JPWO2010032448A1 - 軟骨欠損部位修復シート - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は，変形性関節症など，損傷した軟骨部位を修復する肥大分化しない軟骨細胞および肥大分化しない軟骨細胞シートの製造方法を提供することを目的とする。本発明は，軟骨の再生を促進することができる軟骨細胞シート，及びその製造方法を提供することを目的とする。本発明は，軟骨の再生を促進する剤を提供することを目的とする。【解決手段】 本発明は，脱分化した軟骨細胞、未分化間葉系細胞にチエノインダゾール誘導体（（以下，ＴＭともいう）で表わされる化合物））を投与することで，脱分化した軟骨細胞を再分化させることができるという知見に基づくものである。また，ＴＭは軟骨初期分化を誘導し，軟骨細胞の肥大分化を促進させないという知見に基づくものである。さらに，ＴＭは軟骨分化マーカーである２型コラーゲンの発現を上昇させるという知見に基づくものである。【選択図】図７

Description

本発明は，欠損した軟骨部位を修復する細胞シート，及び軟骨の再生を促進する剤に関する。

従来，疾患や事故などの原因による軟骨損傷を修復するため，軟骨組織の再生が試みられてきた。しかしながら，軟骨は，血管がないため，血液を介しての新陳代謝が行われない。そのため，軟骨は再生されにくい。

骨粗鬆症を治療するために，軟骨細胞の軟骨内骨化を促進する方法が有用である。軟骨内骨化の過程のうち、軟骨の肥大化が起こり、その後に続いて起こる肥大化が、変形性関節症においては病因の１つとして考えられている。よって，変形性関節症を治療するために，肥大化しない移植用軟骨細胞の開発が望まれていた。

特開２００３−１２５７８７号公報（特許文献１）には，軟骨移植に使用する軟骨細胞の培養方法が開示されている。軟骨細胞を製造する際に，通常の培養方法を用いて培養すると，軟骨細胞が脱分化を起こしてしまう。この文献では，細胞を低酸素状態で培養することによって，未分化細胞を軟骨細胞に分化させる方法を開示している。このように分化させても，一般的な培養方法で培養すると，分化した軟骨細胞が脱分化してしまう。そのため，使用するまで特殊な条件下で培養を続ける必要がある。このため，この公報に開示された方法は，臨床では使用しにくいという問題があった。また，この培養方法では，軟骨細胞の骨化につながる肥大軟骨細胞も製造されるという問題があった。このため，骨化しない移植用軟骨細胞を培養する方法や，肥大軟骨細胞を伴うことなく移植用軟骨細胞を培養する方法が望まれた。

特開２００３−１２５７８７号公報

本発明は，肥大化しない軟骨細胞シートを提供することを目的とする。

本発明は，肥大化しない移植用軟骨細胞を培養する方法や，肥大軟骨細胞を伴うことなく移植用軟骨細胞を培養する方法を提供することを目的とする。

また，本発明は，軟骨の再生を促進する剤を提供することを目的とする。

本発明は，未分化の細胞に，チエノインダゾール誘導体である式（Ｉ）で表わされる化合物（以下「ＴＭ」ともよぶ）を投与することで，軟骨細胞に分化させることができるという知見に基づくものである。また，本発明は脱分化した軟骨細胞に式（Ｉ）で表わされる化合物を投与することで，脱分化した軟骨細胞を再分化させることができるという知見に基づくものである。さらに，ＴＭは軟骨初期分化を誘導し，軟骨細胞の肥大分化を抑制するという知見に基づくものである。さらに，ＴＭは軟骨分化マーカーである２型コラーゲンの発現を上昇させるという知見に基づくものである。

本発明の第１の側面は，未分化細胞を分化培養する工程を含む，軟骨欠損部位修復シートの製造方法に関する。そして，未分化骨細胞を培養する工程において，式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を含む培地で未分化細胞を用いる。このように，ＴＭなどを含む培地を用いて未分化細胞を培養し，再分化させることで，未分化細胞が肥大分化しない軟骨細胞となる。このような未分化細胞の例は，ＥＳ細胞，ｉＰＳ細胞，間葉系細胞，及び脱分化した軟骨細胞である。後述する実施例で示されたとおり，未分化細胞は，ＴＭなどを含む培地で培養することによって，軟骨細胞に分化する。また，後述する実施例で示されたとおり，ＴＭを含む培地で細胞を培養することによって，軟骨細胞の細胞外マトリックスに含まれる２型コラーゲン，アグリカン，グリコサミノグリカンの発現が増大される。このような細胞外マトリックス成分は，細胞間の接着を強める。よって，本発明の製造方法によれば，細胞間の接着が強く，破損しにくい，軟骨欠損部位修復用の軟骨細胞シートを製造することができる。

本発明の製造方法では，式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物は，培地中にそれぞれ１×１０^−６〜１×１０^２μＭ含まれることが好ましい。後述する実施例で示されたとおり，このような濃度でＴＭを含む培地中で，未分化細胞を培養することで，軟骨細胞に分化させることができる。

本発明の第２の側面は，上記第１の側面にかかる製造方法によって得られる軟骨欠損部位修復シートに関する。後述する実施例で示されたとおり，本発明の工程で得られた軟骨欠損部位修復シートは，マウス全層膝軟骨欠損部位に移植すると，本発明の工程を経ていない細胞シートと比較して，短期間で欠損部位の修復をすることができる。よって，軟骨欠損部位を修復するための細胞シートとして好適に用いることができる。このような細胞シートを用いることで，軟骨の再生を促進することができる。また，後述する実施例で示されたとおり，本発明の工程で得られた軟骨細胞は肥大分化しない。よって，永久軟骨の再生に好適に用いることができる。

本発明の第３の側面は，式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，またはその薬学的に許容される水和物を有効成分として含むＲｕｎｘ１発現誘導剤に関する。後述する実施例で示されたとおり，ＴＭはＲｕｎｘ１を発現誘導することができる。後述する実施例で示されたとおり，Ｒｕｎｘ１は軟骨の分化を促進する。また，Ｒｕｎｘ１は２型コラーゲンの産生を促進する。さらに，Ｒｕｎｘ１は軟骨細胞の肥大分化を抑制する。２型コラーゲンは，軟骨細胞の細胞外マトリックスを形成する因子の１つであり，軟骨の構成成分であるプロテオグリカンを安定させ、軟骨基質を一つに継ぎ合わせる。よって，本発明の剤は，軟骨の再生を促進することができる。また，本発明の剤を用いれば，軟骨細胞の肥大分化を抑制することができるので，関節軟骨など永久軟骨の再生に好適に用いることができる。

本発明の第４の側面は，式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，またはその薬学的に許容される水和物を有効成分として含む軟骨初期分化誘導剤に関する。後述する実施で示されたとおり，ＴＭは未分化細胞から軟骨細胞への初期分化を誘導することができる。しかし，軟骨細胞の肥大分化を誘導しない。よって，本発明の剤によれば，肥大分化しない軟骨細胞を，未分化細胞から分化誘導することができる。したがって，患部（軟骨欠損部位など）に本発明の剤を投与することで，患部の未分化間葉系細胞などから軟骨細胞への分化（軟骨の再生）を早めることができる。また本発明の剤によれば，軟骨欠損だけでなく，軟骨細胞機能障害などの疾患においても，正常な機能を有する軟骨細胞を患部で増殖させることができる。従って，軟骨欠損や軟骨機能障害疾患などにおける軟骨の再生に好適に用いることができる。

本発明の第５の側面は，式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，またはその薬学的に許容される水和物を有効成分として含む脱分化した軟骨細胞の再分化促進剤に関する。後述する実施例で示されたとおり，ＴＭは，脱分化した軟骨細胞を再度軟骨細胞に分化させることができる。よって，本発明の剤は，脱分化した軟骨細胞の再分化促進剤として好適に用いることができる。

本発明の第６の側面は，式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有する軟骨細胞肥大分化予防剤に関する。後述する実施例で示されたとおり，ＴＭは，軟骨細胞の肥大分化を予防することができる。軟骨細胞が肥大分化すると最終的に骨化し，軟骨細胞の機能が損なわれるだけでなく，軟骨としても正常な機能が失われてしまう。よって，本発明の剤によれば，軟骨細胞の肥大分化を予防できるので，軟骨の再生に好適に用いることができる。よって永久軟骨の再生に好適に用いることができる。

本発明の第７の側面は，式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，またはその薬学的に許容される水和物を有効成分として含む２型コラーゲン産生促進剤に関する。後述する実施例で示されたとおり，ＴＭは，２型コラーゲンの産生を促進することができる。２型コラーゲンは，軟骨細胞の細胞外マトリックスを形成する因子の１つであり，軟骨の構成成分であるプロテオグリカンを安定させ、軟骨基質を一つに継ぎ合わせる。このように本発明の剤は，軟骨細胞外マトリックスの産生を促進し，軟骨構成成分を安定化させるので，軟骨の再生を促進することができる。

