JPWO2009119538A1 - エピメラーゼ活性を有する新規ポリペプチド、その製造方法ならびにその利用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明の目的は、オリゴ糖の水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒する新規ポリペプチドを取得し、水酸基の立体配座が変化したオリゴ糖の酵素的合成法を提供することにある。【解決手段】 （１）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（２）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチド。

Description

本発明は、新規ポリペプチドおよびその利用に関するものであり、より詳細には、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチドおよびその製造方法、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその利用方法、ならびに当該ポリペプチドを用いた還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座が変化した当該還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖およびプレバイオティクスの製造方法に関する。

炭水化物は、生物の主要なエネルギー源であり、生体成分（脂肪酸、トリグリセリド、アミノ酸、核酸）に変換される生合成前駆体である。炭水化物はまた、結合組織、神経組織、細菌細胞壁、および核酸の構造的成分として重要な役割を担っている。さらに、糖タンパク質等が有する糖鎖として生体内の種々の情報伝達において重要な役割を担うことが近年明らかにされており、遺伝子工学、タンパク質工学および糖鎖工学等で注目を集めている。

上記のようなエネルギー源としての炭水化物や生体内情報伝達に関与する糖タンパク質中の糖鎖とは異なる機能性糖類として、多種多様な天然オリゴ糖あるいは人工オリゴ糖が報告され、これらを利用した医薬品および／または健康食品の開発も盛んに行われている（例えば、特許文献１および２参照）。

近年、様々な生理機能を有するオリゴ糖はプレバイオティクスとして特に注目されている。こうした機能性オリゴ糖合成を目的として多くの研究開発が行われた結果、これまでに様々なオリゴ糖が発見、合成され、応用開発の研究素材として利用されたり、中には工業的に生産されたりしているものもある（例えば、特許文献３参照）。現在、日本における特定保健用食品の半数以上が、機能性成分としてオリゴ糖を含んでいる。

機能性オリゴ糖の一例は、広く食品や化粧品に利用されているトレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシド）である。トレハロースは、デンプンからイソアミラーゼを用いてアミロースを製造した後、これを出発物質として先ずマルトオリゴシルトレハロースシンターゼの作用でアミロシルトレハロースを中間体として生成し、さらにこの中間体をマルトオリゴシルトレハローストレハロヒドロラーゼを用いて加水分解することで、生成される。この生成方法では、反応残渣であるアミロースを回収して、上記と同じ反応を繰り返さすことが必要である（非特許文献１参照）。

トレハロースは、深海のパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌の生産するマルトースホスホリラーゼを用いて、マルトースとリン酸存在下でβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸を生成し、この反応液にグルコースを加えてトレハロースホスホリラーゼの逆反応によっても生成される（特許文献４参照）。この生成法も、デンプンを原料とする上記方法と同様に、２〜４段階の酵素反応を要するために煩雑である。

機能性オリゴ糖の別の例として、プレバイオティクスや低カロリー商品として使用されるイソマルトオリゴ糖を挙げることができる。イソマルトオリゴ糖は、デンプンからバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のα−アミラーゼ、大豆のβ−アミラーゼおよび黒かび（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のα−グルコシダーゼを用いた３段階酵素反応で生成される。この酵素反応で生成されるオリゴ糖は、一般に（α−１，２、α−１，３、α−１，６）グリコシド結合された重合度２〜６糖類の混合物であり、混合物中に含まれるオリゴ糖の組成制御は難しい（非特許文献２参照）。

機能性オリゴ糖の他の例として、エピラクトースがある。エピラクトースは、バチルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ ３１３８２株由来のβ−１，４−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの逆反応を利用して製造される（非特許文献３参照）。しかしこの製造法では、β−１，３結合、β−１，４結合およびβ−１，６結合をもつガラクトシルマンノースが約１：３：１で生成されるため、純粋なエピラクトースを得るためには、残存する基質とともにこれら副産物を複雑な精製操作によって除去する必要がある。

本発明者らが見出したエピラクトースの別の製造方法として、セロビオース２−エピメラーゼ（以下、ＣＥと表す）を利用する方法がある（非特許文献４参照）。ＣＥ（ＥＣ５．１．３．１１）は、セロビオースの還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒する活性を有する酵素であり、偏性嫌気性ルーメン細菌ルミノコックス アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）（以下、Ｒ．ａｌｂｕｓ）７株（ＡＴＣＣ ２７２１０として保存されている）において、その存在が示唆されていた（非特許文献５参照）。本発明者らは、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１株からＣＥをコードする遺伝子のクローニングとその塩基配列の決定に成功し、本酵素が菌体内酵素であること、セロビオースからＯ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−マンノース（Ｇｌｃ−Ｍａｎ）（図１）を生成することに加え、セロトリオース（Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｇｌｃ）から希少セロオリゴ糖であるＧｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎ（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−マンノース）（図２）を、セロテトラオース（Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｇｌｃ）からＧｌｃ−Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎ（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−マンノース）を生成することを明らかにした（非特許文献４参照）。

本発明者らは Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１株由来ＣＥが、ラクトース（Ｇａｌ−Ｇｌｃ）からエピラクトース（Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−マンノース）（図３）を生成することを証明しており、別途特許出願を行っている（ＰＣＴ／ＪＰ２００７／００１２５３）。

異性化酵素であるエピメラーゼは、これまでに３０数種類が報告されている。エピメラーゼの多くは、ヌクレオチドやリン酸、アシル基等の修飾を受けた糖類を基質とするものであり、未修飾の糖を基質とするものはアルドース１−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．３）、マルトース１−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．２１）および前記のＣＥ（ＥＣ５．１．３．１１）の３種類だけである。これら３種類のエピメラーゼのうち、還元末端糖残基の２位水酸基に作用するエピメラーゼは前記ＣＥのみである。

ＣＥは、基質分子内部の立体配座を変化させる反応を触媒するために副産物を生じず、オリゴ糖の製造における有用性が高いと期待できる。このように異性化酵素であるエピメラーゼは、その独特な酵素活性から、希少オリゴ糖の合成に対して多くの利点および有用性を期待することができるが、現在までに報告された還元末端糖残基の２位水酸基に作用するエピメラーゼは、前記ＣＥただ１種類にすぎない（非特許文献４参照）。

特開平８−２５６７３０号公報（平成８年１０月８日公開） 特開２００３−４７４０２公報（平成１５年２月１８日公開） 特開平２−１６９９２号公報（平成２年１月１９日公開） ＷＯ２００５／００３３４３（平成１７年１月１３日公開） 杉本利行ら、日本農芸化学会誌、１９９５年、）第７２巻、第９１５−９２２頁 菅野智栄、月刊フードケミカル、１９９８年、第１０巻、第６１−６６頁 Ｍｉｙａｓａｔｏ，Ｍ．ａｎｄ Ａｊｉｓａｋａ，Ｋ．、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００４年、第６８巻、第２０８６−２０９０頁 Ｓ．Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００７年、第３６０巻、第６４０−６４５頁 Ｔ．Ｒ．Ｔｙｌｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｌｅａｔｈｅｒｗｏｏｄ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｃｔａ、１９６７年、第１１９巻、第３６３−３６７頁

本発明の目的は、オリゴ糖の水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒する新規ポリペプチドを取得し、水酸基の立体配座が変化したオリゴ糖の酵素的合成法を提供することにある。

本発明者らは、オリゴ糖の水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するエピメラーゼをコードする遺伝子を新たに取得し、さらに当該遺伝子にコードされる、オリゴ糖の水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチドを取得し、その酵素化学的諸性質を解明して、下記の各発明を完成するに至った。

（i）（１）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（２）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチド。

（ii）下の（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチド；
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４２〜４４ｋＤａであり、
（Ｂ）配列番号９に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
（Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
（Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜７．５で８０％以上の酵素活性を示し、
（Ｅ）ｐＨ５．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
（Ｆ）最適温度：２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、１５〜３０℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
（Ｇ）温度安定性：５０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。

（iii）下の（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチド；
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４３〜４５ｋＤａであり、
（Ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
（Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
（Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜８．０で８０％以上の酵素活性を示し、
（Ｅ）ｐＨ４．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
（Ｆ）２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、１０〜４５℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
（Ｇ）４０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。

（iv）下の（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチド；
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４６〜４８ｋＤａであり、
（Ｂ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
（Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
（Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜９．０で８０％以上の酵素活性を示し、
（Ｅ）ｐＨ４．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
（Ｆ）２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、１５〜３５℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
（Ｇ）４０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。

（v）下の（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチド；
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４４〜４６ｋＤａであり、
（Ｂ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
（Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
（Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜７．５で８０％以上の酵素活性を示し、
（Ｅ）ｐＨ５．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
（Ｆ）２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、２０〜４５℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
（Ｇ）５０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。

（vi）（１）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（２）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

（vii）（１）配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（２）配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかである、（vi）記載のポリヌクレオチド。

（viii）（vi）または（vii）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。

（ix）（viii）に記載の組み換えベクターが導入された形質転換体。

（x）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチドの生産方法であって、（ix）記載の形質転換体を培養する工程と、前記形質転換体に前記ポリペプチドを生産させる工程と、前記形質転換体または前記形質転換体の培養上清から前記ポリペプチドを回収する工程とを包含することを特徴とする方法。

