JPWO2009057575A1 - 新規アミロイド親和性化合物の使用及び製造方法 - Google Patents

Abstract

アミロイドへの親和性を有し、かつ、変異原性等の毒性がおさえられた化合物を用いて、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でアミロイドを高感度に検出し得る、生体組織中のアミロイドの検出試薬を提供する。下記式（１）で表される化合物またはその塩を含有してなる、生体組織に沈着したアミロイドの検出試薬。（式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４はそれぞれ独立に炭素又は窒素、Ｒ３は式で表される基、Ｒ１は放射性ハロゲン置換基、ｍは、０〜４の整数、ｎは、０又は１の整数である。ここで、Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４のうち少なくとも一つは炭素であって、Ｒ３は炭素であるＡ１、Ａ２、Ａ３又はＡ４に結合する。）

Description

本発明は、新規アミロイド親和性化合物の使用及び製造方法、特に、全身性アミロイドーシスを初めとするアミロイドが蓄積する疾患の診断において、病巣部位におけるアミロイドの検出に有用な、生体組織中のアミロイド検査試薬に関する。

アミロイドと呼ばれる繊維状蛋白質が体内の種々の器官あるいは組織に沈着することにより発症する疾患は、アミロイドーシスと総称されている。アミロイドーシスに共通しているのはアミロイドと呼ばれるβシート構造に富んだ繊維状蛋白質が全身の諸臓器あるいは局所に沈着し、その臓器や組織における機能異常を生じる点である。アミロイドとは、アミロイドβや変異トランスサイレチン、β２ミクログロブリンなど種々のアミロイド前駆体蛋白が生体内において凝集することにより形成される蛋白質凝集体の総称をいう。アミロイドは、いずれのアミロイド前駆体蛋白から形成されても、βシートに富んだ特徴的な構造を有している。そのため、βシートとの結合性を有するコンゴーレッドやチオフラビンＴなどの化合物はアミロイドとの親和性を有するという特徴がある。

アミロイドーシスは、アミロイドの沈着様式により、全身性アミロイドーシスと限局性アミロイドーシスに分類される。
全身性アミロイドーシスは全身の様々な部分にアミロイド沈着が起こる疾患である。全身性アミロイドーシスとしては、例えば、肝臓でアミロイドを作り出し、それが全身の器官に沈着して障害を起こす家族性アミロイドーシス、心臓及び手関節等の大関節にアミロイドが沈着する老人性ＴＴＲアミロイドーシス、長期透析患者の骨、関節等に発症する透析アミロイドーシス、慢性関節リウマチ等の慢性の炎症性疾患に続発する急性期蛋白であるserum amyloid Ａ由来のアミロイドが沈着して発症する反応性ＡＡアミロイドーシス（続発性アミロイドーシス）、免疫グロブリン由来のアミロイドが全身諸臓器に沈着する免疫細胞性アミロイドーシスなどがある。
限局性アミロイドーシスは、一部の臓器のみにアミロイド沈着が起こる疾患である。限局性アミロイドーシスとしては、例えば、アミロイドが脳に蓄積するアルツハイマー病、脳血管アミロイドーシス、クロイツフェルト・ヤコブ病などの脳アミロイドーシスの他、ＩＩ型糖尿病に伴う膵島やインスリノーマにアミロイドが沈着したり、心房にアミロイドが沈着する内分泌アミロイドーシス、皮膚にアミロイドが沈着する皮膚アミロイドーシス、皮膚や肺に結節状のアミロイド沈着が生じる限局性結節性アミロイドーシスなどが挙げられる。

アミロイドーシスの診断は、全身性アミロイドーシスの場合、まず、皮膚、腎臓、胃腸等の生検可能な部位から組織を採取し、コンゴーレッド染色又はチオフラビンＴ染色することにより行われている。コンゴーレッドは、アミロイドのβシート構造部分に親和性が高い蛍光性の化合物であり、その配向性により偏光顕微鏡下で複屈折を示すため、組織内のアミロイド沈着を選択的に染色することができる。同様に、チオフラビンＴも、アミロイドに親和性を有する蛍光性の化合物であり、コンゴーレッドと同様に使用されている。そして、この組織染色により陽性の所見が得られた後、抗体を用いた免疫染色等を組合せ、確定診断が行われる。しかしながら、コンゴーレッドやチオフラビンＴによる染色では、偏光顕微鏡下で観察しても陽性の判定が難しい場合がある。

一方、近年、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ等の画像診断装置が著しく普及したことに伴い、全身性アミロイドーシスを画像診断することも検討されている。
しかし、コンゴーレッドやチオフラビンＴは、標識して画像診断プローブとして使用した場合、アミロイドに対する結合特異性が劣り、良好な検出感度が得られないという欠点があった。
さらに、コンゴーレッドは発癌性を有することから、人体の診断用途には使用することができない。
そこで、全身性アミロイドに親和性及び検出感度が高く、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の検出にも使用できるアミロイド検出用蛍光試薬として、コンゴーレッド誘導体である bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy) styrylbenzene (BSB)やその誘導体が提案されている（非特許文献１４、特許文献７）。ＢＳＢは、脳アミロイドーシス及び全身アミロイドーシスによるアミロイドに対する親和性が高く、その構造にベンジジン構造を持たないため、発癌性の問題性が少なく、放射性標識して画像診断プローブとして使用することもできることが報告されている。

一方、脳アミロイドーシスの代表例であるアルツハイマー病（以下、ＡＤという）については、生検を採取することが不可能であることから、アミロイドに高い親和性を有する化合物をマーカーとして用い、ＡＤをインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で検出する試みが既になされている。
このような脳内アミロイド画像診断用プローブの多くは、アミロイドに対する親和性が高く、かつ脳移行性の高い疎水性の低分子化合物を、種々の放射性核種、例えば^１１Ｃ、^１８Ｆ及び^１２３Ｉ等で標識した化合物である。具体例として、６−ヨード−２−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル］ベンゾチアゾール（以下、ＴＺＤＭという）や６−ヒドロキシ−２−［４’−（Ｎ−メチルアミノ）フェニル］ベンゾチアゾール（以下、６−ＯＨ−ＢＴＡ−１という）を初めとする種々のチオフラビン誘導体（特許文献１、非特許文献３）、（Ｅ）−４−メチルアミノ−４’―ヒドロキシスチルベン（以下、ＳＢ−１３という）や（Ｅ）−４−ジメチルアミノ−４’―ヨードスチルベン（以下、ｍ−Ｉ−ＳＢという）を初めとするスチルベン化合物（特許文献２、非特許文献４，非特許文献５）、６−ヨード−２−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル］ベンゾオキサゾール（以下、ＩＢＯＸという）、６−［２−（フルオロ）エトキシ］−２−［２−（２−ジメチルアミノチアゾール−５−イル）エテニル］ベンゾオキサゾールを初めとするベンゾオキサゾール誘導体（非特許文献６，非特許文献７）、２−（１−｛６−［（２−フルオロエチル）（メチル）アミノ］−２−ナフチル｝エチリデン）マロノニトリル（以下、ＦＤＤＮＰという）を初めとするＤＤＮＰ誘導体（特許文献４、非特許文献８）及び６−ヨード−２−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン（以下、ＩＭＰＹという）を初めとするイミダゾピリジン誘導体（特許文献３、非特許文献９）等を^１１Ｃや放射性ハロゲンで標識した化合物が報告されている。さらに、これらの画像診断用プローブの一部については、ヒトイメージング研究が実施され、ＡＤ患者において健常例とは明らかに異なる脳への放射能集積を示すことが報告されている（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。
また、国際公開第２００７／００２５４０号パンフレットには、アミロイド親和性基に、エチレングリコール又はポリエチレングリコールを介して、放射性同位体を標識部位に結合させた一連の化合物が、開示されている（特許文献５）。
さらに、国際公開第２００７／０６３９４６号パンフレットには、脳内での代謝を抑える目的で、５員の芳香族複素環式基を結合させた一連の化合物が、開示されている（特許文献６）。

特表２００４−５０６７２３号公報 特表２００５−５０４０５５号公報 特表２００５−５１２９４５号公報 特表２００２−５２３３８３号公報 国際公開第２００７／００２５４０号パンフレット 国際公開第２００７／０６３９４６号パンフレット 国際公開第２００５／０１６８８８号パンフレット J. A. Hardy &G. A. Higgins, "Alzheimer’s Disease: The Amyloid Cascade Hypohesis.", Science, 1992, 256, p.184-185 G. McKhann et al., "Clinical diagnosis of Alzheimer’s disease: Report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer’s Disease.", Neurology, 1984, 34, p.939-944 Z.-P. Zhuang et al., "Radioiodinated Styrylbenzenes and Thioflavins as Probes for Amyloid Aggregates.", J. Med. Chem., 2001, 44, p.1905-1914 Masahiro Ono et al., "11C-labeled stilbene derivatives as Aβ-aggregate-specific PET imaging agents for Alzheimer’s disease.", Nuclear Medicine and Biology, 2003, 30, p.565-571 H. F. Kung et al., "Novel Stilbenes as Probes for amyloid plaques .", J. American Chemical Society, 2001, 123, p.12740-12741 Zhi-Ping Zhuang et al., "IBOX(2-(4’-dimethylaminophenyl)-6- iodobensoxazole): a ligand for imaging amyloid plaques in the brain.", Nuclear Medicine and Biology, 2001, 28, p.887-894 Furumoto Y et al., "[11C]BF-227: A New 11C-Labeled 2-Ethenylbenzoxazole Derivative for Amyloid-β Plaques Imaging.", European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 2005, 32, Sup.1, P759 Eric D. Agdeppa et al., "2-Dialkylamino-6-Acylmalononitrile Substituted Naphthalenes (DDNP Analogs): Novel Diagnostic and Therapeutic Tools in Alzheimer’s Disease.",Molecular Imaging and Biology, 2003, 5, p.404-417 Zhi-Ping Zhuang et al., "Structure-Activity Relationship of Imidazo[1,2-a]pyridines as Ligands for Detectingβ-Amyloid Plaques in the Brain.", J. Med. Chem, 2003, 46,p.237-243 W. E. Klunk et al., "Imaging brain amyloid in Alzheumer’s disease with Pittsburgh Compound-B.", Ann. Neurol., 2004, 55, p.306-319 Nicolaas P. L. G. Verhoeff et al., "In-Vivo Imaging of Alzheimer Disease β-Amyloid With [11C]SB-13 PET.", American Journal of Geriatric Psychiatry, 2004, 12, p.584-595 Hiroyuki Arai et al., "[11C]-BF-227 AND PET to Visualize Amyloid in Alzheimer's Disease Patients", Alzheimer's &Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association, 2006, 2, Sup.1, S312 Christopher M. Clark et al., "Imaging Amyloid with I123 IMPY SPECT", Alzheimer's &Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association, 2006, 2, Sup.1, S342 D. M. Skovronsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 7609

上記の様に、アミロイドを対象とした画像診断プローブとして、種々の化合物が開示され、臨床応用に向けて検討が進められている。
ＴＺＤＭ、ＩＢＯＸ及びｍ−Ｉ−ＳＢのヨードを［^１２５Ｉ］で標識した化合物は、正常マウスを用いた実験の結果、投与後２分点において、いずれも脳内への移行が認められている。しかしこれらの化合物は、正常組織からのクリアランスが十分ではなく、投与後の時間経過に伴い、徐々に脳内に集積する傾向を示している（特表２００５−５１２９４５号公報、Zhi-Ping Zhuang et al.,Nuclear Medicine and Biology, 2001, 28, p.887-894、H. F. Kung et al.,J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, p.12740-12741）。正常組織からのクリアランスが十分でないと、アミロイド集積部位において十分なコントラストが得られないといった問題がある。ＳＢ−１３を［^１１Ｃ］で標識した化合物については、ラットを用いた実験より正常組織からのクリアランスを有することが示されているが、そのクリアランス速度は十分に速いとはいえない（Masahiro Ono et al., Nuclear Medicine and Biology, 2003, 30, p.565-571）。

一方、ＩＭＰＹを初めとするイミダゾピリジン骨格を有する化合物は、投与後脳内へ移行してアミロイドに集積するといった性質を有すると共に、上述した化合物とは異なり正常組織からのクリアランスが早いといった優れた性質を有することが、［^１２５Ｉ］標識化合物を用いた実験の結果明らかとされている。しかし、ＩＭＰＹは、復帰突然変異試験にて陽性を示す化合物であり、この化合物を画像診断プローブとして用いるには、その投与量や投与形態につき十分な注意が必要となる。（国際公開第０３／１０６４３９号パンフレット）
ＦＤＤＮＰについても、復帰突然変異試験にて陽性を示すことが、報告されている。（国際公開第０３／１０６４３９号パンフレット）

アミロイドを標的とした画像診断プローブとしては、アミロイドへの親和性を有し、正常組織からのクリアランスが十分に早いといったＩＭＰＹの優れた性能を維持しつつ、変異原性等の毒性がおさえられた化合物を用いることが好ましいが、現在のところそのような性能を備えた化合物は開示されていない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、アミロイドへの親和性を有し、かつ、変異原性等の毒性がおさえられた化合物を提供することによって、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でアミロイドを高感度に検出できるようにすることを目的とした。

発明者はイミダゾピリジン−フェニル骨格の炭素に水酸基を結合させた特定の新規化合物がアミロイドに対する親和性を備え、かつ、変異原性等の毒性が低いこと、及び、該化合物群をプローブとして使用することにより、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でアミロイドを高感度に検出し得ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、一側面によれば、下記式（１）：

で表される化合物又はその塩を含有してなる、生体組織に沈着したアミロイドの検出試薬を提供する。

生体組織としては、アミロイドーシスにおいてアミロイドが沈着することが知られている種々の組織とすることができる。このような生体組織の代表例としては、脳、心臓、肺、膵臓、骨、関節等が挙げられ、最も代表的な生体組織としては、脳が挙げられる。脳を対象とした場合における、代表的なアミロイドーシスは、アルツハイマー病及びレビー小体型痴呆である。

