KR102589294B1 - 작동전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 바이오센서 및 생체연료전지 - Google Patents

작동전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 바이오센서 및 생체연료전지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전기화학적 바이오센서 또는 생체연료전지용 작동전극에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 효소 및 전자전달매개체가 링커에 의해 공유결합으로 완전히 고정된 작동전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 바이오센서 및 생체연료전지에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 전극 상에 전자전달 매개체 및 효소가 상기 화학식 1의 링커에 의해 공유결합 됨으로써, 화학적으로 완전한 고정화를 통해 용액 속 질량이동에 대한 산화환원 전위의 변화가 없고, 표면 전자교환반응을 통하여 바탕전류가 매우 낮아 우수한 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)를 가지므로 바이오센서 및 생체연료전지용 전극으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

작동전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 바이오센서 및 생체연료전지{Working electrode, preparation method thereof, and biosensor and enzymatic biofuel cell comprising the same}
본 발명은 전기화학적 바이오센서 또는 생체연료전지용 작동전극에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 효소 및 전자전달매개체가 링커에 의해 공유결합으로 완전히 고정된 작동전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 바이오센서 및 생체연료전지에 관한 것이다.
당뇨병은 엄격한 관리가 수반되지 않을 경우 여러 특징적인 대사 이상을 수반하여 장기, 순환계 및 시력 관련 질환을 유발하여 심각한 합병증을 가져오는 질환으로 주기적인 혈당 검사 및 관리가 매우 중요하다 할 수 있다.
혈중 포도당의 농도를 측정하고 관리하는 것은 현대인의 만성질환 중의 하나인 당뇨병을 관리하기 위해 꼭 필요한 인자이다. 제1형과 제2형 당뇨병환자에 대한 적극적인 혈당조절은 지속적으로 미세혈관합병증(망막병증, 신증, 신경병증)과 대혈관합병증의 발생 및 진행을 줄일 수 있다.
지속적으로 혈당을 관리하는 방법으로는 크게 두 가지로 얘기할 수 있다. 자가 측정용 시스템을 활용하는 방법과 특정 부위의 몸에 부착하여 혈당을 모니터링하는 시스템으로 구분할 수 있다. 자가 측정용 시스템은 휴대가 가능하며, 측정기와 일회용의 검사지를 이용하여 매일 변화되는 혈당을 식사 전/후로 구분을 지어서 체크함으로써 당뇨병을 관리할 수 있다. 이런 경우는 매일 규칙적으로 채혈도구를 이용하여 손가락 끝 또는 대체부위의 혈액을 소량(보통 1 μl이하) 사용해서 측정이 가능하며, 기본적인 측정원리는 도 1에 나타낸 바와 같다.
도 1은 일반적인 바이오센서를 이용한 전기화학 방식의 혈당 측정 원리를 나타내는 모식도이다.
도 1을 참조하면, 바이오센서 작동 전극 상에 부착된 혈중 포도당을 분해하는 산화효소가 포도당을 분해하면 과산화수소가 생성되며, 전극에서 분해되도록 일정한 전압을 인가하면 분해가 되며, 이때 생성되는 전자가 전자전달매개체를 통해 전극에서 일정량의 전류의 세기로 나타나게 된다. 이때 생성된 전류는 혈중 포도당의 농도와 비례하므로 혈당 수치를 정량화 할 수 있다.
현재의 자가혈당 측정 시스템은 침(바늘)을 사용한 채혈 방식(침습형)으로 하루에 몇 번씩 시행되는 검사를 통해 육체적, 정신적 고통뿐만 아니라, 감염의 위험에 노출될 수 있는 단점들이 있다. 이러한 이유로 실제 당뇨환자의 혈당분석 기기 사용에 대한 설문 조사 결과, 자가혈당측정의 중요성에 대한 인식은 낮고 실천이 미흡하였으며 응답자 중 약 80%는 하루 한번도 자가혈당 측정을 하지 않고 있었으며, 약 40%는 자가혈당측정기를 사용하지 않았다고 답변하였다.
이에, 현재의 혈액 채취 없이 땀, 타액, 눈물, 소변 등의 체액을 통해 비침습적인 방법으로 글루코스의 농도를 연속적으로 측정하는 바이오센서의 요구가 증가하고 있다. 이런 비침습형 혈당 측정 시스템의 요구가 많아지는 것은 채혈에 대한 부담감과 규칙적으로 측정해야하는 번거로움과 불편함으로부터 벗어나고자 하는 니즈가 강하기 때문이다.
그러나, 이러한 땀, 타액, 눈물, 소변 등의 체액에 포함되어 있는 글루코스의 농도는 혈액에 포함되는 글루코스의 농도에 약 1/100 정도이므로, 이러한 체액에 포함되어 있는 글루코스의 농도를 감지하기 위하여는 미량의 글루코스도 감지할 수 있는 바이오센서의 개발이 필요하다.
한편, 현재 상용화된 전기화학적 바이오센서는 전기적 신호를 변환할 수 있는 작동전극 위에 글루코스 산화 효소 및 전자전달 매개체가 혼합된 시약조성물을 도포하여 건조시킴으로써 제조되고 있다.
그러나, 이렇게 제조된 바이오센서는 작동전극과 글루코스 산화 효소 및/또는 전자전달 매개체가 물리적으로 접촉되어 있어, 연속적인 글루코스 측정시, 시료의 수용성 용매의 연속적인 접촉에 의해 작동전극상에 부착된 글루코스 산화 효소가 상기 수용성 용매에 용출되어 손실되는 문제가 있다.