本発明は，肥大化しない軟骨細胞シートを提供することができる。

本発明は，肥大化しない移植用軟骨細胞を培養する方法や，肥大軟骨細胞を伴うことなく移植用軟骨細胞を培養する方法を提供することができる。

また，本発明は，軟骨の再生を促進する剤を提供することができる。

図１Ａは，４９塩基対エンハンサーのタンデムコピーを４つ有するヒト２型コラーゲンプロモーターの上流（−１０３１〜＋３７）及び緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子をクローニングしたコンストラクトの概略図である。図１Ｂは，ＴＭ，軟骨形成低分子化合物またはインスリン（１０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＯＬ２−ＧＦＰ ＡＴＤＣ５細胞を示す図面に替わる写真である。右パネルは軟骨基質を可視化するためのトルイジンブルー（ＴＢ）染色を示す。図１Ｃは，ＴＭの化学構造を示す。図１Ｄは，ＴＭ処理中のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の２型コラーゲンプロモーター活性の時間的プロファイルをルシフェラーゼレポーターアッセイによって測定した図面に替わるグラフである。 図２Ａ〜図２Ｆは，ＴＭ，ＧＦＰ発現アデノウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ），Ｓｏｘ９発現アデノウイルス（Ａｄ−Ｓｏｘ９），またはＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９の組み合わせを発現するアデノウイルス（Ａｄ−ｔｈｅ Ｓｏｘ ｔｒｉｏ）で７日間処理したマウスＥＳ細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中の軟骨細胞マーカー遺伝子（２型コラーゲン，アグリカン，及びコンドロモジュリン−１（ＣｈＭ−１））のｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイＲＴ−ＰＣＲ分析した結果を示す図面に替わるグラフである。図２Ａは，マウスＥＳ細胞の２型コラーゲンｍＲＮＡレベルを分析した結果である。図２Ｂは，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の２型コラーゲンｍＲＮＡレベルを分析した結果である。図２Ｃは，マウスＥＳ細胞のアグリカンｍＲＮＡレベルを分析した結果である。図２Ｄは，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のアグリカンｍＲＮＡレベルを分析した結果である。図２Ｅは，マウスＥＳ細胞のコンドロモジュリン−１ｍＲＮＡレベルを分析した結果である。図２Ｆは，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のコンドロモジュリン−１ｍＲＮＡレベルを分析した結果である。図２Ｇは，ＴＭ処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の軟骨基質合成の結果を表す図面に替わる写真である。図２Ｈは，ＴＭ処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量の定量分析の結果を示す図面に替わるグラフである。図２Ｉは，ＴＭ処理した，継代数１（Ｐ１）の初代軟骨細胞の軟骨基質合成の結果を示す図面に替わる写真である。図２Ｊは，ＴＭ処理した，継代数３（Ｐ３）の脱分化初代軟骨細胞の軟骨基質合成の結果を示す図面に替わる写真である。図２Ｋは，ＴＭ，Ａｄ−ＧＦＰ及びＲｕｎｘ２発現アデノウイルス（Ａｄ−Ｒｕｎｘ２）で処理した前軟骨細胞ＡＴＤＣ５細胞中の軟骨細胞肥大マーカー遺伝子１０型コラーゲンのｍＲＮＡ発現レベルを示す図面に替わるグラフである。図２Ｌは，ＴＭ処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の細胞増殖の時間的プロファイルをＷＴＴアッセイで検出した結果を示す図面に替わるグラフである。 図３は，ＴＭによるＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，Ｓｏｘ６及びＲｕｎｘ１の誘導結果を示す。図３Ａは，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＴＭ処理することによってアップレギュレーションされるＲｕｎｘ及びＳｏｘファミリー中の代表的な遺伝子を示すマイクロアレイの結果を示す図面に替わる表である。図３Ｂ〜図３Ｅは，ＴＭ処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中のＲｕｎｘ１（図３Ｂ），Ｓｏｘ５（図３Ｃ），Ｓｏｘ６（図３Ｄ）及びＳｏｘ９（図３Ｅ）のｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションを確認した図面に替わるグラフである。 図４は，Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６およびＳｏｘ９による軟骨細胞分化誘導に対するＲｕｎｘ１の機能的貢献を示す。図４Ａ〜図４Ｃは，Ａｄ−Ｒｕｎｘ１と，Ａｄ−ＧＦＰ，Ａｄ−Ｓｏｘ５＋Ａｄ−Ｓｏｘ６，Ａｄ−Ｓｏｘ９，またはＡｄ−Ｓｏｘ ｔｒｉｏを組み合わせて導入したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中での軟骨細胞マーカー遺伝子である２型コラーゲン（図４Ａ）,アグリカン（図４Ｂ），及びコンドロモジュリン−１（図４Ｃ）の発現を示す図面に替わるグラフである。ｍＲＮＡ発現レベルは，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて解析した。図４Ｄは，定量的グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量アッセイによって決定される，上記に記載のアデノウイルス処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の軟骨基質合成の結果を示す図面に替わるグラフである。図４Ｅは，トルイジンブルー染色によって決定される，上記に記載のアデノウイルス処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の軟骨基質合成の結果を示す図面に替わる写真である。図４Ｆは，単層培養で２４時間上記したアデノウイルスを導入したマウス初代肋骨軟骨細胞において，肥大マーカー１０型コラーゲンの発現結果を示す図面に替わるグラフである。 図５は，軟骨細胞分化の間中のＲｕｎｘ１とＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９との物理的相互作用を示す。図５Ａ〜図５Ｃは，ＧＦＰタグ付きＲｕｎｘ１，Ｆｌａｇタグ付きＳｏｘ５，Ｆｌａｇタグ付きＳｏｘ６，及びＦｌａｇタグ付きＳｏｘ９を用いて共免疫沈降を行い，ウエスタンブロッティングで相互作用を検討した結果を示す図面に替わるグラフである。図５Ａは，トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞溶解液を用いて，イムノブロッティング（ＩＢ）を行った結果を示す図面に替わる写真である。図５Ｂは，抗Ｆｌａｇ抗体（α−Ｆｌａｇ）で免疫沈降（ＩＰ）を行った後，抗Ｆｌａｇ抗体（α−Ｆｌａｇ）を用いてイムノブロッティング（ＩＢ）を行った結果を示す図面に替わるグラフである。図５Ｃは，抗Ｆｌａｇ抗体（α−Ｆｌａｇ）で免疫沈降（ＩＰ）を行った後，抗ＧＦＰ抗体（α−ＧＦＰ）を用いてイムノブロッティング（ＩＢ）を行った結果を示す図面に替わるグラフである。図５Ｄ〜図５Ｆは，Ｒｕｎｘ１変異体（Ｒｕｎｘ１は全長；Ｒｕｎtはｒｕｎｔドメインのみ；ｄｅｌ−Ｒｕｎtはｒｕｎｔドメイン欠失Ｒｕｎｘ１変異体）とＳｏｘ５（図５Ｄ），Ｓｏｘ６（図５Ｅ），及びＳｏｘ９（図５Ｆ）との物理的関連を，ＨｕＨ−７細胞でｃｈｅｃｋｍａｔｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍを用いて分析した結果を示す図面に替わるグラフである。結合活性は，ルシフェラーゼアッセイによって評価した。 図６は，Ｒｕｎｘ１，Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６及びＳｏｘ９タンパク質の発現パターン及び細胞内局在を示す図面に替わる写真である。図６Ａ〜図６Ｆは，Ｅ１７．５のマウスの頸骨成長板中のＲｕｎｘ１（図６Ａ），Ｓｏｘ５（図６Ｂ），Ｓｏｘ６（図６Ｃ），及びＳｏｘ９（図６Ｄ）の発現パターンを，Ｒｕｎｘ２（図６Ｅ）およびＲｕｎｘ３（図６Ｆ）と比較して免疫組織学的に調べた結果を示す図面に替わる写真である。上部写真中に挿入されたボックスを高倍率で拡大した写真が，下２枚の写真に相当する。図中，Ｌ１は増殖帯，Ｌ２は前肥大帯，Ｌ３は肥大帯をそれぞれ示す。図６Ｇは，抗Ｍｙｃ抗体（α−Ｍｙｃ）を使用する免疫細胞化学的に，Ｍｙｃタグ付きＲｕｎｘ１（Ｒｕｎｘ１−Ｍｙｃ：Ｒｈｏｄ），ＧＦＰタグ付きＳｏｘ５（Ｓｏｘ５−ＧＦＰ：ＦＩＴＣ），ＧＦＰタグ付きＳｏｘ６（Ｓｏｘ６−ＧＦＰ：ＦＩＴＣ），又はＧＦＰタグ付きＳｏｘ９（Ｓｏｘ９−ＧＦＰ：ＦＩＴＣ）を発現するプラスミドをトランスフェクションしたＨｅＬa細胞中のＲｕｎｘ１，Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６及びＳｏｘ９の細胞内局在を，核の対比染色（ＤＡＰＩ）を用いて検討した結果を示す図面に替わる写真である。 図７は，ＴＭ処理した培養軟骨細胞シート（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ−ｓｈｅｅｔｓ）の製造工程，および培養軟骨細胞シートをマウス全総膝軟骨欠損部位に移植した結果を示す。図７Ａは、軟骨細胞シートの製造工程を示す図面である。図７Ｂは，マウス全層膝軟骨欠損部位に軟骨細胞シートを移植した部位をトルイジンブルー（ＴＢ）で染色した結果を示す図面に替わる写真である。 図８は，再生した膝軟骨組織の由来を検討した結果を示す図面に替わる写真である。図８Ａは，膝関節軟骨の免疫組織化学解析結果を示す図面に替わる写真である。図８Ｂは，図８Ａを拡大した図面に替わる写真である。

本発明の第１の側面は，軟骨欠損部位修復シートの製造方法に関する。本発明の製造方法は，未分化細胞を分化培養する工程（分化培養工程）を含む。そして，分化培養工程では，下記式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，またはその薬学的に許容される水和物を含む培地で未分化細胞を培養する。

上記式（Ｉ）で示されるチエノインダゾール誘導体（ＴＭ）は，例えば，特開２００２−３５６４１９号公報に記載の方法に従って製造できる。また，市販の化合物（武田薬品工業社製：Ｔ−１９８９４６）を入手することもできる。

本明細書において，“その薬学的に許容される塩”とは，上記化合物の塩，特に薬学的に許容される上記化合物（ＴＭ）の塩を意味する。本明細書において“薬学的に許容される”とは，ＴＭを添加する細胞や，本発明の軟骨欠損部位修復シートを用いる患者に有害でないことを意味する。本発明のＴＭは，常法に従って塩にすることができる。その薬学的に許容される塩としては，例えば，ナトリウム塩，カリウム塩，リチウム塩などのアルカリ金属塩，カルシウム塩，マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩，アルミニウム塩，鉄塩，亜鉛塩，銅塩，ニッケル塩，コバルト塩などの金属塩，アンモニウム塩などの無機塩，ｔ-オクチルアミン塩，ジベンジルアミン塩，モルホリン塩，グルコサミン塩，フェニルグリシンアルキルエステル塩，エチレンジアミン塩，Ｎ-メチルグルカミン塩，グアニジン塩，ジエチルアミン塩，トリエチルアミン塩，ジシクロヘキシルアミン塩，Ｎ，Ｎ’-ジベンジルエチレンジアミン塩，クロロプロカイン塩，プロカイン塩，ジエタノールアミン塩，Ｎ-ベンジル-Ｎ-フェネチルアミン塩，ピペラジン塩，テトラメチルアンモニウム塩，トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩などの有機塩などのアミン塩，があげられる。これらのうちで，ポリリン酸の塩として，アルカリ金属塩が好ましく，ナトリウム塩がより好ましい。

本明細書において，“その薬学的に許容される塩”には，無水塩のみならず含水塩が含まれても良い。これらの塩は，例えば，生体内などで電離して上記の化合物と同様に機能する。“その薬学的に許容される水和物”とは，上記化合物（ＴＭ）の水和物を意味する。また，本発明で使用するＴＭは，大気中に放置したり，再結晶することにより，水分を吸収し，吸着水が付いたり，水和物となる場合がある。そのような水和物を形成する場合も，“その薬学的に許容される水和物”に含む。これらの水和物は，生体内などで電離して上記の化合物と同様に機能する。

本明細書において“未分化細胞”とは，軟骨細胞以外の組織または器官としての特定の機能を有する細胞へ分化する分化過程に入っていない，分化能を有する細胞を意味する。このような“未分化細胞”として，ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｉｃ Ｓｔｅｍ）細胞（胚性幹細胞），ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ）細胞（人工多能性幹細胞），未分化間葉系細胞，脱分化した軟骨細胞などがあげられ，軟骨細胞に分化しうる細胞が好ましい。

なお，本明細書において，“分化”とは，細胞，組織または器官のような生物の部分の状態の発達過程であって，特徴のある組織または器官を形成する過程をいう。細胞の分化とは，未分化な細胞から特定機能を有する細胞へと変化していく現象をいう。全く分化していない又は分化レベルが極めて低い未分化細胞（例えば幹細胞）から最終的に機能する細胞が作り出される過程，及び，すでに分化し特定機能を有する細胞が外部からの刺激に応じて新しい機能を獲得する過程のいずれもが分化に含まれる。

［ＥＳ細胞］
ＥＳ細胞は，発生初期の胚（胚盤胞）から樹立される幹細胞であり，成体に存在するすべての細胞へと分化できる多能性（万能性）を有する細胞である。このようなＥＳ細胞は，発生初期の胚（胚盤胞）の内部細胞塊から，常法で樹立できる。具体的には，マウスの胚盤胞の内部細胞塊をマウス胎児繊維芽細胞の初代培養細胞の単層シート上に播種し，白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）を含む培地で培養することにより得られる。またＥＳ細胞は，市販のＥＳ細胞を用いてもよい。たとえば，オープン バイオシステム社製のＣ５７ＢＬ／６由来のマウスＥＳ細胞，１２９／ｓｖ由来のマウスＥＳ細胞，ＥＳＩ社製のヒトＥＳ細胞などがあげられる。

このようなＥＳ細胞の培養方法は，公知の方法を用いればよい。たとえば，マウスＥＳ細胞は，白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）を含む培地で培養することで，未分化性を維持したまま継代培養することができる。マウスＥＳ細胞は，フィーダー細胞を播種した培養容器を用いて継代培養する。フィーダー細胞としては，マウス１４〜１５日胚の線維芽細胞初代培養細胞や線維芽細胞由来細胞株であるＭＥＦ（Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞やＳＬ１０細胞（リプロセル社製）などを用いることができる。

フィーダー細胞を播種した培養容器は，公知の方法で作製することができる。たとえば，市販のゼラチンコート培養容器（コーニング社製など）にフィーダー細胞を播種し，インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ_２）で１〜７日間培養することで得ることができる。フィーダー細胞の培養培地は，例えば，ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ），ペニシリン−ストレプトマイシン，グルタミンを含む培地など，公知の培地を用いることができる。

ＥＳ細胞をこのような培養容器で培養するときは，フィーダー細胞を培養する培養溶液を除去し，新たにＥＳ細胞培養用培地を培養容器に加え，その中にＥＳ細胞を播種すればよい。ＥＳ細胞培養用培地としては，例えばＤＭＥＭにＦＢＳ，ＮＥＡＡ（Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ヌクレオシド，２−メルカプトエタノール，ペニシリン−ストレプトマイシン，グルタミン，ＬＩＦなどを含む公知のＥＳ細胞用培地を用いればよい。ＥＳ細胞は，インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ_２）で１〜７日間培養する。培養期間は，細胞の増殖度合いに応じて適宜調整すればよく，４日以上培養するときは，２〜３日ごとに培地交換を行うことが望ましい。ＥＳ細胞は，フィーダー細胞を播種した培養容器などを用いて，適宜継代培養することができる。

ＥＳ細胞の回収は，公知の方法で行うことができるが，たとえば，培養終了後，培養容器にトリプシン−ＥＤＴＡ容器を加え，フィーダー細胞とＥＳ細胞を浮遊させる。浮遊させた両細胞を遠心して集め，ＥＳ細胞培養用培地などに懸濁して，ゼラチンでコートした培養容器に播種して静置する。これにより，接着性の強いフィーダー細胞は培養容器に付着する，一方接着性の弱いＥＳ細胞は培養容器に完全には付着できないので，ＥＳ細胞が含まれる培養培地をピペッティングなどすることによってＥＳ細胞を効率よく回収することができる。このように回収したＥＳ細胞を本発明に用いることができる。しかし，本発明で用いるＥＳ細胞は，上記方法によって得られるＥＳ細胞に限定されることはなく，当業者であれば適宜変更を加え，ＥＳ細胞を得ることができる。

