JPWO2008130025A1 - Hepatocyte culture vessel and hepatocyte culture method - Google Patents
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Abstract
生体内での肝機能を再現することができる肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法を提供すること。本発明に係る肝細胞培養容器１０は、表面に複数のマイクロ容器１１を有する肝細胞培養容器１０であって、マイクロ容器１１の底部面積が０．０１〜０．１ｍｍ２であり、マイクロ容器１１を構成する側壁１３の高さが２５〜１５０μｍあるものである。また、マイクロ容器１１の底部形状が等方的であって、長径が短径の１〜１．５倍の範囲内であることが好ましい。To provide a hepatocyte culture vessel and a hepatocyte culture method capable of reproducing liver function in vivo. A hepatocyte culture container 10 according to the present invention is a hepatocyte culture container 10 having a plurality of microcontainers 11 on the surface, and the bottom area of the microcontainer 11 is 0.01 to 0.1 mm 2. The side wall 13 to be formed has a height of 25 to 150 μm. Moreover, it is preferable that the bottom part shape of the micro container 11 is isotropic, and a major axis is in the range of 1 to 1.5 times the minor axis.
Description
本発明は、肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法に関する。 The present invention relates to a hepatocyte culture container and a hepatocyte culture method.
組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索及び薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。そのため、バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、極めて多様化してきている。 Techniques for testing and examining cells isolated from tissues are indispensable in biotechnology-related fields. It is widely used for diagnosing diseases and pathological conditions, searching for new drugs and determining their efficacy, animal testing, plant testing, and testing for environmental pollutants. Therefore, the cells used in the biotechnology field have been extremely diversified.
単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くの場合、培養皿や試験管のなかで細胞培養が行われる。この培養細胞を用いて、種々の検査が行われる。細胞培養試験に用いられる細胞培養株には、生体内での試験いわゆるin vivo試験と同様の薬剤感受性、毒性反応を示すことが要求される。すなわち、細胞培養容器の表面で規則性を有して配列された細胞間のネットワークを構築できることが必要とされる。また、細胞培養試験に用いられる細胞培養株は極めて高額であるため、細胞の生存率及び増殖速度の向上が望まれている。 The isolated cells may be used immediately for testing, but in many cases, cell culture is performed in a culture dish or a test tube. Various tests are performed using the cultured cells. Cell culture strains used for cell culture tests are required to exhibit drug sensitivities and toxic reactions similar to in vivo tests, so-called in vivo tests. That is, it is necessary to be able to construct a network between cells arranged with regularity on the surface of a cell culture vessel. In addition, since cell culture strains used for cell culture tests are extremely expensive, it is desired to improve cell survival rate and growth rate.
上記細胞培養試験は、同一条件下、評価する薬物等の量、濃度などを変量し、その効果を測定するものである。そのため、細胞培養容器の材質、形状等も同一にする必要がある。この細胞培養容器としては、プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート等が一般的に用いられる。ウェルプレートには、６ウェル、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレート又はシャーレがある。これらは、一般に、プレート全体の大きさはほぼ同じであり、ウェル数が大きくなるほど、１ウェルのサイズが小さくなる。この１ウェルが１培養皿に相当する。また、最近の微量化への流れから、さらに小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。これらの培養皿の底部は平坦な平板状であり、この底面を培養面として用いている。 In the cell culture test, the amount and concentration of the drug to be evaluated are varied under the same conditions, and the effect is measured. Therefore, the material, shape, etc. of the cell culture container must be the same. As the cell culture container, a plastic petri dish, a glass petri dish, a glass plate fixed in the container, a well plate, or the like is generally used. Well plates include 6-well, 12-well, 48-well, and 96-well plates or petri dishes. In general, the size of the whole plate is substantially the same, and the larger the number of wells, the smaller the size of one well. One well corresponds to one culture dish. In addition, due to the recent trend toward miniaturization, a 384-well plate consisting of a large number of culture dishes with a smaller diameter has begun to be used. The bottom of these culture dishes is a flat plate shape, and this bottom is used as the culture surface.
