JPWO2009157562A1 - 成体膵臓幹細胞の樹立方法及び分化方法 - Google Patents
成体膵臓幹細胞の樹立方法及び分化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2009157562A1 JPWO2009157562A1 JP2010518084A JP2010518084A JPWO2009157562A1 JP WO2009157562 A1 JPWO2009157562 A1 JP WO2009157562A1 JP 2010518084 A JP2010518084 A JP 2010518084A JP 2010518084 A JP2010518084 A JP 2010518084A JP WO2009157562 A1 JPWO2009157562 A1 JP WO2009157562A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- stem cells
- differentiation
- adult
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 199
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 184
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 140
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 129
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 claims abstract description 61
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 claims abstract description 34
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 claims description 46
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 claims description 46
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 36
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 36
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 35
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 34
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 30
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 claims description 30
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N Valproic acid Chemical compound CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 26
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 25
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 23
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 23
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 claims description 21
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 claims description 21
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 20
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 claims description 20
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 12
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 8
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 8
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 8
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims description 6
- 210000001926 inhibitory interneuron Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 claims description 5
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 145
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 abstract description 79
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract description 75
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 abstract description 70
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 abstract description 16
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 57
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 57
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 57
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 53
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 33
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 29
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 29
- 108050000588 Neurogenic differentiation factor 1 Proteins 0.000 description 27
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 27
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 25
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 description 25
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 24
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 24
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 23
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 23
- 102000052549 Wnt-3 Human genes 0.000 description 23
- 108700020985 Wnt-3 Proteins 0.000 description 23
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 20
- 101150037203 Sox2 gene Proteins 0.000 description 19
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 18
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 18
- MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M valproate semisodium Chemical compound [Na+].CCCC(C(O)=O)CCC.CCCC(C([O-])=O)CCC MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 18
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 17
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 15
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 15
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 15
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 15
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 13
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 13
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 13
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 12
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 12
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 12
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 12
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 12
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 12
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 210000003757 neuroblast Anatomy 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 10
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 10
- 108010016283 TCF Transcription Factors Proteins 0.000 description 10
- 102000000479 TCF Transcription Factors Human genes 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 9
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 8
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 8
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 8
- 102000044880 Wnt3A Human genes 0.000 description 8
- 108700013515 Wnt3A Proteins 0.000 description 8
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 8
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 8
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 7
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 7
- 101000756346 Homo sapiens RE1-silencing transcription factor Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 7
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 7
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 7
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 101100226845 Strongylocentrotus purpuratus EGF2 gene Proteins 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102100022940 RE1-silencing transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 5
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 4
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 4
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 4
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 4
- 208000019736 Cranial nerve disease Diseases 0.000 description 3
- 108091035710 E-box Proteins 0.000 description 3
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 3
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 3
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000001153 interneuron Anatomy 0.000 description 3
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 208000024691 pancreas disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 2
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CN1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031786 Adiponectin Human genes 0.000 description 1
- 108010076365 Adiponectin Proteins 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 1
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 101100257362 Homo sapiens SOX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100540833 Homo sapiens WNT3A gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000004369 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000969 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 229940079131 Methylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002946 anti-pancreatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003140 astrocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- -1 etc.) Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000747 hippocampal granule cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000007728 intracellular signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- YAEMHJKFIIIULI-UHFFFAOYSA-N n-(4-methoxybenzyl)-n'-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CNC(=O)NC1=NC=C([N+]([O-])=O)S1 YAEMHJKFIIIULI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 230000007383 nerve stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012031 short term test Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940084026 sodium valproate Drugs 0.000 description 1
- AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M sodium valproate Chemical compound [Na+].CCCC(C([O-])=O)CCC AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
- C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
成体膵臓幹細胞の樹立方法及び分化方法として、基本的に成体神経幹細胞で用いられる樹立方法を適用した成体膵臓幹細胞の樹立方法及び神経細胞への分化誘導剤を用いた各膵臓細胞への分化方法を確立した。また、得られた成体膵臓幹細胞と共に神経細胞分化誘導剤を用いる、各種膵臓細胞再生治療用キット、特にインシュリン産生β細胞前駆細胞と共に、神経細胞分化誘導剤を用いる神経再生治療用キットを提供した。
Description
本発明は、成体膵臓幹細胞の樹立・培養・分化方法及び成体膵臓幹細胞を用いた膵臓組織再生用及び神経組織再生用の移植治療に関する。
骨髄幹細胞や間葉系幹細胞の移植は、既に臨床応用が始められているが、その標準化、単一化において非常に厳密な制御が必要となる。我々「成体」の各臓器には、臓器に必要な細胞群を産み出す源となる幹細胞が存在している。ただ、胎生幹細胞やES細胞の研究に比べ、「成体」の幹細胞の研究自体の歴史はまだ浅く、各臓器の「成体幹細胞」の確立もしっかり統一されていない。また、分化を左右する遺伝子の調節機構の違いについて、胎生幹細胞と詳細に比較解析されている例も少ない。今後、成体組織幹細胞の再生医療への利用開発を促すためには、その分子機構の基礎研究がさらに発展する必要がある。
安全な再生医療を考えた場合、増殖性の極端に高い胎生期から樹立された細胞（胎生幹細胞）やES細胞を用いるより、「成体」から樹立された「成体組織幹細胞」は、標的となる各臓器部位で、制御分子機構や細胞応答性がより生体環境に馴染んだ幹細胞であるため、ガン化などのリスクファクターが少ない利点があり、とりわけ「成体」由来の「自己幹細胞」を用いた方が、患者に負担も低く免疫拒絶性も無い、自然で効果的な医療が行えると考えられる。
現在までに種々の組織由来の組織幹細胞が報告され、血液幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、心筋幹細胞、骨格筋幹細胞などと共に、脳の神経幹細胞も、既に国際的、学術的にも確立された成体幹細胞である（非特許文献１など）。
ヒトからマウス等、下等動物に至るまで、「成体」神経幹細胞の存在が国際学術誌に多数報告されている。成体脳内での神経新生は従来不可能だと考えられていたが、成体の脳内にも日々分裂を繰り返し、神経新生を繰り返している神経幹細胞が存在する領域が保持されていることが分かった。最近の研究から、胎生神経幹細胞と成体神経幹細胞からの分化制御機構で、細胞外シグナル分泌には幾らか相同性があるが、そのシグナルに応答して細胞内で発現し、実際に分化開始を誘導する上で、中心となる遺伝子の発現制御機構が違うという重要な事実が、徐々に明らかになってきた。
成体の神経幹細胞の存在が1990年代に始めて明らかにされて以降、脳内で神経新生を起こす成体神経幹細胞の仕組みを解明し、創薬開発や再生医療、脳神経疾患の治療に役立てる研究が盛んに今日では行われている。神経幹細胞からは、成熟神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞の３種が分化して形成される。
この分化能力を備えた神経幹細胞は胎生期にも存在する。この胎生神経幹細胞から神経新生を起こす代表転写遺伝子例はNeurogeninという遺伝子である。一方、成体の「神経新生」を起こす代表転写遺伝子はNeuroD1/beta2であり、この遺伝子が無いと、成体の脳内で神経新生を起こす領域のみが限定して欠損する。
さらに、成熟神経細胞まで分化全過程に必要な、神経特異的遺伝子群の発現を「活性化」調節する転写因子が、成体脳ではNRSF/REST転写遺伝子なのだが、胎生期では神経細胞以外に発現されることにより、「活性化」ではなく「抑制」している。発現される転写因子の種類や時期、遺伝子の発現調節機構自体も全く違うため、「成体期」と「胎生期」の幹細胞・分化制御は明確に区別できる。
このように、現在では、成体神経幹細胞につては、その樹立方法、未分化状態に維持した培養方法、及び各種の成熟した神経細胞、グリア細胞への分化方法はほぼ確立しているといえる。
安全な再生医療を考えた場合、増殖性の極端に高い胎生期から樹立された細胞（胎生幹細胞）やES細胞を用いるより、「成体」から樹立された「成体組織幹細胞」は、標的となる各臓器部位で、制御分子機構や細胞応答性がより生体環境に馴染んだ幹細胞であるため、ガン化などのリスクファクターが少ない利点があり、とりわけ「成体」由来の「自己幹細胞」を用いた方が、患者に負担も低く免疫拒絶性も無い、自然で効果的な医療が行えると考えられる。
現在までに種々の組織由来の組織幹細胞が報告され、血液幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、心筋幹細胞、骨格筋幹細胞などと共に、脳の神経幹細胞も、既に国際的、学術的にも確立された成体幹細胞である（非特許文献１など）。
ヒトからマウス等、下等動物に至るまで、「成体」神経幹細胞の存在が国際学術誌に多数報告されている。成体脳内での神経新生は従来不可能だと考えられていたが、成体の脳内にも日々分裂を繰り返し、神経新生を繰り返している神経幹細胞が存在する領域が保持されていることが分かった。最近の研究から、胎生神経幹細胞と成体神経幹細胞からの分化制御機構で、細胞外シグナル分泌には幾らか相同性があるが、そのシグナルに応答して細胞内で発現し、実際に分化開始を誘導する上で、中心となる遺伝子の発現制御機構が違うという重要な事実が、徐々に明らかになってきた。
成体の神経幹細胞の存在が1990年代に始めて明らかにされて以降、脳内で神経新生を起こす成体神経幹細胞の仕組みを解明し、創薬開発や再生医療、脳神経疾患の治療に役立てる研究が盛んに今日では行われている。神経幹細胞からは、成熟神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞の３種が分化して形成される。
この分化能力を備えた神経幹細胞は胎生期にも存在する。この胎生神経幹細胞から神経新生を起こす代表転写遺伝子例はNeurogeninという遺伝子である。一方、成体の「神経新生」を起こす代表転写遺伝子はNeuroD1/beta2であり、この遺伝子が無いと、成体の脳内で神経新生を起こす領域のみが限定して欠損する。
さらに、成熟神経細胞まで分化全過程に必要な、神経特異的遺伝子群の発現を「活性化」調節する転写因子が、成体脳ではNRSF/REST転写遺伝子なのだが、胎生期では神経細胞以外に発現されることにより、「活性化」ではなく「抑制」している。発現される転写因子の種類や時期、遺伝子の発現調節機構自体も全く違うため、「成体期」と「胎生期」の幹細胞・分化制御は明確に区別できる。
このように、現在では、成体神経幹細胞につては、その樹立方法、未分化状態に維持した培養方法、及び各種の成熟した神経細胞、グリア細胞への分化方法はほぼ確立しているといえる。
しかしながら、膵臓幹細胞については、糖尿病患者など、インシュリン産生膵臓細胞に分化し得る膵臓幹細胞への臨床的期待が大きいにもかかわらず、確立した樹立細胞としては胎児性（ES)幹細胞のみである。唾液腺由来の成体幹細胞の報告はある（非特許文献２）ものの、当該報告中では、多能性を有していることの確認実験はなく、樹立細胞としての要件も不十分である。
また、従来、膵臓幹細胞を、インシュリン産生性のβ細胞をはじめ、α細胞、γ細胞、δ細胞へと分化させるためには、それぞれES細胞から誘導分化させる手法（非特許文献３）などの手法が用いられていたが、分化能が限られていたり、高度なテクニックを要したり、増殖能の違いから生じるガン化などの欠点があった。
そこで、膵臓組織における再生医療においては、患者への負担も低く免疫拒絶性も無い「自己幹細胞」も視野に入れた、膵臓への移植が可能であり、かつ各種膵臓細胞へ分化可能な成体幹細胞の安定的な提供が強く望まれていた。
また、従来、膵臓幹細胞を、インシュリン産生性のβ細胞をはじめ、α細胞、γ細胞、δ細胞へと分化させるためには、それぞれES細胞から誘導分化させる手法（非特許文献３）などの手法が用いられていたが、分化能が限られていたり、高度なテクニックを要したり、増殖能の違いから生じるガン化などの欠点があった。
そこで、膵臓組織における再生医療においては、患者への負担も低く免疫拒絶性も無い「自己幹細胞」も視野に入れた、膵臓への移植が可能であり、かつ各種膵臓細胞へ分化可能な成体幹細胞の安定的な提供が強く望まれていた。
Gage,F. H. et al., Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cellstransplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 11879-11883(1995).
Suzuki, A., Nakauchi, H. & Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes 53, 2143-2152 (2004).
Kume, S. Stem-cell-based approaches for regenerative medicine. Dev Growth Differ. 2005 Aug;47(6):393-402.
Hsieh, J. et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. J. Cell Biol. 164, 111-122 (2004).
Kuwabara, T., Hsieh, J., Nakashima, K., Taira, K. & Gage, F. H. A small modulatory dsRNA specifies the fate of adult neural stem cells. Cell 116, 779-793 (2004).
Nakashima, K et al., Synergistic signaling in fetal brain by STAT3-Smad1 complex bridged by p300. Science 284, 479-482.
D'Amour K.A. & Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 11866-11872 (2003).
Habener, J. F., Kemp, D. M. & Thomas M. K. Minireview: transcriptional regulation in pancreatic development. Endocrinology 146, 1025-1034 (2005).
Clevers H., Wnt/β-Catenin Signaling in Development and Disease. Cell 127,469-480 (2006).