［ｉＰＳ細胞］
ｉＰＳ細胞は，分化した体細胞から作製される万能性を有する細胞（未分化の状態に戻した（初期化した）細胞）である。このようなｉＰＳ細胞は，当業者であれば，公知の方法，例えば，「Ｋａｚｕｔｏｓｈｉ Ｔ．，２００７，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１３１，ｐ８６１−ｐ８７２」に記載の方法などを用いて作製することができる。具体的には，（分化済みの）培養細胞に，転写因子であるＯｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，及びｃ−Ｍｙｃを発現するベクターを導入することで作製することができる。このようなベクターとしては，公知のレトロウイルスベクター又はアデノウイルスベクターなどがあげられ，公知の方法で導入することができる。遺伝子を導入後，細胞は４〜７日培養し，トリプシン処理などを行って，細胞を回収する。回収した細胞は，上記したＥＳ細胞の培養と同様に，フィーダー細胞を播種した培養容器で培養すればよい。

ｉＰＳ細胞が作製されたことは，細胞マーカーの発現を調べることで確認することができる。ｉＰＳ細胞は，ＥＳ細胞マーカー（例えば，ＧＤＦ３（ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３），ＥＳＧ１（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ １），ＦＧＦ４（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ４）など）を発現することが知られている。よって,ｉＰＳ細胞が作製されたことは，上記したようなＥＳ細胞マーカーの発現を調べることで確認することができる。ＥＳ細胞マーカー発現の確認方法は，ＲＴ−ＰＣＲ，ノーザンブロッティング，イムノブロッティング（ウエスタンブロッティング）など公知の方法を用いればよい。作製したｉＰＳ細胞は，上記したＥＳ細胞と同様に継代培養し，本発明に用いることができる。このように作製したｉＰＳ細胞は，分化能を有する多能性細胞として，ＥＳ細胞と同様に使用することができる。しかし，本発明で用いるｉＰＳ細胞は，上記に記載の方法によって得られる細胞に限定されることはなく，当業者であれば適宜変更を加え，ｉＰＳ細胞を得ることができる。

［未分化間葉系細胞］
未分化間葉系細胞は，骨格を形成する細胞，すなわち軟骨細胞，骨芽細胞，脂肪細胞，繊維芽細胞，腱細胞，筋芽細胞などに分化する機能を有する細胞である。これらの細胞への分化は，それぞれ異なった転写因子によって決定されることが知られている。このような未分化間葉系細胞として，骨髄由来の細胞，関節軟骨由来の細胞，皮膚由来の細胞，胚細胞，胎児由来の細胞などを用いることができる。このような未分化間葉系細胞は，個体から採取し，本発明に用いるための（培養）細胞とすることができる。このように個体から採取した組織から培養細胞を樹立する方法は公知であり，当業者であれば適宜行うことができる。たとえば，個体から骨髄液を採取し，細胞培養用フラスコに播種する。１８〜３６時間静置後，フラスコをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などで洗浄し，フラスコに接着しなかった細胞を除去する。その後，フラスコに培養培地を加え，細胞培養用フラスコの底面に付着した細胞を増殖させる。培養培地は，当業者であれば適宜公知のものを使用することができる。培養期間は１０〜６０日があげられ，フラスコ底面に付着した細胞量や細胞の増殖能に応じて適宜変動させる。培養期間中は,定期的に培地交換を行うことが好ましい。培地交換の期間としては，１〜７日があげられ,好ましくは１〜２日である。細胞の培養は公知のインキュベーター（３７℃，５％ＣＯ_２）で行えばよい。

本発明に用いるための未分化間葉系細胞は，個体から採取した細胞を継代培養したものを用いてもよい。継代培養は，公知の方法で行うことができる。細胞はポリリシンコートやコラーゲンコートなどされた公知の培養細胞用ディッシュやフラスコで培養することができる。培養培地は，採取した細胞の特性に応じて，当業者であれば適宜選択することができる。たとえば，例えばＤＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，ＥＭＥＭなどがあげられる。培養培地は，成長因子などを含む血清（例えば，ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＦＣＳ）など）を１〜２０％含むものが好ましいが，無血清培地で培養することもできる。無血清培地で培養する場合には，成長因子であるインスリンやＴＧＦ−βなどを適宜添加することが好ましい。また培養培地には，ペニシリン，ストレプトマイシンなどの抗生物質，グルタミンなどのアミノ酸，アスコルビン酸などのビタミン類などを適宜添加して用いることができる。細胞の培養条件は，細胞の状態に応じて適宜調整することができる。たとえば，公知のインキュベーター（３７℃，５％ＣＯ_２）で培養することができる。培養細胞は適宜継代して培養する。継代のタイミングは，当業者であれば適宜判断することができる。継代までの培養日数は，細胞の増殖程度に応じて適宜調整することができ，たとえば１〜３０日があげられる。１週間以上継代しない場合は，５〜７日ごとに培地交換をすることが好ましい。このようにすることで，培養細胞の生存率，増殖率を高めることができる。

［脱分化した軟骨細胞］
脱分化した軟骨細胞とは，一度軟骨細胞に分化した細胞が，軟骨細胞としてその特徴（機能）を失い，未分化な状態に戻った細胞である。軟骨細胞を脱分化させる方法は，公知の方法で行うことができる。たとえば，軟骨細胞は，接着型の細胞で通常行われる単層培養などを行うことで，いわゆる脱分化を起こし，軟骨特有の性質を失わせることができる。接着型の細胞で通常行われる単層培養とは，ポリリシンやコラーゲンでコーティングされた公知の培養容器（例えば，日本ＢＤ社製のセルカルチャーディッシュ，セルカルチャーフラスコなど）を用いて行うことができる。このような培養方法は，上記した樹立した培養細胞の培養と同様の方法で行うことができるが，上記方法に限定されるものではなく，当業者であれば適宜変更することができる。

脱分化させる軟骨細胞は，上記した未分化間葉系細胞の樹立と同様に，個体から採取し用いることができる。また，上記したＥＳ細胞，ｉＰＳ細胞，未分化間葉系細胞を公知の方法で軟骨細胞に分化誘導させてもよい。このような方法として，例えば，培養培地中に，軟骨細胞分化誘導因子など（例えば塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）など）を添加する方法や，市販の軟骨細胞分化誘導用培地（例えば，ミルテニーバイオテク社製ＮＨ ＣｏｎｄｒｏＤｉｆｆ Ｍｅｄｉｕｍなど）を用いて，軟骨細胞に分化させる方法があげられる。軟骨細胞の分化は，後述する方法で分化度合いを調べることができ，結果に応じて適宜添加する分化誘導因子量を変更すればよい。このような方法は公知であり，当業者であれば，細胞の特性に応じて適宜変更を加えることができる。

［分化培養工程］
本発明の分化培養工程は，式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，またはその薬学的に許容される水和物を含む培地で未分化細胞を培養する工程である。本工程において，ＴＭ，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物の培地中の濃度は１×１０⁻⁶〜１×１０^２μＭがあげられ，１×１０^−５〜５×１０μＭが好ましく，１×１０^−３〜1×１０μＭがより好ましい。後述する実施例で示されたとおり，このような濃度のＴＭを含むことで，効果的に未分化細胞の分化が誘導される。本発明の分化培養工程で使用する培地は，ＤＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０又はＥＭＥＭなど公知の培地を適宜用いることができる。そして，ＴＭなど以外の培地への添加物（例えば，血清，抗生物質，アミノ酸類，ビタミン類など）は，使用する未分化細胞に応じて当業者であれば適宜選択することができる。分化培養期間は，１〜３０日があげられ，３０日以上も可能であるが，好ましくは２〜２０日であり，より好ましくは２〜１４日である。培養は，公知の細胞培養用インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ_２）などを用いて行うことができる。

本発明の製造方法では，未分化細胞は，公知の細胞培養用容器で培養することができるが，温度応答性培養容器上で培養することが好ましい。公知の細胞培養用容器としては，上記したとおり，ポリリシンやコラーゲンなどでコーティングされた培養細胞用ディッシュやフラスコがあげられる。このような培養容器で培養した時は，培養終了後，細胞をたとえばスクレーパーなどを用いて容器から剥離することで，シート状の細胞を得ることができる。しかし，スクレーパーなどを用いて，物理的に剥離すると細胞が傷つきやすい。そのため，温度応答性培養容器を用いることが好ましい。温度応答性培養容器は，温度によって細胞接着性が変わる温度応答性ポリマーなどで細胞培養（接着）面が，コーティングされた培養容器である。温度応答性ポリマーとしては，公知のものを用いることができ，例えば，ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）があげられる。この温度応答性ポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）は，３７℃では疎水性を示すが，３２℃以下では親水性に性質が変化する。このため，培養（接着）表面にこの温度応答性ポリマー（ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を固定し，その上で細胞を培養後，温度を下げると，細胞は足場を失いシード状に脱離してくる。このような培養容器を用いることで，培養容器から，細胞間結合や接着因子を保持（細胞マトリックスを保持）した状態の細胞シートを回収することが可能なる。このような培養容器として細胞シートを回収するときに，細胞シートが容器の壁などに接触しにくいペトリディッシュなどのような培養容器が好ましい。このような温度応答性培養容器は，公知のものを使うことができ，たとえばセルシード社製のアップセル（温度応答性培養皿）などがあげられる。上記したとおり，このような温度応答性培養皿で製造したシートは，細胞間マトリックスが保持された細胞シートは，シートが破損しにくいので使用しやすい。また，細胞シート回収時に細胞が受けるダメージが少ないので，このような細胞シートは高い治療効果および早期治癒を望むことができる。

また，培養容器として，培養容器の細胞培養面を覆う生体分解性ポリマーシートを設置したものを用いることもできる。生体分解性ポリマーとしては，コラーゲン，ポリ乳酸，ポリグリコール酸，ポリグリコール酸共重合体など，細胞が付着する足場となりえるものが好ましい。このような生体分解性ポリマーからシートを製造する方法は，公知の方法を用いればよい。具体的には，生体分解性ポリマーを熱で溶解し，平面を有する容器（例えば，ペトリディッシュなど）に入れ，容器の平面上にポリマー溶解液をのばし，ポリマーを冷ませばよい。生体分解性ポリマー溶解液はヘラなどで，目的とする厚みとなるように容器に広げることができる。冷めて固まった生体分解性ポリマーを容器から剥離するとシート状の生体分解性ポリマーを得ることができる。このような生体分解性ポリマーシートは，適宜切断して本発明の製造方法に用いる培養容器に設置するシートとして用いることができる。本発明の製造方法において，生体分解性ポリマーシートは培養容器に接着していないものが好ましく，培養容器から容易に外せるものが好ましい。生体分解性ポリマーシートは，生体分解性ポリマーシート上で細胞を培養後，細胞とともに回収され，欠損部位修復シートとして用いることができる。このような用途に用いる生体分解性ポリマーの厚みとしては,１ｍｍ以下があげられる。生体分解性ポリマーシートの厚みは，均一であることが好ましいが，凹凸があってもよい。このような凹凸としては，シートの厚み平均値の５０％以下があげられ，２０％以下であることが好ましい。生体分解性ポリマーシートの凹凸が小さい方が，シート上で細胞を均一に増殖させやすくなるので好ましい。生体分解性ポリマーシート上で培養した細胞を生体分解性ポリマーシートとともに回収するとき（シートを持ち上げたときなど）に，生体分解性ポリマーシートが破損しない厚さであればよく，当業者であれば適宜設計することができる。このような生体分解性ポリマーシートを用いることで，軟骨欠損部位修復シートとして，十分な強度を持たせることができるので，軟骨欠損部位の治療に好適に用いることができる。

軟骨細胞は，分化の度合いにより，軟骨前駆細胞，静止軟骨細胞，増殖軟骨細胞，前肥大化軟骨細胞，及び肥大化軟骨細胞に分類される。本発明の製造方法の工程に含まれる再分化工程では，各分化過程の指標とされる軟骨分化マーカーを測定することで，軟骨細胞の分化度合いを確認することができる。本発明の製造方法で製造される軟骨欠損部位修復シートは，静止軟骨細胞を多く含むシートであることが好ましい。一方，軟骨欠損部位修復シートは，軟骨前駆細胞，増殖軟骨細胞，前肥大化軟骨細胞などが含まれていてもよい。本発明の軟骨欠損部位修復シート中には，軟骨細胞以外に細胞外マトリックスなども含まれる。本発明の軟骨欠損部位修復シート中の静止軟骨細胞の割合は，２０％〜９９％（Ａ〜Ｂは，Ａ以上Ｂ以下を示す。以下同じ）があげられ，好ましくは５０％〜９５％であり，より好ましくは７０〜９０％である。静止軟骨細胞を多く含むシートとすることで，永久軟骨再生医療に好適に使用することができる。永久軟骨（静止軟骨ともいう）とは，たとえば関節軟骨など，円滑な関節運動，組織の弾性および形態維持などに役立つ軟骨である。このような永久軟骨は，肥大化軟骨細胞を含まず，骨化が起こらない。そのため，本発明の細胞シートを永久軟骨再生に用いるときは，肥大化軟骨細胞を含まないものであることが好ましい。静止軟骨細胞への分化は，分化工程中または工程後に，軟骨分化マーカーを調べることで確認することができる。軟骨分化マーカーとしては，例えばアグリカン遺伝子や２型コラーゲン遺伝子，コンドロモジュリン−１（ＣｈＭ−１）などの発現があげられる。肥大化軟骨細胞のマーカーとしては，例えば，１０型コラーゲン，インディアンヘッジホッグ遺伝子などの発現があげられる。このようなマーカーの発現は，ｍＲＮＡ発現量や遺伝子産物（タンパク質）量を調べることで確認できる。ｍＲＮＡ発現量は，例えばノーザンブロッティングやリアルタイムＰＣＲなど公知の方法で調べることができる。遺伝子産物（タンパク質）量は，ウエスタンブロッティングやＥＬＩＳＡなど公知の方法によって調べることができる。このような指標に基づいて，本発明の軟骨欠損部位修復シートが製造できたことを確認することができる。