式（１）中、Ｒ^３は式

で表される基であり、
Ｒ^１は放射性ハロゲン置換基、ｍは０〜４の整数、ｎは０又は１である。放射性ハロゲンとしては種々の核種を用いることができ、好ましくは^１８Ｆ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ及び^１３１Ｉからなる群より選択されるハロゲン、より好ましくは^１８Ｆ、^１２３Ｉ及び^１２５Ｉからなる群より選択されるハロゲンを用いることができる。なお、式（１）中、ｎ＝０の場合、ｍ＝０〜４であることが好ましく、ｎ＝１の場合、ｍ＝１〜４であることが好ましい。

Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４はそれぞれ独立に炭素又は窒素であるが、少なくとも一つは炭素である必要がある。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうちの３つ以上が炭素であることが好ましく、全てが炭素であることがより好ましい。なお、式（１）において、Ｒ^３は炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４のいずれかに結合する。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のそれぞれは、Ｒ^３が結合していない炭素である場合、それに結合している水素原子は置換されていないものとする。前記式（１）に示された水酸基は、そのフェニル骨格を構成する何れの炭素に結合していてもよいが、該フェニル骨格の４´位の炭素に結合していることが好ましい。Ｒ^３の結合部位は、炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４である限り特に限定されないが、炭素であるＡ^３、すなわち、６位の炭素であることが好ましい。

上記式（１）の化合物は新規化合物であり、本発明は、別の一側面によると、下記式（２）：

（式中、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４はそれぞれ独立に炭素又は窒素、
Ｒ^４は式

で表される基、
ｍは、０〜４の整数、
ｎは、０又は１の整数、
Ｒ^２はｍ＝ｎ＝０のとき、非放射性ハロゲン置換基、ニトロ置換基、炭素数３〜１２のトリアルキルアンモニウム置換基、炭素数３〜１２のトリアルキルスタニル置換基又はトリフェニルスタニル置換基、ｍ≠０及び／又はｎ≠０のとき、非放射性ハロゲン置換基、メタンスルホン酸置換基、トリフルオロメタンスルホン酸置換基又は芳香族スルホン酸置換基である。ここで、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうち少なくとも一つは炭素であって、Ｒ^４は炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４に結合する。）で表される化合物又はその塩と放射性ハロゲンイオンとを含む反応溶液を調製する工程と、
前記反応溶液に反応条件を与えることによって、下記式（１）：

（式中、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４は式（２）と同じ、
Ｒ^３は式

で表される基、
Ｒ^１は放射性ハロゲン置換基、
ｍ及びｎは、式（２）と同じである。
ここで、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうち少なくとも一つは炭素であって、Ｒ^３は炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４に結合する。）で表される化合物又はその塩を合成する工程とを含むことを特徴とする、放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法を提供する。

式（２）において、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４はそれぞれ独立に炭素又は窒素であるが、少なくとも一つは炭素である必要がある。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうちの３つ以上が炭素であることが好ましく、全てが炭素であることがより好ましい。なお、式（２）において、Ｒ^４は炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４のいずれかに結合する。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のそれぞれは、Ｒ^４が結合していない炭素である場合、それに結合している水素原子は置換されていないものとする。前記式（２）に示された水酸基は、そのフェニル骨格を構成する何れの炭素に結合していてもよいが、該フェニル骨格の４´位の炭素に結合していることが好ましい。Ｒ^４の結合部位は、炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４である限り特に限定されないが、炭素であるＡ^３、すなわち、６位の炭素であることが好ましい。

上記式（２）で示される前駆体化合物又はその塩と放射性ハロゲンイオンとを含む反応溶液を調製する工程は、例えば、該前駆体化合物又はその塩を不活性有機溶媒に溶解し、これに公知の方法にて得られた放射性ハロゲンイオン含有溶液を加えることにより行うことができる。
不活性有機溶媒は、該前駆体化合物又はその塩及び放射性ハロゲンイオンとの間で反応性を有さない種々の溶媒を用いることができ、例えば、用いる放射性ハロゲンが放射性ヨウ素の場合は、メタノールを好ましく用いることができ、用いる放射性ハロゲンが放射性フッ素の場合はアセトニトリルを好ましく用いることができる。
上記式（１）で表される化合物又はその塩を合成する工程において反応溶液に与える反応条件は、式（２）の化合物のＲ^２を、反応溶液に添加された放射性ハロゲンイオンで置換する反応を進行させる条件であれば特に限定はされず、放射性ハロゲンイオンの種類に応じた公知の反応条件を使用することができる。

本発明の放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法において、放射性ハロゲンイオンとしては、例えば、^１８Ｆ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ又は^１３１Ｉを用いることができる。
Ｒ^１で示される放射性ハロゲン置換基が^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ又は^１３１Ｉである式（１）の化合物を製造する場合、放射性ハロゲンイオンとして^１２３Ｉイオン、^１２４Ｉイオン、^１２５Ｉイオン又は^１３１Ｉイオンがそれぞれ使用され、式（２）の化合物としては、ｍ＝ｎ＝０のときＲ^２がヨウ素、シュウ素、炭素数３〜１２のトリアルキルスタニル置換基又はトリフェニルスタニル置換基である化合物を、ｍ≠０及び／又はｎ≠０のときＲ^２がヨウ素である化合物を使用することが好ましく、特にｍ＝ｎ＝０の場合においては、Ｒ^２がヨウ素、トリメチルスタニル置換基、トリブチルスタニル置換基及びトリフェニルスタニル置換基である化合物を使用することがより好ましい。
Ｒ^１で示される放射性ハロゲン置換基が^１８Ｆである式（１）の化合物を製造する場合、放射性ハロゲンイオンとして^１８Ｆイオンが使用され、式（２）の化合物としては、ｍ＝ｎ＝０のときＲ^２がニトロ置換基又は炭素数３〜１２のトリアルキルアンモニウム置換基である化合物、ｍ≠０及び／又はｎ≠０のときメタンスルホン酸置換基、トリフルオロメタンスルホン酸置換基又は芳香族スルホン酸置換基である化合物を使用することが好ましく、特にｍ≠０及び／又はｎ≠０の場合において、Ｒ^２がトリフルオロメタンスルホン酸置換基又はトルエンスルホン酸置換基である化合物を使用することがより好ましい。
Ｒ^１で示される放射性ハロゲン置換基が^７５Ｂｒ又は^７６Ｂｒである式（１）の化合物を製造する場合、放射性ハロゲンイオンとして^７５Ｂｒイオン又は^７６Ｂｒイオンがそれぞれ使用され、式（２）の化合物としては、Ｒ^２がシュウ素である化合物を使用することが好ましい。

また、本発明は、更に別の一側面によると、下記式（２）：

（式中、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４はそれぞれ独立に炭素又は窒素、
Ｒ^４は式

で表される基、
ｍは、０〜４の整数、
ｎは、０又は１の整数、
Ｒ^２はｍ＝ｎ＝０のとき、非放射性ハロゲン置換基、ニトロ置換基、炭素数３〜１２のトリアルキルアンモニウム置換基、炭素数３〜１２のトリアルキルスタニル置換基又はトリフェニルスタニル置換基、ｍ≠０及び／又はｎ≠０のとき、非放射性ハロゲン置換基、メタンスルホン酸置換基、トリフルオロメタンスルホン酸置換基又は芳香族スルホン酸置換基である。
ここで、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうち少なくとも一つは炭素であって、Ｒ^４は炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４に結合する。）で表される放射性ハロゲン標識有機化合物調製用の前駆体化合物又はその塩を提供する。

式（２）のＲ^２の非放射性ハロゲン置換基としては、放射性フッ素を用いた求核置換反応における標的となりうるハロゲン又は放射性ヨウ素との間の同位体交換反応の標的となりうるハロゲンを用いることができ、好ましくはヨウ素、臭素又は塩素を用いることができる。トリアルキルスタニル置換基としては種々の置換基を用いることができ、トリメチルスタニル置換基及びトリブチルスタニル置換基を好ましく用いることができる。式（２）において、好ましいＲ²は、ヨウ素、シュウ素、トリメチルスタニル置換基、トリブチルスタニル置換基、トリフルオロメタンスルホン酸置換基及びトリフェニルスタニル置換基からなる群より選択されたものである。なお、式（２）中、ｎ＝０の場合、ｍ＝０〜４であることが好ましく、ｎ＝１の場合、ｍ＝１〜４であることが好ましい。

式（２）において、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４はそれぞれ独立に炭素又は窒素であるが、少なくとも一つは炭素である必要がある。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうちの３つ以上が炭素であることが好ましく、全てが炭素であることがより好ましい。なお、式（２）において、Ｒ^４は炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４のいずれかに結合する。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のそれぞれは、Ｒ^４が結合していない炭素である場合、それに結合している水素原子は置換されていないものとする。前記式（２）に示された水酸基は、そのフェニル骨格を構成する何れの炭素に結合していてもよいが、該フェニル骨格の４´位の炭素に結合していることが好ましい。Ｒ^４の結合部位は、炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４である限り特に限定されないが、炭素であるＡ^３、すなわち、６位の炭素であることが好ましい。

本発明により、アミロイドへの親和性を有し、かつ、変異原性等の毒性がおさえられているため広範囲のアミロイドーシスに関連するアミロイドのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での検出に使用可能なアミロイド検出試薬並びにその製造方法及び製造用中間体を得ることが可能となる。

（放射性ハロゲン標識有機化合物調製用の前駆体化合物の合成方法）
以下、６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを例にとり、本発明の一つの側面に係る、放射性ハロゲン標識有機化合物調製用の前駆体化合物の合成方法を説明する。

まず、４’−ヒドロキシアセトフェノンと臭化第二銅とを反応させ、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノンを合成する（図１、工程１）。このときの反応は定法、例えば文献（King L. Carroll &Ostrum G. Kenneth, Journal of Organic Chemistry, 1964, 29(12), p.3459-3461）記載の方法に従って行うことができる。

次に、上記で合成した２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノンを２−アミノ−５−ブロモピリジンと反応させ、６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシ）フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを合成する（図１、工程２）。この工程は、下記の要領にて行うことができる。

まず、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノンと２−アミノ−５−ブロモピリジンとをアセトニトリル等の不活性溶媒に溶解し、還流温度にて２〜６時間反応させると、６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの臭化水素酸塩が生成し、白色沈殿を生じる。このときの溶媒としては、アセトニトリルの他、メタノールやアセトンといった、同様の反応にて通常用いられる溶媒を用いることができる。また、反応温度は還流することができる温度であればよく、例えばアセトニトリルを溶媒とした場合は９０℃とすることができる。なお、用いる溶媒の量は、反応に十分な量であればよいが、多過ぎると反応物の沈殿を得ることができないため、注意が必要である。例えば、１０ｍｍｏｌ相当の２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノンを用いて反応させる場合は、約４０〜５０ｍＬの溶媒を用いればよい。

次に、反応液をろ過して沈殿物をろ別後、この白色沈殿をメタノール／水混液（１：１）に懸濁し、これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を沈殿物に対して大過剰となるように加えると、６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンが遊離して沈殿が生ずる。この新たに生じた沈殿をろ取することによって、本工程の目的物である６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを得ることができる（図１、工程２）。メタノール／水混液の量は、反応させるために十分な量であれば特に限定する必要はないが、多すぎると生成物の析出の妨げとなるため注意が必要である。例えば、１０ｍｍｏｌ相当の２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノンを用いた場合であれば、４０〜１００ｍＬ程度のメタノール／水混液を用いればよい。また、炭酸水素ナトリウムの量は、反応基質である前記沈殿物に対して大過剰であれば特に限定する必要はなく、例えば、前記条件にて反応させる場合であれば、２５ｍＬ程度の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を反応液に添加すればよい。

次いで、合成した６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを十分に乾燥させた後、ジオキサンに溶解し、トリエチルアミンを加えた後、ビストリブチルスズ及び触媒量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウムを添加する。この反応液を約９０℃に加熱して約２４時間反応させた後、溶媒を留去し、クロマトグラム精製を行って、目的物である６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを得ることができる（図１、工程３）。このとき、ビストリブチルスズの量は、反応基質に対して過剰量となる条件を満たす量であればよく、具体的には反応基質である６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンに対してモル比にして１．５倍程度であれば良い。

なお、６位の置換基をトリブチルスタニル置換基以外のトリアルキルスタニル置換基とした化合物を得る場合は、工程３でビストリブチルスズを用いる代わりに、目的に応じた種々のビストリアルキルスズを用いればよい。例えば、６位の置換基をトリメチルスタニル置換基とした化合物を合成する場合は、工程３においてビストリメチルスズを用いて上記と同様の反応を行えばよい。

また、６位の置換基を非放射性ハロゲン置換基とした化合物を得るためには、ハロゲン置換基が臭素の化合物については、工程２で得られた化合物をそのまま用いればよく、６位のハロゲン置換基がフッ素、塩素およびヨウ素の化合物については、工程２において、２−アミノ−５−ブロモピリジンの代わりに２−アミノ−５−フルオロピリジン、２−アミノ−５−クロロピリジンおよび２−アミノ−５−ヨードピリジンをそれぞれ用い、工程２と同様の反応を行えばよい。

６位に酸素原子を介して、置換基が結合した化合物を得るには、工程２において、２−アミノ−５−ブロモピリジンの代わりに２−アミノ−５−ヒドロキシピリジンを反応させて２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを合成し、これに塩基の存在下、導入したい置換基の臭化物などを反応させればよい。例えば、６位に３−フルオロプロポキシ置換基を結合させた化合物を得るためには、炭酸カリウムの存在下、２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンと１−ブロモ−３−フルオロプロパンを反応させればよい。

さらに、６位にアルキル鎖を介して置換基が結合した化合物を得るためには、次のような操作を行えばよい。例えば６位の置換基が、３’−ブロモプロピル基である化合物については、工程２で得られた２−（４’−ヒドロキシ）フェニル−６−ブロモイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンに、アリルトリブチルスズを反応させて、６−アリル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンへ変換したのち、ヒドロホウ素化と酸化反応を行って、２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−（３’−ヒドロキシプロピル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンへと変換し、さらにトリフェニルホスフィンの存在下、四臭化炭素による水酸基の臭素化を行えばよい。
上記式（１）においてＡ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうちＡ^１を窒素とした化合物、並びに、上記式（２）においてＡ^５、Ａ^６、Ａ^７及びＡ^８のうちＡ^５を窒素とした化合物は、例えば、図１の工程２において２−アミノ−５−ブロモピリジンの代わりに２−アミノ−５−ブロモピリミジンを用いる以外上記の方法に準じて製造することができる。
上記式（１）においてＡ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうちＡ^２及びＡ^４を窒素とした化合物、並びに、上記式（２）においてＡ^５、Ａ^６、Ａ^７及びＡ^８のうちＡ^６及びＡ^８を窒素とした化合物は、例えば、図１の工程２において２−アミノ−５−ブロモピリジンの代わりに６−アミノ−３−ブロモ−１，２，４−トリアジンを用いる以外上記の方法に準じて製造することができる。