しかしながら、組織細胞の培養に、従来の細胞培養容器を用いると、細胞が薄く伸びて方向性のない形態となる。また、細胞培養容器の表面にランダムに配置されるため、細胞間のネットワークは、複雑に交錯して形成される。そのため、生体内での細胞機能を再現できないという問題があった。例えば、肝細胞では肝機能を維持することで知られるスフェロイド状の肝細胞塊を形成しない。 However, when a conventional cell culture vessel is used for culturing tissue cells, the cells are thinly stretched and have no orientation. Moreover, since it arrange | positions at random on the surface of a cell culture container, the network between cells is intricately crossed and formed. For this reason, there has been a problem that cell functions in vivo cannot be reproduced. For example, hepatocytes do not form a spheroid-like hepatocyte mass known to maintain liver function.
上記問題を解決するため、平板状の培養面に特殊な高分子を固定化する方法（特許文献１参照）、特殊な装置を使用する方法（特許文献２参照）などが開示されている。
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、固定化方法が煩雑で安定的に製造できず、高コストとなる問題があった。他方、特許文献２に記載の方法では、培養方法が複雑であるのに関わらず、スフェロイドの形成効率が悪く、高コストになる等の問題があった。 However, the method described in Patent Document 1 has a problem that the immobilization method is complicated and cannot be stably produced, resulting in high cost. On the other hand, the method described in Patent Document 2 has problems such as poor spheroid formation efficiency and high cost, regardless of the complicated culture method.
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、生体内での肝機能を再現することができる肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve such problems, and an object of the present invention is to provide a hepatocyte culture vessel and a hepatocyte culture method that can reproduce liver functions in vivo.
係る目的を達成するために、本発明に係る肝細胞培養容器は、表面に複数のマイクロ容器を有する肝細胞培養容器であって、前記マイクロ容器底部の面積が０．０１〜０．１ｍｍ２であり、前記マイクロ容器の深さが２５〜１５０μｍであるものである。前記マイクロ容器底部の、長径が短径の１〜１．５倍の範囲内であることが好ましい。前記マイクロ容器底部の形状が円又は正多角形等の等方的であることがより好ましい。In order to achieve the object, the hepatocyte culture container according to the present invention is a hepatocyte culture container having a plurality of micro containers on the surface, and the area of the bottom of the micro container is 0.01 to 0.1 mm 2 . The depth of the micro container is 25 to 150 μm. It is preferable that the major axis of the bottom of the micro container is in the range of 1 to 1.5 times the minor axis. More preferably, the shape of the bottom of the micro container is isotropic such as a circle or a regular polygon.
また、前記マイクロ容器水平面を基準面とした前記側壁の高さ方向の上部５０％以上において、水平面と該側壁の各側面がなす角度が８０°〜９０°であることが好ましい。 In addition, in the upper 50% or more of the side wall in the height direction with respect to the horizontal surface of the micro container, the angle formed by the horizontal surface and each side surface of the side wall is preferably 80 ° to 90 °.
さらに、前記マイクロ容器が隣接するマイクロ容器の少なくとも１つと連通しており、そのための開口部の底面幅が１μｍ〜２５μｍであることが好ましい。 Furthermore, it is preferable that the micro container communicates with at least one of the adjacent micro containers, and the bottom surface width of the opening is 1 μm to 25 μm.
また、前記マイクロ容器が設けられた領域に表面処理が行われており、前記表面処理により形成される積層膜が２層以上であり、少なくとも１層が無機膜、少なくとも１層が有機膜であることが好ましい。さらに、その領域が透明であることが好ましい。 In addition, a surface treatment is performed on a region where the micro container is provided, and the laminated film formed by the surface treatment has two or more layers, at least one layer is an inorganic film, and at least one layer is an organic film. It is preferable. Further, the region is preferably transparent.