本発明の課題は、成体膵臓幹細胞を確実に効率よく樹立できる方法及び当該手法で樹立した成体膵臓幹細胞を提供することであり、また、得られた成体膵臓幹細胞を未分化状態に維持する培養方法、及び各種成熟膵臓細胞へ分化させる方法を提供することであり、当該成体膵臓幹細胞を用いた膵臓組織の再生治療方法を提供することである。
本発明者らは、脳内での学習機能に必要なインシュリン産生能を有する神経細胞と、膵臓内で血糖値低下に必要なインシュリン産生能を有する膵臓細胞との間の性質の共通性に着目し、胎生期の発生段階では前者は外胚葉系、後者は内胚葉系という遠い隔たりのある細胞ではあるが、成体幹細胞としての制御機構などにおいて類似している可能性があると考え、鋭意研究の結果、神経幹細胞で用いられる樹立方法を基本とした膵臓幹細胞の樹立方法を成功させ、はじめて確実な成体組織幹細胞としての要件を備え、糖尿病など各種膵臓細胞の移植治療用に用いることのできる膵臓幹細胞についての本発明を完成させた。
また、このようにして樹立した成体膵臓幹細胞を、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞それぞれに分化させる際にも、神経幹細胞から各種神経系細胞へ分化させるための方法が転化応用できること、つまり、β細胞分化には神経分化の方法、α細胞の分化にはアストロサイト細胞への分化方法、δ細胞の分化には抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件、γ細胞分化にはオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件を使用すればよいことを見出し、膵臓幹細胞の各種膵臓細胞への効率的な分化方法も確立することができた。
さらに、本発明の成体膵臓幹細胞と、同時に樹立・培養した成体神経幹細胞との分子基盤の詳細な比較解析から、両者の分化制御因子群に非常に高い類似性・相補性があることを明らかにした。さらに、神経幹細胞と膵臓幹細胞とが、樹立、培養工程のみならず、分化工程においてもきわめて類似した挙動を示すという知見を踏まえ、膵臓幹細胞を神経組織に移植した場合も、神経細胞分化誘導剤又はグリア細胞分化誘導剤を併用することで、神経系細胞又はグリア細胞に分化し、神経幹細胞を膵臓組織に移植した場合は、反対にβ細胞等の各膵臓細胞に分化するという仮説を立て、トランスジェニックマウスを用いた実験系で当仮説を立証した。
本発明で得られた成体膵臓幹細胞を用いた膵臓の再生移植治療用キットと共に、当該成体膵臓幹細胞を用いた脳、脊髄など中枢神経系又は末梢神経系細胞又はグリア系細胞の再生移植治療用キットについての発明を完成した。なお、同時に成体神経幹細胞を用いた糖尿病用の再生移植医療についての発明も完成し、本願と同日付で別出願をしている（特願2008-168187号）。
また、このようにして樹立した成体膵臓幹細胞を、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞それぞれに分化させる際にも、神経幹細胞から各種神経系細胞へ分化させるための方法が転化応用できること、つまり、β細胞分化には神経分化の方法、α細胞の分化にはアストロサイト細胞への分化方法、δ細胞の分化には抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件、γ細胞分化にはオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件を使用すればよいことを見出し、膵臓幹細胞の各種膵臓細胞への効率的な分化方法も確立することができた。
さらに、本発明の成体膵臓幹細胞と、同時に樹立・培養した成体神経幹細胞との分子基盤の詳細な比較解析から、両者の分化制御因子群に非常に高い類似性・相補性があることを明らかにした。さらに、神経幹細胞と膵臓幹細胞とが、樹立、培養工程のみならず、分化工程においてもきわめて類似した挙動を示すという知見を踏まえ、膵臓幹細胞を神経組織に移植した場合も、神経細胞分化誘導剤又はグリア細胞分化誘導剤を併用することで、神経系細胞又はグリア細胞に分化し、神経幹細胞を膵臓組織に移植した場合は、反対にβ細胞等の各膵臓細胞に分化するという仮説を立て、トランスジェニックマウスを用いた実験系で当仮説を立証した。
本発明で得られた成体膵臓幹細胞を用いた膵臓の再生移植治療用キットと共に、当該成体膵臓幹細胞を用いた脳、脊髄など中枢神経系又は末梢神経系細胞又はグリア系細胞の再生移植治療用キットについての発明を完成した。なお、同時に成体神経幹細胞を用いた糖尿病用の再生移植医療についての発明も完成し、本願と同日付で別出願をしている（特願2008-168187号）。
すなわち、本発明は以下の発明を含むものである。
〔１〕 成体由来の膵臓組織からの膵臓幹細胞の樹立方法であって、下記の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む成体膵臓幹細胞の樹立方法；
（ａ）膵臓幹細胞を含む膵臓組織を、コラゲナーゼを含む神経幹細胞用培養培地に懸濁する工程、
（ｂ）膵臓幹細胞を、神経幹細胞培養用ディッシュに播種し、神経幹細胞用培養培地を加えて培養する工程。
〔２〕 前記培養工程において、まずFCS及びFGF2を含有する神経幹細胞用培養培地で膵臓幹細胞を増殖させ、次いでFCSを除いたFGF2を含有する神経幹細胞用培養培地で培養することを特徴とする、前記〔１〕に記載の成体膵臓幹細胞の樹立方法。
〔３〕 前記〔１〕又は〔２〕に記載の樹立方法により得られた成体膵臓幹細胞であって、sox-2遺伝子を発現している成体膵臓幹細胞。
〔４〕 成体膵臓幹細胞を、FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞を未分化状態に維持する方法。
〔５〕 成体膵臓幹細胞を神経細胞分化条件下で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞をβ細胞及びδ細胞へ分化誘導する分化誘導方法。
〔６〕 成体膵臓幹細胞を、抑制性のインターニューロンを作製する神経細胞分化条件下で培養することでδ細胞の含有度を高めることを特徴とする、前記〔５〕に記載の分化誘導方法。
〔７〕 成体膵臓幹細胞を、アストロサイト細胞分化条件下で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞をα細胞及びγ細胞へ分化誘導する分化誘導方法。
〔８〕 成体膵臓幹細胞を、オリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化条件下で培養することでγ細胞含有度を高めることを特徴とする、前記〔７〕に記載の分化誘導方法。
〔９〕 前記〔３〕に記載の成体膵臓幹細胞を含むことを特徴とする、膵臓細胞再生移植用キット。
〔１０〕 さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、前記〔９〕に記載の膵臓細胞再生移植用キット。
〔１１〕 生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞と、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤とを含むことを特徴とする、膵臓β細胞再生移植用キット。
〔１２〕 成体膵臓幹細胞を、生体適合性シート上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養して、β前駆細胞に分化させた後、前記生体適合性シートと共に、膵臓患部に導入することを特徴とする、膵臓再生移植治療方法。
〔１３〕 RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤を有効成分として含む、糖尿病治療用組成物。
〔１４〕 さらに、生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞を含む、前記〔１３〕に記載の糖尿病治療用組成物。
〔１５〕 前記成体膵臓幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、前記〔１４〕に記載の糖尿病治療用組成物。
〔１６〕 成体膵臓幹細胞を含むことを特徴とする、神経細胞再生移植用キット。
〔１７〕 さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、前記〔１６〕に記載の神経細胞再生移植用キット。
〔１８〕 前記神経細胞分化誘導剤が、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種を含むことを特徴とする、前記〔１７〕に記載の神経細胞再生移植用キット。
〔１９〕 成体膵臓幹細胞を、生体適合性シート上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養して、β前駆細胞に分化させた後、前記生体適合性シートと共に、神経組織患部に導入することを特徴とする、神経組織再生治療方法。
〔２０〕 生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞と共に、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、神経性疾患治療用組成物。
〔２１〕 前記成体膵臓幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、前記〔２０〕に記載の神経性疾患治療用組成物。
〔１〕 成体由来の膵臓組織からの膵臓幹細胞の樹立方法であって、下記の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む成体膵臓幹細胞の樹立方法；
（ａ）膵臓幹細胞を含む膵臓組織を、コラゲナーゼを含む神経幹細胞用培養培地に懸濁する工程、
（ｂ）膵臓幹細胞を、神経幹細胞培養用ディッシュに播種し、神経幹細胞用培養培地を加えて培養する工程。
〔２〕 前記培養工程において、まずFCS及びFGF2を含有する神経幹細胞用培養培地で膵臓幹細胞を増殖させ、次いでFCSを除いたFGF2を含有する神経幹細胞用培養培地で培養することを特徴とする、前記〔１〕に記載の成体膵臓幹細胞の樹立方法。
〔３〕 前記〔１〕又は〔２〕に記載の樹立方法により得られた成体膵臓幹細胞であって、sox-2遺伝子を発現している成体膵臓幹細胞。
〔４〕 成体膵臓幹細胞を、FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞を未分化状態に維持する方法。
〔５〕 成体膵臓幹細胞を神経細胞分化条件下で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞をβ細胞及びδ細胞へ分化誘導する分化誘導方法。
〔６〕 成体膵臓幹細胞を、抑制性のインターニューロンを作製する神経細胞分化条件下で培養することでδ細胞の含有度を高めることを特徴とする、前記〔５〕に記載の分化誘導方法。
〔７〕 成体膵臓幹細胞を、アストロサイト細胞分化条件下で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞をα細胞及びγ細胞へ分化誘導する分化誘導方法。
〔８〕 成体膵臓幹細胞を、オリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化条件下で培養することでγ細胞含有度を高めることを特徴とする、前記〔７〕に記載の分化誘導方法。
〔９〕 前記〔３〕に記載の成体膵臓幹細胞を含むことを特徴とする、膵臓細胞再生移植用キット。
〔１０〕 さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、前記〔９〕に記載の膵臓細胞再生移植用キット。
〔１１〕 生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞と、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤とを含むことを特徴とする、膵臓β細胞再生移植用キット。
〔１２〕 成体膵臓幹細胞を、生体適合性シート上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養して、β前駆細胞に分化させた後、前記生体適合性シートと共に、膵臓患部に導入することを特徴とする、膵臓再生移植治療方法。
〔１３〕 RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤を有効成分として含む、糖尿病治療用組成物。
〔１４〕 さらに、生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞を含む、前記〔１３〕に記載の糖尿病治療用組成物。
〔１５〕 前記成体膵臓幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、前記〔１４〕に記載の糖尿病治療用組成物。
〔１６〕 成体膵臓幹細胞を含むことを特徴とする、神経細胞再生移植用キット。
〔１７〕 さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、前記〔１６〕に記載の神経細胞再生移植用キット。
〔１８〕 前記神経細胞分化誘導剤が、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種を含むことを特徴とする、前記〔１７〕に記載の神経細胞再生移植用キット。
〔１９〕 成体膵臓幹細胞を、生体適合性シート上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養して、β前駆細胞に分化させた後、前記生体適合性シートと共に、神経組織患部に導入することを特徴とする、神経組織再生治療方法。
〔２０〕 生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞と共に、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、神経性疾患治療用組成物。
〔２１〕 前記成体膵臓幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、前記〔２０〕に記載の神経性疾患治療用組成物。
本発明により、多能性を有する成体膵臓幹細胞を確実に効率よく樹立できる手法を確立することができた。また、このようにして樹立した成体膵臓幹細胞は、糖尿病など各種膵臓細胞の移植治療に用いることができるばかりか、中枢神経系の神経再生のための移植治療用細胞としても用いることができる。
１．成体神経幹細胞と成体膵臓幹細胞について
成体幹細胞の中で、神経幹細胞は国際的、学術的にも確立されている。1990年代に始めて明らかにされて以降、脳内で神経新生を起こす成体神経幹細胞の仕組みを解明し、創薬開発や再生医療、脳神経疾患の治療に役立てる研究が盛んに今日では行われている。
本発明者らは、内分泌器官である「成体」の膵臓にも、成体神経幹細胞と同じ未分化マーカー遺伝子（Sox2）を発現する膵臓幹細胞が存在することを明らかにさせた（図１）。Sox2遺伝子は、ES細胞でも発現する非常に高い未分化性を保持する転写因子である。トランスジェニックマウスを用いた動物個体の脳と膵臓で、その発現を確認した（Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結した遺伝子改変マウス内で、Sox2遺伝子を発現している細胞が蛍光を発する）。重要なこととして、両臓器の神経細胞及び、β細胞がともにインシュリンを発現していることである（図１、上図、赤がインシュリン抗体陽性、緑がSox2遺伝子を発現している成体幹細胞）。神経細胞とβ細胞は成体ではNRSF/RESTという転写因子を発現しており（マゼンタ）、そのNRSF/REST発現陽性の細胞がインシュリン（緑）を発現していることが分かる（図１、下段）。
成体幹細胞の中で、神経幹細胞は国際的、学術的にも確立されている。1990年代に始めて明らかにされて以降、脳内で神経新生を起こす成体神経幹細胞の仕組みを解明し、創薬開発や再生医療、脳神経疾患の治療に役立てる研究が盛んに今日では行われている。
本発明者らは、内分泌器官である「成体」の膵臓にも、成体神経幹細胞と同じ未分化マーカー遺伝子（Sox2）を発現する膵臓幹細胞が存在することを明らかにさせた（図１）。Sox2遺伝子は、ES細胞でも発現する非常に高い未分化性を保持する転写因子である。トランスジェニックマウスを用いた動物個体の脳と膵臓で、その発現を確認した（Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結した遺伝子改変マウス内で、Sox2遺伝子を発現している細胞が蛍光を発する）。重要なこととして、両臓器の神経細胞及び、β細胞がともにインシュリンを発現していることである（図１、上図、赤がインシュリン抗体陽性、緑がSox2遺伝子を発現している成体幹細胞）。神経細胞とβ細胞は成体ではNRSF/RESTという転写因子を発現しており（マゼンタ）、そのNRSF/REST発現陽性の細胞がインシュリン（緑）を発現していることが分かる（図１、下段）。
２．本発明における「成体膵臓幹細胞」について
本発明において樹立された「成体膵臓幹細胞」は、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞への分化能を有し、かつ多能性を有するものである。未分化状態では、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞いずれの性質も示さず、各細胞に対応した分化処理を施すことにより、各細胞に分化する。α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞への分化は、例えば、α細胞は「グルカゴン」、β細胞は「インシュリンのC-peptide」、δ細胞は「ソマトスタチン」、γ細胞は「Pancreatic polypeptide（PP）」などの分化経路マーカーの発現により確認できる（非特許文献８）。また、得られた「膵臓幹細胞」が多能性を有していることは、「sox-2マーカー」により確認することができる。ここで、「sox-2マーカー」とは、Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結したものであり、遺伝子改変マウス内でSox2遺伝子を発現している細胞が蛍光を発することで確認できる（非特許文献７）。Sox2遺伝子配列は、公知のデータベースから入手可能であり、例えばヒトSox2遺伝子は、NM_003106（Gene Bankアクセッションナンバー）、マウスSox2遺伝子はNM_011443（Gene Bankアクセッションナンバー）である。Sox2遺伝子は、典型的な多能性を有する未分化細胞であるES細胞でも発現している遺伝子であり、未分化状態を示す幹細胞特異的な遺伝子であるとされ、当該遺伝子の発現は、成体組織幹細胞が樹立されたことを示す最もよい指標となる。本発明の実施例でも、成体膵臓幹細胞の樹立の確認は、Sox2遺伝子を発現していることを確認した実験事実に基づいて行った（図１）。また、Sox2遺伝子発現は、抗Sox2抗体によっても簡単に確認することができ、抗Sox2抗体はすでに市販されているものを用いることができる（例えば、Chemicon社製）。
なお、本発明において「成体膵臓幹細胞」というとき、典型的にはドナーとなるヒトの膵臓組織から得られた「成体膵臓幹細胞」であり、好ましくは再生治療を行う患者自身の「成体膵臓幹細胞」であることが好ましいが、ブタなど異種哺乳類由来の「成体膵臓幹細胞」であってもよい。また、マウス、ラットなどの実験動物由来、又はイヌ、ネコなどの愛玩動物由来の「成体膵臓幹細胞」であってもよい。