（放射性ハロゲン標識有機化合物の合成方法）
次に、２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−［^１２３Ｉ］ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを例にとり、本発明の別の一側面に係る、放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法について説明する。

２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−［^１２３Ｉ］ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの製造においては、まず、標識に供する放射性ハロゲンイオンとして［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウム溶液を得る。［^１２３Ｉ］放射性ヨウ素は、例えば、キセノンガスをターゲットとしてプロトン照射を行うといった、公知の方法にて得ることができる。この［^１２３Ｉ］放射性ヨウ素を公知の方法を用いて［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウム溶液とし、標識に用いる。

次に、標識前駆体である６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを不活性有機溶媒に溶解し、前記［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウム溶液、酸及び酸化剤を加えて反応させ、目的物である２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−［^１２３Ｉ］ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを得る。前駆体を溶解させる不活性有機溶媒としては標識前駆体及び［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウムとの間で反応性を有さない種々の溶媒を用いることができ、好ましくはメタノールを用いることができる。

酸は種々のものを用いることができ、好ましくは塩酸を用いることができる。
酸化剤は、反応液中のヨウ素を酸化させることができるものであれば特に限定する必要はなく、好ましくは過酸化水素又は過酢酸を用いることができる。酸化剤の添加量は、反応溶液中のヨウ素を酸化させるのに十分な量であれば良い。

ヨウ素以外の放射性ハロゲン標識体は、合成目的に応じた標識前駆体を、目的に応じた放射性ハロゲンで標識することによって合成することができる。例えば、６−［^１８Ｆ］フルオロプロポキシ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを合成する場合は、標識前駆体である２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−（３’−パラトルエンスルホニルオキシプロポキシ）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを、相間移動触媒と炭酸カリウムの存在下で［^１８Ｆ］フッ化物イオンと反応させれば良い。

（本発明に係る検出試薬の使用方法及び調製方法）
アミロイドは前駆蛋白の種類により多くの異なる構造を有するが、βシート構造を有する点で共通している。チオフラビンＴやコンゴーレッドを初めとする、アミロイドを対象とした多くの染色試薬は、このβシート構造を認識ターゲットとしており、アミロイドの種類によらず、同様の染色能を有していることが知られている。
本発明に係る式（１）の化合物は、アミロイドβ蛋白質（以下、Ａβという）を前駆体とするアミロイドに親和性を有し、しかも、広範囲のアミロイドに結合することが知られているチオフラビンＴのアミロイドに対する結合阻害作用を有する。
したがって、本発明に係る式（１）の化合物は、チオフラビンＴと同様に、アミロイド蛋白質のβシート構造に親和性を有していると考えられる。このことは、本発明に係る式（１）の化合物が、多種のアミロイドに対して、同様の親和性を有していることを示唆している。
すなわち、本発明のアミロイド検出試薬は、チオフラビンＴやコンゴーレッドと同様に、全身性アミロイドーシス及び限局性アミロイドーシスの診断に使用することができる。ここにおいて、全身性アミロイドーシスとしては、免疫グロブリン性アミロイドーシス、反応性ＡＡアミロイドーシス、家族性アミロイドーシス、透析アミロイドーシス、老人性アミロイドーシスなどが挙げられる。限局性アミロイドーシスとしては、脳アミロイドーシス、内分泌アミロイドーシス、皮膚アミロイドーシス、限局性結節性アミロイドーシスなどが挙げられる。

本発明のアミロイド検出試薬は、生検を対象としたインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で使用する試薬として使用できるだけでなく、放射性診断剤としてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で使用する試薬として使用することができる。

本発明に係るアミロイド検出試薬は、他の一般に知られている放射性診断剤と同様、上記式（１）で示される放射性ハロゲン標識化合物を所望により適当なｐＨに調整された水又は生理食塩水、あるいはリンゲル液等に配合させた液として調製することができる。この場合における本化合物の濃度は、配合された本化合物の安定性が得られる濃度以下とする必要がある。本化合物の投与量は、投与された薬剤の分布を画像化するために十分な量であれば特に限定する必要はない。例えば、ヨウ素−１２３標識化合物及びフッ素−１８標識化合物の場合は、体重６０ｋｇの成人一人当り５０〜６００ＭＢｑ程度、静脈投与又は局所投与して使用することができる。投与された薬剤の分布は、公知の方法にて画像化することができ、例えばヨウ素−１２３標識化合物の場合はＳＰＥＣＴ装置、フッ素−１８標識化合物の場合はＰＥＴ装置を用いて画像化することができる。

本発明のアミロイド検出試薬を生体に投与することにより、脳、心臓、肺、消化管、血管、肝臓、膵臓、腎臓、関節、骨等の生体組織に沈着したアミロイドを画像化することができ、生検の採取が困難な生体組織、例えば、脳、心臓、肺、膵臓、骨及び関節におけるアミロイド沈着を画像化するために有用である。

以下、実施例、比較例及び参考例を記載して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
なお、下記実施例において、実験に供する各化合物の名称を、表１の様に定義した。

（実施例I-１）６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成

臭化第二銅２８．１７ｇ（１２６ｍｍｏｌ相当）に酢酸エチル５０ｍＬを加えて懸濁させ、これに４’−ヒドロキシアセトフェノン８．１８ｇ（６０．０ｍｍｏｌ相当）を酢酸エチル５０ｍＬ−クロロホルム５０ｍＬ混液に溶解した液を加え、加熱還流した。５時間後、反応液を室温まで冷却してろ過を行い、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、活性炭を加えて脱色操作を行った後、溶液をろ過、濃縮した。得られた粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、さらに酢酸エチル−石油エーテルから再結晶を行い、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン７．２５ｇ（３３．７ｍｍｏｌ相当）を得た（図１、工程１）。

２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン２．１５ｇ（１０．０ｍｍｏｌ相当）と２−アミノ−５−ブロモピリジン１．７４ｇ（１０．０ｍｍｏｌ相当）をアセトニトリル５０ｍＬに溶解し、１０５℃の油浴にて６時間加熱還流した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、沈殿物をろ別したのち、アセトニトリルで洗浄し、減圧下乾燥させた。得られた粗結晶を、水２０ｍＬ−メタノール２０ｍＬ混液に懸濁させた後、これに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を約２５ｍＬ加え、超音波洗浄器で５分間振とうした。得られた混合物から、沈殿物をろ別して水でよく洗浄し、減圧下乾燥して、６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン２．４１ｇ（８．３２ｍｍｏｌ相当）を得た（図１、工程２）。

６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン１３８ｍｇ（０．４７６ｍｍｏｌ相当）をジオキサン２０ｍＬに溶解し、トリエチルアミン２ｍＬを加えた後、ビストリブチルスズ３６０μＬ（０．７１３ｍｍｏｌ相当）とテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム２０ｍｇ（触媒量）を加えた。反応混合物を９０℃で２２時間攪拌した後、溶媒を減圧下留去し、残渣をプレパラーティブＴＬＣ（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／４）にて精製した。さらに得られた粗生成物をリサイクル分取ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ装置：ＬＣ−９０８（製品名、日本分析工業社製）、カラム：ＪＡＩＧＥＬ ２Ｈ（製品名、日本分析工業社製）を２本連結、移動相：クロロホルム）を用いて精製し、６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン４７ｍｇ（９４．９μｍｏｌ相当）を得た（図１、工程３）。

得られた６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：テトラメチルシラン）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重クロロホルム、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ8.01-7.94 ( m, 1H ), 7.71-7.67 ( m, 2H ), 7.70-7.67 ( m, 1H ), 7.64-7.60 ( m, 1H ), 7.20-7.11 ( m, 1H ), 6.89-6.85 ( m, 2H ), 1.62-1.46 ( m, 6H ), 1.34 ( sext, J = 7.3 Hz, 6H ), 1.18-1.03 ( m, 6H ), 0.90 ( t, J= 7.3 Hz, 9H )。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：重クロロホルム、共鳴周波数：１２５ＭＨｚ）：δ157.85, 145.11, 144.72, 131.90, 129.93, 127.62, 124.02, 122.59, 116.14, 116.09, 106.19, 28.96, 27.27, 13.62, 9.81。

（実施例I-２）［^１２５Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成

６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのメタノール溶液（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）５３μＬに、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸 ７５μＬ、１３６ＭＢｑの［^１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム（容量として、４０μＬ）、１０％（Ｗ／Ｖ）過酸化水素１０μＬを添加した。当該混合液を５０℃にて１０分間静置した後、下記の条件のＨＰＬＣに付して［^１２５Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン画分を分取した。

ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（商品名、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製、サイズ：４．６×１５０ｍｍ）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む水／０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル＝８０／２０→０／１００（１７分、直線グラジエント）
流速：１．０ ｍＬ／分
検出器：紫外可視吸光光度計（検出波長：２８２ｎｍ）及び放射線検出器 （形式：ＳＴＥＦＦＩ型、ｒａｙｔｅｓｔ社製）

当該画分に水１０ｍＬを添加した液を逆相カラム（商品名：Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標、ウォターズ・インヴェストメンツ・リミテッド）Ｌｉｇｈｔ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、Ｗａｔｅｒｓ社製、充填剤の充填量：１３０ｍｇ）に通液し、［^１２５Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを当該カラムに吸着捕集した。このカラムを水１ｍＬで洗浄した後、エタノール１ｍＬを通液して［^１２５Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを溶出させた。得られた放射能量は合成直後において３７．５ＭＢｑであった。また、下記の条件によるTLC分析にて測定したところ、その放射化学的純度は９６．５％であった。

ＴＬＣ分析条件：
ＴＬＣプレート：ＲＰ−１８Ｆ２５４（製品名、メルク社製）
展開相：メタノール／水＝２０／１
検出器：バイオイメージングアナライザー，ＢＡＳ−２５００（形式：ＢＡＳ−２５００、富士写真フィルム株式会社製）

（実施例I-３）［^１２３Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成

６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのメタノール溶液（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）７０μＬに、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸 ７５〜１００μＬ、２３６〜４５４ＭＢｑの［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウム（容量として、１５〜１２０μＬ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ヨウ化ナトリウム溶液 ７．５〜１０μＬ、１０％（Ｗ／Ｖ）過酸化水素１０〜１５μＬを添加した。当該混合液を５０℃で１０分間加熱した後、実施例I-２と同様の条件のＨＰＬＣに付して［^１２３Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン画分を分取し、［^１２３Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを得た。

当該画分に水１０ｍＬを添加した液を逆相カラム（商品名：Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標、ウォターズ・インヴェストメンツ・リミテッド） Ｌｉｇｈｔ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、Ｗａｔｅｒｓ社製、充填剤の充填量：１３０ｍｇ）に通液し、［^１２３Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを当該カラムに吸着捕集した。このカラムを水１ｍＬで洗浄した後、ジエチルエーテル１ｍＬを通液して［^１２３Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを溶出させた。得られた放射能量は合成直後において２１〜１８０ＭＢｑであった。また、実施例I-２と同様の条件にてＴＬＣ分析を行ったところ、その放射化学的純度は９９．５％であった。

（実施例I-４）６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成

臭化第二銅２８．１７ｇ（１２６ｍｍｏｌ相当）に酢酸エチル５０ｍＬを加えて懸濁させ、これに４’−ヒドロキシアセトフェノン８．１８ｇ（６０．０ｍｍｏｌ相当）を酢酸エチル５０ｍＬ−クロロホルム５０ｍＬ混液に溶解した液を加え、加熱還流した。５時間後、反応液を室温まで冷却してろ過を行い、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、活性炭を加えて脱色操作を行った後、溶液をろ過、濃縮した。得られた粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、さらに酢酸エチル−石油エーテルから再結晶を行い、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン７．２５ｇ（３３．７ｍｍｏｌ相当）を得た（図２、工程１）。

２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン２．１５ｇ（１０．０ｍｍｏｌ相当）と２−アミノ−５−ブロモピリジン１．７４ｇ（１０．０ｍｍｏｌ相当）をアセトニトリル５０ｍＬに溶解し、１０５℃の油浴にて６時間加熱還流した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、沈殿物をろ別したのち、アセトニトリルで洗浄し、減圧下乾燥させた。得られた粗結晶は、水２０ｍＬ−メタノール２０ｍＬ混液に懸濁させた後、これに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を約２５ｍＬ加え、超音波洗浄器で５分間振とうした。得られた混合物から、沈殿物をろ別して水でよく洗浄し、減圧下乾燥して、６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン２．４１ｇ（８．３２ｍｍｏｌ相当）を得た（図２、工程２）。

得られた６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：ジメチルスルホキシド）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ9.54 ( br. s, 1H ), 8.83-8.81 ( m, 1H ), 8.17 ( s, 1H ), 7.79-7.74 ( m, 2H ), 7.51 ( d, J = 9.6 Hz, 1H ), 7.30( dd, J = 9.6, 1.8 Hz, 1H ), 6.86-6.81 ( m, 2H )。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：１２５ＭＨｚ）：δ158.15, 146.40, 143.79, 127.82, 127.67, 127.14, 125.01, 117.87, 116.15, 108.60, 106.05。

（実施例I-５）２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成

臭化第二銅２８．１７ｇ（１２６ｍｍｏｌ相当）に酢酸エチル５０ｍＬを加えて懸濁させ、これに４’−ヒドロキシアセトフェノン８．１８ｇ（６０．０ｍｍｏｌ相当）を酢酸エチル５０ｍＬ−クロロホルム５０ｍＬ混液に溶解した液を加え、加熱還流した。５時間後、反応液を室温まで冷却してろ過を行い、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、活性炭を加えて脱色操作を行った後、溶液をろ過、濃縮した。得られた粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、さらに酢酸エチル−石油エーテルから再結晶を行い、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン７．２５ｇ（３３．７ｍｍｏｌ相当）を得た（図３、工程１）。

