JPWO2010005055A1 - オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現制御方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Fire,A.,Xu,S.,Montgomery,M.K.,Kostas,S.A.,Driver,S.E. and Mello,C.C.(1998) Nature,391,806−811. Elbashir,S.M.,Harborth,J.,Lendeckel,W.,Yalcin,A.,Weber,K. and Tuschl,T.(2001) Nature,411,494−498. Brummelkamp,T.R.,Bernards,R. and Agami,R.(2002) Science,296,550−553. Paddison,P.J.,Caudy,A.A.,Bernstein,E.,Hannon,G.J. and Conklin,D.S.(2002) Genes Dev,16,948−958. Lima WF, Murray H, Nichols JG, Wu H, Sun H, Prakash TP, Berdeja AR, Gaus HJ,Crooke ST.,J Biol Chem. 2009 Jan 23;284(4):2535−48.Epub 2008 Nov. 18. Links
図1は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の概念を説明する図である。
図2(a)に示すように、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の近傍に上記トリガー鎖1と相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチド4(図2の例では、mRNA)が存在すると、トリガー鎖1の他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位t1−2を認識し、サポート鎖3との間で交換反応が起こる。この交換反応により、三方向ジョイント構造が崩壊する。
[細胞内におけるRNAiの発生の評価]
ヒト乳がん由来細胞(MCF−7細胞)におけるRNAiの発生を評価した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor:VEGF)のmRNAの一部に対応するDNAを用い、トリガー鎖として、VEGFの受容体の一つであるKDR(2型受容体)のDNAを用いた。VEGFは、多くのガン細胞が産生しており、血管をガン組織に誘導する因子である。さらに、ガン細胞自身がこの増殖因子に反応して、増殖することが知られている。KDRは、血管内皮細胞やガン細胞などの細胞表面などにあり、VEGFと結合する。
[電気泳動におけるオリゴヌクレオチド構造体の崩壊の評価]
図1に示す三方向ジョイント構造を有するオリゴヌクレオチド構造体(以下、「TWJ構造体」という)が出来ているかどうか、およびmRNA相当配列によって、その構造が崩壊しているかどうか検討をした。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表2に示す。
aのレーン: エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖
bのレーン: エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖、mRNA相当鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖
cのレーン: エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖
dのレーン: エフェクター鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖
[TWJ構造のトリガー鎖に結合するポリヌクレオチドの長さの評価]
図1に示す三方向ジョイント構造を有するTWJ構造体を作製し、mRNA相当配列の長さが、TWJ構造体の崩壊に対する、mRNA相当配列の長さの影響を検討した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor:VEGF)のmRNAの一部に対応するDNAを用い、トリガー鎖として、VEGFの受容体の一つであるKDR(2型受容体)のDNAを用いた。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表3に示す。各配列中のアンダーラインは、TWJ構造体の1本鎖の部分または1本鎖の部分の相補鎖を意味する。
図5から、n=8以上のときは、TWJ構造体は完全に崩壊していることがわかる。
[一塩基置換認識能の評価]
図1に示す三方向ジョイント構造を有するTWJ構造体を作製し、mRNA相当配列の長さが、一塩基置換認識能に対する、mRNA相当配列の長さの影響を検討した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor:VEGF)のmRNAの一部に対応するDNAを用い、トリガー鎖として、VEGFの受容体の一つであるKDR(2型受容体)のDNAを用いた。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表4に示す。各配列中のアンダーラインは、TWJ構造体の1本鎖の部分または1本鎖の部分の相補鎖を意味する。
[一塩基置換認識能の位置特異性の評価]
図1に示す三方向ジョイント構造を有するTWJ構造体を作製し、mRNA相当配列に含まれる一塩基置換の位置が、一塩基置換認識能に対する、影響を検討した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor:VEGF)のmRNAの一部に対応するDNAを用い、トリガー鎖として、VEGFの受容体の一つであるKDR(2型受容体)のDNAを用いた。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表5に示す。各配列中のアンダーラインは、TWJ構造体の1本鎖の部分または1本鎖の部分の相補鎖を意味する。
[細胞選択性の評価]
(カスパーゼ8またはカスパーゼ3のsiRNAによるノックダウンの確認)