本発明において樹立された「成体膵臓幹細胞」は、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞への分化能を有し、かつ多能性を有するものである。未分化状態では、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞いずれの性質も示さず、各細胞に対応した分化処理を施すことにより、各細胞に分化する。α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞への分化は、例えば、α細胞は「グルカゴン」、β細胞は「インシュリンのC-peptide」、δ細胞は「ソマトスタチン」、γ細胞は「Pancreatic polypeptide（PP）」などの分化経路マーカーの発現により確認できる（非特許文献８）。また、得られた「膵臓幹細胞」が多能性を有していることは、「sox-2マーカー」により確認することができる。ここで、「sox-2マーカー」とは、Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結したものであり、遺伝子改変マウス内でSox2遺伝子を発現している細胞が蛍光を発することで確認できる（非特許文献７）。Sox2遺伝子配列は、公知のデータベースから入手可能であり、例えばヒトSox2遺伝子は、NM_003106（Gene Bankアクセッションナンバー）、マウスSox2遺伝子はNM_011443（Gene Bankアクセッションナンバー）である。Sox2遺伝子は、典型的な多能性を有する未分化細胞であるES細胞でも発現している遺伝子であり、未分化状態を示す幹細胞特異的な遺伝子であるとされ、当該遺伝子の発現は、成体組織幹細胞が樹立されたことを示す最もよい指標となる。本発明の実施例でも、成体膵臓幹細胞の樹立の確認は、Sox2遺伝子を発現していることを確認した実験事実に基づいて行った（図１）。また、Sox2遺伝子発現は、抗Sox2抗体によっても簡単に確認することができ、抗Sox2抗体はすでに市販されているものを用いることができる（例えば、Chemicon社製）。
なお、本発明において「成体膵臓幹細胞」というとき、典型的にはドナーとなるヒトの膵臓組織から得られた「成体膵臓幹細胞」であり、好ましくは再生治療を行う患者自身の「成体膵臓幹細胞」であることが好ましいが、ブタなど異種哺乳類由来の「成体膵臓幹細胞」であってもよい。また、マウス、ラットなどの実験動物由来、又はイヌ、ネコなどの愛玩動物由来の「成体膵臓幹細胞」であってもよい。
３．神経幹細胞の樹立法を用いた成体膵臓幹細胞の樹立法及び培養法
本発明では、成体の膵臓から採取した膵臓細胞から、多能性をもつ成体膵臓幹細胞を樹立したが、その際の樹立法・培養法は、基本的には、成体の神経幹細胞の樹立法・培養法（非特許文献１）を転化応用したものである。樹立した成体膵臓幹細胞は未分化状態を示す成体幹細胞特異的な遺伝子を発現する。未分化状態を保つ成体膵臓幹細胞は、ES細胞でも発現するSox2遺伝子を発現している（図１）。
具体的な手法は以下の通りであり、基本的には、上記成体神経幹細胞の樹立法・培養法に従って行った。膵臓細胞に適用するにあたっての改善点をあわせて記載する。
本発明では、成体の膵臓から採取した膵臓細胞から、多能性をもつ成体膵臓幹細胞を樹立したが、その際の樹立法・培養法は、基本的には、成体の神経幹細胞の樹立法・培養法（非特許文献１）を転化応用したものである。樹立した成体膵臓幹細胞は未分化状態を示す成体幹細胞特異的な遺伝子を発現する。未分化状態を保つ成体膵臓幹細胞は、ES細胞でも発現するSox2遺伝子を発現している（図１）。
具体的な手法は以下の通りであり、基本的には、上記成体神経幹細胞の樹立法・培養法に従って行った。膵臓細胞に適用するにあたっての改善点をあわせて記載する。
４．成体組織からの幹細胞含有細胞成分の採取
成体神経幹細胞樹立の際には、神経幹細胞存在領域をマイクロダイセクションしたのち、迅速にトリプシン酵素処理下で細胞を分散させ、次いで、37℃のCO2インキュベーター内で神経細胞培養用培地中に細胞を懸濁し、培地による洗浄を繰り返し、遠心により、神経幹細胞を含有する神経由来の細胞成分を採取する。ここで、神経細胞培養用培地としては、典型的には［DME/F12，high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加］が用いられる。
一方、膵臓の場合は、トリプシン処理では効率よい細胞の分散が行えなかったため、コラゲナーゼ処理を施すことで細胞を分散させ、また洗浄の際にも、コラゲナーゼ入り神経細胞培養用培地を用いて細胞を洗浄する。
その際のコラゲナーゼ添加量は、1 mg/mLコラゲナーゼ含有の神経培養培地で調整した溶液を10-30 mLのボリュームで使用し、上述の37℃のCO2インキュベーター内での培養およびその後の繰り返し洗浄に使用するのが好ましい。
成体神経幹細胞樹立の際には、神経幹細胞存在領域をマイクロダイセクションしたのち、迅速にトリプシン酵素処理下で細胞を分散させ、次いで、37℃のCO2インキュベーター内で神経細胞培養用培地中に細胞を懸濁し、培地による洗浄を繰り返し、遠心により、神経幹細胞を含有する神経由来の細胞成分を採取する。ここで、神経細胞培養用培地としては、典型的には［DME/F12，high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加］が用いられる。
一方、膵臓の場合は、トリプシン処理では効率よい細胞の分散が行えなかったため、コラゲナーゼ処理を施すことで細胞を分散させ、また洗浄の際にも、コラゲナーゼ入り神経細胞培養用培地を用いて細胞を洗浄する。
その際のコラゲナーゼ添加量は、1 mg/mLコラゲナーゼ含有の神経培養培地で調整した溶液を10-30 mLのボリュームで使用し、上述の37℃のCO2インキュベーター内での培養およびその後の繰り返し洗浄に使用するのが好ましい。
５．膵臓幹細胞を含有した細胞成分の培養と膵臓幹細胞の樹立
成体神経幹細胞の培養法と基本的には同じ条件下で行う。すなわち、例えば、典型的な神経幹細胞用培地である［DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加］を用いることができる。（非特許文献１など）
細胞増殖能を上昇させるためには、上記神経幹細胞培養用培地に、さらにFCS及びFGF2を添加することが好ましい。例えば、FCSを濃度1〜10％、好ましくは5％で添加すると共に、FGF2を10〜200ng/mL、好ましくは100ng/mL添加する、樹立初期特有の培養方法を続ける。
さらに、上記FCS及びFGF2を添加して約５〜８日間、好ましくは７日間培養することで十分増殖させた後に、FCSの添加をやめ、FGF2のみを添加した神経幹細胞用培地（好ましいFGF2の添加量は、10〜100ng/mL、より好ましくは20ng/mLである。）で培養すれば、成人膵臓幹細胞の未分化状態を維持し続けることができる。
これらの手法は神経幹細胞の樹立の際にも用いられる方法の１つである。しかし、神経幹細胞の場合は、FGF2と同様にEGF2にも未分化状態の維持効果があるが、膵臓幹細胞の場合は、EGF2を添加してもあまり効果が見られない。
なお、一般に、神経幹細胞など、各種幹細胞が樹立されたことは、上述のように、Sox2遺伝子が発現していることを確認して、未分化状態を示すことを確認する。膵臓幹細胞の場合、膵臓細胞が分化した状態で発現が上昇するインシュリンやグルカゴン遺伝子の発現が認められないことも同時に確認できる（図３AおよびB）。
成体神経幹細胞の培養法と基本的には同じ条件下で行う。すなわち、例えば、典型的な神経幹細胞用培地である［DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加］を用いることができる。（非特許文献１など）
細胞増殖能を上昇させるためには、上記神経幹細胞培養用培地に、さらにFCS及びFGF2を添加することが好ましい。例えば、FCSを濃度1〜10％、好ましくは5％で添加すると共に、FGF2を10〜200ng/mL、好ましくは100ng/mL添加する、樹立初期特有の培養方法を続ける。
さらに、上記FCS及びFGF2を添加して約５〜８日間、好ましくは７日間培養することで十分増殖させた後に、FCSの添加をやめ、FGF2のみを添加した神経幹細胞用培地（好ましいFGF2の添加量は、10〜100ng/mL、より好ましくは20ng/mLである。）で培養すれば、成人膵臓幹細胞の未分化状態を維持し続けることができる。
これらの手法は神経幹細胞の樹立の際にも用いられる方法の１つである。しかし、神経幹細胞の場合は、FGF2と同様にEGF2にも未分化状態の維持効果があるが、膵臓幹細胞の場合は、EGF2を添加してもあまり効果が見られない。
なお、一般に、神経幹細胞など、各種幹細胞が樹立されたことは、上述のように、Sox2遺伝子が発現していることを確認して、未分化状態を示すことを確認する。膵臓幹細胞の場合、膵臓細胞が分化した状態で発現が上昇するインシュリンやグルカゴン遺伝子の発現が認められないことも同時に確認できる（図３AおよびB）。
６．幹細胞の分化誘導と分化経路マーカーについて
成体神経幹細胞を分化させる際の手法として、神経分化誘導法やグリアへの分化誘導法など、各種神経細胞への分化方法が既に確立されている（非特許文献１、４−６など）。
本発明において、成体膵臓幹細胞を、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞それぞれに分化させるために、各種神経細胞への分化方法を適用する。このように、成体神経幹細胞の分化方法が成体膵臓幹細胞の分化方法を転化応用すれば良いことを本発明者らが今回始めて実証した。つまり、β細胞分化には神経分化の方法、α細胞の分化にはアストロサイト細胞への分化方法、δ細胞の分化には抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件、γ細胞分化にはオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件が適用できる。
具体的には、以下の通りである。
成体神経幹細胞を分化させる際の手法として、神経分化誘導法やグリアへの分化誘導法など、各種神経細胞への分化方法が既に確立されている（非特許文献１、４−６など）。
本発明において、成体膵臓幹細胞を、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞それぞれに分化させるために、各種神経細胞への分化方法を適用する。このように、成体神経幹細胞の分化方法が成体膵臓幹細胞の分化方法を転化応用すれば良いことを本発明者らが今回始めて実証した。つまり、β細胞分化には神経分化の方法、α細胞の分化にはアストロサイト細胞への分化方法、δ細胞の分化には抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件、γ細胞分化にはオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件が適用できる。
具体的には、以下の通りである。
（ａ）インシュリン産生能を有するβ細胞への分化
神経幹細胞から神経細胞への分化条件を適用することで、成体膵臓幹細胞を、インシュリン産生能を有するβ細胞に分化させることができる。基本的には、非特許文献４又は５に記載の神経細胞への分化条件に従うことが好ましい。典型的には、［RA+FSK+KCl］添加培地が用いられ、例えば、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地中に、1μMのretinoic acid (RA, シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製）及び40 mMのKCl（WAKO社製）を添加する。また、本実施例中では、神経細胞分化誘導剤として典型的に用いられる「RA+FSK+KCl」を添加する以外に、レチノイン酸（RA）単独、またはレチノイン酸＋フォスフォコリン（RA＋FSK）でも、さらにヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤の一種であるバルプロ酸（VPA）、メチル化酵素阻害剤の5AzaCもインシュリンプロモーターを活性化することを確認した（図４Ａ）。
また、脳内の神経新生領域で発現する分泌タンパク質として知られるWnt3もしくはその遺伝子又はWnt3のシグナリング促進物質を用いることでも、成体膵臓幹細胞をインシュリン産生性のβ細胞へ効率的に分化することができることを本発明において、初めて実証できた。すなわち、成体膵臓幹細胞の培地にWnt3aもしくはその活性化剤を添加するか、当該細胞内にWnt3a遺伝子を導入することでインシュリンを産生できるように分化させることができる。Wnt3aについては、下記７．で詳細に述べる。
成体膵臓幹細胞がβ細胞に分化したことを確認するためには、β細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「インシュリン」発現を抗体で確認すればよい。インシュリンが新しく生成する反応由来の「C-peptide」で発現を新規のインシュリン産生を同時に確認することもできる。例えば、インシュリン検出用の「guinea pig anti-Insulin（1:300；Sigma社製)」又はC-peptide検出用の「goat anti-C-peptide (1:250，Linco Research社製)」が好適に用いられる。また、インシュリン又はC-peptideのmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる（図３B）。
神経幹細胞から神経細胞への分化条件を適用することで、成体膵臓幹細胞を、インシュリン産生能を有するβ細胞に分化させることができる。基本的には、非特許文献４又は５に記載の神経細胞への分化条件に従うことが好ましい。典型的には、［RA+FSK+KCl］添加培地が用いられ、例えば、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地中に、1μMのretinoic acid (RA, シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製）及び40 mMのKCl（WAKO社製）を添加する。また、本実施例中では、神経細胞分化誘導剤として典型的に用いられる「RA+FSK+KCl」を添加する以外に、レチノイン酸（RA）単独、またはレチノイン酸＋フォスフォコリン（RA＋FSK）でも、さらにヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤の一種であるバルプロ酸（VPA）、メチル化酵素阻害剤の5AzaCもインシュリンプロモーターを活性化することを確認した（図４Ａ）。
また、脳内の神経新生領域で発現する分泌タンパク質として知られるWnt3もしくはその遺伝子又はWnt3のシグナリング促進物質を用いることでも、成体膵臓幹細胞をインシュリン産生性のβ細胞へ効率的に分化することができることを本発明において、初めて実証できた。すなわち、成体膵臓幹細胞の培地にWnt3aもしくはその活性化剤を添加するか、当該細胞内にWnt3a遺伝子を導入することでインシュリンを産生できるように分化させることができる。Wnt3aについては、下記７．で詳細に述べる。
成体膵臓幹細胞がβ細胞に分化したことを確認するためには、β細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「インシュリン」発現を抗体で確認すればよい。インシュリンが新しく生成する反応由来の「C-peptide」で発現を新規のインシュリン産生を同時に確認することもできる。例えば、インシュリン検出用の「guinea pig anti-Insulin（1:300；Sigma社製)」又はC-peptide検出用の「goat anti-C-peptide (1:250，Linco Research社製)」が好適に用いられる。また、インシュリン又はC-peptideのmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる（図３B）。
（ｂ）δ細胞への分化
成体膵臓幹細胞に対して、β細胞の場合と同様の神経幹細胞から神経細胞への分化条件を適用することで、δ細胞にも分化させることができるが、δ細胞の含量を高めたい場合は、神経幹細胞から抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件を適用する。基本的には、非特許文献４、５に記載の神経分化条件に従うことが好ましい。典型的には、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地中に、1μMのretinoic acid (RA、シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製）、追加的に40 mMのKCl（WAKO社製）を添加する。
成体膵臓幹細胞がδ細胞に分化したことを確認するためには、δ細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「ソマトスタチン」発現を確認すればよい。例えば、ソマトスタチン検出用の「rat anti-Somatostatin (1:300、Chemicon社製)」抗体が好適に用いられる。また、ソマトスタチンmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。
成体膵臓幹細胞に対して、β細胞の場合と同様の神経幹細胞から神経細胞への分化条件を適用することで、δ細胞にも分化させることができるが、δ細胞の含量を高めたい場合は、神経幹細胞から抑制性のインターニューロンを作製する神経分化条件を適用する。基本的には、非特許文献４、５に記載の神経分化条件に従うことが好ましい。典型的には、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地中に、1μMのretinoic acid (RA、シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製）、追加的に40 mMのKCl（WAKO社製）を添加する。
成体膵臓幹細胞がδ細胞に分化したことを確認するためには、δ細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「ソマトスタチン」発現を確認すればよい。例えば、ソマトスタチン検出用の「rat anti-Somatostatin (1:300、Chemicon社製)」抗体が好適に用いられる。また、ソマトスタチンmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。
（ｃ）α細胞への分化
神経幹細胞からアストロサイト細胞への分化条件を適用することで、成体膵臓幹細胞を、α細胞に分化させることができる。基本的には、非特許文献４−６に記載のアストロサイト細胞への分化条件に従うことが好ましい。典型的には、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地に、5%FCSまたはLIF（50 ng/mL；WAKO社製)とBMP2(50 ng/mL；WAKO社製)を添加する。