２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン４４１ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ相当）と２−アミノ−５−ヨードピリジン４４９ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ相当）をアセトニトリル１５ｍＬに溶解し、１１０℃の油浴にて５時間加熱還流した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、沈殿物をろ別したのち、アセトニトリルで洗浄し、減圧下乾燥させた。得られた粗結晶は、水１０ｍＬ−メタノール１０ｍＬ混液に懸濁させた後、これに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を約１０ｍＬ加え、超音波洗浄器で５分間振とうした。得られた混合物から、沈殿物をろ別して水でよく洗浄し、減圧下乾燥して、２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン５２６ｍｇ（１．５６ｍｍｏｌ相当）を得た（図３、工程２）。

得られた２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：ジメチルスルホキシド）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ8.86-8.84 ( m, 1H ), 8.14 ( s, 1H ), 7.78-7.74 ( m, 2H ), 7.40-7.35 ( m, 2H ), 6.86-6.82 ( m, 2H )。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：１２５ＭＨｚ）：δ158.08, 145.87, 143.87, 132.48, 131.72, 127.67, 124.99, 118.14, 116.14, 108.02, 75.85。

（実施例I-６）２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンの合成

臭化第二銅２８．１７ｇ（１２６ｍｍｏｌ相当）に酢酸エチル５０ｍＬを加えて懸濁させ、これに４’−ヒドロキシアセトフェノン８．１８ｇ（６０．０ｍｍｏｌ相当）を酢酸エチル５０ｍＬ−クロロホルム５０ｍＬ混液に溶解させた液を加え、加熱還流した。５時間後、反応混合物を室温まで冷却してろ過を行い、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、活性炭を加えて脱色操作を行った後、溶液をろ過、濃縮した。得られた粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、さらに酢酸エチル−石油エーテルから再結晶を行い、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン７．２５ｇ（３３．７ｍｍｏｌ相当）を得た（図４、工程１）。

２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン６４６ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ相当）と２−アミノ−５−ヨードピリミジン６６８ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ相当）をアセトニトリル２０ｍＬに溶解し、１１０℃の油浴にて８時間加熱還流した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、沈殿物をろ別したのち、アセトニトリルで洗浄し、減圧下乾燥させた。得られた粗結晶は、水１０ｍＬ−メタノール１０ｍＬ混液に懸濁させた後、これに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を約１５ｍＬ加え、超音波洗浄器で３分間振とうした。得られた混合物から、沈殿物をろ別して水でよく洗浄し、減圧下乾燥して、２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン７３７ｍｇ（２．１９ｍｍｏｌ相当）を得た（図４、工程２）。

得られた２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：ジメチルホルムアミド）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルホルムアミド、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ9.80 ( br. s, 1H ), 9.35 ( d, J = 2.3 Hz, 1H ), 8.60 ( d, J = 2.3 Hz, 1H ), 8.23 ( s, 1H ), 7.94-7.90 ( m, 2H ), 6.98-6.94 ( m, 2H )。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルホルムアミド、共鳴周波数：１２５ＭＨｚ）：δ158.87, 154.00, 147.18, 146.77, 139.07, 127.68, 124.50, 115.85, 106.10, 73.46。

（実施例I-７）６−（３’−フルオロプロポキシ）−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成

２−ブロモ−３−ヒドロキシピリジン３１．１１ｇ（１７８．８８ｍｍｏｌ相当）をジメチルスルホキシド９５．８ｍＬに溶解し、これに１ｍｏｌ／Ｌナトリウムメトキシド−メタノール溶液８９．９ｍＬ（８９．９ｍｍｏｌ相当）を加えた後、反応液を９０℃に加温しメタノールを留去した。反応液を５℃以下まで冷却後、ヨウ化メチル２９．２ｇ（２０５．６２ｍｍｏｌ相当）を加え、室温で１７時間攪拌した。反応終了後、反応液を氷水に注ぎクロロホルムで２回抽出した。合わせたクロロホルム層は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで洗浄したのち、飽和食塩水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去して、２−ブロモ−３−メトキシピリジン２０．７４ｇ（１１０．３１ｍｍｏｌ相当）を得た（図５、工程１）。

濃硫酸８３ｍＬを−５℃まで冷却し、これに９０％硝酸８３ｍＬを注意深く加えた後、２−ブロモ−３−メトキシピリジン２０．６９ｇ（１１０．０４ｍｍｏｌ相当）を注意深く加えた。反応混合物を氷浴下５分攪拌後、室温で１０分攪拌し、さらに５５℃まで昇温して１時間攪拌した。反応液を室温まで冷却後、少量ずつ氷中に注いで沈殿物を生成させ、この沈殿物をろ取して水で洗浄した。これを五酸化二リンの存在下で減圧乾燥させ、２−ブロモ−３−メトキシ−６−ニトロピリジン１７．４１ｇ（７４．７１ｍｍｏｌ相当）を得た（図５、工程２）。

２−ブロモ−３−メトキシ−６−ニトロピリジン１７．３６ｇ（７４．５０ｍｍｏｌ相当）をエタノール５２０ｍＬに溶解し、アルゴン気流下１０％パラジウム炭素（５０％ｗｅｔ）１１．６３ｇを添加後、ヒドラジン１水和物８８．４ｍＬを滴下した。この混合物を４５分間加熱還流後、室温まで冷却してパラジウム炭素をろ過し、さらにろ過物をエタノールで洗浄して洗浄液をろ液と合わせた。この液を減圧濃縮後、水４０２ｍＬと濃アンモニア水３８ｍLを加え、クロロホルムで８回抽出した。合わせたクロロホルム層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧濃縮し、次いで減圧蒸留して、２−アミノ−５−メトキシピリジン８．１４ｇ（６５．５７ｍｍｏｌ相当）を得た（図５、工程３）。

４’−ベンゾイルオキシアセトフェノン１３．５０ｇ（５９．６６ｍｍｏｌ相当）をメタノール１１００ｍＬに溶解し、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムトリブロミド３４．５２ｇ（７１．５９ｍｍｏｌ相当）を加え、室温で終夜攪拌した。溶媒を減圧下留去後、残渣を酢酸エチルに溶解し、これを水で２回洗浄したのち、飽和食塩水で洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して得られた粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／塩化メチレン＝１／１）で精製して、４’−ベンゾイルオキシ−２−ブロモアセトフェノン１３．３８ｇ（４３．８４ｍｍｏｌ相当）を得た（図５、工程４）。

４’−ベンゾイルオキシ−２−ブロモアセトフェノン１３．３３ｇ（４３．６８ｍｍｏｌ相当）と２−アミノ−５−メトキシピリジン５．６７ｇ（４５．６７ｍｍｏｌ相当）をエタノール４８１ｍＬに溶解し、２時間加熱還流した。反応液を冷却後、炭酸水素ナトリウム６．６４ｇ（７９．０９ｍｍｏｌ相当）を加え、反応混合物をさらに４時間加熱還流した。反応終了後溶媒を減圧濃縮し、残渣をクロロホルムに溶解した後、水で洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／酢酸エチル＝２０／１）で精製して、２−（４’−ベンゾイルオキシフェニル）−６−メトキシイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン１０．２０ｇ（３０．８７ｍｍｏｌ相当）を得た（図５、工程５）。

十分に乾燥させ水分を取り除いた２−（４’−ベンゾイルオキシフェニル）−６−メトキシイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン４．９０ｇ（１４．８３ｍｍｏｌ相当）をクロロホルム２４５ｍＬに溶解し、−１５℃まで冷却した。これに三臭化ホウ素１２．６２ｍＬ（１３３．４８ｍｍｏｌ相当）をジクロロメタン１３４ｍＬに溶解した液を滴下し、室温に昇温後１７時間攪拌した。反応終了後、反応液を氷冷してメタノール６６８ｍＬを加え、さらに室温にて３時間攪拌したのち、反応混合物を減圧濃縮した。得られた粗生成物にクロロホルム２９０ｍＬとメタノール２９ｍＬを加えてリパルプ後、沈殿物をろ別した。ろ別した沈殿物をクロロホルムで洗浄した後、減圧下乾燥を行い、２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン３．００ｇ（１３．２８ｍｍｏｌ相当）を得た（図５、工程６）。

２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン５６０ｍｇ（２．４８ｍｍｏｌ相当）をジメチルホルムアミド２１ｍＬに溶解し、炭酸カリウム１．３７ｇ（９．９０ｍｍｏｌ相当）と１−ブロモ−３−フルオロプロパン３４９ｍｇ（２．４８ｍｍｏｌ相当）を加え，室温にて２４時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮した後、これにクロロホルム１０ｍＬとメタノール１０ｍＬを加えてリパルプし、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０：１）で精製して、６−（３’−フルオロプロポキシ）−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン１５１ｍｇ（０．５２７μｍｏｌ相当）を得た（図５、工程７）。

得られた６−（３’−フルオロプロポキシ）−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：ジメチルスルホキシド）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＧＳＸ−２７０（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：２７０ＭＨｚ）：δ9.52 ( s, 1H ), 8.22 ( d, J = 2.2 Hz, 1H ), 8.08 ( s, 1H ), 7.75-7.65 ( m, 2H ), 7.44 ( d, J = 9.6 Hz, 1H ), 6.99 ( dd, J = 9.6, 2.2 Hz, 1H ), 6.85-6.75 ( m, 2H ), 4.62 ( dt, ²J_HF = 47.0 Hz, J = 6.0 Hz,2H ), 4.05 ( t, J = 6.0 Hz, 2H ), 2.13 ( dquint, ³J_HF = 25.9 Hz, J = 6.0 Hz, 2H )。

（実施例I-８）６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンの合成

臭化第二銅２８．１７ｇ（１２６ｍｍｏｌ相当）に酢酸エチル５０ｍＬを加えて懸濁させ、これに４’−ヒドロキシアセトフェノン８．１８ｇ（６０．０ｍｍｏｌ相当）を酢酸エチル５０ｍＬ−クロロホルム５０ｍＬ混液に溶解させた液を加え、加熱還流した。５時間後、反応混合物を室温まで冷却してろ過を行い、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、活性炭を加えて脱色操作を行った後、溶液をろ過、濃縮した。得られた粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、さらに酢酸エチル−石油エーテルから再結晶を行い、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン７．２５ｇ（３３．７ｍｍｏｌ相当）を得た（図６、工程１）。

２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン７４８ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ相当）と２−アミノ−５−ブロモピリミジン６０５ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ相当）をアセトニトリル３０ｍＬに溶解し、１１０℃の油浴にて５時間加熱還流した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、沈殿物をろ別したのち、アセトニトリルで洗浄し、減圧下乾燥させた。得られた粗結晶は、水１０ｍＬ−メタノール１５ｍＬ混液に懸濁させた後、これに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を約１０ｍＬ加え、超音波洗浄器で５分間振とうした。得られた混合物から、沈殿物をろ別して水でよく洗浄し、減圧下乾燥したのち、得られた粗生成物をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから再結晶して、６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン２８９ｍｇ（０．９９７ｍｍｏｌ相当）を得た（図６、工程２）。

得られた６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：ジメチルスルホキシド）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ9.56 ( br. s, 1H ), 9.21 ( d, J = 2.5 Hz, 1H ), 8.46 ( d, J = 2.5 Hz, 1H ), 8.09 ( s, 1H ), 7.79-7.75 ( m, 2H ), 6.83-6.79 ( m, 2H )。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：１２５ＭＨｚ）：δ158.63, 149.99, 147.68, 146.88, 134.78, 127.93, 124.52, 116.23, 106.83, 103.94。

（実施例I-９）６−フルオロ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成

臭化第二銅４０．０ｇ（１７９ｍｍｏｌ相当）に酢酸エチル７０ｍＬを加えて懸濁させ、これに４’−ヒドロキシアセトフェノン１１．６ｇ（８５．３ｍｍｏｌ相当）を酢酸エチル７０ｍＬ−クロロホルム７０ｍＬ混液に溶解させた液を加え、加熱還流した。５．５時間後、反応混合物を室温まで冷却してろ過を行い、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、活性炭を加えて脱色操作を行った後、溶液をろ過、濃縮した。得られた粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、さらに酢酸エチル−石油エーテルから再結晶を行い、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン１０．２ｇ（４７．３ｍｍｏｌ相当）を得た（図７、工程１）。

２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン４３９ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ相当）と２−アミノ−５−フルオロピリジン２２４ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ相当）をアセトニトリル２０ｍＬに溶解し、１１０℃の油浴にて５時間加熱還流した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、沈殿物をろ別したのち、アセトニトリルで洗浄し、減圧下乾燥させた。得られた粗結晶は、水８ｍＬ−メタノール８ｍＬ混液に溶解したのち、これに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を約１０ｍＬ加え、超音波洗浄器で５分間振とうした。混合物から、生成した沈殿物をろ別して水でよく洗浄し、減圧下乾燥して、６−フルオロ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン３０２ｍｇ（１．３２ｍｍｏｌ相当）を得た（図７、工程２）。

得られた６−フルオロ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：ジメチルスルホキシド）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ9.45 ( br. s, 1H ), 8.65 ( ddd, ³J_HF = 4.6 Hz, J = 2.5, 0.7 Hz, 1H ), 8.16-8.15 ( m, 1H ), 7.75-7.69 ( m, 2H ), 7.56-7.51 ( m, 1H ), 7.23 ( ddd, ³J_HF = 8.4 Hz, J = 9.9, 2.5 Hz, 1H ), 6.82-6.76 ( m, 2H )。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：１２５ＭＨｚ）：δ157.82, 152.81 (d, ¹J_CF = 232.3 Hz ), 146.58, 142.92, 127.35, 124.99, 117.19 ( d, ³J_CF = 9.6 Hz ), 116.40 ( d, ²J_CF = 25.9 Hz ), 115.89, 113.66 ( d, ²J_CF = 41.8 Hz ), 109.48。

^１９Ｆ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：４７０MHｚ）：δ141.93 ( br. s )。

（実施例I-１０）２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ニトロイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成

臭化第二銅４０．０ｇ（１７９ｍｍｏｌ相当）に酢酸エチル７０ｍＬを加えて懸濁させ、これに４’−ヒドロキシアセトフェノン１１．６ｇ（８５．３ｍｍｏｌ相当）を酢酸エチル７０ｍＬ−クロロホルム７０ｍＬ混液に溶解させた液を加え、加熱還流した。５．５時間後、反応混合物を室温まで冷却してろ過を行い、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、活性炭を加えて脱色操作を行った後、溶液をろ過、濃縮した。得られた粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、さらに酢酸エチル−石油エーテルから再結晶を行い、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン１０．２ｇ（４７．３ｍｍｏｌ相当）を得た（図８、工程１）。

