JPWO2010082497A1 - タンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、患者の生体内の試料を迅速かつ的確に測定する方法を提供することを目的とする。本発明は、タンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法であって、前記タンパク質系薬剤に含まれるタンパク質と特異的な相互作用によって結合する物質を備えた検知手段により、前記タンパク質系薬剤を含む溶液の前記検知手段に備えられた前記物質に対する単位面積あたりの結合質量を基準値として決定するステップＡ、及び採取された生体試料自体を前記検知手段により測定し、前記基準値と比較することにより、前記生体試料に含まれる前記タンパク質系薬剤の濃度を決定するステップＢを含むことを特徴とするものである。これにより、患者の体内において、循環するタンパク質系薬剤の血中濃度を、測定し、最適な投薬量を決定することが可能となり、ひいては効果的な治療が可能となる。
Description
本願は、タンパク質系薬剤の体内濃度及び補体依存的殺細胞活性を迅速に測定する方法に関するものである。
本出願は、2009年1月15日に出願の米国の仮出願第61/144,910号の優先権を主張し、その内容を本願明細書に引用している。
医者は患者に合わせた薬剤の投薬量を決めるために様々な方法を利用している（例えば、特許文献１）。インシュリンや抗高血圧薬は、鎮痙薬、精神安定剤を含む薬剤や様々な種類の薬剤に対する患者の生理学的応答に合わせて調整される。そしていくつかの抗生物質は、医者が投薬量を決定するための基準になる確立した血中濃度がある。薬剤の血中濃度が、確立された最低限の病気に効く血中濃度を下回っている場合、投薬量を増加する。逆に、血中濃度が推奨されたレベルよりも高い場合は、副作用のリスクを減少させるため、又は単に不必要な程大量に処方して薬剤を浪費することを避けるため、医者は投薬量を減少させる。
医者は患者に合わせた薬剤の投薬量を決めるために様々な方法を利用している（例えば、特許文献１）。インシュリンや抗高血圧薬は、鎮痙薬、精神安定剤を含む薬剤や様々な種類の薬剤に対する患者の生理学的応答に合わせて調整される。そしていくつかの抗生物質は、医者が投薬量を決定するための基準になる確立した血中濃度がある。薬剤の血中濃度が、確立された最低限の病気に効く血中濃度を下回っている場合、投薬量を増加する。逆に、血中濃度が推奨されたレベルよりも高い場合は、副作用のリスクを減少させるため、又は単に不必要な程大量に処方して薬剤を浪費することを避けるため、医者は投薬量を減少させる。
非常に多くの抗体系薬剤がここ数年で開発されている。抗体は、特定の対象物である抗原と結合する特定のアミノ酸配列を有するタンパク質である。結合することによって対象物を不活性化することができ、対象物に免疫システムで破壊するためのマーキングをすることができる。抗体が生物活性物質（即ち、化学療法剤又は放射性のアイソトープ）に付着した場合には、効果的に生物活性物質を特定の対象物に付着させることができる。治癒効果のあるモノクローナル抗体の使用がかなり拡大したにもかかわらず、血液濃度や薬剤の効果を測定する有効な方法はほとんどない。例えば、新しい薬剤であるアブシキシマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト等はモノクローナル抗体であって、体内でタンパク質と結合し、特定のタンパク質を不活性化する。後の３種の薬剤は、特に腫瘍壊死因子α（TNFα）と結合する。TNFαはサイトカインであって、通常、不必要な細胞を破壊すると同時に炎症を抑える免疫システムにおいて用いられる。特異なTNFαの活動はクローン病、強直性脊椎、慢性関節リューマチ等の多くの自己免疫疾患の病因と関係している。TNFαの活動を減らすことにより、これらの薬剤はそれらの病気の効果的な治療薬となりえる。
残念なことに、上記で述べた薬剤の種類を用いて治療に失敗することはよくある。抗体を体内に入れることで、患者の自己免疫システムが薬剤に拒絶反応を示すこともある。これにより、TNFαと結合する薬剤の量が減り、治癒効果も制限される。過度な抗TNFα活動もまた問題がある。これらの薬剤は自己免疫システムの重要な要素を不活性化することを意図しているため、結果として抗TNFα治療を休止せざるを得ない感染症にかかる恐れがある。それらの薬剤の他の効果としては、狼瘡様症候群、鬱血性心不全の悪化、神経細胞での脱随、肝毒性発症の可能性がある。モノクローナル抗体系薬剤を処方する医者は、投薬量が抗TNFα抗体が効力を発揮できるのに十分な量であって、危険な副作用が発生するのを回避するものであるか否かを決定する必要がある。
それらのモノクローナル抗体系薬剤の高額な費用が、適切な投薬量を決定することが重要であることを示す他の理由である。例えば、一服100mgのインフリキシマブの値段は1000ドルを超える。投薬量が、効果を発揮するには少なすぎる量である場合には、多大な費用を要するだけでなく、資源の無駄遣いとなる。患者にとって有用な効果以上の副作用が現れるほど投薬量が過度に多い場合には、資源の無駄遣いであって、危険をはらんだものとなる。
残念なことに、モノクローナル抗体の薬剤の血中レベルを決めるには多くの時間が必要であって、複雑である。通常使われる方法はEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay(ELISA)である。しかしながら、この方法は技術的に複雑であって、多くの時間を費やすものなので、早急に検査をしたい場合には向いていない。従って、治癒効果を客観的に計測する方法はもちろん、薬剤の血中濃度を決めるためのシンプルで早急な方法が必要である。
