３のそれぞれの酵素電極系を１、２、３、６、７、１０、１４、１５日間浸漬した後の応答感度を測定した。なお応答感度の測定方法は、実施例１にて示す応答感度の検討と同じ条件である。その結果を図４に示す。なお図４におけるグラフは、初期値に対する相対活性（グルコースの終濃度は１００ｍｇ／ｄｌ）で示している。この結果、ＭＰＣを介在した酵素固定化電極による電気化学センサーは、ＭＰＣを介在していない吸着方式の酵素固定化電極による電気化学センサーよりも、安定性が高いことが確認された。

Claims (18)

1. 基材と、
   該基材上に配置された、炭素粒子からなる導電性層と、
   該導電性層上に配置された、内部および界面の少なくとも１つに酵素を含む細胞膜類似構造層と、
   から構成される電気化学センサー。
2. 前記細胞膜類似構造層がリン脂質膜である、請求項１に記載の電気化学センサー。
3. 前記リン脂質膜が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体である、請求項２に記載の電気化学センサー。
4. 前記酵素がグルコース脱水素酵素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の電気化学センサー。
5. 前記酵素が、細胞膜類似構造層に対して自己組織化した状態で上記細胞膜類似構造層に固定化されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の電気化学センサー。
6. 前記炭素粒子が一次粒径１００ｎｍ以下でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ²／ｇ以上である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の電気化学センサー。
7. 前記炭素粒子がケッチェンブラック（商標）またはBLACK PEARLS（商標）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の電気化学センサー。
8. 前記導電性層は、前記炭素粒子のスクリーン印刷により形成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の電気化学センサー。
9. 前記導電性層は、前記炭素粒子の充填により形成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の電気化学センサー。
10. 基材上に、炭素粒子からなる導電性層を配置するステップと、
    該導電性層上に、細胞膜類似構造層を配置するステップと、
    該細胞膜類似構造層に、酵素を固定するステップ
    から構成される、電気化学センサーの製造方法。
11. 前記細胞膜類似構造層がリン脂質膜である、請求項１０に記載の製造方法。
12. 前記リン脂質膜が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体である、請求項１１に記載の製造方法。
13. 前記酵素がグルコース脱水素酵素である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
14. 前記酵素が、細胞膜類似構造層に対して自己組織化した状態で上記細胞膜類似構造層に固定化されていることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
15. 前記炭素粒子が一次粒径１００ｎｍ以下でかつ比表面積が少なくとも２００ｍ²／ｇ以上である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
16. 前記炭素粒子がケッチェンブラック（商標）またはBLACK PEARLS（商標）である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
17. 前記導電性層は、前記炭素粒子のスクリーン印刷により形成される、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
18. 前記導電性層は、前記炭素粒子の充填により形成される、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。

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