２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン４３２ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ相当）と２−アミノ−５−ニトロピリジン２７９ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ相当）をアセトニトリル２０ｍＬに溶解し、１１０℃の油浴にて６時間加熱還流した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、沈殿物をろ別したのち、アセトニトリルで洗浄し、減圧下乾燥させた。得られた粗結晶は、水８ｍＬ−メタノール８ｍＬ混液に懸濁し、これに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を約８ｍＬ加え、超音波洗浄器で３分間振とうした。得られた混合物から、沈殿物をろ別して水でよく洗浄し、減圧下乾燥して、２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ニトロイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン１４８ｍｇ（０．５８０ｍｍｏｌ相当）を得た（図８、工程２）。

得られた２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ニトロイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：ジメチルスルホキシド）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ9.74-9.72 ( m, 1H ), 9.59 ( br. s, 1H ), 8.39 ( s, 1H ), 7.87 ( dd, J = 9.9, 2.3 Hz, 1H ), 7.79-7.74 ( m, 2H ), 7.65-7.61 ( m, 1H ), 6.84-6.80 ( m, 2H )。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルスルホキシド、共鳴周波数：１２５ＭＨｚ）：δ158.47, 148.51, 145.25, 136.63, 127.93, 127.81, 124.06, 118.92, 116.09, 115.92, 110.37。

（実施例II-１）６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンの合成

臭化第二銅２８．１７ｇ（１２６ｍｍｏｌ相当）に酢酸エチル５０ｍＬを加えて懸濁させ、これに４’−ヒドロキシアセトフェノン８．１８ｇ（６０．０ｍｍｏｌ相当）の酢酸エチル５０ｍＬ−クロロホルム５０ｍＬ混液を加え、加熱還流した。５時間後、反応液を室温まで冷却してろ過を行い、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、活性炭を加えて脱色操作を行った後、溶液をろ過、濃縮した。得られた粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、さらに酢酸エチル−石油エーテルから再結晶を行い、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン７．２５ｇ（３３．７ｍｍｏｌ相当）を得た（図１０、工程１）。

２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン７４８ｍｇ（３．４８ｍｍｏｌ相当）と５−ブロモ−２−アミノピリミジン６０５ｍｇ（３．４８ｍｍｏｌ相当）をアセトニトリル３０ｍＬに溶解し、１１０℃の油浴にて５時間加熱還流した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、沈殿物をろ別したのち、アセトニトリルで洗浄し、減圧下乾燥させた。得られた粗結晶は、水１０ｍＬ−メタノール１５ｍＬ混液に懸濁させた後、これに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を約１０ｍＬ加え、超音波洗浄器で５分間振とうした。得られた混合物から、沈殿物をろ別して水でよく洗浄し、減圧下乾燥した。得られた固体をＤＭＦから再結晶して、６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン２８９ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ相当）を得た（図１０、工程２）。

６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン７５．４ｍｇ（０．２６０ｍｍｏｌ相当）をジオキサン１０．０ｍＬに溶解し、トリエチルアミン２．０ｍＬを加えた後、ビストリブチルスズ０．２０ｍＬ（０．３９ｍｍｏｌ相当）とテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム２０．１ｍｇ（触媒量）を加えた。反応混合物を９０℃で１０時間攪拌した後、溶媒を減圧下留去し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製を行ない、６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン２４．０ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ相当）を得た（図１０、工程３）。

得られた６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：テトラメチルシラン）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重クロロホルム、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ8.41 ( s, 1H ), 8.23 ( s, 1H ), 7.80 ( d, J = 8.7 Hz, 2H ), 7.63 ( s, 1H ), 6.93 ( d, J = 8.7 Hz, 2H ), 1.57-1.51 ( m,6H ), 1.37-1.23 ( m, 6H ), 1.16-1.12 ( m, 6H ), 0.88 ( d, J = 7.3 Hz, 9H )。

（実施例II-２）６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジンの合成

臭化第二銅２８．１７ｇ（１２６ｍｍｏｌ相当）に酢酸エチル５０ｍＬを加えて懸濁させ、これに４’−ヒドロキシアセトフェノン８．１８ｇ（６０．０ｍｍｏｌ相当）の酢酸エチル５０ｍＬ−クロロホルム５０ｍＬ混液を加え、加熱還流した。５時間後、反応液を室温まで冷却してろ過を行い、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、活性炭を加えて脱色操作を行った後、溶液をろ過、濃縮した。得られた粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、さらに酢酸エチル−石油エーテルから再結晶を行い、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン７．２５ｇ（３３．７ｍｍｏｌ相当）を得た（図１１、工程１）。

２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン４．６６ｇ（２１．６ｍｍｏｌ相当）と５−ブロモ−２−アミノピラジン２．５３ｇ（１４．５ｍｍｏｌ相当）をアセトニトリル１００ｍＬに溶解し、１１０℃の油浴にて３．５時間加熱還流した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、沈殿物をろ別したのち、アセトニトリルで洗浄し、減圧下乾燥させた。得られた粗結晶は、水１０ｍＬ−メタノール１０ｍＬ混液に懸濁させた後、これに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を約２０ｍＬ加え、超音波洗浄器で１０分間振とうした。得られた混合物から、沈殿物をろ別して水でよく洗浄し、減圧下乾燥して、６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン１．３２ｇ（４．５５ｍｍｏｌ相当）を得た（図１１、工程２）。

６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン１．００ｇ（３．４５ｍｍｏｌ相当）をジオキサン５０．０ｍＬに溶解し、トリエチルアミン２０ｍＬを加えた後、ビストリブチルスズ４．５ｍＬ（５．１８ｍｍｏｌ相当）とテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム２３９ｍｇ（触媒量）を加えた。反応混合物を９０℃で２４時間攪拌した後、溶媒を減圧下留去し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製を行ない、６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン３１４ｍｇ（０．６２８ｍｍｏｌ相当）を得た（図１１、工程３）。

得られた６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：テトラメチルシラン）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重クロロホルム、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ9.21 ( s, 1H ), 7.95 ( s, 1H ), 7.79 ( d, J = 8.7 Hz, 2H ), 7.77 ( s, 1H ), 6.91 ( d, J = 8.7 Hz, 2H ), 1.70-1.55 ( m,6H ), 1.38-1.31 ( m, 6H ), 1.18-1.15 ( m, 6H ), 0.89 ( d, J = 7.3 Hz, 9H )。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：重クロロホルム、共鳴周波数１２５ＭＨｚ）：δ157.3, 146.4, 143.5, 140.3, 128.0, 124.9, 123.6, 116.1, 106.9, 29.0, 27.3, 13.7, 10.0。

（実施例II-３）２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピラジンの合成

実施例II-２で得られた、６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン３１４ｍｇ（０．６２８ｍｍｏｌ相当）をジクロロメタン５．０ｍＬに溶解し、同じくジクロロメタン５．０ｍＬに溶解したヨウ素１１４ｍｇ（０．９４２ｍｍｏｌ相当）を加えた。反応混合物を０℃で１０分、室温で３０時間攪拌を行った後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、沈殿物をろ別したのち、水，酢酸エチルの順で洗浄し、減圧下乾燥させ，２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン１３１ｍｇ（０．３８９ｍｍｏｌ相当）を得た（図１２、工程１）。

得られた２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピラジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：テトラメチルシラン）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重ジメチルホルムアミド、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ9.89 ( s, 1H ), 9.01 ( s, 1H ), 8.82, ( s, 1H ), 8.42 ( s, 1H ), 7.92 ( d, J = 8.7 Hz, 2H ), 6.93 ( d, J = 8.7Hz, 2H )。

（実施例II-４）８−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成

臭化第二銅２８．１７ｇ（１２６ｍｍｏｌ相当）に酢酸エチル５０ｍＬを加えて懸濁させ、これに４’−ヒドロキシアセトフェノン８．１８ｇ（６０．０ｍｍｏｌ相当）の酢酸エチル５０ｍＬ−クロロホルム５０ｍＬ混液を加え、加熱還流した。５時間後、反応液を室温まで冷却してろ過を行い、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、活性炭を加えて脱色操作を行った後、溶液をろ過、濃縮した。得られた粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、さらに酢酸エチル−石油エーテルから再結晶を行い、２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン７．２５ｇ（３３．７ｍｍｏｌ相当）を得た（図１３、工程１）。

２−ブロモ−４’−ヒドロキシアセトフェノン４３２ｍｇ（２．０１ｍｍｏｌ相当）と３−ブロモ−２−アミノピリジン３４８ｍｇ（２．０１ｍｍｏｌ相当）をアセトニトリル２０ｍＬに溶解し、１１０℃の油浴にて６時間加熱還流した。反応終了後、反応液を室温まで冷却し、沈殿物をろ別したのち、アセトニトリルで洗浄し、減圧下乾燥させた。得られた粗結晶は、水８ｍＬ−メタノール８ｍＬ混液に懸濁させた後、これに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を約８ｍＬ加え、超音波洗浄器で５分間振とうした。得られた混合物から、沈殿物をろ別して水でよく洗浄し、減圧下乾燥して、８−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン３６８ｍｇ（１．２７ｍｍｏｌ相当）を得た（図１３、工程２）。

８−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン７５．２ｍｇ（０．２６０ｍｍｏｌ相当）をジオキサン１０．０ｍＬに溶解し、トリエチルアミン２．０ｍＬを加えた後、ビストリブチルスズ０．２０ｍＬ（０．３９ｍｍｏｌ相当）とテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム２０．１ｍｇ（触媒量）を加えた。反応混合物を９０℃で１１時間攪拌した後、溶媒を減圧下留去し、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて精製を行ない、８−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン６２．５ｍｇ（０．１２５ｍｍｏｌ相当）を得た（図１３、工程３）。

得られた８−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：テトラメチルシラン）は、以下の通りであった。

使用ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＰ−５００（日本電子株式会社製）
^１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：重クロロホルム、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）：δ8.01( d, J = 6.4 Hz, 1H ),7.87 ( d, J = 8.7 Hz, 2H ), 7.70 ( s, 1H ), 7.17 ( d, J = 6.4 Hz, 1H ), 6.87 ( d, J = 8.7 Hz, 2H ), 6.68-6.66 ( m, 1H ), 1.69-1.56 ( m, 6H ), 1.38-1.30 ( m, 6H ), 1.28-1.16 ( m, 6H ), 0.88 ( t, J = 7.3 Hz, 9H )。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：重クロロホルム、共鳴周波数１２５ＭＨｚ）：δ145.2, 141.0, 139.2, 132.4, 131.8, 127.7, 127.3, 125.0, 115.4, 112.2, 106.4, 29.2, 27.4, 13.7, 10.2。

（実施例II-５）[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンの合成

６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンのメタノール溶液（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬに、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸 １００μＬ、６２１ＭＢｑの［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウム（容量として、１５０μＬ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ヨウ化ナトリウム溶液 ２０μＬ、１０％（Ｗ／Ｖ）過酸化水素２０μＬを添加した。当該混合液を５０℃で１０分間加熱した後、実施例I-２と同様の条件のＨＰＬＣに付して[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン画分を分取し、[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンを得た。

前項同様の操作をおこない[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンを得た（試薬添加量：６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンのメタノール溶液（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）１５０μＬ、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸 ７５μＬ、４８７ＭＢｑの［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウム（容量として、１５０μＬ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ヨウ化ナトリウム溶液 ２０μＬ、１０％（Ｗ／Ｖ）過酸化水素３０μＬ）。

前項並びに前々項の操作によって得た２つの画分を混合し、これに水１０ｍＬを添加した液を逆相カラム（商品名：Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標、ウォターズ・インヴェストメンツ・リミテッド） Ｌｉｇｈｔ Ｃ８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、Ｗａｔｅｒｓ社製、充填剤の充填量：１４５ｍｇ）に通液し、[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンを当該カラムに吸着捕集した。このカラムを水１ｍＬで洗浄した後、ジエチルエーテル１ｍＬを通液して[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンを溶出させた。得られた放射能量は合成直後において６７ＭＢｑであった。また、下記の条件によるＴＬＣ分析を行ったところ、その放射化学的純度は９２．５％であった。

ＴＬＣ分析条件：
ＴＬＣプレート：Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ_２５４（製品名、メルク社製）
展開相：クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝１００／１／２
検出器：Ｒｉｔａ Ｓｔａｒ（製品名、ｒａｙｔｅｓｔ社製）

（実施例II-６）[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，３］ピラジンの合成

６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジンのメタノール溶液（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬに、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸 ７５μＬ、４６９ＭＢｑの［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウム（容量として、１００μＬ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ヨウ化ナトリウム溶液 ２０μＬ、１０％（Ｗ／Ｖ）過酸化水素２０μＬを添加した。当該混合液を５０℃で１０分間加熱した後、実施例I-２と同様の条件のＨＰＬＣに付して[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，３］ピラジン画分を分取し、[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，３］ピラジンを得た。

当該画分に水１０ｍＬを添加した液を逆相カラム（商品名：Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標、ウォターズ・インヴェストメンツ・リミテッド） Ｌｉｇｈｔ Ｃ８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、Ｗａｔｅｒｓ社製、充填剤の充填量：１４５ｍｇ）に通液し、[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，３］ピラジンを当該カラムに吸着捕集した。このカラムを水１ｍＬで洗浄した後、ジエチルエーテル１ｍＬを通液して[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，３］ピラジンを溶出させた。得られた放射能量は合成直後において１３３ＭＢｑであった。また、実施例II-５と同様の条件にてＴＬＣ分析を行ったところ、その放射化学的純度９９．０％であった。

（実施例II-７）
[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−８−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成

８−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのメタノール溶液（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）７０μＬに、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸 ５０μＬ、４５４ＭＢｑの［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウム（容量として、１００μＬ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ヨウ化ナトリウム溶液 ２０μＬ、１０％（Ｗ／Ｖ）過酸化水素２０μＬを添加した。当該混合液を５０℃で１０分間加熱した後、実施例I-２と同様の条件のＨＰＬＣに付して[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−８−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン画分を分取し、[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−８−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを得た。