대한민국 특허등록 제10-0854389호
본 발명의 제1 목적은 연속적인 글루코스 측정시에도 작동전극상에서 산화환원효소가 용출되지 않도록 전극 상에 효소 및 전자전달매개체가 공유결합으로 완전히 고정된 작동전극을 제공하는 것이다.
본 발명의 제2 목적은 상기 작동전극의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제3 목적은 상기 작동전극을 포함하는 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 제4 목적은 상기 작동전극을 포함하는 생체연료전지를 제공하는 것이다.
상기 제1 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 바이오센서용 또는 생체연료전지용 작동전극을 제공한다. 상기 작동전극은 효소 및 전자전달매개체가 전극 상에 화학적으로 고정된 작동전극이되, 전극; 상기 전극 상에 공유결합으로 고정된 하기 화학식 1로 표시되는 링커; 상기 링커와 공유결합을 형성하는 효소; 및 상기 링커와 공유결합을 형성하는 전자전달매개체를 포함한다.
[화학식 1]
상기 전극은 ITO, 카본, 금, 은, 탄소나노튜브, 그래핀 및 그래파이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질 또는 이의 혼합물일 수 있다.
상기 효소는 탈수소화효소(dehydrogenase), 산화효소(oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는 탈수소화효소, 산화효소, 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함할 수 있다.
상기 효소는 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올 산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 및 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 전자전달매개체는 상기 전자 전달 매개체는 Os, Rh, Ru, Ir, Fe 및 Co 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 전이금속과, 한 자리 또는 복수 자리의 유기 리간드를 포함하는 전이금속착제, 및 중합체 골격(backbone)을 포함할 수 있다.
상기 유기 리간드는 2,2'-바이피리딘, 4,4'-디메톡시-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디메틸-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디아미노-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디클로로-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디메톡시-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디하이드록시-2,2'-바이피리딘, 2,2'-바이피리딘-4,4'-디카르복실산, 4-아미노피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 4-하이드록시피리딘, 2-메틸피라진, 2-메틸피라졸, 3-메틸아미노피리딘, 시아나이드 이온, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 비닐이미다졸, 비닐피리딘, 비닐피롤리돈, 폴리(아크릴아미드-co-비닐이미다졸), 폴리(아크릴산-co-비닐이미다졸), 폴리(아크릴아미드-co-비닐피리딘, 폴리(아크릴산-co-비닐피리딘), 폴리(아크릴아미드-co-비닐피롤리돈) 및 폴리(아크릴산-co-비닐피롤리돈)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 제2 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 작동전극의 제조방법을 제공한다. 상기 작동전극의 제조방법은 전극을 준비하는 단계(S10); 전극 표면에 수산화기(-OH)를 형성하는 단계(S20); 상기 수산화기에 에폭시기를 갖는 실란을 반응시켜 공유결합에 의해 전극 상에 링커를 고정시키는 단계(S30); 및 아민기를 포함하는 전자전달매개체와 아민기를 포함하는 효소의 혼합액을 상기 에폭시기에 반응시켜, 전자전달매개체와 효소를 각각 공유결합으로 링커에 고정시키는 단계(S40)를 포함한다.
상기 에폭시기를 갖는 실란은 3-그리시독시프로필트리메톡시실란, 3-그리시독시프로필트리에톡시실란, 2-(3,4-에폭시사이클로헥실)-에틸트리메톡실실란, 2-(3,4-에폭시사이클로헥실)-에틸트리에톡실실란 및 5,6-에폭시헥실트리에톡시실란으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
나아가, 상기 제3 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 작동전극을 포함하는 바이오센서를 제공한다.
상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비된 평면형 전기화학적 바이오센서일 수 있다.
상기 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비된 대면형 전기화학적 바이오센서일 수 있다.
상기 전기화학적 바이오센서는 연속 글루코스 측정용일 수 있다.
상기 전기화학적 바이오센서는 9 mg/dL 이하의 글루코스 농도를 감응할 수 있다.
상기 전기화학적 바이오센서는 비침습적 글루코스 측정용일 수 있다.
또한, 상기 제4 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 작동전극을 포함하는 생체연료전지를 제공한다.
상기 생체연료전지에 있어서, 상기 작동전극은 산화전극으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 전극 상에 전자전달 매개체 및 효소가 화학식 1의 링커에 의해 공유결합 됨으로써, 화학적으로 완전한 고정화를 통해 용액 속 질량이동에 대한 산화환원 전위(redox potential)의 변화가 없고, 표면 전자교환반응을 통하여 바탕전류가 매우 낮아 우수한 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)를 갖는다.
이에, 본 발명에 따른 작동전극은 혈액 속 보다 글루코스의 농도가 현저히 낮은 타액에 존재하는 9 mg/dL 이하의 저 농도의 포도당을 검출하는데 유용함으로써 비침습형 바이오센서에 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 작동전극은 전극 상에 전자전달 매개체 및 효소가 화학적으로 완전하게 고정되어 연속적인 수용성 용매의 접촉에도 효소가 용출되지 않으므로, 연속적인 측정에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일반적인 바이오센서를 이용한 전기화학 방식의 혈당 측정 원리를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 작동전극의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 작동전극의 제조방법을 나타내는 순서도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 작동전극의 제조방법을 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극에 있어서, 주사 속도(scan rate)에 따른 순환 전압 전류곡선이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극에 있어서, 주사 속도(scan rate)에 따른 산화/환원 전류 값을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에 있어서, 상용 범위(0~350 mg/dL)에서 글루코스의 감응성을 나타내는 순환 전압 전류곡선이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에 있어서, 상용 범위(0~350 mg/dL)에서 글루코스의 감응성을 나타내는 시간에 대한 전류 곡선이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에 있어서, 상용 범위(0~350 mg/dL)에서 글루코스의 감응성을 나타내는 검정곡선이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에 있어서, 비침습을 위한 타액의 글루코스 농도 범위(0~9 mg/dL)에서 글루코스 감응성을 나타내는 시간에 대한 전류 곡선이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에 있어서, 비침습을 위한 타액의 글루코스 농도 범위(0~9 mg/dL)에서 글루코스 감응성을 나타내는 검정곡선이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서와, 일 비교예에 따른 시판되는 글루코스 바이오센서에서 글루코스 농도 0~300mg/dL 범위에서 스파이킹(spiking) 방식을 통한 연속 측정 결과를 나타낸다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고, 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 일 측면은 바이오센서용 또는 생체연료전지용 작동전극을 제공한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 작동전극의 모식도이다.