抗体系薬剤の血中濃度を測定する能力が必要であるのに加えて、薬剤の効果を精密に評価する必要がある。自己免疫疾患は炎症性メディエータの複合体相互作用と補体依存性細胞障害等の様々な細胞破壊の進行を含む。例えば、インフリキシマブの治療法としては、それらのプロセスを調製することを意図している。しかしながら、それらの薬剤の異常な免疫活性に対する効果を測定することは困難である。自覚症状のレポートと炎症に対する特異性のない検査を用いて、特異性のある薬を用いた治療法に対する体の生理反応を正確に計測する能力と比較する。高価で危険性のある抗体性薬剤を注意深く正確に服用するためには、疾患過程におけるそのような薬剤の効果を正確に測定する必要がある。
そこで、本発明は、患者の生体内の試料を迅速かつ的確に測定する方法を提供することを目的とする。
本発明は、タンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法であって、前記タンパク質系薬剤と特異的な相互作用によって結合する物質を備えた検知手段により、前記タンパク質系薬剤を含む溶液の前記検知手段に備えられた前記物質に対する単位面積あたりの結合質量を基準値として決定するステップＡ、及び採取された生体試料を前記検知手段により測定し、前記基準値と比較することにより、前記生体試料に含まれる前記タンパク質系薬剤の濃度を決定するステップＢを含むことを特徴とするものである。
本発明によれば、患者の体内において、循環するタンパク質系薬剤の血中濃度を、測定し、最適な投薬量を決定することが可能となり、ひいては効果的な治療が可能となる。
本発明の測定方法においては、予め、タンパク質系薬剤を含む溶液の検出手段表面の特異的結合物質に対する単位面積あたりの結合質量を基準値として決定するステップＡと、採取された生体試料自体を検知手段により測定し、基準値と比較することにより、生体試料に含まれるタンパク質系薬剤の濃度を決定するステップＢとを含むものである。
前記ステップＡは、例えば、既知のタンパク質系薬剤溶液の単位質量当たりに含まれるタンパク質の質量を計算又は測定することにより行うことができる。例えば、バッファー液に含まれるものであれば、実際に以後に説明する検出手段により、単位質量当たりのバッファー液に溶解されたタンパク質系薬剤自体を計測する方法等がある。例えば、単位面積に付着する質量を検知する検知手段の場合には、この単位面積当たりで検知した質量が基準値となる。
本発明では、採取された生体試料自体を直接検知手段により検知するものであり、これによって、例えば、生体試料が血液であれば全血を用いて測定することが可能であり、血清等の分離をする前処理工程が必要なくなり、血液の採取から測定まで短時間で測定が可能となる。また、採取する生体試料も分離等の必要がないので、少量を採取するだけでよいので人体への負担も軽減することになる。ただし、生体試料として血清及び血漿を用いる場合であっても同様の測定値を得ることはできる。
前記ステップＡは、例えば、既知のタンパク質系薬剤溶液の単位質量当たりに含まれるタンパク質の質量を計算又は測定することにより行うことができる。例えば、バッファー液に含まれるものであれば、実際に以後に説明する検出手段により、単位質量当たりのバッファー液に溶解されたタンパク質系薬剤自体を計測する方法等がある。例えば、単位面積に付着する質量を検知する検知手段の場合には、この単位面積当たりで検知した質量が基準値となる。
本発明では、採取された生体試料自体を直接検知手段により検知するものであり、これによって、例えば、生体試料が血液であれば全血を用いて測定することが可能であり、血清等の分離をする前処理工程が必要なくなり、血液の採取から測定まで短時間で測定が可能となる。また、採取する生体試料も分離等の必要がないので、少量を採取するだけでよいので人体への負担も軽減することになる。ただし、生体試料として血清及び血漿を用いる場合であっても同様の測定値を得ることはできる。
生体試料が血餅及び血清を含む全血の場合には、抗凝固剤が添加されたものであることが好ましい。測定中に凝固することを防止できるからである。
上記ステップＡはあらかじめ測定された固定の基準値であり、ステップＢを行う試験者が実施する必要がないことが望ましい。ただし測定精度の向上のためにステップＡをステップＢと同時か、或いは、ステップＢよりも２４時間以内前に行うことができるものとする。
上記ステップＡはあらかじめ測定された固定の基準値であり、ステップＢを行う試験者が実施する必要がないことが望ましい。ただし測定精度の向上のためにステップＡをステップＢと同時か、或いは、ステップＢよりも２４時間以内前に行うことができるものとする。
本発明で使用する検知手段は、水晶振動子、表面プラズモン共鳴素子及び干渉計の何れかを使用することができる。
タンパク質系薬剤とは、タンパク質が含まれた薬剤をいうものとし、例示すると、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体等のタンパク質が含まれた薬剤となる。尚、前記タンパク質は、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質及びレセプターの抗原結合部位を含む融合タンパク質も含むものとする。