当該画分に水１０ｍＬを添加した液を逆相カラム（商品名：Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標、ウォターズ・インヴェストメンツ・リミテッド） Ｌｉｇｈｔ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、Ｗａｔｅｒｓ社製、充填剤の充填量：１３０ｍｇ）に通液し、[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−８−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを当該カラムに吸着捕集した。このカラムを水１ｍＬで洗浄した後、ジエチルエーテル１ｍＬを通液して[^１２３Ｉ]−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−８−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを溶出させた。得られた放射能量は合成直後において１８５ＭＢｑであった。また、実施例II-５と同様の条件にてＴＬＣ分析を行ったところ、その放射化学的純度は９１．７％であった。

（参考例１）［^１２５Ｉ］−ＩＭＰＹの合成

ｌｏｇＰ_{ｏｃｔａｎｏｌ}の検討における比較例（比較例I-６）に用いるため、下記の工程に従い、［^１２５Ｉ］−ＩＭＰＹを合成した。

文献（Zhi-Ping Zhuang et al., J. Med. Chem, 2003, 46, p.237-243）記載の方法に従い、６−トリブチルスタニル−２−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを合成し、メタノールに溶解した（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。当該溶液５３μＬに、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸 ７５μＬ、１３．５ＭＢｑの［^１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム２０μＬ、１０％（Ｗ／Ｖ）過酸化水素１０μＬを添加した。当該混合液を５０℃にて１０分間静置した後、実施例I-２と同様の条件のＨＰＬＣに付して［^１２５Ｉ］−ＩＭＰＹ画分を分取した。

当該画分に水１０ｍＬを添加した液を逆相カラム（商品名：Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標、ウォターズ・インヴェストメンツ・リミテッド） Ｌｉｇｈｔ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、Ｗａｔｅｒｓ社製、充填剤の充填量：１３０ｍｇ）に通液し、［^１２５Ｉ］−ＩＭＰＹを当該カラムに吸着捕集した。このカラムを水１ｍＬで洗浄した後、エタノール１ｍＬを通液して［^１２５Ｉ］−ＩＭＰＹを溶出させた。得られた放射能量は合成直後において２．６ＭＢｑであった。また、実施例I-２と同様の条件にてＴＬＣ分析を行ったところ、その放射化学的純度は９８．０％であった。

（参考例２）［^１２３Ｉ］−ＩＭＰＹの合成

脳集積性の検討における比較例（比較例I-７）に用いるため、下記の工程に従い、［^１２３Ｉ］−ＩＭＰＹを合成した。

文献（Zhi-Ping Zhuang et al., J. Med. Chem, 2003, 46, p.237-243）記載の方法に従い、６−トリブチルスタニル−２−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを合成し、メタノールに溶解した（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。当該溶液５３μＬに、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸 １００μＬ、１９０〜２４０ＭＢｑの［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウム２０〜５０μＬ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ヨウ化ナトリウム溶液 １０μＬ、１０％（Ｗ／Ｖ）過酸化水素１０μＬを添加した。当該混合液を５０℃にて１０分間静置した後、実施例I-２と同様の条件のＨＰＬＣに付して［^１２３Ｉ］−ＩＭＰＹ画分を分取した。

当該画分に水１０ｍＬを添加した液を逆相カラム（商品名：Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標、ウォターズ・インヴェストメンツ・リミテッド） Ｌｉｇｈｔ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、Ｗａｔｅｒｓ社製、充填剤の充填量：１３０ｍｇ）に通液し、［^１２３Ｉ］−ＩＭＰＹを当該カラムに吸着捕集した。このカラムを水１ｍＬで洗浄した後、エタノール１ｍＬを通液して［^１２３Ｉ］−ＩＭＰＹを溶出させた。得られた放射能量は合成直後において４７〜５６ＭＢｑであった。また、実施例I-２と同様の条件にてＴＬＣ分析を行ったところ、その放射化学的純度は９８．０％であった。

（実施例I-１１〜I-１４、比較例I-１〜I-５）アミロイド親和性の測定
本発明化合物のアミロイド親和性を、以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合試験により評価した。

（１）Ａβ_１−４０（ペプチド研究所）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解して３７℃で６２〜７２時間振盪させ、凝集Ａβ懸濁液（濃度：１ｍｇ／ｍＬ相当、以下、本実施例にてアミロイド懸濁液という）を得た。

（２）上記アミロイド懸濁液につき、文献（Naiki, H.ら、Laboratory Investigation.74、p.374-383(1996)）記載の方法に従ってチオフラビンＴ（Ｆｌｕｋａ社製）を用いた蛍光光度測定による定性実験を行い、（１）で得た凝集化Ａβがアミロイドであることを確認した（測定条件：励起波長４４６ｎｍ、蛍光波長４９０ｎｍ）。

（３）文献（Wang, Y.ら、J. Labelled Compounds Radiopharmaceut.44, S239(2001)）記載の方法に従い、２−（４’−アミノフェニル）ベンゾチアゾールを標識前駆体として［^１２５Ｉ］２−（３’−ヨード−４’−アミノフェニル）ベンゾチアゾール（以下、［^１２５Ｉ］３’−Ｉ−ＢＴＡ−０という）を調製し、エタノールに溶解した。製造には１２〜７１ＭＢｑの［^１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム（容量として、１０〜３０μL）を使用し、合成直後において１〜２２ＭＢｑの［^１２５Ｉ］３’−Ｉ−ＢＴＡ−０を得た。コンゴーレッド、チオフラビンＴ及び６−メチル−２−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル］ベンゾチアゾール（以下、６−Ｍｅ−ＢＴＡ−２という）は、市販の試薬をそのまま秤量して用いた。

（４）２−（３’−ヨード−４’−アミノフェニル）ベンゾチアゾール（以下、３’−Ｉ−ＢＴＡ−０という）及びＩＭＰＹを、それぞれ文献（Wang, Y.ら、J. Labelled Compounds Radiopharmaceut.44, S239(2001)）及び文献（Zhuang, Z.P.ら、J.Med. Chem.46,237(2003)）記載の方法に従って合成した。

（５）［^１２５Ｉ］３’−Ｉ−ＢＴＡ−０、各評価化合物及びアミロイドの最終濃度が表２記載の濃度となるように０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）に溶解した試料を調製し、９６穴マイクロプレートの各ウェル（容量約０．３ｍＬ）に充填した。

（６）試料溶液を充填したマイクロプレートを、２２℃で３時間、一定速度（４００回転／分）で振盪した後、各試料溶液をグラスファイバーフィルター（商品名：Ｍｕｌｕｔｉｓｃｒｅｅｎ^ＴＭ−ＦＣ、ミリポア社製）にて濾過することにより、アミロイドに結合した［^１２５Ｉ］３’−Ｉ−ＢＴＡ−０と結合していない［^１２５Ｉ］３’−Ｉ−ＢＴＡ−０とを分離した。

（７）各試料溶液の濾過に用いたグラスファイバーフィルターを、０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）で洗浄（０．５ｍＬ×５回）し、グラスファイバーフィルターの放射能をオートウェル・ガンマシステム（形式：ＡＲＣ−３０１Ｂ、Ａｌｏｋａ社製）で測定し、アミロイドに結合した各試料溶液の放射能量として阻害率の計算に用いた（以下、各評価化合物濃度が０の試料における放射能量をＡ、評価化合物濃度が０．００１ｎｍｏｌ／Ｌ以上の試料における放射能量をＢとする）。

（８）別に、０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）に、６−Ｍｅ−ＢＴＡ−２を１５μｍｏｌ／Ｌ、［^１２５Ｉ］３’−Ｉ−ＢＴＡ−０を４００ｐｍｏｌ／Ｌ、Ａβ_１−４０を１μｍｏｌ／Ｌ配合させた液を調製し、上記（６）及び（７）と同様の操作を行って放射能量を測定した。求めた放射能量をバックグランド放射能量とし、阻害率の計算に用いた（以下、ＢＧとする）。

（９）上記（７）及び（８）において測定した放射能量を用い、下記式（１）：

より阻害率を求めた。得られた阻害率をプロビット変換した値を評価化合物の濃度の対数に対してプロットしたグラフを作成し、最小二乗法にて近似直線を作成した。この直線を用い、放射能量が各評価化合物無添加試料における値の半分となるような各評価化合物濃度を求め、各化合物の５０％阻害濃度（以下、ＩＣ_５０％値という）とした。この値を指標として用い、各評価化合物のアミロイド（凝集化Ａβ_１−４０）親和性を評価した。

各評価化合物におけるＩＣ_５０％値を表３に示す。化合物１〜４は、何れも１００未満のＩＣ_５０％値を示し、コンゴーレッド及びチオフラビンＴよりも高いアミロイド（凝集化Ａβ_１−４０）親和性を有していた。この結果より、化合物１〜４は、良好なアミロイド（凝集化Ａβ_１−４０）親和性を有する化合物であることが示された。特に、化合物１においては、３’−Ｉ−ＢＴＡ−０及び６−Ｍｅ−ＢＴＡ−２よりも高くＩＭＰＹと同等のアミロイド（凝集化Ａβ_１−４０）親和性を有していた。

（実施例I-１５、実施例II-８〜II-１０、比較例I-６）オクタノール抽出法を用いた分配係数の測定

化合物の血液脳関門（以下、ＢＢＢという）透過性の指標として一般に知られているオクタノール抽出法を用いた分配係数（以下、ｌｏｇＰ_{ｏｃｔａｎｏｌ}という）を測定した。

実施例I-２にて調製した化合物５のジエチルエーテル溶液（実施例I-１５）、実施例II-５にて調製した化合物９のジエチルエーテル溶液（実施例II-８）、実施例II-６にて調製した化合物１０のジエチルエーテル溶液（実施例II-９）、実施例II-７にて調製した化合物１１のジエチルエーテル溶液（実施例II-１０）及び参考例１にて調製した［^１２３Ｉ］−ＩＭＰＹのジエチルエーテル溶液（比較例I-６）を、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸含有生理食塩液にて希釈し、放射能濃度２０〜３０ＭＢｑ／ｍＬとなるように調整した。調製した試料溶液各１０μＬをそれぞれオクタノール２ｍＬに添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍＬを添加して、３０秒間攪拌した。この混合液を低速遠心機で遠心分離（２０００ 回転／分×６０分間）した後、オクタノール層及び水層を各１ｍＬ分取し、それぞれの放射能カウントをオートウェル・ガンマシステム（形式：ＡＲＣ−３０１Ｂ、Ａｌｏｋａ社製）にて計測した。得られた放射能カウントを用い、式（２）を用いてｌｏｇＰ_{ｏｃｔａｎｏｌ}値を算出した。

結果を表４に示す。化合物５におけるｌｏｇＰ_{ｏｃｔａｎｏｌ}の値は、１．６であり、［^１２５Ｉ］−ＩＭＰＹにおけるｌｏｇＰ_{ｏｃｔａｎｏｌ}の値は、２．１であった。ＢＢＢを透過可能な化合物においては、ｌｏｇＰ_{ｏｃｔａｎｏｌ}値は１〜３の間の値の値であることが知られている（Douglas D. Dischino et al., J.Nucl.Med., (1983), 24, p.1030-1038）。以上の結果より、両化合物は、ＩＭＰＹ同様にＢＢＢ透過性を有するものと示唆された。

（実施例I-１６、比較例I-７）脳内移行性及びクリアランスの測定

化合物６を用い、雄性のＷｉｓｔａｒ系ラット（７週齢）における脳への放射能集積の経時的変化を測定した。

化合物６（実施例I-１６）を１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸含有生理食塩液に溶解した液（放射能濃度２０〜３０ＭＢｑ／ｍＬ）０．０５ｍＬ及び上記参考例２にて調製した［^１２３Ｉ］−ＩＭＰＹ（比較例I-７）を１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸含有生理食塩液に溶解した液（放射能濃度２０〜３０ＭＢｑ／ｍＬ）０．０５ｍＬを、別々のＷｉｓｔａｒ系ラット（７週齢）にチオペンタール麻酔下で尾静脈より投与した。投与後２分、５分、３０分、６０分に腹部大動脈より脱血した上で脳を採取し、脳の放射能をオートウェル・ガンマシステム（形式：ＡＲＣ−３０１Ｂ、Ａｌｏｋａ社製）を用いて計測し（以下、本実施例にてＡとする）、さらに脳の質量を測定した。また、投与液を１０００倍希釈した溶液０．０５ｍＬについての放射能量を同様に測定した（以下、本実施例にてＢとする）。これらの測定結果を用い、下記式（３）より、各解剖時間点における脳への単位重量当たりの放射能集積量（％ＩＤ／ｇ）を算出した。
各時間点において、実施例I-１６及び比較例I-７ともに２匹の動物を用いて実験を行った。

結果を表５に示す。表５に示すように、化合物６は、投与後２分点において、^１２３Ｉ−ＩＭＰＹと同等の集積が認められ、その後６０分にかけて速やかに消失する傾向を示していた。この結果より、化合物６は、^１２３Ｉ−ＩＭＰＹと同様、高い脳移行性及び速やかな脳からのクリアランスを有することが示唆された。

（実施例I-１７）脳内アミロイドの描出の確認

本発明に係る化合物が脳内アミロイドを描出し得るかを評価するため、下記の実験を行った。

（１）Ａβ_１−４０（ペプチド研究所製）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解して３７℃で７２時間振盪させ、凝集Ａβ懸濁液（Ａβ濃度：１ｍｇ／ｍＬ相当、以下、本実施例にてアミロイド懸濁液という）を得た。

（２）雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（７週齢）の片側扁桃核へ上記アミロイド懸濁液を２５μＬ（２５μｇ相当）注入し、対照として、反対側の扁桃核にリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）を２５μＬ注入した。アミロイド懸濁液及びリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）注入１日後のラットを、検体とした。

（３）化合物６を１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸含有生理食塩液に溶解し、試料溶液とした（放射能濃度３２ＭＢｑ／ｍＬ）。この溶液を、上記ラットに尾静脈より投与した（投与量：０．５ｍＬ、投与した放射能：１６ＭＢｑ相当）。