（xi）還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座が変化した当該還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の製造方法であって、（i）〜（v）のいずれかに記載のポリペプチドと還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖とをインキュベートする工程と、前記ポリペプチドに前記オリゴ糖の還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒させて前記オリゴ糖を製造する工程を包含することを特徴とする方法。

（xii）還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座が変化した当該還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖を含むプレバイオティクスの製造方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドと還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖を含む材料とをインキュベートする工程と、前記ポリペプチドに前記オリゴ糖の還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒させて前記プレバイオティクスを製造する工程を包含することを特徴とする方法。

本発明が提供するポリペプチドは、（１）基質分子内部の立体配座を変化させる反応を触媒し、オリゴ糖以外の反応物を必要とはしないので、オリゴ糖の製造を簡便かつ安価に製造することができる、（２）反応副生物が無いため目的の生成物の精製が容易であり、機能性オリゴ糖の大量生産に好適である、（３）非還元末端糖についての基質特異性が厳密ではないので、従来の手法では合成し得ないオリゴ糖を合成することができる、等の利点を有する。

したがって本発明が提供するポリペプチドを用いれば、還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座が変化したセロオリゴ糖やエピラクトースのみならず、所望の還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座が変化した還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖を容易かつ大量に合成することができる。これにより、生理作用を有するオリゴ糖、プレバイオティクス、シンバイオティクス、およびこれらを含む機能性食品を低価格で提供することができる。

本発明のポリペプチドが触媒する、セロビオースの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化してＧｌｃ−Ｍａｎに変換する反応を示すスキームである。 本発明のポリペプチドが触媒する、セロトリオースの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化してＧｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎに変換する反応を示すスキームである。 本発明のポリペプチドが触媒する、ラクトースの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化してエピラクトースに変換する反応を示すスキームである。 ＣＥ−ＮＥ１（登録番号ＢＡＦ８１１０８）、Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ 由来ＡＧＥ様タンパク（Ｃｐ ＡＧＥ−ｌｉｋｅ、登録番号ＡＢＸ４２６２５）、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来ＡＧＥ様タンパク（Ｃｓ ＡＧＥ−ｌｉｋｅ、登録番号ＡＢＰ６５９４１）、およびＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ由来ＡＧＥ様タンパク（Ｂｆ ＡＧＥ−ｌｉｋｅ、登録番号ＢＡＤ４７６００）のアミノ酸配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて多重整列した結果を示す図である。配列中の太字アミノ酸は２つの保存領域を、配列下の＊は全ての配列で保存されているアミノ酸を、●はＡｎａｂａｅｎａのＡＧＥ反応に関与する推定触媒残基を示す。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＣＢＢ染色したゲルの写真を示す図である。レーン１は、ＣＥ−ＮＥ１（対照）、レーン２はｍＤ１、レーン３はｍＤ２、レーン４はｍＤ３、レーン５はｍＲ６である。 ＣＥ−ＮＥ１のアミノ酸配列と比較するため、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて多重整列した結果を示す図である。配列中の太字アミノ酸はＣＥ−ＮＥ１で保存されているアミノ酸を示す。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、セロビオースを基質とした酵素反応を行った後、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーンＳは酵素無添加、レーン１はＣＥ−ＮＥ１（対照）、レーン２はｍＤ１、レーン３はｍＤ２、レーン４はｍＤ３、レーン５はｍＲ６を用いた反応生成物である。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、セロトリオースを基質とした酵素反応を行った後、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーンＳは酵素無添加、レーン１はＣＥ−ＮＥ１（対照）、レーン２はｍＤ１、レーン３はｍＤ２、レーン４はｍＤ３、レーン５はｍＲ６を用いた反応生成物である。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、セロテトラオースを基質とした酵素反応を行った後、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーンＳは酵素無添加、レーン１はＣＥ−ＮＥ１（対照）、レーン２はｍＤ１、レーン３はｍＤ２、レーン４はｍＤ３、レーン５はｍＲ６を用いた反応生成物である。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、ラクトースを基質とした酵素反応を行った後、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーンＳは酵素無添加、レーン１はＣＥ−ＮＥ１（対照）、レーン２はｍＤ１、レーン３はｍＤ２、レーン４はｍＤ３、レーン５はｍＲ６を用いた反応生成物である。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、４β−マンノビオースを基質とした酵素反応を行った後、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーンＳは酵素無添加、レーン１はＣＥ−ＮＥ１（対照）、レーン２はｍＤ１、レーン３はｍＤ２、レーン４はｍＤ３、レーン５はｍＲ６を用いた反応生成物である。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、グロボトリオースを基質とした酵素反応を行った後、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーンＳは酵素無添加、レーン１はＣＥ−ＮＥ１（対照）、レーン２はｍＤ１、レーン３はｍＤ２、レーン４はｍＤ３、レーン５はｍＲ６を用いた反応生成物である。 精製した組み換え酵素ｍＲ６について、セロビオース、グルコシルマンノースを基質とした酵素反応を行った後、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーン１はセロビオースのみ、レーン２はセロビオース＋ｍＲ６、レーン３はグルコシルマンノースのみ、レーン４はグルコシルマンノース＋ｍＲ６で反応させた生成物である。 精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、単糖を基質とした酵素反応を行った後、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーン１はグルコース、レーン２はマンノース、レーン３はガラクトース、レーン４はフルクトース、レーン５はキシロース、レーン６はアラビノースを基質とし、各レーンの左側は酵素無添加、右側は酵素添加した反応生成物について分析を行った。 精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、単糖をα−２糖とした酵素反応を行った後、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーン１はコージビオース、レーン２はニゲロース、レーン３はマルトース、レーン４はイソマルトースを基質とし、各レーンの左側は酵素無添加、右側は酵素添加した反応生成物について分析を行った。 精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、単糖をβ−２糖とした酵素反応を行った後、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーン１はソホロース、レーン２はラミナリビオース、レーン３はセロビオース、レーン４はゲンチオビオースを基質とし、各レーンの左側は酵素無添加、右側は酵素添加した反応生成物について分析を行った。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、（Ａ）セロビオース、（Ｂ）ラクトースを基質とした酵素反応を行った後、反応生成物を酸加水分解後、ＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーンＳｔｄは標準の単糖（（Ａ）グルコースとマンノース、（Ｂ）ガラクトースとマンノース）、レーン１はＣＥ−ＮＥ１（対照）、レーン２はｍＤ１、レーン３はｍＤ２、レーン４はｍＤ３、レーン５はｍＲ６を用いた反応生成物である。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、最適ｐＨを示す図である。グラフ縦軸は、ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合の相対値を、グラフ横軸はｐＨを示す。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、ｐＨ安定性を示す図である。グラフ縦軸は、保持処理を行わない場合の酵素活性を１００％とした場合の相対活性を、グラフ横軸はｐＨを示す。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、最適温度を示す図である。グラフ縦軸は、２５℃における酵素活性を１００％とした場合の相対活性を、グラフ横軸は反応温度を示す。 ＣＥ−ＮＥ１、精製した組換え酵素（ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６）について、温度安定性を示す図である。グラフ縦軸は、保持処理を行わない場合の酵素活性を１００％とした場合の相対活性を、グラフ横軸は反応温度を示す。 精製した組換え酵素（ｍＲ６）を市販牛乳と反応させ、反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。レーンＳは標準のラクトース、レーン１は３０℃で反応１時間後、レーン２は３０℃で反応２時間後、レーン３は３０℃で反応３時間後、レーン４は３０℃で反応４時間後、レーン５は室温で反応２４時間後の反応生成物である。

（Ｉ）ポリペプチド
本発明は、（１）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（２）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチドを提供する。

また、本発明は、下の（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチドも提供する：
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は４２〜４４ｋＤａであり、
（Ｂ）配列番号９に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
（Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
（Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜７．５で８０％以上の酵素活性を示し、
（Ｅ）ｐＨ５．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
（Ｆ）２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、１５〜３０℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
（Ｇ）５０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。

なお、上記（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は、用いたポリペプチドにおける翻訳後修飾の程度や、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるゲルの濃度によって若干変動するため、実際のポリペプチドの分子質量が約３８ｋＤａ〜４８ｋＤａであり得ることを当業者は容易に理解する。また、本発明により提供される配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは上記（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチドの例であり、その配列情報に基づいて計算された分子量は４５４２５．５である。また、図５のレーン２に示される単一のバンドの位置を正確に表せば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は４３．２ｋＤａである。

さらに本発明は、下の（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチドも提供する：
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４３〜４５ｋＤａであり、
（Ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
（Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
（Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜８．０で８０％以上の酵素活性を示し、
（Ｅ）ｐＨ４．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
（Ｆ）最適温度：２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、１０〜４５℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
（Ｇ）４０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。

なお、上記（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は、用いたポリペプチドにおける翻訳後修飾の程度や、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるゲルの濃度によって若干変動するため、実際のポリペプチドの分子量が約３９ｋＤａ〜４９ｋＤａであり得ることを当業者は容易に理解する。また、本発明により提供される配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは上記（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチドの例であり、その配列情報に基づいて計算された分子量は４８３４６．９である。また、図５のレーン３に示される単一のバンドの位置を正確に表せば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は４４．３ｋＤａである。