前記検知手段によりタンパク質系薬剤を検知するためには、タンパク質と特異的な相互作用によって結合する物質を検知手段の検知部に設ける必要がある。具体的には、タンパク質と特異的な相互作用により結合するリガンドを検知手段の検知部に固定化する。これにより、タンパク質系薬剤とリガンドとの抗体−抗原の結合又はリガンド−レセプターの結合を検知部における質量変化等として測定することが可能となる。
タンパク質系薬剤とは、タンパク質が含まれた薬剤をいうものとし、例示すると、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体等のタンパク質が含まれた薬剤となる。尚、前記タンパク質は、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質及びレセプターの抗原結合部位を含む融合タンパク質も含むものとする。
前記検知手段によりタンパク質系薬剤を検知するためには、タンパク質と特異的な相互作用によって結合する物質を検知手段の検知部に設ける必要がある。具体的には、タンパク質と特異的な相互作用により結合するリガンドを検知手段の検知部に固定化する。これにより、タンパク質系薬剤とリガンドとの抗体−抗原の結合又はリガンド−レセプターの結合を検知部における質量変化等として測定することが可能となる。
また、上記測定方法を使用して、タンパク質系薬剤をモノクローナル抗体系薬剤とし、生体試料内の補体が活性な状態におけるモノクローナル抗体系薬剤の検知装置の検知部への結合から生じる補体系タンパク質相互作用と、生体試料内の補体が不活性な状態におけるモノクローナル抗体系薬剤の相互作用を測定し、これら２つの測定値の差から細胞毒性に応じた補体のレベルが高いことを決定することができる。
尚、上記説明した基準値の取得や濃度の比較は、公知の演算装置、その結果を出力する印刷又は表示装置により行うことができる。
尚、上記説明した基準値の取得や濃度の比較は、公知の演算装置、その結果を出力する印刷又は表示装置により行うことができる。
以下に、本発明の実施例について図面を参照して説明する。
［検出手段の準備及び説明］
以下の実施例において、測定は単位面積当たりの質量を測定するQCMを利用したバイオセンサーを使用した。このバイオセンサーは、図１に示すように、水晶板１の両面に金電極２，２を備えた構造で、構造自体は公知のものである。このバイオセンサーを容器３の底面に配置してセルとしている。尚、図示しないが、測定に際しては、容器内を撹拌するための撹拌手段と容器内の溶液の温度を制御するためのヒーター等の加熱手段を使用した。
［検出手段の準備及び説明］
以下の実施例において、測定は単位面積当たりの質量を測定するQCMを利用したバイオセンサーを使用した。このバイオセンサーは、図１に示すように、水晶板１の両面に金電極２，２を備えた構造で、構造自体は公知のものである。このバイオセンサーを容器３の底面に配置してセルとしている。尚、図示しないが、測定に際しては、容器内を撹拌するための撹拌手段と容器内の溶液の温度を制御するためのヒーター等の加熱手段を使用した。
上記バイオセンサーを使用して、センサーの金電極表面に結合した抗体の単位面積当たりの質量を、Sauerbreyの方程式を用いて、共振周波数の変化を測定することにより測定するものである。
上記式のΔFは計測した周波数（Hz）、F0は水晶振動子の基本共振周波数（本実施例では27MHz）、Δmは質量変化、Aは電極面積（0.049cm2）、ρｑは、水晶の密度（2.65gcm-3）、そして、μqは水晶のせん断応力（2.95×1011dyn・cm-2）である。上記式及び値によれば、0.62ng・cm-2のセンサー表面の質量が増加すると振動数は１Hz減少することになる。
図１において、センサーの金電極２の表面にTNFα４を固定化し、容器３内に約495μLのアッセイバッファー（PBS及び15%の非働化したウシ胎仔血清（FCS））を注入した。非働化したFCSは、電極の表面上に全血成分の特有結合ではないものを減少させるためのブロッキング分子である。このFCSは、約56℃で約60分培養され、最大通過粒子径0.2μmのフィルタにより濾過することで非働化した。
各種の濃度のインフリキシマブ試料６は、例えば、PBST（PBS、0.1%Tween20）等のバッファー、もしくは全血に溶かしてサンプル溶液６’とした。
センサーと結合した非働化FCSが飽和状態となるのを待って、各濃度の約5μLのサンプル溶液６’を、約495μLのアッセイバッファー５で満たされているセル３内に加えた。以下の実施例では、インフリキシマブ６の結合速度がそのときに計測されている。
各種の濃度のインフリキシマブ試料６は、例えば、PBST（PBS、0.1%Tween20）等のバッファー、もしくは全血に溶かしてサンプル溶液６’とした。
センサーと結合した非働化FCSが飽和状態となるのを待って、各濃度の約5μLのサンプル溶液６’を、約495μLのアッセイバッファー５で満たされているセル３内に加えた。以下の実施例では、インフリキシマブ６の結合速度がそのときに計測されている。
［検出手段に目的となるタンパク質と特異的な相互作用により結合する物質の固定化］
測定前に、同センサーの金電極の表面は有機汚染を取り除くために1%のSDS溶液とピラニア溶液（H2SO4(30%):H2O2＝3:1）で洗浄した。この作業後、金電極の表面を数回蒸留水で洗浄し、25℃の雰囲気下で0.2Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.4）に15分間静置した。