（４）投与６０分後に脳を摘出して、ミクロトーム（形式：ＣＭ３０５０Ｓ、ＬＥＩＣＡ社製）を用いて厚さ１０μｍの脳切片を作製した。当該脳切片をイメージングプレート上で２０時間露光させた後、バイオイメージングアナライザー（形式：ＢＡＳ−２５００、富士写真フィルム株式会社製）を用いて画像解析を行った。

（５）バイオイメージングアナライザーを用いた上記画像解析の終了後、チオフラビンＴによる病理染色を行って蛍光顕微鏡（形式：ＴＥ２０００−Ｕ型、株式会社ニコン製、励起波長：４００〜４４０ｎｍ、検出波長：４７０ｎｍ）を用いたイメージングを行い、当該切片上にアミロイドが沈着していることを確認した（図９ｂ）。

アミロイド脳内注入ラットの脳切片におけるオートラジオグラム及びチオフラビンＴ染色のイメージを図９に示す。この図に示すように、アミロイド懸濁液を注入した側の扁桃核において、明らかな放射能集積が認められた。また、放射能集積部位におけるチオフラビンＴ染色の結果より、当該部位においてアミロイドが存在していることが確認された。一方、生理食塩液を注入した側の扁桃核においては、他の部位と比較した有意な放射能集積は確認されなかった。
この結果より、化合物６は、脳内アミロイドに集積する性能を有し、脳内アミロイドの描出能を有することが示唆された。

（実施例I-１８〜I-２０）復帰突然変異試験

化合物１、化合物２及び化合物４の遺伝子突然変異誘発性を調べるため、ネズミチフス菌（Salmonellatyphimurium）のＴＡ９８及びＴＡ１００を用いる復帰突然変異試験（以下、Ａｍｅｓ試験という）を行った。

試験はＳ９ｍｉｘ無添加とＳ９ｍｉｘ添加の場合について実施した。陰性対象はジメチルスルホオキサイドを用い、陽性対象はＳ９ｍｉｘ無添加の場合は２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミドを用い、Ｓ９ｍｉｘ添加の場合は２−アミノアントラセンを用いた。

試験用プレートへの各試料の添加量は、５０００μg／プレートを最高用量として７用量（公比３）とした。被験物質と試験菌株（ＴＡ９８又はＴＡ１００）、あるいは被験物質とＳ９ｍｉｘと試験菌株を混合後，軟寒天を用いて試験用プレート上の培地へ重層し、３７℃で４８時間培養した。判定は、培養後のプレートにおける復帰突然変異コロニー数をカウントすることにより行い、復帰突然変異コロニー数が陰性対照の２倍以上の値を示し、更に濃度に依存して増加した場合を陽性とした。

結果を表６に示す。化合物１、化合物２及び化合物４処理群における復帰変異コロニー数は、いずれの菌株ともＳ９ｍｉｘ添加の有無および被験物質添加量にかかわらず、陰性対照物質処理群の２倍未満であった。以上の結果より、化合物１、化合物２及び化合物４はＡｍｅｓ陰性と判定され、いずれも遺伝子突然変異誘発性は無いものと判断された。

（実施例II-１１、 II-１２、比較例II-１）脳内移行性及びクリアランスの測定

化合物１０及び化合物１１を用い、雄性のＷｉｓｔａｒ系ラット（７週齢）における脳への放射能集積の経時的変化を測定した。

化合物１０（実施例II-１１）、化合物１１（実施例II-１２）及び上記参考例２にて調製した［^１２３Ｉ］−ＩＭＰＹ（比較例II-１）を、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸含有生理食塩液に溶解した液（放射能濃度２０〜３１ＭＢｑ／ｍＬ）０．０５ｍＬを、別々のＷｉｓｔａｒ系ラット（７週齢）にチオペンタール麻酔下で尾静脈より投与した。投与後２分、５分、３０分、６０分に腹部大動脈より脱血した上で脳を採取し、脳の質量を測定し、さらに脳の放射能をシングルチャネルアナライザー（検出器型番：ＳＰ−２０、応用光研工業株式会社製）を用いて計測した（以下、本実施例にてＡとする）。また、残り全身の放射能量を同様に測定した（以下、本実施例にてＢとする）。これらの測定結果を用い、下記式（４）より、各解剖時間点における、脳への単位質量当たりの放射能集積量（％ＩＤ／ｇ）を算出した。
なお、実験は、各時間点において、３匹の動物を用いて行った。

結果を表７に示す。表７に示すように、化合物１０及び化合物１１は、^１２３Ｉ−ＩＭＰＹ同様、投与後２分点において高い放射能集積が認められ、その後６０分にかけて速やかに消失する傾向を示していた。この結果より、化合物１０及び化合物１１は^１２３Ｉ−ＩＭＰＹと同様、高い脳移行性及び速やかな脳からのクリアランスを有することが示唆された。

（実施例II-１３）アミロイド注入モデルラットを用いた化合物１０のｅｘ ｖｉｖｏオートラジオグラム

（１）Ａβ_１−４２（ペプチド研究所製）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解して３７℃で７２時間振盪させ、１ｍｇ／ｍＬの凝集Ａβ懸濁液（以下、本実施例にてアミロイド懸濁液という）を得た。

（２）雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（７週齢）の片側扁桃核へ上記アミロイド懸濁液を２．５μＬ（２５μｇ相当）注入し、対照として、反対側の扁桃核にリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）を２．５μＬ注入した。アミロイド懸濁液及びリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）注入１日後のラットを、検体とした。

（３）化合物１０を１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸含有生理食塩液に溶解し、試料溶液とした（試料溶液中の放射能濃度３１ＭＢｑ／ｍＬ）。この溶液を、上記ラットに、チオペンタール麻酔下で尾静脈より投与した（投与量：０．５ｍＬ、投与した放射能１５ＭＢｑ相当）。

（４）投与６０分後に脳を摘出して、ミクロトーム（形式：ＣＭ３０５０Ｓ、ＬＥＩＣＡ社製）を用いて厚さ１０μｍの脳切片を作製した。当該脳切片をイメージングプレート上で２０時間露光させた後、バイオイメージングアナライザー（形式：ＢＡＳ−２５００、富士写真フィルム株式会社製）を用いて画像解析を行った。

（５）バイオイメージングアナライザーを用いた上記画像解析の終了後、チオフラビンＴによる病理染色を行って蛍光顕微鏡（株式会社ニコン製、形式：ＴＥ２０００−Ｕ型、励起波長：４００〜４４０ｎｍ、検出波長：４７０ｎｍ）を用いたイメージングを行い、当該切片上にアミロイドが沈着していることを確認した（図１４ｂ）。

アミロイド脳内注入ラットの脳切片におけるオートラジオグラム及びチオフラビンＴ染色のイメージを図１４に示す。この図に示すように、アミロイド懸濁液を注入した側の扁桃核において、明らかな放射能集積が認められた。一方、生理食塩液を注入した側の扁桃核においては、他の部位と比較した有意な放射能集積は確認されなかった。また、このオートラジオグラム上において、アミロイド注入部位以外における放射能集積はほとんど見られなかった。なお、チオフラビンＴ染色の結果より、放射能集積部位においてアミロイドが存在していることが確認されている（図１４ｂ）。この結果より、化合物１０は、脳内アミロイドに集積する性能を有し、脳内アミロイドの描出能を有することが示唆された。

（実施例II-１４）アミロイド注入モデルラットを用いた化合物１１のｅｘ ｖｉｖｏオートラジオグラム

試料溶液として、化合物１１を１0ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸溶液に溶解した液（試料溶液中の放射能濃度３０ＭＢｑ／ｍＬ）を用いた他は、実施例II-１３と同様の操作を行った。

アミロイド脳内注入ラットの脳切片におけるオートラジオグラム及びチオフラビンＴ染色のイメージを図１５に示す。この図に示すように、アミロイド懸濁液を注入した側の扁桃核において、明らかな放射能集積が認められた。また、チオフラビンＴ染色の結果より、放射能集積部位においてアミロイドが存在していることが確認された（図１５ｂ）。一方、生理食塩液を注入した側の扁桃核においては、他の部位と比較した有意な放射能集積は確認されなかった。以上の結果より、化合物１１は、脳内アミロイドに集積する性能を有し、脳内アミロイドの描出能を有することが示唆された。

（実施例II-１５）復帰突然変異試験

化合物８の遺伝子突然変異誘発性を調べるため、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）のＴＡ９８及びＴＡ１００を用いる復帰突然変異試験（以下、Ａｍｅｓ試験という）を行った。

試験はＳ９ｍｉｘ無添加とＳ９ｍｉｘ添加の場合について実施した。陰性対照はジメチルスルホオキサイドを用い、陽性対照はＳ９ｍｉｘ無添加の場合は２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミドを用い、Ｓ９ｍｉｘ添加の場合は２−アミノアントラセンを用いた。

試験用プレートへの化合物８の添加量は、５０００μg／プレートを最高用量として７用量（公比３）とした。化合物８と試験菌株（ＴＡ９８又はＴＡ１００）、あるいは化合物８とＳ９ｍｉｘと試験菌株を混合後、軟寒天を用いて試験用プレート上の培地へ重層し、３７℃で４８時間培養した。判定は、培養後のプレートにおける復帰突然変異コロニー数をカウントすることにより行い、復帰突然変異コロニー数が陰性対照の２倍以上の値を示し、更に濃度に依存して増加した場合を陽性とした。

結果を表８に示す。化合物８処理群における復帰変異コロニー数は、いずれの菌株ともＳ９ｍｉｘ添加の有無および被験物質添加量にかかわらず、陰性対照物質処理群の２倍未満であった。一方、陽性対照物質処理群は、明らかな復帰変異コロニー数の増加を示していた。以上の結果より、化合物８はＡｍｅｓ陰性と判定され、遺伝子突然変異誘発性は無いものと判断された。

（実施例III-1〜実施例III-2）アミロイド結合性の確認
本発明に係る化合物の結合機序を調べるため、アミリンを前駆体とするアミロイドを用い、チオフラビンＴとの結合阻害実験を行った。アミリンは、II型糖尿病において膵臓に蓄積するアミロイドである。

（方法）
（１）アミリン（ヒト）（和光純薬工業）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解して３７℃で７２時間振盪させ、１ｍｇ／ｍＬの凝集化アミリン懸濁液（以下、本実施例にてアミロイド懸濁液という）を得た。

（２）上記アミロイド懸濁液につき、文献（Naiki, H.ら、Laboratory Investigation.74、p.374-383(1996)）記載の方法に従ってチオフラビンＴ（Ｆｌｕｋａ社製）を用いた蛍光光度測定による定性実験を行い、（１）で得た凝集化アミリンがアミロイドであることを確認した（測定条件：励起波長４４６ｎｍ、蛍光波長４９０ｎｍ）。

（３）アミロイド懸濁液中のアミリン濃度が15μMとなるように５０ｍＭ リン酸緩衝液(ｐＨ ７．４）に溶解した。また、チオフラビンＴの濃度が15μMとなるように５０mM グリシン−NaOH緩衝液（ｐＨ ８．５）に溶解した。

（４）各評価化合物及びアミロイドの最終濃度が表９記載の濃度となるように５０ｍＭ リン酸緩衝液(ｐＨ ７．４）に溶解したものを試料溶液とし、（３）で調製したアミロイド液及びチオフラビンＴ液 各５０μＬ、試料溶液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェル（容量約０．３ｍＬ）に充填した。

（５）５０mM リン酸緩衝液(ｐＨ ７．４）１００μＬ及び５０mM グリシン−NaOH緩衝液５０μLを混合したサンプルをブランクとし、（４）同様に操作して阻害率の計算に用いた（以下、ＢＧとする）。

（６）試料溶液を充填したマイクロプレートを、室温で３０間静置した後、各試料溶液の蛍光強度を，マイクロプレートリーダー（型式：SPECTRA MAX GEMINI XS、Molecular Devices社製）で測定（測定条件：励起波長４４６ｎｍ、蛍光波長４９０ｎｍ）した（以下、各評価化合物濃度が０の試料における蛍光強度をＡ、評価化合物濃度が１．５μmol／Ｌ以上の試料における蛍光強度をＢとする）。

（７）上記（６）において測定した蛍光強度を用い、下記式（５）：

より阻害率を求めた。

各評価化合物における阻害率を表１０に示す。化合物１及び化合物２共に、いずれの濃度においてもチオフラビンＴの結合を阻害していた。この結果より、化合物１及び化合物２は、チオフラビンＴの結合を競合的に阻害することが示された。チオフラビンＴは、アミロイドのβシート構造を認識して結合することが一般に知られている。よって、化合物１及び化合物２は、チオフラビンＴと同様のアミロイドへの結合機序、すなわちβシート構造を認識して結合することが示唆された。

（実施例III-3）アミロイド結合性の測定

本発明化合物のアミロイド親和性を、以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合試験により評価した。

（方法）
（１）実施例III-1および実施例III-2に記載の方法を用いて、１ｍｇ／ｍＬの凝集化アミリン懸濁液（以下、本実施例にてアミロイド懸濁液という）を調製した。

既報（Burke, M.J.ら、Biochemistry. 11、p.2435-2439（1972））に記載の方法に若干の変更を加えた以下（２）及び（３）の操作にて、クロスβシート構造をとったインスリンを調製した。

（２）インスリン（シグマ アルドリッチ ジャパン社製）５ｍｇを塩酸でｐＨ２に調整した脱イオン水１ｍLで溶解し、９０℃で１０分間加熱後、ドライアイス／エタノール中で急速に冷却した。

（３）（２）のサンプル液を９０℃で５分間加熱後、ドライアイス／エタノール中で急速に冷却した。同じ操作をさらに１０回繰り返した後、サンプル液がゲル状に変化したことを目視で確認した。

（４）（３）のサンプルを遠心分離（１６０００ｇ×１５分間）した後、上清を除去して沈殿を脱イオン水１ｍLで溶解して凝集化インスリン懸濁液（以下、本実施例にてインスリンアミロイド懸濁液という）を得た。

既報（Ohhashi, Y.ら、Journal of Biological Chemistry. 280、p.32843-32848（2005））に記載の方法に若干の変更を加えた以下（５）及び（６）の操作にて、クロスβシート構造をとったβ２ｍミクログロブリンを調製した。

（５）β２ミクログロブリン（オリエンタル酵母社製）１ｍｇ／ｍLの溶液に１００ｍM NaClを含む５０ｍMグリシン−HCｌ緩衝液（ｐH ２．５）を添加した後、超音波温水槽を使って３７℃で１分間の超音波処理を行い、続けて超音波処理なしで９分間、３７℃で加温した。