本発明はさらに、下のＡ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチドも提供する：
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４６〜４８ｋＤａであり、
（Ｂ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
（Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
（Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜９．０で８０％以上の酵素活性を示し、
（Ｅ）ｐＨ４．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、

（Ｆ）最適温度：２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、１５〜３５℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
（Ｇ）４０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。

なお、このＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は、用いたポリペプチドにおける翻訳後修飾の程度や、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるゲルの濃度によって若干変動するため、実際のポリペプチドの分子量が約４２ｋＤａ〜５２ｋＤａであり得ることを当業者は容易に理解する。また、本発明により提供される配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは上記（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチドの例であり、その配列情報に基づいて計算された分子量は４６９６４．０である。また、図５のレーン４に示される単一のバンドの位置を正確に表せば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は４６．７ｋＤａである。

本発明は、下のＡ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチドも提供する：
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４４〜４６ｋＤａであり、
（Ｂ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
（Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
（Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜７．５で８０％以上の酵素活性を示し、
（Ｅ）ｐＨ５．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
（Ｆ）２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、２０〜４５℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
（Ｇ）５０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。

なお、このＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は、用いたポリペプチドにおける翻訳後修飾の程度や、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるゲルの濃度によって若干変動するため、実際のポリペプチドの分子量が約４０ｋＤａ〜５０ｋＤａであり得ることを当業者は容易に理解する。また、本発明により提供される配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは上記（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチドの例であり、その配列情報に基づいて計算された分子量は４９１７７．６である。また、図５のレーン５に示される単一のバンドの位置を正確に表せば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は４５．４ｋＤａである。

上記のポリプチドは何れも、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチドである。以下、本明細書において使用される場合、「２−エピメラーゼ活性」とは、オリゴ糖の還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒する活性が意図され、「２−エピマー化」とは、オリゴ糖の還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させることが意図される。したがって、本発明のポリペプチドは、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖に対して２−エピメラーゼ活性を示し、当該オリゴ糖を２−エピマー化することができるポリペプチドである。

本発明のポリペプチドは、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖に作用し、還元末端糖残基がβ−１，２結合、β−１，３結合、β−１，６結合、α−１，２結合、α−１，３結合、α−１，４結合、α−１，６結合のいずれかにより結合しているオリゴ糖には作用しない基質特異性を有する。

本発明のポリペプチドに対して基質となる、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖は、２〜１５個の糖残基からなるオリゴ糖が意図される。好ましい糖残基の数は２〜５個であり、具体的には、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、ラクトース、グルコシルマンノース、４β−マンノビオース（Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−Ｏ−Ｄ−マンノース）、またはグロボトリオース（Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース）等を挙げることができる。

本発明のポリペプチドが有する２−エピメラーゼ活性は、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖を基質とした酵素反応により生成する２―エピマー化されたオリゴ糖を定性的または定量的に測定して、表すことができる。例えば、ＨＰＬＣやＴＬＣ等のクロマトグラフィーで反応液中のオリゴ糖を分析し、標準品との保持時間または移動度の比較により反応生成物ピークを同定し、標準品とのピーク面積比またはスポット強度から反応生成物濃度を算出することで、活性を測定することができる。また、標準品がない未知の反応生成物の場合は、例えば反応生成物を酸分解して構成糖に分解した後、クロマトグラフィーによる分離後、還元末端糖残基濃度を分析することで、活性を測定することができる。

以上のように、本発明は、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、セロビオースに対する２−エピメラーゼ活性を有するが、ラクトースまたはセロビオース以外のセロオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性をも有する。このような性質を併せ持つ本発明のポリペプチドは、新規オリゴ糖の合成あるいは希少オリゴ糖の大量生産に非常に有用である。

本発明のポリペプチドが有する理化学的性質における（Ｄ）は、いわゆる「最適ｐＨ」に関する性質であり、３０℃、ｐＨ７．５での酵素活性を１００％とした場合に、８０％以上の酵素活性を示すｐＨを意味する。また本発明のポリペプチドが有する理化学的性質における（Ｅ）は、いわゆる「ｐＨ安定性」に関する性質であり、種々のｐＨで酵素を２０時間４℃で保持した後に、３０℃、ｐＨ７．５での酵素活性が８０％以上残存するｐＨ範囲を意味する。さらに、本発明のポリペプチドが有する理化学的性質における（Ｆ）は、いわゆる「最適温度」に関する性質であり、２５℃、ｐＨ７．５での酵素活性を１００％とした場合に、８０％以上の酵素活性を示す反応温度を意味する。そして本発明のポリペプチドが有する理化学的性質における（Ｇ）は、いわゆる「温度安定性」に関する性質であり、種々の温度で酵素を１時間保持した後に、３０℃、ｐＨ７．５での酵素活性が８０％以上残存する温度範囲を意味する。なお、反応液に要する緩衝液としては、リン酸ナトリウム緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液が好ましく、緩衝液の濃度は２０〜１００ｍＭが好ましい。

本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分アミノ酸配列からなるポリペプチドが意図される。

また、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの精製に有用なアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。ポリペプチドの精製に有用なアミノ酸配列としては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドをコードするアミノ酸配列が挙げられる。

また、本発明のポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、リン酸基や糖鎖等の様々な修飾基を有するポリペプチドであってもよい。

さらに本発明は、配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体も提供する。

本明細書中においてポリペプチドに関して用いられる場合、「変異体」は、配列番号１〜４のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を保持するポリペプチドが意図される。本発明におけるアミノ酸の変異部位および個数は、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドが提供される限りにおいて特に制限はないが、アミノ酸の個数でいえば１〜８０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個である。アミノ酸配列の同一性の程度で改変の許容範囲を表せば、本発明の蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有していればよい。

ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変し得ることは、当該分野において周知である。

好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、欠失、および付加であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明のポリペプチドの還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を変化させない。代表的な保存性置換としては、疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間での相互の置換、ヒドロキシルアミノ酸ＳｅｒおよびＴｈｒの相互の置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの相互の置換、アミド型アミノ酸ＡｓｎおよびＧｌｎの相互の置換、塩基性アミノ酸ＬｙｓおよびＡｒｇの相互の置換、芳香属アミノ酸ＰｈｅおよびＴｙｒの相互の置換等が挙げられる。

当業者は、既知の技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法や、ＤＮＡを用いたＰＣＲ法によって、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加された変異体を作製することができる。さらに、ランダム変異によっても目的は達成される。さらに、上で述べた２−エピメラーゼ活性測定方法を用いれば、作製した変異体が所望の還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するか否かを容易に決定し得る。

（ＩＩ）ポリヌクレオチド
本発明は、本発明のポリペプチドすなわち上記に説明した還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

本明細書の記載に基づけば、当業者は、本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列（または、ＯＲＦもしくはその一部）を取得することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、以下のように取得され得る。

先ず、本発明のポリヌクレオチドをクローニングする際の鋳型となるＤＮＡもしくはＲＮＡを準備する。鋳型のＤＮＡもしくはＲＮＡは、特に限定されるものではなく、例えば単一の生物に由来するものであってもよいし、複数の生物に由来するものであってもよい。したがって例えば、ルーメンや土壌等の自然界のサンプルから公知の方法により調製したメタゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを用いることができる。

「メタゲノム」とは、自然界から、（微）生物の分離・培養をしないで直接回収されたゲノムをいう。近年、環境微生物の生態を調べたり、未培養微生物の有用機能を持つ遺伝子を獲得したりするために、メタゲノム的手法による微生物生態学の研究が注目されている。「メタゲノム的手法」とは、自然界から（微）生物の分離・培養をしないでＤＮＡやＲＮＡを直接組換えて大規模シークエンスを行ない、目的形質（例えば酵素活性）を発現させる手法である。

メタゲノム的手法は、類似遺伝子と目的遺伝子の配列がある程度判明している場合に最も有効に発揮され、ＰＣＲによる完全長の目的機能性遺伝子の単離と発現が可能となる。Ｅｓｃｈｅｎｆｅｌｄｔらは土壌中の難培養性微生物ＤＮＡから２種の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸還元酵素を単離し（Ｗ．Ｈ．Ｅｓｃｈｅｎｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００１年、第６７巻、第４２０６−４２１４頁）、Ｂｅｌｌらも環境バイオマスから新規なリパーゼを単離した（Ｐ．Ｊ．Ｌ．Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第１４８巻、第２２８３−２２９１頁）。同様に、ＵｃｈｉｙａｍａとＷａｔａｎａｂｅは、ＰＣＲでメタゲノム・ウォーキングを行い、キチナーゼの単離を行っている（Ｔ．Ｕｃｈｉｙａｍａ ａｎｄ Ｔ．Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００６年、第４１巻、第１８３−１８８頁）。

本発明のポリヌクレオチドをクローニングする際のプライマーは、本発明のポリヌクレオチドを特異的に増幅可能な塩基配列からなることが好ましい。一例として、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列、例えば配列番号５〜８のいずれかに示される塩基配列の中から、それぞれの塩基配列に特徴的な塩基配列の一部または全部を選択してプライマーとすることができる。