測定前に、同センサーの金電極の表面は有機汚染を取り除くために1%のSDS溶液とピラニア溶液（H2SO4(30%):H2O2＝3:1）で洗浄した。この作業後、金電極の表面を数回蒸留水で洗浄し、25℃の雰囲気下で0.2Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.4）に15分間静置した。
約0.2μg/mLのTNFα溶液を使用してセンサーの金電極２上にTNFα４を固定化した。このとき安定化剤としてウシ血清アルブミン（BSA）７がTNFαとともに固定化された。
次に、TNFα及びBSAが固定化されたセンサーと、BSAのみが固定化されたセンサーとを使用し、インフリキシマブを濃度を変えて注入しながら周波数変動を測定した。
インフリキシマブとTNFαとの特異的結合は、図２のグラフ（ａ）で示される周波数変動で表される。インフリキシマブの終濃度は、図示された黒矢印で、左から順に、２ng/mL，20ng/mL，200ng/mL，2μg/mL，20μg/mL，40μg/mLである。
このグラフ（ａ）から、TNFαへのインフリキシマブの特有結合は、終濃度20ng/mLのインフリキシマブが40μg/mLでは周波数変動が少ないことから、その前の20μg/mLが飽和していることが分かる。
一方、インフリキシマブとBSAとの結合は同図のグラフ（ｂ）で示した通り、BSAにはインフリキシマブは特有の結合を示していない。尚、ｂの上方に示す矢印は、左から順に、終濃度20ng/mL，200ng/mL，2μg/mL，20μg/mLである。
インフリキシマブとTNFαとの特異的結合は、図２のグラフ（ａ）で示される周波数変動で表される。インフリキシマブの終濃度は、図示された黒矢印で、左から順に、２ng/mL，20ng/mL，200ng/mL，2μg/mL，20μg/mL，40μg/mLである。
このグラフ（ａ）から、TNFαへのインフリキシマブの特有結合は、終濃度20ng/mLのインフリキシマブが40μg/mLでは周波数変動が少ないことから、その前の20μg/mLが飽和していることが分かる。
一方、インフリキシマブとBSAとの結合は同図のグラフ（ｂ）で示した通り、BSAにはインフリキシマブは特有の結合を示していない。尚、ｂの上方に示す矢印は、左から順に、終濃度20ng/mL，200ng/mL，2μg/mL，20μg/mLである。
［実施例１］
TNFαを金電極表面に固定化したセンサーのセルを使用し、PBS及び全血に溶解された以下の（ａ）〜（ｇ）のインフリキシマブを含むサンプル溶液を注入して周波数変動を測定した。尚、各濃度のサンプル溶液は、濃度（ａ）0μg/mL，（ｂ）5μg/mL，（ｃ）10μg/mL，（ｄ）30μg/mL，（ｅ）50μg/mL，（ｇ）100μg/mLのインフリキシマブ溶液であり、このサンプル溶液を約5μLを、約495μLのアッセイバッファーに注入した。
TNFαを金電極表面に固定化したセンサーのセルを使用し、PBS及び全血に溶解された以下の（ａ）〜（ｇ）のインフリキシマブを含むサンプル溶液を注入して周波数変動を測定した。尚、各濃度のサンプル溶液は、濃度（ａ）0μg/mL，（ｂ）5μg/mL，（ｃ）10μg/mL，（ｄ）30μg/mL，（ｅ）50μg/mL，（ｇ）100μg/mLのインフリキシマブ溶液であり、このサンプル溶液を約5μLを、約495μLのアッセイバッファーに注入した。
図３Ａ〜Ｃは、PBSに上記（ａ）〜（ｇ）のサンプル溶液を注入して、インフリキシマブのTNFαに対する特異的な結合を測定した結果である。
各サンプル溶液の濃度に対する周波数変動を図３Ａに示し、図３Ａの0〜200秒の拡大図を図３Ｂに示す。
図３Ｂから、インフリキシマブを含むサンプル溶液の注入開始から100秒以内に直線状の周波数変動によって表れる結合反応が得られることが分かる。サンプル溶液（ｂ）〜（ｇ）の濃度では、結合初期速度はグラフの傾きで表される。
インフリキシマブの濃度1〜100μg/mLに対する結合初期速度のプロットを図３Ｃに示す。ここでは結合初期速度とインフリキシマブの濃度とが直線関係を示すことが分かる。
TNFαと結合したインフリキシマブの解離定数と速度パラメータはそれぞれの結合曲線を１対１の結合モデルで記述できる式で曲線回帰することにより計測することができる。
Kd＝0.48nMが得られ、値は以前報告されている膜貫通型TNFαとインフリキシマブの解離定数（0.45nM）と非常に近いものとなった。
各サンプル溶液の濃度に対する周波数変動を図３Ａに示し、図３Ａの0〜200秒の拡大図を図３Ｂに示す。
図３Ｂから、インフリキシマブを含むサンプル溶液の注入開始から100秒以内に直線状の周波数変動によって表れる結合反応が得られることが分かる。サンプル溶液（ｂ）〜（ｇ）の濃度では、結合初期速度はグラフの傾きで表される。
インフリキシマブの濃度1〜100μg/mLに対する結合初期速度のプロットを図３Ｃに示す。ここでは結合初期速度とインフリキシマブの濃度とが直線関係を示すことが分かる。
TNFαと結合したインフリキシマブの解離定数と速度パラメータはそれぞれの結合曲線を１対１の結合モデルで記述できる式で曲線回帰することにより計測することができる。
Kd＝0.48nMが得られ、値は以前報告されている膜貫通型TNFαとインフリキシマブの解離定数（0.45nM）と非常に近いものとなった。
図３Ｄ〜Ｆは、上記（ａ）〜（ｇ）の全血に溶解されたサンプル溶液を注入して、インフリキシマブのTNFαに対する特異的な結合を測定した結果である。
各サンプル溶液の周波数変動を図３Ｄに示し、図３Ｄの0〜200秒の拡大図を図３Ｅに示す。