도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 작동전극은 전극(10), 링커(20), 효소(30) 및 전자전달매개체(40)를 포함한다.
본 발명에 따른 작동전극은 전극(10) 상에 효소(30)와 전자전달매개체(40)가 각각 하기 화학식 1로 표시되는 링커(20)에 의해 공유결합되어 화학적으로 완전히 고정된 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
상기 링커는 한쪽 말단이 -Si-O- 공유결합을 형성하고, 다른쪽 말단은 에폭시기의 반응에 의해 에폭시 고리가 열리면서 -CHOH-CH2-NH- 공유결합을 형성하며, 상기 -Si-O- 공유결합은 전극과 연결되고, -CHOH-CH2-NH- 공유결합은 효소 또는 전자전달매개체와 연결된다. 상기 링커는 탄소사슬을 포함하는데, 상기 탄소사슬은 C1~C12의 직쇄 또는 분지쇄의 탄소사슬을 포함할 수 있다.
상기 작동전극에 있어서, 상기 전극(10)은 상기 전극은 인듐주석산화물(ITO), 카본, 금, 은, 탄소나노튜브, 그래핀 및 그래파이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질 또는 이의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바이오센서 또는 생체연료전지에서 사용되는 전극이면 제한없이 사용할 수 있다.
상기 작동전극에 있어서, 상기 효소(30)는 바이오센서 또는 생체연료전지에서 사용되는 산화환원효소 중에서 선택될 수 있으며, 구체적으로, 각종 탈수소화효소(dehydrogenase), 산화효소(oxidase), 에스테르화효소(esterase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 산화환원 또는 검출 대상물질에 따라서, 상기 효소 군에 속하는 효소들 중에서 상기 대상 물질을 기질로 하는 효소를 선택하여 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 산화환원효소는 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
한편, 상기 산화환원효소는 측정하고자 하는 대상물질(예컨대, 대사물질)로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관하는 역할을 하는 보조인자(cofactor)를 함께 포함할 수 있는데, 예컨대, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드(flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 피롤로퀴놀린 퀴논(Pyrroloquinoline quinone, PQQ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 글루코스 농도를 측정하고자 하는 경우, 상기 산화환원효소로서 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase, GDH)를 사용할 수 있으며, 상기 글루코스 탈수소화효소는 보조인자로서 FAD를 포함하는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드-글루코스 탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및/또는 보조인자로서 FAD-GDH를 포함하는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드-글루코스 탈수소화효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)일 수 있다.
구체적 예에서, 상기 사용 가능한 산화환원효소는 FAD-GDH(예컨대, EC 1.1.99.10 등), NAD-GDH(예컨대, EC1.1.1.47 등), PQQ-GDH(예컨대, EC1.1.5.2 등), 글루탐산 탈수소화효소(예컨대, EC 1.4.1.2 등), 글루코스 산화효소(예컨대, EC 1.1.3.4 등), 콜레스테롤 산화효소(예컨대, EC 1.1.3.6 등), 콜레스테롤 에스테르화효소(예컨대, EC 3.1.1.13 등), 락테이트 산화효소(예컨대, EC 1.1.3.2 등), 아스코빅산 산화효소(예컨대, EC1.10.3.3 등), 알코올산화효소(예컨대, EC 1.1.3.13 등), 알코올 탈수소화효소(예컨대, EC 1.1.1.1 등), 빌리루빈 산화효소(예컨대, EC 1.3.3.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 작동전극에 있어서, 상기 전자전달매개체(40)는 산화환원효소가 환원(글루코스 산화)되어 얻은 전자를 전달하여 주는 역할을 하는 것으로, 전이금속에 하나 이상의 유기 리간드들이 배위결합하고 있는 전이금속 복합체, 및 중합체 골격(backbone)을 포함할 수 있다.
상기 전이금속은 Os, Rh, Ru, Ir, Fe 및 Co 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 전이금속일 수 있다.
또한, 유기 리간드들은 일반적으로 한 자리, 두 자리, 세 자리 또는 네 자리이며, 공지의 전이금속과 배위결합할 수 있는 리간드라면 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 피리딘 및/또는 이미다졸 유도체와 같은 질소를 포함하는 헤테로고리 화합물일 수 있다. 나아가, 여러 자리 리간드들은 다중의 피리딘 및/또는 이미다졸환(예를 들어, 바이피리딘, 바이이미다졸 등)을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 유기 리간드로는 2,2'-바이피리딘, 4,4'-디메톡시-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디메틸-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디아미노-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디클로로-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디메톡시-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디하이드록시-2,2'-바이피리딘, 2,2'-바이피리딘-4,4'-디카르복실산, 4-아미노피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 4-하이드록시피리딘, 2-메틸피라진, 2-메틸피라졸, 3-메틸아미노피리딘, 시아나이드 이온, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 비닐이미다졸, 비닐피리딘, 비닐피롤리돈, 폴리(아크릴아미드-co-비닐이미다졸), 폴리(아크릴산-co-비닐이미다졸), 폴리(아크릴아미드-co-비닐피리딘, 폴리(아크릴산-co-비닐피리딘), 폴리(아크릴아미드-co-비닐피롤리돈), 폴리(아크릴산-co-비닐피롤리돈) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 작동전극은 전극 상에 전자전달 매개체 및 효소가 화학식 1의 링커에 의해 공유결합 됨으로써, 화학적으로 완전한 고정화를 통해 용액 속 질량이동에 대한 산화환원 전위(redox potential)의 변화가 없고, 표면 전자교환반응을 통하여 바탕전류가 매우 낮아 우수한 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)를 가짐을 확인하였다(도 5 내지 12 참조).