本発明のポリヌクレオチドは、上記の鋳型ＤＮＡもしくはＲＮＡと、上記のプライマーを用いて、公知のＰＣＲ等の方法により取得した組換えＤＮＡから得ることができる。いくつかの組換えＤＮＡ単離物からのヌクレオチド配列情報を組み合わせて、本発明のポリペプチドの全アミノ酸のコード配列、ならびに上流ヌクレオチド配列および下流ヌクレオチド配列を提供し得る。

また、本発明のポリヌクレオチドは、ホスホアミダイド法等の化学合成的手法により、あるいは市販のＤＮＡシンセサイザー等を用いて製造することもできる。

本発明のポリヌクレオチドの好ましい例は、配列番号５〜８のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。また、本発明は、配列番号５〜８の何れかに示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。また、塩基配列の同一性（％）で示せば、配列番号５〜８の塩基配列に対してそれぞれ７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸であればよい。

本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。当該核酸は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。

本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに付加されるＨｉｓタグやＦＬＡＧタグ、あるいはＧＦＰ等のマーカータンパク質をコードする塩基配列を、５’側または３’側に付加されたものであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列には、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列、非翻訳領域の配列等が含まれる。

（ＩＩＩ）ベクター
本発明は、前記の本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

本発明のベクターは、上述した本発明のポリヌクレオチドを含むものであれば、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよく、またインビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクター等が挙げられる。

本発明のベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能である。本発明のベクターは、特に宿主中で自立複製可能なものが好ましく、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡの形態にあることが好ましい。核酸を大腸菌に導入するためのベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、市販の発現ベクターであるｐＥＴ−２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等のプラスミドＤＮＡを、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔＩＩ等のファージＤＮＡ等を、それぞれ挙げることができる。また酵母に導入するためのベクターの例としては、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を挙げることができる

組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドに加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。

発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の他、アミノ酸や核酸等の栄養素の細胞内生合成に関与する遺伝子、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質遺伝子、およびルシフェラーゼ遺伝子等を挙げることができる。

組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。

本発明のポリペプチド、任意の塩基配列ならびに選択マーカー等を用いたベクターの構築に際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させたりあるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）を初めとする、種々の遺伝子組み換え操作を詳細に解説した実験操作マニュアル書の指示に基づいて行うことができる。

本発明のベクターを使用すると、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入でき、当該生物または細胞中に本発明のポリペプチドを発現させることができる。さらに、本発明のベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、本発明のポリペプチドを合成することができる。このように、本発明のベクターは、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

（ＩＶ）形質転換体
本発明は、本発明のポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。すなわち本発明の形質転換体は、本発明のポリペプチドを発現し、生産することのできる形質転換体である。なお、本発明の形質転換体は、本発明のポリペプチドが安定的に発現することが好ましいが、一過性的に発現していてもよい。

本明細書中で使用される場合、「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図されるが、細胞（特に、原核生物細胞、菌類（例えば、糸状菌等）であることが好ましい。本発明における形質転換体は、適当な宿主細胞に本発明のポリヌクレオチドあるいはベクターを導入することによって作製することができる。本発明で使用される宿主細胞は、好ましくは微生物である。好適な微生物としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌（より好ましくは大腸菌）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌（より好ましくは枯草菌）の他に、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エルウニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属微生物、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母等の微生物を挙げることができる。特に好ましい宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。

宿主細胞への本発明のポリヌクレオチドやベクターの導入は、当業者に知られた方法によって行うことができる。宿主細胞へのベクター等の導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、接合伝達法、カルシウムイオンを用いる方法や等が挙げられる。

（Ｖ）ポリペプチドの製造方法
本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法を提供する。

例えば、上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を培養した後、上記ポリペプチドを含有する画分（形質転換細胞、培養上清、またはその混合物）を回収し、慣用的な手法（例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等）に従って、目的のポリペプチドを回収、精製することができる。上記画分が形質転換細胞を含む場合は、上述の慣用的手法に細胞破砕処理を組み合わせて、目的のポリペプチドを回収、精製することも可能である。

上記精製の過程で単離された画分は、例えば、本発明のポリペプチドに特異的なバイオアッセイ（例えば、ラクトースまたはセロオリゴ糖を基質として用いる酵素反応およびその生成物の解析）を用いて分析されることによって、本発明のポリペプチドの存在を確認することができる。

また、例えば、本発明のポリペプチドは、上述の慣用的精製方法に組み合わせて、アフィニティークロマトグラフィーによる精製も可能である。例えば、本発明のポリペプチドのうち、Ｈｉｓタグを有するものはニッケルカラムを、Ｍｙｃタグを有するものは抗Ｍｙｃ抗体を、Ｆｌａｇタグを有するものは抗Ｆｌａｇ抗体を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、効率的な精製が実現される。本発明のポリペプチドを、タグその他の機能性ポリペプチドを付した形態で発現させる場合には、適当なプロテアーゼ（トロンビン、トリプシン等）を用いて付加されたタグや機能性ポリペプチド切断し、本発明のタンパク質を回収することができる。

本発明のポリペプチドは、それ単独の形態でもタグや機能性ポリペプチドが付加された形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本発明で使用されるタンパク質をさらに種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合、リポソームへの封入等、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。

本発明のポリペプチドは、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の、有機化学的合成方法、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を用いて製造することもできるが、遺伝子組換え技術によって、前記の核酸、特に発現ベクターに組み込まれたＤＮＡを原核生物もしくは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた好適な発現系に導入することによって製造することが好ましい。

（ＶＩ）オリゴ糖の製造方法
本発明は、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合した２−エピマー化オリゴ糖の製造方法を提供する。

本発明のオリゴ糖の製造方法は、本発明のポリペプチドを用いる。一実施形態において、本発明の方法は、本発明のポリペプチドを、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖とともにインキュベートする工程を包含する。上記オリゴ糖は特に限定されないが、セロオリゴ糖（セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース等）、ラクトース、グルコシルマンノース、４β−マンノビオースまたはグロボトリオースであることが好ましい。

本発明の方法における触媒反応の条件については、特に限定されないが、使用する本発明のポリペプチドに応じて先に述べた至適条件を考慮して設定することができる。また、本発明のポリペプチドは、精製された状態で触媒反応に使用することもできるが、カラムに固定化した状態、もしくは上記形質転換体の状態で使用することもできる。

本発明の方法において製造したオリゴ糖は、ＨＰＬＣ、シリカゲル、活性炭カラムクロマトグラフィー等の公知の方法により、大量生産レベルで精製される。精製の確認は、先に述べた方法で２−エピメラーゼ活性を測定することで、行うことができる。

（ＶＩＩ）プレバイオティクスの製造方法
本発明は、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合した２−エピマー化オリゴ糖を含むプレバイオティクスの製造方法を提供する。

「プレバイオティクス」は、「腸内フローラ（消化管内に生息している微生物群（主に嫌気性菌叢））のバランスを改善することによって宿主の健康に好影響を与える難消化性物質」（Ｇ．Ｒ．Ｇｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｍ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ、Ｊ． Ｎｕｔｒ．、１９９５年、第１２５巻、第１４０１−１４１２頁、またはＭ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、２００７年、第１３７８３０Ｓ−１３７８３７Ｓ）とされており、本明細書中で使用される場合、「動物（ヒトを含む）の腸内環境において有用な微生物（例えば、乳酸菌、ビフィズス菌等のプロバイオティクス）を増殖させて、腸内環境の改善を促進する物質」が意図される。代表的な「プレバイオティクス」としては、オリゴ糖等の難消化性物質、プロピオン酸菌による乳清発酵物、および食物繊維等があり、オリゴ糖は、プロバイオティクスのエサとなり、食物繊維は腸内細菌を貯留させてその増殖を補助する。

「プレバイオティクス」の効果としては、ミネラル分吸収促進効果、血中コレステロールや中性脂肪値の抑制、動脈硬化の予防、血糖値の抑制、糖尿病の改善、肥満の改善、腸の運動の活性化、便秘の改善、免疫能の活性化、感染症の予防、癌の予防、血中アンモニア値の抑制、肝機能低下による肝性脳症の改善、腸内細菌によるビタミン類合成の促進、各種ミネラルの吸収の促進、潰瘍性大腸炎の症状の改善等が挙げられるが、これらに限定されない。また、「プレバイオティクス」の摂取によってミネラル（例えば、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｆｅ^３＋等）の吸収が改善されることが、最近の研究によって明らかにされており、特にＣａ^２＋の吸収促進効果が注目されている。オリゴ糖は、ミネラル分吸収促進効果を有する場合がある。この作用機序は、オリゴ糖が小腸または大腸の内面の細胞と細胞との間の細胞相互結合組織の隙間（いわゆる、タイトジャンクション（ＴＪ））を広げることによって各種ミネラルの吸収が促進されるためであると考えられている（Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ ａｎｄ Ｈ．Ｈａｒａ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、２００６年、第７９４０１−７９４１０頁）。