本発明に係る肝細胞培養方法は、上記の肝細胞培養容器において、肝細胞培養容器に設けられた前記マイクロ容に細胞を注入して、前記細胞を培養するものである。また、前記肝細胞培養方法によれば、前記マイクロ容に培養する細胞が集積し、細胞塊を形成する。この細胞塊の直径が３０〜２００μｍとなることを特徴とするものである。 The hepatocyte culture method according to the present invention comprises culturing the cells by injecting the cells into the micro volume provided in the hepatocyte culture container in the hepatocyte culture container. Further, according to the hepatocyte culture method, cells to be cultured in the micro volume accumulate and form a cell mass. This cell mass has a diameter of 30 to 200 μm.
前記細胞の播種密度が１．０×１０４〜１．０×１０６細胞／ｃｍ２であることが好ましい。The seeding density of the cells is preferably 1.0 × 10 4 to 1.0 × 10 6 cells / cm 2 .
本発明によれば、生体内での肝機能を再現することができる肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the hepatocyte culture container and hepatocyte culture method which can reproduce the liver function in the living body can be provided.
１０ 肝細胞培養容器
１１ マイクロ容器
１２ 側壁
１３ 開口部10
本発明に係る肝細胞培養容器には凹凸パターンすなわち複数のマイクロ容器が形成されている。これにより、生体内と同様な立体的な細胞生育が可能であることに加え、各マイクロ容器内において、ばらつき無く細胞が凝集した形態で培養できる。また、マイクロ容器は、例えば、マイクロ容器を仕切る側壁（凸部）の高さを最適化することで、凝集した肝細胞塊をマイクロ容器内のみで培養することができる。 The hepatocyte culture container according to the present invention is formed with an uneven pattern, that is, a plurality of micro containers. As a result, in addition to enabling three-dimensional cell growth similar to that in a living body, the cells can be cultured in a form in which the cells are aggregated without variation in each micro container. Moreover, the micro container can culture | cultivate the aggregated hepatocyte mass only in a micro container, for example by optimizing the height of the side wall (convex part) which partitions off a micro container.
側壁により囲まれたマイクロ容器の寸法は、細胞を培養するために最適な範囲とする必要である。マイクロ容器の底部面積が大きすぎると、平板上での培養と同様、細胞は薄く伸び、立体構造とならない。一方、マイクロ容器の底部面積が小さすぎると、細胞を収容できなくなる。従って、空間の寸法は、培養する細胞種に応じて、一又は複数個が収容できる範囲とすることが好ましい。細胞が複数個集積した肝細胞塊を形成させる場合、その肝細胞塊が収納できる範囲とすることが好ましい。 The size of the micro container surrounded by the side wall needs to be in an optimum range for culturing cells. If the bottom area of the micro container is too large, the cells will grow thin and do not have a three-dimensional structure, similar to the culture on a flat plate. On the other hand, if the bottom area of the micro container is too small, cells cannot be accommodated. Therefore, the size of the space is preferably in a range that can accommodate one or more according to the cell type to be cultured. In the case of forming a hepatocyte mass in which a plurality of cells are accumulated, it is preferable that the hepatocyte mass be accommodated.
側壁の高さは、マイクロ容器で培養する細胞を隣接するマイクロ容器へ移動させないために最適な範囲とする必要である。側壁の高さが低すぎると、細胞が側壁を乗り越えてしまい、培養に適さない。側壁の高さが高すぎると、作製が困難な上、物質拡散がしにくくなり培養環境が悪化してしまう。従って、側壁の高さは、細胞種に応じて、マイクロ容器内に配置された培養細胞を、そのマイクロ容器内において安定的に培養し続けられる範囲とすることが好ましい。 The height of the side wall needs to be in an optimum range so that cells cultured in the micro container do not move to the adjacent micro container. If the height of the side wall is too low, the cells get over the side wall and are not suitable for culture. If the height of the side wall is too high, it will be difficult to produce, and it will be difficult for the substance to diffuse, and the culture environment will deteriorate. Therefore, it is preferable that the height of the side wall be in a range in which the cultured cells arranged in the micro container can be stably cultured in the micro container according to the cell type.