本発明の第２の側面は，上記式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，または薬学的に許容される水和物を含む培地で未分化細胞を分化培養する工程（分化培養工程）によって得られる軟骨欠損部位修復シートに関する。

本発明のシートは，上記した工程によって製造することができる。上記したように，本発明のシートは，温度応答性培養皿などを用いて製造されることが好ましい。温度応答性培養皿から本発明の軟骨欠損部位修復シート（軟骨細胞シート）を回収する方法は,公知の方法を用いることができる。具体的には，ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドでコーティングされた温度応答性培養皿を用いた場合，３２〜３７℃で細胞を培養後，室温（２０〜２５℃）に１０〜３０分静置すればよい。温度を下げることで，細胞の足場となっていたポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが親水性になる。すなわちポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが培養培地中に溶けるので，細胞の足場がなくなり，細胞が培養皿から剥離されてくる。一方，温度が下がっても細胞マトリックスには変化がない。よって，培養皿から剥離されてくる細胞はバラバラになることなく，シート状となる。

本明細書において，“欠損部位修復シート（細胞シート）”とは，細胞結合で細胞同士が少なくとも単層で連結されたシート状の細胞集合体を意味する。細胞結合としては，細胞が周囲の細胞外マトリックスと行う結合によって，細胞外マトリックスを介して細胞同士が結合される細胞−細胞外マトリックス結合や，隣接する細胞同士が結合する細胞間結合があげられる。本明細書において，“軟骨部位修復シート（軟骨細胞シート）”とは，軟骨細胞に分化した細胞同士が細胞結合で少なくとも単層で連結されたシート状の細胞集合体を意味する。

本発明の軟骨欠損部位修復シートは，医療従事者であれば，欠損部位の大きさに応じて適宜メスなどで切断して用いることができる。本発明の軟骨欠損部位修復シートは，１枚で用いてもよいが，複数枚重ねて用いてもよい。重ねるシートの枚数としては，特に限定されないが，たとえば２〜１００枚があげられる。作製したシートの厚みや軟骨欠損部位の状態に応じて適宜調整すればよい。軟骨欠損部位修復シートは，欠損部位を覆い隠すようにかぶせて使うことができる。軟骨欠損部位修復シートを重ねて用いる場合は，同じ大きさのシートを重ねてもよいが，欠損部位の形状に応じて，重ねるシートの大きさを変化させてもよい。このようにシートに欠損部位の形状に応じた起伏を持たせることで，欠損部位を好適に覆うことができ，治療効果を高めることができる。シートを重ねて用いる場合は，シートを重ねた後，シートを培養した条件を同様の培地条件，培養条件下に置くことが望ましい。このようにすることで，シート間の細胞結合が強くなり，好適に治療にもちいることができる。

本発明の分化培養した細胞は，たとえばトリプシンなどの細胞分離液を用いて，培養容器から細胞を分散させることもできる。本発明の培養条件で培養した細胞は，分散させても，シート状の細胞と同様の機能を有する。よって，分散した細胞を公知の方法で回収し，軟骨欠損部位に投与することもできる。しかし，このような状態の細胞は，欠損部位に留りにくく，欠損部外へ移動してしまいやすい。そのため，このような状態の細胞は，軟骨欠損部位に投与しても，軟骨の再生促進効果が望めない。一方，シート状の細胞は，細胞は細胞結合により連結しているので，細胞が欠損部外へ移動しにくい。そのため，軟骨の再生を促進することができる。さらに，細胞シートを用いれば，細胞シートで欠損部位を覆い隠すことができるので，欠損部位周辺の組織が欠損部位に侵入することを防ぐことができる。これにより，好適に欠損部位を治療することができる。

本発明の第３の側面は，上記式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有するＲｕｎｘ１発現誘導剤に関する。Ｒｕｎｘ１は，Ｒｕｎｔ関連転写因子ファミリーの１つである。Ｒｕｎｔ関連転写因子ファミリーは３種類（Ｒｕｎｘ１，Ｒｕｎｘ２，Ｒｕｎｘ３）存在することが知られている。これまで，Ｒｕｎｘ１は造血幹細胞の分化に必須であることが知られており，急性骨髄性白血病の原因遺伝子と考えられてきた。Ｒｕｎｘ２は，骨芽細胞及び軟骨細胞の分化に必須であることが知られており，鎖骨頭蓋胃骨症などの原因遺伝子と考えられている。また，後述する実施例で示されたとおり，Ｒｕｎｘ２は軟骨細胞の肥大化を誘導する。Ｒｕｎｘ３は，癌抑制遺伝子として胃癌の発症に関与，炎症性サイトカイン（ＩＬ−４）の発現抑制に関与することが報告され，またＲｕｎｘ３の欠失が軟骨細胞の分化増殖機能の低下に影響すると考えられている。後述する実施例で示されたとおり，ＴＭは，Ｒｕｎｔ関連転写因子ファミリーのうち，Ｒｕｎｘ１のみを特異的に誘導する。Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３はＴＭによって誘導されない。よって本発明の剤は，Ｒｕｎｘ１以外のＲｕｎｔ関連転写因子ファミリーを発現誘導しないので，Ｒｕｎｘ１特異的発現誘導剤として好適に用いることができる。また，後述する実施例で示されたとおり，Ｒｕｎｘ１は軟骨細胞の初期分化誘導機能を有するので，本発明の剤は，変形性関節症などの軟骨細胞機能障害が起因する疾患において，治療剤・予防剤として使用することができる。

本発明の第４の側面は，上記式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有する軟骨細胞初期分化誘導剤に関する。上記したとおり，軟骨細胞の分化過程の細胞は，軟骨前駆細胞，静止軟骨細胞，増殖軟骨細胞，前肥大軟骨細胞，肥大化軟骨細胞などに分類される。本発明の軟骨細胞初期分化は，未分化細胞，軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化をしめす。上記したとおり，未分化細胞には，ＥＳ細胞，ｉＰＳ細胞，未分化間葉系細胞や脱分化した軟骨細胞など，軟骨細胞に分化しうる細胞が含まれる。軟骨細胞初期分化誘導は，初期軟骨基質マーカーである２型コラーゲンなどの発現を調べることで，未分化細胞が初期分化誘導されたことを確認することができる。上記したとおり，マーカーの発現は，ノーザンブロッティング，リアルタイムＰＣＲ，イムノブロッティング（ウエスタンブロッティング），ＥＬＩＳＡなど公知の方法を用いて確認することができる。後述する実施例で示されたとおり，ＥＳ細胞，未分化間葉系細胞，及び脱分化した軟骨細胞は，ＴＭを含む培地で培養することによって，２型コラーゲンの発現が上昇する。よって，ＴＭはＥＳ細胞，未分化間葉系細胞及び脱分化した軟骨細胞の初期分化を誘導する。よって，本発明の剤を軟骨欠損部などに公知の方法で投与することにより，患部に存在する未分化細胞の軟骨細胞初期分化を誘導し，軟骨再生を促進させることができる。

本発明の第５の側面は，上記式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有する脱分化した軟骨細胞の再分化促進剤に関する。脱分化した軟骨細胞は，一度軟骨細胞に分化した細胞が軟骨細胞としての機能を欠失し未分化の状態になった細胞である。再分化とは，一度特定の機能有する細胞に分化した細胞が脱分化して機能を失った後，再度脱分化前と同じ機能を有する細胞に分化することをいう。本明細書において，再分化とは，脱分化して軟骨細胞としての機能を欠失した細胞が，再度軟骨細胞に分化することをいう。細胞の分化状態（脱分化又は再分化状態）は，上記した初期軟骨基質マーカーの発現などを調べることにより，確認することができる。

本発明の第６の側面は，上記式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有する軟骨細胞肥大分化予防剤に関する。上記したとおり，軟骨細胞の分化過程の細胞は，軟骨前駆細胞，静止軟骨細胞，増殖軟骨細胞，前肥大軟骨細胞，肥大化軟骨細胞などに分類される。本明細書において，軟骨細胞肥大分化抑制とは，軟骨細胞の分化過程において，肥大化軟骨細胞への分化を抑制することをしめす。軟骨細胞の肥大化は，肥大軟骨細胞マーカー（例えば，１０型コラーゲンなど）の発現を上記した公知の方法で調べることにより確認することができる。

本発明の第７の側面は，上記式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有する２型コラーゲン産生促進剤に関する。

コラーゲンは，動物の結合組織を構成する主要タンパク質であり，細胞間接着などに関与する細胞外マットリックスなどに含まれる。コラーゲンには，１型，２型，１０型などのファミリーが存在しており，組織によって分布するコラーゲンの種類が異なっている。軟骨細胞は，２型コラーゲン合成能が高く，軟骨には２型コラーゲンが多く存在している。この他に，２型コラーゲンは椎間板や脊索などにも存在する。本発明の剤は，２型コラーゲンの産生を促進するので，軟骨や椎間板などの欠損時に，欠損部位の細胞の細胞外マトリックスを増強することができ，治療効果を高めることができる。

本発明の剤は，当業者に公知の方法で製造すればよい。本発明の剤は，経口用製剤および非経口用製剤として製造することができる。経口用製剤としては，顆粒剤，錠剤，トローチ剤，カプセル剤，内用液剤などがあげられる。非経口用製剤としては注射剤，点滴剤，貼付剤，軟膏剤，座剤などがあげられる。非経口用の注射剤は，液剤（水性液剤，非水性液剤，懸濁性液剤，乳濁性液剤など）としてもよいし,固形剤（粉末充填製剤，凍結乾燥製剤など）としてもよい。また，本発明の剤は，徐放製剤としてもよい。このような製剤化方法は公知であり，当業者であれば適宜製剤化することができる。

本発明の剤を製剤化する場合，薬学的に許容される担体又は媒体などと適宜組み合わせて製剤化することもできる。さらに，他の薬剤を含ませてもよい。薬学的に許容される担体又は媒体は，例えば，賦形剤，安定化剤，溶解補助剤，乳化剤，懸濁化剤，緩衝剤，等張化剤，抗酸化剤，又は保存剤など薬学的に許容される物質があげられる。また，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子材料やシクロデキストリン等の抱合化防物を使用することもできる。以下，具体例をあげるが，本発明はそれらに限定されるものではなく，公知のものを使用することができる。賦形剤としては，デンプンや乳糖などそれ自体が薬理作用を有さないものが好ましい。安定化剤としては，アルブミン,ゼラチン，ソルビトール，マンニトール，乳糖，ショ糖，トレハロース，マルトース，グルコースなどがあげられる。これらのうちでは，ショ糖又はトレハロースが好ましい。溶解補助剤としては，エタノール，グリセリン，プロピレングリコール，ポリエチレングリコールなどがあげられる。乳化剤としては，レシチン，ステアリン酸アルミニウム，またはセスキオレイン酸ソルビタンなどがあげられる。懸濁化剤としては，マクロゴール，ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），またはカルメロース（ＣＭＣ）などがあげられる。等張化剤としては，塩化ナトリウム，グルコースなどがあげられる。緩衝剤としては，クエン酸塩，酢酸塩，ホウ酸，またはリン酸塩などがあげられる。抗酸化剤としては，アスコルビン酸，亜硫酸水素ナトリウム，ピロ亜硫酸ナトリウムなどがあげられる。保存剤としては，フェノール，チメロサール，塩化ベンザルコニウムなどがあげられる。

本発明の剤に含ませる薬剤としては，関節疾患治療剤，抗炎症剤，鎮痛剤，骨再生剤，骨吸収抑制剤，抗生物質，または成長剤など，関節疾患に用いられる公知の薬剤があげられる。これらの薬剤は，１種または２種以上含ませることができ，また更に他の薬効を有する公知の薬剤と組み合わせてもよい。関節疾患治療剤としては，例えば関節軟骨細胞外マトリックス分解阻害剤（ＷＯ２００４／０１７９９６号パンフレット），副腎皮質ホルモン剤やコンドイチン硫酸ナトリウム，ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＡ））などの関節軟骨の保護剤，又はシグナル伝達系阻害剤であるｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）阻害剤（特表２００７−５３７１３４号公報）などがあげられる。