本発明者らは、ラクトースの還元末端糖残基の２位水酸基についての立体異性体（エピマー）であるエピラクトースが、プレバイオティクスとして腸内環境改善作用、脂質代謝改善作用、ミネラル吸収促進作用、低カロリー性といった機能を有することを見出し、別途特許出願を行っている（国際特許出願 第ＰＣＴ／ＪＰ２００７／００１２５３号）。本発明のポリペプチドはラクトースからエピラクトースを生成することができ、従って本発明のポリペプチドは、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合した２−エピマー化オリゴ糖を含むプレバイオティクスの製造に利用することができる。

本発明のプレバイオティクスの製造方法は、上記ポリペプチドを用いる。一実施形態において、本発明の方法は、上記ポリペプチドを、還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖を含む材料とともにインキュベートする工程を包含する。上記オリゴ糖を含む材料は、特に限定されないが、例えばラクトースを含む天然原料である乳、特にウシ、ヤギあるいはヒツジ等の家畜乳を生乳のまま、あるいは脱脂してから、用いることができる。また、家畜乳から回収されるホエイ（乳精）画分や、低脂肪乳、低タンパク乳、脱脂・脱タンパク乳あるいは低乳糖乳等の加工乳や乳飲料も、上記オリゴ糖を含む組成物として用いることができ、その場合は、エピラクトースを含むプレバイオティクスを安価にかつ簡便に製造することができる。

以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、請求項および上記実施形態に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、塩基配列の解析はｐＤＲＡＷ３２ ＡｃａＣｌｏｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃａｃｌｏｎｅ．ｃｏｍ／） を，相同性検索はＢＬＡＳＴ（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年、第２１５巻、第４０３−４１０頁）を、塩基配列およびアミノ酸配列の多重整列にはＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（ｖｅｒ．１．８３）（Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１９９４年、第２２巻、第４６７３−４６８０頁）を使用した。

＜実施例１＞メタゲノムＤＮＡとＲＮＡからの遺伝子のクローニングとシーケンス
メタゲノムＤＮＡおよびＲＮＡからのＣＥ遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定を，以下の方法に従って行った。なお、アガロースゲル電気泳動装置には、サブマリン型電気泳動層Ｍｕｐｉｄ−ｅｘ（ＡＤＶＡＮＣＥ社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用し，電気泳動用アガロースには、Ｓｅａｋｅｍ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｌｏｎｚａ社，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を使用した。塩基配列の解析はダイ・ターミネーター法により行い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）あるいはＣＥＱ ８０００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によって行った。サーマルサイクラーは、Ｔ−ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。

（１）ルーメン内容物からのＤＮＡの抽出
ヒツジからカニューレによりルーメン内容物を採取した。約６ｇの新鮮なルーメン内容物を、４５ｍＬの０．１％（ｗ／ｖ）ツィーン８０を含む希釈液［３ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＣＯ_３、０．３４ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．３４ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．３４ｇ／Ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、７．５ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、２４．８ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、３８．４ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、７．５ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、７．５ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．７５ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ_２・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ_２Ｏ、１ｍｇ／Ｌ レサズリン（ｐＨ６．８）］に懸濁し、４℃において植物表面からルーメン細菌を剥離した。その懸濁液を４０μｍのナイロンメッシュで濾過し、濾液を５００×ｇで遠心分離した。回収した上清を遠心分離して（１３，４００×ｇ、１分間、４℃）ルーメン細菌の沈殿を回収した。Ｉｓｏｐｌａｎｔ ＩＩ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）を用いて、この沈殿からＤＮＡを抽出した。

（２）ルーメン内容物からのＲＮＡの抽出と１本鎖ｃＤＮＡの合成
上記（１）と同様に採取したヒツジのルーメン内容物約０．２ｇを液体窒素で凍結し、マルチビーズショッカー（Ｙａｓｕｉ Ｋｉｋａｉ社）を用いて凍結したまま２０００ｒｐｍ、１０秒間の破砕を４回繰り返した。その後、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１ｍＬ加え、室温にて２０００ｒｐｍ、１０秒間の破砕を２回繰り返した。菌体破液に２００μＬのクロロホルムを加え、よく撹拌してから２〜３分間室温で静置後、遠心分離した（２００００×ｇ、１０分間、室温）。上清に５００μＬのイソプロパノールを加え、よく撹拌してから１０分間室温で静置後、遠心分離した（２００００×ｇ、１０分間、４℃）。得られたＲＮＡの沈殿を１００μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水に溶解し、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。精製したｍＲＮＡをＭＩＣＲＯＢＥｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて濃縮した。濃縮後のｍＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。

（３）エピメラーゼ遺伝子部分断片の増幅
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ２−エピメラーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、以下ＡＧＥ）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを２−エピマー化してＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを生成する酵素であり、既にブタ（登録番号ＰＤＢ １Ｆ３Ｐ）とシアノバクテリアであるアナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）（登録番号ＰＤＢ ２ＧＺ６）で立体構造も判明している。そこで、エピメラーゼ遺伝子の増幅に適した共通プライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ）の設計を目的として、Ｒ．ａｌｂｕｓ由来ＣＥ−ＮＥ１（登録番号ＢＡＦ８１１０８）、クロストリジウム ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＩＳＤｇ株由来ＡＧＥ様タンパク（Ｃｐ ＡＧＥ−ｌｉｋｅ、登録番号ＡＢＸ４２６２５）、カルディセルロシルプター サッカロリティクス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＤＳＭ ８９０３株由来ＡＧＥ様タンパク（Ｃｓ ＡＧＥ−ｌｉｋｅ、登録番号ＥＡＰ４３９７０）とバクテロイデス フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＹＣＨ ４６株由来ＡＧＥ様タンパク（Ｂｆ ＡＧＥ−ｌｉｋｅ、登録番号ＢＡＤ４７６００）の各アミノ酸配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて多重整列した。

多重整列の結果（図４）、２つの保存領域（それぞれ、ボールド・フェース体で表示）が認められた。配列の上に示した黒丸（●）は、ＡｎａｂａｅｎａのＡＧＥ反応に関与する推定触媒残基を示している（Ｙ．Ｃ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００７年、第３６７巻、第８９５−９０８頁）。この保存領域の塩基配列を使用して、共通プライマーとして、ｕｎｉｖ−ｆ（配列番号１３）とｕｎｉｖ−ｒ（配列番号１４）を設計した。

前記（１）の抽出ＤＮＡを試料とした場合、１００ｎｇのＤＮＡ、１ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）、１×ＰＣＲ緩衝液（２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ）および各０．２５μＭの前記プライマーｕｎｉｖ−ｆとｕｎｉｖ−ｒにより調製した２５μＬのＰＣＲ反応溶液でＰＣＲを行った。また、前記（２）の一本鎖ＤＮＡを試料とした場合、１００ｎｇのＤＮＡ、１２．５μＬのＡｍｐｄｉｒｅｃｔ Ｐｌｕｓ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社）、１ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）またはＮｏｖａ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ社）および各６．２５ｐｍｏｌのプライマーｕｎｉｖ−ｆとｕｎｉｖ−ｒにより調製した２５μＬのＰＣＲ反応溶液でＰＣＲを行った。ＤＮＡサーマルサイクラーは、９４℃で３０秒、４８℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル、続けて７２℃で４．５分伸長反応後、４℃で冷却する設定とした。ＰＣＲ反応によって増幅された４種類の断片（ｍｄ１、ｍｄ２、ｍｄ３、ｍｄ６）を電気泳動（１．５％アガロースゲル）で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製し、その塩基配列を決定した。

（４）エピメラーゼ遺伝子部分断片からの完全長遺伝子の取得
（３）で増幅されたｍｄ１〜３およびｍｄ６の各塩基配列を基にして、インバースＰＣＲと入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ用の下記の各プライマーを設計、合成した。

（１）の抽出ＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩでそれぞれ２時間消化し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ ｋｉｔ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）を用いて、一晩、自己環状化（セルフライゲーション）反応を行った。１００ｎｇのセルフライゲーションしたＤＮＡ、１ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）および１×ＰＣＲ緩衝液（２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、それぞれ０．２ｍＭのｄＮＴＰ、インバースＰＣＲ用の各プライマーセット２０ｐｍｏｌを含む）２５μＬにより調製したＰＣＲ反応溶液で、インバースＰＣＲを行った。次に、インバースＰＣＲの反応産物１．０μＬ、１ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）および１×ＰＣＲ緩衝液（２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、それぞれ０．２ｍＭのｄＮＴＰ、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ用各プライマーセット２０ｐｍｏｌを含む）２５μＬにより調製したＰＣＲ反応溶液で、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。いずれのＰＣＲ反応も、ＤＮＡサーマルサイクラーは、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分を４０サイクル、続けて７２℃で５分伸長反応後、４℃で冷却する設定とした。ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによる増幅断片を電気泳動（１．０％アガロースゲル）で分離し、Ｒｅｃｏｃｈｉｐ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）を用いて回収した。回収した増幅断片をそれぞれｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にサブクローニング後、塩基配列を決定した。