また、側壁に開口部を設け、複数のマイクロ容器を連通した構造とするにより、細胞への酸素や栄養分の供給及び細胞からの老廃物の除去を効率良く行うことができる。なお、培養する細胞種に応じ、側壁の高さ、マイクロ容器寸法、開口部の幅を適宜設定することにより、多様な培養系に適用することもできる。 In addition, by providing an opening on the side wall and connecting a plurality of microcontainers, it is possible to efficiently supply oxygen and nutrients to the cells and remove waste from the cells. In addition, according to the cell type to culture, it can also apply to various culture systems by setting the height of a side wall, a micro container dimension, and the width | variety of an opening part suitably.
実施の形態
以下に、本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。また、説明を明確にするため、以下の記載及び図面は、適宜、簡略化されている。Embodiment Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described. However, the present invention is not limited to the following embodiment. In addition, for clarity of explanation, the following description and drawings are simplified as appropriate.
実施の形態に係る肝細胞培養容器の構成について図１、２を用いて説明する。図１は、本実施の形態に係る肝細胞培養容器の構成を示す平面図であり、図２は図１のＸ−Ｘ'断面図である。図１に示すように、肝細胞培養容器１０はマイクロ容器１１、側壁１２、開口部１３を備える。肝細胞培養容器１０の培養面には、複数の側壁１２が網目状に形成されており、この側壁１２に四方を囲われた空間がマイクロ容器１１となる。また、各マイクロ容器１１の四辺に形成された側壁１２の各辺の中央部に、開口部１３が形成されている。
The structure of the hepatocyte culture container according to the embodiment will be described with reference to FIGS. FIG. 1 is a plan view showing the configuration of the hepatocyte culture container according to the present embodiment, and FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line XX ′ of FIG. As shown in FIG. 1, the
図１において、マイクロ容器１１の底部の幅ａ、マイクロ容器１１を区画するための側壁１２の幅ｂ、高さｃ、隣接するマイクロ容器１１が互いに連通するための開口部１３の幅ｄを示した。本発明における底部面積とは、マイクロ容器開口水平面（側壁１２上面と同一面）に垂直方向に上方から容器底へ平行光を照射した際の投影面積のことをいう。例えば、マイクロ容器の底がＵ字形状である場合、その開口面に垂直方向な上方より底に入射した平行光が投影する形状が底部面積となる。投影底部の長径及び短径とは、円及び楕円の場合、その重心を通る長軸及び短軸と円周との交点の各軸上の距離を長径及び短径といい、多角形の場合、その多角形の面積との差が最小となり各頂点を通る外挿円又は外挿楕円の長径および短径をいい、各頂点を通る外挿円又は外挿楕円を描けない場合は、最も多くの頂点を通る近似円又は楕円の長径および短径をいう。
In FIG. 1, the width a of the bottom part of the
マイクロ容器１１の底部形状は特に制限されるものではなく、正方形、円、多角形以外にも種々の形状を採用することができる。生体内での肝機能を再現する細胞培養には、この底部面積は０．０１ｍｍ２〜０．１ｍｍ２が好ましい。また、底部の長径が短径の１〜１．５倍であることが好ましい。さらに、等方的形状が好ましく、正方形であれば、例えば、相当直径１００μｍの肝細胞塊を形成させる場合、一辺の長さが１００μｍ〜３００μｍが好ましい。The bottom shape of the
マイクロ容器１１の水平面と側壁１２とがなす角度は、細胞が乗り上げない角度でなければならないため、側面の上部から５０％以上の部分は８０〜９０°が好ましく、特に、８５°〜９０°であることが好ましい。
Since the angle formed between the horizontal surface of the
側壁１２の高さｃは、マイクロ容器１１で培養する細胞が乗り上げ隣接するマイクロ容器１１へ移動しなければよく、例えば、相当直径１００μｍの肝細胞塊を形成させる場合、５０μｍ〜１５０μｍが好ましい。
The height c of the
隣接するマイクロ容器１１を互いに連通するための開口部１３の幅ｄは、培養細胞が最初に播種されたマイクロ容器１１から隣接するマイクロ容器１１に移動できない程度であればよい。例えば、培養細胞の相当直径が２０μｍであれば、５〜１５μｍであることが好ましい。なお、開口部１３は必須ではなく、図３及び図４に示すように、マイクロ容器１１の四辺が側壁１２により完全に囲まれていてもよい。ここで、図３は、本実施の形態に係る他の肝細胞培養容器の構成を示す平面図であり、図４は図３のＹ−Ｙ'断面図である。