抗炎症剤としては，ステロイド性抗炎症剤や非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）などがあげられる。ステロイド性抗炎症剤は，たとえば，デキサメタゾン，コルチゾン，ヒドロコルチゾン，プレドニゾロン，メチルプレドニゾロン，ベタメタゾン，トリアムシノロン，トリアムシノロンアセトニド，フルオシノロンアセトニド，フルオシノニド，ベクロメタゾン，エテンザミドなどがあげられる。非ステロイド性抗炎症剤として，たとえば，アスピリン，イブプロフェン，ナプロキセン，ジクロフェナク，インドメタシン，ナブトメン，フェニルブタゾン，ロフェコキシブ，セレコキシブ，オキシカム，ピロキシカム，ピラゾロン，アザプロパゾンなどがあげられる。

鎮痛剤として，消炎鎮痛薬でもあるＮＳＡＩＤｓに加えて，オピオイド系鎮痛薬などがあげられる。オピオイド系鎮痛薬としては，たとえば，エンドルフィン，ダイノルフィン，エンケファリン，コデイン，ジヒドロコデイン，デキストロプロポキシフェンなどがあげられる。骨吸収抑制剤として，エストロゲン剤，カルシトニン及びビスホスホネートのいずれか１種又は２種以上の混合物があげられる。

抗生物質としては，ベンジルペニシリン，アンピシリン，メチシリンなどのペニシリン系抗生物質；セファゾリン，セフロキシム，セフィキシムなどのセフェム系抗生物質；ゲンタマイシン，ストレプトマイシン，ネオマイシン，カナマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質；エリスロマイシン，ロキタマイシンなどのマクロライド系抗生物質；テトラサイクリン，ドキシサイクリンなどのテトラサイクリン系抗生物質，ペプチド系抗生物質；ラタモキセフなどのβ−ラクタム系抗生物質；この他にバンコマイシン，リファンピシン，クロラムフェニコールなどの抗生物質があげられる。

成長剤として，骨形成因子（ＢＭＰ），骨増殖因子（ＢＧＦ），血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ），塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ），インスリン，インスリン様増殖因子（ＩＧＦ），ホルモン，サイトカイン，又はトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）などがあげられる。これらの成長剤は，１種または２種以上含ませることができ，また更に他の薬効を有する公知の薬剤と組み合わせてもよい。

本明細書において，“有効成分”とは，脱分化した軟骨細胞を再分化する機能，Ｒｕｎｘ１を発現誘導する機能，軟骨細胞の分化を誘導する機能，軟骨初期分化を誘導する機能，２型コラーゲンの産生を促進する機能を有する成分を意味する。本発明において，有効成分は,式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，またはその薬学的に許容される水和物をさす。

“有効量”とは，有効成分が上記機能を示すための量を意味する。本発明の剤は，上記式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を，有効量含んでいればよい。本発明の剤に含まれる上記式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物の割合は，全重量を１００重量部としたときに，１×１０^−３〜９×１０重量部であればよく，１×１０^−１〜７×１０重量部が好ましく，２×１０〜５×１０重量部がより好ましい。投与量は，投与する対象，年齢，症状などによって変化する。一般的には，１日の投与量は，本発明の剤の有効量で個体（６０ｋｇ）あたり，１×１０^−１〜１×１０^３ｍｇがあげられる。１日分の投与量を１回で投与してもよいが，１日分の投与量を２〜５回に分けて投与することが好ましい。また，本発明の剤を徐放製剤として，１日当たりの投与回数を減らすことも可能である。このような徐放製剤とするには，公知の方法を利用すればよい。分けて投与したり，徐放製剤としたりすることで，生体内の薬剤濃度を一定に保ちやすくなるので，持続した薬効が得やすくなり，さらに副作用が軽減されうるので，患者への負担を減らすことができる。

本発明は，Ｒｕｎｘ１発現誘導剤，軟骨初期分化誘導剤，脱分化した軟骨細胞の再分化促進剤，軟骨細胞肥大分化予防剤，２型コラーゲン産生促進剤を製造するための本発明の式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物の使用をも提供する。すなわち，本発明は，Ｒｕｎｘ１発現誘導剤を製造するための式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物の使用；軟骨初期分化誘導剤を製造するための式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物の使用；脱分化した軟骨細胞の再分化促進剤を製造するための式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物の使用；軟骨細胞肥大分化抑制剤を製造するための式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物の使用；２型コラーゲン産生促進剤を製造するための式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物の使用をも提供する。

本発明は，対象に有効量の式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を投与するＲｕｎｘ１発現誘導方法；対象に有効量の式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を投与する軟骨細胞分化誘導方法；対象に有効量の式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を投与する脱分化した軟骨細胞の再分化促進方法；対象に有効量の式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を投与する軟骨細胞肥大分化予防方法；対象に有効量の式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を投与する２型コラーゲン産生促進方法をも提供する。そして，このような対象に有効量の式（Ｉ）で示される化合物（ＴＭ），その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物の使用において，先に説明したそれぞれのパターンを組み合わせて用いることができる。

軟骨細胞の機能障害疾患としては，軟骨細胞が正常に機能しなくなったために惹起される疾患に加えて，他の疾患により軟骨細胞が障害をうけ正常に機能しなくなった疾患を含む。このような軟骨細胞が関与する疾患として，変形性関節症，慢性関節リウマチ，軟骨無形成症，軟骨低形成症，２次性変形性関節症（靱帯損傷，半月板損傷）などがあげられる。本発明のシート，及び本発明の剤は，このような疾患に好適に用いることができる。また，本発明のシート，及び本発明の剤は，軟骨細胞と軟骨基質からなる軟骨組織の欠損部位の修復（治療）に好適に用いることができる。このような軟骨組織としては，硝子軟骨（気管軟骨，助軟骨，関節軟骨など），弾性軟骨（耳介軟骨，喉頭蓋軟骨など），線維軟骨（椎間円板，恥骨軟骨など）があげられる。また，本発明のシート及び本発明の剤は，軟骨細胞の肥大分化を誘導しないので，永久軟骨再生治療に好適に用いることができる。

以下，本発明の実施例を説明するが，本発明は実施例に限定されるものではなく，当業者であれば，適宜変更を加えることができる。

（細胞培養）
本発明では，以下の細胞を用いて検討を行った。マウス未分化間葉系細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２，サル腎繊維芽細胞株ＣＯＳ−７，ヒト胎児陣細胞株ＨＥＫ２９３，ヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７，ヒト子宮頚癌細胞株ＨｅＬa細胞及び前軟骨細胞株ＡＴＤＣ５細胞は，理研細胞バンク（筑波，日本）から入手した。初代軟骨細胞は，Ｅ１８．５野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス胎児（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離した。これらの細胞は，「Ｙａｎｏ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，ｖｏｌ．３３３，ｐ１３００−ｐ１３０８」または「Ｂｕｔｔｅｒｙ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ，ｖｏｌ．７，ｐ８９−９９」に記載の方法に基づいて，単層培養で維持した。初代軟骨細胞の３Ｄ培養は，「Ｙａｎｏ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，ｖｏｌ．３３３，ｐ１３００−ｐ１３０８」に記載の方法に基づいて行った。

軟骨形成化合物のスクリーニング
軟骨形成低分子化合物をスクリーニングするために，軟骨細胞分化を検出することができるモニタリングシステムを構築した。まず，緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用）の上流に，４９塩基対のＳｏｘ９エンハンサーをタンデムに４つ有するヒト２型コラーゲンプロモーター（−１０３１〜＋３７）の配列を挿入してベクターを構築した（図１Ａ）。４９塩基対のエンハンサーをタンデムに４つ有するヒト２型コラーゲンプロモーター（−１０３１〜＋３７）の軟骨細胞特異的フラグメントの制御下で，緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定して発現する前軟骨形成細胞ＡＴＤＣ５細胞株を樹立した（以下，「ＣＯＬ２−ＧＦＰ ＡＴＤＣ５」ともよぶ）。ＡＴＤＣ５細胞へのベクターの導入は，ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行った。軟骨細胞は，２型コラーゲンを多く発現することが知られていることから，２型コラーゲンプロモーターの活性化を指標にスクリーニングを行った。

この細胞をインスリン１０μｇ／ｍｌを含む培地で分化させたところ，ＧＦＰを発現し蛍光を発した（図１Ｂ）。なお，インスリンは，２型コラーゲンプロモーターを活性化することが知られており，コントロールとして使用した。このシステムを用いて，合成及び天然低分子ライブラリーをスクリーニングした。軟骨細胞の分化を間接的というよりむしろ直接誘導する化合物を発見するために，蛍光の観察は処理後４８時間以内に行った。その結果，新規チオインダゾール誘導体（Ｔ−１９８９４６，武田薬品工業社製（以下，「ＴＭ」ともよぶ））（図１Ｃに記載の化合物）のみＧＦＰ蛍光の発現を強く誘導した（図１Ｂ）。１０^−１５（１ｆ）〜１０^−５（１０μ）Ｍの範囲のＴＭ濃度でＣＯＬ２−ＧＦＰ ＡＴＤＣ５細胞を処理し，その後，７日間培養した。その結果，ＴＭ（１μＭ）で処理した細胞は，７日間にわたって，ＧＦＰ蛍光の発現を強く誘導することが分かった（図１Ｂ）。その結果を図１Ｂに示した。

図１ＢはＣＯＬ２−ＧＦＰ ＡＴＤＣ５細胞を，インスリン１０μｇ／ｍｌ，ＴＭ ０μＭ又は１μＭで２日間（図１Ｂ中，「２ｄ」と記載，以下同じ）又は７日間（図１Ｂ中，「７ｄ」と記載，以下同じ）処理したときのＧＦＰの発現を，蛍光顕微鏡を用いて確認した結果を示す。図１Ｂ中，「ハロゲン」は蛍光フィルターを使用せずハロゲンランプを照射したときの細胞，「ＦＩＴＣ」はＦＩＴＣフィルターを用いたときの細胞，「Ｒｈｏｄ」はＲｈｏｄフィルターを用いたときの細胞の写真である。ＧＦＰの発現は，ＦＩＴＣの写真で確認することができる。図１Ｂで示されたとおり，ＴＭ（１μＭ）で処理した細胞は，２ｄ，７ｄともにＧＦＰを発現していることが分かった。ＴＭのこの結果は，インスリンの結果に匹敵する。このことから，ＴＭはインスリンと同様に２型コラーゲンプロモーターを活性化することが示された。

次に，ＴＭが軟骨基質の誘導に与える影響を，トルイジンブルー（ＴＢ）染色を用いて調べた。細胞は，ＣＯＬ２−ＧＦＰ ＡＴＤＣ５細胞を用いた。ＴＢ染色は，「Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，２００７，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ，ｖｏｌ．８，ｐ５０４−５０９」に記載の方法に基づいて行った。軟骨基質が誘導され蓄積している場合は，ＴＢ染色によって青色に染まる。その結果，ＴＭによって誘導される軟骨基質の蓄積の程度が，インスリンによって誘導される軟骨基質の蓄積と同程度であることが，トルイジンブルー（ＴＢ）染色によって明らかになった（図１Ｂ，最右パネル）。このことから，ＴＭは軟骨基質の発現を誘導することが示された。

ＴＭによる未分化細胞及び脱分化細胞での軟骨細胞分化の誘導
軟骨細胞分化におけるＴＭの影響を分析するために，マウスＥＳ細胞及びマウス未分化間葉系細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＴＭ（１ｐ−１μＭ）で処理した後，７日間培養した。軟骨細胞分化を検出するために，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって，軟骨細胞の早期分化マーカーである２型コラーゲン，アグリカン，及びコンドロモジュリン−１のｍＲＮＡの発現を測定した（図２Ａ〜図２Ｆ）。

（ＧＦＰ及びＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，Ｓｏｘ９発現アデノウイルスの構築）
Ｓｏｘ５，６，９及びＧＦＰを発現するアデノウイルス（以下，それぞれ「Ａｄ−Ｓｏｘ５」，「Ａｄ−Ｓｏｘ６」，「Ａｄ−Ｓｏｘ９」，「Ａｄ−ＧＦＰ」ともよぶ）の構築は，「Ｉｋｅｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，ｖｏｌ．５０，ｐ３５６１−ｐ３５７３」に記載の方法に基づいて行った。これらのアデノウイルスは，マウスＥＳ細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に，ＭＯＩ（感染多重度）１００で感染させた。

［リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析］
マウスＥＳ細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を，ＴＭ（０〜１μＭ），Ａｄ−ＧＦＰ，Ａｄ−Ｓｏｘ９，Ａｄ−Ｓｏｘ ｔｒｉｏ（Ａｄ−Ｓｏｘ５，Ａｄ−Ｓｏｘ６，Ａｄ−Ｓｏｘ９の組み合わせ）で７日間処理し，各細胞中の軟骨細胞早期分化マーカー遺伝子の発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで調べた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは，「Ｙａｎｏ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，ｖｏｌ．３３３，ｐ１３００−ｐ１３０８」に記載の方法に基づいて行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのコントロールとして，アクチンの発現量を測定した。アクチンの発現量を確認するプライマーとして，配列番号１及び配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）の発現を確認するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは，プライマーとして，配列番号３及び配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。アグリカン（Ａｇｃ１）の発現を確認するために，配列番号５及び配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。コンドロモジュリン−１（ＣｈＭ−１）の発現を確認するために，配列番号７及び配列番号８に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。トータルＲＮＡ中の特定の遺伝子のｍＲＮＡのコピー数は，「Ｋｕｇｉｍｉｙａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，ｖｏｌ．２８０，ｐ３５７０４−ｐ３５７１２」に基づいて算出した。全反応は３回行った。以下，同様に行った。その結果を図２Ａ〜図２Ｆに示した。