成体膵臓幹細胞がα細胞に分化したことを確認するためには、α細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「グルカゴン」発現を確認すればよい。例えば、グルカゴン検出用の「mouse anti-Glucagon (1:300、Immuno社製)」抗体での検出が好適に用いられる。また、グルカゴンmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。
神経幹細胞からアストロサイト細胞への分化条件を適用することで、成体膵臓幹細胞を、α細胞に分化させることができる。基本的には、非特許文献４−６に記載のアストロサイト細胞への分化条件に従うことが好ましい。典型的には、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地に、5%FCSまたはLIF（50 ng/mL；WAKO社製)とBMP2(50 ng/mL；WAKO社製)を添加する。
成体膵臓幹細胞がα細胞に分化したことを確認するためには、α細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「グルカゴン」発現を確認すればよい。例えば、グルカゴン検出用の「mouse anti-Glucagon (1:300、Immuno社製)」抗体での検出が好適に用いられる。また、グルカゴンmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。
（ｄ）γ細胞への分化
成体膵臓幹細胞に対して、α細胞の場合と同様の神経幹細胞からアストロサイト細胞への分化条件を適用することで、γ細胞にも分化させることができるが、γ細胞の含量を高めたい場合は、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件を適用する。基本的には、非特許文献４〜６に記載のグリア細胞、非特許文献４のオリゴデンドロサイト細胞への分化条件に従うことが好ましい。典型的には、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加, Antibiotic-Antimicotic添加培地に、1%FCSまたはIGF1 (500 ng/mLが好適。使用範囲として20−1000 ng/mL)を添加する。
成体膵臓幹細胞がγ細胞に分化したことを確認するためには、γ細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「Pancreatic polypeptide」発現を確認すればよい。例えば、Pancreatic polypeptide検出用の「guinea pig anti-Pancreatic polypeptide (1:100、Linco Research社製)」抗体が好適に用いられる。また、Pancreatic polypeptideのmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。
成体膵臓幹細胞に対して、α細胞の場合と同様の神経幹細胞からアストロサイト細胞への分化条件を適用することで、γ細胞にも分化させることができるが、γ細胞の含量を高めたい場合は、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件を適用する。基本的には、非特許文献４〜６に記載のグリア細胞、非特許文献４のオリゴデンドロサイト細胞への分化条件に従うことが好ましい。典型的には、DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加, Antibiotic-Antimicotic添加培地に、1%FCSまたはIGF1 (500 ng/mLが好適。使用範囲として20−1000 ng/mL)を添加する。
成体膵臓幹細胞がγ細胞に分化したことを確認するためには、γ細胞分化経路マーカーとして広く用いられている「Pancreatic polypeptide」発現を確認すればよい。例えば、Pancreatic polypeptide検出用の「guinea pig anti-Pancreatic polypeptide (1:100、Linco Research社製)」抗体が好適に用いられる。また、Pancreatic polypeptideのmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認することができる。
７．Wnt3a及びWnt3シグナル伝達機構（Wnt3／βcateninシグナリング）の促進物質について
Wnt3は脳内の神経新生領域で、アストロサイト細胞（GFAP陽性）が発現する分泌タンパク質で、この効果により神経幹細胞は神経新生を開始し、ニューロブラストという神経新生細胞（NeuroD1陽性）を産生する物質であるが、このWnt3が、膵臓の膵島α細胞（GFAP、Glucagon陽性）で発現していることが分かった（実施例４−２、図４A）。
また、膵臓の内分泌系は、脳内神経系と非常に高い相関が有り、β細胞内で新生している細胞は、NeuroD1陽性であるという共通点が有る（図４B−D）。NeuroD1のプロモーター上には、Wnt/βcateninシグナリングで活性化されるβcatenin/TCF/LEF転写因子が認識して結合する配列がヒト−ラット−マウスで保存されている。膵臓幹細胞をβ細胞へ分化誘導する際に、初期神経誘導条件下（ニューロブラスト産生状態）に置くと２４時間経過後には、Wnt/βcateninシグナリングで重要となるβcateninタンパク質の安定化が起きていることを、ウエスタンブロッティングで確認した（図４E）。
さらに、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の活性化にWntが必須であり、Wnt3が両遺伝子の活性化を導くことをRT-PCRで確認した（図４F）。
図４Fは、Wnt/βcateninシグナリングの活性化（試薬）でインシュリン遺伝子の発現が上昇し（Wnt3，GSK3beta-inhibitor）、対照的にWnt/βcateninシグナリングの不活性化（DnWnt;ドミナントネガティブWnt，βcatenin shRNA）でインシュリン遺伝子の発現が起きないことを示している。
NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンの活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）がWnt3で誘導されること、さらにNeuroD1がインシュリン遺伝子の活性化（インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位（E-box））部位へ、直接結合し、クロマチン（染色体）の活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）を誘導する）を導くことを示した（図４G）。
これらのことから、成体膵臓幹細胞を未分化状態に保つコントロール因子と共に、その分化制御におけるコントロール因子も、成体神経幹細胞からの神経再生制御機構ときわめて共通性が高いことが実証された。
したがって、Wnt3a自身及びWnt/βcateninシグナリングを活性化する物質は、成体膵臓幹細胞を前駆β細胞、さらにはβ細胞へと分化させるβ細胞分化誘導剤となると同時に、インシュリン遺伝子発現を活性化することができることから、これらの物質を、インシュリン産生増強用医薬組成物、糖尿病用治療薬（下記８．で詳細に述べる。）として用いることができる。具体的には、Wnt3a自身、GSK3βインヒビター、リチウム塩（リチウムはWntシグナルを特異的に活性化することで知られている）、及びβカテニンを用いることができる。なお、β細胞への分化効果、インシュリン産生増強効果のいずれに関しても、神経細胞の分化誘導剤として知られるRA（＋FA,KCl）、AzaCとVPAもWnt3aやWntシグナル活性化剤と同様な作用がある（図３D）。
Wnt3は脳内の神経新生領域で、アストロサイト細胞（GFAP陽性）が発現する分泌タンパク質で、この効果により神経幹細胞は神経新生を開始し、ニューロブラストという神経新生細胞（NeuroD1陽性）を産生する物質であるが、このWnt3が、膵臓の膵島α細胞（GFAP、Glucagon陽性）で発現していることが分かった（実施例４−２、図４A）。
また、膵臓の内分泌系は、脳内神経系と非常に高い相関が有り、β細胞内で新生している細胞は、NeuroD1陽性であるという共通点が有る（図４B−D）。NeuroD1のプロモーター上には、Wnt/βcateninシグナリングで活性化されるβcatenin/TCF/LEF転写因子が認識して結合する配列がヒト−ラット−マウスで保存されている。膵臓幹細胞をβ細胞へ分化誘導する際に、初期神経誘導条件下（ニューロブラスト産生状態）に置くと２４時間経過後には、Wnt/βcateninシグナリングで重要となるβcateninタンパク質の安定化が起きていることを、ウエスタンブロッティングで確認した（図４E）。
さらに、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の活性化にWntが必須であり、Wnt3が両遺伝子の活性化を導くことをRT-PCRで確認した（図４F）。
図４Fは、Wnt/βcateninシグナリングの活性化（試薬）でインシュリン遺伝子の発現が上昇し（Wnt3，GSK3beta-inhibitor）、対照的にWnt/βcateninシグナリングの不活性化（DnWnt;ドミナントネガティブWnt，βcatenin shRNA）でインシュリン遺伝子の発現が起きないことを示している。
NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンの活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）がWnt3で誘導されること、さらにNeuroD1がインシュリン遺伝子の活性化（インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位（E-box））部位へ、直接結合し、クロマチン（染色体）の活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）を誘導する）を導くことを示した（図４G）。
これらのことから、成体膵臓幹細胞を未分化状態に保つコントロール因子と共に、その分化制御におけるコントロール因子も、成体神経幹細胞からの神経再生制御機構ときわめて共通性が高いことが実証された。
したがって、Wnt3a自身及びWnt/βcateninシグナリングを活性化する物質は、成体膵臓幹細胞を前駆β細胞、さらにはβ細胞へと分化させるβ細胞分化誘導剤となると同時に、インシュリン遺伝子発現を活性化することができることから、これらの物質を、インシュリン産生増強用医薬組成物、糖尿病用治療薬（下記８．で詳細に述べる。）として用いることができる。具体的には、Wnt3a自身、GSK3βインヒビター、リチウム塩（リチウムはWntシグナルを特異的に活性化することで知られている）、及びβカテニンを用いることができる。なお、β細胞への分化効果、インシュリン産生増強効果のいずれに関しても、神経細胞の分化誘導剤として知られるRA（＋FA,KCl）、AzaCとVPAもWnt3aやWntシグナル活性化剤と同様な作用がある（図３D）。
Wntは、細胞外に分泌され、細胞間のシグナル伝達を司るタンパク質として複数種類（哺乳類では１９種類）存在し、線虫、ショウジョウバエからヒトに至るまで生物種を超えて保存されている。ノックアウトマウスの解析によりWntは発生初期における体軸形成や器官形成に必須な、生物学的に重要なタンパク質である。Wntにより活性化される細胞内シグナル伝達機構には、（１）βカテニン経路、（２）平面内細胞極性（PCP)経路(細胞骨格制御）、及び（３）Ca2+経路(細胞運動制御）の３種類が存在するが、本発明において「Wntシグナル伝達機構」又は「Wnt/βcateninシグナリング」というときは、βカテニン転写因子（非特許文献８）を介した「βカテニン経路」を指す。
Wnt3aは、典型的なWntであり、幹細胞、特に造血幹細胞の増殖および自己再生を含む多数の発達イベントに関与することが知られており、本発明において、成体膵臓幹細胞からβ細胞への分化を誘導する物質であることが見出された。
Wnt3aをインシュリン産生β細胞への分化誘導剤として用いる場合、成体の膵臓組織に対して、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を含む発現ベクターなどを直接導入することも考えられるが、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を常法により作用させた成体膵臓幹細胞、β前駆細胞を膵臓組織に移植する手法が好ましい。
その際に用いるWnt3aタンパク質としては、生体試料から精製されたもの、化学合成されたものや遺伝子組み換えによって製造されたものを用いることができ、市販Wnt3aを用いることもできる。Wnt3aは保存性が高いので、由来の生物種はいずれのものであってもよいが、医薬製剤として用いる場合は対象生物種と同一の生物種由来のものが好ましい。また、Wnt3aタンパク質におけるWntシグナル伝達機構に関与する領域は古くから研究され、ほぼ解明されており（非特許文献９）、当該領域が含まれていれば、Wnt3aタンパク質及びその遺伝子の全長でなく部分配列であってもよい。
Wnt3a遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生来のプロモーターと共に、もしくは強力な公知プロモーター（例えばCAGプロモーターやCMVプロモーター）などに繋いで、生理学的に受容可能なキャリアと共にそのまま導入してもよいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各種の公知ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV) ベクターやレンチウイルスベクター）を用いて導入することができる。
なお、「Wnt3a遺伝子」というとき、Wnt3aタンパク質をコードするDNA又はmRNAを指し、Wnt3a遺伝子配列は、公知のデータベースから入手可能であり、例えばヒトWnt3a遺伝子は、NM_033131（Gene Bankアクセッションナンバー）、マウスWnt3a遺伝子はNM_009522（Gene Bankアクセッションナンバー）である。
また、公知のWnt3a活性化剤（Wnt3aの活性を増加させるような化合物やWnt3a 転写を活性化するような化合物）、例えば、Wntのシグナル伝達機構を促進することが知られているグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）インヒビターであるAR-A014418（J. Biol. Chem., Vol. 278, No. 46, p45937-45945, 2003）やCT 99021 - CHIR 99021（Axon Ligands社製やSTEMGENT社製）、リチウム塩(Lithium Chloride, Wakoやシグマ社製；)βカテニン（Proc.Natl.Acad.Sci. USA, Vol.97. 4262-4266, 2000 ）を用いることができる。また、図３Ｄに示されるインシュリン遺伝子発現増強効果が確認された、レチノイン酸（RA）は単独でも、フォスフォコリン（FSK）と共に、さらにKCl塩と共に用いることができ、神経分化誘導剤のバルプロ酸ナトリウム（VPA）や５AzaCも用いられる。
なお、本発明の実施例４で用いた、Wnt3aのドミナントネガティブタンパク質（dnWnt）は、Wnt3aの作用領域を改変して機能不全タンパク質をコードする遺伝子をレンチウイルスベクター（Lie DC et al. Nature 437, 1370-1375. (2005)）に組み込み発現させたものを用いている。
Wnt3aは、典型的なWntであり、幹細胞、特に造血幹細胞の増殖および自己再生を含む多数の発達イベントに関与することが知られており、本発明において、成体膵臓幹細胞からβ細胞への分化を誘導する物質であることが見出された。
Wnt3aをインシュリン産生β細胞への分化誘導剤として用いる場合、成体の膵臓組織に対して、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を含む発現ベクターなどを直接導入することも考えられるが、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を常法により作用させた成体膵臓幹細胞、β前駆細胞を膵臓組織に移植する手法が好ましい。
その際に用いるWnt3aタンパク質としては、生体試料から精製されたもの、化学合成されたものや遺伝子組み換えによって製造されたものを用いることができ、市販Wnt3aを用いることもできる。Wnt3aは保存性が高いので、由来の生物種はいずれのものであってもよいが、医薬製剤として用いる場合は対象生物種と同一の生物種由来のものが好ましい。また、Wnt3aタンパク質におけるWntシグナル伝達機構に関与する領域は古くから研究され、ほぼ解明されており（非特許文献９）、当該領域が含まれていれば、Wnt3aタンパク質及びその遺伝子の全長でなく部分配列であってもよい。
Wnt3a遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生来のプロモーターと共に、もしくは強力な公知プロモーター（例えばCAGプロモーターやCMVプロモーター）などに繋いで、生理学的に受容可能なキャリアと共にそのまま導入してもよいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各種の公知ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV) ベクターやレンチウイルスベクター）を用いて導入することができる。
なお、「Wnt3a遺伝子」というとき、Wnt3aタンパク質をコードするDNA又はmRNAを指し、Wnt3a遺伝子配列は、公知のデータベースから入手可能であり、例えばヒトWnt3a遺伝子は、NM_033131（Gene Bankアクセッションナンバー）、マウスWnt3a遺伝子はNM_009522（Gene Bankアクセッションナンバー）である。
また、公知のWnt3a活性化剤（Wnt3aの活性を増加させるような化合物やWnt3a 転写を活性化するような化合物）、例えば、Wntのシグナル伝達機構を促進することが知られているグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）インヒビターであるAR-A014418（J. Biol. Chem., Vol. 278, No. 46, p45937-45945, 2003）やCT 99021 - CHIR 99021（Axon Ligands社製やSTEMGENT社製）、リチウム塩(Lithium Chloride, Wakoやシグマ社製；)βカテニン（Proc.Natl.Acad.Sci. USA, Vol.97. 4262-4266, 2000 ）を用いることができる。また、図３Ｄに示されるインシュリン遺伝子発現増強効果が確認された、レチノイン酸（RA）は単独でも、フォスフォコリン（FSK）と共に、さらにKCl塩と共に用いることができ、神経分化誘導剤のバルプロ酸ナトリウム（VPA）や５AzaCも用いられる。