インフリキシマブの全血溶解サンプル溶液の結合反応は、上記図３Ａ〜Ｃとは異なり、最終的な周波数変動は３倍で、結合反応の曲線は１対１結合の形式の理論曲線を用いては分析できなかった。これは、センサー表面で、全血成分とインフリキシマブ−TNFα複合体とが多重結合したことを意味している。
初期結合の状態は、図３Ｅに示されている。図３Ｆから分かるように、1〜100μg/mLの範囲において、初期結合速度とインフリキシマブの濃度とのプロットでは、インフリキシマブの全血溶解サンプルの場合においても、直線的な結合反応が得られることが分かった。
各サンプル溶液の周波数変動を図３Ｄに示し、図３Ｄの0〜200秒の拡大図を図３Ｅに示す。
インフリキシマブの全血溶解サンプル溶液の結合反応は、上記図３Ａ〜Ｃとは異なり、最終的な周波数変動は３倍で、結合反応の曲線は１対１結合の形式の理論曲線を用いては分析できなかった。これは、センサー表面で、全血成分とインフリキシマブ−TNFα複合体とが多重結合したことを意味している。
初期結合の状態は、図３Ｅに示されている。図３Ｆから分かるように、1〜100μg/mLの範囲において、初期結合速度とインフリキシマブの濃度とのプロットでは、インフリキシマブの全血溶解サンプルの場合においても、直線的な結合反応が得られることが分かった。
［実施例２］
補体系タンパク質のインフリキシマブ−TNFα複合体への結合を測定する方法を、図４を参照して説明する。
センサーの金電極の表面にTNFαを固定化する。100μg/mLのインフリキシマブを、それぞれ、全血及び補体システムが加熱不活性化した血漿溶液に溶解して、全血に溶解したインフリキシマブのサンプル溶液及び不活性化した血漿に溶解したインフリキシマブのサンプル溶液を調製した。
各サンプル溶液の5μLを、495μLのアッセイバッファー内に注入したものを測定した結果を図４Ａに示す。尚、グラフａは全血、グラフｂは非働化血漿の周波数変動を示す。図４Ａから、グラフｂは、グラフａよりも周波数変動が少ないことが分かる。
補体系タンパク質のインフリキシマブ−TNFα複合体への結合を測定する方法を、図４を参照して説明する。
センサーの金電極の表面にTNFαを固定化する。100μg/mLのインフリキシマブを、それぞれ、全血及び補体システムが加熱不活性化した血漿溶液に溶解して、全血に溶解したインフリキシマブのサンプル溶液及び不活性化した血漿に溶解したインフリキシマブのサンプル溶液を調製した。
各サンプル溶液の5μLを、495μLのアッセイバッファー内に注入したものを測定した結果を図４Ａに示す。尚、グラフａは全血、グラフｂは非働化血漿の周波数変動を示す。図４Ａから、グラフｂは、グラフａよりも周波数変動が少ないことが分かる。
次に、全血に溶解したインフリキシマブのサンプル溶液5μLを、5mMのEDTAを含むPBS（15%FCS）のアッセイバッファー495μLに注入したものを測定した。EDTAはC1の初期混合の形成反応を抑制する物質として働くので、5mMのEDTAを含むPBS（15%FCS）のアッセイバッファー内における全血に溶解したインフリキシマブのグラフｃは、EDTAなしのアッセイバッファー内における全血に溶解したインフリキシマブのグラフａと比較して周波数変動が少ないことが分かる。
これらの結果から、全血に溶解したインフリキシマブの多重結合は全血からの補体システムタンパク質の多重結合により生じることを示している。
これらの結果から、全血に溶解したインフリキシマブの多重結合は全血からの補体システムタンパク質の多重結合により生じることを示している。
［実施例３］
補体タンパク質が確実にインフリキシマブ−TNFα複合体に対してセンサー表面で結合できるかを調べるために、図４Ｂを参照して、インフリキシマブ−TNFα複合体に対するC1qの結合を測定した例について説明する。
100μg/mLのC1q及び100μg/mLのインフリキシマブをPBSに溶解したサンプル溶液5μLを495μLのアッセイバッファー内に注入したものをセル内で測定した結果をグラフａに示す。100μg/mLのインフリキシマブをPBSに溶解したサンプル溶液5μLを495μLのアッセイバッファー内に注入したものをセル内で測定し、インフリキシマブとセンサー表面のTNFαとの結合が飽和状態になった後、100μg/mLのC1qを5μL加えて測定した結果をグラフｂに示す。グラフａ及びｂから、測定開始後200秒間の結合比率はほぼ同じであることが分かる。
その後の結合反応については、インフリキシマブとC1qをPBSに溶解したサンプル溶液の結合を示す周波数変動は約2000Hzであった。これはインフリキシマブのみをPBSに溶解したサンプル溶液よりも約1000Hz高かった。
この結果から、インフリキシマブとセンサー表面のTNFαとの結合が飽和状態になった後（約5000秒）に、C1qはセンサー表面のTNFαと結合することが分かった。
補体タンパク質が確実にインフリキシマブ−TNFα複合体に対してセンサー表面で結合できるかを調べるために、図４Ｂを参照して、インフリキシマブ−TNFα複合体に対するC1qの結合を測定した例について説明する。
100μg/mLのC1q及び100μg/mLのインフリキシマブをPBSに溶解したサンプル溶液5μLを495μLのアッセイバッファー内に注入したものをセル内で測定した結果をグラフａに示す。100μg/mLのインフリキシマブをPBSに溶解したサンプル溶液5μLを495μLのアッセイバッファー内に注入したものをセル内で測定し、インフリキシマブとセンサー表面のTNFαとの結合が飽和状態になった後、100μg/mLのC1qを5μL加えて測定した結果をグラフｂに示す。グラフａ及びｂから、測定開始後200秒間の結合比率はほぼ同じであることが分かる。