図２Ａ〜図２Ｃは，マウスＥＳ細胞（ｍＥＳ細胞）の結果を示す。図２Ｄ〜図２Ｆは，マウス未分化間葉系細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の結果を示す。図２Ａ及び図２Ｄは２型コラーゲン（図２中「Ｃｏｌ２ａ１」と記載），図２Ｂ及び図２Ｅはアグリカン，図２Ｃ及び図２Ｆは，コンドロモジュリン−１（図２中「ＣｈＭ−１」と記載）のｍＲＮＡの発現を測定した結果を示すグラフである。図２Ａ〜図２Ｆの縦軸は，トータルＲＮＡ１μｇあたりのｍＲＮＡのコピー数［コピー／μｇトータルＲＮＡ］を示し，値が高いほどｍＲＮＡの発現量が多いことを示す。

その結果，ＴＭ処理によって，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中のマーカー（２型コラーゲン，アグリカン，コンドロモジュリン−１）のｍＲＮＡの発現レベルは著しく上昇することが明らかになった（図２Ｄ〜図２Ｆ）。また，マウスＥＳ細胞においても軟骨細胞早期分化マーカーのｍＲＮＡ発現レベルが上昇することが明らかになった（図２Ａ〜図２Ｃ）。このことからＴＭはＥＳ細胞，及び未分化間葉系細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の軟骨細胞への早期分化を誘導することが示された。

次に，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中の軟骨基質合成におけるＴＭ処理の影響を分析するために，トルイジンブルー（ＴＢ）及びアリシアンブルー（ＡＣ）で軟骨基質を染色し（図２Ｇ），グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量を測定した（図２Ｈ）。

［未分化間葉系細胞の軟骨基質染色］
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＴＭ（０，１ｐ，１ｎ，１μＭ）で７日間，又は１４日間処理し，トルイジンブルー又はアリシアンブル−で染色した。トルイジンブルー及びアリシアンブルー染色は，「Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，２００７，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ，ｖｏｌ．８，ｐ５０４−５０９」に記載の方法に基づいて行った。その結果を図２Ｇに示した。

図２Ｇは，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＴＭで７日間（図中「７ｄ」と記載，以下同じ），又は１４日間（図中「１４ｄ」と記載，以下同じ）処理した後，トルイジンブルー（ＴＢ）またはアリシアンブルー（ＡＣ）染色した結果を示す図面に替わる写真である。ＴＢおよびＡＣによって，軟骨基質が染色される。濃く染色するほど軟骨基質量が多いことを示す。その結果，ＴＭ濃度及び時間依存的に濃く染色された。よって，軟骨基質合成はＴＭ濃度及び時間依存的に著しく増大することが明らかになった（図２Ｇ）。このデータは，ＴＭが未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化を促進することを示唆している。

［グリコサミノグリカンの生化学的測定］
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＴＭ（０，１ｐ，１ｎ，１μＭ）で７日間，又は１４日間し，アリシアンブルーで染色した。アリシアンブルー結合アッセイ（Ｗｉｅｓｌａｂ社製）を用いて，製造業者の使用説明書に従って，グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を定量した。アリシアンブルー結合アッセイに使用する全細胞溶解液はＭ−ＰＥＲ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて回収した。グリコサミノグリカンの定量結果を図２Ｈに示した。

図２Ｈ中，縦軸はグリコサミノグリカン量（μｇ／ｍｌ）を示し，横軸はＴＭ濃度（Ｍ）を示す。すなわち，縦軸の値が高いほど，グリコサミノグリカンが合成されたことを示す。その結果，グリコサミノグリカン量は，ＴＭ濃度及び時間依存的に著しく増強することが明らかになった（図２Ｈ）。グリコサミノグリカンは，軟骨細胞の細胞外マトリックスを構成成分の一つである。よって，このデータは，ＴＭが未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化を強く促進することを示唆している。

［肋骨軟骨細胞の軟骨基質染色］
次に，Ｅ１８．５マウス（野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス）胎児肋骨（胸骨を除く）から単離した初代軟骨細胞（Ｐ１），または３回継代した脱分化した初代軟骨細胞（Ｐ３）を用いて，ＴＭが軟骨形成へ与える影響について調べた（図２Ｉ，図２Ｊ）。継代数１（Ｐ１）の初代軟骨細胞，及び継代数３（Ｐ３）の脱分化した初代軟骨細胞を，ＴＭ（０，１ｐ，１ｎ，１μＭ）で２日間，７日間，１４日間処理した後，トルイジンブルー（ＴＢ）で染色した。その結果を図２Ｉ，及び図２Ｊに示した。

図２Ｉは，初代軟骨細胞（Ｐ１）をＴＢ染色した結果を示す図面に替わる写真である。図２Ｊは，脱分化した初代軟骨細胞（Ｐ３）をＴＢ染色した結果を示す図面に替わる写真である。図中，濃く染色されるほど，軟骨基質量が多いことを示す。その結果，初代軟骨細胞（Ｐ１）は，ＴＭ処理によって軟骨基質の合成が増大することが明らかになった（図２Ｉ）。さらに，初代軟骨細胞（Ｐ１）は，ＴＭ処理によって，軟骨細胞分化マーカーのｍＲＮＡの発現量が増大していた（データは示さず）。そして，脱分化した初代軟骨細胞（Ｐ３）は，初代軟骨細胞（Ｐ１）と比較して軟骨基質量が減少していたが，ＴＭ処理によって，軟骨基質の合成能が回復することが明らかになった（図２Ｊ）。また，脱分化した初代軟骨細胞（Ｐ３）は，ＴＭ処理によって，軟骨細胞分化マーカーのｍＲＮＡの発現量が回復していた（データは示さず）。これらのデータは，ＴＭが脱分化した軟骨細胞の再分化を誘導することを示唆している。

ＴＭによる肥大分化促進の欠如
ＢＭＰｓを含む既知の軟骨形成因子は，軟骨細胞の初期分化だけでなく肥大分化も促進する。軟骨細胞の肥大は，血管湿潤および骨形成を刺激するので，肥大を促進せず早期分化を誘導する軟骨形成因子を見つけることは，関節軟骨再生に重要である。このため，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって,ＴＭで処理したＡＴＤＣ５細胞中，肥大のマーカーである１０型コラーゲンのｍＲＮＡ発現を測定した。

［リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析］
前軟骨細胞ＡＴＤＣ５細胞を，ＴＭ（０〜１μＭ），Ａｄ−ＧＦＰ，Ａｄ−Ｒｕｎｘ２で７日間処理し，各細胞中の軟骨細胞肥大マーカー遺伝子の発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで調べた。なお，Ａｄ−Ｒｕｎｘ２（Ｒｕｎｘ２を発現するアデノウイルス）は，大阪大学Ｄｒ．Ｒ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａよりいただいた。アデノウイルスは，感染多重度（ＭＯＩ）１００で感染させた。上記と同様にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い，トータルＲＮＡ中の１０型コラーゲンのｍＲＮＡのコピー数を算出した。なお，コントロールとしてアクチンの発現量を測定した。アクチンの発現を確認するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは，プライマーとして配列番号１及び配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。１０型コラーゲン（Ｃｏｌｌ１０）の発現を確認するために，プライマーとして，配列番号９及び配列番号１０に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。その結果を図２Ｋに示した。

図２Ｋ中，縦軸はトータルＲＮＡ１μｇあたりのｍＲＮＡのコピー数［コピー／μｇトータルＲＮＡ］を示し，値が高いほど１０型コラーゲン（図中「Ｃｏｌl１０」と記載，以下同じ）のｍＲＮＡの発現量が多いことを示す。その結果，どのＴＭ濃度においてもＡＴＤＣ５細胞中の１０型コラーゲンのｍＲＮＡの発現は上昇しなかった。一方，肥大軟骨細胞で発現することが知られているＲｕｎｘ２を発現するアデノウイルス（Ａｄ−Ｒｕｎｘ２）を導入したＡＴＤＣ５細胞は，１０型コラーゲンのｍＲＮＡ発現が上昇した。この結果から，ＴＭは軟骨細胞の肥大化を誘導しないことが示された。すなわち，ＴＭは軟骨細胞の肥大分化を予防することができることが示された。これらのデータは，ＴＭは軟骨細胞の肥大化を促進することなく，未分化間葉系細胞の早期軟骨細胞分化を誘導することを示唆している。

細胞増殖におけるＴＭの影響
細胞増殖におけるＴＭの影響を分析するために，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を用いてＷＴＴアッセイ（細胞増殖アッセイ）を行った。

［細胞増殖アッセイ］
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を９６ウェルプレートに１０^３ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し，ＴＭ ０Ｍ，１ｎＭ，または１μＭを添加した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で２４，４８，７２，９６時間培養した。細胞増殖はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ(ＤＯＪＩＮＤＯ社製)を用いて，製造業者の使用説明書に従って定量した。結果を図２Ｌに示した。

図２Ｌ中，横軸は細胞の培養時間（ｈ）を示し，縦軸は吸光度Ａ４５０ｎｍの測定値を示す。吸光度はウェル中の細胞数が多いほど値が高くなる。すなわち，縦軸の値が高いほど，細胞の増殖能が高いことを示す。その結果，ＴＭ処理はどの濃度においても細胞増殖に影響を与えないことが明らかになった（図２Ｌ）。そして，軟骨細胞，ＡＴＤＣ５，及びＥＳ細胞を含む他の細胞からも同様の結果が得られた（データは示さず）。よって，ＴＭは，細胞増殖に影響を与えず，軟骨細胞の初期分化を誘導することが示された。

ＴＭ処理によるＳｏｘ５，Ｓｏｘ６,Ｓｏｘ９及びＲｕｎｘ１の誘導
ＴＭの転写ターゲットを同定するために，ＴＭ（１μＭ）またはＤＭＳＯ（コントロール）で処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を用いて，マイクロアレイ分析を行った。さらに，マイクロアレイ分析で変化のあった遺伝子について，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。

［マイクロアレイ分析］
軟骨細胞分化を再現するために，ＴＭで処理した未分化間葉系細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を用いた。実験用ＲＮＡ及びコントロールＲＮＡは，ＴＭ（１μＭ）またはビヒクル（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））で４８時間処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から抽出した。トータルＲＮＡは，製造業者の使用説明書に従って，ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて単離し，ＤＮａｓｅＩで処理した。マイクロアレイ分析は，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏによって行い，Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にかけた。結果を確認するために，４８時間でアップレギュレートした５８１遺伝子から任意に選択された３０遺伝子についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。その結果，４８時間で５８１遺伝子がアップレギュレートされた。マイクロアレイ分析の結果をすべてＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（アセッションナンバー：Ｅ−ＭＥＸＰ−９６０）に提供した。それらのうち，Ｓｏｘファミリーに属し，Ｓｏｘ９と連携して２型コラーゲンプロモーターを活性化させるＳｏｘ５およびＳｏｘ６は，マイクロアレイ分析では劇的な増大を示した（図３Ａ）。また，Ｒｕｎｔ関連転写因子１であるＲｕｎｘ１も増大することが示された（図３Ａ）。

［リアルタイムＲＰ−ＰＣＲ分析］
マイクロアレイ分析でアップレギュレートされた遺伝子（Ｒｕｎｘ１，Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６，Ｓｏｘ９）について，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行い，上記と同様にトータルＲＮＡ中の特定の遺伝子のｍＲＮＡのコピー数を算出した。なお，Ｒｕｎｘ１の発現を確認するプライマーとして，配列番号１１及び配列番号１２に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。Ｓｏｘ５の発現を確認するプライマーとして，配列番号１３及び配列番号１４に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。Ｓｏｘ６の発現を確認するプライマーとして，配列番号１５及び配列番号１６に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。Ｓｏｘ９の発現を確認するプライマーとして，配列番号１７及び配列番号１８に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。その結果を図３Ｂ〜図３Ｅに示した。

図３Ｂ〜図３Ｅ中，横軸の「ＴＭ」はＴＭ処理した細胞，「コントロール」はＴＭで処理しなかった細胞を示す。細胞は，マイクロアレイ分析と同様，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を用いた。図３Ｂ〜図３Ｅ中，縦軸はトータルＲＮＡ１μｇあたりの特定遺伝子のｍＲＮＡのコピー数［コピー／μｇトータルＲＮＡ］を示し，値が高いほどｍＲＮＡの発現量が多いことを示す。図３ＢはＲｕｎｘ１，図３ＣはＳｏｘ５，図３ＤはＳｏｘ６，図３ＥはＳｏｘ９の結果を示す。