The width d of the
本発明の肝細胞培養容器上の凹凸パターンを作製する方法としては、特に限定されないが、例えば、モールドを用いた転写成形、３次元光造形、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等の方法が挙げられる。肝細胞培養容器の用途、要求される加工精度、コスト等を考慮してこれらの製造方法を適宜選択することが好ましい。 The method for producing the concavo-convex pattern on the hepatocyte culture container of the present invention is not particularly limited. For example, transfer molding using a mold, three-dimensional stereolithography, precision machine cutting, wet etching, dry etching, laser processing, Examples of the method include electric discharge machining. It is preferable to appropriately select these production methods in consideration of the use of the hepatocyte culture container, required processing accuracy, cost, and the like.
モールドを用いて転写成形方法の具体例としては、金属構造体を型として樹脂成形で凹凸パターンを形成する方法が挙げられる。この方法は金属構造体の形状を高い転写率で樹脂へ凹凸パターンに再現することが可能であり、また汎用の樹脂材料を使用することにより材料コストを低くできるので好ましい。このような金属構造体の型を用いる方法は、低コストであり、高い寸法精度を満足できる点で優れている。 As a specific example of the transfer molding method using a mold, there is a method of forming a concavo-convex pattern by resin molding using a metal structure as a mold. This method is preferable because the shape of the metal structure can be reproduced in a concavo-convex pattern on the resin at a high transfer rate, and the cost of the material can be reduced by using a general-purpose resin material. The method using such a metal structure mold is excellent in that it is low in cost and can satisfy high dimensional accuracy.
上記金属構造体の製造方法としては、例えば、フォトリソグラフィによって作製されたレジストパターンや３次元光造形によって作製された樹脂パターンへのメッキ処理、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等が挙げられる。用途、要求される加工精度、コスト等を考慮して適宜選択すればよい。 Examples of the method for manufacturing the metal structure include plating treatment on a resist pattern produced by photolithography and a resin pattern produced by three-dimensional stereolithography, precision mechanical cutting, wet etching, dry etching, laser processing, electric discharge. Processing etc. are mentioned. What is necessary is just to select suitably in consideration of a use, the required process precision, cost, etc.
上記で得られた金属構造体を型として用いて樹脂へ凹凸パターンを成形する方法としては、例えば、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等の方法を挙げることができる。生産性及び型転写性の観点から射出成形を採用することが好ましい。 Examples of a method for forming a concavo-convex pattern on a resin using the metal structure obtained above as a mold include, for example, injection molding, press molding, monomer cast molding, solvent cast molding, hot emboss molding, roll transfer by extrusion molding, etc. Can be mentioned. It is preferable to employ injection molding from the viewpoint of productivity and mold transferability.