なお、本発明の実施例４で用いた、Wnt3aのドミナントネガティブタンパク質（dnWnt）は、Wnt3aの作用領域を改変して機能不全タンパク質をコードする遺伝子をレンチウイルスベクター（Lie DC et al. Nature 437, 1370-1375. (2005)）に組み込み発現させたものを用いている。
８．成体膵臓幹細胞を用いた、膵臓細胞移植治療方法について
成体の膵臓の膵尾部分に多く含まれる膵島を抽出し、そこから本件の技術を用いて成体膵臓幹細胞を樹立する。市販のコラーゲンシート（例；コラーゲンビトリゲル（旭テクノグラス株式会社））などの生体適合性シート上で本件に記述されたようなβ細胞分化を促す薬剤（すなわち、神経系細胞分化を促進する薬剤）処理を施して培養し、複数の成体膵臓幹細胞培養コラーゲンシートを、患者本人の膵臓に移植して戻す方法が考えられる。例えば重度の合併症を起こす前の糖尿病患者などが対象としてあげられる。患者本人の細胞を使うため、ドナーや移植に伴う拒絶反応の心配が無い。β細胞分化を促す薬剤処理として、上記６．（ａ）記載の神経分化を促進する薬剤（1μMのretinoic acid（RA、シグマ社製）、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl（WAKO社製））や、上記７．記載のWntシグナリングを活性化する薬剤遺伝子（Wnt3A，beta-catenin，GSK3betaインヒビター、リチウム塩など）、またこれまでに開発されている神経分化を誘導する薬剤（抗てんかん薬として知られるVPA；バルプロ酸ナトリウム、TSA；トリコスタチンA）なども用いることができる（図３D）。
また、シートを用いる手法の他、成体膵臓幹細胞を、遠心分離した細胞単独で、又は上記神経分化を促進もしくは誘導する薬剤を含有する培養液と共に、注射器などにより膵臓組織（患部）に直接注入する手法を採ることもできる。
成体の膵臓の膵尾部分に多く含まれる膵島を抽出し、そこから本件の技術を用いて成体膵臓幹細胞を樹立する。市販のコラーゲンシート（例；コラーゲンビトリゲル（旭テクノグラス株式会社））などの生体適合性シート上で本件に記述されたようなβ細胞分化を促す薬剤（すなわち、神経系細胞分化を促進する薬剤）処理を施して培養し、複数の成体膵臓幹細胞培養コラーゲンシートを、患者本人の膵臓に移植して戻す方法が考えられる。例えば重度の合併症を起こす前の糖尿病患者などが対象としてあげられる。患者本人の細胞を使うため、ドナーや移植に伴う拒絶反応の心配が無い。β細胞分化を促す薬剤処理として、上記６．（ａ）記載の神経分化を促進する薬剤（1μMのretinoic acid（RA、シグマ社製）、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl（WAKO社製））や、上記７．記載のWntシグナリングを活性化する薬剤遺伝子（Wnt3A，beta-catenin，GSK3betaインヒビター、リチウム塩など）、またこれまでに開発されている神経分化を誘導する薬剤（抗てんかん薬として知られるVPA；バルプロ酸ナトリウム、TSA；トリコスタチンA）なども用いることができる（図３D）。
また、シートを用いる手法の他、成体膵臓幹細胞を、遠心分離した細胞単独で、又は上記神経分化を促進もしくは誘導する薬剤を含有する培養液と共に、注射器などにより膵臓組織（患部）に直接注入する手法を採ることもできる。
９．インシュリン増強用医薬組成物、糖尿病治療用組成物、又は神経疾患治療用組成物としての製剤化、及び投与方法
特に、インシュリンを産生するβ細胞への分化作用のある、RA（＋FSK,KCl）、VPA、5AzaCなどの神経分化誘導剤、Wnt3aもしくはその活性化剤（GSK3βインヒビター、リチウム塩）、又はIGFBP-4インヒビターは、分化後のインシュリン産生も増強できるので、糖尿病用治療薬として有効であり、Ｉ型糖尿病用、II型糖尿病用のいずれにも効果が期待できる。
本発明の医薬組成物は、移植用の膵臓幹細胞と共に膵臓の患部に直接注入するか、又はin vitroで膵臓幹細胞又はそれを分化させた前駆β細胞などに注入して移植する方法を用いることもできる。一般的には、コラーゲンシートなど移植用の生体適合性シート上で膵臓幹細胞を上記分化誘導剤と共に培養し、β前駆細胞にまで分化させた後にシートごと患部に移植するのが最も効率的であるので、その際の培地中に添加するか、その膵臓幹細胞に導入するのが一般的である。本発明で生体適合性シートというとき、典型的にはコラーゲンシートであるが、コラーゲンマトリックスやコラーゲンスポンジを用いることもでき、その際の材質としては生体適合性材料製、例えば周知の生体適合性合成樹脂製であってもよい。
したがって、本発明でインシュリン増強用医薬組成物、糖尿病再生治療用組成物というとき、単に上述のβ細胞分化誘導剤を有効成分とする医薬組成物のみならず、移植用シート上の成体膵臓幹細胞も含めた移植用キットを含む場合も包含し、さらに、成体膵臓幹細胞をあらかじめ移植用シート上で、上述のβ細胞分化誘導剤存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させた状態の移植用シート上の細胞を含めることもある。反対に、成体膵臓幹細胞をあらかじめβ前駆細胞にまで分化させた後にシートごと患部に移植する場合には、上述のインシュリン産生増強効果のあるβ細胞分化誘導剤を同時に患部に導入することは好ましいが必須ではないので、その場合は、β前駆細胞及び移植用シートを含む組成物を、インシュリン増強用医薬組成物、糖尿病治療用組成物と呼ぶこともできる。
さらに、成体膵臓幹細胞は、下記１０．で述べるように、成体神経幹細胞に代えて、神経組織の再生用移植治療に用いることができるので、上記のインシュリン増強用医薬組成物、又は糖尿病治療用組成物は、すべて神経系疾患治療用の神経組織の再生治療用組成物として用いることができる。
そして、いずれの場合も、好ましくは通常の注射製剤などと同様、無菌の水溶液に溶解、又は懸濁し、薬学的に許容される安定化剤、等張化剤、緩衝剤などが配合される。また、遺伝子製剤の場合は、常法に従い、核内に遺伝子を運搬するためのキャリアが併用されることが好ましい。生理学的に受容可能なキャリアとしては、リポフェクタミン（Invitrogen社）などの遺伝子導入用カチオン性脂質などがある。
遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生来のプロモーターと共に、もしくは強力な公知プロモーター（例えばCAGプロモーターやCMVプロモーター）などに繋いで、生理学的に受容可能なキャリアと共にそのまま導入してもよいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各種の公知ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を用いて導入する。
また、公知のインシュリン製剤又はアディポネクチン製剤などの公知インシュリン産生増強剤を併用することもできる。
本発明の医薬有効投与量および投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり1μｇ/kg〜10mg/kgである。
特に、インシュリンを産生するβ細胞への分化作用のある、RA（＋FSK,KCl）、VPA、5AzaCなどの神経分化誘導剤、Wnt3aもしくはその活性化剤（GSK3βインヒビター、リチウム塩）、又はIGFBP-4インヒビターは、分化後のインシュリン産生も増強できるので、糖尿病用治療薬として有効であり、Ｉ型糖尿病用、II型糖尿病用のいずれにも効果が期待できる。
本発明の医薬組成物は、移植用の膵臓幹細胞と共に膵臓の患部に直接注入するか、又はin vitroで膵臓幹細胞又はそれを分化させた前駆β細胞などに注入して移植する方法を用いることもできる。一般的には、コラーゲンシートなど移植用の生体適合性シート上で膵臓幹細胞を上記分化誘導剤と共に培養し、β前駆細胞にまで分化させた後にシートごと患部に移植するのが最も効率的であるので、その際の培地中に添加するか、その膵臓幹細胞に導入するのが一般的である。本発明で生体適合性シートというとき、典型的にはコラーゲンシートであるが、コラーゲンマトリックスやコラーゲンスポンジを用いることもでき、その際の材質としては生体適合性材料製、例えば周知の生体適合性合成樹脂製であってもよい。
したがって、本発明でインシュリン増強用医薬組成物、糖尿病再生治療用組成物というとき、単に上述のβ細胞分化誘導剤を有効成分とする医薬組成物のみならず、移植用シート上の成体膵臓幹細胞も含めた移植用キットを含む場合も包含し、さらに、成体膵臓幹細胞をあらかじめ移植用シート上で、上述のβ細胞分化誘導剤存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させた状態の移植用シート上の細胞を含めることもある。反対に、成体膵臓幹細胞をあらかじめβ前駆細胞にまで分化させた後にシートごと患部に移植する場合には、上述のインシュリン産生増強効果のあるβ細胞分化誘導剤を同時に患部に導入することは好ましいが必須ではないので、その場合は、β前駆細胞及び移植用シートを含む組成物を、インシュリン増強用医薬組成物、糖尿病治療用組成物と呼ぶこともできる。
さらに、成体膵臓幹細胞は、下記１０．で述べるように、成体神経幹細胞に代えて、神経組織の再生用移植治療に用いることができるので、上記のインシュリン増強用医薬組成物、又は糖尿病治療用組成物は、すべて神経系疾患治療用の神経組織の再生治療用組成物として用いることができる。
そして、いずれの場合も、好ましくは通常の注射製剤などと同様、無菌の水溶液に溶解、又は懸濁し、薬学的に許容される安定化剤、等張化剤、緩衝剤などが配合される。また、遺伝子製剤の場合は、常法に従い、核内に遺伝子を運搬するためのキャリアが併用されることが好ましい。生理学的に受容可能なキャリアとしては、リポフェクタミン（Invitrogen社）などの遺伝子導入用カチオン性脂質などがある。
遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生来のプロモーターと共に、もしくは強力な公知プロモーター（例えばCAGプロモーターやCMVプロモーター）などに繋いで、生理学的に受容可能なキャリアと共にそのまま導入してもよいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各種の公知ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を用いて導入する。
また、公知のインシュリン製剤又はアディポネクチン製剤などの公知インシュリン産生増強剤を併用することもできる。
本発明の医薬有効投与量および投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり1μｇ/kg〜10mg/kgである。
１０．成体膵臓幹細胞を用いた、神経系再生用移植治療方法について
成体の膵臓の膵尾部分に多く含まれる膵島を部分結紮して抽出し、そこから本件の技術を用いて成体膵臓幹細胞を樹立する。コラーゲンシート上で本件に記述されたようなβ細胞分化を促す薬剤処理を施して培養し、複数の成体膵臓幹細胞培養コラーゲンシートを、患者本人の神経疾患部位に移植して戻す方法が考えられる。また、コラーゲンシートを用いずに、この細胞培養物を神経損傷部位に直接インジェクションする方法も考えられる。上述と同様、患者本人の細胞を使うため、ドナーや移植に伴う拒絶反応の心配が無い。神経分化を促す薬剤処理として、上述の神経分化を促進する薬剤（1μMのretinoic acid（RA、シグマ社製）、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl（WAKO社製））や、Wntシグナリングを活性化する薬剤遺伝子（Wnt3A，beta-catenin，GSK3betaインヒビターなど）、またこれまでに開発されている神経分化を誘導する薬剤（抗てんかん薬として知られるVPA；バルプロ酸ナトリウム、TSA；トリコスタチンA）なども用いることができる。
成体の膵臓の膵尾部分に多く含まれる膵島を部分結紮して抽出し、そこから本件の技術を用いて成体膵臓幹細胞を樹立する。コラーゲンシート上で本件に記述されたようなβ細胞分化を促す薬剤処理を施して培養し、複数の成体膵臓幹細胞培養コラーゲンシートを、患者本人の神経疾患部位に移植して戻す方法が考えられる。また、コラーゲンシートを用いずに、この細胞培養物を神経損傷部位に直接インジェクションする方法も考えられる。上述と同様、患者本人の細胞を使うため、ドナーや移植に伴う拒絶反応の心配が無い。神経分化を促す薬剤処理として、上述の神経分化を促進する薬剤（1μMのretinoic acid（RA、シグマ社製）、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl（WAKO社製））や、Wntシグナリングを活性化する薬剤遺伝子（Wnt3A，beta-catenin，GSK3betaインヒビターなど）、またこれまでに開発されている神経分化を誘導する薬剤（抗てんかん薬として知られるVPA；バルプロ酸ナトリウム、TSA；トリコスタチンA）なども用いることができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は特にこれら実施例に限定されるものではない。
なお、本発明の実施例で用いた遺伝子組換え技術、PCR法、その他の手法などの具体的な手順や条件は、特に断らない限り、Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed.,"Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, PartB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法により行うことができる。
また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、本明細書の記載として組み入れるものとする。
なお、本発明の実施例で用いた遺伝子組換え技術、PCR法、その他の手法などの具体的な手順や条件は、特に断らない限り、Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed.,"Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, PartB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法により行うことができる。
また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、本明細書の記載として組み入れるものとする。
（実施例１）成体内の神経幹細胞及び膵臓幹細胞の存在の確認
Sox2遺伝子は、ES細胞でも発現する非常に高い未分化性を保持する転写因子であり、多能性を有する幹細胞の存在を確認するマーカーとなる。脳内の神経幹細胞存在領域として広く知られている海馬領域でのSox2遺伝子の発現も周知であった。この実施例１では、Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結し、導入したトランスジェニックマウスを観察したところ、当該マウスの脳と膵臓で、その発現を確認した。その際の組換えベクターの製法、導入量などの実験条件は、非特許文献５に従った。また、同時に、両臓器の分化した神経細胞及び、β細胞がともにインシュリンを発現していることも確認した（図１、上図、点線枠内がインシュリン抗体陽性、矢印で示した細胞がSox2遺伝子を発現している成体幹細胞）。神経細胞とβ細胞は成体ではNRSF/RESTという転写因子を発現しており（下段、矢印。細胞核内）、そのNRSF/REST発現陽性の細胞がインシュリン（同、矢印で示した細胞。細胞質でインシュリン産生）を発現していることが分かる（図１、下段）。
Sox2遺伝子は、ES細胞でも発現する非常に高い未分化性を保持する転写因子であり、多能性を有する幹細胞の存在を確認するマーカーとなる。脳内の神経幹細胞存在領域として広く知られている海馬領域でのSox2遺伝子の発現も周知であった。この実施例１では、Sox2プロモーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連結し、導入したトランスジェニックマウスを観察したところ、当該マウスの脳と膵臓で、その発現を確認した。その際の組換えベクターの製法、導入量などの実験条件は、非特許文献５に従った。また、同時に、両臓器の分化した神経細胞及び、β細胞がともにインシュリンを発現していることも確認した（図１、上図、点線枠内がインシュリン抗体陽性、矢印で示した細胞がSox2遺伝子を発現している成体幹細胞）。神経細胞とβ細胞は成体ではNRSF/RESTという転写因子を発現しており（下段、矢印。細胞核内）、そのNRSF/REST発現陽性の細胞がインシュリン（同、矢印で示した細胞。細胞質でインシュリン産生）を発現していることが分かる（図１、下段）。
（実施例２）膵臓からの幹細胞含有細胞成分の採取
Fisher344成体ラット（７週齢）から成体膵臓を取り出し、ブレードカッターにより十分なマイクロダイセクションを施した後、コラゲナーゼを添加した神経幹細胞培養用培地［DME/F12, high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加］中で、３７℃のCO2インキュベーター内で３０分から４５分間、定期的に撹拌しながら細胞を懸濁した。次いで、細胞成分を遠心処理で集め（遠心数1000rpm、２分）、新たなコラゲナーゼ入り神経幹細胞培養用培地で洗浄し、当該培地中で撹拌懸濁する、という工程を計３回繰り返した。
Fisher344成体ラット（７週齢）から成体膵臓を取り出し、ブレードカッターにより十分なマイクロダイセクションを施した後、コラゲナーゼを添加した神経幹細胞培養用培地［DME/F12, high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加］中で、３７℃のCO2インキュベーター内で３０分から４５分間、定期的に撹拌しながら細胞を懸濁した。次いで、細胞成分を遠心処理で集め（遠心数1000rpm、２分）、新たなコラゲナーゼ入り神経幹細胞培養用培地で洗浄し、当該培地中で撹拌懸濁する、という工程を計３回繰り返した。
（実施例３）膵臓幹細胞の樹立
実施例２の方法により、1000rpmで２分間遠心後の細胞成分を、神経幹細胞を培養する際に用いる、特殊コートを施した培養用ディッシュ［市販の細胞培養用ディッシュ／プレートを、PORN（poly-L-ornithine）で２４時間室温でコート（第１コート）し、その後滅菌済み超純水で２回以上洗浄し、LamininをPBSに溶解した第２コート液で３７℃のCO2インキュベーター内で２４時間コートしたもの］に撒いた。
細胞増殖を上昇させるため、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地と、100ng/mL FGF2および100ng/mL EGF2を添加した神経幹細胞培養用培地、100ng/mL FGF2のみを添加した神経幹細胞培養用培地中で、細胞培養を行った。数日後に全ての条件下から新たな細胞の増殖が開始されたことを確認した。最も増殖が促進された、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地での培養は、一週間後にFCSの添加を中止してFGF2のみの添加に切り替えた。これは神経幹細胞の樹立の際に用いられる方法で、一旦増殖を開始させた神経幹細胞は20ng/mLのFGF2存在下で未分化性を効率よく維持できる知見に基づく。しかし、同様に神経幹細胞の未分化維持に効果があるとされるEGF2については、膵臓幹細胞の培養培地中に添加してみても、FGF2の場合のような効果は見られなかった（図示せず）。