その結果，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において，ＴＭ処理によりＳｏｘ５及びＳｏｘ６の発現が強く誘導されることが確認された（図３Ｃ，図３Ｄ）。しかしながら，後述する実施例で示されるとおり，Ｓｏｘ５を発現するアデノウイルス（Ａｄ−Ｓｏｘ５），Ｓｏｘ６を発現するアデノウイルス（Ａｄ−Ｓｏｘ６），又は両方を発現するアデノウイルス（Ａｄ−Ｓｏｘ５＋Ａｄ−Ｓｏｘ６）をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に導入しても２型コラーゲンｍＲＮＡは誘導されなかった（図４Ａ）。Ｓｏｘ９は軟骨細胞分化および肥大のコントロールに重要な役割を果たすことが知られている。マイクロアレイ分析によって，ＴＭはＳｏｘ９のｍＲＮＡの発現を約２倍誘導すること示された（図３Ａ）。同様に，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によっても，ＴＭでＣ３Ｈ１０Ｔ１／２を処理するとＳｏｘ９のｍＲＮＡが同程度誘導されることが確認された（図３Ｅ）。

次に，ｒｕｎｔ関連転写因子１であるＲｕｎｘ１（Ｃｂｆａ２／ＡＭＬ１）に注目した。Ｒｕｎｘ１のｍＲＮＡレベルは，マイクロアレイ分析において最大の増加を示した（図３Ａ）。Ｒｕｎｘ１は正常造血に必要であり，最近早期の骨格発達に重要であることが報告されてきている。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によっても，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＴＭ処理することでＲｕｎｘ１発現は強く誘導されるということが確認された（図３Ｂ）。一方，Ｒｕｎｘ１の補因子であるＣｂｆｂのｍＲＮＡ発現は上昇しなかった（データは示さず）。このことから，ＴＭはＲｕｎｘ１を発現誘導することが示された。

Ｒｕｎｘ１の軟骨分化作用とＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，およびＳｏｘ９との相互作用
Ｒｕｎｘ１と軟骨細胞分化の機能的関連性を調べるために，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞Ｓｏｘ５＋Ｓｏｘ６発現アデノウイルス（Ａｄ−Ｓｏｘ５＋Ａｄ−Ｓｏｘ６），Ｓｏｘ９発現アデノウイルス（Ａｄ−Ｓｏｘ９），またはＳｏｘ−トリオ（ｔｒｉｏ）（Ａｄ−Ｓｏｘ５＋Ａｄ−Ｓｏｘ６＋Ａｄ−Ｓｏｘ９，以下「Ａｄ−Ｓｏｘ ｔｒｉｏ」ともよぶ）の組み合わせと一緒に，Ａｄ−Ｒｕｎｘ１を導入した。遺伝子発現は，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびイムノブロッティング（ウエスタンブロッティング）で確認した（イムノブロッティングのデータは示さず）。また，グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）タンパク質の合成も確認した。また，軟骨基質量はトルイジンブルー染色によって確認した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのコントロールとして，アクチンの発現量を測定した。アクチンの発現量を確認するプライマーとして，配列番号１及び配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。２型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）の発現を確認するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは，プライマーとして，配列番号３及び配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。アグリカン（Ａｇｃ１）の発現を確認するために，配列番号５及び配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。コンドロモジュリン−１（ＣｈＭ−１）の発現を確認するために，配列番号７及び配列番号８に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を図４Ａ〜図４Ｃに示した。ＧＡＧタンパク質合成の結果を図４Ｄに示した。トルイジンブルー染色の結果を図４Ｅに示した。

［リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ］
図４Ａ〜図４Ｃ中，縦軸はトータルＲＮＡ１μｇあたりの特定遺伝子のｍＲＮＡのコピー数［コピー／μｇトータルＲＮＡ］を示し，値が高いほどその発現量が多いことを示す。図４Ａ〜図４Ｃ中，黒色の棒グラフはＡｄ−Ｒｕｎｘ１を導入した細胞を示し，白色の棒グラフはＭｏｃｋを示す。図中，Ｍｏｃｋは，対象遺伝子などを含まないのみで，同様の操作を行ったことを示し，コントロールとなる（以下，同様である）。図４Ａは２型コラーゲン（Ｃｏｌｌ２），図４Ｂはアグリカン，図４Ｃはコンドロモジュリン−１の結果を示す。その結果，Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は，初期軟骨細胞分化マーカーの発現は，Ａｄ−Ｒｕｎｘ１を導入することによって増大することが明らかになった。さらに，Ａｄ−Ｒｕｎｘ１とＡｄ−Ｓｏｘ ｔｒｉｏとの共誘導（ｃｏ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）は，早期軟骨細胞分化マーカーの発現は増大した。

［グリコサミノグリカン量の定量］
グリコサミノグリカン量の定量は，上記したとおり，アリシアンブルー結合アッセイ（Ｗｉｅｓｌａｂ社製）を用いて，製造業者の使用説明書に従って，グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を定量した。アリシアンブルー結合アッセイに使用する全細胞溶解液はＭ−ＰＥＲ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて回収した。結果を図４Ｄに示した。図４Ｄ中，縦軸はグリコサミノグリカン量（μｇ／ｍｌ）を示す。すなわち，縦軸の値が高いほど，グリコサミノグリカンが合成されたことを示す。その結果，Ａｄ−Ｒｕｎｘ１を導入することによって，グリコサミノグリカン量が増大することが明らかになった。さらに，Ａｄ−Ｒｕｎｘ１とＡｄ−Ｓｏｘ５＋Ａｄ−Ｓｏｘ６，Ａｄ−Ｓｏｘ９，又はＡｄ−Ｓｏｘ ｔｒｉｏとの共誘導（ｃｏ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって，グリコサミノグリカン量がさらに増大することが明らかになった。

［トルイジンブルー（ＴＢ）染色］
トルイジンブルー染色は，上記した方法と同様に行った。その結果を図４Ｅに示した。その結果，Ａｄ−Ｒｕｎｘ１を導入することによって，軟骨基質量が増大することが明らかになった。さらに，Ａｄ−Ｒｕｎｘ１とＡｄ−Ｓｏｘ５＋Ａｄ−Ｓｏｘ６，Ａｄ−Ｓｏｘ９，又はＡｄ−Ｓｏｘ ｔｒｉｏとの共誘導（ｃｏ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって，グリコサミノグリカン量がさらに増大することが明らかになった。

次に，アルジネートビーズ中（３次元培養）で培養した初代軟骨細胞の肥大においてのＲｕｎｘ１の影響を調べた（図４Ｆ）。まず，マウス初代軟骨細胞にＳｏｘ５＋Ｓｏｘ６発現アデノウイルス（Ａｄ−Ｓｏｘ５＋Ａｄ−Ｓｏｘ６），Ｓｏｘ９発現アデノウイルス（Ａｄ−Ｓｏｘ９），またはＳｏｘ−トリオ（ｔｒｉｏ）（Ａｄ−Ｓｏｘ５＋Ａｄ−Ｓｏｘ６＋Ａｄ−Ｓｏｘ９，以下「Ａｄ−Ｓｏｘ ｔｒｉｏ」ともよぶ）の組み合わせと一緒に，Ａｄ−Ｒｕｎｘ１を導入した。その後，遺伝子を導入した細胞を２４時間単層培養し，トリプシン処理後，３Ｄアルギン酸ビーズ中で３日間培養した。この培養条件は，軟骨細胞の肥大を促進することが知られている。そこで，軟骨細胞肥大マーカー１０型コラーゲンのｍＲＮＡレベルを上記したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い分析した。上記と同様にトータルＲＮＡ中の特定の遺伝子（１０型コラーゲン）のｍＲＮＡのコピー数を算出した。なお，コントロールとしてアクチンの発現量を測定した。アクチンの発現を確認するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは，プライマーとして配列番号１及び配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。１０型コラーゲン（Ｃｏｌｌ１０）の発現を確認するために，プライマーとして，配列番号９及び配列番号１０に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。その結果を図４Ｆに示した。

図４Ｆ中，縦軸はトータルＲＮＡ１μｇあたりの１０型コラーゲンのｍＲＮＡのコピー数［コピー／μｇトータルＲＮＡ］を示し，値が高いほど１０型コラーゲンの発現量が多いことを示す。図４Ｆ中，黒色の棒グラフはＡｄ−Ｒｕｎｘ１を導入した細胞を示し，白色の棒グラフはＭｏｃｋを示す。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果，Ａｄ−Ｒｕｎｘ１を単独で導入することによって１０型コラーゲンのｍＲＮＡ発現は抑制され，そしてこの効果はＡｄ−Ｓｏｘ５＋Ａｄ−Ｓｏｘ６，Ａｄ−Ｓｏｘ９またはＡｄ−Ｓｏｘ ｔｒｉｏとの共誘導（ｃｏ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって増強されることが分かった。このようにＲｕｎｘ１，Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６及びＳｏｘ９の組み合わせは，ＴＭ処理の効果と同様に，軟骨細胞の肥大を促進することなく（軟骨細胞の肥大化を予防し），初期軟骨細胞分化および基質合成を強く促進することが分かった。

軟骨細胞分化中のＲｕｎｘ１とＳｏｘ ｔｒｉｏの相互作用
Ｒｕｎｘ１及びＳｏｘ ｔｒｉｏタンパク質間の物理的相互作用の可能性を解明するために，Ｆｌａｇタグ付きＳｏｘ５（Ｓｏｘ５−Ｆｌａｇ），Ｆｌａｇタグ付きＳｏｘ６（Ｓｏｘ６−Ｆｌａｇ），Ｆｌａｇタグ付きＳｏｘ９（Ｓｏｘ９−Ｆｌａｇ），ＧＦＰ及びＲｕｎｘ１−ＧＦＰを発現するプラスミドを用いて共免疫沈降を行った。ＨＥＫ２９３にＧＦＰとＳｏｘ５−Ｆｌａｇ，Ｓｏｘ６−Ｆｌａｇ若しくはＳｏｘ９−Ｆｌａｇの組み合わせ，またはＲｕｎｘ１−ＧＦＰとＳｏｘ５−Ｆｌａｇ，Ｓｏｘ６−Ｆｌａｇ若しくはＳｏｘ９−Ｆｌａｇの組み合わせを共トランスフェクションした。トランスフェクションは，ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行った。トランスフェクション後，ＨＥＫ２９３細胞溶解液（細胞抽出物）を調整した。その後，抽出物は抗Ｆｌａｇ抗体を用いる免疫沈降を行い，次いで抗ＧＦＰ抗体を用いるブロッティングによって分析を行った。

（Ｆｌａｇタグ付きプラスミドの構築）
ＧＦＰタグ付きＳｏｘ５，ＧＦＰタグ付きＳｏｘ６及びＧＦＰタグ付きＳｏｘ９を発現するプラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｓｏｘ５，６，および９）の構築は，「Ｉｋｅｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，ｖｏｌ．５０，ｐ３５６１−ｐ３５７３」に記載の方法に基づいて行った。ｐＥＧＦＰベクター中のヒトＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９を，ｐＣＭＶ−Ｆｌａｇベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入することで，Ｆｌａｇタグ付きプラスミドを構築した。

［共免疫沈降およびイムノブロッティング（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）］
全細胞溶解液（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）は，Ｍ−ＰＥＲ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて，製造業者の使用説明書に従って調整した。細胞質と核タンパク質の分離抽出は次のように行った。全細胞溶解液をＰＢＳで洗浄した。細胞沈殿物（ｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔｓ）は，１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８），１０ｍＭ ＫＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）及び０．１％ＮＰ−４０を含む溶液と混合し，その上清は細胞質タンパク質として回収した。その後，沈殿物（ｐｅｌｌｅｔｓ）は５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８），４２０ｍＭ ＫＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），５ｍＭ ＭｇＣl_２及び２０％グリセロールを含む溶液と混合し，その上清は核タンパク質として回収した。共免疫沈降アッセイは，Ｃａｔｃｈ ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｋｉｔ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を用いて，製造業者の使用説明書に従って行った。細胞溶解液は，２μｇの抗Ｆｌａｇ抗体と室温で１時間インキュベートした。その後，免疫複合体を溶出し，ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。イムノブロッティングは，抗Ｆｌａｇ抗体（１：１，０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）），抗ＥＧＦＰ抗体（１：１，０００（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）），又は抗Ａｃｔｉｎ抗体（１：１，０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製））を用いて，「Ｙａｎｏ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，ｖｏｌ．３３３，ｐ１３００−ｐ１３０８」に記載の方法に基づいて行った。２次抗体（ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ又はヤギ抗ラビットＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製））を１：１０，０００の希釈で使用した。その結果を図５Ａ〜図５Ｃに示した。