決定した塩基配列を基に、さらに下記の各プライマーを設計した。
ｍｄ１； ｍｄ１Ｆ−Ｓ１（配列番号３１）とｍｄ１Ｆ−Ａ１（配列番号３２）
ｍｄ２； ｍｄ２Ｆ−Ｓ１（配列番号３３）とｍｄ２Ｆ−Ａ１（配列番号３４）
ｍｄ３； ｍｄ３Ｆ−Ｓ１（配列番号３５）とｍｄ３Ｆ−Ａ１（配列番号３６）
ｍｒ６； ｍｒ６Ｆ−Ｓ１（配列番号３７）とｍｒ６Ｆ−Ａ１（配列番号３８）

前記（１）の抽出ＤＮＡ１００ｎｇ、１ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよび１×ＰＣＲ緩衝液（２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、上記各プライマーセット２０ｐｍｏｌを含む）２５μＬにより調製したＰＣＲ反応溶液で、さらにＰＣＲを行った。ＤＮＡサーマルサイクラーは、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で２分を３５サイクル、続けて７２℃で５分伸長反応後、４℃で冷却する設定とした。増幅されたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクターにサブクローニングして、完全長のｍｄ１、ｍｄ２、ｍｄ３、ｍｒ６を含む組換えプラスミドｐＧＥＭ−ｍｄ１、ｐＧＥＭ−ｍｄ２、ｐＧＥＭ−ｍｄ３およびｐＧＥＭ−ｍｒ６を得、それぞれの塩基配列を決定した。

ｍｄ１の塩基配列とそれにコードされるタンパク質（ｍＤ１と表す）の推定アミノ酸配列を配列番号５と配列番号１に、ｍｄ２に含まれるＯＲＦの塩基配列とそれにコードされるタンパク質（ｍＤ２と表す）の推定アミノ酸配列を配列番号６と配列番号２に、ｍｄ３に含まれるＯＲＦの塩基配列とそれにコードされるタンパク質（ｍＤ３と表す）の推定アミノ酸配列を配列番号７と配列番号３に、ｍｒ６に含まれるＯＲＦの塩基配列とそれにコードされるタンパク質（ｍＲ６と表す）の推定アミノ酸配列を配列番号８と配列番号４に、それぞれ示す。

＜実施例２＞タンパク質ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の発現系の構築と精製
（１）発現用プラスミドの構築
タンパク質ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６を大腸菌を宿主として発現させるための発現ベクターを構築するため、以下のプライマーを設計した。

ｍＤ１；ｍＤ１−Ｆ（配列番号３９）とｍＤ１−Ｒ（配列番号４０）
ｍＤ２；ｍＤ２−Ｆ（配列番号４１）とｍＤ２−Ｒ（配列番号４２）
ｍＤ３；ｍＤ３−Ｆ（配列番号４３）とｍＤ３−Ｒ（配列番号４４）
ｍＲ６；ｍＲ６−Ｆ（配列番号４５）とｍＲ６−Ｒ（配列番号４６）

ｍＤ１−ＦおよびｍＤ１−ＲとｐＧＥＭ−ｍｄ１とを、ｍＤ２−ＦおよびｍＤ２−ＲとｐＧＥＭ−ｍｄ２とを、ｍＤ３−ＦおよびｍＤ３−ＲとｐＧＥＭ−ｍｄ３とを、ｍＲ６−ＦおよびｍＲ６−ＲとｐＧＥＭ−ｍｒ６とを組み合わせてＰＣＲを行い、各ＯＲＦ両末端に制限酵素認識部位を導入した（ｍｄ１：ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ、ｍｄ２：ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ、ｍｄ３：ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ、ｍｄ６：ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ）。ＰＣＲは９８℃で１０秒間、５５℃で２秒間、７２℃で１．５分間の反応を２５サイクル行った。反応液から増幅断片をそれぞれ回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。挿入断片に変異が導入されていないことを確認した後、導入した前記制限酵素認識部位を用いて大腸菌発現ベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入して、発現ベクターｐＥＴ−ｍｄ１、ｐＥＴ−ｍｄ２、ｐＥＴ−ｍｄ３およびｐＥＴ−ｍｒ６を得た。

（２）タンパク質の発現誘導
ｐＥＴ−ｍｄ１、ｐＥＴ−ｍｄ２、ｐＥＴ−ｍｄ３およびｐＥＴ−ｍｒ６をＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、最終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で形質転換体を選抜し、同様の液体培地１０ｍＬ中にて３７℃で一晩前培養した。５００ｍＬ容三角フラスコに入れた同液体培地２００ｍＬに前培養液０．５ｍＬを接種し（合計８００ｍＬ）、３７℃で１６０ｒｐｍにて振盪培養を行った。６００ｎｍにおける吸光度が０．６に達した時点でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を最終濃度０．１ｍＭになるように添加し、目的タンパク質の発現を誘導し、さらに２０℃にて２０時間振盪培養を行った。

（３）組換え酵素の精製
以下の操作は全て４℃で行った。
４０００×ｇで１０分間の遠心分離により、（２）の培養液８００ｍＬから菌体を回収した。この菌体を、２５ｍＬの１ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を含む緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）に懸濁した後に、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ＵＤ−２０１（ＴＯＭＹ社）を用いて破砕した。菌体破砕後、２００００×ｇで２０分間の遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液とした。

粗酵素液を、予め緩衝液Ａで平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）とＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の連結カラムに添加した。緩衝液Ａで洗浄後、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍカラムを分離し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着したタンパク質を０〜５００ｍＭのＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出して、５ｍＬずつ５０本に分画して回収した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、組換えタンパク質が最も多く溶出された画分を精製画分として回収した後、緩衝液Ａ中で透析した。

透析後の酵素溶液をＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ社）を用いて濃縮した。濃縮液に等量のグリセロールを加えてよく撹拌した後、精製された組み換え酵素として、使用するまで−２０℃で保存した。

＜実施例３＞組換え酵素の性質
（１）組換え酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，１９７０年、第２２７巻、第６８０−６８５頁）に従って行った。泳動装置には ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎＩＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用した。分離ゲルのアクリルアミド濃度は１０％（ゲル厚０．７５ｍｍ）とし、１５ｍＡの定電流で泳動を行った。泳動後のゲルはＢｉｏ−Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ−２５０ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて染色した。標準タンパク質にはＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｌｏｗ ｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いた。また対照のＣＥ−ＮＥ１は、非特許文献１記載の方法に従って調製した。

得られた全ての精製組換え酵素、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６はＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一なバンドを与えた。それぞれの組換え酵素の電気泳動パターンを図５に示した。レーン１は、ＣＥ−ＮＥ１（対照）、レーン２はｍＤ１、レーン３はｍＤ２、レーン４はｍＤ３、レーン５はｍＲ６である。

（２）組換え酵素のＮ末端アミノ酸配列
精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｅｌｏｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。転写は、ブロッティング緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン、０．１％ ＳＤＳ、１０％メタノール）を使用し、１００Ｖの定電圧で１時間行った。転写後、タンパク質をＣＢＢで染色後、バンドを切り出し、水ならびにメタノールによってそれぞれ３回洗浄を行った。プロテインシーケンサーを用いて、得られたバンドのＮ末端アミノ酸配列を解析した。その結果、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６のＮ末端アミノ酸配列は、それぞれＭＦＶＥＥＩＫＫＤＬＶＥＤ（配列番号９）、ＭＤＬＫＴＭＳＥＱＭＫＥＨ（配列番号１０）、ＭＫＮＥＶＶＹＫＱＬ（配列番号１１）、ＭＶＱＴＭＩＫＥＭＱ（配列番号１２）と同定された。これらのアミノ酸配列は、それぞれの完全長推定アミノ酸配列（配列番号１、２、３、４）のＮ末端配列と完全に一致した。

（３）分子量
精製された組み換え酵素ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６をＳＤＳ−ＰＡＧＥして染色した後、ゲルを市販のデジタルカメラで撮影し，ＩｍａｇｅＪ １．３６ｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて泳動度（図５）を測定し、同一ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｌｏｗ ｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の泳動度から分子量を算出した。その結果、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の分子量は、それぞれ約４３．２、４４．３、４６．７、４５．４ｋＤａと推定された。また、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の推定アミノ酸配列をもとにＣｏｍｐｕｔｅ ｐＩ／Ｍｗ（ｈｔｔｐ：／／ｋｒ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ）を用いて推定分子量を計算した。その結果、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の分子量は４５４２５．５（配列番号１；アミノ酸数、３８９）、４８３４６．９（配列番号２；アミノ酸数、４１２）、４６９６４．０（配列番号３；アミノ酸数、４０５）、４９１７７．６（配列番号４；アミノ酸数、４２３）と見積もられ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と近似していた。なお、非特許文献１によると、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１のＣＥ−ＮＥ１の分子量は、約４３．１ｋＤａ付近である（計算分子量、４５２１７．４；アミノ酸数、３８９）。

（４）等電点
推定アミノ酸配列をもとにした等電点（ｐＩ）を、Ｃｏｍｐｕｔｅ ｐＩ／Ｍｗを用いて計算した。その結果、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の等電点は、それぞれｐＨ４．９９、４．８３、４．８２、４．８９と計算された。なお、非特許文献１によると、Ｒ． ａｌｂｕｓ ＮＥ１のＣＥ−ＮＥ１の計算等電点は、ｐＨ４．６９である。

（５）アミノ酸配列の相同性
ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の推定アミノ酸配列と相同性の高い公知のそれと相同性（同一性）検索を行った（ｂｌａｓｔｐ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。