樹立した成体膵臓幹細胞は20 ng/mLFGF2を添加した神経幹細胞培養用培地（DME/F12，high glucose（1mM L-glutamine）、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加）で培養し、継代可能であることも確認した（図２、P１）。
実施例２の方法により、1000rpmで２分間遠心後の細胞成分を、神経幹細胞を培養する際に用いる、特殊コートを施した培養用ディッシュ［市販の細胞培養用ディッシュ／プレートを、PORN（poly-L-ornithine）で２４時間室温でコート（第１コート）し、その後滅菌済み超純水で２回以上洗浄し、LamininをPBSに溶解した第２コート液で３７℃のCO2インキュベーター内で２４時間コートしたもの］に撒いた。
細胞増殖を上昇させるため、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地と、100ng/mL FGF2および100ng/mL EGF2を添加した神経幹細胞培養用培地、100ng/mL FGF2のみを添加した神経幹細胞培養用培地中で、細胞培養を行った。数日後に全ての条件下から新たな細胞の増殖が開始されたことを確認した。最も増殖が促進された、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地での培養は、一週間後にFCSの添加を中止してFGF2のみの添加に切り替えた。これは神経幹細胞の樹立の際に用いられる方法で、一旦増殖を開始させた神経幹細胞は20ng/mLのFGF2存在下で未分化性を効率よく維持できる知見に基づく。しかし、同様に神経幹細胞の未分化維持に効果があるとされるEGF2については、膵臓幹細胞の培養培地中に添加してみても、FGF2の場合のような効果は見られなかった（図示せず）。
樹立した成体膵臓幹細胞は20 ng/mLFGF2を添加した神経幹細胞培養用培地（DME/F12，high glucose（1mM L-glutamine）、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加）で培養し、継代可能であることも確認した（図２、P１）。
（実施例４）成体膵臓幹細胞の分化制御機構の解析
実施例３で樹立した成体膵臓幹細胞を用いて、分化制御機構の解析を行った。神経幹細胞はSox2遺伝子を発現し、多能性を保持した未分化状態に保つことができる。樹立した膵臓幹細胞を、神経幹細胞の分化調節制御機構を参考に、未分化状態と分化状態に分けて免疫染色解析を行った（図３A）。
FGF２存在下では、成体膵臓幹細胞は神経幹細胞と同様にSox2遺伝子を発現し、β細胞が発現するインシュリンやα細胞が発現するGlucagon遺伝子を発現していないことを抗Sox2抗体、抗インシュリン抗体（guinea pig anti-Insulin；1:300；Sigma社製、以下同様。)及び抗Glucagon抗体（mouse anti-Glucagon；1:300，Immuno社製、以下同様。)を用いる免疫染色法で確認した。
実施例３で樹立した成体膵臓幹細胞を用いて、分化制御機構の解析を行った。神経幹細胞はSox2遺伝子を発現し、多能性を保持した未分化状態に保つことができる。樹立した膵臓幹細胞を、神経幹細胞の分化調節制御機構を参考に、未分化状態と分化状態に分けて免疫染色解析を行った（図３A）。
FGF２存在下では、成体膵臓幹細胞は神経幹細胞と同様にSox2遺伝子を発現し、β細胞が発現するインシュリンやα細胞が発現するGlucagon遺伝子を発現していないことを抗Sox2抗体、抗インシュリン抗体（guinea pig anti-Insulin；1:300；Sigma社製、以下同様。)及び抗Glucagon抗体（mouse anti-Glucagon；1:300，Immuno社製、以下同様。)を用いる免疫染色法で確認した。
次いで、膵臓幹細胞を神経分化条件下（非特許文献４、５)の神経分化条件下、すなわち1μM のretinoic acid（RA、シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl（WAKO社製）を含むDME/F12，high glucose（1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地（RA＋FSK＋KCl）を用いて培養すると、β細胞への分化が促進され、インシュリン遺伝子の発現の上昇とともに、細胞表面に神経突起のようなプロセスを伸長させた。
δ細胞特異的なソマトスタチン遺伝子の発現の上昇も抗ソマトスタチン抗体（rat anti-Somatostatin；1:300，Chemicon社製、以下同様。）で確認できた。
一方、細胞をアストロサイト分化条件下（非特許文献４〜６による。）のアストロサイト分化条件下、すなわち50 ng/mLのLIF（WAKO社製）及び50 ng/mLのBMP（WAKO社製）を含む培地を用いて培養すると、α細胞への分化が促進され、Glucagon遺伝子の発現が上昇した（抗Glucagon抗体により確認）。この際、幾つかの膵島構造が出現し、一部でγ細胞の発現も上昇することがPancreatic polypeptide遺伝子の免疫染色解析から確認できた。γ細胞含有度を高めたければ、オリゴデンドロサイト細胞分化条件（500ng/mL IGF-I（WAKO社製）入りのDME/F12, high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地）を用いる。
これらの抗体によるタンパク質の発現のみでなく、細胞抽出RNAを用いたRT-PCRからも、未分化、β細胞誘導、α細胞への誘導が行えること、その条件が神経幹細胞の未分化性の維持（FGF２存在下）、神経分化誘導（RA＋FSK＋KCl）、アストロサイト分化誘導（グリア細胞誘導；LIF＋BMP）条件を疑似する条件で行えることを実証した（図３B）。
δ細胞特異的なソマトスタチン遺伝子の発現の上昇も抗ソマトスタチン抗体（rat anti-Somatostatin；1:300，Chemicon社製、以下同様。）で確認できた。
一方、細胞をアストロサイト分化条件下（非特許文献４〜６による。）のアストロサイト分化条件下、すなわち50 ng/mLのLIF（WAKO社製）及び50 ng/mLのBMP（WAKO社製）を含む培地を用いて培養すると、α細胞への分化が促進され、Glucagon遺伝子の発現が上昇した（抗Glucagon抗体により確認）。この際、幾つかの膵島構造が出現し、一部でγ細胞の発現も上昇することがPancreatic polypeptide遺伝子の免疫染色解析から確認できた。γ細胞含有度を高めたければ、オリゴデンドロサイト細胞分化条件（500ng/mL IGF-I（WAKO社製）入りのDME/F12, high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地）を用いる。
これらの抗体によるタンパク質の発現のみでなく、細胞抽出RNAを用いたRT-PCRからも、未分化、β細胞誘導、α細胞への誘導が行えること、その条件が神経幹細胞の未分化性の維持（FGF２存在下）、神経分化誘導（RA＋FSK＋KCl）、アストロサイト分化誘導（グリア細胞誘導；LIF＋BMP）条件を疑似する条件で行えることを実証した（図３B）。
さらに、未分化状態ではα細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞の指示マーカーが陰性であることに比較し、分化誘導下では対照的に全ての分化経路マーカーの発現が上昇することから、樹立した細胞が膵臓幹細胞の多能性を保持していることを示した。図３Cの免疫組織染色解析により、δ細胞（ソマトスタチン）は脳神経でのInterneuron（興奮性の神経刺激を抑制する神経）に特異的な分布を示し、δ細胞が神経誘導条件下で発現が上昇する背景が判明した。さらに、γ細胞（Pancreatic polypeptide）は、脳神経でオリゴデンドロサイトのマーカーであるGSTπと疑似する分布を示し、γ細胞がグリア細胞誘導条件下で発現が上昇する背景も判明した。これらの知見は、脳神経の細胞群（神経幹細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞）と膵臓内分泌系の細胞群（膵臓幹細胞、β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞）の発現する遺伝子に非常に高い相関が有る学術的意義を示しており、β細胞誘導には、従来の神経促進／誘導薬が転化使用できることを示唆している。レポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子をインシュリンプロモーターの下流に連結したアッセイ系で解析したところ、実際に、RA＋FSK＋KClという神経分化促進条件のみでなく、RA単独、RA＋FSK、VPA、5AzaC、Wnt3などの他の神経分化促進薬剤を用いた場合でもインシュリンプロモーターの活性が上昇することが、本発明の膵臓幹細胞培養系（神経幹細胞培養用培地中）での培養により確認できた（図３D）。
（実施例４）成体内の神経幹細胞及び膵臓幹細胞の培養工程と分化工程の類似性
（４−１）未分化状態を維持した培養工程
Sox2遺伝子は未分化状態を保つ機能をもつが、FGF2というgrowth factor存在下で培養することで、神経幹細胞及び膵臓幹細胞のいずれもの未分化状態が維持される。神経幹細胞と膵臓幹細胞を、神経幹細胞を培養する条件で培養し、細胞からtotal RNAを抽出、精製し、RT-PCR（mRNAの発現を調べる分子生物学的手法）を行った結果を図３Bに示す。具体的な培養条件は、DME/F12培地中, high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加, Antibiotic-Antimicotic添加という条件で、ともに、特殊コート［市販の細胞培養用ディッシュ／プレートを、PORN（poly-L-ornithine）で２４時間室温でコート（第１コート）、その後滅菌済み超純水で２回以上洗浄し、LamininをPBSに溶解した第２コート液で、３７℃CO2インキュベーター内で２４時間コートしたもの］を施した培養用ディッシュ上で培養した。この条件で、両細胞はFGF2というgrowth factor存在下でSox2遺伝子を発現する（図３B、上から２段目）。
細胞増殖を上昇させるため、両細胞に対して、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地と、100ng/mL FGF2および100ng/mL EGF2を添加した神経幹細胞培養用培地、100ng/mL FGF2のみを添加した神経幹細胞培養用培地中で、細胞培養を行った。数日後に全ての条件下から新たな細胞の増殖が開始されたことを確認した。一旦増殖を開始させた神経幹細胞については、10％FCSに加えて20ng/mLのFGF2を存在させることで、未分化性を効率よく維持できる。膵臓幹細胞培地についても最も増殖が促進されたクローンに対し、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地で培養した。両者とも、一週間後にFCSの添加を中止してFGF2のみの添加に切り替えた。なお、神経幹細胞の場合は、FGF2に代えてEGF2を用いても同様に未分化維持に効果があるが、膵臓幹細胞の培養培地中に添加してみても効果は見られなかった（図示せず）。
樹立した成体膵臓幹細胞について、20 ng/mLFGF2を添加した神経幹細胞培養用培地(DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加)で培養し、継代可能であることも上記実施例３において確認した（図２、P１）。
（４−１）未分化状態を維持した培養工程
Sox2遺伝子は未分化状態を保つ機能をもつが、FGF2というgrowth factor存在下で培養することで、神経幹細胞及び膵臓幹細胞のいずれもの未分化状態が維持される。神経幹細胞と膵臓幹細胞を、神経幹細胞を培養する条件で培養し、細胞からtotal RNAを抽出、精製し、RT-PCR（mRNAの発現を調べる分子生物学的手法）を行った結果を図３Bに示す。具体的な培養条件は、DME/F12培地中, high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supplement添加, Antibiotic-Antimicotic添加という条件で、ともに、特殊コート［市販の細胞培養用ディッシュ／プレートを、PORN（poly-L-ornithine）で２４時間室温でコート（第１コート）、その後滅菌済み超純水で２回以上洗浄し、LamininをPBSに溶解した第２コート液で、３７℃CO2インキュベーター内で２４時間コートしたもの］を施した培養用ディッシュ上で培養した。この条件で、両細胞はFGF2というgrowth factor存在下でSox2遺伝子を発現する（図３B、上から２段目）。
細胞増殖を上昇させるため、両細胞に対して、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地と、100ng/mL FGF2および100ng/mL EGF2を添加した神経幹細胞培養用培地、100ng/mL FGF2のみを添加した神経幹細胞培養用培地中で、細胞培養を行った。数日後に全ての条件下から新たな細胞の増殖が開始されたことを確認した。一旦増殖を開始させた神経幹細胞については、10％FCSに加えて20ng/mLのFGF2を存在させることで、未分化性を効率よく維持できる。膵臓幹細胞培地についても最も増殖が促進されたクローンに対し、10％FCSと100ng/mL FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地で培養した。両者とも、一週間後にFCSの添加を中止してFGF2のみの添加に切り替えた。なお、神経幹細胞の場合は、FGF2に代えてEGF2を用いても同様に未分化維持に効果があるが、膵臓幹細胞の培養培地中に添加してみても効果は見られなかった（図示せず）。
樹立した成体膵臓幹細胞について、20 ng/mLFGF2を添加した神経幹細胞培養用培地(DME/F12，high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加)で培養し、継代可能であることも上記実施例３において確認した（図２、P１）。
（４−２）分化制御機構の解析
成体神経幹細胞と共に成体膵臓幹細胞が樹立できたため、両者の分化制御機構の解析を行った。
多能性を保持した未分化状態に保つことはSox2遺伝子の発現により確認できるので、非特許文献４、５に記載される公知の神経幹細胞の分化調節制御機構を参考に、樹立した神経幹細胞及び膵臓幹細胞について、未分化状態と分化状態に分けて免疫染色解析を行った（図３A）。
FGF2存在下では、成体膵臓幹細胞は神経幹細胞と同様にSox2遺伝子を発現し、β細胞が発現するインシュリンやα細胞が発現するGlucagon遺伝子を発現していないことを抗Sox2抗体、抗インシュリン抗体（guinea pig anti-Insulin；1:300；Sigma社製、以下同様。)及び抗Glucagon抗体（mouse anti-Glucagon ；1:300，Immuno社製、以下同様。）を用いる免疫染色法で確認した。
次いで、神経幹細胞及び膵臓幹細胞を神経分化条件下（非特許文献４、５）の神経分化条件下、すなわち1μM のretinoic acid (RA、シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製）及び40 mMのKCl（WAKO社製）を含むDME/F12，high glucose（1mM L-glutamine）、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地（RA+FSK+KCl）を用いて培養すると、β細胞への分化が促進され、インシュリン遺伝子の発現の上昇とともに、細胞表面に神経突起のようなプロセスを伸長させた。両成体幹細胞を神経分化に導く条件（RA+FSK+KCl）下で培養すると、Insulin，β-III tubulin、ソマトスタチン遺伝子の発現が上昇する。
両細胞で、δ細胞特異的なソマトスタチン遺伝子の発現の上昇も抗ソマトスタチン抗体（rat anti-Somatostatin；1:300, Chemicon社製、以下同様。）で確認できた。ソマトスタチンは、膵臓ではδ細胞だが（図３C、下段左、実線で示した細胞。点線の矢印はGlucagon陽性のα細胞）、脳神経系では神経伝達の上で、刺激に対して抑制性の機能を示すinterneuron（インターニューロン）という神経細胞の一種に相当することが分かった（図３C、下段右、海馬のHilus領域内の矢印で示した細胞）。
一方、両細胞をアストロサイト分化条件下（非特許文献４〜６による。）のアストロサイト分化条件下、すなわち50 ng/mLのLIF（WAKO社製）及び50 ng/mLのBMP（WAKO社製）を含むDME/F12，high glucose（1mM L-glutamine）、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地を用いて培養すると、α細胞への分化が促進され、Glucagon遺伝子の発現が上昇した（抗Glucagon抗体により確認）。この際、幾つかの膵島構造が出現し、一部でγ細胞の発現も上昇することがPancreatic polypeptide遺伝子の免疫染色解析から確認できた。γ細胞含有度を高めたければ、オリゴデンドロサイト細胞分化条件（500ng/mL IGF-I（WAKO社製）入りのDME/F12、high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地）を用いる。このように、両成体幹細胞を、グリア細胞に分化させる条件下（グリア細胞誘導；LIF＋BMP）で培養すると、グルカゴン（α細胞のマーカー遺伝子）、GFAP（アストロサイト細胞のマーカー遺伝子）、Pancreatic polypeptide（γ細胞のマーカー遺伝子）という遺伝子が上昇することが分かった（図３B）。Pancreatic polypeptide、膵臓ではγ細胞だが（図３C、上段左、実線で示した細胞。点線の矢印はGlucagon陽性のα細胞）、脳神経系ではオリゴデンドロサイト細胞に特異的なGSTπという抗体で共に染色されることが分かった（図３C、上段右、矢印で示した細胞）。
これらの抗体によるタンパク質の発現のみでなく、細胞抽出RNAを用いたRT-PCRからも、成体膵臓幹細胞の未分化状態の維持、β細胞（δ細胞）への誘導、及びα細胞（γ細胞）への誘導が、それぞれ神経幹細胞の未分化性の維持（FGF２存在下）、神経分化誘導（RA+FSK+KCl）、及びアストロサイト分化誘導（グリア細胞誘導；LIF＋BMP）条件を疑似する条件で行えることを実証した（図３B）。
成体神経幹細胞と共に成体膵臓幹細胞が樹立できたため、両者の分化制御機構の解析を行った。
多能性を保持した未分化状態に保つことはSox2遺伝子の発現により確認できるので、非特許文献４、５に記載される公知の神経幹細胞の分化調節制御機構を参考に、樹立した神経幹細胞及び膵臓幹細胞について、未分化状態と分化状態に分けて免疫染色解析を行った（図３A）。