図５Ａは，細胞溶解液を免疫沈降を行わず，抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロッティングを行った結果を示す図面に替わる写真である。図５Ａ中，黒矢印はＩＰ前のＩｎｐｕｔのバンドを示す。図５Ｂは，細胞溶解液を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降を行った後、抗Ｆｌａｇ抗体でイムノブロッティングを行った結果を示す図面に替わる写真である。図５Ｂ中，アスタリスク（＊）は，α−Ｆｌａｇを用いたＩＰ後のＳｏｘ５，Ｓｏｘ６及びＳｏｘ９のバンドを示す。図５Ｃは，細胞溶解液を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降を行った後、抗ＧＦＰ抗体でイムノブロッティングを行った結果を示す図面に替わる写真である。図５Ｃ中，白矢印はα−ＧＦＰを用いたＩＰ後のＲｕｎｘ１のバンド；ＨＣはイムノグロブリン重鎖のバンド；ＩＣはイムノグロブリン軽鎖のバンドを示す。

共免疫沈降およびイムノブロッティングの結果，Ｒｕｎｘ１−ＧＦＰはＳｏｘ５−Ｆｌａｇ，Ｓｏｘ６−Ｆlａｇ，又はＳｏｘ９−Ｆｌａｇと共免疫沈降することが明らかになった。対照的に，ＧＦＰは，Ｓｏｘ５−Ｆｌａｇ，Ｓｏｘ６−Ｆlａｇ，又はＳｏｘ９−Ｆｌａｇと共免疫沈降しなかった。同様の結果が，逆の実験（ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）から得られた（データは示さず）。これらの結果によって，Ｒｕｎｘ１は軟骨細胞分化の間中Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９と物理的に相互作用することが示唆された。

［哺乳動物細胞ツーハイブリッドシステム］
Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９と相互作用するために必要なＲｕｎｘ１内のドメインを確認するために，哺乳動物細胞ツーハイブリッドシステム（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて，Ｒｕｎｘ１の欠失変異体とＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９との物理的な相互作用を調べた（図５Ｄ〜図５Ｆ）。Ｒｕｎｘ２のｒｕｎｔドメインは，多数の転写因子と直接相互作用することが示されている。Ｒｕｎｘ２のｒｕｎｔドメインはＳｏｘ９との相互作用に重要であることを考慮し，Ｒｕｎｘ１の欠失変異体を２つ構築した。Ｃｈｅｃｋｍａｔｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）用に，全長のＲｕｎｘ１，２つのＲｕｎｘ１欠失変異体（ｒｕｎｔドメイン領域のみ及びｒｕｎｔドメイン領域欠失Ｒｕｎｘ１）を，全長のＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９と同様に，ｐＡＣＴ及びｐＢＩＮＤベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングした。Ｒｕｎｘ１とＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，又はＳｏｘ９との結合活性は，ルシフェラーゼアッセイで評価した。結果を図５Ｄ〜図５Ｆに示した。

図５Ｄ〜図５Ｆの縦軸はルシフェラーゼ活性を示し，値が高いほど結合活性が高いことを示す。図５ＤはＲｕｎｘ１とＳｏｘ５，図５ＥはＲｕｎｘ１とＳｏｘ６，図５ＦはＲｕｎｘ１とＳｏｘ９の結合活性を示す。図５Ｄ〜図５Ｆ中，Ｒｕｎtはｒｕｎｔドメイン領域のみを含む変異体を示し，ｄｅｌ−Ｒｕｎｔはｒｕｎｔドメイン領域を欠失する変異体を示す。

ツーハイブリッドシステムの結果，ｄｅｌ−Ｒｕｎｔは全長Ｒｕｎｘ１及びＲｕｎtと比較して，Ｓｏｘ５（図５Ｄ），Ｓｏｘ６（図５Ｅ），及びＳｏｘ９（図５Ｆ）との相互作用が減少していた。同様の結果が，逆の実験（ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）から得られた。これらの結果により，Ｒｕｎｘ１はｒｕｎｔドメインを介して，Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６及びＳｏｘ９と相互作用することが示唆された。

Ｒｕｎｘ１とＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９の共発現
軟骨細胞の各分化段階におけるＲｕｎｘ１，Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６及びＳｏｘ９の発現パターンを確認するために，マウス成長板（ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ）の免疫組織染色を行った（図６Ａ〜図６Ｆ）。

［免疫染色（成長板）］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス胎児（Ｅ１７．５）からの組織を，４℃で一晩，４％パラアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し，パラフィンに埋め込み，５μｍに切断した。切断部は，Ｒｕｎｘ１，Ｒｕｎｘ２，Ｒｕｎｘ３，Ｓｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９に対する一次抗体（１：５００，Ｓａｎtａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。その局在を，ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識２次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて検出した。その結果を図６Ａ〜図６Ｆに示した。

図６Ａ〜図６Ｆは，Ｅ１７．５ｎｏマウスの頸骨成長板中のＳｏｘ５（図６Ａ），Ｓｏｘ６（図６Ｂ），Ｓｏｘ９（図６Ｃ），Ｒｕｎｘ１（図６Ｄ），Ｒｕｎｘ２（図６Ｅ），及びＲｕｎｘ３（図６Ｆ）の発現パターンを示す。上部写真中に挿入されたボックスを高倍率で拡大した写真が，下２枚の写真に相当する。図中，Ｌ１は軟骨増殖層，Ｌ２は前肥大軟骨層，Ｌ３は肥大軟骨層を示す。免疫染色の結果，Ｒｕｎｘ１は，増殖層（Ｌ１）および前肥大性軟骨細胞層（Ｌ２）中でＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９と広く共発現し，一方，Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３は主に肥大性軟骨細胞層（Ｌ３）内で主に発現することが分かった。

次に，細胞内局在性を，Ｍｙｃタグ付きＲｕｎｘ１（Ｒｕｎｘ１−Ｍｙｃ），ＧＦＰタグ付きＳｏｘ５（Ｓｏｘ５−ＧＦＰ），ＧＦＰタグ付きＳｏｘ６（Ｓｏｘ６−ＧＦＰ），及びＧＦＰタグ付きＳｏｘ９（Ｓｏｘ９−ＧＦＰ）をトランスフェクションしたヒト子宮頚癌細胞株である培養ＨｅＬａ細胞を用いて免疫組織学的に調べた（図６Ｇ）。

（Ｍｙｃタグ付きＲｕｎｘ１プラスミドの構築）
全長のヒトＲｕｎｘ１ ｃＤＮＡはＰｆｕポリメラーゼ（ＫＯＤ ｐｌｕｓ，Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いてＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｙによってクローニングした。入れ子ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングし，配列を決定した。Ｍｙｃタグ付きＲｕｎｘ１を発現するプラスミド（Ｒｕｎｘ１−Ｍｙｃ）を構築するために，ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター中のＲｕｎｘ１フラグメントをｐＣＭＶ−Ｍｙｃベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にサブクローニングした。

［免疫染色（細胞）］
ＨｅＬａ細胞に，Ｒｕｎｘ１−ＭｙｃとＳｏｘ５−ＧＦＰ，Ｓｏｘ６−ＧＦＰ又はＳｏｘ９−ＧＦＰを共トランスフェクションした。トランスフェクションは，ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行った。トランスフェクションしたＨｅＬa細胞を１０分間４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し，Ｒｕｎｘ１（Ｈ−６５）に対する１次抗体と室温で１時間インキュベートした。Ａｌｅｘａ５６８標識２次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を蛍光可視化に用い，核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｓｉｇｍａ社製）で対比染色した。その結果を図６Ｇに示した。

図６Ｇ中，ＦＩＴＣはＳｏｘ−ＧＦＰを，ＲｈｏｄはＲｕｎｘ１−Ｍｙｃを，ＤＡＰＩは核を検出することができる。マージは，ＦＩＴＣ，Ｒｈｏｄ，ＤＡＰＩの結果を１つにまとめた写真である。免疫染色の結果，ＦＩＴＣとＲｈｏｄの蛍光の分布が一致していることが分かった。このことから，Ｒｕｎｘ１は核内にＳｏｘ５，Ｓｏｘ６，及びＳｏｘ９と共局在していることが示された。これらのデータによって，Ｒｕｎｘ１は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においてＳｏｘ ｔｒｉｏと関連していることが強く示唆された。

ＴＭ処理した脱分化初代軟骨細胞の細胞シートの治療効果
次に細胞シート技術を用いて，ＴＭがマウス膝関節軟骨欠損の治療に効果があるかどうかを調べた。脱分化したマウス肋骨軟骨細胞を培養し，温度応答性培養皿で７日間，ＴＭ（１μＭ）存在下又は非存在下で培養した。その後，軟骨細胞の細胞シートを２５℃でインキュベーションすることによって取り上げ，マウス膝全層軟骨欠損（直径１ｍｍ）に移植した（図７Ａ）。移植後１４日でトルイジンブルー及びサフラン−Ｏ染色を用いて組織学的に分析した（図７Ｂ）。

［培養軟骨細胞シート（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ−ｓｈｅｅｔ）の移植および組織学的な分析］
Ｅ１８．５ ＳＶ４０ Ｔ−抗原トランスジェニックマウス胎児（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ）から単離した継代数１０（Ｐ１０）の脱分化マウス肋骨軟骨細胞をポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）でコートした温度応答性皿（ｔｅｍｐａｒａｔｕｒｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｄｉｓｈ）（ＣｅｌｌＳｅｅｄ社製）で培養した。ＴＭ（１μＭ）で７日間処理後，軟骨細胞シートを２０〜２５℃で３０分以内でインキュベートし，非侵襲的に取り上げ，１２週齢マウスにトレパンによって作られた膝軟骨全層欠損（直径１ｍｍ）に移植した。手術後１４日（２Ｗ）で，マウスは二酸化炭素を用いて窒息させ安楽死させた。組織学的分析のために，マウスの大腿骨を固定し，パラフィンに埋め込み，厚み５mmで組織切片を作成し，トルイジンブルー及びサフラニン−Ｏを用いて染色した。その結果を図７Ｂに示した。

図７Ｂ中，左写真はコントロールであり，未処理の全層膝欠損を示す。中央写真は，ＴＭ未処理の軟骨細胞シートを移植した欠損部位を示す。右写真は，ＴＭ（１μＭ）で処理した軟骨細胞シートを移植した欠損部位を示す。矢印は，欠損部位の端をしめす。軟骨細胞シートを移植した結果，移植後１４日でＴＭ（１μＭ）で処理した軟骨細胞の細胞シートは，軟骨組織の欠損が修復された。しかしながら，コントロール群（欠損のみ及びＴＭ（０μＭ））は修復されなかった。これらの結果によって，ＴＭ処理細胞シートは軟骨欠損に治療効果があることが示唆された。

再生した膝軟骨組織の由来の検討
次に，再生した膝軟骨組織が移植細胞由来か宿主の細胞由来かを同定するためにＧＦＰ免疫染色を行った。その方法として，ＧＦＰ全身発現マウスから軟骨細胞を採取し，上記の方法と同様にマウス膝全層軟骨欠損部位に移植した。移植２週間後に膝関節組織を採取し，ＧＦＰ抗体を用いて免疫組織化学的解析を行った。その結果を図８に示した。

図８は，再生した膝軟骨組織の由来を検討した結果を示す図面に替わる写真である。図８Ａは，膝関節軟骨の免疫組織化学解析結果を示す図面に替わる写真である。図８中，バーのサイズは，２００μｍを示す。図８Ａ中，矢印は，欠損部位の端を示す。図８Ｂは，図８Ａの四角で囲んだ領域の拡大写真を示す。図８中，点線は再生軟骨組織と軟骨下骨の境界を示す。この結果，再生された軟骨組織は，ほぼ移植軟骨細胞由来であることが示された。

本発明は，医薬産業において好適に用いることができる。

Claims (11)

1. 下記式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を含む培地で未分化細胞を分化培養する工程を含む，
   軟骨欠損部位修復シートの製造方法。
   
2. 前記未分化細胞は，
   ＥＳ細胞，ｉＰＳ細胞，間葉系細胞，及び脱分化した軟骨細胞のいずれかである，
   請求項１に記載の軟骨欠損部位修復シートの製造方法。
3. 前記培地は，
   前記式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を１×１０⁻⁶〜１×１０^２μＭ含む，
   請求項１に記載の軟骨欠損部位修復シートの製造方法。
4. 式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を含む培地で未分化細胞を分化培養する工程を含む製造工程によって得られる軟骨欠損部位修復シート。
   
5. 前記未分化細胞は，
   ＥＳ細胞，ｉＰＳ細胞，間葉系細胞，及び脱分化した軟骨細胞のいずれかである，
   請求項４に記載の軟骨欠損部位修復シート。
6. 前記培地は，
   前記式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を１×１０^−６〜１×１０^２μＭ含む，
   請求項４に記載の軟骨欠損部位修復シート。
7. 式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有するＲｕｎｘ１発現誘導剤。
8. 式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有する軟骨初期分化誘導剤。
9. 式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有する脱分化した軟骨細胞の再分化促進剤。
10. 式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有する軟骨細胞肥大分化予防剤。
11. 式（Ｉ）で示される化合物，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される水和物を有効成分として含有する２型コラーゲン産生促進剤。