Fasリガンドは受容体Fasに結合すると細胞にアポトーシスを誘導するサイトカイン=デス因子である。具体的には、Fasリガンドは細胞表層の受容体Fasに結合して、カスパーゼ8を活性化する。次にカスパーゼ8はカスパーゼ3を活性化し、アポトーシスを引き起こす。このとき、カスパーゼ8または3が細胞内になければ、この細胞はFasリガンドによるアポトーシスに耐性となる。
GFPのmRNAを認識する部位を有するトリガー鎖と、カスパーゼ8または3に対するsiRNAを放出するエフェクター鎖(下記表8に示す「ガイド鎖」)を有するTWJ構造体を設計した。このTWJ構造体を用いると、細胞がGFPを発現していると、GFP mRNAによって、TWJ構造体が崩壊し、カスパーゼ8または3に対するsiRNAを放出し、カスパーゼ8または3をノックダウンする。これにより、Fasリガンドによるアポトーシス誘導に耐性となる。一方、GFP非発現細胞ではGFP mRNAが存在しないので、TWJ構造体は崩壊しない。すなわち、siRNAは放出せず、アポトーシスに感受性である。このため、Fasリガンドによって細胞死が起こる。
ヒト培養細胞株HEK293T(GFP非発現株)およびそれにGFPを恒常発現させた株(GFP発現株)を用い、4種類のTWJ構造体+パッセンジャー鎖(各33 microM)、コントロールとしてトランスフェクション剤だけ(Lipo)、無添加(none)をそれぞれの細胞株にトランスフェクションした。2日後、FasLigandを(25 ng/ml)を添加した。1日後、細胞の生死をWSTで常法によりアッセイした。結果を図11に示す。
2 エフェクター鎖
2’ エフェクター鎖に相補的なオリゴヌクレオチド
3 サポート鎖
4 トリガー鎖に相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチド
Claims (11)
- トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との3本のオリゴヌクレオチドで構成され、
前記3本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の2本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、
前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体。 - 前記三方向ジョイント構造は、前記トリガー鎖に結合する前記他のポリヌクレオチドにより崩壊する、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
- 前記エフェクター鎖は、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する、請求項1または2に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
- 前記エフェクター鎖は、相補性を有するオリゴヌクレオチドと二本鎖を形成する、請求項1ないし3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド構造体。
- 前記トリガー鎖が結合する他のポリヌクレオチドの配列がそれぞれ異なるトリガー鎖を有する二種類のオリゴヌクレオチド構造体から、得られるエフェクター鎖同士から二本鎖を形成する、請求項1ないし3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド構造体。
- 前記他のポリヌクレオチドの配列が異なる遺伝子由来のものである、請求項5に記載のオリゴヌクレオチド構造体。
- トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との3本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記3本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の2本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体を細胞、あるいは組織に導入し、
他のポリヌクレオチドが存在する細胞、あるいは組織においてのみ、前記三方向ジョイント構造の崩壊を生じさせ、1本鎖エフェクター鎖を得る、
遺伝子発現抑制方法。 - 前記エフェクター鎖は、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する、請求項7に記載の遺伝子発現抑制方法。
- 前記オリゴヌクレオチド構造体と共に、このオリゴヌクレオチド構造体のエフェクター鎖と相補的に結合するオリゴヌクレオチドを導入し、
前記三方向ジョイント構造の崩壊を生じた細胞、あるいは組織内で、生じた1本鎖エフェクター鎖とオリゴヌクレオチドとが二本鎖を形成する、請求項7または8に記載の遺伝子発現抑制方法。 - エフェクター鎖の塩基配列が同一で、トリガー鎖が認識する他のポリヌクレオチドが異なる二種類のオリゴヌクレオチド構造体を細胞、あるいは組織に導入し、
前記トリガー鎖が認識する他のポリヌクレオチドが二種類存在する細胞、あるいは組織においてのみ、前記二種類のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させ、
生じたエフェクター鎖同士が二本鎖を形成する、請求項9に記載の遺伝子発現抑制方法。 - トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との3本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記3本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の2本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体と、他のポリヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドの一塩基置換体とを混合し、
前記オリゴヌクレオチド構造体の崩壊の有無により、他のポリヌクレオチドの一塩基置換体を検出する、一塩基置換体の検出方法。
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