その後の結合反応については、インフリキシマブとC1qをPBSに溶解したサンプル溶液の結合を示す周波数変動は約2000Hzであった。これはインフリキシマブのみをPBSに溶解したサンプル溶液よりも約1000Hz高かった。
この結果から、インフリキシマブとセンサー表面のTNFαとの結合が飽和状態になった後（約5000秒）に、C1qはセンサー表面のTNFαと結合することが分かった。
［タンパク質系薬剤の評価］
インフリキシマブとTNFαとの複合体形成速度は、結合速度（kon）、解離速度（koff）及びそれぞれの分子の濃度（以下に各分子の濃度を「［分子名］」で表記する。）を用いて、
kon［インフリキシマブ］［TNFα］−koff［インフリキシマブ／TNFα］
と示される。結合初期においては、この速度は２番目の項を削除することによって、ｋｏｎ［インフリキシマブ］［TNFα］と簡略化することができる。何故なら、初期結合では、［インフリキシマブ／TNFα］の値が低いからである。従って、測定開始後100秒以内での初期周波数の変化はインフリキシマブの濃度を示す直線式で表すことができる。そして、初期結合速度を定める傾きを得ることができる。初期結合速度はインフリキシマブの濃度に比例している。
インフリキシマブをPBSに溶解させたサンプル溶液と、インフリキシマブを全血に溶解させたサンプル溶液について、1〜100μg/mLの間のインフリキシマブの濃度に対する初期結合速度においては直線が得られる。インフリキシマブの薬物動態の研究から、8週間毎日3回5mg/kg服用した後の、最も高い濃度のインフリキシマブの中央値は、約90〜110μg/mLである。そして、インフリキシマブの血清トラフ濃度は約1μg/mLである。従って、この方法のダイナミックレンジはインフリキシマブの治療時の血中濃度計測において、適切な濃度範囲を包含することができる。
インフリキシマブとTNFαとの複合体形成速度は、結合速度（kon）、解離速度（koff）及びそれぞれの分子の濃度（以下に各分子の濃度を「［分子名］」で表記する。）を用いて、
kon［インフリキシマブ］［TNFα］−koff［インフリキシマブ／TNFα］
と示される。結合初期においては、この速度は２番目の項を削除することによって、ｋｏｎ［インフリキシマブ］［TNFα］と簡略化することができる。何故なら、初期結合では、［インフリキシマブ／TNFα］の値が低いからである。従って、測定開始後100秒以内での初期周波数の変化はインフリキシマブの濃度を示す直線式で表すことができる。そして、初期結合速度を定める傾きを得ることができる。初期結合速度はインフリキシマブの濃度に比例している。
インフリキシマブをPBSに溶解させたサンプル溶液と、インフリキシマブを全血に溶解させたサンプル溶液について、1〜100μg/mLの間のインフリキシマブの濃度に対する初期結合速度においては直線が得られる。インフリキシマブの薬物動態の研究から、8週間毎日3回5mg/kg服用した後の、最も高い濃度のインフリキシマブの中央値は、約90〜110μg/mLである。そして、インフリキシマブの血清トラフ濃度は約1μg/mLである。従って、この方法のダイナミックレンジはインフリキシマブの治療時の血中濃度計測において、適切な濃度範囲を包含することができる。
ELISAのように抗体を測定する他の方法は多くの時間を必要とし、煩雑な実験工程を必要とする方法と比べて、本発明は、タンパク質修飾、酵素増幅又は希釈や遠心分離することなく、全血を用いて100秒以内でタンパク質系薬剤の迅速な測定が可能である。本発明は、比較的技術として簡単であって、数分以内に薬剤濃度を評価する能力を持っている。この点は、現在タンパク質系薬剤を測定する方法として使用されているものと比較して重要な利点である。
この方法は、キメラ抗体に適用することに加えて、ヒト抗体、マウス抗体、融合タンパク質等のようなほぼ全てのタンパク質系薬剤の測定に使用することができる。例えば、エタネルセプトはヒト免疫グロブリンG1のFc成分とヒト可溶性TNFαレセプターの融合タンパク質であり、関節リウマチの治療薬として食品医薬局に認められている。TNFαと結びついたエタネルセプトの親和性はインフリキシマブの親和性と比べるとわずかに劣るが、バッファー液条件と試料の注入量をエタネルセプトの分析の為に最適化した。全血内での、1〜100μg/mLの範囲のエタネルセプトの測定は達成される。同様に、アダリムマブは完全ヒト抗体である。キメラ抗体に比べて免疫抗原性が低いように考えられているが、最近の調査報告では、抗アダリムマブ抗体の発生が治療薬の臨床反応だけでなく薬剤濃度も減少させていることが示されている。この方法は、他のタイプのヒト抗体系治療薬と同様にアダリムマブの血中濃度の測定用にも最適化することが可能である。
本発明の方法は、イブリツモマブ・チウキセタンやゲムツズマブ・オゾガマイシン等の治療薬の評価のために使用することができる。このような治療薬は通常、化学療法剤又はアイソトープといった、他の生物学的活性物質と融合した抗体の使用を含む。薬剤の抗体要素を補足するリガンドを載せたセンサー表面を準備することによって、同様の方法を用いて、関連性のある抗体を計測するために、この方法を使用することができる。
［補体依存性細胞障害活性の評価］