FGF2存在下では、成体膵臓幹細胞は神経幹細胞と同様にSox2遺伝子を発現し、β細胞が発現するインシュリンやα細胞が発現するGlucagon遺伝子を発現していないことを抗Sox2抗体、抗インシュリン抗体（guinea pig anti-Insulin；1:300；Sigma社製、以下同様。)及び抗Glucagon抗体（mouse anti-Glucagon ；1:300，Immuno社製、以下同様。）を用いる免疫染色法で確認した。
次いで、神経幹細胞及び膵臓幹細胞を神経分化条件下（非特許文献４、５）の神経分化条件下、すなわち1μM のretinoic acid (RA、シグマ社製)、5μMのforskolin（FSK、シグマ社製）及び40 mMのKCl（WAKO社製）を含むDME/F12，high glucose（1mM L-glutamine）、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地（RA+FSK+KCl）を用いて培養すると、β細胞への分化が促進され、インシュリン遺伝子の発現の上昇とともに、細胞表面に神経突起のようなプロセスを伸長させた。両成体幹細胞を神経分化に導く条件（RA+FSK+KCl）下で培養すると、Insulin，β-III tubulin、ソマトスタチン遺伝子の発現が上昇する。
両細胞で、δ細胞特異的なソマトスタチン遺伝子の発現の上昇も抗ソマトスタチン抗体（rat anti-Somatostatin；1:300, Chemicon社製、以下同様。）で確認できた。ソマトスタチンは、膵臓ではδ細胞だが（図３C、下段左、実線で示した細胞。点線の矢印はGlucagon陽性のα細胞）、脳神経系では神経伝達の上で、刺激に対して抑制性の機能を示すinterneuron（インターニューロン）という神経細胞の一種に相当することが分かった（図３C、下段右、海馬のHilus領域内の矢印で示した細胞）。
一方、両細胞をアストロサイト分化条件下（非特許文献４〜６による。）のアストロサイト分化条件下、すなわち50 ng/mLのLIF（WAKO社製）及び50 ng/mLのBMP（WAKO社製）を含むDME/F12，high glucose（1mM L-glutamine）、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地を用いて培養すると、α細胞への分化が促進され、Glucagon遺伝子の発現が上昇した（抗Glucagon抗体により確認）。この際、幾つかの膵島構造が出現し、一部でγ細胞の発現も上昇することがPancreatic polypeptide遺伝子の免疫染色解析から確認できた。γ細胞含有度を高めたければ、オリゴデンドロサイト細胞分化条件（500ng/mL IGF-I（WAKO社製）入りのDME/F12、high glucose (1mM L-glutamine)、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地）を用いる。このように、両成体幹細胞を、グリア細胞に分化させる条件下（グリア細胞誘導；LIF＋BMP）で培養すると、グルカゴン（α細胞のマーカー遺伝子）、GFAP（アストロサイト細胞のマーカー遺伝子）、Pancreatic polypeptide（γ細胞のマーカー遺伝子）という遺伝子が上昇することが分かった（図３B）。Pancreatic polypeptide、膵臓ではγ細胞だが（図３C、上段左、実線で示した細胞。点線の矢印はGlucagon陽性のα細胞）、脳神経系ではオリゴデンドロサイト細胞に特異的なGSTπという抗体で共に染色されることが分かった（図３C、上段右、矢印で示した細胞）。
これらの抗体によるタンパク質の発現のみでなく、細胞抽出RNAを用いたRT-PCRからも、成体膵臓幹細胞の未分化状態の維持、β細胞（δ細胞）への誘導、及びα細胞（γ細胞）への誘導が、それぞれ神経幹細胞の未分化性の維持（FGF２存在下）、神経分化誘導（RA+FSK+KCl）、及びアストロサイト分化誘導（グリア細胞誘導；LIF＋BMP）条件を疑似する条件で行えることを実証した（図３B）。
（４−３）成体膵臓幹細胞の成熟膵臓細胞への分化誘導
実施例３で樹立した膵臓幹細胞に対して、さらに詳細な分子制御機構の解析を行った。Wnt3は脳内の神経新生領域で、アストロサイト細胞（GFAP陽性）が発現する分泌タンパク質で、この効果により神経幹細胞は神経新生を開始し、ニューロブラストと言う神経新生細胞（NeuroD1陽性）を産生する物質であるが、このWnt3が、膵臓の膵島α細胞（GFAP、Glucagon陽性）で発現していることが分かった（図４A、矢印で示した細胞）。
また、膵臓の内分泌系は、脳内神経系と非常に高い相関が有り、β細胞内で新生している細胞は、NeuroD1陽性であるという共通点が有る（図４B−D）。NeuroD1のプロモーター上には、Wnt/βcateninシグナリングで活性化されるβcatenin/TCF/LEF転写因子が認識して結合する配列がヒト−ラット−マウスで保存されている。膵臓幹細胞をβ細胞へ分化誘導する際に、初期神経誘導条件下（ニューロブラスト産生状態）に置くと２４時間経過後には、Wnt/βcateninシグナリングで重要となるβcateninタンパク質の安定化が起きていることを、ウエスタンブロッティングで確認した（図４E）。
さらに、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の活性化にWntが必須であり、Wnt3が両遺伝子の活性化を導くことをRT-PCRで確認した（図４F）。
図４Fは、Wnt/βcateninシグナリングの活性化（試薬）でインシュリン遺伝子の発現が上昇し（Wnt3，GSK3beta-inhibitor）、対照的にWnt/βcateninシグナリングの不活性化（DnWnt;ドミナントネガティブWnt，βcatenin shRNA）でインシュリン遺伝子の発現が起きないことを示している。
NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンの活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）がWnt3で誘導されること、さらにNeuroD1がインシュリン遺伝子の活性化（インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位（E-box））部位へ、直接結合し、クロマチン（染色体）の活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）を誘導する）を導くことを示した（図４G）。
これらのことから、成体膵臓幹細胞を未分化状態に保つコントロール因子と共に、その分化制御におけるコントロール因子も、成体神経幹細胞からの神経再生制御機構ときわめて共通性が高いことが実証された。
実施例３で樹立した膵臓幹細胞に対して、さらに詳細な分子制御機構の解析を行った。Wnt3は脳内の神経新生領域で、アストロサイト細胞（GFAP陽性）が発現する分泌タンパク質で、この効果により神経幹細胞は神経新生を開始し、ニューロブラストと言う神経新生細胞（NeuroD1陽性）を産生する物質であるが、このWnt3が、膵臓の膵島α細胞（GFAP、Glucagon陽性）で発現していることが分かった（図４A、矢印で示した細胞）。
また、膵臓の内分泌系は、脳内神経系と非常に高い相関が有り、β細胞内で新生している細胞は、NeuroD1陽性であるという共通点が有る（図４B−D）。NeuroD1のプロモーター上には、Wnt/βcateninシグナリングで活性化されるβcatenin/TCF/LEF転写因子が認識して結合する配列がヒト−ラット−マウスで保存されている。膵臓幹細胞をβ細胞へ分化誘導する際に、初期神経誘導条件下（ニューロブラスト産生状態）に置くと２４時間経過後には、Wnt/βcateninシグナリングで重要となるβcateninタンパク質の安定化が起きていることを、ウエスタンブロッティングで確認した（図４E）。
さらに、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の活性化にWntが必須であり、Wnt3が両遺伝子の活性化を導くことをRT-PCRで確認した（図４F）。
図４Fは、Wnt/βcateninシグナリングの活性化（試薬）でインシュリン遺伝子の発現が上昇し（Wnt3，GSK3beta-inhibitor）、対照的にWnt/βcateninシグナリングの不活性化（DnWnt;ドミナントネガティブWnt，βcatenin shRNA）でインシュリン遺伝子の発現が起きないことを示している。
NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンの活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）がWnt3で誘導されること、さらにNeuroD1がインシュリン遺伝子の活性化（インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位（E-box））部位へ、直接結合し、クロマチン（染色体）の活性化（Anti-Acetyl HistoneH3）を誘導する）を導くことを示した（図４G）。
これらのことから、成体膵臓幹細胞を未分化状態に保つコントロール因子と共に、その分化制御におけるコントロール因子も、成体神経幹細胞からの神経再生制御機構ときわめて共通性が高いことが実証された。
（参考例１）神経幹細胞から成熟膵臓細胞への分化誘導
細胞抽出RNAを用いたRT-PCR（図３B）以外にも、免疫組織染色解析（図３A）からも、脳神経の細胞群（神経幹細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞）と膵臓内分泌系の細胞群（膵臓幹細胞、β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞）の発現する遺伝子に非常に高い相関が有ることが示された。さらに、図３Fに示すように、インシュリンを産生するβ細胞への分化誘導には、従来の神経促進／誘導薬が転化使用できることが分かった。上述したRA＋FSK＋KClという神経分化促進条件のみでなく、他の神経分化促進薬剤（RA単独、RA＋FSK、VPA、5AzaC、Wnt3などの薬剤）でもインシュリンプロモーターの活性が上昇することが膵臓幹細胞培養系で明らかになった（図３D）。
これは、神経分化を促進する試薬、または神経疾患の治療薬の、膵臓疾患への転化応用の可能性が高いことを示す。
細胞抽出RNAを用いたRT-PCR（図３B）以外にも、免疫組織染色解析（図３A）からも、脳神経の細胞群（神経幹細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト細胞、アストロサイト細胞）と膵臓内分泌系の細胞群（膵臓幹細胞、β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞）の発現する遺伝子に非常に高い相関が有ることが示された。さらに、図３Fに示すように、インシュリンを産生するβ細胞への分化誘導には、従来の神経促進／誘導薬が転化使用できることが分かった。上述したRA＋FSK＋KClという神経分化促進条件のみでなく、他の神経分化促進薬剤（RA単独、RA＋FSK、VPA、5AzaC、Wnt3などの薬剤）でもインシュリンプロモーターの活性が上昇することが膵臓幹細胞培養系で明らかになった（図３D）。
これは、神経分化を促進する試薬、または神経疾患の治療薬の、膵臓疾患への転化応用の可能性が高いことを示す。
（実施例５）成体膵臓幹細胞の、脳神経疾患へ効果的な移植応用
膵臓幹細胞が、膵臓内分泌系β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞に分化することに加え、神経細胞と非常に高い相似性を持つこと、インシュリンは膵臓だけでなく脳内にも産出されており、学習機能の向上等に必要とされていることなどから、膵臓幹細胞と神経幹細胞との間に互換性がある可能性を想定し、樹立した膵臓幹細胞が脳内神経系に組み込まれるかどうかを調べた。移植する膵臓幹細胞が追跡できるよう、マーカーとしてGFP（蛍光を発するタンパク質）を選択した。GFP発現カセットがゲノムに安定に組み込まれた膵臓幹細胞株を作製した。106-107個の細胞を、Fisher344成体ラット（７−８週齢）の脳海馬領域に、Stereotaxic脳固定装置を用いてマイクロインジェクションした(図５A)。５週間飼育後、脳を抽出してGFPを発現している膵臓幹細胞由来の移植生細胞を、マイクロトームを用いて作製した脳切片上で探索した。共焦点顕微鏡を用いた免疫組織染色解析により、成体膵臓幹細胞が、分化制御機構の非常に似通った脳内の神経系に効率よく取り込まれること、神経細胞に転移分化できることがin vivoで示された（図５B）。
以上の研究成果から、胎生期の発生段階で遠い隔たりのある外胚葉系の神経細胞と、内胚葉系の膵細胞が、成体でインシュリンを必要とする脳内（学習機能）と膵臓（血糖値低下）の内分泌系器官で、『インシュリンを産生』するという共通の役割を満たすため、非常に良く似た制御機構によって成体幹細胞から生み出されていることと、その相互利用が双方で可能であることが実際にin vivoで証明された。
膵臓幹細胞が、膵臓内分泌系β細胞、α細胞、δ細胞、γ細胞に分化することに加え、神経細胞と非常に高い相似性を持つこと、インシュリンは膵臓だけでなく脳内にも産出されており、学習機能の向上等に必要とされていることなどから、膵臓幹細胞と神経幹細胞との間に互換性がある可能性を想定し、樹立した膵臓幹細胞が脳内神経系に組み込まれるかどうかを調べた。移植する膵臓幹細胞が追跡できるよう、マーカーとしてGFP（蛍光を発するタンパク質）を選択した。GFP発現カセットがゲノムに安定に組み込まれた膵臓幹細胞株を作製した。106-107個の細胞を、Fisher344成体ラット（７−８週齢）の脳海馬領域に、Stereotaxic脳固定装置を用いてマイクロインジェクションした(図５A)。５週間飼育後、脳を抽出してGFPを発現している膵臓幹細胞由来の移植生細胞を、マイクロトームを用いて作製した脳切片上で探索した。共焦点顕微鏡を用いた免疫組織染色解析により、成体膵臓幹細胞が、分化制御機構の非常に似通った脳内の神経系に効率よく取り込まれること、神経細胞に転移分化できることがin vivoで示された（図５B）。
以上の研究成果から、胎生期の発生段階で遠い隔たりのある外胚葉系の神経細胞と、内胚葉系の膵細胞が、成体でインシュリンを必要とする脳内（学習機能）と膵臓（血糖値低下）の内分泌系器官で、『インシュリンを産生』するという共通の役割を満たすため、非常に良く似た制御機構によって成体幹細胞から生み出されていることと、その相互利用が双方で可能であることが実際にin vivoで証明された。
（参考例２）神経幹細胞の膵臓への移植応用
膵臓幹細胞からのβ細胞分化制御が、神経幹細胞からの神経細胞分化制御と非常に高い相似性を持つこと、インシュリンは膵臓だけでなく脳内にも産出されており、本来学習機能の向上等に必要とされていることなどから、神経幹細胞が膵臓の内分泌系に組み込まれるかどうか（転移分化）、移植実験を行った。移植する神経幹細胞が追跡できるよう、マーカーとしてGFP（蛍光を発するタンパク質）を選択した。GFP発現カセットがゲノムに安定に組み込まれた神経幹細胞株を作製した。107-108個の細胞を、Fisher344成体ラット（７−８週齢）の膵臓にマイクロインジェクションした（図５A）。５週間飼育後、膵臓を抽出してGFPを発現している神経幹細胞由来の移植生細胞を、マイクロトームを用いて作製した脳切片上で探索した。共焦点顕微鏡を用いた免疫組織染色解析により、成体神経幹細胞が、分化制御機構の非常に似通った膵臓内分泌系に効率よく取り込まれること、インシュリンを産生するβ細胞に転移分化できることがin vivoで示された（図６C）。
膵臓幹細胞からのβ細胞分化制御が、神経幹細胞からの神経細胞分化制御と非常に高い相似性を持つこと、インシュリンは膵臓だけでなく脳内にも産出されており、本来学習機能の向上等に必要とされていることなどから、神経幹細胞が膵臓の内分泌系に組み込まれるかどうか（転移分化）、移植実験を行った。移植する神経幹細胞が追跡できるよう、マーカーとしてGFP（蛍光を発するタンパク質）を選択した。GFP発現カセットがゲノムに安定に組み込まれた神経幹細胞株を作製した。107-108個の細胞を、Fisher344成体ラット（７−８週齢）の膵臓にマイクロインジェクションした（図５A）。５週間飼育後、膵臓を抽出してGFPを発現している神経幹細胞由来の移植生細胞を、マイクロトームを用いて作製した脳切片上で探索した。共焦点顕微鏡を用いた免疫組織染色解析により、成体神経幹細胞が、分化制御機構の非常に似通った膵臓内分泌系に効率よく取り込まれること、インシュリンを産生するβ細胞に転移分化できることがin vivoで示された（図６C）。
(参考例３)糖尿病等膵臓疾患を標的とした再生医療への応用
さらに、糖尿病に対する治療効果を調べるために、神経幹細胞をII型糖尿病のモデルラット（GKラット）の膵臓に移植した。効率よい移植を促すために、コラーゲンシート上の培養を行い（図６B）、神経幹細胞、ニューロブラスト（神経分化の初期状態）の培養が問題なく行えること、およびコラーゲンシート上でも、インシュリンプロモーター活性が神経分化誘導条件下で、上昇することを確認した（図６B、右グラフ）。この神経幹細胞などを培養したコラーゲンシートを糖尿病のモデルラットの膵臓に移植し、血糖値の変遷を測定したグラフを図６Cに示す。図６Cから分かるように、神経幹細胞、ニューロブラストを移植した全ての系で、手術後に血糖値の低下が確認された。さらに、コラーゲンシートが無い場合に比べ、コラーゲンシート上のニューロブラストを移植したケースが、最も効率の良い血糖値の低下が見られた。
以上の研究成果から、胎生期の発生段階で遠い隔たりのある外胚葉系の神経細胞と、内胚葉系の膵細胞が、成体でインシュリンを必要とする脳内（学習機能）と膵臓（血糖値低下）の内分泌系器官で、『インシュリンを産生』するという共通の役割を満たすため、非常に良く似た制御機構によって成体幹細胞から生み出されていることと、神経幹細胞の糖尿病治療への利用が可能であることが実際に疾患モデル動物を用いたin vivoレベルで証明された。
さらに、糖尿病に対する治療効果を調べるために、神経幹細胞をII型糖尿病のモデルラット（GKラット）の膵臓に移植した。効率よい移植を促すために、コラーゲンシート上の培養を行い（図６B）、神経幹細胞、ニューロブラスト（神経分化の初期状態）の培養が問題なく行えること、およびコラーゲンシート上でも、インシュリンプロモーター活性が神経分化誘導条件下で、上昇することを確認した（図６B、右グラフ）。この神経幹細胞などを培養したコラーゲンシートを糖尿病のモデルラットの膵臓に移植し、血糖値の変遷を測定したグラフを図６Cに示す。図６Cから分かるように、神経幹細胞、ニューロブラストを移植した全ての系で、手術後に血糖値の低下が確認された。さらに、コラーゲンシートが無い場合に比べ、コラーゲンシート上のニューロブラストを移植したケースが、最も効率の良い血糖値の低下が見られた。
以上の研究成果から、胎生期の発生段階で遠い隔たりのある外胚葉系の神経細胞と、内胚葉系の膵細胞が、成体でインシュリンを必要とする脳内（学習機能）と膵臓（血糖値低下）の内分泌系器官で、『インシュリンを産生』するという共通の役割を満たすため、非常に良く似た制御機構によって成体幹細胞から生み出されていることと、神経幹細胞の糖尿病治療への利用が可能であることが実際に疾患モデル動物を用いたin vivoレベルで証明された。
（参考例４）糖尿病等膵臓疾患を標的とした再生医療への応用(長期間試験)