이에, 본 발명에 따른 작동전극은 혈액 속 보다 포도당의 농도가 현저히 낮은 타액에 존재하는 저 농도의 포도당을 검출하는데 유용함으로써 침습형 뿐만 아니라 비침습형 바이오센서에도 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 작동전극은 전극 상에 전자전달 매개체 및 효소가 화학적으로 완전하게 고정되어 연속적인 수용성 용매의 접촉에도 효소가 용출되지 않으므로, 연속적인 측정에도 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 작동전극의 제조방법을 제공한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 작동전극의 제조방법을 나타내는 순서도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 작동전극의 제조방법을 나타내는 모식도이다.
도 3 및 도 4를 참조하면, 상기 작동전극의 제조방법은
전극을 준비하는 단계(S10);
전극 표면에 수산화기(-OH)를 형성하는 단계(S20);
상기 수산화기에 에폭시기를 갖는 실란을 반응시켜 공유결합에 의해 전극 상에 링커를 고정시키는 단계(S30); 및
아민기를 포함하는 전자전달매개체와 아민기를 포함하는 효소의 혼합액을 상기 에폭시기에 반응시켜, 전자전달매개체와 효소를 각각 공유결합으로 링커에 고정시키는 단계(S40)를 포함한다.
이하, 본 발명의 작동전극의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
먼저, S10 단계는 전극을 준비하는 단계이다.
상기 전극은 바이오센서 또는 생체연료전지에서 사용되는 전극이면 제한없이 사용할 수 있으며, 예컨대, 인듐주석산화물(ITO), 카본, 금, 은, 탄소나노튜브, 그래핀 및 그래파이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있다.
상기 전극으로서, 바람직하게는 ITO 전극을 사용할 수 있는데, 상기 ITO 전극의 경우, 바이오 센서에 적용 시, 노이즈 신호를 줄일 수 있고 별도의 점착층 없이도 유기 기판 상에 ITO 박막이 침적된 기판을 그대로 사용할 수 있는 장점이 있다. 상기 ITO 전극은 디스플레이 산업 등에서 대형 기판 상에 높고 안정적인 전기전도성 특성을 갖는 박막 기판 제조 공정을 동일하게 활용할 수 있으므로, 매우 저렴하게 전극으로 제작이 가능하다는 이점을 갖는다.
상기 전극(10)은 시판되는 것을 이용하거나, 기판 상에 용액공정 또는 증착공정을 이용하여 형성될 수 있다.
상기 용액공정으로는 스핀코팅(spin-coating), 드롭캐스팅(drop-casting), 바코팅(bar coating), 슬롯 다이(slot-die coating), 그라비아 프린팅(Gravure-printing), 노즐 프린팅(nozzle printing), 잉크젯 프린팅(ink-jet printing), 스크린 프린팅(screen printing), 전기수력학적 젯 프린팅(electrohydrodynamic jet printing), 전기분무(electrospray) 등을 포함할 수 있다.
상기 증착공정으로는 진공 증착(evaporation), 열 증착(thermal deposition), 플래쉬 증착(flash deposition), 레이저 증착(laser deposition), 화학적 증기 증착 (chemical vapor deposition), 원자층 증착(atomic layer deposition), 물리 기상 증착(physical vapor deposition), 물리화학적 공-진공증착 (physical-chemical co-evaporation deposition), 순차적인 증착 (sequential vapor deposition), 용액 공정 조합 증착(solution process-assisted thermal deposition) 등을 포함할 수 있다.
다음으로, S20 단계는 전극 표면에 수산화기(-OH)를 형성하는 단계이다.
상기 단계는 전극 표면에 링커를 고정시키기 위하여 수행되는 전처리 단계로서, 전극에 종류에 따라 당 업계에서 통상적으로 사용되는 전극 표면 개질 방법을 통하여 전극 상에 수산화기를 형성할 수 있다.
예컨대, 전극이 ITO 전극인 경우, 상기 ITO 전극을 황산과 과산화수소가 혼합된 피라냐 용액(Pirahna solution)에 일정 시간 침전시킴으로써 전극 표면을 개질하여 도 4(b)에 나타낸 바와 같이, 전극 표면에 수산화기를 형성시킬 수 있다.
다음으로, S30 단계는 상기 수산화기에 에폭시기를 갖는 실란을 반응시키는 단계이다.
상기 단계에서, 전극 상에 링커를 화학적으로 고정시키기 위하여, 링커를 형성하는 물질로서 상기 수산화기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 실란을 사용할 수 있다.
상기 실란은 추후 S40 단계에서 효소 및 전자전달매개체의 아민기(-NH2)와 공유결합을 시키기 위하여 에폭시기를 갖는 실란을 사용하는 것이 바람직하다. 일례로서, 상기 에폭시기를 갖는 실란으로서 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane)을 기본으로 하여 탄소 1~12개의 탄소사슬을 가지는 실란을 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 에폭시기를 갖는 실란은 3-그리시독시프로필트리메톡시실란, 3-그리시독시프로필트리에톡시실란, 2-(3,4-에폭시사이클로헥실)-에틸트리메톡실실란, 2-(3,4-에폭시사이클로헥실)-에틸트리에톡실실란 및 5,6-에폭시헥실트리에톡시실란으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 에폭시기를 갖는 실란은 하기 반응식 1에 따른 반응 또는 하기 반응식 2에 따른 반응에 의해 전극 상의 수산화기(-OH)와 공유결합을 형성함으로써 도 4(c)에 나타낸 바와 같이, 전극에 화학적으로 완전하게 고정될 수 있다.
[반응식 1]
1) Hydrolysis : RSi(OMe)3 + 3H2O → RSi(OH)3 + 3MeOH
2) Condensation : 3RSi(OH)3 → R3Si3O2(OH)5 + 2H2O
3) Hydrogen bonding : R3Si3O2(OH)5 + Electrode-(OH)3 → R3Si3O2(OH)2(OH)3…(OH)3-Electrode
4) Bond formation : R3Si3O2(OH)2(OH)3…(OH)3-Electrode → R3Si3O2(OH)2(O-Electrode)3 + 2H2O
[반응식 2]
Anhydrous deposition : RSi(OMe)3 + Electrode-OH → RSi(OMe)2O-Electrode + MeOH
다음으로, S40 단계는 아민기를 포함하는 전자전달매개체와 아민기를 포함하는 효소의 혼합액을 상기 에폭시기에 반응시켜, 전자전달매개체와 효소를 각각 공유결합으로 링커에 고정시키는 단계이다.
상기 단계에서, 전극 상에 고정된 링커를 전자전달매개체 및 효소와 화학적으로 고정시키기 위하여, 전극 상에 고정된 링커의 다른쪽 말단에 형성된 에폭시와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 아민기를 포함하는 전자전달매개체와 효소를 사용할 수 있다.
상기 에폭시기는 하기 반응식 3에 따른 반응에 의해 전자전달매개체 및 효소의 아민기와 반응하여 에폭시 고리가 열리면서 아민기와 공유결합을 형성함으로써, 도 4(d)에 나타낸 바와 같이, 링커에 전자전달매개체 및 효소가 화학적으로 완전하게 고정될 수 있다.
[반응식 3]
R-NH2 + Epoxy-R' → R-NH-(C2H3-OH)-R'
상기 화학식 1의 링커에 의해 전극 상에 전자전달매개체 및 효소가 화학적 공유결합으로 완전하게 고정됨은 도 5의 순환 전압 전류곡선 및 도 6의 산화/환원 전류 값을 통하여 확인할 수 있다.
나아가, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 작동전극을 포함하는 바이오센서를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비되는 평면형 전기화학적 바이오센서일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되는 대면형 전기화학적 바이오센서일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서는, 대한민국 특허출원 10-2003-0036804호, 대한민국 특허출원 10-2005-0010720호, 대한민국 특허출원 10-2007-0020447호, 대한민국 특허출원 10-2007-0021086호, 대한민국 특허출원 10-2007-0025106호, 대한민국 특허출원 10-2007-0030346호, [E. K. Bauman et al., Analytical Chemistry, vol 37, p 1378, 1965; K. B. Oldham in "Microelectrodes: Theory and Applications," Kluwer Academic Publishers, 1991.] 등에 공지된 방법을 통해 제조할 수 있다.
나아가, 본 발명의 또다른 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 연속 글루코스 측정용 전기화학적 바이오센서일 수 있다.
본 발명에 따른 바이오센서에 있어서, 2 전극을 갖는 전기화학적 바이오센서의 경우 보조 전극이 금, 백금, 은 또는 은/염화은 전극을 사용할 수 있고, 기준 전극까지 포함하는 3 전극의 전기화학적 바이오센서의 경우, 기준 전극으로 금, 백금, 은 또는 은/염화은 전극을 사용할 수 있다.
나아가, 이러한 전극 외에도, 본 발명은 예를 들어 기판, 확산막(diffusion layer), 보호 막(protection layer) 등을 더 포함할 수 있다.
상기 기판은 PET(polyethylene terephthalate), PC(polycarbonate) 및 PI(polyimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 소재로 된 것일 수 있다.
상기 확산막으로는 Nafion, 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate) 및 실리콘 고무(silicone rubber), 폴리우레탄, 폴리우레탄 기반 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있으며, 보호막으로는 실리콘 고무, 폴리우레탄 및 폴리우레탄 기반 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서는 상기 화학식 1의 링커에 의해 전극 상에 전자전달매개체 및 효소가 화학적 공유결합으로 완전하게 고정된 작동전극을 사용함으로써, 하기 표 1의 종래 바이오센서의 상용범위 뿐만 아니라, 이의 1/100에 해당하는 낮은 농도(9 mg/dL 이하)에서도 글루코스 농도에 대한 감응성이 뛰어나므로, 비침습적으로 체액 내의 글루코스 또한 감응이 가능하고, 글루코스의 연속 측정시에도 작동 전극에 고정된 효소가 용출되지 않으므로, 연속 글루코스 측정용 전기화학적 바이오센서로서 유용하게 사용될 수 있다.
이때, 체액은 혈액을 제외한 땀, 타액, 눈물, 소변 등일 수 있다.
제품 회사 제품명 글루코스 감응 범위
Roche 아큐첵고 혈당측정기 10~600 mg/dL
KDK 슈퍼글루코카드2 혈당측정기 20~600 mg/dL
녹십자 마이케어 혈당측정기 20~900 mg/dL
인포피아 파인 테스트 혈당측정기 10~600 mg/dL
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 작동전극을 포함하는 생체연료전지를 제공한다.
생체연료전지(biofuel cell, 이하 BFC)는 효소, 살아있는 세포와 같은 생체 촉매를 기반으로 한 연료 전지로서 정의되며, 생물학적 에너지를 전기 에너지로 변환하는 초소형 장치로서, 효소, 세포 기관 또는 미생물을 이용하여 더욱 치밀한 시스템으로 발전되어 왔으며, 현재는 심박조율기, 신경 자극기, 약물전달 펌프를 비롯한 이식용 바이오메디컬 기기의 전원으로서 각광받고 있다(A Heller, Miniature biofuel cells, Physical Chemistry Chemical Physics 6 (2004) 209, I Ivanov, T Vidakovic-Koch, K Sundmacher, Recent Advances in Enzymatic Fuel Cells: Experiments and Modeling, Energies 3 (2010) 803-846).
상기 생체연료전지는 효소를 이용한 생체연료전지일 수 있다.
상기 생체연료전지에서 이용하게 되는 연료는 효소가 기질로서 사용하는 유기 화합물이면 어떠한 것이든 사용 가능하다. 본 발명의 한 실시예에서, 상기 유기 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 당, 탄수화물, 유기산, 알코올, 지방산, 탄화수소, 케톤, 알데히드, 아미노산, 단백질 및 핵산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기 화합물일 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 상기 작동전극은 유체 채널 내에 구비되어 있는 것일 수 있다. 유체 채널은 연료 유체의 공급이 지속적으로 이루어질 수 있도록 하기 때문에, 닫힌 공간 내에 연료가 존재하는 경우에 비해 에너지 밀도와 전류 밀도의 증가를 제공할 수 있다. 연료 유체는 주입구와 배출구를 통해 지속적으로 생체연료전지에 제공되게 되며, 이를 통해 효소의 산화제와 환원제의 공급이 원활하게 이루어지게 된다. 또한, 닫힌 공간 내에 연료가 존재하는 경우에 비해 산화전극의 효소 또는 환원전극의 효소가 이들의 기질이 아닌 다른 산화제나 환원제에 의해 반응 효율이 저하되는 것을 방지할 수 있는 장점을 갖는다. 특히, 미세 유체 채널을 이용하면 생체연료전지의 동작 시간을 늘릴 수 있을 뿐만 아니라 전지의 소형화가 가능하다.
상기 생체연료전지는 본 발명에 따른 작동전극을 산화전극으로 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실험예(example)를 제시한다. 다만, 하기의 제조예 및 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1 : 작동 전극의 제조>
H2SO4와 H2O2를 3:1의 비율로 천천히 가하여 만든 피라냐 용액(Pirahna solution)에 ITO 전극을 약 30분간 담가둔 후 에탄올과 증류수로 깨끗이 씻어 ITO 전극 표면을 수산화기(-OH)로 형성시켰다.
이후, 표면이 수산화기로 개질된 ITO 전극을 에폭시기를 갖는 트리알콕시실란을 4% 녹인 톨루엔 용액과 반응시켜 도 3의 b)와 같이 ITO 전극 상에 공유결합된 링커를 형성하였다.
한편, 전자전달매개체와 고분자를 반응시켜 전자전달매개체-고분자 복합체를 형성하였다. 먼저, 전자전달매개체를 합성하였는데, 구체적으로 상기 전자전달매개체는 에틸렌글라이콜을 용매로 사용하여 헥사아미노오스메이트와 4,4'-디메톡시-2,2'-바이피리딘을 당량비로 1:2.2 당량수로 하여 오일베스를 통해 160℃에서 30분간 반응을 진행한 후, 40당량의 소듐하이드로설파이트를 첨가한 후 15분간 저온반응을 진행하였으며, 저온반응이 끝난 최종물을 0.45 μm의 나일론 막 필터를 통하여 정제하여 수득하였다.
다음으로, 고분자 중합체를 하기와 같이 합성하였다. 구체적으로, 아크릴아마이드 모노머와 비닐이미다졸 모노머를 7:1, 10:1, 15:1 당량비율로 증류수, 에탄올 및 초산에틸 등을 용매로 사용하여 0.2 wt%에 해당하는 AIBN 개시제와 함께 히팅멘틀에서 85℃에서 3시간 동안 고분자 중합반응을 진행시켰다. 상기 고분자 중합반응 후, 생성된 고분자 중합체 생성물에 AIBN을 과량 첨가하여 종결반응을 유도한 후 0.45 μm의 나일론 막 필터를 사용하여 최종 고분자 중합체 생성물을 수득하였다.
다음으로, 합성된 고분자 복합체 내의 리간드 당량과 전자전달매개체의 당량을 1:1 당량수로 하여 160℃ 오일베스에서 에틸렌글라이콜을 용매로 사용하여 5분간 반응을 진행하여 전자전달매개체-고분자 복합체를 형성하였다. 반응 종결 후 다이에틸에테르를 이용하여 탈용매화 과정을 진행한 후 증류수를 사용하여 재용해를 진행하고, 최종적으로 10KDa 폴리머필터를 통해 질소압력하에서 정제함으로써 최종 전자전달매개체-고분자 복합체를 얻었다.
다음으로, 전자전달매개체-고분자 복합체와 효소로서 아민기를 포함하는 FAD-GDH(FAD-glucose dehydrogenase)를 증류수에 용해시킨 4.0㎎/㎖ 용액을 혼합한 혼합용액을 링커가 형성된 ITO 전극에 반응시켜 아민기와 에폭시기의 반응에 의해 공유결합이 형성되어 전자전달매개체와 효소가 링커에 의해 ITO 전극상에 완전히 고정된 작동 전극을 제조하였다.
<제조예 2 : 작동 전극의 제조>
전자전달매개체-고분자 복합체 대신 전자전달매개체를 단독으로 사용한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하여 전자전달매개체와 효소가 링커에 의해 ITO 전극상에 완전히 고정된 작동 전극을 제조하였다.
<제조예 3~4 : 바이오센서의 제조>
제조예 1 또는 2에서 제조된 작동전극과, 탄소 잉크로 스크린 프린트된 보조전극 및 실버잉크로 스크린 프린트된 기준전극을 사용하여 바이오센서를 제작하였다.
<비교예 1>
ITO 전극 상에 전자전달매개체-고분자 복합체와 효소로서 아민기를 포함하는 FAD-GDH(FAD-glucose dehydrogenase)를 증류수에 용해시킨 4.0㎎/㎖ 용액을 혼합한 혼합용액을 도포한 뒤 건조시켜, 전자전달매개체와 효소가 ITO 전극상에 부착된 작동 전극을 제조하였다.
<실험예 1 : 작동전극의 효소 및 전자전달매개체의 고정화 확인>
본 발명에 따른 작동전극의 효소 및 전자전달매개체의 고정화를 확인하기 위하여, 제조예 1에서 제조된 작동전극에 대하여 순환 전압 전류법(cyclic voltammetry)을 사용하였다. 순환 전압 전류법을 위한 기준전극으로는 Ag/AgCl 전극이 사용되었다. 순환 전압 전류법을 시행할 때 사용되는 전해질로 인산 버퍼(phosphate buffer)가 포함된 생리식염수를 사용하였다. 순환 전압 전류법을 시행힐 때 인가 전압을 변화하는 주사 속도(scan rate)를 10 mV/s 내지 1000 mV/s로 변화시키면서 전압에 따른 전류의 변화를 측정하여 도 5 내지 도 6에 나타내었다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극에 있어서, 주사 속도(scan rate)에 따른 순환 전압 전류곡선이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극에 있어서, 주사 속도(scan rate)에 따른 산화/환원 전류 값을 나타낸 그래프이다.
도 5 및 도 6을 통하여 Epa 및 Epc의 변화량을 통해 전자 전달 매개체의 고정화를 확인하였다.
구체적으로, 도 5의 경우 Epa와 Epc의 중앙 값인 E°(E1/2) 값이 -0.03V의 낮은 전위를 나타냄을 확인할 수 있고, 도 6의 주사 속도(scan rate)에 따른 산화/환원 전류 값이 선형성을 나타내고 있어, 정상상태(steady-state)의 산화/환원이 일어남을 확인할 수 있다.
또한 주사속도에 제곱근을 취하지 않고도, 산화 신호(anodic peaks ; (Ip)a)와 환원 신호(cathodic peaks ; (Ip)c)가 0.01 ~ 1.00 V/s 의 범위에서 선형성(linearly)이 나오는 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과는 전극 위에 고정된 전자 전달 매개체가 완전히 고정되어 확산 반응(diffusion reaction) 없이 나타나는 결과이며, 이를 통해 전자전달매개체와 효소가 전극 표면에 잘 고정되어 있음을 증명한다. (참고 문헌: E. Steckhan and T. Kuwana, ‘Spectrochemical studu of mediators. I. Bipyridylium Salts and their electron transfer rates to cytochrome C.’ Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 89, 253 (1974))
<실험예 2 : 글루코스 농도 0~360 mg/dL 범위에서의 정량분석>
본 발명에 따라 효소 및 전자전달매개체가 화학적으로 완전히 고정된 작동전극이 바이오센서로서 사용이 가능한 지 알아보기 위하여, 제조예 3에서 제조된 바이오센서에 있어서, 일반적인 글루코스 바이오센서의 측정 범위인 360 mg/dL 이하의 농도를 갖는 글루코스 용액에서 순환 전압 전류법 및 시간대전류법(chronoamperometry)을 수행하여 도 7 내지 도 9에 나타내었다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에 있어서, 상용 범위(0~360 mg/dL)에서 글루코스의 감응성을 나타내는 순환 전압 전류곡선이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에 있어서, 상용 범위(0~360 mg/dL)에서 글루코스의 감응성을 나타내는 시간에 대한 전류 곡선이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에 있어서, 상용 범위(0~360 mg/dL)에서 글루코스의 감응성을 나타내는 검정곡선이다.
도 7 내지 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 바이오센서는 글루코스 농도 0~360mg/dL 범위에서의 정량분석 결과로 결정계수(R2)가 0.99514로 선형적인 감응을 확인하였다.
<실험예 3 : 글루코스 농도 0~9 mg/dL 범위에서의 정량분석>
본 발명에 따라 효소 및 전자전달매개체가 화학적으로 완전히 고정된 작동전극을 포함하는 바이오센서가 타액 등의 낮은 글루코스 농도에도 감응하는 지 알아보기 위하여, 제조예 3에서 제조된 바이오센서에 있어서, 9 mg/dL 이하의 낮은 글루코스 용액에 대하여 시간대전류법(chronoamperometry)을 수행하여 도 10 내지 도 11에 나타내었다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에 있어서, 비침습을 위한 타액의 글루코스 농도 범위(0~9 mg/dL)에서 글루코스 감응성을 나타내는 시간에 대한 전류 곡선이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에 있어서, 비침습을 위한 타액의 글루코스 농도 범위(0~9 mg/dL)에서 글루코스 감응성을 나타내는 검정곡선이다.
도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 바이오센서는 글루코스 0~9 mg/dL의 낮은 농도의 경우에도 정량분석되어 저농도에서도 선형적인 감응을 확인하였다.
<실험예 4 : 글루코스 농도 연속 측정>
본 발명에 따라 효소 및 전자전달매개체가 화학적으로 완전히 고정된 작동전극을 포함하는 바이오센서가 글루코스의 연속 측정이 가능하는 지 알아보기 위하여, 제조예 3에서 제조된 바이오센서에 있어서, 0~300 mg/dL의 글루코스 농도 범위에서 스파이킹(spiking) 방식을 통하여 연속 측정을 수행하면서 시간대전류법(chronoamperometry)을 수행하여 도 12에 나타내었다.
비교군으로서 비교예 1의 효소 및 전자전달매개체가 도포 및 건조되어 물리적으로 접착된 작동전극을 사용한 바이오센서를 사용하였다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서와, 일 비교예에 따라 효소 및 전자전달매개체가 물리적으로 접착된 작동전극을 포함하는 글루코스 바이오센서에서 글루코스 농도 0~300mg/dL 범위에서 스파이킹(spiking) 방식을 통한 연속 측정 결과를 나타낸다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 전극은 전자전달 매개체와 효소가 화학적으로 완전 고정되어 글루코스의 연속 측정이 가능하였으나, 비교예 1의 효소 및 전자전달매개체가 물리적으로 접착된 작동전극을 포함하는 바이오센서는 50초 까지는 글루코스의 감응이 있었으나, 이후 시간에는 감응도가 낮아짐으로써 연속적인 글루코스 측정이 어려움을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 작동전극을 포함하는 바이오센서는 글루코스의 연속 측정이 가능하므로, 연속 글루코스 측정용 전기화학적 바이오센서로서 유용하게 사용될 수 있다.
이상 본 발명을 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예에 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위 내에서 상기 실시예를 다양하게 변형 및 수정할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 따라서, 본 발명은 특허청구범위 및 그 균등물에 의해서만 제한된다.
10: 전극
20: 링커
30: 효소
40: 전자전달매개체

Claims (15)

  1. 효소 및 전자전달매개체가 전극 상에 화학적으로 고정된 작동전극이되,
    전극;
    상기 전극 상에 공유결합으로 고정된 하기 화학식 1로 표시되는 링커;
    상기 링커와 공유결합을 형성하는 효소; 및
    상기 링커와 공유결합을 형성하는 전자전달매개체를 포함하는 작동전극.
    [화학식 1]
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전극은 ITO, 카본, 금, 은, 탄소나노튜브, 그래핀 및 그래파이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 하는 작동전극.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 탈수소화효소(dehydrogenase), 산화효소(oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는
    탈수소화효소, 산화효소, 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 작동전극.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올 산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 및 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 작동전극.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 작동전극.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 전자전달매개체는 Os, Rh, Ru, Ir, Fe 및 Co 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 전이금속과, 한 자리 또는 복수 자리의 유기 리간드를 포함하는 전이금속착제, 및 중합체 골격(backbone)을 포함하는 것을 특징으로 하는 작동전극.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유기 리간드는 2,2'-바이피리딘, 4,4'-디메톡시-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디메틸-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디아미노-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디클로로-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디메톡시-2,2'-바이피리딘, 4,4'-디하이드록시-2,2'-바이피리딘, 2,2'-바이피리딘-4,4'-디카르복실산, 4-아미노피리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 4-하이드록시피리딘, 2-메틸피라진, 2-메틸피라졸, 3-메틸아미노피리딘, 시아나이드 이온, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 비닐이미다졸, 비닐피리딘, 비닐피롤리돈, 폴리(아크릴아미드-co-비닐이미다졸), 폴리(아크릴산-co-비닐이미다졸), 폴리(아크릴아미드-co-비닐피리딘, 폴리(아크릴산-co-비닐피리딘), 폴리(아크릴아미드-co-비닐피롤리돈) 및 폴리(아크릴산-co-비닐피롤리돈)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 작동전극.
  8. 전극을 준비하는 단계(S10);
    전극 표면에 수산화기(-OH)를 형성하는 단계(S20);
    상기 수산화기에 에폭시기를 갖는 실란을 반응시켜 공유결합에 의해 전극 상에 링커를 고정시키는 단계(S30); 및
    아민기를 포함하는 전자전달매개체와 아민기를 포함하는 효소의 혼합액을 상기 에폭시기에 반응시켜, 전자전달매개체와 효소를 각각 공유결합으로 링커에 고정시키는 단계(S40)를 포함하는 작동전극의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 에폭시기를 갖는 실란은 3-그리시독시프로필트리메톡시실란, 3-그리시독시프로필트리에톡시실란, 2-(3,4-에폭시사이클로헥실)-에틸트리메톡실실란, 2-(3,4-에폭시사이클로헥실)-에틸트리에톡실실란 및 5,6-에폭시헥실트리에톡시실란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 작동전극의 제조방법.
  10. 제1항의 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비된 평면형 전기화학적 바이오센서.
  11. 제1항의 작동전극과 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비된 대면형 전기화학적 바이오센서.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 전기화학적 바이오센서는 연속 글루코스 측정용인 것을 특징으로 하는, 전기화학적 바이오센서
  13. 제10항에 있어서,
    상기 전기화학적 바이오센서는 9 mg/dL 이하의 글루코스 농도를 감응하는 것을 특징으로 하는, 전기화학적 바이오센서.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 전기화학적 바이오센서는 비침습적 글루코스 측정용인 것을 특징으로 하는, 전기화학적 바이오센서.
  15. 제1항의 작동전극을 산화전극으로 포함하는 생체연료전지.
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