ｍＤ１は、コプロコックス ユータクタス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｕｔａｃｔｕｓ）ＡＴＣＣ ２７７５９由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＧＥ様）（登録番号ＥＤＰ２７１３０）と６５％、フェカリバクテリウム プラウスニッチ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ｍ２１／２由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＧＥ様）（登録番号ＥＤＰ２２１０８）と６０％、およびＣ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＩＳＤｇ由来ＡＧＥ（登録番号ＡＢＸ４２６２５）と５９％の同一性を示した。Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１株とＡＴＣＣ ２７２１０株のＣＥ（登録番号ＢＡＦ８１１０８とＢＡＦ８１１０９）に対しては５１％の同一性を示した。

ｍＤ２は、Ｃ．ｅｕｔａｃｔｕｓ ＡＴＣＣ ２７７５９由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＧＥ様）（登録番号ＥＤＰ２７１３０）と５５％、Ｃ． ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＩＳＤｇ由来ＡＧＥ様タンパク（登録番号ＡＢＸ４２６２５）と５５％、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ｍ２１／２由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＧＥ様）（登録番号ＡＢＰ６５９４）と５０％、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ８９０３由来ＡＧＥ様タンパク（登録番号ＥＤＰ２７１３０）と４５％の同一性を示した。Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１とＡＴＣＣ ２７２１０のＣＥ（ＢＡＦ８１１０８とＢＡＦ８１１０９）に対しては４４％の同一性を示した。

ｍＤ３は、Ｃ．ｅｕｔａｃｔｕｓ ＡＴＣＣ ２７７５９由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＧＥ様）（登録番号ＥＤＰ２２１０８）と５４％、Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ｍ２１／２由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＧＥ様）（登録番号ＡＢＰ６５９４）と５１％、Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＩＳＤｇ由来ＡＧＥ様タンパク（登録番号ＡＢＸ４２６２５）と５０％の同一性を示した。Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１とＡＴＣＣ２７２１０のＣＥ（登録番号ＢＡＦ８１１０８とＢＡＦ８１１０９）に対しては４６％の同一性を示した。

ｍＲ６は、バクテロイデス ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ８４９２由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＧＥ様）（登録番号ＥＤＯ５２２８２）と５７％、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＮＣＴＣ９３４３由来ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＧＥ様）（登録番号ＣＡＨ０６５２０）と５６％、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ ＹＣＨ４６由来ＡＧＥ様タンパク（登録番号ＢＡＤ４７６００）と５６％、パラバクテロイデス ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）ＡＴＣＣ８５０３由来ＡＧＥ様タンパク（登録番号ＡＢＲ４１８５２）と５４％の同一性を示した。Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１とＡＴＣＣ ２７２１０のＣＥ（登録番号ＢＡＦ８１１０８とＢＡＦ８１１０９）に対しては、３８％の同一性を示した。

図６は、ＣＥ−ＮＥ１の推定アミノ酸配列（登録番号ＢＡＦ８１１０８）と、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の各推定アミノ酸配列との多重整列を示したものである。ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の推定アミノ酸配列は、ＣＥ−ＮＥ１のそれと、それぞれ５０．９、４５．５、４６．６、４０．９％の同一性を示した。

（６）２−エピメラーゼ活性の定量的測定
４０μＬの２５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１０μＬの０．２Ｍ Ｄ−ラクトース（または、適当な基質）および４０μＬの水を混合した後、適当に希釈した１０μＬの酵素溶液を加え反応を開始した。反応温度は３０℃とした。１０分後、１００μＬの０．１Ｎ ＨＣｌを加え混合した後、速やかに２分間煮沸し反応を停止させた。上記の条件で酵素反応させた後、３００μＬの水を加え１３，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清９０μＬに内部標準として１０μＬの２ｍｇ／ｍＬマルチトール（林原社）を混合し、下記の設定のＨＰＬＣに供した。

ＨＰＬＣシステム：ＬＣ−２０００ Ｐｌｕｓ（日本分光）
ガードカラム：ＳＵＧＡＲ ＳＰ−Ｇ（６．０ｍｍ×５０ｍｍ，Ｓｈｏｄｅｘ）
分離カラム：ＳＵＧＡＲ ＳＰ０８１０（８．０ｍｍ×３００ｍｍ、Ｓｈｏｄｅｘ）
溶離液：水
流速：０．８ｍＬ／分
カラム温度：８０℃。
検出：気化光散乱検出器（ＥＬＤ２０００ＥＳ；Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、温度１１５℃、ガス流速３．２ｌ／分

検量線はエピラクトース（Ｓｉｇｍａ社）を用いて作成した。エピラクトースに由来するピーク（溶出時間）とマルチトールに由来するピーク（溶出時間）の面積から相対的に算出した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７６年、第７２巻、第２４８−２５４頁）に従って、タンパク質を定量した。検量線は牛血清アルブミンを用いて作製した。

（７）基質特異性
ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の基質特異性を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって調べた。１５μＬの２０ｍＭグリシルグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、２０μＬの各基質溶液（０．１Ｍ）および５μＬの精製酵素溶液（約０．５μｇ）を混合し、３０℃で一晩反応させた。反応溶液の１μＬをＴＬＣアルミニウムシート（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０、Ｍｅｒｃｋ社）にスポットし、２−プロパノール／１−ブタノール／水＝７：６：２の溶媒系を用いて展開した。乾燥後、アニスアルデヒド法によって生産物の有無を検証した。

セロビオースを基質とした場合の結果を図７に、セロトリオースの結果を図８に、セロテトラオースの結果を図９に、ラクトースの結果を図１０に、４β−マンノビオースの結果を図１１に、グロボトリオースの結果を図１２に示す。ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３は、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、ラクトース、４β−マンノビオースおよびグロボトリオースから生成物を生成した。ｍＲ６の場合、セロビオース、セロトリオース、ラクトース、４β−マンノビオースおよびグロボトリオースから生成物が検出され、セロテトラオースから生成物は検出されなかった。生成物の移動度はＣＥ−ＮＥ１と同一であった。したがってセロビオースからはＧｌｃ−Ｍａｎ（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−マンノース）が、セロトリオースからはＧｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎ（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−マンノース）が、セロテトラオースからはＧｌｃ−Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎ（Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−マンノース）が、ラクトースからはエピラクトース（Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−マンノース）が、４β−マンノビオースからはＭａｎ−Ｇｌｃ（Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース）が、グロボトリオースからはＯ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−マンノースが、それぞれ生成したと推察された。

同じ実験条件下で、セロビオースと、その２位水酸基についてのエピマーであるグルコシルマンノースを基質とした試験を行った。ｍＲ６を用いた結果を図１３に示す。セロビオースを基質とした場合はグルコシルマンノースが生成し、グルコシルマンノースを基質とした場合はセロビオースが生成した。したがって本発明のポリペプチドは、２位水酸基がａｘｉａｌ位、ｅｑｕａｔｒｉａｌ位のいずれの位置にある糖に対しても、エピメラーゼ活性を示すことが明らかとなった。

同じ実験条件下でグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、アラビノース、コージビオース（α−１，２）、ニゲロース（α−１，３）、マルトース（α−１，４）、イソマルトース（α−１，６）、ソホロース（β−１，２）、ラミナリビオース（β−１，３）、ゲンチオビオース（β−１，６）を基質として用いても、ｍＤ１，ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＤ６はいずれも生成物を与えなかった（図１４〜図１６）。

（８）反応生成物の同定
ａ．反応生成物の精製
前記（７）で反応生成物が検出された基質のうち、セロビオース、セロトリオースおよびラクトースについて、生成物の同定を行った。５０ｍｇのセロビオース、セロトリオースあるいはラクトースを１ｍＬの５ｍＭ ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）に溶解し、酵素溶液５μＬ（約２μｇ）を加え、３０℃で一晩反応させた後、全量を０．５ｍｍ厚ガラスＴＬＣプレート（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ_２５４，Ｍｅｒｃｋ）によって２回展開した（２−プロパノール／１−ブタノール／水＝１２：３：４）。ＴＬＣプレートの反応生成物を含む領域のシリカゲルを削りとり、３０ｍＬの水で抽出した。これを８０００×ｇで１０分間の遠心分離を行い、上清を０．２２μｍのシリンジフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）でろ過し、ろ液を凍結乾燥機ＦＤ−１０００（ＥＹＥＬＡ社）で濃縮した。

ｂ．酸加水分解による同定
精製されたセロビオースおよびラクトース（約１ｍｇ）からの反応生成物を１００μＬの水に溶解し、等量の８Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、１００℃で３時処理し、減圧濃縮機で乾固させた。少量の２−プロパノールの添加→再乾固という操作を３回繰り返し、ＴＦＡを完全に取り除いた。その後、１００μＬの水に溶解し、１μＬを前記ａと同じ条件によるＴＬＣで解析した。その結果、セロビオースからの生成物はグルコースとマンノースが、ラクトースからの生成物はガラクトースとマンノースが検出され、発色強度からその組成比はそれぞれ１：１であると予想された（図１７）。これらの結果から、セロビオースから生成したオリゴ糖はＧｌｃ−Ｍａｎ、ラクトースから生成したオリゴ糖はエピラクトースであり、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６が、ＣＥ−ＮＥ１と同様の２−エピメラーゼ活性を有することが示唆された。