（６）（５）の操作をさらに１７回繰り返した後、このサンプル液に上記（２）と同様の処理を行った。このサンプルを遠心分離（１６０００ｇ×１５分間）した後、上清を除去して沈殿を１００ｍM NaClを含む５０ｍMグリシン−HCｌ緩衝液（ｐH ２．５）０．５ｍLで溶解して凝集化β２ミクログロブリン懸濁液（以下、本実施例にてβ２mアミロイド懸濁液という）を得た。

（７）実施例III-1および実施例III-2に記載のチオフラビンＴ（Ｆｌｕｋａ社製）を用いた蛍光光度測定による定性実験により、（４）及び（６）で得た凝集化インスリン及び凝集化β２ミクログロブリンがアミロイドであることを確認した。

（７）上記実施例I-３の方法にて合成した化合物６の水溶液（放射能濃度５００MBｑ／ｍＬ）を調製しこれを、０．１％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）で希釈して２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン総量として、１．０〜１０１．０ｐＭ相当の溶液を調製した。

（８）９６穴マイクロプレートの各ウェルに、上記（７）で調製した溶液 ５０μＬ（最終濃度０．２〜２０．２ｐＭ）、アミリンアミロイド懸濁液或いはインスリンアミロイド懸濁液或いはβ２mアミロイド懸濁液を０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）で希釈した液５０μＬ（最終濃度０．８μｇ／ｍL）を添加した後、同緩衝液１５０μＬを添加した。

（９）当該マイクロプレートを２２℃で３時間、一定速度（４００回転/分）で振盪した後、各ウェルの混合液をグラスファイバーフィルター（ミリポア社、Ｍｕｌｕｔｉｓｃｒｅｅｎ^ＴＭ−ＦＣ）にて濾過することによりアミロイドに結合した化合物６及び遊離の化合物６を分離した。

（１０）混合液を濾過したグラスファイバーフィルターについて、０．１％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液で洗浄（０．２ｍＬ×５回）した後、グラスファイバーフィルターの放射能をオートウェル・ガンマシステム（Ａｌｏｋａ社、ＡＲＣ−７００１）で測定した。

（１１）（１０）の測定結果より化合物６のアミロイドへの結合量と添加したアミロイド量との関係を評価した。非特異的結合については上記（８）においてアミロイド懸濁液を添加しなかったサンプルより求めた（実施例I-３）。

試料溶液中の化合物６の濃度と、上記（１１）にて測定したグラスファイバーフィルター上の放射能カウント（ＣＰＭ）との関係を図１６に示す。アミロイド懸濁液を加えた群（図１６、アミリンアミロイド添加群、インスリンアミロイド添加群及びβ２ｍアミロイド添加群）では、アミロイド懸濁液を添加しなかった群（図１６、アミロイド非添加群）と比較してその放射能は総じて高く、また、化合物１の添加濃度に比例してグラスファイバーフィルター上の放射能が増加していた。本実験における条件では、いずれのアミロイド（及び化合物６が結合したアミロイド）も、グラスファイバーのポアサイズよりも大きい。そのため、アミロイドは、グラスファイバー上に保持されることとなり、グラスファイバーの放射能カウントはアミロイドに結合した化合物６の量を反映した値となる。グラスファイバーの放射能カウントの値が、化合物６の濃度増加に伴って増加していたこと、および、アミロイド非添加群と比してその放射能が高かったことから、化合物６はアミロイドに特異的に結合する性質を有する化合物であることが示された。

（実施例IV）各臓器における放射能分布率の測定

本発明に係わる化合物が目的とする臓器に分布し得ること、及び、良好な体外へのクリアランスを有することを確認するため、化合物６を用い、ＳＤ系ラット（８週齢）における各臓器への放射能集積の経時的変化を測定した。

６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンのアセトニトリル溶液（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）４００μＬに、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸 ４００μＬ、１ｍｍｏｌ／ｍＬヨウ化ナトリウム１０μＬ、１０７４ＭＢｑの［^１２３Ｉ］ヨウ化ナトリウム２７０μＬ、３０％（Ｗ／Ｖ）過酸化水素１０μＬを添加した。当該混合液を４０度にて１０分間静置した後、下記の条件のＨＰＬＣに付して［^１２３Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン画分を分取した。

ＨＰＬＣ条件：
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｒｏ Ｃ８（商品名、ＹＭＣ社製、サイズ：４．６×１５０ｍｍ）
移動相：１０ｍＭギ酸緩衝液（ｐＨ３．０）／アセトニトリル＝８０／２０→８０／２０→１０／９０（０分→２０分→３０分）
流速：１．０ ｍＬ／分
検出器：紫外可視吸光光度計（検出波長：２５４ｎｍ）及び放射線検出器（ｒａｙｔｅｓｔ社 ＳＴＥＦＦＩ型）

当該画分に水１０ｍＬを添加した液をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カラム（商品名：Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標） Ｌｉｇｈｔ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、Ｗａｔｅｒｓ社製、充填剤の充填量１３０ｍｇ）に通液し、［^１２３Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンを当該カラムに吸着捕集した。このカラムを水１ｍＬで洗浄した後、ジエチルエーテル１ｍＬを通液して［^１２３Ｉ］−２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン（化合物６）を溶出させた。得られた放射能量は合成直後において４７０ＭＢｑであった。下記の条件によるＴＬＣ分析を行ったところ、その放射化学的純度は９８％であった。

ＴＬＣ分析条件：
ＴＬＣプレート：Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ_２５４（製品名、メルク社製）
展開相：酢酸エチル／メタノール／ジエチルアミン＝１００／４／１
検出器：Ｒｉｔａ Ｓｔａｒ（製品名、ｒａｙｔｅｓｔ社製）

化合物６のジエチルエーテル溶液を、１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸含有生理食塩液にて希釈し、放射能濃度８〜１２ＭＢｑ／ｍＬとなるように調整した。調製した試料溶液各０．２ｍＬを、上記ラットに、無麻酔下で尾静脈より投与した。投与後５分、３０分、６０分、１８０分に腹部大動脈より脱血した後、表１１記載の各臓器を採取した。採取した各臓器の質量および放射能を、実施例II-１１と同様の方法にて計測した。加えて、臓器を採取した後のラットの全身（以下、残全身と称す）の放射能も計測した。これらの測定結果を用い、下記式（６）より、各時間点における、各臓器への単位質量当たりの放射能分布率（％ＩＤ／ｇ）を算出した。
なお、実験は、各時間点において、３匹の動物を用いて行った。

結果を表１１に示す。表１１に示すように、化合物６は、投与後５分において各臓器に分布した後、その放射能の大部分が小腸や大腸へと分布していた。加えて、その放射能分布率が、小腸から大腸へと移行していた。このことから、化合物６は、投与後、速やかに胆汁排泄され、良好な体外へのクリアランスを有することが示された。
また、アミロイドが蓄積するとされる、脳、心臓、肺、膵臓、骨などを見てみると、各組織共に、投与後５分において明らかな放射能集積がみられ、化合物６が分布していることが確認された。また、投与後５分と投与後１８０分の比（（投与後５分の％ＩＤ／ｇ）／（投与後１８０分の％ＩＤ／ｇ））が、それぞれ、脳が１２２、心臓が１３、肺が７、膵臓が１４、骨が４と高い値を示していた。このことから、アミロイドが蓄積するとされる組織において、速やかな放射能分布および速やかなクリアランスがなされていることが示された。
以上より、生体組織中においてアミロイド検出試薬として必要な、投与後早期における放射能分布および速やかな体外クリアランスが達成されていることが示された。

本発明に係る生体組織中のアミロイド検出試薬は、全身性アミロイドーシスをはじめとするアミロイドーシスにおけるアミロイド蛋白質のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での診断剤に利用することができる。

６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成スキーム。 ６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成スキーム。 ２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成スキーム。 ２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンの合成スキーム。 ６−（３’−フルオロプロポキシ）−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成スキーム。 ６−ブロモ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンの合成スキーム。 ６−フルオロ−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成スキーム。 ２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ニトロイミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成スキーム。 （ａ）化合物６投与後の脳切片におけるオートラジオグラム及び（ｂ）チオフラビンＴ染色試料の蛍光顕微鏡像（アミロイド懸濁液投与部位の拡大表示。）。 ６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジンの合成スキーム ６−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジンの合成スキーム ２−（４’−ヒドロキシフェニル）−６−ヨードイミダゾ［１，２−ａ］ピラジンの合成スキーム ８−トリブチルスタニル−２−（４’−ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジンの合成スキーム （ａ）化合物６０投与後の脳切片におけるオートラジオグラム及び（ｂ）チオフラビンＴ染色試料の蛍光顕微鏡像（アミロイド懸濁液投与部位の拡大表示。） （ａ）化合物６１投与後の脳切片におけるオートラジオグラム及び（ｂ）チオフラビンＴ染色試料の蛍光顕微鏡像（アミロイド懸濁液投与部位の拡大表示。） 化合物６のアミロイド結合能を示す図

Claims (17)

1. 下記式（１）：
   

   

   （式中、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４はそれぞれ独立に炭素又は窒素、
   Ｒ^３は式
   

   

   で表される基、
   Ｒ^１は放射性ハロゲン置換基、
   ｍは、０〜４の整数、
   ｎは、０又は１の整数である。
   ここで、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうち少なくとも一つは炭素であって、Ｒ^３は炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４に結合する。）で表される化合物又はその塩を含有してなる生体組織に沈着したアミロイドの検出試薬。
2. Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうち、少なくとも３つが炭素である、請求項１記載の試薬。
3. Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４が全て炭素である、請求項２記載の試薬。
4. Ｒ^１が、^１８Ｆ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ及び^１３１Ｉからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬。
5. 生体組織が、脳、心臓、肺、膵臓、骨又は関節である請求項１〜４の何れか１項に記載の試薬。
6. 下記式（２）：
   

   

   （式中、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４はそれぞれ独立に炭素又は窒素、
   Ｒ^４は式
   

   

   で表される基、
   ｍは、０〜４の整数、
   ｎは、０又は１の整数、
   Ｒ^２はｍ＝ｎ＝０のとき、非放射性ハロゲン置換基、ニトロ置換基、炭素数３〜１２のトリアルキルアンモニウム置換基、炭素数３〜１２のトリアルキルスタニル置換基又はトリフェニルスタニル置換基、ｍ≠０及び／又はｎ≠０のとき、非放射性ハロゲン置換基、メタンスルホン酸置換基、トリフルオロメタンスルホン酸置換基又は芳香族スルホン酸置換基である。ここで、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうち少なくとも一つは炭素であって、Ｒ^４は炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４に結合する。）で表される化合物又はその塩と放射性ハロゲンイオンとを含む反応溶液を調製する工程と、
   前記反応溶液に反応条件を与えることによって、下記式（１）：
   

   

   （式中、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４は式（２）と同じ、
   Ｒ^３は式
   

   

   で表される基、
   Ｒ^１は放射性ハロゲン置換基、
   ｍ及びｎは、式（２）と同じである。
   ここで、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうち少なくとも一つは炭素であって、Ｒ^３は炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４に結合する。）で表される化合物又はその塩を合成する工程と、
   を含むことを特徴とする、放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法。
7. Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうち、少なくとも３つが炭素である、請求項６記載の放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法。
8. Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４が全て炭素である、請求項７記載の放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法。
9. Ｒ^２がヨウ素、シュウ素、炭素数３〜１２のトリアルキルスタニル置換基及びトリフェニルスタニル置換基からなる群より選択されたものであり、放射性ハロゲンイオンが^１２３Ｉイオン、^１２４Ｉイオン、^１２５Ｉイオン及び^１３１Ｉイオンからなる群より選択されたものであり、Ｒ^１が^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ及び^１３１Ｉからなる群より選択されたものである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法。
10. Ｒ^２がヨウ素、トリメチルスタニル置換基、トリブチルスタニル置換基及びトリフェニルスタニル置換基からなる群より選択されたものである、請求項９に記載の放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法。
11. Ｒ^２がニトロ置換基、炭素数３〜１２のトリアルキルアンモニウム置換基、メタンスルホン酸置換基、トリフルオロメタンスルホン酸置換基及び芳香族スルホン酸置換基からなる群より選択されたものであり、放射性ハロゲンイオンが^１８Ｆイオンであり、Ｒ^１が^１８Ｆである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法。
12. Ｒ^２がトリフルオロメタンスルホン酸置換基又はトルエンスルホン酸置換基である、請求項１１に記載の放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法。
13. Ｒ^２がシュウ素であり、放射性ハロゲンイオンが^７５Ｂｒイオン又は^７６Ｂｒイオンであり、Ｒ^１が^７５Ｂｒ又は^７６Ｂｒである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法。
14. 下記式（２）：
    

    

    （式中、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４はそれぞれ独立に炭素又は窒素、
    Ｒ^４は式
    

    

    で表される基、
    ｍは、０〜４の整数、
    ｎは、０又は１の整数、
    Ｒ^２はｍ＝ｎ＝０のとき、非放射性ハロゲン置換基、ニトロ置換基、炭素数３〜１２のトリアルキルアンモニウム置換基、炭素数３〜１２のトリアルキルスタニル置換基又はトリフェニルスタニル置換基、ｍ≠０及び／又はｎ≠０のとき、非放射性ハロゲン置換基、メタンスルホン酸置換基、トリフルオロメタンスルホン酸置換基又は芳香族スルホン酸置換基である。
    ここで、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうち少なくとも一つは炭素であって、Ｒ^４は炭素であるＡ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４に結合する。）で表される放射性ハロゲン標識有機化合物調製用の前駆体化合物又はその塩。
15. Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４のうち、少なくとも３つが炭素である、請求項１４に記載の放射性ハロゲン標識有機化合物調製用の前駆体化合物又はその塩。
16. Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４が全て炭素である、請求項１５に記載の放射性ハロゲン標識有機化合物調製用の前駆体化合物又はその塩。
17. Ｒ²が、ヨウ素、シュウ素、トリメチルスタニル置換基、トリブチルスタニル置換基、トリフルオロメタンスルホン酸置換基及びトリフェニルスタニル置換基からなる群より選択されたものである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の放射性ハロゲン標識有機化合物調製用の前駆体化合物又はその塩。

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