本発明の肝細胞培養容器を構成する材料としては、自己支持性を有するものであれば特に制限されず、例えば、合成樹脂、シリコン、ガラス等が挙げられる。コスト面や顕微鏡観察による細胞視認性の観点から、透明な合成樹脂を材料とすることが好ましい。透明な合成樹脂としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体等のアクリル系樹脂、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、シクロオレフィン等のオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸等のエステル系樹脂、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系樹脂、ポリカーボネート樹脂等が挙げられる。このような樹脂には、透明性を損なわない範囲で着色剤、拡散剤、増粘剤等の各種添加剤を含んでいてもよい。 The material constituting the hepatocyte culture vessel of the present invention is not particularly limited as long as it has self-supporting properties, and examples thereof include synthetic resin, silicon, glass and the like. From the viewpoint of cost and cell visibility by microscopic observation, it is preferable to use a transparent synthetic resin as a material. Examples of the transparent synthetic resin include acrylic resins such as polymethyl methacrylate and methyl methacrylate-styrene copolymer, styrene resins such as polystyrene, olefin resins such as cycloolefin, polyethylene terephthalate, and polylactic acid. Examples thereof include ester resins, silicone resins such as polydimethylsiloxane, and polycarbonate resins. Such a resin may contain various additives such as a colorant, a diffusing agent, and a thickener as long as the transparency is not impaired.
本発明の肝細胞培養容器は、容器表面の親水性、生体適合性、細胞親和性等を向上させることを目的として、凹凸パターン表面側に表面処理を行い、改質層及び／又はコーティング層が配されていてもよい。上記改質層を設ける方法としては、自己支持性を失う方法や１００μｍ以上の極端な表面荒れを起こす方法でなければ特に制限はないが、例えば、薬品処理、溶剤処理、表面グラフト重合によるグラフトポリマーの導入等の化学的処理、コロナ放電、オゾン処理、プラズマ処理等の物理的処理等の方法が挙げられる。またコーティング層を設ける方法としては、特に制限されるものではないが、例えば、スパッタ、蒸着等のドライコーティング、無機材料コーティング、ポリマーコーティング等のウェットコーティング等の方法が挙げられる。凹凸パターン上には、気泡の混入することなく培養液を注入するために親水性を付与することが望ましく、均一な親水性膜を形成させる方法として、無機蒸着が好ましい。 The hepatocyte culture container of the present invention is subjected to surface treatment on the surface side of the concavo-convex pattern for the purpose of improving the hydrophilicity, biocompatibility, cell affinity, etc. of the container surface, and the modified layer and / or the coating layer It may be arranged. The method for providing the modified layer is not particularly limited unless it is a method for losing self-supporting property or a method for causing extreme surface roughness of 100 μm or more. For example, a graft polymer by chemical treatment, solvent treatment, or surface graft polymerization is used. And methods such as chemical treatment such as introduction of carbon, physical treatment such as corona discharge, ozone treatment, and plasma treatment. The method for providing the coating layer is not particularly limited, and examples thereof include dry coating such as sputtering and vapor deposition, wet coating such as inorganic material coating and polymer coating. It is desirable to impart hydrophilicity to the concavo-convex pattern in order to inject the culture solution without mixing bubbles, and inorganic vapor deposition is preferred as a method for forming a uniform hydrophilic film.
また、細胞親和性を考慮した場合には、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞親和性タンパク質をコーティングすることがより好ましい。コラーゲン水溶液等を均一にコートするために、上述の親水性膜を形成させた後、コートすることが好ましい。通常、肝細胞培養においては、生体内環境を模倣して細胞外マトリックス表面での培養が望ましいため、上記のように均一な親水性無機膜を配した後に、培養細胞に適した細胞外マトリックスからなる有機膜を配することが特に好ましい。 In consideration of cell affinity, it is more preferable to coat a cell affinity protein such as collagen or fibronectin. In order to uniformly coat a collagen aqueous solution or the like, it is preferable to coat after forming the above-mentioned hydrophilic film. Usually, in hepatocyte culture, it is desirable to cultivate on the surface of the extracellular matrix by imitating the in vivo environment. Therefore, after arranging a uniform hydrophilic inorganic membrane as described above, the extracellular matrix suitable for the cultured cells is used. It is particularly preferable to arrange an organic film.