本発明の方法は、TNFαと補体を含む多重結合反応を検出し、測定することができる結果、病気の深刻さや治療反応の測定に利用できる可能性がある。異常なCDCは多くの自己免疫疾患の発症における重要な要素であり、それを測定することは病気の深刻さの個人差を測定できることになる。また膜貫通TNFαは補体依存性細胞障害（CDC）の重要な標的であり、それは体が通常望まない細胞を除去する際に使用するメカニズムを用いて補体タンパク質複合体が膜貫通TNFαを持つ細胞に結合して作用することを含む。リツキシマブのような、ある特定のタイプのモノクローナル抗体系薬剤は特にCDC活性を調整する。インフリキシマブのような、TNFαを減らすための他の治療薬は同様の効果を持つと予期することができる。CDC活性のレベルを計測することが、疾患の進行や治療反応を測定するための客観的な尺度となるということになる。
本発明の方法は、TNFαと補体を含む多重結合反応を検出し、測定することができる結果、病気の深刻さや治療反応の測定に利用できる可能性がある。異常なCDCは多くの自己免疫疾患の発症における重要な要素であり、それを測定することは病気の深刻さの個人差を測定できることになる。また膜貫通TNFαは補体依存性細胞障害（CDC）の重要な標的であり、それは体が通常望まない細胞を除去する際に使用するメカニズムを用いて補体タンパク質複合体が膜貫通TNFαを持つ細胞に結合して作用することを含む。リツキシマブのような、ある特定のタイプのモノクローナル抗体系薬剤は特にCDC活性を調整する。インフリキシマブのような、TNFαを減らすための他の治療薬は同様の効果を持つと予期することができる。CDC活性のレベルを計測することが、疾患の進行や治療反応を測定するための客観的な尺度となるということになる。
ここで示した方法は、初期結合挙動の分析を通じて迅速に抗体系薬剤を測定することができる一方で、同様の方法でCDC活性を測定することもできる。CDC活性のレベルは実験結果から補体活性を失活させたコントロール実験の結果を差し引いて、その値を既知の標準値と比較することによって決定できる。CDC活性を評価する迅速な方法は、患者と接する医者にこのような治療薬の臨床効果やそれにより治療法を決定するための指標について有益なデータを提供することができる。
また、上記測定に使用した検出手段のセンサーは、複数用いるようにすれば同時に多数のサンプルの測定が可能である。また、異なるセンサーに、異なるタンパク質を固定化することにより、異なるタンパク質濃度を測定することが可能となる。
測定結果の算出方法に関しては、特に制限するものではないが、例えば、測定したいタンパク質の血中内における濃度は、センサー表面に存在する抗体の単位面積当たりの質量から算出する方法がある。
以上、本発明は、患者の体内を循環するタンパク質系薬剤の量を測定することが可能となり、薬剤の適切な投薬量を決定したり、疾患の重大さと疾患に対する自己免疫とを評価したり、或いは、タンパク質系薬剤を用いた治療に対する患者の反応を評価等をはじめとして広く産業上利用することができる。
１ 水晶板
２ 電極
３ 容器
４ TNFα
５ アッセイバッファー
６ インフリキシマブ
６’サンプル溶液
７ BSA
２ 電極
３ 容器
４ TNFα
５ アッセイバッファー
６ インフリキシマブ
６’サンプル溶液
７ BSA
次に、TNFα及びBSAが固定化されたセンサーと、BSAのみが固定化されたセンサーとを使用し、インフリキシマブを濃度を変えて注入しながら周波数変動を測定した。
インフリキシマブとTNFαとの特異的結合は、図２のグラフ（ａ）で示される周波数変動で表される。インフリキシマブの終濃度は、図示された黒矢印で、左から順に、２ng/mL，20ng/mL，200ng/mL，2μg/mL，20μg/mL，40μg/mLである。
このグラフ（ａ）から、TNFαへのインフリキシマブの特有結合は、終濃度20μg/mLのインフリキシマブが40μg/mLでは周波数変動が少ないことから、その前の20μg/mLが飽和していることが分かる。
一方、インフリキシマブとBSAとの結合は同図のグラフ（ｂ）で示した通り、BSAにはインフリキシマブは特有の結合を示していない。尚、ｂの上方に示す矢印は、左から順に、終濃度20ng/mL，200ng/mL，2μg/mL，20μg/mLである。
インフリキシマブとTNFαとの特異的結合は、図２のグラフ（ａ）で示される周波数変動で表される。インフリキシマブの終濃度は、図示された黒矢印で、左から順に、２ng/mL，20ng/mL，200ng/mL，2μg/mL，20μg/mL，40μg/mLである。
このグラフ（ａ）から、TNFαへのインフリキシマブの特有結合は、終濃度20μg/mLのインフリキシマブが40μg/mLでは周波数変動が少ないことから、その前の20μg/mLが飽和していることが分かる。
一方、インフリキシマブとBSAとの結合は同図のグラフ（ｂ）で示した通り、BSAにはインフリキシマブは特有の結合を示していない。尚、ｂの上方に示す矢印は、左から順に、終濃度20ng/mL，200ng/mL，2μg/mL，20μg/mLである。
［タンパク質系薬剤の評価］
インフリキシマブとTNFαとの複合体形成速度は、結合速度（kon）、解離速度（koff）及びそれぞれの分子の濃度（以下に各分子の濃度を「［分子名］」で表記する。）を用いて、
kon［インフリキシマブ］［TNFα］−koff［インフリキシマブ／TNFα］
と示される。結合初期においては、この速度は２番目の項を削除することによって、ｋｏｎ［インフリキシマブ］［TNFα］と簡略化することができる。何故なら、初期結合では、［インフリキシマブ／TNFα］の値が低いからである。従って、測定開始後100秒以内での初期周波数の変化はインフリキシマブの濃度を示す直線式で表すことができる。そして、初期結合速度を定める傾きを得ることができる。初期結合速度はインフリキシマブの濃度に比例している。