ｃ．核磁気共鳴（ＮＭＲ）法による同定
上述のｍＲ６をラクトースに反応させた生成物について、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を重水に置換した後、高分解能核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置（ＢＲＵＫＥＲ ＡＭＸ−５００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（５００ＭＨｚ）；Ｂｒｕｋｅｒ社）に供し、^１３Ｃのスペクトルを測定した（^１３Ｃ−ＮＭＲ）。なお、外部標準としてＴＳＰ（［２，２，３，３−Ｄ_４］ｓｏｄｉｕｍ ３−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）を用いた。得られた^１３Ｃのスペクトルは、市販のエピラクトース（Ｓｉｇｍａ社）スペクトルと完全に一致するものであった。さらに、表２の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるケミカルシフトに纏めたように、得られたエピラクトースはαとβのアノマーであり、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのピークのケミカルシフトから生成物がエピラクトースであると同定した。

また、セロトリオース反応生成物から得られたスペクトルは、過去に報告された細胞壁多糖由来Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎのスペクトルと完全に一致した（Ｒ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、１９９１年、第２１０巻、第２６３−２７６頁）（データは示さない）ことから、Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎであると同定した。

（９）最適ｐＨ
ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６について、最適ｐＨを測定した。１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０）あるいは１００ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５、８．０、８．５、９．０）を用い、緩衝液以外は全て前記（６）の条件に従って活性を測定した。その結果、ｍＤ２はリン酸緩衝液中でｐＨ７．５近傍（図１８Ａ）、ｍＤ２はリン酸緩衝液中でｐＨ７〜８（図１８Ｂ）、ｍＤ３はリン酸緩衝液とグリシルグリシン緩衝液中でｐＨ７〜８．５に渡り（図１８Ｃ）、ｍＲ６はリン酸緩衝液とグリシルグリシン緩衝液中でｐＨ７〜８に最大活性が認められた（図１８Ｄ）。なお、ＣＥ−ＮＥ１の最大活性はリン酸緩衝液中でｐＨ７．５近傍に認められた。

（１０）ｐＨ安定性
ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６のｐＨ安定性試験を行った。各酵素をｐＨ２．５〜１０．０の条件下、２０時間４℃で保持した後、前記（６）の条件に従って残存酵素活性を測定した。その結果、ｍＤ１はｐＨ５〜８、ｍＤ２はｐＨ４〜８、ｍＤ３はｐＨ４〜８、ｍＲ６はｐＨ５〜８の保持処理後も８０％以上の活性を維持した（図１９Ａ〜Ｄ）。なおＣＥ−ＮＥ１は、ｐＨ５〜９の保持処理後も８０％以上の活性を維持した。ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６はいずれもＣＥ−ＮＥ１と同等のｐＨ安定性を有していた。

（１１）最適温度
ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の酵素活性測定を各温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０℃）で行った。反応温度以外は全て（６）の条件に従い、リン酸緩衝液中で活性を測定した。その結果、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６は、それぞれ約２５℃（図２０Ａ）、２０〜４０℃（図２０Ｂ）、２５〜３５℃（図２０Ｃ）、３０〜４５℃付近（図２０Ｄ）で最大活性を示した。なお、ＣＥ−ＮＥ１の最大活性は３０℃近傍に認められた。ＣＥ−ＮＥ１と比較して、ｍＤ２は０℃でも相対活性５０％と、低温領域でも顕著な活性を示す酵素であった。また、ｍＲ６は５０℃でも６０％以上の相対活性を示しており、高温領域でも作用する酵素であった。

（１２）温度安定性
ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６の温度安定性試験を行った。３０、４０、５０、６０℃で１時間インキュベート後、前記（６）の条件に従って、１０分後、３０分後、１時間後の酵素活性を測定した。その結果、ｍＤ１およびｍＲ６は５０℃、ｍＤ２とｍＤ３は４０℃の保持処理後も８０％以上の活性を維持した（図２１Ａ〜Ｄ）。なおＣＥ−ＮＥ１は、４０℃の保持処理後も８０％以上の活性を維持した。ｍＤ１とｍＲ６はＣＥ−ＮＥ１よりも優れた温度安定性を有しており、特にｍＲ６は、５０℃で１時間処理しても、ほぼ１００％の活性を維持しており、極めて温度安定性の高い酵素であった。ｍＤ２およびｍＤ３はＣＥ−ＮＥ１と同等の温度安定性を有していた。

（１３）最大ＵＶ吸収値
各ポリペプチドを２３０〜５００ｎｍでの吸収を測定した。その結果、ｍＤ１、ｍＤ２、ｍＤ３、ｍＲ６のいずれも最大吸収が２７８〜２８０ｎｍにあるタンパク質であった。

＜実施例４＞市販牛乳を用いたプレバイオティクス製造試験
ｍＲ６を用いて、エピラクトースを含むプレバイオティクスの製造試験を行った。市販の牛乳４９０μｌに１０μｌ（約１μｇ）のｍＲ６を添加して酵素反応を行い、３０℃で反応１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、および室温で反応２４時間反応を行った。反応液を水で１０倍希釈し、１０分間煮沸した後、１５０００×ｇで１０分間の遠心分離を行って得た上清をＴＬＣで分析した。上記以外は、全て実施例３の（７）の条件に従った。

３０℃で反応３時間後、４時間後、および室温で反応２４時間後の反応液において、エピラクトースの生成が認められ（図２２）、本発明のポリペプチドを用いることによって市販牛乳から直接、エピラクトースを含むプレバイオティクスの製造が可能であることが示された。

本発明を用いれば、２−エピマー化したセロオリゴ糖やエピラクトースのみならず、所望のβ−１，４結合を有するエピマー化オリゴ糖を容易かつ大量に合成することができるので、食品分野において、例えば、プレバイオティクス、シンバイオティクス、これらを含有する機能性食品（例えば、ノンカロリーもしくは低カロリーの食品、またはミネラル（特に、Ｃａ^２＋等）吸収に優れた食品）を低価格で提供することができる。 また、生理機能を有する食品または食品添加物等を開発することができるので、医薬／製薬の分野においても有用である。

Claims (12)

1. （１）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（２）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチド。
2. 下の（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチド；
   （Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４２〜４４ｋＤａであり、
   （Ｂ）配列番号９に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
   （Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
   （Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜７．５で８０％以上の酵素活性を示し、
   （Ｅ）ｐＨ５．０〜８．０で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
   （Ｆ）最適温度：２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、１５〜３０℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
   （Ｇ）温度安定性：５０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。
3. 下の（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチド；
   （Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４３〜４５ｋＤａであり、
   （Ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
   （Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
   （Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜８．０で８０％以上の酵素活性を示し、
   （Ｅ）ｐＨ４．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
   （Ｆ）２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、１０〜４５℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
   （Ｇ）４０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。
4. 下の（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチド；
   （Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４６〜４８ｋＤａであり、
   （Ｂ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
   （Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
   （Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜９．０で８０％以上の酵素活性を示し、
   （Ｅ）ｐＨ４．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
   （Ｆ）２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、１５〜３５℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
   （Ｇ）４０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。
5. 下の（Ａ）〜（Ｇ）に示される理化学的性質を有するポリペプチド；
   （Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４４〜４６ｋＤａであり、
   （Ｂ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有し、
   （Ｃ）還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を特異的に触媒し、
   （Ｄ）ｐＨ７．５における酵素活性を１００％とした場合に、ｐＨ７．０〜７．５で８０％以上の酵素活性を示し、
   （Ｅ）ｐＨ５．０〜８．０下で４℃、２０時間保持した後、酵素活性が８０％以上残存し、
   （Ｆ）２５℃における酵素活性を１００％とした場合に、２０〜４５℃で８０％以上の酵素活性を示し、および
   （Ｇ）５０℃で１時間保持した後に、３０℃における酵素活性が８０％以上残存する。
6. （１）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（２）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
7. （１）配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（２）配列番号５〜８のいずれかで示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかである、請求項６記載のポリヌクレオチド。
8. 請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
9. 請求項８に記載の組み換えベクターが導入された形質転換体。
10. 還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の当該還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒するポリペプチドの生産方法であって、請求項９記載の形質転換体を培養する工程と、前記形質転換体に前記ポリペプチドを生産させる工程と、前記形質転換体または前記形質転換体の培養上清から前記ポリペプチドを回収する工程とを包含することを特徴とする方法。
11. 還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座が変化した当該還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖の製造方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドと還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖とをインキュベートする工程と、前記ポリペプチドに前記オリゴ糖の還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒させて前記オリゴ糖を製造する工程を包含することを特徴とする方法。
12. 還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座が変化した当該還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖を含むプレバイオティクスの製造方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドと還元末端糖残基がβ−１，４結合により結合しているオリゴ糖を含む材料とをインキュベートする工程と、前記ポリペプチドに前記オリゴ糖の還元末端糖残基の２位水酸基の立体配座を変化させる反応を触媒させて前記プレバイオティクスを製造する工程を包含することを特徴とする方法。

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