本発明の肝細胞培養方法は、細胞を培養するマイクロ容器のみに細胞を配置させ、その空間内で生体内に類似した形態や機能を発現させるため、適切な細胞数を播種する必要があり、細胞播種密度１．０×１０４〜１．０×１０６細胞／ｃｍ２が好ましい。例えば、マイクロ容器が正方形で、１辺が２００μｍの場合、５．０×１０４〜５．０×１０５細胞／ｃｍ２が好ましい。このような条件のもと、直径が３０〜２００μｍに及ぶ肝細胞塊を得ることができる。In the method for culturing hepatocytes of the present invention, it is necessary to dispose an appropriate number of cells in order to place cells only in a micro container for culturing cells and to express a similar form and function in the living body in the space, A cell seeding density of 1.0 × 10 4 to 1.0 × 10 6 cells / cm 2 is preferable. For example, when the micro container is square and one side is 200 μm, 5.0 × 10 4 to 5.0 × 10 5 cells / cm 2 are preferable. Under such conditions, a hepatocyte mass having a diameter of 30 to 200 μm can be obtained.
次に本発明に係る肝細胞培養容器の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Next, examples of the hepatocyte culture container according to the present invention will be described, but the present invention is not limited to these examples.
＜肝細胞の調製＞
培養に用いる初代ラット肝細胞は以下のように調製した。６週齢のウィスター系マウスの門脈にサーフロー留置針を挿入し、ＥＤＴＡ含有溶液を流して脱血液を行った後、コラゲナーゼ溶液を還流した。その後、コラゲナーゼ溶液で処理された肝臓を培養液へ入れ、メスピペットによるピペッティングで肝細胞を分散させた。肝細胞懸濁液を３回洗浄し、肝細胞以外の細胞を除去し、単離した肝細胞を培養に用いた。<Preparation of hepatocytes>
Primary rat hepatocytes used for culture were prepared as follows. A cerflow indwelling needle was inserted into the portal vein of a 6-week-old Wistar mouse, blood was removed by flowing an EDTA-containing solution, and then the collagenase solution was refluxed. Thereafter, the liver treated with the collagenase solution was put into the culture medium, and the hepatocytes were dispersed by pipetting with a pipette. The hepatocyte suspension was washed three times to remove cells other than hepatocytes, and the isolated hepatocytes were used for culture.
＜培養方法＞
培養に用いる培養液は以下のように調製した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％ ウシ胎児血清、１ｕｇ／ｍｌ インシュリン、１×１０−７Ｍ デキサメタゾン、１０ｍＭ ニコチンアミド、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｍ β−メルカプトエタノール、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５９ｕｇ／ｍｌ ペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、２５ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを添加した。凹凸パターン基材上に、１．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度で肝細胞を播種し、５％ＣＯ２、３７℃で所定時間培養した。また、同組成の新鮮培地０．５ｍＬを用い、１日から２日毎に培地交換を行った。<Culture method>
The culture solution used for culture was prepared as follows. 10% fetal bovine serum in DMEM / F12 medium, 1 ug / ml insulin, 1 × 10 −7 M dexamethasone, 10 mM nicotinamide, 2 mM L-glutamine, 50 μm β-mercaptoethanol, 5 mM HEPES, 59 ug / ml penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 25 ng / ml HGF, 20 ng / ml EGF was added. Hepatocytes were seeded on a concavo-convex pattern substrate at a concentration of 1.0 × 10 5 cells / cm 2 and cultured at 5% CO 2 and 37 ° C. for a predetermined time. In addition, 0.5 mL of fresh medium having the same composition was used, and the medium was changed every 1 to 2 days.
側壁上面の接着細胞数は、所定時間経過後の写真にて評価した。なお、アンモニア代謝能等の評価で用いた細胞数は、トリパンブルーにて染色を行い、染色されていない生細胞数をカウントした。 The number of adherent cells on the upper surface of the side wall was evaluated by a photograph after a predetermined time. In addition, the number of cells used in the evaluation of ammonia metabolic capacity and the like was stained with trypan blue, and the number of unstained living cells was counted.
アンモニア代謝能は、０．４％塩化アンモニウム水溶液を培養液へ添加し、２４時間後の液中のアンモニウムイオン濃度を測定することで評価した。 Ammonia metabolizing ability was evaluated by adding a 0.4% ammonium chloride aqueous solution to the culture solution and measuring the ammonium ion concentration in the solution 24 hours later.
［実施例１］
図１に示す凹凸パターン形状であって、ａ＝２００μｍ、ｂ＝２０μｍ、ｃ＝５０μｍ、ｄ＝１０μｍのパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上にパターン転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させ、γ線滅菌を行い、凹凸パターン基材を得た。その凹凸基材上で肝細胞を培養した。[Example 1]
A pattern having a concavo-convex shape shown in FIG. 1 is produced by photolithography using a pattern having a = 200 μm, b = 20 μm, c = 50 μm, and d = 10 μm, and performing Ni electrolytic plating. Obtained. Using the mold, pattern transfer was performed on polystyrene by hot embossing to produce a resin substrate having the above dimensions. A silicon dioxide film having a thickness of 100 nm was formed on the surface of the resin base material by vacuum deposition, and γ-ray sterilization was performed to obtain an uneven pattern base material. Hepatocytes were cultured on the uneven substrate.
［実施例２］
図３に示す凹凸パターン形状であって、ａ＝２００μｍ、ｂ＝２０μｍ、ｃ＝５０μｍのパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上にパターン転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させ、γ線滅菌を行い、凹凸パターン基材を得た。その凹凸基材上で肝細胞を培養した。[Example 2]
A pattern having a concavo-convex pattern shown in FIG. 3 and having a = 200 μm, b = 20 μm, and c = 50 μm was produced by photolithography and Ni electrolytic plating was performed to obtain a mold having a corresponding concavo-convex shape. Using the mold, pattern transfer was performed on polystyrene by hot embossing to produce a resin substrate having the above dimensions. A silicon dioxide film having a thickness of 100 nm was formed on the surface of the resin base material by vacuum deposition, and γ-ray sterilization was performed to obtain an uneven pattern base material. Hepatocytes were cultured on the uneven substrate.
［比較例１］
市販（ベクトン・ディッキンソン製、ファルコン（登録商標））のγ線滅菌済み平面状２４ウェル培養プレートを用い、肝細胞を培養した。[Comparative Example 1]
Liver cells were cultured using a commercially available flat-plate 24-well culture plate sterilized by γ-ray (Becton Dickinson, Falcon (registered trademark)).
表１に、細胞播種後３日目の実施例１、実施例２及び比較例１における接着細胞数及び５日目の肝細胞塊の直径、３日目のアンモニア代謝能の測定結果を示す。比較例１に係る肝細胞培養容器の底部は平板状であり、側壁１２が形成されていないため、底部細胞数は最も多かった。しかしながら、図５に示すように、実施例１及び２では、各マイクロ容器の中央部に、肝細胞塊を形成したのに対し、図６に示すように、比較例１では、肝細胞塊を形成しなかった。細胞播種後３日目のアンモニア代謝能では、比較例１に比較して、実施例１及び実施例２は高い代謝能を示した。中でも、隣接するマイクロ容器１１を連通する開口部１３を有する実施例１に係る肝細胞培養容器が最も高い代謝能を示した。
本発明は、肝細胞を培養する肝細胞培養容器に適用することができる。 The present invention can be applied to a hepatocyte culture vessel for culturing hepatocytes.
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