インフリキシマブをPBSに溶解させたサンプル溶液と、インフリキシマブを全血に溶解させたサンプル溶液について、1〜100μg/mLの間のインフリキシマブの濃度に対する初期結合速度においては直線が得られる。インフリキシマブの薬物動態の研究から、8週間おきに3mg/kgおよび5mg/kgを投与した後の、最も高い濃度のインフリキシマブの中央値は、約90〜110μg/mLである。そして、インフリキシマブの血清トラフ濃度は約1μg/mLである。従って、この方法のダイナミックレンジはインフリキシマブの治療時の血中濃度計測において、適切な濃度範囲を包含することができる。
インフリキシマブとTNFαとの複合体形成速度は、結合速度（kon）、解離速度（koff）及びそれぞれの分子の濃度（以下に各分子の濃度を「［分子名］」で表記する。）を用いて、
kon［インフリキシマブ］［TNFα］−koff［インフリキシマブ／TNFα］
と示される。結合初期においては、この速度は２番目の項を削除することによって、ｋｏｎ［インフリキシマブ］［TNFα］と簡略化することができる。何故なら、初期結合では、［インフリキシマブ／TNFα］の値が低いからである。従って、測定開始後100秒以内での初期周波数の変化はインフリキシマブの濃度を示す直線式で表すことができる。そして、初期結合速度を定める傾きを得ることができる。初期結合速度はインフリキシマブの濃度に比例している。
インフリキシマブをPBSに溶解させたサンプル溶液と、インフリキシマブを全血に溶解させたサンプル溶液について、1〜100μg/mLの間のインフリキシマブの濃度に対する初期結合速度においては直線が得られる。インフリキシマブの薬物動態の研究から、8週間おきに3mg/kgおよび5mg/kgを投与した後の、最も高い濃度のインフリキシマブの中央値は、約90〜110μg/mLである。そして、インフリキシマブの血清トラフ濃度は約1μg/mLである。従って、この方法のダイナミックレンジはインフリキシマブの治療時の血中濃度計測において、適切な濃度範囲を包含することができる。
Claims (10)
- タンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法であって、前記測定方法は以下のステップ、
前記タンパク質系薬剤に含まれるタンパク質と特異的な相互作用によって結合する物質を備えた検知手段により、前記タンパク質系薬剤を含む溶液の前記検知手段に備えられた前記物質に対する単位面積あたりの結合質量を基準値として決定するステップＡ、及び
採取された生体試料を前記検知手段により測定し、前記基準値と比較することにより、前記生体試料に含まれる前記タンパク質系薬剤の濃度を決定するステップＢを含むことを特徴とするタンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法。 - 前記生体試料は、血餅及び血清を含む全血であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法。
- 前記生体試料は、血漿又は血清であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法。
- 前記ステップＡにおいて、前記基準値は、前記タンパク質系薬剤を含ませたサンプル溶液を使用して、あらかじめ実施された前記ステップＡにより決定された固定の基準値として用いるか、前記ステップＡは前記ステップＢと同時に行うか、或いは、前記ステップＡは前記ステップＢよりも２４時間以内前に行うことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法。
- 前記検知手段は、水晶振動子、表面プラズモン共鳴素子及び干渉計の中の何れかであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法。
- 前記タンパク質は、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質及びレセプターの抗原結合部位を含む融合タンパク質の中の何れかであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法。
- 前記タンパク質と特異的な相互作用により結合するリガンドが前記検出手段に固定化されていることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法。
- 前記特異的な相互作用は、抗体−抗原レセプターの結合又はリガンド−レセプターの結合であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法。
- 前記タンパク質系薬剤の体内濃度が薬剤の適切な投薬を決定するのに使用される請求項１に記載のタンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法。
- 前記タンパク質系薬剤は、モノクローナル抗体系薬剤とし、
前記生体試料内の補体が活性な状態におけるモノクローナル抗体系薬剤の前記検知装置の検知部への結合から生じる補体系タンパク質相互作用と、前記生体試料内の補体が不活性な状態における前記モノクローナル抗体系薬剤の相互作用を測定し、これら２つの測定値の差から細胞毒性に応じた補体のレベルが高いことを決定することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質系薬剤の体内濃度の測定方法。
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