糖尿病に対する治療効果を調べるために、神経幹細胞をII型糖尿病のモデルラット（GKラット）の膵臓に移植した。前記参考例３と同様に、効率よい移植を促すために、コラーゲンシート上の培養を行い（図６B、同様）、図６Cの短期間試験で効果的な血糖値低下作用を示したニューロブラスト（神経分化の初期状態）の移植で試験を開始した。コラーゲンシート上にニューロブラストを培養し、複数枚数（３シート、t2×10の8乗個の細胞数に最終的に相当）重ねたものを糖尿病のモデルラットの膵臓の膵島部に移植し、血糖値の変遷を測定したグラフを図に示す。図６Cと同様、ニューロブラストを移植した系で、手術後に血糖値の低下が確認された。さらに、この効果は３ヶ月の長期の試験に対しても有用であることが判明した。
以上の研究成果から、成体神経幹細胞の培養系の糖尿病治療への利用が、疾患モデル動物を用いたin vivoレベルで証明された。（図８）
また、本参考例により、成体神経幹細胞であっても、本発明の神経分化誘導剤を用いて前駆β細胞に分化させた後に、膵臓組織への移植を行うことの治療上の有効性が確認されたのであるから、成体膵臓幹細胞と成体神経幹細胞との間は完全に互換性があることが証明できたことになる。つまり、成体膵臓幹細胞に対しても、この参考例４と同様な手法、すなわち、コラーゲンシート上で神経細胞分化誘導剤により前駆β細胞にまで分化させた状態で、糖尿病患者もしくは神経性疾患患者の膵臓組織もしくは神経組織に対する移植治療を行えば、同様の治療効果が十分に期待できることである。
糖尿病に対する治療効果を調べるために、神経幹細胞をII型糖尿病のモデルラット（GKラット）の膵臓に移植した。前記参考例３と同様に、効率よい移植を促すために、コラーゲンシート上の培養を行い（図６B、同様）、図６Cの短期間試験で効果的な血糖値低下作用を示したニューロブラスト（神経分化の初期状態）の移植で試験を開始した。コラーゲンシート上にニューロブラストを培養し、複数枚数（３シート、t2×10の8乗個の細胞数に最終的に相当）重ねたものを糖尿病のモデルラットの膵臓の膵島部に移植し、血糖値の変遷を測定したグラフを図に示す。図６Cと同様、ニューロブラストを移植した系で、手術後に血糖値の低下が確認された。さらに、この効果は３ヶ月の長期の試験に対しても有用であることが判明した。
以上の研究成果から、成体神経幹細胞の培養系の糖尿病治療への利用が、疾患モデル動物を用いたin vivoレベルで証明された。（図８）
また、本参考例により、成体神経幹細胞であっても、本発明の神経分化誘導剤を用いて前駆β細胞に分化させた後に、膵臓組織への移植を行うことの治療上の有効性が確認されたのであるから、成体膵臓幹細胞と成体神経幹細胞との間は完全に互換性があることが証明できたことになる。つまり、成体膵臓幹細胞に対しても、この参考例４と同様な手法、すなわち、コラーゲンシート上で神経細胞分化誘導剤により前駆β細胞にまで分化させた状態で、糖尿病患者もしくは神経性疾患患者の膵臓組織もしくは神経組織に対する移植治療を行えば、同様の治療効果が十分に期待できることである。
Claims (21)
- 成体由来の膵臓組織からの膵臓幹細胞の樹立方法であって、下記の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む成体膵臓幹細胞の樹立方法；
（ａ）膵臓幹細胞を含む膵臓組織を、コラゲナーゼを含む神経幹細胞用培養培地に懸濁する工程、
（ｂ）膵臓幹細胞を、神経幹細胞培養用ディッシュに播種し、神経幹細胞用培養培地を加えて培養する工程。 - 前記培養工程において、まずFCS及びFGF2を含有する神経幹細胞用培養培地で膵臓幹細胞を増殖させ、次いでFCSを除いたFGF2を含有する神経幹細胞用培養培地で培養することを特徴とする、請求項１に記載の成体膵臓幹細胞の樹立方法。
- 請求項１又は２に記載の樹立方法により得られた成体膵臓幹細胞であって、sox-2遺伝子を発現している成体膵臓幹細胞。
- 成体膵臓幹細胞を、FGF2を添加した神経幹細胞培養用培地で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞を未分化状態に維持する方法。
- 成体膵臓幹細胞を神経細胞分化条件下で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞をβ細胞及びδ細胞へ分化誘導する分化誘導方法。
- 成体膵臓幹細胞を、抑制性のインターニューロンを作製する神経細胞分化条件下で培養することでδ細胞の含有度を高めることを特徴とする、請求項５に記載の分化誘導方法。
- 成体膵臓幹細胞を、アストロサイト細胞分化条件下で培養することを特徴とする、成体膵臓幹細胞をα細胞及びγ細胞へ分化誘導する分化誘導方法。
- 成体膵臓幹細胞を、オリゴデンドロサイト細胞を誘導するグリア細胞分化条件下で培養することでγ細胞含有度を高めることを特徴とする、請求項７に記載の分化誘導方法。
- 請求項３に記載の成体膵臓幹細胞を含むことを特徴とする、膵臓細胞再生移植用キット。
- さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、請求項９に記載の膵臓細胞再生移植用キット。
- 生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞と、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤とを含むことを特徴とする、膵臓細胞再生移植用キット。
- 成体膵臓幹細胞を、生体適合性シート上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養して、β前駆細胞に分化させた後、前記生体適合性シートと共に、膵臓患部に導入することを特徴とする、膵臓再生移植治療方法。
- RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤を有効成分として含む、糖尿病治療用組成物。
- さらに、生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞を含む、請求項１３に記載の糖尿病治療用組成物。
- 前記成体膵臓幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、請求項１４に記載の糖尿病治療用組成物。
- 成体膵臓幹細胞を含むことを特徴とする、神経細胞再生移植用キット。
- さらに神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の神経細胞再生移植用キット。
- 前記神経細胞分化誘導剤が、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の神経細胞再生移植用キット。
- 成体膵臓幹細胞を、生体適合性シート上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養して、β前駆細胞に分化させた後、前記生体適合性シートと共に、神経組織患部に導入することを特徴とする、神経組織再生治療方法。
- 生体適合性シート表面に配置した成体膵臓幹細胞と共に、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の神経細胞分化誘導剤を含むことを特徴とする、神経性疾患治療用組成物。
- 前記成体膵臓幹細胞が、あらかじめ前記生体適合性シート表面上で、RA、RA+FSK、RA+FSK+KCl、Wnt3a、GSK3βインヒビター、リチウム塩、VPA、5AzaC及びβカテニンから選択された少なくとも1種の存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化させておいた状態の細胞であることを特徴とする、請求項２０に記載の神経性疾患治療用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010518084A JP5268009B2 (ja) | 2008-06-27 | 2009-06-26 | 成体膵臓幹細胞の樹立方法及び分化方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008168222 | 2008-06-27 | ||
| JP2008168222 | 2008-06-27 | ||
| PCT/JP2009/061776 WO2009157562A1 (ja) | 2008-06-27 | 2009-06-26 | 成体膵臓幹細胞の樹立方法及び分化方法 |
| JP2010518084A JP5268009B2 (ja) | 2008-06-27 | 2009-06-26 | 成体膵臓幹細胞の樹立方法及び分化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2009157562A1 true JPWO2009157562A1 (ja) | 2011-12-15 |
| JP5268009B2 JP5268009B2 (ja) | 2013-08-21 |
Family
ID=41444622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010518084A Expired - Fee Related JP5268009B2 (ja) | 2008-06-27 | 2009-06-26 | 成体膵臓幹細胞の樹立方法及び分化方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5268009B2 (ja) |
| WO (1) | WO2009157562A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109963938B (zh) * | 2016-11-16 | 2024-04-19 | 美国绿阳生物技术及医药公司 | 以RNA通过干细胞分化诱导胰脏β细胞 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5978379A (en) | 1997-01-23 | 1999-11-02 | Gadzoox Networks, Inc. | Fiber channel learning bridge, learning half bridge, and protocol |
| US7430171B2 (en) | 1998-11-19 | 2008-09-30 | Broadcom Corporation | Fibre channel arbitrated loop bufferless switch circuitry to increase bandwidth without significant increase in cost |
| EP4202040A1 (en) | 2010-07-01 | 2023-06-28 | Regenerative Research Foundation | Methods for culturing undifferentiated cells using sustained release compositions |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2362593A1 (en) * | 1999-02-10 | 2000-08-17 | Curis, Inc. | Pancreatic progenitor cells, methods and uses related thereto |
| EP1539930A4 (en) * | 2002-07-29 | 2006-08-09 | Es Cell Int Pte Ltd | METHOD IN MULTIPLE STAGES OF DIFFERENTIATION OF POSITIVE INSULIN-SENSITIVE CELLS, GLUCOSE |
| EP1670900A4 (en) * | 2003-08-27 | 2008-06-11 | Stemcells California Inc | ENHANCED PANCREATIC STEM CELL AND PRECURSOR CELL POPULATIONS AND METHOD OF IDENTIFYING, INSULATING AND ENRICHING SUCH POPULATIONS |
| US20050176140A1 (en) * | 2004-02-10 | 2005-08-11 | Benedict Daniel J. | Method and apparatus for cell culture using a two liquid phase bioreactor |
| US20090269309A1 (en) * | 2004-10-28 | 2009-10-29 | Helena Edlund | Retinoic acid stimulates differentiation of pancreatic progenitor cells into insulin producing cells |
| JP5584875B2 (ja) * | 2005-04-13 | 2014-09-10 | 国立大学法人 千葉大学 | 成体膵由来膵幹細胞の製造方法 |
| JP5122973B2 (ja) * | 2005-11-15 | 2013-01-16 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Ｅｓ細胞からすい臓を生産する方法 |
| EP1960777B1 (en) * | 2005-11-28 | 2009-10-21 | Choongwae Pharma Corporation | Serum-free expansion of cells in culture |
-
2009
- 2009-06-26 JP JP2010518084A patent/JP5268009B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2009-06-26 WO PCT/JP2009/061776 patent/WO2009157562A1/ja active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109963938B (zh) * | 2016-11-16 | 2024-04-19 | 美国绿阳生物技术及医药公司 | 以RNA通过干细胞分化诱导胰脏β细胞 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009157562A1 (ja) | 2009-12-30 |
| JP5268009B2 (ja) | 2013-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20120107284A1 (en) | Stem cells for transplantation and methods for production thereof | |
| US11920160B2 (en) | Pancreatic insulin-producing beta-cell lines derived from human pluripotent stem cells | |
| US10870830B2 (en) | Method for culturing differentiation-promoting and -sustaining spheroid form of tonsil-derived stem cells | |
| US20240189363A1 (en) | Cardiomyocytes and compositions and methods for producing the same | |
| JP5268009B2 (ja) | 成体膵臓幹細胞の樹立方法及び分化方法 | |
| US12060579B2 (en) | Human pluripotent stem cell derived endocardial endothelium | |
| CN108779435A (zh) | 用于重新衍生不同的多能干细胞衍生的褐色脂肪细胞的方法 | |
| US7297538B2 (en) | Encapsulated cell indicator system | |
| Bose et al. | Regenerative medicine for diabetes: differentiation of human pluripotent stem cells into functional β-cells in vitro and their proposed journey to clinical translation | |
| JP7426340B2 (ja) | 糖尿病を治療するための膵臓細胞および適用に関連するその生成方法 | |
| US10017740B2 (en) | Deriving brown adipose tissue cells | |
| JP5294041B2 (ja) | 膵臓疾患又は糖尿病のための膵臓細胞再生移植用キット | |
| JP2023055915A (ja) | 幹細胞からの成長ホルモン産生細胞の誘導およびその使用 | |
| JP2006075022A (ja) | 膵臓ホルモン産生細胞取得方法 | |
| WO2019093047A1 (ja) | インビトロでの機能的な外分泌腺の製造方法、および、当該方法によって製造される外分泌腺 | |
| Li | Generation of Human Pancreatic Beta Like Cells from Pluripotent Stem Cells | |
| CN115052983A (zh) | 重编程体细胞的方法和试剂盒 | |
| WO2018011989A1 (ja) | 歯髄細胞を含む神経損傷治療用移植材 | |
| CN115216437A (zh) | 视黄酸在胰岛细胞团体外扩增中的应用 | |
| Lu | Signal pathways that regulate retinal differentiation from embryonic stem cells | |
| Thwaites | Methods affecting neuronal differentiation of human adult and pluripotent stem cells | |
| Sripathy Rao | Determination of Methods for Improved Reprogramming of Various Cell Types to Functional Beta-like Cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130115 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130315 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130423 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130426 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5268009 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |