JPWO2008062555A1 - Novel polypeptide having epimerase activity and use thereof - Google Patents

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Abstract

β−１，４結合を有するオリゴ糖を生成する酵素、該オリゴ糖の製造方法、及び該オリゴ糖の新たな機能に基づき機能性食品を提供すること。（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチドを提供する：（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失された、アミノ酸配列；または（Ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と５１％以上の相同性を有するアミノ酸配列。また本発明は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする機能性食品を提供する。To provide a functional food based on an enzyme that produces an oligosaccharide having a β-1,4 bond, a method for producing the oligosaccharide, and a new function of the oligosaccharide. A polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of (A) to (C), having an epimerase activity for an oligosaccharide having at least a β-1,4 bond is provided: A) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (B) an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, added or deleted; or (C) a SEQ ID NO: 1. An amino acid sequence having 51% or more homology with the amino acid sequence represented by 1. The present invention also provides a functional food characterized by containing 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose.

Description

本発明は、新規ポリペプチドおよびその利用に関するものであり、より詳細には、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドおよびその製造方法、該ポリペプチドを用いて合成したヘテロオリゴ糖およびその合成方法、ならびにこれらの利用に関するものである。   The present invention relates to a novel polypeptide and use thereof, and more specifically, a polypeptide having 2-epimerase activity for oligosaccharides having β-1,4 bonds, a method for producing the same, and using the polypeptide The present invention relates to a synthesized hetero-oligosaccharide, a method for synthesizing the same, and use thereof.

炭水化物は、生物の主要なエネルギー源であり、脂肪酸、トリグリセリド、およびいくつかのアミノ酸のような他の化合物の生合成における前駆体である。炭水化物はまた、結合組織、神経組織、細菌細胞壁、および核酸の構造的成分として重要な役割を担っている。このような生体における栄養成分および／または構成成分としての役割以外に、炭水化物は、糖タンパク質などが有する糖鎖として生体内の種々の情報伝達において重要な役割を担うことが近年明らかにされており、遺伝子工学および／またはタンパク質工学だけでなく糖鎖工学が注目を集めている。   Carbohydrates are the main energy source of living organisms and are precursors in the biosynthesis of other compounds such as fatty acids, triglycerides, and several amino acids. Carbohydrates also play an important role as structural components of connective tissue, neural tissue, bacterial cell walls, and nucleic acids. In recent years, it has been clarified that carbohydrates play an important role in various information transmissions in vivo as sugar chains of glycoproteins, in addition to their role as nutrients and / or constituents in the living body. In addition to genetic engineering and / or protein engineering, glycoengineering has attracted attention.

単糖が２〜１０個程度結合した炭水化物であるオリゴ糖は、例えば、根菜類の根粒部分および／または哺乳動物の乳汁に含まれており、動植物の組織中に広く分布している。また、薬理作用を持ったオリゴ糖が数多く発見されており、これらを利用した医薬品および／または健康食品の開発も盛んに行われている（例えば、特許文献１および２などを参照のこと）。   Oligosaccharides, which are carbohydrates to which about 2 to 10 monosaccharides are bound, are contained in, for example, root nodules and / or mammalian milk, and are widely distributed in animal and plant tissues. In addition, many oligosaccharides having a pharmacological action have been discovered, and pharmaceuticals and / or health foods using these have been actively developed (see, for example, Patent Documents 1 and 2).

近年、様々な生理機能を有するオリゴ糖に注目が寄せられている。機能性オリゴ糖合成を目的とした多くの研究開発が行われており、機能性オリゴ糖の研究開発として、様々なオリゴ糖が工業的規模で生産されてきた。現在では，特定保健用食品の半数以上が機能性成分としてオリゴ糖を含んでいる。   In recent years, attention has been focused on oligosaccharides having various physiological functions. Much research and development has been conducted for the purpose of functional oligosaccharide synthesis, and various oligosaccharides have been produced on an industrial scale as research and development of functional oligosaccharides. At present, more than half of the foods for specified health use contain oligosaccharides as functional ingredients.

ヘテロオリゴ糖は、２種類以上の異なる単糖が結合して形成されるオリゴ糖であり、種々の生理活性を有することが知られている。そのため、ヘテロオリゴ糖は広範な分野において利用されている。ヘテロオリゴ糖の製造方法の一例としては、セロビオースホスホリラーゼの逆反応を利用してグルコース−１−リン酸と糖類から製造する方法がある（特許文献３を参照のこと）。セロビオースホスホリラーゼは、本来セロビオースをグルコース−１−リン酸とグルコースとに加リン酸分解する酵素であるが、この反応が可逆的であることを利用して、グルコース−１−リン酸と種々の糖類とから様々なヘテロオリゴ糖が合成されている。   Hetero-oligosaccharides are oligosaccharides formed by combining two or more different monosaccharides, and are known to have various physiological activities. For this reason, hetero-oligosaccharides are used in a wide range of fields. As an example of a method for producing a hetero-oligosaccharide, there is a method for producing glucose-1-phosphate and saccharides by utilizing the reverse reaction of cellobiose phosphorylase (see Patent Document 3). Cellobiose phosphorylase is originally an enzyme that phosphorylates cellobiose into glucose-1-phosphate and glucose. By utilizing this reversible reaction, glucose-1-phosphate and various sugars are used. Various hetero-oligosaccharides have been synthesized.

しかし、上述したヘテロオリゴ糖の製造方法は、グルコース−１−リン酸が高価であるため、製造されるヘテロオリゴ糖が高価になるという欠点を有する。また、この方法は、反応時に生成されるリン酸を反応終了後に除去する必要がある。さらに、この方法を用いた場合、ヘテロオリゴ糖の収率に限界がある。また、このようなヘテロオリゴ糖の製造方法以外の方法として、安価でありかつ入手容易なスクロースに、グルコース−１−リン酸の存在下で、スクロースホスホリラーゼとセロビオースホスホリラーゼとを作用させることによって反応時にリン酸が副生しない方法が特許文献４に記載されている。   However, the above-described method for producing a hetero-oligosaccharide has a disadvantage that the produced hetero-oligosaccharide becomes expensive because glucose-1-phosphate is expensive. In this method, it is necessary to remove phosphoric acid produced during the reaction after the reaction is completed. Furthermore, when this method is used, the yield of heterooligosaccharide is limited. Further, as a method other than such a method for producing a hetero-oligosaccharide, sucrose phosphorylase and cellobiose phosphorylase are allowed to react with sucrose, which is inexpensive and readily available, in the presence of glucose-1-phosphate. Patent Document 4 describes a method in which no acid is by-produced.

偏性嫌気性ルーメン細菌であるルミノコッカス アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ（以下、Ｒ．ａｌｂｕｓ））７株（ＡＴＣＣ２７２１０として登録されている。）がセロビオースを２−エピマー化する活性を有することは知られており、セロビオースエピメラーゼ（ＣＥ）としてその存在が示唆されていた（非特許文献１を参照のこと）。この菌の培養液に分泌されるというこの活性が単一の酵素としてのＣＥによるものであることを証明するために、多くの研究者によって酵素の分離精製が試みられてきた。しかしながら、未だに本酵素の純化および同定には至っておらず、その実体は不明である。
特開平８−２５６７３０号公報（平成８年（１９９６）１０月８日公開） 特開２００３−４７４０２公報（平成１５年２月１８日公開） 特開平２−１６９９２号公報（平成２年１月１９日公開） 特開２００１−２０４４８９号公報（平成１３年７月３１日公開 Ｔ．Ｒ．ＴｙｌｅｒとＪ．Ｍ．Ｌｅａｔｈｅｒｗｏｏｄ（１９６７） Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１１９，３６３。 It is known that luminococcus albus (hereinafter referred to as R. albus) 7 strain (registered as ATCC27210), which is an obligate anaerobic rumen bacterium, has an activity to make cellobiose 2-epimerized. The presence of cellobiose epimerase (CE) has been suggested (see Non-Patent Document 1). In order to prove that this activity of being secreted into the culture medium of this fungus is due to CE as a single enzyme, many researchers have attempted to separate and purify the enzyme. However, the enzyme has not yet been purified and identified, and its substance is unknown.
JP-A-8-256730 (published October 8, 1996) JP 2003-47402 A (published February 18, 2003) Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2-16992 (published on January 19, 1990) JP 2001-204489 A (published July 31, 2001) T. T. R. Tyler and J.M. M.M. Deathwood (1967) Arch. Biochem. Biophys. 119,363.

特許文献４に記載されるような方法を用いるヘテロオリゴ糖合成法は、以下のような不都合を有する：（１）原料が高価である；（２）合成するために複数の基質および酵素を必要とし、その結果、コストが上昇し、反応条件の設定が複雑化する；（３）スクロースを用いる反応において、反応工程は一段階であるものの、反応液中には目的のヘテロオリゴ糖以外に未反応の基質（スクロース）、スクロースの分解によって生じるフルクトース、未反応の受容体糖および複数の糖が混在しているため、目的のヘテロオリゴ糖の分離が複雑である；（４）セロビオースホスホリラーゼを用いた合成法では、非還元末端側の糖がグルコースに限定される。   The hetero-oligosaccharide synthesis method using the method described in Patent Document 4 has the following disadvantages: (1) Raw materials are expensive; (2) Multiple substrates and enzymes are required for synthesis. As a result, the cost increases and the setting of reaction conditions becomes complicated; (3) In the reaction using sucrose, although the reaction process is one step, there is no unreacted substance other than the target hetero-oligosaccharide in the reaction solution. The substrate (sucrose), fructose produced by the decomposition of sucrose, unreacted acceptor sugars and multiple sugars are mixed, so the separation of the target hetero-oligosaccharide is complicated; (4) Synthesis method using cellobiose phosphorylase Then, the sugar at the non-reducing terminal side is limited to glucose.

非特許文献１においてその存在が示唆された酵素ＣＥ（ＥＣ ５．１．３．１１）の反応生成物は、４−O−β−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−マンノース（グルコシルマンノース；Ｇｌｃ−Ｍａｎ）であると推定された。しかし、本酵素が分泌酵素であるのか否かは決定されておらず、また、酵素の詳細な諸性質や、基質特異性、生成物の詳細な構造決定は未だなされていない。   The reaction product of the enzyme CE (EC 5.1.3.11), whose existence was suggested in Non-Patent Document 1, is 4-O-β-D-glucopyranosyl-D-mannose (glucosyl mannose; Glc-Man). It was estimated that. However, whether or not this enzyme is a secreted enzyme has not been determined, and detailed properties of the enzyme, substrate specificity, and detailed structure of the product have not yet been determined.

上述したようにＣＥは独特な酵素活性を有しており、酵素学的観点から非常に興味深い酵素である。よって、本酵素を用いたヘテロオリゴ糖合成に対して多くの利点および有用性を期待することができる。   As described above, CE has a unique enzyme activity and is a very interesting enzyme from an enzymatic viewpoint. Therefore, many advantages and usefulness can be expected for hetero-oligosaccharide synthesis using this enzyme.

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＣＥの精製を実現し、その酵素化学的諸性質を解明して新規オリゴ糖合成方法を提供することにある。   The present invention has been made in view of the above-described problems, and an object of the present invention is to provide a novel oligosaccharide synthesis method by realizing purification of CE and elucidating various enzyme chemical properties.

本発明者らは、上述のような問題点を解決するため、ＣＥ産生菌を自然界に求め、探索してきた。その結果、牛ルーメンから分離したＲ．ａｌｂｕｓが産生する酵素の中から、優れたＣＥを見出し（実施例１を参照）、また、この微生物の産生するＣＥをコードする遺伝子を取得し（実施例２と以下の文章を参照）、本発明を完成するに至った。本発明に係るポリペプチドは、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有することを特徴としており、解決しようとする課題を克服するに至った。   In order to solve the above-described problems, the present inventors have sought and searched for CE-producing bacteria in nature. As a result, R. cerevisiae separated from cattle rumen. Among the enzymes produced by albus, an excellent CE was found (see Example 1), and a gene encoding CE produced by this microorganism was obtained (see Example 2 and the following text). The invention has been completed. The polypeptide according to the present invention is characterized by having 2-epimerase activity for oligosaccharides having β-1,4 bonds, and has overcome the problems to be solved.

すなわち、本発明に係るポリペプチドは、（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失された、アミノ酸配列；または（Ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と５１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、のいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有することを特徴としている。   That is, the polypeptide according to the present invention has (A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (B) one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are substituted, added or deleted. A polypeptide comprising any one of the amino acid sequences; or (C) an amino acid sequence having 51% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, comprising at least β-1,4 It has the epimerase activity with respect to the oligosaccharide which has a coupling | bonding.

本発明に係るポリペプチドは、（Ａ）ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌由来である；（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４０〜４２ｋＤａである；（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有する；および（Ｄ）少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有する、という生物学的性状を有していることを特徴としている。本発明に係るポリペプチドはさらに、（Ｅ）少なくともセロビオース、セロトリオース、セロテトラオースまたはラクトースの還元末端のグルコースを２−エピマー化する活性を有する；（Ｆ）紫外線の最大吸収が２７８〜２８０ｎｍである；（Ｇ）等電点（ｐＩ）が４．６９である；（Ｈ）（Ｄ）に示される活性が金属塩（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋，Ｚｎ２＋またはＡｇ＋）で阻害される；（Ｉ）（Ｄ）に示される活性が化学物質（例えば、Ｎ−ブロモスクシミド、ヨード酢酸またはｐ−クロロマーキュリーベンゾエート）で阻害される；（Ｊ）（Ｄ）に示される活性の最大活性が、ブリットン−ロビンソン緩衝液中でｐＨ７．７〜８．２にて示される；または（Ｋ）（Ｄ）に示される活性の最大活性が、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液中で２８〜３２℃にて示される、という性状を有していることが好ましい。上記金属塩または化学物質の好ましい濃度は１ｍＭであり、上記緩衝液の好ましい濃度は４０〜１００ｍＭである。また、上記性状（Ｅ）に示した活性は、可逆的であり、本発明に係るポリペプチドは、当該可逆的反応もまた触媒する。The polypeptide according to the present invention is (A) derived from a bacterium of the genus Ruminococcus; (B) has an apparent molecular weight of 40 to 42 kDa by SDS-PAGE; (C) the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 It has a biological property of having a sequence at the N-terminus; and (D) having 2-epimerase activity for an oligosaccharide having at least a β-1,4 bond. The polypeptide according to the present invention further has (E) an activity of 2-epimerizing glucose at the reducing end of at least cellobiose, cellotriose, cellotetraose or lactose; (F) the maximum absorption of ultraviolet light is 278 to 280 nm. (G) the isoelectric point (pI) is 4.69; (H) the activity shown in (D) is a metal salt (eg Fe 3+ , Co 2+ , Cu 2+ , Pb 2+ , Zn 2+ or Ag + (I) the activity shown in (D) is inhibited by a chemical (eg, N-bromosuccinimide, iodoacetic acid or p-chloromercury benzoate); (J) the activity shown in (D) The maximum activity of the activity shown in (K) (D) is shown in Britton-Robinson buffer at pH 7.7-8.2; Shown at 28-32 ° C. in Tris- maleate buffer preferably has a property called. A preferred concentration of the metal salt or chemical substance is 1 mM, and a preferred concentration of the buffer is 40 to 100 mM. Moreover, the activity shown in the above property (E) is reversible, and the polypeptide according to the present invention also catalyzes the reversible reaction.

本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすることを特徴としている。   The polynucleotide according to the present invention is characterized by encoding the above polypeptide.

本発明に係るポリヌクレオチドは、（Ａ）配列番号２に示される塩基配列；（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列中の１個もしくは数個のヌクレオチドが置換、付加もしくは欠失された、塩基配列；または（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、オリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴としている。   The polynucleotide according to the present invention is (A) a base sequence represented by SEQ ID NO: 2; (B) one or several nucleotides in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 are substituted, added or deleted; A nucleotide sequence; or (C) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence that hybridizes with a complementary sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions, and encodes a polypeptide having epimerase activity against an oligosaccharide It is characterized by that.

本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。   The vector according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned polynucleotide.

本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを用いることを特徴としている。   The polypeptide production method according to the present invention is characterized by using the above-mentioned vector.

また、本発明に係るポリペプチドを生産するためのキットは、上記ベクターを備えていることを特徴としている。   A kit for producing a polypeptide according to the present invention is characterized by comprising the above vector.

本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。本発明に係る形質転換体は、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌であることが好ましく、ルミノコッカス アルブス（Ｒ．ａｌｂｕｓ）であることがより好ましい。   The transformant according to the present invention is characterized by containing the above polynucleotide. The transformant according to the present invention is preferably a bacterium of the genus Ruminococcus, more preferably R. albus.

本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記の形質転換体を用いることを特徴としている。   The polypeptide production method according to the present invention is characterized by using the transformant described above.

また、本発明に係るポリペプチドを生産するためのキットは、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。   A kit for producing a polypeptide according to the present invention is characterized by comprising the above transformant.

本発明に係る抗体は、上記のポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。   The antibody according to the present invention is characterized by specifically binding to the above polypeptide.

本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記の抗体を用いることを特徴としている。   The polypeptide production method according to the present invention is characterized by using the above-mentioned antibody.

また、本発明に係るポリペプチドを生産するためのキットは、上記抗体を備えていることを特徴としている。   A kit for producing a polypeptide according to the present invention is characterized by comprising the above-described antibody.

本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成する方法は、上記のポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖と反応させる工程を包含することを特徴としている。   The method for synthesizing a hetero-oligosaccharide according to the present invention is characterized by including a step of reacting the above polypeptide with an oligosaccharide having a β-1,4 bond.

本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成するための試薬キットは、上記のポリペプチドを備えていることを特徴としている。本発明に係る試薬キットは、β−１，４結合を有するオリゴ糖をさらに備えていることが好ましい。   A reagent kit for synthesizing a hetero-oligosaccharide according to the present invention is characterized by comprising the above polypeptide. The reagent kit according to the present invention preferably further comprises an oligosaccharide having a β-1,4 bond.

本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成するための試薬組成物は、上記のポリペプチドを含んでいることを特徴としている。   The reagent composition for synthesizing the hetero-oligosaccharide according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned polypeptide.

本発明に係る機能性食品は、プレバイオティクスとして機能するために、上記のポリペプチドを用いて生産される化合物を含んでいることを特徴としている。本発明に係る機能性食品は、ビフィズス菌の成長促進剤および低カロリー性（難消化性）食品であることが好ましい。また、本発明に係る機能性食品は、さらなる機能性物質を含んでいてもよい。なお、本発明に係る機能性食品は、組成物の形態で単品にて提供されても、キットの形態にて提供されてもよい。   The functional food according to the present invention is characterized in that it contains a compound produced using the above-mentioned polypeptide in order to function as a prebiotic. The functional food according to the present invention is preferably a growth promoter for bifidobacteria and a low calorie (digestible) food. Moreover, the functional food which concerns on this invention may contain the further functional substance. The functional food according to the present invention may be provided as a single product in the form of a composition or in the form of a kit.

本発明に係る機能性食品の製造方法は、上記のポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖と反応させる工程；および反応生成物を食品に添加する工程を包含することを特徴としている。本発明に係る機能性食品の製造方法は、上記食品にさらなる機能性物質を添加する工程をさらに包含してもよい。   The method for producing a functional food according to the present invention includes a step of reacting the above polypeptide with an oligosaccharide having a β-1,4 bond; and a step of adding a reaction product to the food. Yes. The method for producing a functional food according to the present invention may further include a step of adding a further functional substance to the food.

本発明に係る腸内環境改善用機能性食品は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴としている。特に当該機能性食品は、ビフィズス菌の増殖を促進することで腸内環境を改善するためのものである。   The functional food for improving the intestinal environment according to the present invention is characterized by containing 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose. In particular, the functional food is intended to improve the intestinal environment by promoting the growth of bifidobacteria.

本発明に係る脂質代謝改善用機能性食品は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴としている。特に当該機能性食品は、血中コレステロール量を減少させることで脂質代謝を改善するためのものである。   The functional food for improving lipid metabolism according to the present invention is characterized by containing 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose. In particular, the functional food is for improving lipid metabolism by reducing blood cholesterol level.

本発明に係るミネラル吸収能促進用機能性食品は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴としている。   The functional food for promoting mineral absorbability according to the present invention is characterized by containing 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose.

本発明に係る糖尿病患者用機能性食品は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴としている。   The functional food for diabetic patients according to the present invention is characterized by containing 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose.

本発明に係わる低カロリー性低甘味料は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−D−マンノースを含有することを特徴とする。 The low calorie low sweetener according to the present invention is characterized by containing 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose.

本発明に係わる便秘改善剤は、４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする。   The constipation improving agent according to the present invention is characterized by containing 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose.

本発明に係るポリペプチドを用いれば、セロオリゴ糖の還元末端グルコースが２−エピマー化した生成物や乳糖から４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースなどを容易にかつ大量に合成することができるだけでなく、所望のヘテロオリゴ糖を容易に合成することができる。これにより、機能性食品素材（例えば、ノンカロリーもしくは低カロリーの食品、またはミネラル（特に、Ｃａ２＋など）の吸収に優れた食品）を低価格で提供することができる。また、本発明を用いればは血中コレステロールの減少を生じさせる食品または食品添加物を開発することができる。さらに、制腸作用などを有するビフィズス菌の成長を促進することが可能である。但し、上記以外の生理活性が認めうることを否定するものではない。When the polypeptide according to the present invention is used, 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose and the like are easily and in large quantities from 2-epimerized product or lactose of the reducing end glucose of cellooligosaccharide. In addition to being able to synthesize, the desired hetero-oligosaccharide can be easily synthesized. Thereby, a functional food material (for example, a non-calorie or low-calorie food, or a food excellent in absorption of minerals (particularly, Ca 2+ )) can be provided at a low price. Moreover, if this invention is used, the foodstuff or food additive which produces the reduction | decrease in blood cholesterol can be developed. Furthermore, it is possible to promote the growth of bifidobacteria having an anti-enteric action and the like. However, it does not deny that physiological activities other than the above can be recognized.

４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースは別名エピラクトース（ｅｐｉｌａｃｔｏｓｅ）とも呼ばれ、牛乳中にごく微量存在することが知られている（Ｔ．Ｒ．Ｉ．Ｃａｔａｌｄｉら，（１９９９） Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１，４９１９）。本化合物を以下エピラクトースと略記する。   4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose is also known as epilactose and is known to be present in a very small amount in milk (T.R.I. Cataldi et al., (1999) Anal. Chem. 71, 4919). This compound is hereinafter abbreviated as epilactose.

図１は、本発明に係るポリペプチドが触媒する、セロビオースの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化してＧｌｃ−Ｍａｎに変換する反応を示すスキームである。FIG. 1 is a scheme showing a reaction catalyzed by a polypeptide according to the present invention to isomerize the 2-position hydroxyl group of glucose on the reducing end side of cellobiose and convert it to Glc-Man. 図２は、本発明に係るポリペプチドが触媒する、ラクトースの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化してエピラクトースに変換する反応を示すスキームである。FIG. 2 is a scheme showing a reaction catalyzed by the polypeptide according to the present invention to isomerize the 2-position hydroxyl group of glucose at the reducing end of lactose and convert it to epilactose. 図３は、種々のクロマトグラフィーを用いて精製した本発明に係るポリペプチドを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＣＢＢ染色写真である。Ｍ、分子量マーカー；Ｃ、粗抽出液；Ｐ、ＣＥ精製酵素標品。FIG. 3 is a CBB-stained photograph of an SDS-PAGE gel showing polypeptides according to the present invention purified using various chromatographies. M, molecular weight marker; C, crude extract; P, CE purified enzyme preparation. 図４は、本発明に係るポリペプチドを、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ａ）、ＵＤＰ−グルコース（Ｂ）、グルコース−６−リン酸（Ｃ）、グルコース（Ｄ）、マンノース（Ｅ）、フルクトース（Ｆ）、ガラクトース（Ｇ）、キシロース（Ｈ）、アラビノース（Ｉ）、ソホロース（Ｊ）、ラミナリビオース（Ｋ）、ゲンチオビオース（Ｌ）、ラクトース（Ｍ）、マルトース（Ｎ）、スクロース（Ｏ）、セロビオース（Ｐ）、セロトリオース（Ｑ）およびセロテトラオース（Ｒ）を基質として行った反応生成物をＴＬＣで分析した結果を示す図である。FIG. 4 shows a polypeptide according to the present invention comprising N-acetyl-D-glucosamine (A), UDP-glucose (B), glucose-6-phosphate (C), glucose (D), mannose (E), Fructose (F), galactose (G), xylose (H), arabinose (I), sophorose (J), laminaribiose (K), gentiobiose (L), lactose (M), maltose (N), sucrose (O ), Cellobiose (P), cellotriose (Q) and cellotetraose (R) as a substrate, the results of analysis of the reaction product by TLC. 図５は、本発明に係るポリペプチドが生成したラクトースからの生成物（エピラクトース）の１Ｈ−ＮＭＲ（ａ）と１３Ｃ−ＮＭＲ（ｂ）のスペクトラである。FIG. 5 shows 1 H-NMR (a) and 13 C-NMR (b) spectra of a product (epilactose) from lactose produced by the polypeptide of the present invention. 図６は、本発明に係るポリペプチドが生成したセロトリオースからの生成物（Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎ）の１Ｈ−ＮＭＲ（ａ）と１３Ｃ−ＮＭＲ（ｂ）のスペクトラである。FIG. 6 shows the 1 H-NMR (a) and 13 C-NMR (b) spectra of the product (Glc-Glc-Man) from cellotriose produced by the polypeptide of the present invention. 図７は、本発明に係るポリペプチドが触媒する、セロトリオ−スの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化してＧｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎに変換する反応を示すスキームである。FIG. 7 is a scheme showing a reaction catalyzed by the polypeptide according to the present invention to isomerize the 2-position hydroxyl group of glucose at the reducing end of cellotriose and convert it to Glc-Glc-Man. 図８は、エピラクトース（ａ）またはＤＦＡＩＩＩ（ｂ）がミネラル吸収促進作用を有することを示す結果である。FIG. 8 shows the results showing that epilactose (a) or DFAIII (b) has a mineral absorption promoting action. 図９は、エピラクトースがミネラル吸収促進作用を有することを示す結果である。パネルＡはＣａ２＋、パネルＢはＭｇ２＋、パネルＣはＺｎ２＋の吸収をそれぞれ示す。FIG. 9 shows the results showing that epilactose has a mineral absorption promoting effect. Panel A shows Ca 2+ , Panel B shows Mg 2+ , and Panel C shows Zn 2+ absorption. 図１０は、反転サック法で測定した、エピラクトースのＣａ２＋吸収促進効果を示す図である。縦軸は、サックに用いた小腸の長さ（ｃｍ）当たりのＣａ２＋吸収量を表す。FIG. 10 is a diagram showing the Ca 2+ absorption promoting effect of epilactose measured by the inverted sack method. The vertical axis represents the amount of Ca 2+ absorbed per length (cm) of the small intestine used for the sac. 図１１は、エピラクトース添加食を摂取したラットにおける血中総コレステロール値の変化を示すグラフである。パネルＡが絶食時、パネルＢが摂食時を表す。FIG. 11 is a graph showing changes in the total blood cholesterol level in rats fed an epilactose-added diet. Panel A represents fasting and panel B represents feeding. 図１２は、エピラクトース添加食を摂取したラットにおける血中の中性脂質、リン脂質、コレステロール量の変化を示すグラフである。FIG. 12 is a graph showing changes in blood neutral lipids, phospholipids, and cholesterol levels in rats fed an epilactose-added diet. 図１３は、エピラクトース摂食後の血糖値の変化を表したグラフである。FIG. 13 is a graph showing changes in blood glucose level after feeding epilactose.

異性化酵素の一つに分類されるエピメラーゼは、これまでに３２種類の存在が報告されている。その多くは、ヌクレオチドやリン酸、アシル基などの修飾を受けた糖類を基質とするものであり、未修飾の糖を基質とするものはアルドース１−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．３）、マルトース１−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．２１）およびＣＥ（ＥＣ ５．１．３．１１）の３種類だけである。   Up to now, 32 types of epimerases classified as one of isomerases have been reported. Most of them use saccharides modified with nucleotides, phosphates, acyl groups and the like as substrates, and those using unmodified sugars as substrates are aldose 1-epimerase (EC 5.1.3.3). , Maltose 1-epimerase (EC 5.1.3.21) and CE (EC 5.1.3.11).

本発明者らは、自ら見出したルミノコッカス アルブス（Ｒ．ａｌｂｕｓ）ＮＥ１由来のＣＥを精製し、酵素化学的諸性質の解明を試みた。本酵素はセロビオースの還元末端側グルコースの２位水酸基を異性化し、Ｇｌｃ−Ｍａｎへの相互変換を触媒した（図１）。上述した３種類のエピメラーゼのうち還元末端側の２位に作用するエピメラーゼはＣＥのみである。   The present inventors have refined CE derived from R. albus NE1 found by themselves and tried to elucidate various enzyme chemical properties. This enzyme isomerized the 2-position hydroxyl group of glucose at the reducing end of cellobiose and catalyzed the interconversion to Glc-Man (FIG. 1). Of the three types of epimerases described above, CE is the only epimerase that acts at the 2-position on the reducing end side.

このように、ＣＥの触媒する反応は非常に独特であったので、本発明者らは、本酵素をセロビオース以外の基質に作用させるあるいは本酵素の基質特異性を改変することで、新規の生成物が得られるのではないかと考え、ＣＥによる新規オリゴ糖合成をさらに試みた。   Thus, since the reaction catalyzed by CE was very unique, the present inventors made a novel production by allowing the enzyme to act on a substrate other than cellobiose or modifying the substrate specificity of the enzyme. We thought that a product could be obtained, and further attempted new oligosaccharide synthesis by CE.

〔１〕ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
〔１−１〕ポリペプチド
本発明は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
本明細書中において使用される場合、「本発明に係るポリペプチド」は、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌由来の、少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはその変異体が意図され、より詳細には、ＣＥまたはその変異体が意図される。上記細菌は、Ｒ．ａｌｂｕｓであることが好ましく、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１系統であることがより好ましい。なお、本明細書中に記載されるＲ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１０３６（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）によって提供され得る。[1] Polypeptide and Polynucleotide [1-1] Polypeptide The present invention provides a polypeptide having 2-epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond.
As used herein, “polypeptide according to the present invention” is a polypeptide having 2-epimerase activity against oligosaccharides having at least β-1,4 linkages derived from bacteria belonging to the genus Ruminococcus. A peptide or variant thereof is contemplated, and more specifically, CE or variant thereof is contemplated. The bacteria are R. albus, preferably R. albus. Albus NE1 strain is more preferable. Note that R.I. albus NE1 may be provided by accession number FERM P-21026 (Independent Administrative Institution National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Depositary).

本明細書中において使用される場合、「Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ（Ｒ．ａｌｂｕｓ） ＮＥ１由来のＣＥ」は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が約４１ｋＤａ（例えば、４０〜４２ｋＤａ）であり、配列番号４に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有していることを特徴としている。なお、この見かけの分子量は、用いたポリペプチド（タンパク質）における翻訳後修飾の程度や、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるゲルの濃度によって若干変動するため、実際のアミノ酸配列から計算される分子量が約３５ｋＤａ〜約４６ｋＤａであり得ることを当業者は容易に理解する。なお、本発明者らによって同定されたＣＥの配列情報に基づいて計算された分子量は４５２１７Ｄａである。また、図３のレーンＰに示される単一のバンドの位置を正確に表せば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量は４３．１ｋＤａである。   As used herein, “CE from Ruminococcus albus (R. albus) NE1” has an apparent molecular weight of about 41 kDa (eg, 40-42 kDa) by SDS-PAGE and is shown in SEQ ID NO: 4. The amino acid sequence is characterized by having an N-terminal amino acid sequence. The apparent molecular weight slightly varies depending on the degree of post-translational modification in the polypeptide (protein) used and the concentration of the gel used for SDS-PAGE, so that the molecular weight calculated from the actual amino acid sequence is about 35 kDa to One skilled in the art will readily appreciate that it can be about 46 kDa. The molecular weight calculated based on the sequence information of CE identified by the present inventors is 45217 Da. Moreover, if the position of the single band shown in the lane P of FIG. 3 is accurately represented, the apparent molecular weight by SDS-PAGE is 43.1 kDa.

本発明に係るポリペプチドの有する活性は、オリゴ糖の還元末端側である糖の２位水酸基を異性化する活性であることが好ましい。本明細書中において使用される場合、「オリゴ糖」は、２〜１０個の単糖からなる糖が意図され、単糖の数は、２〜６個が好ましく、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオースまたはラクトースであることがより好ましい。   The activity of the polypeptide according to the present invention is preferably the activity of isomerizing the hydroxyl group at the 2-position of the sugar on the reducing end side of the oligosaccharide. As used herein, “oligosaccharide” is intended to be a sugar composed of 2 to 10 monosaccharides, and the number of monosaccharides is preferably 2 to 6, and cellobiose, cellotriose, cellotetraose. Or it is more preferable that it is lactose.

後述の実施例に示されるように、本発明に係るポリペプチドは、紫外線の最大吸収が２７８〜２８０ｎｍであり、等電点（ｐＩ）が４．６９である。また、本発明に係るポリペプチドにおいて、上記オリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性は、金属塩（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋，Ｚｎ２＋またはＡｇ＋）で阻害され、化学物質（例えば、Ｎ−ブロモスクシミド、ヨード酢酸またはｐ−クロロマーキュリーベンゾエート）で阻害される。なお、本発明に係るポリペプチドの有する活性を阻害するために好ましい上記金属塩または化学物質の濃度は１ｍＭである。さらに、本発明に係るポリペプチドにおいて、上記オリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性は、ブリットン−ロビンソン緩衝液中でｐＨ７．７〜８．２にてその最大活性が示され、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液中で２８〜３２℃にてその最大活性が示される。なお、上記緩衝液の好ましい濃度は４０〜１００ｍＭである。As shown in Examples described later, the polypeptide according to the present invention has a maximum ultraviolet absorption of 278 to 280 nm and an isoelectric point (pI) of 4.69. In the polypeptide of the present invention, the 2-epimerase activity for the oligosaccharide is inhibited by a metal salt (for example, Fe 3+ , Co 2+ , Cu 2+ , Pb 2+ , Zn 2+ or Ag + ), and a chemical substance ( For example, N-bromosuccinimide, iodoacetic acid or p-chloromercury benzoate). In addition, the concentration of the metal salt or chemical substance preferable for inhibiting the activity of the polypeptide according to the present invention is 1 mM. Furthermore, in the polypeptide according to the present invention, the 2-epimerase activity for the oligosaccharide has a maximum activity in Britton-Robinson buffer at pH 7.7 to 8.2, and in Tris-maleic acid buffer. Shows its maximum activity at 28-32 ° C. In addition, the preferable density | concentration of the said buffer solution is 40-100 mM.

本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。   As used herein, the term “polypeptide” is used interchangeably with “peptide” or “protein”. In addition, “fragment” of a polypeptide is intended to be a partial fragment of the polypeptide. The polypeptides according to the invention may also be isolated from natural sources or chemically synthesized.

用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。   The term “isolated” polypeptide or protein is intended to be a polypeptide or protein that has been removed from its natural environment. For example, recombinantly produced polypeptides and proteins expressed in a host cell can be isolated in the same manner as natural or recombinant polypeptides and proteins that have been substantially purified by any suitable technique. It is thought that there is.

本発明に係るポリペプチドは、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１から精製されたが、本発明に係るポリペプチドとしてはこれに限定されず、他の天然の精製産物、化学合成手順の産物、または原核生物宿主から組換え技術によって産生された産物を包含する。   The polypeptide according to the present invention is the R.I. Although purified from albus NE1, the polypeptide according to the present invention includes, but is not limited to, other natural purified products, products of chemical synthesis procedures, or products produced by recombinant techniques from prokaryotic hosts. To do.

本明細書の記載に基づけば、当業者は、本発明に係るポリペプチドの全アミノ酸配列および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列（または、オープンリーディングフレームもしくはその一部）を取得することができる。例えば、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下のように取得され得る。   Based on the description of the present specification, a person skilled in the art obtains the entire amino acid sequence of the polypeptide according to the present invention and the entire base sequence (or an open reading frame or a part thereof) of the polynucleotide encoding the polypeptide. be able to. For example, a polynucleotide encoding a polypeptide according to the present invention can be obtained as follows.

本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの単離方法は、本発明に係るポリペプチドを発現する細胞から調製されるゲノムライブラリーを作製する工程を包含する。本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するためには、ゲノムライブラリーを用いる方が好ましい。プラスミド、コスミド、ファージ、ＹＡＣなどの広範囲に入手可能なクローニングベクターを用いて、本発明に係るポリペプチドまたはその部分をコードするヌクレオチド配列を単離するのに適した遺伝子ライブラリーを作成し得る。   A method for isolating a polynucleotide encoding a polypeptide according to the present invention includes a step of preparing a genomic library prepared from cells expressing the polypeptide according to the present invention. In order to isolate a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, it is preferable to use a genomic library. Widely available cloning vectors such as plasmids, cosmids, phages, YACs and the like can be used to create gene libraries suitable for isolating nucleotide sequences encoding the polypeptides of the invention or portions thereof.

本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を確認するために遺伝子ライブラリーをスクリーニングする方法は、配列番号１に示されるアミノ酸配列情報に基づくオリゴヌクレオチドプローブを調製する工程を包含する。標準トリプレット遺伝暗号を用いて、約１７塩基対またはそれより長いオリゴヌクレオチド配列が、通常のインビトロ合成技術によって調製され得る。このオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の全長または一部分に対応するように合成される。得られたオリゴヌクレオチドは、次いで、放射性核種、酵素、ビオチン、蛍光試薬などで標識され、そして遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用される。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づいて設計した縮重プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってもよい。   A method for screening a gene library to confirm the presence of a polynucleotide encoding a polypeptide according to the present invention includes a step of preparing an oligonucleotide probe based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1. Using the standard triplet genetic code, oligonucleotide sequences of about 17 base pairs or longer can be prepared by conventional in vitro synthetic techniques. This oligonucleotide sequence is synthesized to correspond to the full length or a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The resulting oligonucleotide is then labeled with a radionuclide, enzyme, biotin, fluorescent reagent, etc. and used as a probe to screen a gene library. Alternatively, polymerase chain reaction (PCR) using a degenerate primer designed based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be performed.

本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記遺伝子ライブラリー単離物から回収される組換えＤＮＡから得られ得る。本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、これらの組換え分子の非ベクターヌクレオチド配列の配列決定によって得られ得る。ヌクレオチド配列情報は、広く用いられているＤＮＡ配列決定プロトコル（例えば、Ｓ．Ｌ．ＢｅｒｇｅｒとＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２，３０７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）（本明細書中に参考として援用される））中に見いだされ得る配列決定法などを使用して得られ得る。いくつかの組換えＤＮＡ単離物（ｃＤＮＡからの単離物およびゲノムライブラリーからの単離物の両方を包含する）からのヌクレオチド配列情報を組み合わせて、本発明に係るポリペプチドの全アミノ酸のコード配列、ならびに上流ヌクレオチド配列および下流ヌクレオチド配列を提供し得る。   A polynucleotide encoding a polypeptide according to the present invention can be obtained from recombinant DNA recovered from the gene library isolate. Polynucleotides encoding polypeptides according to the present invention can be obtained by sequencing non-vector nucleotide sequences of these recombinant molecules. Nucleotide sequence information can be obtained from widely used DNA sequencing protocols (eg, SL Berger and AR Kimmel (1987) Methods Enzymol. 152, 307, Academic Press, NY) (referenced herein). Which can be found using a sequencing method or the like that can be found in). By combining nucleotide sequence information from several recombinant DNA isolates (including both isolates from cDNA and isolates from genomic libraries), the total amino acids of the polypeptides of the invention Coding sequences can be provided, as well as upstream and downstream nucleotide sequences.

本発明に係るポリペプチドに特異的な遺伝子ライブラリー単離物から得られたヌクレオチド配列は、本発明に係るポリペプチド遺伝子の重要な領域を同定するために分析に供される。これらの重要な領域には、オープンリーディングフレーム、プロモーター配列、終止配列などが包含される。ヌクレオチド配列情報の分析は、好ましくは、コンピューターで行われる。重要な領域についてヌクレオチド配列を分析するのに適したソフトウェアは市販されており、これには、例えば、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などが包含される。本発明に係るポリヌクレオチド配列情報を分析する際に、精製された本発明に係るポリペプチドのＮ末端配列決定から得られたアミノ酸配列情報を使用してそのヌクレオチド配列分析の精度を向上させることも重要である。Nucleotide sequences obtained from gene library isolates specific for the polypeptides according to the invention are subjected to analysis in order to identify important regions of the polypeptide genes according to the invention. These important regions include open reading frames, promoter sequences, termination sequences and the like. The analysis of nucleotide sequence information is preferably performed on a computer. Software suitable for analyzing nucleotide sequences for critical regions is commercially available and includes, for example, DNASIS ™ (Pharmacia LKB Technology, Piscataway, NJ). When analyzing the polynucleotide sequence information according to the present invention, it is possible to improve the accuracy of the nucleotide sequence analysis using amino acid sequence information obtained from N-terminal sequencing of the purified polypeptide according to the present invention. is important.

本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列がベクター中に機能的に挿入される場合、組換え技術によって発現され得る。本明細書中において使用される場合、「機能的に挿入される」は、適切なオープンリーディングフレームおよび方向に従って発現ベクター中に挿入されることが意図される。   The polypeptide according to the present invention can be expressed by a recombinant technique when the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention is functionally inserted into a vector. As used herein, “functionally inserted” is intended to be inserted into an expression vector according to the appropriate open reading frame and orientation.

このように、本明細書を読んだ当業者は、本発明によって、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドだけでなく、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供されることを、容易に理解する。本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについては、本明細書中下記にて詳述する。本発明に係るポリペプチドの完全なオープンリーディングフレームを含む遺伝子構築物を作製する場合、好ましい出発物質は本発明に係るポリペプチドをコードするゲノムライブラリー単離物である。より好ましくは、上述した方法によって取得したポリヌクレオチドである。   Thus, a person skilled in the art who has read this specification can use not only a polypeptide having 2-epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond but also a polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention. You will also easily understand what is offered. The polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention is described in detail below in the present specification. When generating a genetic construct comprising a complete open reading frame of a polypeptide according to the invention, the preferred starting material is a genomic library isolate encoding the polypeptide according to the invention. More preferably, it is a polynucleotide obtained by the method described above.

典型的には、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターの下流に挿入され、それに停止コドンが続くが、所望であればハイブリッドタンパク質としての生産とそれに続く開裂が、使用され得る。一般的には、本発明に係るポリペプチドの生産収率を向上させる宿主細胞に特異的な配列が使用され、そして適切な制御配列（エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、およびリボソーム結合部位など）が発現ベクターに付加される。いったん適切なコード配列が単離されると、これは、種々の異なる発現系；例えば、細菌、酵母、バキュロウイルスまたは哺乳動物細胞を用いて発現され得る。本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。   Typically, a polynucleotide encoding a polypeptide according to the invention is inserted downstream of the promoter followed by a stop codon, but production as a hybrid protein and subsequent cleavage can be used if desired. . In general, sequences specific to the host cell that improve the production yield of the polypeptide according to the present invention are used, and appropriate control sequences (such as enhancer sequence, polyadenylation sequence, and ribosome binding site) are expressed. Added to the vector. Once the appropriate coding sequence is isolated, it can be expressed using a variety of different expression systems; for example, bacteria, yeast, baculovirus or mammalian cells. The polypeptide according to the present invention may be a polypeptide in which amino acids are peptide-bonded, but is not limited thereto, and may be a complex polypeptide including a structure other than the polypeptide.

また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。   The polypeptide according to the present invention may include an additional polypeptide. Examples of the additional polypeptide include epitope-tagged polypeptides such as His, Myc, and Flag.

例えば、本発明に係るポリペプチドは、天然の細菌からの抽出物、または本発明に係るポリペプチドを産生するように遺伝的に改変された形質転換体（例えば、原核生物細胞および真核生物細胞）から、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合し得る抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、容易に精製され得る。抗体アフィニティークロマトグラフィーの使用に加えて、本発明に係るポリペプチドおよび本発明に係るポリペプチド由来のポリペプチドは、他の広範な公知のタンパク質精製技術（例えば、硫安分画、溶媒沈殿、免疫沈降法、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、等電点沈殿、エレクトロフォーカシング、電気泳動法など）を単独または組み合わせて用いて精製され得る。   For example, a polypeptide according to the present invention may be an extract from a natural bacterium, or a transformant genetically modified to produce a polypeptide according to the present invention (eg, prokaryotic cells and eukaryotic cells). ), It can be easily purified by affinity chromatography using an antibody that can specifically bind to the polypeptide of the present invention. In addition to the use of antibody affinity chromatography, the polypeptides of the present invention and polypeptides derived from the polypeptides of the present invention can be used in a wide variety of other known protein purification techniques (eg, ammonium sulfate fractionation, solvent precipitation, immunoprecipitation). Method, gel filtration, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, isoelectric precipitation, electrofocusing, electrophoresis, etc.) alone or in combination.

精製の過程で単離された画分は、本発明に係るポリペプチド特異的抗体を用いたイムノアッセイ、または本発明に係るポリペプチド特異的バイオアッセイ（例えば、ラクトースまたはセロオリゴ糖を基質として用いる酵素反応およびその生成物の解析）を用いて分析されることによって、本発明に係るポリペプチドの存在を分析され得る。   The fraction isolated in the course of the purification is subjected to an immunoassay using the polypeptide-specific antibody according to the present invention or a polypeptide-specific bioassay according to the present invention (for example, an enzyme reaction using lactose or cellooligosaccharide as a substrate). And the analysis of the product thereof), the presence of the polypeptide according to the present invention can be analyzed.

本発明に係るポリペプチドに特異的な抗体は、適切な脊椎動物宿主（例えば、ウサギ）を、精製された本発明に係るポリペプチドを単独でまたは通常のアジュバントと組み合わせて免疫することによって産生される。普通、２つかそれ以上の免疫感作が含まれ、そして血液または脾臓が、最後の注射の数日後に採取される。ポリクローナル抗血清については、免疫グロブリンは、種々の標準的技法により、沈降、単離、および精製され得る。これには、アフィニティーカラム中のゲルまたはビーズのような固体表面に結合した本発明に係るポリペプチドを用いるアフィニティー精製が含まれる。モノクローナル抗体については、脾臓細胞が、通常、不死化リンパ球、例えば骨髄細胞株とハイブリドーマ形成のための選択的条件下で融合される。次いでハイブリドーマは、限定的希釈条件下でクローニングされ得、そしてそれらの上清が、所望の特異性を有する抗体についてスクリーニングされ得る。抗体を産生する技法は文献に公知であり、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＤ．Ｌａｎｅ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）」（本明細書中に参考として援用される）に例示される。   Antibodies specific for a polypeptide according to the invention are produced by immunizing a suitable vertebrate host (eg rabbit) with a purified polypeptide according to the invention alone or in combination with a conventional adjuvant. The Usually two or more immunizations are included, and blood or spleen is collected several days after the last injection. For polyclonal antisera, immunoglobulins can be precipitated, isolated, and purified by a variety of standard techniques. This includes affinity purification using a polypeptide according to the invention bound to a solid surface such as a gel or bead in an affinity column. For monoclonal antibodies, spleen cells are usually fused with immortalized lymphocytes, such as bone marrow cell lines, under selective conditions for hybridoma formation. The hybridomas can then be cloned under limiting dilution conditions and their supernatants can be screened for antibodies with the desired specificity. Techniques for producing antibodies are known in the literature and are described, for example, in “Antibodies: A Laboratory Manual, edited by E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratories Press, NY (1988)” (incorporated herein by reference). Exemplified).

このように、本明細書を読んだ当業者は、本発明によって、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドだけでなく、該ポリペプチドと特異的に結合する抗体もまた提供されることを、容易に理解する。本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体については、本明細書中下記にて詳述する。   Thus, those skilled in the art who have read the present specification, according to the present invention, not only have a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having a β-1,4 bond and a polynucleotide encoding the polypeptide, It will be readily appreciated that antibodies that specifically bind to the polypeptide are also provided. The antibody that specifically binds to the polypeptide of the present invention will be described in detail later in this specification.

本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、本発明に係るポリペプチドの有するβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を保持するポリペプチドが意図される。   As used herein with respect to proteins or polypeptides, the term “variant” refers to a polypeptide that retains 2-epimerase activity for oligosaccharides having β-1,4 linkages of the polypeptides according to the present invention. Intended.

本明細書中において使用される場合、変異体の一例としては、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１由来のＣＥのアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、欠失、逆位、転座、反復およびタイプ置換されたアミノ酸配列を含む変異体が挙げられる。   As used herein, examples of mutants include R.I. In the amino acid sequence of CE derived from albus NE1, there may be mentioned variants comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, added, deleted, inverted, translocated, repeated and type substituted.

ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変し得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。   It is well known in the art that some amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the polypeptide. Furthermore, it is also well known that there are variants in natural proteins that do not significantly alter the structure or function of the protein, not only artificially modified.

当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、ランダム変異によっても目的は達成される。さらに、本明細書中に記載される活性測定方法を用いれば、作製した変異体が所望のβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するか否かを容易に決定し得る。   One skilled in the art can readily mutate one or several amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide using well-known techniques. For example, according to a known point mutation introduction method, an arbitrary base of a polynucleotide encoding a polypeptide can be mutated. In addition, a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site of a polynucleotide encoding a polypeptide. Furthermore, the object can be achieved by random mutation. Furthermore, if the activity measurement method described in this specification is used, it can be easily determined whether the produced mutant has 2-epimerase activity with respect to an oligosaccharide having a desired β-1,4 bond. .

好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドのβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を変化させない。   Preferred variants have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions, or additions. Silent substitution, addition, and deletion are preferred, and conservative substitution is particularly preferred. These do not change the 2-epimerase activity for oligosaccharides having β-1,4 bonds of the polypeptides according to the invention.

代表的な保存性置換としては、疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシルアミノ酸ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド型アミノ酸ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性アミノ酸ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香属アミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換などが挙げられる。   Representative conservative substitutions include substitution of one amino acid for another in the hydrophobic amino acids Ala, Val, Leu, and Ile; exchange of the hydroxyl amino acids Ser and Thr, the acidic residues Asp and Glu Exchange, substitution between amide type amino acids Asn and Gln, exchange of basic amino acids Lys and Arg, substitution between aromatic amino acids Phe and Tyr, and the like.

本明細書中において使用される場合、変異体の他の例としては、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１由来のＣＥをコードする塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。   Other examples of variants as used herein include R.I. In the base sequence encoding CE derived from albus NE1, it is preferably encoded by a polynucleotide having a base sequence in which one or several bases are deleted, inserted, substituted or added.

本明細書中において使用される場合、変異体の別の例としては、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１由来のＣＥをコードする塩基配列の相補配列の１個もしくは数個の塩基が置換、付加、欠失もしくは挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。   As used herein, another example of a variant is R.I. A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence in which one or several bases of the base sequence encoding CE derived from albus NE1 have been substituted, added, deleted, or inserted Is preferably encoded by

ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第３版，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋとＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」（本明細書中に参考として援用される）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。   Hybridization is described in “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition, J. Sambrook and D. W. Russll, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (2001)” (incorporated herein by reference). It can be carried out by a known method such as a known method. Usually, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (harder to hybridize), and a more homologous polynucleotide can be obtained. The appropriate hybridization temperature varies depending on the base sequence and the length of the base sequence. For example, when a DNA fragment consisting of 18 bases encoding 6 amino acids is used as a probe, a temperature of 50 ° C. or lower is preferable.

本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。   As used herein, the term “stringent hybridization conditions” refers to hybridization solution (50% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate. (Containing pH 7.6), 5 × Denhart solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg / mL denatured sheared salmon sperm DNA) overnight at 42 ° C., then 0.1 × at about 65 ° C. It is intended to wash the filter in SSC. Depending on the polynucleotide that hybridizes to a “portion” of the polynucleotide, at least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt, and even more preferably about Polynucleotides (either DNA or RNA) that hybridize to polynucleotides longer than 30 nt are contemplated. Polynucleotides (oligonucleotides) that hybridize to “parts” of such polynucleotides are also useful as detection probes as discussed in more detail herein.

本明細書中において使用される場合、変異体の別の例としては、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１由来のＣＥをコードする塩基配列と少なくとも５０％同一、より好ましくは少なくとも５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７２％、７５％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％，９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。また、ＮＥ１株由来のＣＥとアミノ酸レベルで相同性を示す天然の配列は、最高でも５１％の相同性を示すに過ぎない。なお、この配列は、クロストリディウム ファイトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のＮ−アシルグルコサミン２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉタンパク質（登録番号Ｑ１ＦＫＶ５）である。   As used herein, another example of a variant is R.I. at least 50% identical to the nucleotide sequence encoding CE from albus NE1, more preferably at least 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, A polynucleotide comprising a base sequence that is 65%, 70%, 72%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical Is preferably encoded by In addition, a natural sequence showing homology at the amino acid level with CE derived from the NE1 strain shows only 51% homology at most. This sequence is N-acylglucosamine 2-epimerase (GlcNAc-2-epi protein (Registration No. Q1FKV5) derived from Clostridium phytofermentans.

例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一であるということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。   For example, the target base sequence encodes the polypeptide according to the present invention by “a polynucleotide comprising a base sequence at least 95% identical to the reference (QUERY) base sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention”. It is intended to be identical to the reference sequence, except that it may contain up to 5 mismatches per 100 nucleotides (bases) of the polynucleotide reference base sequence. In other words, up to 5% of the bases in the reference sequence can be deleted or replaced with another base to obtain a polynucleotide comprising a base sequence that is at least 95% identical to the reference base sequence, or Many bases up to 5% of the total bases in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. These discrepancies in the reference sequence are distributed either individually at the 5 ′ or 3 ′ end position of the reference base sequence or at the base in the reference sequence or in one or more adjacent groups within the reference sequence. Can occur anywhere between the end parts of

任意の特定の核酸分子が、例えば、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に対して、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７２％、７５％、８０％、８２％、８５％、９０％、９２％，９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ｔ．Ｆ．ＳｍｉｔｈとＭ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１） Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（本明細書中に参考として援用される））を用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す。最も相同性が高い（Ｂｅｓｔｆｉｔ）または任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。   Any particular nucleic acid molecule is, for example, at least 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56% relative to the base sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, 57%, 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 72%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% Alternatively, whether it is 99% identical or not is determined by a known computer program (for example, Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix (registered trademark), Genetics Computer Science Group, University 75) n, WI 53711) Bestfit is a Smith and Waterman local homology algorithm (TF Smith and MS Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2,482). )) Is used to find the best homologous segment between two sequences, using the best homology (Bestfit) or any other sequence alignment program, When determining whether a particular sequence is, for example, 95% identical to a reference sequence according to the invention, the percent identity is calculated over the entire length of the reference base sequence and the number of nucleotides in the reference sequence Parameters are set so that gaps in homology up to 5% of the total are allowed.

特定の実施形態では、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｄ．Ｌ．Ｂｒｕｔｌａｇら（１９９０）のアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６，２３７（本明細書中に参考として援用される））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ，ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１，Ｊｏｉｎｉｎｇ， Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０，Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１，Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５，Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５，Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）ＱＵＥＲＹ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。ＱＵＥＲＹ配列と比較して５’末端または３’末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致／整列していない、対象配列の５’および３’であるＱＵＥＲＹ配列の塩基数を、ＱＵＥＲＹ配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的で使用されるものである。ＱＵＥＲＹ配列と一致／整列していない対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従ってＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（整合していない５’末端および３’末端での塩基の数／ＱＵＥＲＹ配列中の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と比較される。この場合、その欠失は内部欠失であり、そのためＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、ＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端および３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。   In a particular embodiment, the identity (also referred to as global sequence alignment) between a reference (QUERY) sequence (sequence according to the invention) and a subject sequence is defined as L. Determined using the FASTDB computer program based on the algorithm of Brutlag et al. (1990) (Comp. Appl. Biosci. 6,237, incorporated herein by reference). To calculate% identity, preferred parameters used in FASTDB alignment of DNA sequences are: Matrix = Unity, k-tuple = 4, Mismatch Penalty = 1, Joining, Penalty = 30, Randomization Group Length = 0, Cutoff Score = 1, Gap Penalty = 5, Gap Size Penalty = 0.05, Window Size = 500, or the length of the target base sequence (whichever is shorter). According to this embodiment, if the subject sequence is shorter than the QUERY sequence (due to an internal deletion) due to a 5 ′ or 3 ′ deletion, the FASTDB program calculates the percent identity, Manual corrections are made to the results in view of the fact that 5 ′ and 3 ′ shortenings of the subject sequence are not considered. For subject sequences that are truncated at the 5 'end or 3' end relative to the QUERY sequence, the percent identity is the number of bases in the QUERY sequence that are 5 'and 3' of the subject sequence that are not matched / aligned Is calculated as a percentage of the total base of the QUERY sequence. The determination of whether a nucleotide is matched / aligned is determined by the result of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity calculated by the above FASTDB program using the specified parameters to arrive at a final percent identity score. This corrected score is used for the purpose of this embodiment. Only bases outside the 5 'and 3' bases of the subject sequence that do not match / align with the QUERY sequence are calculated for the purpose of manually adjusting the percent identity score, as shown in the FASTDB alignment. For example, a 90 base subject sequence is aligned with a 100 base QUERY sequence to determine percent identity. The deletion occurs at the 5 'end of the subject sequence, so the FASTDB alignment does not show a match / alignment of the first 10 bases at the 5' end. Ten unpaired bases represent 10% of the sequence (number of bases at unmatched 5 'and 3' ends / total number of bases in the QUERY sequence), so 10% is converted by the FASTDB program Subtracted from the calculated percent identity score. If the remaining 90 residues are perfectly matched, the final percent identity is 90%. In another example, a 90 residue subject sequence is compared to a 100 base QUERY sequence. In this case, the deletion is an internal deletion, so there is no base at the 5 'or 3' end of the subject sequence that is not aligned / aligned with the QUERY sequence. In this case, the percent identity calculated by FASTDB is not manually corrected. Again, only the 5 'and 3' terminal bases of the subject sequence that do not match / align with the QUERY sequence are manually corrected. No other manual correction is made for the purposes of this embodiment.

以上のように、本発明は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチドは、セロビオースに対する２−エピメラーゼ活性を有するが、ラクトースまたはセロビオース以外のセロオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性をも有する。このような性質を併せ持つ本発明に係るポリペプチドは、新規オリゴ糖の合成に非常に有用である。   As described above, the present invention provides a polypeptide having 2-epimerase activity for oligosaccharides having β-1,4 bonds. The polypeptide according to the present invention has 2-epimerase activity against cellobiose, but also has 2-epimerase activity against cellooligosaccharides other than lactose or cellobiose. The polypeptide according to the present invention having such properties is very useful for the synthesis of novel oligosaccharides.

なお、本発明に係るポリペプチドを用いてヘテロオリゴ糖を合成する方法は、特許文献４に記載されるような合成法と比較して、以下のような利点を有する：（１）１基質−１酵素の反応であるので、反応系が簡便かつ安価である；（２）反応副生物が無いため目的の生成物の精製が容易であり、大量生産に好適である；（３）非還元末端糖についての基質特異性が厳密ではないので、上述した合成法では合成し得ないヘテロオリゴ糖を合成することができる。   In addition, the method of synthesizing a hetero-oligosaccharide using the polypeptide according to the present invention has the following advantages compared with the synthesis method described in Patent Document 4: (1) 1 substrate-1 Since it is an enzymatic reaction, the reaction system is simple and inexpensive; (2) the reaction product is easy to purify because there is no reaction by-product, and it is suitable for mass production; (3) non-reducing end sugars Since the substrate specificity for is not strict, hetero-oligosaccharides that cannot be synthesized by the synthesis method described above can be synthesized.

〔１−２〕ポリヌクレオチド
上述したように、本発明はまた、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。[1-2] Polynucleotide As described above, the present invention also provides a polynucleotide encoding a polypeptide having 2-epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond.

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号２の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。   As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides. As used herein, the term “base sequence” is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence” and refers to the sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated A, G, C, and T). As shown. The “polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof” means a polynucleotide containing the sequence shown by each deoxynucleotide A, G, C and / or T of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof Is intended.

本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。   The polynucleotide according to the present invention may exist in the form of RNA (for example, mRNA) or in the form of DNA (for example, cDNA or genomic DNA). DNA can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or it can be the non-coding strand (also known as the antisense strand).

本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド、トリヌクレオチドといわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドはより長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。   As used herein, the term “oligonucleotide” is intended to be a combination of several to several tens of nucleotides, and is used interchangeably with “polynucleotide”. Oligonucleotides are represented by the number of nucleotides polymerized such that short ones are called dinucleotides and trinucleotides and long ones are 30-mers or 100-mers. Oligonucleotides may be generated as fragments of longer polynucleotides or may be chemically synthesized.

本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。   The polynucleotide according to the present invention can also be fused to the polynucleotide encoding the tag tag (tag sequence or marker sequence) described above on the 5 'or 3' side.

本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。   The polynucleotide according to the present invention may contain a sequence such as a sequence of an untranslated region or a vector sequence (including an expression vector sequence).

なお、本発明のＣＥの全塩基配列（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号１）にはそれぞれシグナル配列およびシグナルペプチドは存在しないので、ＣＥが菌体内酵素であることは明白である。但し、このことは、未だ未発見の分泌機構がＣＥに存在することを完全に否定するものではないことを付記しておく。   In addition, since the signal sequence and the signal peptide do not exist in the entire base sequence (SEQ ID NO: 2) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the CE of the present invention, it is clear that CE is an intracellular enzyme. However, it should be noted that this does not completely deny that an undiscovered secretory mechanism still exists in CE.

本発明の目的は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチド、およびβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法およびポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得されるβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチド、およびβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意すべきである。   An object of the present invention is to provide a polypeptide encoding a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having a β-1,4 bond and a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having a β-1,4 bond. The purpose is to provide nucleotides, not to the polypeptide production method and polynucleotide production method specifically described in the present specification. Therefore, a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having a β-1,4 bond and a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having a β-1,4 bond obtained by a method other than the above methods It should be noted that the polynucleotide coding for also belongs to the technical scope of the present invention.

〔２〕抗体
上述したように、本発明はまた、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるが、これらに限定されない。[2] Antibody As described above, the present invention also provides an antibody that specifically binds to a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having a β-1,4 bond. As used herein, the term “antibody” refers to immunoglobulins (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM and their Fab fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fc fragments), eg Examples include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, single chain antibodies, anti-idiotype antibodies, and humanized antibodies.

ペプチド抗体は、当該分野に周知の方法によって作製される。例えば、Ｍ．Ｃｈｏｗら、（１９８５） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，９１０、およびＦ．Ｊ．Ｂｉｔｔｌｅら、（１９８５） Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６，２３４７（これらはいずれも本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。   Peptide antibodies are produced by methods well known in the art. For example, M.M. Chow et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,910, and F.R. J. et al. Bittle et al. (1985) J. MoI. Gen. Virol. 66, 2347, both of which are incorporated herein by reference. In general, animals can be immunized with free peptide; however, anti-peptide antibody titers can be boosted by coupling the peptide to a macromolecular carrier such as keyhole limpet hemocyanin or tetanus toxoid. For example, peptides containing cysteine are coupled to a carrier using a linker such as m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, while other peptides are more commonly linked such as glutaraldehyde. Agents can be used to couple to the carrier. Animals such as rabbits, rats, and mice can be injected either intraperitoneally and / or intradermally with either free or carrier-coupled peptides, eg, emulsions containing about 100 μg of peptide or carrier protein and Freund's adjuvant. Immunized. To provide useful titers of anti-peptide antibodies that can be detected by an ELISA assay using, for example, free peptide adsorbed on a solid surface, for example, at intervals of about 2 weeks May be needed. The titer of anti-peptide antibodies in serum from immunized animals is increased by selection of anti-peptide antibodies, for example, adsorption to peptides on solid supports and elution of selected antibodies by methods well known in the art. obtain.

本明細書中で使用される場合、本発明に係る「抗体」は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｒ．Ｌ．Ｗａｈｌら、（１９８３） Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４，３１６（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。As used herein, an “antibody” according to the present invention is a complete antibody molecule and antibody fragment (eg, Fab and F (ab ′) 2 ) capable of specifically binding to a polypeptide according to the present invention. Fragment). Fab and F (ab ′) 2 fragments lack the Fc portion of the complete antibody, are removed more rapidly by circulation, and have little nonspecific tissue binding of the complete antibody (RL). Wahl et al. (1983) J. Nucl. Med. 24, 316 (incorporated herein by reference)). These fragments are therefore preferred.

さらに、本発明に係るポリペプチドのペプチド抗原と結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体に結合する能力が本発明に係るポリペプチド抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなる本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。   Furthermore, further antibodies that can bind to the peptide antigens of the polypeptides according to the invention can be produced in a two-step procedure through the use of anti-idiotypic antibodies. Such a method uses the fact that the antibody itself is an antigen, and thus it is possible to obtain an antibody that binds to a secondary antibody. According to this method, an antibody that specifically binds to a polypeptide according to the present invention is used to immunize an animal (preferably a mouse). The spleen cells of such animals are then used to produce hybridoma cells, and the hybridoma cells are capable of binding to an antibody that specifically binds to a polypeptide according to the present invention and have a polypeptide antigen according to the present invention. Are screened to identify clones producing antibodies that can be blocked by. Such antibodies include anti-idiotypic antibodies against antibodies that specifically bind to a polypeptide according to the present invention, and animals to induce the formation of antibodies that specifically bind to a polypeptide according to the present invention. Can be used to immunize.

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、本発明に係るポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。It is clear that Fab and F (ab ′) 2 and other fragments of the antibodies according to the invention can be used according to the methods disclosed herein. Such fragments are typically produced by proteolytic cleavage using enzymes such as papain (resulting in Fab fragments) or pepsin (resulting in F (ab ′) 2 fragments). Alternatively, polypeptide binding fragments according to the present invention can be produced by the application of recombinant DNA technology or by synthetic chemistry.

本発明に係る抗体は、キメラモノクローナル抗体であり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞由来の遺伝構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。既報については、Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，１２０２；Ｖ．Ｔ．Ｏｉら、（１９８６） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４，２１４；Ｓ．ＣａｂｉｌｌｙおよびＨ．Ｌ．Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍ．ＴａｎｉｇｕｃｈｉおよびＭ．Ｋｕｒｏｓａｗａ、ＥＰ １７１４９６；Ｓ．Ｌ．ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＬ．Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、ＥＰ １７３４９４；Ｍ．Ｓ．ＮｅｕｂｅｒｇｅｒおよびＴ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓ、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒ．Ｒ．ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＡ．Ｙ．Ｌｉｕ、ＷＯ ８７０２６７１；Ｇ．Ｌ．Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３１２，６４３；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ，３１４，２６８（これらはいずれも本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。   The antibody according to the present invention may be a chimeric monoclonal antibody. Such antibodies can be generated using genetic constructs derived from hybridoma cells that produce the monoclonal antibodies described above. Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. For previous reports, see S.A. L. Morrison, (1985) Science, 229, 1202; T.A. Oi et al. (1986) BioTechniques 4,214; Cabilly and H.C. L. Heyneker, US Pat. No. 4,816,567; Taniguchi and M.A. Kurosawa, EP 17196; L. Morrison and L.M. Herzenberg, EP 173494; S. Neuberger and T.W. H. Rabbits, WO 8601533; R. Robinson and A.M. Y. Liu, WO 8702671; L. Boulianne et al. (1984) Nature, 312, 643; S. See Neuberger et al. (1985) Nature, 314, 268, both of which are incorporated herein by reference.

このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明に係るポリペプチドを認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。Thus, it can be said that the antibody according to the present invention only needs to have at least an antibody fragment (for example, Fab and F (ab ′) 2 fragment) that recognizes the polypeptide according to the present invention. That is, it should be noted that an immunoglobulin comprising an antibody fragment that recognizes the polypeptide of the present invention and an Fc fragment of a different antibody molecule is also included in the present invention.

このように、本発明に係る抗体を用いれば、本発明に係るポリペプチドであるβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを容易に取得し得、アフィニティークロマトグラフィー等と組み合わせることにより、本発明に係るポリペプチドを生産することができる。すなわち、本発明は、上記抗体を用いるポリペプチドの生産方法、上記抗体を備えているポリペプチド生産用キットもまた提供し、ポリペプチドの生産方法およびポリペプチド生産用キットの具体的な態様を、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。   As described above, when the antibody according to the present invention is used, a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having a β-1,4 bond, which is a polypeptide according to the present invention, can be easily obtained. Etc., the polypeptide according to the present invention can be produced. That is, the present invention also provides a method for producing a polypeptide using the above-described antibody, a kit for producing a polypeptide comprising the above-described antibody, Those skilled in the art who have read this specification will readily understand.

〔３〕ベクター
本発明は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。[3] Vector The present invention provides a vector used for producing a polypeptide having 2-epimerase activity for oligosaccharide having β-1,4 linkage. The vector according to the present invention may be a vector used for in vitro translation or a vector used for recombinant expression.

本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。   The vector according to the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described polynucleotide according to the present invention. For example, a recombinant expression vector into which a cDNA of a polynucleotide encoding a polypeptide having 2-epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond is inserted. A method for producing a recombinant expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, phage, cosmid or the like.

ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。また、発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。   The specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide according to the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide according to the present invention are incorporated into various plasmids is used as an expression vector. Use it. In addition, transformation of a host with an expression vector can also be performed according to a conventional technique.

上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。   A host transformed with the above expression vector is cultured, cultivated or bred, and then subjected to conventional techniques (eg, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography) from the culture. Etc.), the target protein can be recovered and purified.

発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子などが挙げられる。   The expression vector preferably contains at least one selectable marker. Such markers include tetracycline resistance genes or ampicillin resistance genes for culture in Escherichia coli, Bacillus subtilis, and other bacteria.

上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。   A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. .

本発明に係るベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを発現させることができる。さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドを合成することができる。   If the vector according to the present invention is used, when the polynucleotide is introduced into an organism or cell, a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having a β-1,4 bond is expressed in the organism or cell. be able to. Furthermore, if the vector according to the present invention is used in a cell-free protein synthesis system, a polypeptide having 2-epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond can be synthesized.

このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。   Thus, it can be said that the vector according to the present invention should include at least a polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention. That is, it should be noted that vectors other than expression vectors are also included in the technical scope of the present invention.

このように、本発明に係るベクターを用いれば、本発明に係るポリペプチドを容易に生産することができる。すなわち、本発明は、上記ベクターを用いるポリペプチドの生産方法、上記ベクターを備えているポリペプチド生産用キットもまた提供し、ポリペプチドの生産方法およびポリペプチド生産用キットの具体的な態様を、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。   Thus, when the vector according to the present invention is used, the polypeptide according to the present invention can be easily produced. That is, the present invention also provides a method for producing a polypeptide using the vector, a kit for producing a polypeptide comprising the vector, and a specific embodiment of the method for producing a polypeptide and the kit for producing a polypeptide. Those skilled in the art who have read this specification will readily understand.

〔４〕形質転換体
本発明は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本発明に係る形質転換体を用いれば、本発明に係るポリペプチドを容易にかつ大量に生成することができる。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図されるが、細胞（特に、原核生物細胞、菌類（例えば、糸状菌など）であることが好ましい。[4] Transformant The present invention provides a transformant into which a polynucleotide encoding a polypeptide having 2-epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond is introduced. If the transformant which concerns on this invention is used, the polypeptide which concerns on this invention can be produced | generated easily and in large quantities. As used herein, the term “transformant” is intended to include not only cells, tissues or organs, but also individual organisms, although cells (particularly prokaryotic cells, fungi (eg, And filamentous fungi).

本発明に係る形質転換体は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドが発現されていることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドが安定的に発現することが好ましいが、一過性に発現していてもよい。   The transformant according to the present invention is characterized in that a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having a β-1,4 bond is expressed. The transformant according to the present invention preferably stably expresses a polypeptide having 2-epimerase activity for oligosaccharides having β-1,4 bonds, but may be transiently expressed.

一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドが発現され得るように生物中に導入することによって取得される。   In one embodiment, the transformant according to the present invention comprises a recombinant vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having β-1,4 linkage, It is obtained by introducing into a living organism so that a polypeptide having 2-epimerase activity against an oligosaccharide having a bond can be expressed.

このように、本発明に係る形質転換体を用いれば、本発明に係るポリペプチドを容易に生産することができる。すなわち、本発明は、上記形質転換体を用いるポリペプチドの生産方法、上記形質転換体を備えているポリペプチド生産用キットもまた提供し、ポリペプチドの生産方法およびポリペプチド生産用キットの具体的な態様を、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。   Thus, when the transformant according to the present invention is used, the polypeptide according to the present invention can be easily produced. That is, the present invention also provides a method for producing a polypeptide using the transformant, a kit for producing a polypeptide comprising the transformant, and a specific method for producing the polypeptide and a kit for producing the polypeptide. Those skilled in the art who have read this specification will readily understand these embodiments.

〔５〕ヘテロオリゴ糖を合成するためのキット、試薬組成物および方法
本発明は、ヘテロオリゴ糖を合成するためのキット、試薬組成物および方法を提供する。本発明を用いれば、Ｇｌｃ−Ｍａｎを従来法よりもはるかに簡便に合成することができるだけでなく、新規オリゴ糖を容易に取得することができる。[5] Kits, reagent compositions and methods for synthesizing hetero-oligosaccharides The present invention provides kits, reagent compositions and methods for synthesizing hetero-oligosaccharides. By using the present invention, it is possible not only to synthesize Glc-Man much more easily than conventional methods, but also to easily obtain new oligosaccharides.

本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成するためのキットは、本発明に係るポリペプチドを備えている。本発明に係るキットは、本発明に係るポリペプチド以外に、該ポリペプチドの酵素反応を促進するための試薬、または該酵素反応を適切に行うための試薬を一緒に備えていてもよく、これらの試薬は酵素反応に応じて適宜選択され得る。本発明に係るキットを適用する際に使用される炭素源としては、特に限定されないが、セロオリゴ糖（２糖、３糖、４糖、５糖、６糖など）およびラクトースが挙げられる。これらの炭素源を得るためのバルク資材としては、セロオリゴ糖については、セルロースを含む未利用資源または低利用資源（例えば、パルプなど）が挙げられるがこれらに限定されず、β−１，４結合多糖を含むヘミセルロースもまたバルク資材として挙げられる。また、ラクトースについては、バルク資材として、ウシ、ヤギやヒツジなどの生乳、粉ミルク、乳清（ホエイ）等が挙げられる。これらのバルク資材は、直接用いられても、分解酵素（例えば、セルラーゼおよびキシラナーゼなど）を添加して予め分解させておいてもよい。   The kit for synthesizing the hetero-oligosaccharide according to the present invention comprises the polypeptide according to the present invention. In addition to the polypeptide of the present invention, the kit of the present invention may be provided with a reagent for promoting the enzymatic reaction of the polypeptide or a reagent for appropriately performing the enzymatic reaction. These reagents can be appropriately selected depending on the enzyme reaction. Although it does not specifically limit as a carbon source used when applying the kit which concerns on this invention, Cellooligosaccharides (disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide, pentasaccharide, hexasaccharide, etc.) and lactose are mentioned. Bulk materials for obtaining these carbon sources include, for cello-oligosaccharides, unused resources including cellulose or low-utilized resources (for example, pulp), but are not limited to these, and β-1,4 bonds Hemicellulose containing polysaccharides is also mentioned as a bulk material. For lactose, examples of bulk materials include raw milk such as cows, goats and sheep, powdered milk, whey, and the like. These bulk materials may be used directly or may be decomposed in advance by adding a degrading enzyme (for example, cellulase or xylanase).

本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成するための試薬組成物は、本発明に係るポリペプチドを含む。本発明に係る試薬組成物は、本発明に係るポリペプチド以外に、上述した該ポリペプチドの酵素反応を促進するための試薬、または該酵素反応を適切に行うための試薬を一緒に含んでもよい。本発明に係る試薬組成物を適用する際に使用される炭素源としては、特に限定されないが、セロオリゴ糖（２糖、３糖、４糖、５糖、６糖など）およびラクトースが挙げられる。これらの炭素源を得るためのバルク資材としては、上述した通りである。   The reagent composition for synthesizing the hetero-oligosaccharide according to the present invention includes the polypeptide according to the present invention. The reagent composition according to the present invention may contain, in addition to the polypeptide according to the present invention, a reagent for promoting the enzyme reaction of the polypeptide described above or a reagent for appropriately performing the enzyme reaction. . Although it does not specifically limit as a carbon source used when applying the reagent composition which concerns on this invention, Cellooligosaccharides (disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide, pentasaccharide, hexasaccharide, etc.) and lactose are mentioned. Bulk materials for obtaining these carbon sources are as described above.

本発明に係るヘテロオリゴ糖を合成するための方法は、本発明に係るポリペプチドを用いる。一実施形態において、本発明に係る方法は、本発明に係るポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖とともにインキュベートする工程を包含する。上記オリゴ糖は、ラクトースまたはセロオリゴ糖であることが好ましい。本発明に係る方法を適用する際に使用される炭素源としては、特に限定されないが、セロオリゴ糖（２糖、３糖、４糖、５糖、６糖など）およびラクトースが挙げられる。これらの炭素源を得るためのバルク資材としては、上述した通りである。なお、ＨＰＬＣ、シリカゲル、活性炭カラムクロマトグラフィーなどを用いれば、合成したヘテロオリゴ糖を大量生産レベルで精製することができる。   The method for synthesizing the hetero-oligosaccharide according to the present invention uses the polypeptide according to the present invention. In one embodiment, the method according to the present invention comprises the step of incubating the polypeptide according to the present invention with an oligosaccharide having a β-1,4 bond. The oligosaccharide is preferably lactose or cellooligosaccharide. The carbon source used when applying the method according to the present invention is not particularly limited, and examples thereof include cellooligosaccharides (disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide, pentasaccharide, hexasaccharide, etc.) and lactose. Bulk materials for obtaining these carbon sources are as described above. If HPLC, silica gel, activated carbon column chromatography or the like is used, the synthesized hetero-oligosaccharide can be purified at a mass production level.

〔６〕機能性食品
「プレバイオティクス」は、Ｇ．Ｒ．ＧｉｂｓｏｎとＭ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ（１９９５）（Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５，１４０１）による定義では，「腸内フローラ（消化管内に生息している微生物群（主に嫌気性菌））のバランスを改善することによって宿主の健康に好影響を与える、食品。」とされており、本明細書中で使用される場合、「動物（ヒトを含む）の腸内環境において有用な微生物（例えば、乳酸菌、ビフィズス菌などのプロバイオティクス）を増殖させて、腸内環境の改善を促進する物質」が意図され、有用微生物増殖因子ともいう。代表的なプレバイオティクスとしては、オリゴ糖などの難消化性物質、プロピオン酸菌による乳清発酵物、および食物繊維などが挙げられ、オリゴ糖は、プロバイオティクスのエサとなり、食物繊維は腸内細菌を貯留させてその増殖を補助する。[6] Functional food “Prebiotics” R. Gibson and M.C. B. According to the definition of RobertFroid (1995) (J. Nutr. 125, 1401), “intestinal flora (organisms inhabiting the digestive tract (mainly anaerobic bacteria)) is improved by improving the balance of the host. Foods that have a positive effect ”and as used herein,“ probiotics such as lactic acid bacteria, bifidobacteria, etc. useful in the intestinal environment of animals (including humans) ) Is intended to promote the improvement of the intestinal environment "and is also referred to as a useful microbial growth factor. Typical prebiotics include indigestible substances such as oligosaccharides, whey fermented products from propionic acid bacteria, and dietary fiber. Oligosaccharide serves as food for probiotics, and dietary fiber is used as an intestine. Storing internal bacteria to assist its growth.

プレバイオティクスの効果としては、ミネラル分吸収促進効果、血中コレステロールや中性脂肪値の抑制、動脈硬化の予防、血糖値の抑制、糖尿病の改善、肥満の改善、腸の運動の活性化、便秘の改善、免疫能の活性化、感染症の予防、癌の予防、血中アンモニア値の抑制、肝機能低下による肝性脳症の改善、腸内細菌によるビタミン類合成の促進、各種ミネラルの吸収の促進、潰瘍性大腸炎の症状の改善などが挙げられるが、これらに限定されない。また、プレバイオティクスの摂取によってミネラル（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋など）の吸収が改善されることが、最近の研究によって明らかにされており、特にＣａ２＋の吸収促進効果が注目されている。オリゴ糖は、ミネラル分吸収促進効果を有する場合がある。この作用機序は、オリゴ糖が小腸または大腸の内面の細胞と細胞との間の細胞相互結合組織の隙間（いわゆる、タイトジャンクション（ＴＪ））を広げることによって各種ミネラルの吸収が促進されるためであると考えられている。The effects of prebiotics include mineral absorption promotion effect, suppression of blood cholesterol and neutral fat level, prevention of arteriosclerosis, suppression of blood glucose level, improvement of diabetes, improvement of obesity, activation of intestinal motility, Improvement of constipation, activation of immunity, prevention of infectious diseases, prevention of cancer, suppression of blood ammonia level, improvement of hepatic encephalopathy due to decreased liver function, promotion of vitamin synthesis by enteric bacteria, absorption of various minerals And the like, but are not limited to these. Moreover, it has been clarified by recent studies that absorption of minerals (for example, Ca 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ , Fe 3+, etc.) is improved by ingestion of prebiotics, in particular, promotion of absorption of Ca 2+ . The effect is drawing attention. An oligosaccharide may have a mineral absorption promoting effect. The mechanism of action is that oligosaccharides promote the absorption of various minerals by widening the intercellular tissue gap (so-called tight junction (TJ)) between cells inside the small or large intestine. It is considered to be.

以下の実施例に示すように、本発明に係るポリペプチドを用いてβ−１，４結合を有するラクトースから合成したヘテロオリゴ糖であるエピラクトースを合成する方法を用いればプレバイオティクスとしての機能性食品が提供され得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。   As shown in the following examples, if a method of synthesizing epilactose, which is a hetero-oligosaccharide synthesized from lactose having a β-1,4 bond, using the polypeptide according to the present invention, functionality as prebiotics is used. Those of ordinary skill in the art who have read this specification will readily appreciate that food can be provided.

例えば、実施例５に示されるように、ビフィズス菌は、エピラクトースを資化することができる（表６）。また、実施例９に示されるように、エピラクトースはラットの盲腸内ビフィズス菌の増殖を促進させ、ｐＨの低下（表９）と盲腸内の短鎖脂肪酸量と有機酸量を増加させることができるので(表１０)、腸内環境を改善することができ、腸内環境改善用機能性食品として利用することができる。   For example, as shown in Example 5, Bifidobacteria can assimilate epilactose (Table 6). In addition, as shown in Example 9, epilactose promotes the growth of rat cecal bifidobacteria and can decrease pH (Table 9) and increase the amount of short-chain fatty acids and organic acids in the cecum. Since it can (Table 10), intestinal environment can be improved and it can utilize as a functional food for intestinal environment improvement.

また、実施例７と８に示されるように、エピラクトースはミネラル吸収能促進能を有しており（図８、９と１０）、従ってミネラル吸収能促進剤又はミネラル吸収促進用機能性食品として利用することができる。   Moreover, as shown in Examples 7 and 8, epilactose has the ability to promote mineral absorption (FIGS. 8, 9 and 10), and therefore as a mineral absorption promoter or a functional food for promoting mineral absorption. Can be used.

さらに、実施例９に示されるように、エピラクトースは盲腸内容物を増加させるので（表９）、便秘改善剤として利用することができる。   Furthermore, as shown in Example 9, epilactose increases the content of the cecum (Table 9) and can therefore be used as an agent for improving constipation.

さらに、実施例１０に示されるように、エピラクトースは血中コレステロール量を減少させることができ（図１１と１２）、従って脂質代謝改善剤又は脂質代謝改善用機能性食品として利用することができる。   Furthermore, as shown in Example 10, epilactose can reduce blood cholesterol levels (FIGS. 11 and 12), and thus can be used as a lipid metabolism improving agent or a functional food for improving lipid metabolism. .

また、エピラクトースは胃や腸で消化吸収されにくく(表７)、低カロリーであると共に、実施例１１に示されるように、摂食後の血糖値の上昇も見られないことから（図１３）、血糖値の上昇を避ける必要のある糖尿病患者用機能性食品として利用することができる。   In addition, epilactose is difficult to digest and absorb in the stomach and intestine (Table 7), is low in calories, and, as shown in Example 11, there is no increase in blood glucose level after eating (FIG. 13). It can be used as a functional food for diabetics who need to avoid an increase in blood sugar level.

また、エピラクトースは甘味が弱いので、低カロリー性低甘味剤として利用することができる。   Moreover, since epilactose has a weak sweetness, it can be used as a low calorie low sweetener.

すなわち、本発明は機能性食品およびその製造方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る機能性食品は、β−１，４結合を有するオリゴ糖であるエピラクトースを含んでいることを特徴としており、ビフィズス菌の成長促進剤、便秘改善剤、脂質代謝改善剤、低カロリー性食品またはミネラル吸収能促進剤であることが好ましい。なお、本発明に係る機能性食品は、エピラクトース以外のさらなる機能性物質を含んでもよい。   That is, the present invention provides a functional food and a method for producing the same. In one embodiment, the functional food according to the present invention contains epilactose, which is an oligosaccharide having β-1,4 bonds, and is characterized by a bifidobacteria growth promoter, constipation improving agent, lipid It is preferably a metabolism improving agent, a low calorie food or a mineral absorption promoter. In addition, the functional food which concerns on this invention may contain the further functional substance other than epilactose.

他の実施形態において、本発明に係る機能性食品は、β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを用いて生産される化合物を含んでいることを特徴としている。   In another embodiment, the functional food according to the present invention is characterized by containing a compound produced using a polypeptide having epimerase activity for oligosaccharides having β-1,4 bonds.

本実施形態に係る機能性食品を製造するためには、上記のポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖と反応させ、反応産物を食品に添加すればよい。例えば、上記のポリペプチドをラクトースと反応させることでエピラクトースを反応産物として製造することができるが、この反応産物は前述の通り、腸内環境改善作用、ミネラル吸収能促進作用、脂質代謝改善作用、低カロリー性、さらには血糖値の上昇をもたらさない等の機能を有していることから、前記反応産物を他の食品に添加することで、前記反応産物が有する機能が付加された機能性食品を製造することができる。さらに反応産物であるエピラクトースは、スクロースより低甘味であるので、甘みを抑えつつ、低カロリーの飲食品を製造するための低カロリー性低甘味料として利用することができる。   In order to produce the functional food according to this embodiment, the above-described polypeptide may be reacted with an oligosaccharide having a β-1,4 bond, and the reaction product may be added to the food. For example, epilactose can be produced as a reaction product by reacting the above-mentioned polypeptide with lactose. As described above, this reaction product can improve the intestinal environment, promote mineral absorption, and improve lipid metabolism. Since it has functions such as low caloricity, and also does not cause an increase in blood sugar level, the function of the reaction product is added by adding the reaction product to other foods. Food can be produced. Furthermore, since epilactose, which is a reaction product, has a lower sweetness than sucrose, it can be used as a low-caloric low-sweetener for producing low-calorie foods and drinks while suppressing sweetness.

反応産物であるエピラクトースは、ラクトースを含む天然原料である乳、特にウシ、ヤギあるいはヒツジなどの家畜乳を生乳のまま、あるいは脱脂してから、上記のポリペプチドと反応させることで製造することができる。また、家畜乳から回収されるホエイ（乳精）画分や、低脂肪乳、低タンパク乳、脱脂・脱タンパク乳あるいは低乳糖乳などの加工乳を上記のポリペプチドと反応させることでも、エピラクトースを製造することができる。   Epilactose, the reaction product, is produced by reacting milk, which is a natural raw material containing lactose, especially livestock milk such as cows, goats or sheep, as raw milk or after defatting, with the above-mentioned polypeptide. Can do. It is also possible to react whey (milk) fraction collected from livestock milk or processed milk such as low fat milk, low protein milk, non-fat / deproteinized milk or low lactose milk with the above polypeptide. Lactose can be produced.

なお、本発明は、プロバイオティクスとプレバイオティクスとを組み合わせたシンバイオティクスおよびその製造方法として提供されてもよい。   In addition, this invention may be provided as a synbiotic which combined probiotic and prebiotic, and its manufacturing method.

以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、請求項および上記実施形態に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the present invention is not limited to these examples, and various modifications are possible within the scope shown in the claims and the above embodiments. Embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments are also included in the technical scope of the present invention.

〔実施例１：ＮＥ１株の分離法と菌学的性質〕
［１．菌株の分離法］
カニューレ付きの牛からルーメン内容物を採取し、嫌気性希釈液（Ｍ．Ｐ．ＢｒｙａｎｔとＬ．Ａ．Ｂｕｒｋｅｙ（１９５３） Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．３６，２０５）を用いて１０５倍に希釈した。希釈液をイノキュラムとしＲＧＣＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に記載））培地のロールチューブを作製した。ロールチューブ内寒天表層に出現したコロニーをＲＭ−濾紙培地に接種し、濾紙を崩壊させた株を選択した。ＲＭ培地の組成を表１に示した。[Example 1: Separation method and mycological properties of NE1 strain]
[1. Method for separating strains]
The rumen contents were collected from conditioned bovine cannula was diluted 10 5 fold with an anaerobic diluent (M.P.Bryant and L.A.Burkey (1953) J.Dairy Sci.36,205). A roll tube of RGCA (described in American Type Culture Collection (ATCC)) medium was prepared using the diluted solution as an inoculum. A colony that appeared on the surface of the agar in the roll tube was inoculated into the RM-filter paper medium, and a strain that disrupted the filter paper was selected. The composition of the RM medium is shown in Table 1.

［２．ＣＥ活性測定］
定性的測定法として、共存すると考えられるβ−グルコシダーゼ活性を阻害する目的で、Ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．８）１０μＬ、１００ｍＭ セロビオース５μＬ、酵素液１０μＬ）を精製過程に用いた。３０℃で反応させ、酵素活性の強弱によって反応時間を調整し、５分間煮沸することにより反応を停止させた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて反応生成物を同定した。反応液２．５μＬを０．５ｍｍ厚ガラスプレートＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ）にスポットした後、展開液［２−プロパノール／１−ブタノール／Ｈ２Ｏ＝７：１：２、ｖ／ｖ］で展開した。乾燥後、ｐ−アニスアルデヒド溶液を噴霧し、ホットプレートまたはオーブンで加熱して発色させた。[2. CE activity measurement]
As a qualitative measurement method, Tris buffer solution (100 mM Tris-maleic acid buffer solution (pH 7.8) 10 μL, 100 mM cellobiose 5 μL, enzyme solution 10 μL) was used in the purification process for the purpose of inhibiting the β-glucosidase activity considered to coexist. Using. The reaction was performed at 30 ° C., the reaction time was adjusted depending on the strength of the enzyme activity, and the reaction was stopped by boiling for 5 minutes. The reaction product was identified using thin layer chromatography (TLC). After spotting 2.5 μL of the reaction solution on a 0.5 mm thick glass plate Silica gel 60F 254 (Merck), with a developing solution [2-propanol / 1-butanol / H 2 O = 7: 1: 2, v / v]. Expanded. After drying, the p-anisaldehyde solution was sprayed and heated in a hot plate or oven for color development.

定量的測定法を、以下の方法に従って行った。反応液の組成を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３．２ｍＬ、１００ｍＭ ラクトースを６．２ｍＬ（２１２ｍｇ）、酵素液１．６ｍＬ（１０．９μｇ）とし、３０℃で２０分間または４０分間反応させた。サンプルを５分間煮沸することによって反応を停止させた後、イオン交換樹脂（ＡＧ５０１−Ｘ８レジン、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムに供し、遠心分離により非吸着性画分を得た。このうちの１０μＬを高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０ （Ｓｈｏｄｅｘ）、溶離液：水、流速：０．６ｍＬ／分、カラム温度：８０℃、検出器：気化光散乱検出器（オルテック））に供し、おおよそ１７分の保持時間で溶出されるエピラクトースに由来するピークの面積から反応液中のエピラクトース濃度を計算した。検量線は試薬のエピラクトース（Ｓｉｇｍａ）を用いて作成した。酵素反応速度は、反応が直線的に進行する反応開始２０分後から４０分後の間に生成するエピラクトースにより計算し、１分間に１μｍｏｌのエピラクトースを生成する反応速度を１ユニット（Ｕ）と定義した。酵素の比活性は牛血清アルブミンを標準タンパク質として計算し、Ｕ／ｍｇとして表示した。   The quantitative measurement method was performed according to the following method. The composition of the reaction solution was 3.2 mL of 100 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0), 6.2 mL (212 mg) of 100 mM lactose, and 1.6 mL (10.9 μg) of enzyme solution, and at 30 ° C. for 20 minutes or The reaction was carried out for 40 minutes. After stopping the reaction by boiling the sample for 5 minutes, it was applied to an ion exchange resin (AG501-X8 resin, Bio-Rad) column, and a non-adsorbing fraction was obtained by centrifugation. 10 μL of this was subjected to high performance liquid chromatography (column: Shodex Sugar SP0810 (Shodex), eluent: water, flow rate: 0.6 mL / min, column temperature: 80 ° C., detector: vaporized light scattering detector (Oltech)) The concentration of epilactose in the reaction solution was calculated from the area of the peak derived from epilactose eluted with a retention time of approximately 17 minutes. A calibration curve was prepared using the reagent epilactose (Sigma). The enzyme reaction rate is calculated by epilactose generated between 20 minutes and 40 minutes after the start of the reaction in which the reaction proceeds linearly, and the reaction rate for generating 1 μmol of epilactose per minute is 1 unit (U). It was defined as The specific activity of the enzyme was calculated using bovine serum albumin as a standard protein and expressed as U / mg.

［３．ＮＥ１株の菌学的性質］
得られた分離菌の中で、高いＣＥ活性を有する菌を選択しＮＥ１株と命名した。本菌は絶対嫌気性菌であり、生育条件により、単独、二連鎖または短連鎖で存在し、球状または卵形（０．３〜１．５×０．７〜１．８μｍ）であった。また、本菌は、グラム陽性であり、セルロース、セロビオース、キシラン、ラクトース、グルコースを資化した。[3. Mycological properties of NE1 strain]
Among the isolates obtained, a bacterium having high CE activity was selected and named NE1 strain. This bacterium was an anaerobic bacterium, and was present alone or in a double or short chain depending on the growth conditions, and was spherical or oval (0.3 to 1.5 × 0.7 to 1.8 μm). Moreover, this bacterium was Gram positive and assimilated cellulose, cellobiose, xylan, lactose, and glucose.

［４．ＮＥ１株染色体ＤＮＡの調製］
ＲＭ−Ｃ培地を用いてＲ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１を培養した後、遠心分離により培養上清を除去した。得られた沈殿を５．６７ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１ｍＭ ＥＤＴＡ含有）（ＴＥ）に懸濁し、０．３ｍＬの１０％ ＳＤＳと９μＬの２０ｍｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ（ＴａＫａＲａ）を添加し、混合した後に３７℃で１時間保温した。反応液に１．２５ｍＬの４Ｍ ＮａＣｌを添加して穏やかに混合し、塩濃度を０．７Ｍに調製した後、０．８ｍＬの１０％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）／０．７Ｍ ＮａＣｌを添加して６５℃で１０分間保温した。８ｍＬのクロロホルムを加え、室温で３０分間かけてゆっくり混合した。６，０００ｒｐｍで２０分間、室温による遠心分離によって水層、中間層、フェノール層に分け、水層を回収した。回収した水層に等量のフェノール／クロロホルムを加え、室温でゆっくりと混合した。再び、６，０００ｒｐｍで２０分間、室温による遠心分離によって水層、中間層、フェノール層に分け、水層を回収した。回収した水層に等量の２−プロパノールを加えてゆっくりと混合し、染色体ＤＮＡを沈殿させた。沈殿を回収し、７０％エタノールでリンスした後、４℃で１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心した。得られた染色体ＤＮＡを、適量のＴＥに溶解し、−２０℃で保存した。[4. Preparation of NE1 strain chromosomal DNA]
Using RM-C medium After culturing albus NE1, the culture supernatant was removed by centrifugation. The resulting precipitate was suspended in 5.67 mL of 10 mM Tris-HCl (containing 1 mM EDTA) (TE), 0.3 mL of 10% SDS and 9 μL of 20 mg / mL proteinase K (TaKaRa) were added and mixed. Incubated at 37 ° C. for 1 hour. Add 1.25 mL of 4M NaCl to the reaction mixture and mix gently to adjust the salt concentration to 0.7M, then add 0.8 mL of 10% cetyltrimethylammonium bromide / 0.7M NaCl. And kept at 65 ° C. for 10 minutes. 8 mL of chloroform was added and mixed slowly at room temperature for 30 minutes. The aqueous layer was recovered by dividing into an aqueous layer, an intermediate layer and a phenol layer by centrifugation at 6,000 rpm for 20 minutes at room temperature. An equal amount of phenol / chloroform was added to the recovered aqueous layer and mixed slowly at room temperature. Again, it was separated into an aqueous layer, an intermediate layer and a phenol layer by centrifugation at 6,000 rpm for 20 minutes at room temperature, and the aqueous layer was recovered. An equal amount of 2-propanol was added to the collected aqueous layer and mixed slowly to precipitate chromosomal DNA. The precipitate was collected, rinsed with 70% ethanol, and then centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. The obtained chromosomal DNA was dissolved in an appropriate amount of TE and stored at -20 ° C.

［５．ＮＥ１株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の決定］
上述の染色体ＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして用い、２７ｆプライマーおよび１４９２ｒプライマーを用いて１６Ｓ ｒＤＮＡをコードする領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲを、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅを用いて行い、ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑを使用した。増幅断片をアガロースゲル電気泳動によって分離後ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。精製断片をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した。これをアンピシリン濃度が５０μｇ／ｍＬのＬＢ寒天培地に塗布し、シングルコロニーを形成させた。形成したコロニーを拾い、アンピシリン濃度が５０μｇ／ｍＬのＬＢ液体培地で培養した。培養液を遠心により集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いプラスミドの回収を行なった。調製したプラスミドをテンプレートとし、ＤＴＣＳ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｍｉｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてシーケンス反応を行い、シーケンス解析にはＣＥＱ８０００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した。反応溶液の組成はマニュアルに従い、反応時間および温度は、目的断片のサイズあるいは反応に用いたプライマーに応じて決定した。なおシーケンス反応およびＰＣＲに使用したプライマー（配列番号５〜１１）の一覧を表２に示した。得られた１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列が配列番号３である。配列番号３に示した塩基配列は、標準菌株（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）Ｒ．ａｌｂｕｓ ＡＴＣＣ２７２１０のものと９９％の相同性を示した。上述の菌学的性質に鑑みて、ＮＥ１株はＲ．ａｌｂｕｓであると同定された。[5. Determination of 16S rDNA sequence of NE1 strain]
Using the chromosomal DNA described above as the template DNA, the region encoding 16S rDNA was PCR amplified using 27f primer and 1492r primer. PCR was performed using TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice, and TaKaRa EX Taq was used as the DNA polymerase. The amplified fragments were separated by agarose gel electrophoresis and then purified by GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit (Amersham Biosciences). The purified fragment was ligated to pGEM-T easy (Promega), and E. coli XL1-Blue was transformed. This was applied to an LB agar medium with an ampicillin concentration of 50 μg / mL to form a single colony. The formed colonies were picked and cultured in an LB liquid medium having an ampicillin concentration of 50 μg / mL. The culture solution was collected by centrifugation, and the plasmid was collected using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Using the prepared plasmid as a template, a sequence reaction was performed using DTCS Quick Start Mix (Beckman Coulter), and CEQ8000 (Beckman Coulter) was used for sequence analysis. The composition of the reaction solution was in accordance with the manual, and the reaction time and temperature were determined according to the size of the target fragment or the primer used in the reaction. Table 2 shows a list of primers (SEQ ID NOs: 5 to 11) used for the sequence reaction and PCR. The base sequence of the obtained 16S rRNA is SEQ ID NO: 3. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a standard strain R. pneumoniae. 99% homology with that of albus ATCC27210. In view of the above bacteriological properties, the NE1 strain is R.P. identified as albus.

〔実施例２：Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１のＣＥの調製〕
［１．培養方法］
実施例１にて得られたＲ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１株を使用した。前培養用液体培地としてＲＭ培地に１％セロビオースを添加した。ＡＴＣＣマニュアルに記載されているＲＧＣＡ培地を改良したＲＧＣ培地、Ｔｙｌｅｒら（非特許文献１）が報告した培地なども使用可能であるが、我々の培地はより簡便に調製し得る。
前培養の場合、加圧培養試験管（三紳工業）に上述の培地２０ｍＬを入れ、嫌気性菌培養装置ＡＧ−２（三紳工業）を用いて試験管内を二酸化炭素ガスで置換した後、滅菌した。凍結保存状態にある菌体を氷上で融解した後、１ｍＬを接種し、３５℃で２４時間静置培養した。[Example 2: R.I. Preparation of CE of albus NE1]
[1. Culture method]
R. obtained in Example 1 The albus NE1 strain was used. As a preculture medium, 1% cellobiose was added to the RM medium. An RGC medium modified from the RGCA medium described in the ATCC manual, a medium reported by Tyler et al. (Non-patent Document 1), and the like can be used, but our medium can be prepared more easily.
In the case of pre-culture, after putting 20 mL of the above-mentioned medium into a pressure culture test tube (San Gen Industrial) and substituting the inside of the test tube with carbon dioxide gas using an anaerobic bacteria culture apparatus AG-2 (San Gen Industrial) Sterilized. After thawing the cells in a cryopreserved state on ice, 1 mL was inoculated and cultured at 35 ° C. for 24 hours.

本培養の場合、１Ｌまたは５００ｍＬの広口メジュームビン（ＩＷＡＫＩ）にそれぞれ７５０ｍＬ、３７５ｍＬの上述の培地を入れ、嫌気性菌培養装置ＡＧ−２を用いてメジュームビン内を二酸化炭素ガスで置換した後、滅菌した。本培地にそれぞれ２０ｍＬ、１０ｍＬの前培養液を接種し、３５℃で１週間静置培養した。なお、接種する際も嫌気性菌培養装置ＡＧ−２により、二酸化炭素置換を行った。通常、炭素源としては、セロビオースまたは濾紙を適宜用いればＣＥが効率よく菌体内に発現される。前培養で得られた培養液を、加圧培養試験管に入れたまま−８０℃で保存した。   In the case of the main culture, after putting 750 mL and 375 mL of the above-mentioned medium into 1 L or 500 mL wide mouthed medium bin (IWAKI), respectively, and replacing the inside of medium bottle with carbon dioxide gas using anaerobic bacteria culture device AG-2, Sterilized. This medium was inoculated with 20 mL and 10 mL of the preculture solution, respectively, and statically cultured at 35 ° C. for 1 week. In addition, carbon dioxide substitution was performed with the anaerobic bacteria culture apparatus AG-2 when inoculating. Usually, CE is efficiently expressed in bacterial cells if cellobiose or filter paper is appropriately used as the carbon source. The culture solution obtained by the pre-culture was stored at −80 ° C. while being put in a pressure culture test tube.

［２：粗酵素液の調製］
上述の培地を用いてＲ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１を１週間培養した後、遠心分離により菌体を回収した。１５ｍＬの１ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフロリド（ＰＭＳＦ）を含む緩衝液Ａ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）に懸濁後，フレンチプレスにより菌体を破砕した。菌体破砕後、１２，０００ｒｐｍにて３０分間の遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液とした。得られた培養上清に７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、一晩穏やかに撹拌した後、１２，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離した。得られた沈殿を、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）に懸濁した後、緩衝液Ａで透析したものを粗酵素液とした。なお、培養後の操作を全て４℃で行った。[2: Preparation of crude enzyme solution]
Using the medium described above, R.I. After culturing albus NE1 for 1 week, the cells were collected by centrifugation. After suspending in 15 mL of buffer A (100 mM Tris-maleic acid (pH 7.0), 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol) containing 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), the cells were disrupted by a French press. After disrupting the cells, centrifugation was performed at 12,000 rpm for 30 minutes, and the resulting supernatant was used as a crude enzyme solution. Ammonium sulfate was added to the obtained culture supernatant so as to be 70% saturation, and after gently stirring overnight, the mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes. The obtained precipitate was suspended in buffer A (20 mM MES (pH 6.0), 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol) containing 1 mM PMSF, and dialyzed against buffer A to obtain a crude enzyme solution. All operations after culturing were performed at 4 ° C.

［３．ＣＥの精製］
（１）陰イオン交換クロマトグラフィー
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる場合、サンプルを緩衝液Ａで透析した後、予め同緩衝液で平衡化した担体に供した。ＮａＣｌ濃度を０Ｍから０．６Ｍへ増加させる直線濃度勾配によって溶出を行い、４ｍＬずつ１００画分を回収した。[3. Purification of CE]
(1) Anion exchange chromatography When using DEAE Sepharose CL-6B (Amersham Biosciences), the sample was dialyzed against buffer A and then applied to a carrier equilibrated in advance with the same buffer. Elution was performed with a linear concentration gradient in which the NaCl concentration was increased from 0 M to 0.6 M, and 100 fractions were collected in 4 mL portions.

ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる場合は、ＦＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、上記と同様の操作を行った。ただし、ＮａＣｌ濃度を０Ｍから０．５Ｍへ増加させる直線濃度勾配によって溶出を行い、０．５ｍＬずつ１００画分を回収した（流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ）。   When RESOURCE Q (Amersham Biosciences) was used, FPLC System (Amersham Biosciences) was used and the same operation as described above was performed. However, elution was performed with a linear concentration gradient increasing the NaCl concentration from 0 M to 0.5 M, and 100 fractions were collected in 0.5 mL increments (flow rate: 0.5 mL / min).

（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）で得られた活性画分に硫酸アンモニウムを加えて５０％飽和とした後、ＦＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＲＥＳＯＵＲＳＥ ＥＴＨ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。担体を、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０％飽和硫酸アンモニウム）で予め平衡化しておいた。硫酸アンモニウム濃度を５０％飽和から０％飽和へ減少させる直線濃度勾配によって溶出を行い、１．５ｍＬずつ１００画分を回収した（流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ）。溶出画分を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩した後、活性測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。(2) Hydrophobic interaction chromatography Ammonium sulfate was added to the active fraction obtained by anion exchange chromatography (DEAE-Sepharose) to bring it to 50% saturation, and then it was subjected to RESOURSE ETH (Amersham Biosciences) using FPLC System. Provided. The carrier was pre-equilibrated with buffer B (20 mM MES (pH 6.0), 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol (DTT), 50% saturated ammonium sulfate). Elution was performed with a linear concentration gradient that decreased the ammonium sulfate concentration from 50% saturation to 0% saturation, and 100 fractions were collected in 1.5 mL portions (flow rate: 1.5 mL / min). The elution fraction was desalted using Microcon (Millipore) and then subjected to activity measurement and SDS-PAGE.

（３）吸着クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィーで得られた活性画分を緩衝液Ｃ（５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）で透析した後、同緩衝液で予め平衡化しておいたヒドロキシアパタイト（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ；和光純薬工業）に供した。吸着後の洗浄を、緩衝液Ｄ（５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５Ｍ ＫＣｌ）を用いて行った。リン酸濃度を５ｍＭから２００ｍＭへ増加させる直線濃度勾配によって溶出を行い、４ｍＬずつ１００画分を回収した。(3) Adsorption chromatography The active fraction obtained by hydrophobic interaction chromatography was dialyzed against buffer C (5 mM phosphate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol), It was subjected to hydroxyapatite (Hydroxyapatite; Wako Pure Chemical Industries) that had been equilibrated in advance with a buffer solution. Washing after adsorption was performed using buffer D (5 mM phosphate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5 M KCl). Elution was performed with a linear concentration gradient in which the phosphate concentration was increased from 5 mM to 200 mM, and 100 fractions were collected in 4 mL portions.

（４）ゲルろ過クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ）で得られた活性画分４．５ｍＬを０．９ｍＬずつ５つに分画した。各画分を、ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍを用いて、緩衝液Ｅ（２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ６．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１Ｍ ＮａＣｌ）で予め平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。同緩衝液にて溶出を行い、２５０μＬずつ５０画分を回収した（流速：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ、溶出開始２０分後から回収）。(4) Gel filtration chromatography 4.5 mL of the active fraction obtained by anion exchange chromatography (RESOURCE Q) was fractionated into five 0.9 mL portions. Each fraction was superdex 200 HR 10/30 previously equilibrated with buffer E (20 mM MES (pH 6.0), 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.1 M NaCl) using an FPLC system. (Amersham Biosciences). Elution was performed with the same buffer, and 50 fractions were collected in a volume of 250 μL (flow rate: 0.5 mL / min, collected 20 minutes after the start of elution).

［４．ＣＥ活性測定］
実施例１に記載の手順に従い、ＣＥ活性を定性的および定量的に測定した。[4. CE activity measurement]
According to the procedure described in Example 1, CE activity was measured qualitatively and quantitatively.

［５．タンパク質の定量］
ブラドフォード法（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８）に従って、タンパク質を定量した。検量線は牛血清アルブミンを用いて作製した。[5. Protein Quantification]
Protein was quantified according to the Bradford method (MM Bradford, (1976) Anal. Biochem. 72, 248). A calibration curve was prepared using bovine serum albumin.

［６．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０）に従って行った。４．８％濃縮ゲル、１０％分離ゲルを使用し、泳動装置にはＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎＩＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて２０ｍＡの定電流で泳動した。泳動後のゲルを、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＳｉｌ−Ｂｅｓｔ Ｓｔａｉｎ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＰＡＧＥ（ナカライテスク）を用いて染色した。[6. SDS-PAGE]
SDS-PAGE was performed according to the Laemmli method (UK Laemmli, (1970) Nature, 227, 680). A 4.8% concentrated gel and a 10% separation gel were used, and MiniProtean III (Bio-Rad) was used as the electrophoresis apparatus for electrophoresis at a constant current of 20 mA. The gel after electrophoresis was stained using Simply Blue SafeStain (Invitrogen) or Sil-Best Stain for Protein / PAGE (Nacalai Tesque).

［７．Ｎ末端アミノ酸配列と塩基配列の解析］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲル中に含まれるタンパク質を、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ ＳＤ ＳＥＭＩ−ＤＲＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＣＥＬＬ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。転写にはブロッティング緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン、０．１％ ＳＤＳ、２０％メタノール）を使用し、メンブレン１ｃｍ２あたり０．８ｍＡの定電流で１時間行った。転写後のメンブレンをポンソーＳで染色後、目的バンドを切り出し、プロテインシーケンサーを用いてＮ末端アミノ酸配列を解析した。[7. Analysis of N-terminal amino acid sequence and nucleotide sequence]
Proteins contained in the gel after SDS-PAGE were transferred to a PVDF membrane using TRANS-BLOT SD SEMI-DRY TRANSFER CELL (Bio-Rad). Blotting buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, 20% methanol) was used for transfer, and the transfer was performed at a constant current of 0.8 mA per 1 cm 2 of membrane for 1 hour. The membrane after transfer was stained with Ponceau S, the target band was cut out, and the N-terminal amino acid sequence was analyzed using a protein sequencer.

アガロースゲル電気泳動装置には、サブマリン型電気泳動漕Ｍｕｐｉｄ−２（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ）を使用し、電気泳動用アガロースには、Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ ０３（ＴａＫａＲａ）を使用した。試料溶液には、泳動用色素（０．２５％ ブロモフェノールブルー、０．２５％ キシレンシアノール、３０％ グリセロール）を１／１０倍容加え、泳動用緩衝液に１×ＴＡＥ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０））を用いた。泳動後のゲルを、エチジウムブロマイドを加えた１×ＴＡＥ中に浸し染色した。ＤＮＡ分子量マーカーには、１Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。電気泳動によって分離した各種ＤＮＡ断片のアガロースゲルからの回収を，ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を使用して、製造業者の指示書に従って行った。   Submarine type electrophoresis kit Mupid-2 (Cosmo Bio) was used for the agarose gel electrophoresis apparatus, and Agarose L 03 (TaKaRa) was used for the agarose for electrophoresis. To the sample solution, 1/10 volume of electrophoresis dye (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 30% glycerol) was added, and 1 × TAE (40 mM Tris-HCl) was added to the electrophoresis buffer. 1 mM EDTA (pH 8.0)) was used. The gel after electrophoresis was immersed and stained in 1 × TAE to which ethidium bromide was added. As a DNA molecular weight marker, 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) was used. Recovery of various DNA fragments separated by electrophoresis from an agarose gel was performed using GENECLEAN III kit (BIO101) according to the manufacturer's instructions.

［８．クローンの塩基配列およびアミノ酸配列の相同性解析］
Ｒ．ａｌｂｕｓ ８株のゲノム情報をＴＩＧＲ（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／）より得た。本遺伝子は未同定遺伝子として記載されている。ＤＲＡＷ３２（ＡｃａＣｌｏｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて塩基配列の解析を、ＢＬＡＳＴ（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３）を用いて相同性検索を行った。塩基配列およびアミノ酸配列の多重整列（アラインメント）にはＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３）を使用した。[8. Homology analysis of clone base sequence and amino acid sequence]
R. Genomic information of 8 strains of albus was obtained from TIGR (http://www.tigr.org/). This gene is described as an unidentified gene. Base sequence analysis was performed using DRAW32 (AcaClone software), and homology search was performed using BLAST (SF Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403). Clustal W (JD Thompson et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 4673) was used for multiple alignment (alignment) of base sequences and amino acid sequences.

Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定を、以下の方法に従って行った。なお、以下に述べる手法は一例であって、本発明を限定するものではない。   R. The cloning of the albus NE1 gene and the determination of the nucleotide sequence were performed according to the following method. The method described below is an example and does not limit the present invention.

先ず、Ｒ．ａｌｂｕｓ ８株の染色体由来の未同定遺伝子の配列をもとにプライマー（５’−ＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴ−３’（配列番号１２）および５’−ＧＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＴＡ−３’（配列番号１３））を構築し、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った．９５℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行った。得られた反応生成物に基づいて、完全に一致するプライマー（５’−ＣＧＣＴＴＡＴＡＴＧＡＣＡＣＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号１４）および５’−ＴＣＡＧＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１５））を構築し、ＰＣＲ ＤＩＧ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＭＩＸ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて同様のサイクルでＰＣＲを行うことで，ＤＩＧで標識されたプローブを作製した。   First, R.D. Primers (5'-GATGATGAGAACGGCGCGCTTT-3 '(SEQ ID NO: 12) and 5'-GCTCTCCCCGCCACCCACCATA-3' (SEQ ID NO: 13)) were constructed based on the sequence of the unidentified gene derived from the chromosome of strain albus 8; PCR was performed using the chromosomal DNA of albus NE1 as a template. 30 cycles of reaction at 95 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes were performed. Based on the obtained reaction products, perfectly matched primers (5′-CGCTTATATGACACTGGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 14) and 5′-TCAGCCTGTCAGCTACTCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 15)) were constructed, and PCR DIG Labeling MIX A probe labeled with DIG was prepared by performing PCR in the same cycle using (Roche).

単離したＲ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１の染色体ＤＮＡを種々の制限酵素（ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌＩＩ）を用いて消化した。３μｇの染色体ＤＮＡ当り１０Ｕの制限酵素を用いて３７℃で１２時間反応させた後，さらに１０Ｕの制限酵素を添加して１２時間反応させた。反応液を、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動に供した。３０Ｖの定電圧で４時間電気泳動して、ＤＮＡを分離した。分離したＤＮＡを、常法に従いナイロン膜であるＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に毛細管現象を利用して転写し，ＵＶ照射によりＤＮＡをナイロン膜に固定した。Isolated R. The chromosomal DNA of albus NE1 was digested with various restriction enzymes (PstI, PvuII, EcoRI, EcoRV, BglII). After reacting at 37 ° C. for 12 hours using 10 U of restriction enzyme per 3 μg of chromosomal DNA, 10 U of restriction enzyme was further added and allowed to react for 12 hours. The reaction solution was subjected to electrophoresis using 0.8% agarose gel. The DNA was separated by electrophoresis at a constant voltage of 30 V for 4 hours. The separated DNA was transferred to Hybond-N + (Amersham Biosciences), which is a nylon membrane, using capillary action according to a conventional method, and the DNA was fixed to the nylon membrane by UV irradiation.

ハイブリダイゼーションおよび検出には、Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。上記の手順で調製した標識プローブならびにナイロン膜を使用して、ハイブリダイゼーションを６０℃で１６時間行った。プローブを、ハイブリダイゼーション溶液１ｍＬ当り１０ｎｇにて使用した。膜の洗浄を、０．１％ ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ溶液中にて６８℃で１５分間振盪させることで行い，同様の操作を合計３回行った。検出を、製造業者の指示書に従って行い、発光基質にはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。Ｘ線フィルムには、ＦＵＪＩ ＭＥＤＩＣＡＬ Ｘ−ＲＡＹ ＦＩＬＭ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を使用し、１分間感光させた。   Anti-Digoxigenin-AP (Roche) was used for hybridization and detection. Hybridization was performed at 60 ° C. for 16 hours using the labeled probe prepared by the above procedure and a nylon membrane. The probe was used at 10 ng per mL of hybridization solution. The membrane was washed by shaking in a 0.1% SDS, 0.1 × SSC solution at 68 ° C. for 15 minutes, and the same operation was performed three times in total. Detection was performed according to manufacturer's instructions and CDP-Star (Roche) was used as the luminescent substrate. As the X-ray film, FUJI MEDICAL X-RAY FILM (FUJIFILM) was used and exposed to light for 1 minute.

Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１の染色体ＤＮＡ３μｇを１０ＵのＥｃｏＲＩで消化し，フェノール／クロロホルム抽出によりＤＮＡを精製した。精製後、エタノール沈殿を行い４μＬのＴＥに溶解し，４℃で一晩セルフライゲーションを行った。セルフライゲーション後の反応液を鋳型とし，プローブの配列をもとに設計したプライマー（５’−ＣＧＡＧＡＡＧＧＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣ−３’（配列番号１６）および５’−ＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＴＡＴＡＣＴＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣ−３’（配列番号１７））を用いてｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った。９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で４分間の反応を３０サイクル行った。ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を鋳型としてシークエンス反応を行うことにより、ＣＥ遺伝子を含む近傍の塩基配列情報を取得した。得られた配列情報に基づいてＣＥ遺伝子全長を含む配列の取得を目的としたプライマー（５’−ＣＴＣＴＴＡＴＡＧＴＴＧＣＡＣＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＧＡＧＧ−３’（配列番号１８）および５’−ＴＴＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＴＣＧＧ−３’（配列番号１９））を作製し、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１の染色体ＤＮＡを鋳型に増幅したＤＮＡ断片をｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。   R. 3 μg of chromosomal DNA of albus NE1 was digested with 10 U of EcoRI, and the DNA was purified by phenol / chloroform extraction. After purification, ethanol precipitation was performed and dissolved in 4 μL of TE, followed by self-ligation at 4 ° C. overnight. Using the reaction solution after self-ligation as a template, primers designed based on the probe sequence (5′-CGAGAAGGTAGCTGACAGGCTGAAGTTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 16) and 5′-CCATCATCCAGTAACTCCACCGTTATC-3 ′ (SEQ ID NO: 17)) Inverse PCR was performed. 30 cycles of reaction at 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 4 minutes were performed. By performing a sequencing reaction using a DNA fragment amplified by the inverse PCR as a template, information on the base sequence in the vicinity including the CE gene was obtained. Based on the obtained sequence information, primers (5′-CTCTTATAGTTGCCACATATATATTGAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 18) and 5′-TTCCATGTTAGTCTCCTTTTCGG-3 ′ (SEQ ID NO: 19)) for the purpose of obtaining a sequence containing the entire CE gene are prepared. R. A DNA fragment amplified using the chromosomal DNA of albus NE1 as a template was subcloned into pT7 Blue vector (Novagen).

塩基配列を、Ｓａｎｇｅｒらのｄｉｄｅｏｘｙ法により決定した（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒら、（１９７７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ７４，５４６３）。ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片またはその増幅断片をｐＴ７ Ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトにサブクローニングし、精製したプラスミドを鋳型として，シークエンス反応を行った。シークエンス反応には、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。解析には、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） を用いた。   The base sequence was determined by the didoxy method of Sanger et al. (F. Sanger et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463). A DNA fragment amplified by PCR or an amplified fragment thereof was subcloned into the multicloning site of pT7 Blue vector, and a sequencing reaction was performed using the purified plasmid as a template. For the sequencing reaction, Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) was used. ABI PRISM 310 Genetic Analyzer for Windows (registered trademark) (Applied Biosystems) was used for the analysis.

［９．基質特異性］
ＣＥの基質特異性を、ＴＬＣを用いて定性的に解析した。反応液の組成を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）１５μＬ、１００ｍＭ 各種基質５μＬ、精製酵素５μＬ（３４ｎｇ）とし、２５℃で一晩反応させた。サンプルを、５分間煮沸することによって反応を停止させた後、ＴＬＣに供した（展開溶媒系；２−プロパノール／１−ブタノール／Ｈ２Ｏ＝７：１：２）。[9. Substrate specificity]
The substrate specificity of CE was analyzed qualitatively using TLC. The composition of the reaction solution was 100 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0) 15 μL, 100 mM various substrates 5 μL, and purified enzyme 5 μL (34 ng), and reacted at 25 ° C. overnight. The reaction was stopped by boiling the sample for 5 minutes and then subjected to TLC (developing solvent system; 2-propanol / 1-butanol / H 2 O = 7: 1: 2).

［１０．反応生成物の解析］
（１）ラクトースを基質とした場合
反応液の組成を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３．２ｍＬ、１００ｍＭ ラクトースを６．２ｍＬ（２１２ｍｇ）、酵素液を１．６ｍＬ（１０．９μｇ）とし、２５℃で一晩反応させた。サンプルを５分間煮沸することによって反応を停止させ、全量をＴＬＣに供した。ＴＬＣプレートの一部を発色させ、反応生成物の移動度を測定した後にシリカゲルを削り取ることによって、生成物を単離した。得られた生成物を、シリカゲルの２倍量の脱塩水で抽出した後、ロータリーエバポレーター（東京理化機械）で濃縮した。本生成物は來雑物として微量のラクトースを含むので、全量を再びＴＬＣに供し、同様の操作を行うことで反応生成物を精製した。精製後の反応生成物５０μＬ（２６２μｇ）に８Ｍ トリフルオロ酢酸を５０μＬ加え、３時間１００℃に放置することによって完全に加水分解させた。遠心濃縮器を用いて本反応液の溶媒を脱塩水に置換した後、反応性生物をＴＬＣに供することによって分解産物を定性的に同定した。[10. Analysis of reaction products]
(1) When lactose is used as substrate The composition of the reaction solution is 3.2 mL of 100 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0), 6.2 mL (212 mg) of 100 mM lactose, and 1.6 mL of enzyme solution (10 0.9 μg) and allowed to react overnight at 25 ° C. The reaction was stopped by boiling the sample for 5 minutes and the entire amount was subjected to TLC. The product was isolated by developing a portion of the TLC plate and measuring the mobility of the reaction product before scraping the silica gel. The obtained product was extracted with deionized water twice the amount of silica gel, and then concentrated with a rotary evaporator (Tokyo Rika Machine). Since this product contains a trace amount of lactose as a contaminant, the entire amount was again subjected to TLC, and the reaction product was purified by the same operation. 50 μL (262 μg) of the purified reaction product was added with 50 μL of 8M trifluoroacetic acid, and left to stand at 100 ° C. for 3 hours for complete hydrolysis. After substituting the solvent of this reaction liquid with demineralized water using a centrifugal concentrator, the degradation product was qualitatively identified by subjecting the reactive organism to TLC.

（２）セロトリオースを基質とした場合
反応液の組成を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）を４．１ｍＬ、１００ｍＭ セロトリオースを２．７ｍＬ（１３６ｍｇ）、酵素液を１．８ｍＬ（１２．２μｇ）とし、上記と同様の操作を行うことによって反応生成物を分離精製した後、高分解能核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置（ＢＲＵＫＥＲ ＡＭＸ−５００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（５００ＭＨｚ））に供し、１Ｈおよび１３Ｃのスペクトラを測定した（１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲ）。(2) When using cellotriose as a substrate The composition of the reaction solution is 4.1 mL of 100 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0), 2.7 mL (136 mg) of 100 mM cellotriose, and 1.8 mL of enzyme solution (12 .2Myug) and then, after separation and purification of the reaction product by performing the same operation as above, subjected to high-resolution nuclear magnetic resonance (NMR) apparatus (BRUKER AMX-500 spectrometer (500MHz )), 1 H and 13 C Were measured ( 1 H-NMR and 13 C-NMR).

〔Ｂ．結果〕
［１．ＣＥの精製］
５段階のクロマトグラフィーにより、電気泳動的に単一のタンパク質を得た（図３）。収率は約０．２％（１０２μｇ）であった。各種緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．８）でＣＥ活性を測定したところ、グリシルグリシン−ＮａＯＨにおいて最も高い活性を示した。この緩衝溶液中での酵素の比活性は３．６Ｕ／ｍｇであった。[B. result〕
[1. Purification of CE]
A single protein was obtained electrophoretically by 5-step chromatography (FIG. 3). The yield was about 0.2% (102 μg). When CE activity was measured with various buffers (0.1 M, pH 7.8), it showed the highest activity in glycylglycine-NaOH. The specific activity of the enzyme in this buffer solution was 3.6 U / mg.

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上から推定される精製酵素の分子量は約４３．１ｋＤａであった。精製酵素の分子吸光係数（Ｅ値、１％酵素溶液で２８０ｎｍにおける吸光度）は約１８であった（牛血清アルブミンを標準タンパク質とした場合）。また、酵素活性の最大活性はｐＨ７．７〜８．２にある（４０ｍＭ ブリットン−ロビンソン緩衝液中）であり、酵素活性の最大活性は２８〜３２℃（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液中）であった。酵素活性は、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｐｂ２＋，Ａｇ＋、Ｎ−ブロモスクシミド、ヨード酢酸、ｐ−クロロマーキュリーベンゾエート（各々１ｍＭ）で阻害された（酵素を３０℃で３０分前処理した場合）。The molecular weight of the purified enzyme estimated from SDS-PAGE was about 43.1 kDa. The molecular extinction coefficient of the purified enzyme (E value, absorbance at 280 nm with 1% enzyme solution) was about 18 (when bovine serum albumin was used as the standard protein). The maximum enzyme activity is at pH 7.7 to 8.2 (in 40 mM Britton-Robinson buffer), and the maximum enzyme activity is 28 to 32 ° C. (in 40 mM Tris-maleic acid buffer). there were. Enzyme activity was inhibited by Fe 3+ , Co 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Pb 2+ , Ag + , N-bromosuccinimide, iodoacetic acid, p-chloro mercury benzoate (1 mM each) (enzyme at 30 ° C. for 30 minutes) If pre-processing).

（表３：ＣＥ精製の工程）   (Table 3: CE purification process)

［２．Ｎ末端アミノ酸配列の解析および基質特異性］
精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した後、目的バンドを切り出した。目的のタンパク質のＮ末端配列を解読した。得られたＮ末端配列はＭＭＩＳＥＩＲＱＥＬＴＤＨＩＩＰＦＷＮＫＬＲＤ（配列番号４）であった。類似性を有するアミノ酸配列をＢＬＡＳＴにて検索したが、高い相同性を示すアミノ酸配列は得られなかった（データは示さない）。[2. Analysis of N-terminal amino acid sequence and substrate specificity]
The purified protein was subjected to SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane, and then the target band was cut out. The N-terminal sequence of the protein of interest was decoded. The obtained N-terminal sequence was MMISEIRQELTDHIIPFWNKKLRD (SEQ ID NO: 4). An amino acid sequence having similarity was searched by BLAST, but an amino acid sequence showing high homology was not obtained (data not shown).

そこで、一部ゲノム配列が明らかとなっているＲ．ａｌｂｕｓ ８株のゲノムデータベースＴＩＧＲで、本配列と類似性を持つアミノ酸配列を検索した結果、２３残基のうち１８残基が一致する配列ＭＭＫＥＥＶＫＱＥＬＴＳＨＩＩＰＦＷＮＫＬＲＤ（配列番号２０）を見出した。Ｒ．ａｌｂｕｓ ８株のゲノムデータベースに掲載されているこのタンパク質は、バクテロイデス フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＹＣＨ４６、ミクロブルビファー デグラダンス（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｄｅｇｒａｄａｎｓ）２−４０由来のＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉとそれぞれ４０％、３７％の割合でアミノ酸配列が一致していた。ＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉは、アセチルグルコサミンの２位の水酸基を異性化し、Ｎ−アセチルマンノサミンを生成する酵素である。   Therefore, a part of the genome sequence has been clarified. As a result of searching an amino acid sequence having similarity to this sequence in the genome database TIGR of albus 8 strain, a sequence MMKEEVKQELTSHIIPFWNKLRRD (SEQ ID NO: 20) in which 18 residues out of 23 residues coincided was found. R. This protein, which is listed in the genome database of strain albus 8, is composed of GlcNAc-2-epi from Bacteroides fragilis YCH46 and Microbulbifer degradans 2-40, 40% and 37% respectively. The amino acid sequence was consistent. GlcNAc-2-epi is an enzyme that isomerizes the hydroxyl group at the 2-position of acetylglucosamine to produce N-acetylmannosamine.

そこで、本発明の酵素を、ＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉの基質であるアセチルグルコサミンを基質とするＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉ活性について薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認したところ、反応生成物は得られなかった。また、これまでに報告のあるエピメラーゼの活性を有するか否かを検討するために、本発明の酵素を、ＵＤＰ−グルコース、グルコース−６−リン酸および種々の単糖を基質とした反応に供したが、いずれの反応においても反応生成物は得られなかった。   Therefore, when the enzyme of the present invention was confirmed by thin layer chromatography (TLC) for GlcNAc-2-epi activity using acetylglucosamine, which is a substrate of GlcNAc-2-epi, as a result, no reaction product was obtained. . In addition, in order to examine whether epimerase activity has been reported so far, the enzyme of the present invention is subjected to reactions using UDP-glucose, glucose-6-phosphate and various monosaccharides as substrates. However, no reaction product was obtained in any reaction.

本発明の酵素を、代表的な２糖であるマルトース（α−１，４）、スクロース、ソホロース（β−１，２）、ラミナリビオース（β−１，３）およびゲンチオビオース（β−１，６）を基質とした酵素反応に供した場合も、反応生成物は得られなかった。しかし、驚くことに、本発明の酵素を、ラクトース（β−１，４）を基質とした反応に供したところ、基質以外のスポットが反応生成物として検出された。これまでに、ラクトースを基質としてヘテロオリゴ糖を生成するエピメラーゼは知られていない。また、本発明の酵素を、少なくともセロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースとともに反応に供した場合も、基質以外のスポットが反応生成物として検出された（図４）。   Enzymes of the present invention can be converted into typical disaccharides such as maltose (α-1,4), sucrose, sophorose (β-1,2), laminaribiose (β-1,3) and gentiobiose (β-1, No reaction product was obtained when the enzyme reaction was performed using 6) as a substrate. Surprisingly, however, when the enzyme of the present invention was subjected to a reaction using lactose (β-1,4) as a substrate, spots other than the substrate were detected as reaction products. To date, no epimerase that produces hetero-oligosaccharides using lactose as a substrate has been known. Further, when the enzyme of the present invention was subjected to the reaction together with at least cellobiose, cellotriose and cellotetraose, spots other than the substrate were detected as reaction products (FIG. 4).

以上の結果、ならびにセロペンタオースおよびセロヘキサオースを基質とした場合の結果を表４にまとめた。これらの結果から、本酵素がこれまでに報告されたエピメラーゼとは全く異なる基質特異性を有する新規エピメラーゼ酵素であることが明らかとなった。また各種糖の反応性から、本酵素がβ−１，４結合を有するオリゴ糖のみに作用する可能性が示唆された。   Table 4 summarizes the above results and the results when cellopentaose and cellohexaose were used as substrates. From these results, it was clarified that this enzyme is a novel epimerase enzyme having a substrate specificity completely different from the epimerase reported so far. In addition, the reactivity of various sugars suggested that this enzyme may act only on oligosaccharides having β-1,4 bonds.

また、エピラクトースまたはＧｌｃ−Ｍａｎを基質として反応させた際の生成物が、それぞれラクトースまたはセロビオースであることを、ＴＬＣで確認した（図は示さず）。この結果は、本発明に係るＣＥが可逆的触媒反応を行なうことを示している。   In addition, it was confirmed by TLC that the products when epilactose or Glc-Man was reacted as a substrate were lactose and cellobiose, respectively (not shown). This result indicates that the CE according to the present invention performs a reversible catalytic reaction.

（表４：精製タンパク質の基質特異性）   (Table 4: Substrate specificity of purified protein)

［３．反応生成物の同定］
上述の基質特異性の解析から、セロビオース以外に、少なくともセロオリゴ糖およびラクトースが上記の新規酵素の基質になり得ることが明らかとなった。このことは、これまでに報告のない新規オリゴ糖が合成されたことを示唆する。[3. Identification of reaction product]
From the analysis of the substrate specificity described above, it was revealed that at least cellooligosaccharide and lactose can be substrates for the above-mentioned novel enzyme, in addition to cellobiose. This suggests that a novel oligosaccharide that has never been reported has been synthesized.

そこで、この生成オリゴ糖の構造を解析した。具体的には、ラクトースを基質として酵素反応を行い、反応生成物をＴＬＣにより分離した後、シリカゲルを削り取ることで生成物を単離した。この生成物を、トリフルオロ酢酸を用いて酸加水分解し、分解産物をＴＬＣにて検出したところ、ガラクトースおよびマンノースであることが観察された。このことから、この酵素はセロビオースと同様にβ−１，４結合を有するラクトースを基質とし、還元末端グルコースをマンノースに変換することで、新規オリゴ糖β−１，４ガラクトシルマンノース（エピラクトース）を生成したと考えられた。   Therefore, the structure of this generated oligosaccharide was analyzed. Specifically, an enzyme reaction was performed using lactose as a substrate, the reaction product was separated by TLC, and then the product was isolated by scraping the silica gel. This product was subjected to acid hydrolysis using trifluoroacetic acid, and the decomposition product was detected by TLC. As a result, it was observed that the product was galactose and mannose. From this fact, this enzyme uses lactose having a β-1,4 bond as a substrate in the same manner as cellobiose, and converts the reducing end glucose to mannose to produce a novel oligosaccharide β-1,4 galactosylmannose (epilactose). It was thought that it was generated.

〔実施例３：ＮＭＲによる反応生成物の構造解析〕
実施例２に記載の手順に従い、ラクトースからの生成物を精製した。抽出後のサンプルを濃縮し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を重水に置換した後、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲに供し、１Ｈおよび１３Ｃのスペクトラを測定した。なお、外部標準としてＴＳＰ（［２，２，３，３−Ｄ４］ｓｏｄｉｕｍ ３−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ） ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）を用いた。得られたスペクトラは、市販のエピラクトース（Ｓｉｇｍａ）と完全に一致するものであった（図５）。[Example 3: Structural analysis of reaction product by NMR]
The product from lactose was purified according to the procedure described in Example 2. The sample after extraction was concentrated and the solvent was replaced with heavy water using a rotary evaporator, and then subjected to 1 H-NMR and 13 C-NMR, and 1 H and 13 C spectra were measured. Note that TSP ([2,2,3,3-D4] sodium 3-3 (trimethylsilyl) propanoate) was used as an external standard. The obtained Spectra was completely consistent with commercially available epilactose (Sigma) (FIG. 5).

セロトリオースを基質とした場合の反応液の組成を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）を４．１ｍＬ、１００ｍＭ セロトリオースを２．７ｍＬ（１３６ｍｇ）、酵素液を１．８ｍＬ（１２μｇ）とし、２５℃で一晩反応させた。５分間の煮沸で反応を停止し、全量をＴＬＣに供した。ＴＬＣプレートの一部を発色させ反応生成物の生成を確認後、シリカゲルを削り取りその生成物を単離した。シリカゲルの２倍量の脱塩水で抽出した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。本サンプルは夾雑物として微量のセロトリオースを含むため、再び全量をＴＬＣに供し、同様の操作を行うことで精製した。抽出後のサンプルを濃縮し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を重水に置換した後、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲに供した。なお、外部標準としてＴＳＰを用いた。得られたスペクトルは、過去に報告された細胞壁多糖由来グルコピラノシル−１，４−O−β−Ｄ−グルコピラノシル１，４−O−β−Ｄ−マンノース（Ｇｌｃ−Ｇｌｃ−Ｍａｎ）のスペクトラと完全に一致した（Ｒ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、（１９９１） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２１０，２６３）（図６、図７））。The composition of the reaction solution when cellotriose was used as a substrate was 4.1 mL of 100 mM Tris-maleic acid buffer (pH 7.0), 2.7 mL (136 mg) of 100 mM cellotriose, and 1.8 mL (12 μg) of enzyme solution. And allowed to react overnight at 25 ° C. The reaction was stopped by boiling for 5 minutes, and the entire amount was subjected to TLC. After confirming the formation of a reaction product by developing a part of the TLC plate, the silica gel was scraped to isolate the product. After extraction with deionized water twice the amount of silica gel, the mixture was concentrated on a rotary evaporator. Since this sample contains a trace amount of cellotriose as a contaminant, the entire amount was again subjected to TLC and purified by the same operation. The sample after extraction was concentrated, and the solvent was replaced with heavy water using a rotary evaporator, followed by 1 H-NMR and 13 C-NMR. Note that TSP was used as an external standard. The obtained spectrum is completely identical with the spectrum of glucopyranosyl-1,4-O-β-D-glucopyranosyl 1,4-O-β-D-mannose (Glc-Glc-Man) reported in the past. (R. Goldberg et al. (1991) Carbohydr. Res. 210, 263) (FIGS. 6 and 7)).

〔実施例４：組換え酵素の調製〕
ＮＥ１株の成熟型ＣＥ酵素のアミノ酸配列および塩基配列は、配列番号１および配列番号２に示される配列であることが判明した。予め行なった実験により得られたＮ末端のアミノ酸配列（配列番号４）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のものと完全に一致していた。配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づけば、ＣＥの分子量は４５，２１７Ｄａであった。[Example 4: Preparation of recombinant enzyme]
The amino acid sequence and base sequence of the mature CE enzyme of the NE1 strain were found to be the sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) obtained by the experiment conducted in advance completely matched the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the molecular weight of CE was 45,217 Da.

ＣＥ酵素（ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２に示される塩基配列を有する。）を以下の方法で発現させた。   A polynucleotide encoding the CE enzyme (polypeptide) (having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2) was expressed by the following method.

［１．発現プラスミドの構築］
ゲノムＤＮＡを鋳型とし，ＣＥ遺伝子の全長をＰＣＲにより増幅した．９５℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行った。反応液からＤＮＡ断片を回収し、サブクローニングした増幅断片に変異が導入されていないことを確認した後、大腸菌発現ベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）ベクターに挿入した。[1. Construction of expression plasmid]
Using the genomic DNA as a template, the full length of the CE gene was amplified by PCR. 30 cycles of reaction at 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes were performed. The DNA fragment was recovered from the reaction solution, and after confirming that no mutation was introduced into the subcloned amplified fragment, it was inserted into the E. coli expression vector pET-23a (+) vector.

［２．酵素の誘導］
宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、発現プラスミドで形質転換した後、最終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ寒天培地上で選抜し、同様の液体培地４ｍＬ中にて３７℃で一晩前培養した。５００ｍＬ容三角フラスコに入れた同液体培地２００ｍＬに前培養液４ｍＬを接種し（合計４００ｍＬ）、３７℃で２００ｒｐｍにて振盪培養を行った。６００ｎｍにおける吸光度が０．６に達した時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。なお、培養後の操作を全て４℃で行った。[2. Enzyme induction]
Host Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with the expression plasmid, then selected on LB agar medium supplemented with a final concentration of 100 μg / mL ampicillin, and pre-cultured overnight at 37 ° C. in 4 mL of the same liquid medium. did. 200 mL of the same liquid medium placed in a 500 mL Erlenmeyer flask was inoculated with 4 mL of the preculture solution (400 mL in total), and cultured with shaking at 37 ° C. and 200 rpm. When the absorbance at 600 nm reached 0.6, IPTG was added to a final concentration of 1 mM to induce expression of the target protein. All operations after culturing were performed at 4 ° C.

［３．菌体の破砕］
６，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により、大腸菌の培養液４００ｍＬから菌体を回収した。この菌体を、１５ｍＬの１ｍＭ ＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−マレイン酸（ｐＨ ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）に懸濁した後に、フレンチプレスにより破砕した。菌体破砕後、１２，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液とした。[3. Disruption of bacterial cells]
The cells were collected from 400 mL of the E. coli culture by centrifugation at 6,000 rpm for 20 minutes. The cells were suspended in buffer A (100 mM Tris-maleic acid (pH 7.0), 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol) containing 15 mL of 1 mM PMSF, and then crushed by a French press. After disrupting the cells, centrifugation was performed at 12,000 rpm for 30 minutes, and the resulting supernatant was used as a crude enzyme solution.

［４．組換え酵素の精製］
１）陰イオン交換クロマトグラフィー
上述の実施例において得られた粗酵素液を、予め緩衝液Ａで平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。溶出を、０Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配で行い、４ｍＬずつ１００画分に分けて回収した。[4. Purification of recombinant enzyme]
1) Anion exchange chromatography The crude enzyme solution obtained in the above Example was subjected to Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) equilibrated with Buffer A in advance. Elution was performed with a linear NaCl gradient from 0 M to 0.5 M, and 4 mL was collected in 100 fractions.

２）吸着クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた活性画分を緩衝液Ｂ（５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール）で透析した後、予め同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイト（和光純薬工業）に供した．吸着後の洗浄は緩衝液Ｃ（５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５Ｍ ＫＣｌ）を用いた。溶出を、５ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸直線濃度勾配で行い、４ｍＬずつ１００画分に分けて回収した。2) Adsorption chromatography The active fraction obtained by anion exchange chromatography was dialyzed against buffer B (5 mM phosphate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol), and then the same buffer in advance. It was subjected to hydroxyapatite (Wako Pure Chemical Industries) equilibrated with liquid. For washing after adsorption, buffer C (5 mM phosphate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5 M KCl) was used. Elution was performed with a phosphate concentration gradient of 5 mM to 200 mM, and 4 mL was collected in 100 fractions.

３）組換え酵素の精製度
精製して得られた組換え酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一なバンドを与えた。収率が約７０％で、比活性が約１０Ｕ／ｍｇの精製標品２０ｍｇを得た。3) Degree of purification of the recombinant enzyme The recombinant enzyme obtained by purification gave a single band by SDS-PAGE. A purified preparation (20 mg) having a yield of about 70% and a specific activity of about 10 U / mg was obtained.

４）組換え酵素の酵素化学的性質
上述の酵素化学的性質の実験手法を用いて試験したところ、本組換えＣＥは、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１由来のＣＥとほぼ同じ性質であった。4) Enzymatic chemistry of the recombinant enzyme When tested using the above-described experimental method of enzymatic chemistry, this recombinant CE Albus NE1-derived CE was almost the same property.

〔実施例５：ビフィズス菌によるエピラクトースの資化性〕
以下の手順に従って、ビフィズス菌を、エピラクトースを含む培地（表５）中で培養し、生育試験を行った。なお、供試したビフィズス菌株は、ビフィデバクテリウム ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ） ＪＣＭ１２５５、ビフィデバクテリウム ブレベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ） ＪＣＭ１１９２、ビフィデバクテリウム ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ） ＪＣＭ１２１７、ビフィデバクテリウム アドレセンチス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ） ＪＣＭ１２７５、ビフィデバクテリウム インファンチス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ） ＪＣＭ１２２２、ビフィデバクテリウム カテヌラタム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ） ＪＣＭ１１９４である。
１．供試糖溶液を添加することにより培地が希釈されることを考慮して、培地の濃度を数倍の濃度で調製した。
２．供試糖溶液を、濾過滅菌した後に培地に添加した（最終濃度１％）。
３．１％グルコース含有培地中にて前培養した供試菌株の菌液を培地量の１％接種した。４．培養を、アネロパックケンキ（Ａｎｅｒｏｐａｃｋ Ｋｅｎｋｉ；三菱ガス化学）を用いたガスパック法によって行った。嫌気条件下にて３７℃で１〜３日間培養し、供試菌株の資化性について検討した。[Example 5: Utilization of epilactose by bifidobacteria]
According to the following procedure, bifidobacteria were cultured in a medium containing epilactose (Table 5), and a growth test was performed. The Bifidobacterium strains tested were Bifidobacterium bifidum JCM1255, B. breve JCM1192, B. longum JCM1217, Bifidobacterium adrecent (B. B. adolescentis) JCM1275, B. infantis JCM1222, B. catenatum. JCM1194.
1. Considering that the medium is diluted by adding the test sugar solution, the concentration of the medium was adjusted to several times.
2. The test sugar solution was sterilized by filtration and then added to the medium (final concentration 1%).
3. 1% of the medium was inoculated with the bacterial solution of the test strain pre-cultured in a medium containing 1% glucose. 4). The culture was performed by a gas pack method using Aneropack Kenki (Mitsubishi Gas Chemical). The cells were cultured at 37 ° C. for 1 to 3 days under anaerobic conditions, and the assimilation property of the test strain was examined.

（表５．エピラクトース資化性試験培地の組成）   (Table 5. Composition of epilactose utilization test medium)

エピラクトースの生育度を表６に示した。何れのビフィズス菌もエピラクトースを利用することができることが判明した。   The growth degree of epilactose is shown in Table 6. It was found that any bifidobacteria can use epilactose.

（表６．ビフィズス菌のエピラクトース資化性）   (Table 6. Epilactose utilization of Bifidobacteria)

〔実施例６：エピラクトースの難消化性〕
エピラクトースの胃内および腸内での消化耐性を、以下の方法により調べた。[Example 6: Indigestibility of epilactose]
The digestive resistance of epilactose in the stomach and intestine was examined by the following method.

日本薬局方崩壊試験第１液（人工胃液）を用いて胃内での消化耐性を調べた。すなわち、１００ｍＭエピラクトース水溶液２５μＬに２倍濃度の人工胃液（０．４％塩化ナトリウム、１．４％濃塩酸）２５μＬを添加した後、３７℃で２時間静置した。１００ｍＭ 水酸化ナトリウムを添加して上記溶液を中和した後、ＡＧ５０１−ＸＢレジンに供し、遠心分離により非吸着性画分を得た。ＣＥ活性の定量的測定法と同様の方法で残存するエピラクトースを定量した。エピラクトースと同様にラクトース、スクロースについても消化耐性を調べた。   Digestion tolerance in the stomach was examined using the Japanese Pharmacopoeia Disintegration Test 1st liquid (artificial gastric juice). That is, 25 μL of double concentration artificial gastric fluid (0.4% sodium chloride, 1.4% concentrated hydrochloric acid) was added to 25 μL of 100 mM epilactose aqueous solution, and then allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. After neutralizing the above solution by adding 100 mM sodium hydroxide, it was subjected to AG501-XB resin, and a non-adsorbing fraction was obtained by centrifugation. Remaining epilactose was quantified by the same method as the quantitative measurement method of CE activity. Digestion resistance was examined for lactose and sucrose as well as epilactose.

腸内での消化耐性を、Ｔ．Ｍｉｓｈｉｍａらの方法（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５３、７２５７（２００５））に従って調製したラット小腸粗酵素液を用いて調べた。すなわち、１００ｍＭ エピラクトース水溶液２５μＬにラット小腸粗酵素液２５μＬを添加した後、３７℃で３時間静置した。上記溶液を５分間煮沸して含まれる酵素を失活させた後、ＡＧ５０１−ＸＢレジンに供し、遠心分離により非吸着性画分を得た。ＣＥ活性の定量的測定法と同様の方法で残存するエピラクトースを定量した。エピラクトースと同様にラクトース、スクロースについても消化耐性を調べた。   The resistance to digestion in the intestines It was examined using a rat small intestine crude enzyme solution prepared according to the method of Misima et al. (J. Agric. Food Chem. 53, 7257 (2005)). That is, 25 μL of rat small intestine crude enzyme solution was added to 25 μL of 100 mM epilactose aqueous solution, and then allowed to stand at 37 ° C. for 3 hours. The solution was boiled for 5 minutes to inactivate the contained enzyme, then subjected to AG501-XB resin, and a non-adsorbing fraction was obtained by centrifugation. Remaining epilactose was quantified by the same method as the quantitative measurement method of CE activity. Digestion resistance was examined for lactose and sucrose as well as epilactose.

胃内および腸内でのエピラクトース、ラクトース、スクロースの消化耐性を表７に示す。エピラクトースは胃内および腸内において消化液に対して高い安定性を有していることが確認された。   Table 7 shows the digestive resistance of epilactose, lactose, and sucrose in the stomach and intestine. It was confirmed that epilactose has high stability to digestive juices in the stomach and intestine.

〔実施例７：エピラクトースのミネラル吸収促進作用〕
Ｃａｃｏ−２細胞は、ヒト大腸ガン組織から樹立された上皮細胞株であり、フラスコや透過性膜上に培養すると、極性を有する単層を形成する。また、Ｃａｃｏ−２細胞は、１０〜１５％ウシ胎児血清添加培地による２〜３週間程度の培養によって、分化誘導剤を使用することなく小腸上皮細胞様に分化する。細胞間にはＴＪが形成され、細胞の刷子縁膜側には微絨毛が形成される。そして、一部のミネラルはこのＴＪを介して吸収される。ラットを用いたｉｎ ｖｉｖｏの実験にてＣａ２＋吸収促進作用の認められた難消化性糖類をＣａｃｏ−２に添加すると、Ｃａ２＋吸収が増加した。このＣａ吸収促進作用はＴＪを介した作用であることが示唆されている（Ｔ．ＳｕｚｕｋｉとＨ．Ｈａｒａ，(２００４) Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３４、１９３５）。[Example 7: mineral lactose absorption promoting effect of epilactose]
Caco-2 cells are an epithelial cell line established from human colon cancer tissue, and form a monolayer with polarity when cultured on a flask or a permeable membrane. Caco-2 cells differentiate into small intestinal epithelial cells without using a differentiation-inducing agent by culturing for about 2 to 3 weeks in a medium supplemented with 10 to 15% fetal bovine serum. TJ is formed between cells, and microvilli are formed on the brush border membrane side of the cells. And some minerals are absorbed through this TJ. When an indigestible saccharide that was observed to promote Ca 2+ absorption in an in vivo experiment using rats was added to Caco-2, Ca 2+ absorption increased. It has been suggested that this Ca absorption promoting action is mediated by TJ (T. Suzuki and H. Hara, (2004) J. Nutr. 134, 1935).

そこで、Ｃａ２＋吸収促進作用を有する難消化性糖類の一種であるジフラクトースアンヒドリド（ｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏ−ｆｕｒａｎｏｓｅ １，２’：２，３’ ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ； ＤＦＡＩＩＩ）を対照として、エピラクトースのＴＪへの影響を検討した。Thus, TJ of epilactose was compared with difructose-anhydride (di-D-fructo-furanose 1,2 ': 2,3'dianhydride; DFAIII), which is a kind of indigestible saccharide having Ca 2+ absorption promoting action. The impact on

ヒト大腸ガン由来細胞株Ｃａｃｏ−２（ＨＴＢ３７、継代数１９）をＡＴＣＣから購入した。１００ｍＬ／Ｌのウシ胎児血清（非働化処理を実施、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ）、４４ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、１ｍＭ Ｎａ−ピルビン酸、５０，０００ ＩＵ／Ｌ ペニシリン、および５０ｍｇ／Ｌ ストレプトマイシン硫酸を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に使用した。Ｃａｃｏ−２細胞を、７５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、５％二酸化炭素および９５％空気の存在下にて３７℃で培養した。本実験では、継代数３９のＣａｃｏ−２細胞を使用した。Human colon cancer-derived cell line Caco-2 (HTB37, passage number 19) was purchased from ATCC. Dulbecco's supplemented with 100 mL / L fetal calf serum (inactivated, Thermo Trace), 44 mM Na 2 CO 3 , 1 mM Na-pyruvic acid, 50,000 IU / L penicillin, and 50 mg / L streptomycin sulfate Modified Eagle medium (Invitrogen) was used as the medium. Caco-2 cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide and 95% air in 75 cm 2 cell culture flasks (Corning). In this experiment, Caco-2 cells with passage number 39 were used.

刷子縁膜側へ添加した難消化性糖類による細胞間透過性へ影響の評価には、試薬として、（１）Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、４．２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、３．４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ Ｄ−グルコース、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（ｐＨ ７．４））、ならびに（２）１ＭのＤＦＡＩＩＩまたはエピラクトース（ＨＢＳＳに溶解）溶液を使用した。In order to evaluate the influence on the intercellular permeability by the indigestible saccharide added to the brush border membrane side, (1) Hank's balanced salt solution (HBSS, 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 4.2 mM NaHCO 3) was used as a reagent. 3 , 3.4 mM Na 2 HPO 4 , 4.4 mM KH 2 PO 4 , 1.25 mM CaCl 2 , 0.41 mM MgSO 4 , 0.49 mM MgCl 2 , 10 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 4 mM L-glutamine (pH 7.4)), and (2) 1M DFAIII or epilactose (dissolved in HBSS) solution was used.

トランズウェル・システム（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ；直径１２ｍｍ、ポアサイズ０．４μｍ、培養面積１．０ｃｍ２；Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用した。細胞間の透過性の評価を、経上皮電気抵抗値（ＴＥＲ）の測定により、以下の方法に従って実施した。
１．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌに、０．６３×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播いたＣａｃｏ−２細胞を、２５−２６日間培養した。
２．Ｃａｃｏ−２細胞を培養したＴｒａｎｓｗｅｌｌの刷子縁膜側および基底膜側を、ＨＢＳＳで２回リンスした後、各々０．５ｍＬおよび１．０ｍＬのＨＢＳＳを充填した。
３．ＣＯ２インキュベーター内（５％二酸化炭素および９５％空気の存在下にて３７℃）で３０分間静置後、０ｍｉｎの測定値としてＴＥＲを測定した。
４．刷子縁膜側からの難消化性糖類の添加の影響を評価する場合は、最終濃度として、各難消化性糖類が０、２０、４０、８０ｍＭとなるように、刷子縁膜側の溶液に添加した。A Transwell system (Transwell; diameter 12 mm, pore size 0.4 μm, culture area 1.0 cm 2 ; Corning) was used. Intercellular permeability was evaluated by measuring transepithelial electrical resistance (TER) according to the following method.
1. Caco-2 cells seeded in Transwell at a density of 0.63 × 10 4 cells / cm 2 were cultured for 25-26 days.
2. The brush border membrane side and basement membrane side of Transwell in which Caco-2 cells were cultured were rinsed twice with HBSS and then filled with 0.5 mL and 1.0 mL of HBSS, respectively.
3. After standing for 30 minutes in a CO 2 incubator (37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide and 95% air), TER was measured as a measured value of 0 min.
4). When evaluating the influence of addition of indigestible saccharides from the brush border side, add to the solution on the brush border side so that the final concentration is 0, 20, 40, 80 mM. did.

その結果、図８に示すように、エピラクトースまたはＤＦＡＩＩＩのＣａｃｏ−２への添加によって、その濃度に依存してＴＥＲが低下し、８０ｍＭ添加の３時間後では、エピラクトースまたはＤＦＡＩＩＩのいずれを添加した場合においても、ＴＥＲが５００Ω・ｃｍ２付近まで低下した。As a result, as shown in FIG. 8, the addition of epilactose or DFAIII to Caco-2 resulted in a decrease in TER depending on the concentration, and 3 hours after the addition of 80 mM, either epilactose or DFAIII was added. Even in this case, the TER decreased to around 500 Ω · cm 2 .

また、難消化性糖類の添加３時間後のＴＥＲを測定した後、各難消化性糖類を除去、培養培地に交換した。培地交換２４時間後のＴＥＲは、エピラクトース、ＤＦＡＩＩＩともに初期値である１２００〜１４００Ω・ｃｍ２に戻っていた。Moreover, after measuring TER 3 hours after the addition of the resistant saccharide, each resistant saccharide was removed and replaced with a culture medium. The TER after 24 hours of medium replacement returned to the initial value of 1200 to 1400 Ω · cm 2 for both epilactose and DFAIII.

このように、エピラクトースは、ＴＪについてのミネラル吸収促進作用を有するＤＦＡＩＩＩと同様の作用を示した。これらの結果は、エピラクトースがＣａ２＋を含むミネラル吸収促進作用を有する可能性を示すものである。Thus, epilactose showed the same action as DFAIII having a mineral absorption promoting action for TJ. These results indicate the possibility that epilactose has a mineral absorption promoting action including Ca 2+ .

［実施例８：ラットに対するミネラル吸収促進作用］
ラットにおけるエピラクトースのミネラル吸収促進作用を検討した。[Example 8: Effect of promoting mineral absorption on rats]
The effect of epilactose on mineral absorption in rats was examined.

（１）４週令のＷｉｓｔａｒ−ＳＴ系雄ラット（日本ＳＬＣ）をステンレスケージに個別に入れて飼育し、飼料および水（イオン交換水）を自由に摂取させた。毎朝同一時刻に体重および摂食量を計測した。動物個体の状態は、脱毛および／または下痢などを指標にして判定した。試験飼料は毎日、飲水は３日毎に交換した。なお、飼育室を、室温２３±１℃、温度６０％前後、明暗周期を１２時間（明期８：００〜２０：００、暗期２０：００〜８：００）に設定した。ＡＩＮ９３Ｇ標準精製飼料（基本食）で５日間飼育した後、表８に示す試験飼料（エピラクトース添加食、ラクトース添加食）またはコントロール食にて１５日間飼育した。 (1) Four-week-old Wistar-ST male rats (Japan SLC) were individually housed in stainless cages and allowed to freely feed and feed (ion-exchanged water). Body weight and food intake were measured every morning at the same time. The state of the animal individual was determined using hair loss and / or diarrhea as an index. The test feed was changed every day and the drinking water was changed every 3 days. The breeding room was set at a room temperature of 23 ± 1 ° C., a temperature of around 60%, and a light / dark cycle of 12 hours (light period 8:00 to 20:00, dark period 20:00 to 8:00). After raising for 5 days with AIN93G standard refined feed (basic diet), it was raised for 15 days with the test diet (food supplemented with epilactose or diet with lactose) shown in Table 8 or control diet.

飼育１２日目から４日間の糞を採集して凍結乾燥し、粉砕後、約１ｇを乾式灰化（５５０℃、１８時間）し、３％塩酸溶液に溶解後、原子吸光度法（偏光ゼーマン原子吸光度計、ＨＩＴＡＣＨＩ）により、ミネラルの測定を行った。飼料１ｇも同様の操作をおこなった。得られたミネラル量より、４日間のミネラルの吸収率を求めた。   Feces collected for 4 days from the 12th day of breeding, freeze-dried, pulverized, about 1 g was dry ashed (550 ° C., 18 hours), dissolved in 3% hydrochloric acid solution, and then subjected to atomic absorption spectrometry (polarized Zeeman atom) Minerals were measured with an absorptiometer (HITACHI). The same operation was performed on 1 g of feed. The absorption rate of the mineral for 4 days was calculated | required from the obtained mineral amount.

結果は、図９に示すとおり、エピラクトース摂取により、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋の吸収率が増加することが確認された。As a result, as shown in FIG. 9, it was confirmed that the absorption rate of Ca 2+ , Mg 2+ , and Zn 2+ increases by epilactose intake.

（２）１５日間の飼育終了後にラットを解剖して小腸を取り出し、生理食塩水で小腸内容物を洗い流した後、空腸と回腸にわけてそれぞれから約３ｃｍのセグメントを３つ作り、裏表を反転させた。反転したセグメントの片端を縫合絹糸（スペシャル縫合絹糸４号、ハシモト）で結紫した。他端は、内液（１２５ｍM ＮａＣｌ、４ｍM ＫＣｌ、１．２５ｍM ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３０ｍM Ｔｒｉｓ、１０ｍM Ｄ−グルコース、 ｐＨ７．４）０．７ｍＬをシリンジにより注入後、同様に結紫し、小腸反転サックを作成した。 (2) After 15 days of breeding, dissect the rat, remove the small intestine, wash away the small intestine contents with saline, create 3 segments of about 3 cm from the jejunum and ileum, and reverse the front and back I let you. One end of the inverted segment was ligated with a suture silk (special suture silk No. 4, Hashimoto). The other end was injected with 0.7 mL of internal solution (125 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.25 mM CaCl 2 .2H 2 O, 30 mM Tris, 10 mM D-glucose, pH 7.4) with a syringe, and then the same was congested and the small intestine inverted sac It was created.

作成した反転サックをＣａ２＋及びエピラクトースをそれぞれ０、５０、１００ ｍＭ含む外液（１２５ｍM ＮａＣｌ、４ｍM ＫＣｌ、１０ｍM ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、 ３０ｍM Ｔｒｉｓ、１０ｍM Ｄ−グルコース、 ｐＨ７．４、浸透圧はＮａＣｌ量で調整した）１５ｍＬの入った５０ｍＬ遠心チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、ウオーターバスにて３７℃、１１０ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ／ｍｉｎで振とうした。３０分間の振とう後、反転サック内の内液を回収し、Ｃａ２＋濃度を市販の測定キット（カルシウムＣテストワコー、和光純薬工業）にて測定した。また、小腸反転サックの長さを定規により測定した。その結果を図１０に示す。The prepared reverse sac is an external solution containing 0, 50, and 100 mM of Ca 2+ and epilactose (125 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM CaCl 2 .2H 2 O, 30 mM Tris, 10 mM D-glucose, pH 7.4, osmotic pressure is the amount of NaCl It was transferred to a 50 mL centrifuge tube (Corning) containing 15 mL, and shaken in a water bath at 37 ° C. and 110 oscillation / min. After shaking for 30 minutes, the internal solution in the inverted sack was collected, and the Ca 2+ concentration was measured with a commercially available measurement kit (Calcium C Test Wako, Wako Pure Chemical Industries). The length of the small intestine reversal sack was measured with a ruler. The result is shown in FIG.

図１０の縦軸は、サックに用いた小腸の長さ（ｃｍ）当たりのＣａ２＋吸収量で表した。エピラクトースの添加量に依存して、空腸、回腸ともに回収した内液中のＣａ２＋濃度が増加した。このことから、エピラクトースが大腸のみならず空腸および回腸においてもＣａ２＋吸収能を促進する機能を有していることが確認された。The vertical axis in FIG. 10 represents the amount of Ca 2+ absorbed per length (cm) of the small intestine used for the sac. Depending on the amount of epilactose added, the Ca 2+ concentration in the internal fluid collected in both jejunum and ileum increased. From this, it was confirmed that epilactose has a function of promoting Ca 2+ absorption ability not only in the large intestine but also in the jejunum and ileum.

〔実施例９：エピラクトースの腸内環境改善作用〕   [Example 9: Effect of epilactose on improving intestinal environment]

実施例８の条件下でラットを１５日間飼育した後、エーテル麻酔下に開腹した。盲腸の両端を縫合糸で結紫して内容物を含む盲腸を摘出し、総盲腸重量を測定した。盲腸内容物を取り出した後、盲腸壁重量を測定した。総盲腸重量から盲腸壁重量を減じた値を盲腸内容物重量とした。盲腸内容物の一部に４倍量の脱イオン水を加えて（５倍希釈）、氷冷下でホモジナイズした。ホモジネートの一部を遠心分離し、上清のｐＨを測定した。さらにホモジネートに内部標準としてクロトン酸を加え、遠心分離後、上層を採取、同量のクロロホルムを加え、混合、遠心分離し、再び上層を集め、フィルターを通したものを有機酸分析用のサンプルとし、島津高速液体クロマトグラフ有機酸分析システムを用い、下記の分離条件及び検出条件で分析を行った。   Rats were raised for 15 days under the conditions of Example 8 and then laparotomized under ether anesthesia. Both ends of the cecum were ligated with sutures, the cecum containing the contents was removed, and the total cecal weight was measured. After removing the cecal contents, the cecal wall weight was measured. The value obtained by subtracting the cecal wall weight from the total cecal weight was defined as the cecal content weight. A part of the cecum contents was added with 4 times amount of deionized water (diluted 5 times) and homogenized under ice cooling. A portion of the homogenate was centrifuged and the pH of the supernatant was measured. Add crotonic acid as an internal standard to the homogenate, centrifuge, collect the upper layer, add the same amount of chloroform, mix and centrifuge, collect the upper layer again, and pass through the filter as a sample for organic acid analysis. Using the Shimadzu high-performance liquid chromatograph organic acid analysis system, analysis was performed under the following separation conditions and detection conditions.

分離条件
カラム：Ｓｈｉｍｐａｋ ＳＣＲ−１０２Ｈ（８ｍｍ Ｉ．Ｄ. × ３００ｍｍ）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸水溶液
流量 ：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
温度 ：４０℃
検出条件
試薬 ：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸水溶液及び１００μＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ水溶液
流量 ：０．８ｍL／ｍｉｎ
検出器：ＣＤＤ−６Ａ
温度 ：４５℃Separation conditions Column: Shimpak SCR-102H (8 mm ID x 300 mm)
Mobile phase: 5 mM p-toluenesulfonic acid aqueous solution Flow rate: 0.8 mL / min
Temperature: 40 ° C
Detection conditions Reagent: 20 mM Bis-Tris aqueous solution containing 5 mM p-toluenesulfonic acid aqueous solution and 100 μM EDTA Flow rate: 0.8 mL / min
Detector: CDD-6A
Temperature: 45 ° C

また、盲腸内容物の一部を嫌気性希釈バッファー（２０ｇ／Ｌ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｐｅｐｔｏｎｅ ｗａｔｅｒ（Ｄｉｆｃｏ）、０．５ｇ／Ｌ―システイン（和光純薬工業）、１ｍＬ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ８０（和光純薬工業）、１ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ （Ｄｉｆｃｏ））に懸濁し、さらにこれを希釈バッファーで希釈した。総嫌気性菌数の計数には５０ｍＬ／Ｌのウマ脱繊維血（日本バイオテスト）を添加したＢＬ寒天培地（栄研化学）を、乳酸菌数の計数には８ｇ／ＬのＬａｂ ｌｅｍｃｏ ｐｏｗｄｅｒ（Ｏｘｏｉｄ）および１．３ｍＬ／Ｌの酢酸を添加したＬＢＳ ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）を用いた。盲腸内容物希釈液を塗布したプレートをアネロパックケンキ（三菱瓦斯化学）中、３７℃、２４時間培養した後に、コロニー数をカウントした。   In addition, a portion of the cecum contents was anaerobic dilution buffer (20 g / L Buffered petone water (Difco), 0.5 g / L-cysteine (Wako Pure Chemical Industries), 1 mL / L Tween 80 (Wako Pure Chemical Industries)), It was suspended in 1 g / L Bacto agar (Difco) and further diluted with a dilution buffer. To count the total number of anaerobic bacteria, BL agar medium (Eiken Chemical) supplemented with 50 mL / L of equine defibrinated blood (Nippon Biotest) was used. For counting the number of lactic acid bacteria, 8 g / L of Lab lemco powder (Oxoid). ) And 1.3 mL / L acetic acid added LBS agar (Difco). The plate coated with the cecal content dilution was cultured in Aneropackenki (Mitsubishi Gas Chemical) at 37 ° C. for 24 hours, and then the number of colonies was counted.

Ｆｅｃａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Kｉｔ（ＭＯ Ｂｉｏ）を用いて盲腸内容物の一部からＤＮＡを抽出した。Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ）を用いてビフィズス菌数をｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ法によって以下に示す条件で計数した。反応液の組成は２００ｎＭ ｇＢｉｆｉｆ−Ｆ、２００ｎＭ ｇＢｉｆｉｆ−Ｒ、1×ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）とし、初期変性９５℃、３０秒間の後、９５℃で５秒間、６４℃で１５秒間、７２℃で１５秒間の反応を４３サイクル行った。   DNA was extracted from a portion of the cecum contents using a Fecal DNA Isolation Kit (MO Bio). The number of bifidobacteria was counted by the realtime PCR method under the conditions shown below using Smart Cycler II (Cepheid). The composition of the reaction solution was 200 nM gBifif-F, 200 nM gBifif-R, 1 × SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio). Initial denaturation 95 ° C., 30 seconds, 95 ° C. for 5 seconds, 64 ° C. for 15 seconds, 72 43 cycles of reaction at 15 ° C. for 15 seconds were performed.

なお、統計解析には、Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、Ｐ値が０．０５以下の場合に、Ｄｕｎｃａｎ’ｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒａｎｇｅ Ｔｅｓｔを用いて平均値間の有意差を判定した。   For statistical analysis, One-way ANOVA was performed, and when the P value was 0.05 or less, a significant difference between the average values was determined using Duncan's Multiple Range Test.

総盲腸重量、盲腸壁重量、盲腸内容物重量と盲腸内容物のｐＨを表９に、盲腸内容物中の有機酸含有量を表１０に示す。   Table 9 shows the total cecal weight, cecal wall weight, cecal content weight, and pH of the cecal content, and Table 10 shows the organic acid content in the cecal content.

表９に示すように、エピラクトース添加飼料の摂取によって盲腸内容物重量、盲腸壁重量がコントロール食を摂取した群と比較して有意に増加した。盲腸内内容物の増加は排便回数の増加を意味しているので、エピラクトースは便秘の改善作用を有するものと期待される。   As shown in Table 9, the cecal content weight and cecal wall weight were significantly increased by ingestion of the epilactose-added feed compared to the group ingested the control diet. Since the increase in the content in the cecum means an increase in the number of defecations, epilactose is expected to have an effect of improving constipation.

また、表１０に示されるように、盲腸内容物中の有機酸量については、エピラクトース摂取群で短鎖脂肪酸量が有意に増加し、総短鎖脂肪酸量はコントロール群の3.2倍となった。さらに、コハク酸量はコントロール群の１２０倍となった。また有機酸量の増加に伴い、盲腸内容物中のｐＨはエピラクトース摂取群で低下した。   Moreover, as shown in Table 10, regarding the amount of organic acid in the cecum contents, the amount of short chain fatty acids was significantly increased in the epilactose intake group, and the total amount of short chain fatty acids was 3.2 times that in the control group. . Furthermore, the amount of succinic acid was 120 times that of the control group. As the amount of organic acid increased, the pH in the cecal contents decreased in the epilactose intake group.

盲腸内総嫌気性菌数（ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ内容物）は、コントロール食群９．４±０．２に対して、エピラクトース添加食群で１０．２±０．２と増加傾向を示した。乳酸菌数（ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ内容物）は、コントロール食群７．５±０．４に対して、エピラクトース添加食群で９．１±０．１となり、エピラクトース添加飼料摂取により１０倍程度増加した。さらに、ビフィズス菌数(ｌｏｇ１０ コピー数／ｇ内容物)は、コントロール食群５．６±０．３に対して、エピラクトース添加食群で７．８±０．３となり、エピラクトース添加飼料摂取により１５０倍程度増加した。   The total number of anaerobic bacteria in the cecum (log 10 CFU / g content) showed an increasing tendency to 10.2 ± 0.2 in the epilactose-added diet group compared to 9.4 ± 0.2 in the control diet group. . The number of lactic acid bacteria (log 10 CFU / g content) is 9.1 ± 0.1 in the epilactose-added food group compared to the control food group 7.5 ± 0.4, and is about 10 times as long as the epilactose-added feed is consumed Increased. Furthermore, the number of bifidobacteria (log 10 copy number / g content) was 7.8 ± 0.3 in the epilactose-added food group compared to 5.6 ± 0.3 in the control food group, and intake of the epilactose-added feed Increased about 150 times.

このように、ビフィズス菌や乳酸菌といった善玉菌がエピラクトース添加飼料により増加し、これらの菌によってエピラクトースの発酵が進んだものと結論され、エピラクトースのプレバイオティクスとしての有効性が示された。   In this way, it was concluded that good bacteria such as bifidobacteria and lactic acid bacteria increased with epilactose-added feed, and these bacteria promoted epilactose fermentation, indicating the effectiveness of epilactose as a prebiotic. .

［実施例１０：エピラクトースの脂質代謝改善作用］
4週令のＷｉｓｔａｒ−ＳＴ系雄ラット（日本ＳＬＣ）をステンレスケージに個別に入れて飼育し、飼料および水（イオン交換水）を自由に摂取させた。毎朝同一時刻に体重および摂食量を計測した。動物個体の状態は、脱毛および／または下痢などを指標にして判定した。試験飼料は毎日、飲水は３日毎に交換した。なお、飼育室を、室温２３±１℃、温度６０％前後、明暗周期を１２時間（明期８：００〜２０：００、暗期２０：００〜８：００）に設定した。ＡＩＮ９３Ｇ標準精製飼料（基本食）で５日間飼育した後、前記表８に示す試験飼料（エピラクトース添加食、ラクトース添加食）またはコントロール食にて１５日間飼育した。[Example 10: Lipid metabolism improving effect of epilactose]
Four-week-old Wistar-ST male rats (Japan SLC) were individually housed in stainless steel cages and allowed to freely feed and feed (ion-exchanged water). Body weight and food intake were measured every morning at the same time. The state of the animal individual was determined using hair loss and / or diarrhea as an index. The test feed was changed every day and the drinking water was changed every 3 days. The breeding room was set at a room temperature of 23 ± 1 ° C., a temperature of around 60%, and a light / dark cycle of 12 hours (light period 8:00 to 20:00, dark period 20:00 to 8:00). After raising for 5 days with the AIN93G standard purified feed (basic diet), it was raised for 15 days with the test diet (food supplemented with epilactose, diet with lactose added) or control diet shown in Table 8 above.

飼育開始日と７日後、１４日後に９時（摂食時）と２０時（絶食時）に尾静脈より採血を行い、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、血漿を回収し、中性脂質、総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、コリン型リン脂質を、それぞれＴＧ-ＥＮカイノス（（株）カイノス）、コレステロールＥテストワコー（和光純薬工業）、ＨＤＬ、コレステロールテストワコー（和光純薬工業、ＰＬ−ＥＮカイノス（（株）カイノス）を使用して測定した（図１１）。ＬＤＬ＋ＶＬＤＬコレステロールは、総コレステロール値よりＨＤＬコレステロール値を減算して求めた。また、１５日間の飼育終了後にラットを解剖して腹部大動脈血を採取し、４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、同様にして血漿中の中性脂質、総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、コリン型リン脂質を測定した（図１２）。なお統計解析には、Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、Ｐ値が０．０５以下の場合に、Ｄｕｎｃａｎ’ｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒａｎｇｅ Ｔｅｓｔを用いて平均値間の有意差を判定した。   Blood was collected from the tail vein at 9 o'clock (at the time of feeding) and 20:00 (at the time of fasting) after 7 days and 14 days after the start of the breeding, and centrifuged at 4 ° C, 3000 rpm for 10 minutes to collect plasma. Phospholipids, total cholesterol, HDL cholesterol, choline phospholipids, TG-EN Kanos (Kainos Co., Ltd.), Cholesterol E Test Wako (Wako Pure Chemical Industries), HDL, Cholesterol Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, PL) -Measured using EN-Kinos (Kinos Co., Ltd.) (Figure 11) LDL + VLDL cholesterol was determined by subtracting HDL cholesterol from total cholesterol, and rats were dissected after 15 days of breeding. Abdominal aorta blood was collected, centrifuged at 4 ° C., 3000 rpm, 10 minutes, and neutral lipid in plasma, total cholesterol , HDL cholesterol, and choline-type phospholipid were measured (Fig. 12.) One-way ANOVA was performed for statistical analysis, and Duncan's Multiple Range Test was used when the P value was 0.05 or less. The significant difference between the mean values was determined.

その結果、中性指質とリン脂質の濃度変化は確認されなかったが、総コレステロール値とＬＤＬ＋ＶＬＤＬコレステロール値は、エピラクトース添加食群においてコントロール群に比べ低下していることが確認された。   As a result, no changes in the concentrations of neutral finger and phospholipid were confirmed, but it was confirmed that the total cholesterol level and the LDL + VLDL cholesterol level were lower in the epilactose-added diet group than in the control group.

［実施例１１：エピラクトース摂食時の血糖値変化］
７週齢の雌性ｄｄＹマウス（日本ＳＬＣ、１群６匹）を一晩絶食後、ラクトースあるいはエピラクトース（各０．１ｍｍｏｌ／匹）を経口投与し、投与０、３０、６０、１２０分後に尾静脈より採血し、血糖値をグルコースＣＩＩテストワコーを用いて測定した。結果を図１３に示す。
図１３に示されるように、ラクトース投与群では投与後血糖値が有意に上昇し、投与３０分後に最高値を示す一方、エピラクトース投与群では血糖値の増加は認められなかった。本結果は、表７に示した消化性結果と合わせて、エピラクトースが低カロリー性を有することを示している。[Example 11: Change in blood glucose level during epilactose consumption]
Seven-week-old female ddY mice (Japan SLC, 6 mice per group) were fasted overnight and then orally administered with lactose or epilactose (each 0.1 mmol / animal), and tailed at 0, 30, 60, and 120 minutes after administration. Blood was collected from a vein and blood glucose level was measured using a glucose CII test Wako. The results are shown in FIG.
As shown in FIG. 13, the glucose level after administration significantly increased in the lactose administration group and showed the highest value 30 minutes after administration, while no increase in blood glucose level was observed in the epilactose administration group. This result, together with the digestibility results shown in Table 7, indicates that epilactose has low caloric properties.

ＣＥは、セロビオースの還元末端側グルコースの２位炭素原子に結合した水酸基の立体配置を転位し、グルコシルマンノースを導く反応を触媒するという点でアルドース１−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．３）およびマルトース１−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．２１）とは異なる。ＣＥは非常に独特な酵素活性を有しているため、酵素学的観点から非常に興味深い。しかしながら、ＣＥの酵素化学的諸性質の解明、ＣＥをコードする遺伝子（ＣＥ遺伝子）の取得、およびアミノ酸配列の解析は、これまで全くなされていなかった。   CE is an aldose 1-epimerase (EC 5.1.3.3) in that it rearranges the configuration of the hydroxyl group bonded to the 2-position carbon atom of glucose at the reducing end of cellobiose and catalyzes the reaction leading to glucosylmannose. And maltose 1-epimerase (EC 5.1.3.21). CE is very interesting from an enzymological point of view because it has a very unique enzymatic activity. However, elucidation of various enzyme chemical properties of CE, acquisition of a gene encoding CE (CE gene), and analysis of an amino acid sequence have never been performed.

本発明者らは、Ｒ．ａｌｂｕｓ ＮＥ１由来のＣＥを用いると、セロビオースを基質としてＧｌｃ−Ｍａｎを生成するが（図１）、さらにセロトリオースおよびセロテトラオースを２−エピマー化することを見出した（図４、図７）。さらに、特徴的なことにＣＥがラクトースを基質とした場合、エピラクトースを生成することも見出した（図２および５）。   We have described R.I. When CE derived from albus NE1 was used, Glc-Man was produced using cellobiose as a substrate (FIG. 1), and it was further found that cellotriose and cellotetraose were 2-epimerized (FIGS. 4 and 7). Furthermore, it has been found characteristically that when CE uses lactose as a substrate, it produces epilactose (FIGS. 2 and 5).

多くのオリゴ糖が生理活性機能を有することから、ＣＥの反応生成物であるエピラクトースにおいてもその機能性が期待される。しかしながら、現在のところ、その物理化学的特性や生理活性などは明らかにされておらず、産業的な利用には至っていない。エピラクトースの特性を明らかにするためには、実用的な大量合成法を確立する必要がある。   Since many oligosaccharides have a physiologically active function, the functionality is expected also in epilactose which is a reaction product of CE. However, at present, its physicochemical characteristics and physiological activity have not been clarified, and it has not been industrially used. In order to clarify the characteristics of epilactose, it is necessary to establish a practical mass synthesis method.

これまでに、高温、高圧条件下においてラクトースの異性化を誘導し、エピラクトースを合成することができることが報告されているが，夾雑物の混在が多いこともあり有効な製法ではない（Ｊ．Ｆ．Ｍｏｒｅｎｏら，（２００３） Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５１，１８９４）。   So far, it has been reported that isomerization of lactose can be induced under high temperature and high pressure conditions to synthesize epilactose, but it is not an effective production method because there are many contaminants (J. F. Moreno et al., (2003) J. Agric. Food Chem. 51, 1894).

また，ｐ−ニトロフェニルガラクトースおよびマンノースを基質に用いる、β−ガラクトシダーゼによる酵素的合成法によってもエピラクトースの生成は可能である（Ｍ．ＭｉｙａｍｏｔｏとＫ．Ａｊｉｓａｋａ（２００４） Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８，２０８６）。この製法は、結合位の異なるガラクトシルマンノースの生成も可能であり、その後の酵素処理によって目的生成物の単離を容易に行える点から、前述の製法よりも実用性は高い。しかしながら、基質にｐ−ニトロフェニルガラクトースを用いるために原価が高価となり、工業的製法としては不向きである。   Epilactose can also be produced by enzymatic synthesis with β-galactosidase using p-nitrophenylgalactose and mannose as substrates (M. Miyamoto and K. Ajisaka (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68). , 2086). This production method is capable of producing galactosyl mannose having different bonding positions, and is more practical than the above-described production method since the target product can be easily isolated by subsequent enzyme treatment. However, since p-nitrophenyl galactose is used as a substrate, the cost is high, which is not suitable for an industrial production method.

これらの製法に比べて、ＣＥによるエピラクトースの酵素的合成法は、基質が安価であること、反応条件が単純であることおよび夾雑物が少ないことから、実用性に富んだ合成法といえる。しかしながら、難培養性細菌であるＲ．ａｌｂｕｓを用いて本酵素を大量調製することは現実的に困難である。この点からも、ＣＥ遺伝子を単離し、組換え酵素を大量に取得することは非常に有効であると考えられる。さらに，Ｒ．ａｌｂｕｓにおけるＣＥの生理学的意義および代謝メカニズムなどが明らかとなっていないので、学術的にも多大な貢献をする。   Compared to these production methods, the enzymatic synthesis method of epilactose by CE can be said to be a highly practical synthesis method because the substrate is inexpensive, the reaction conditions are simple, and there are few impurities. However, R. is a difficult-to-culture bacterium. It is practically difficult to prepare a large amount of this enzyme using albus. Also from this point, it is considered to be very effective to isolate the CE gene and obtain a large amount of the recombinant enzyme. In addition, R.M. Since the physiological significance and metabolic mechanism of CE in albus has not been clarified, it also makes a great contribution academically.

本発明を用いれば、Ｇｌｃ−Ｍａｎ以外にも新規オリゴ糖を合成することができるので、食品分野において、機能性食材（例えば、ノンカロリーもしくは低カロリーの食品、またはミネラル（特にＣａ２＋など）吸収に優れた食品）を低価格で提供することができる。本発明を用いれば、血中コレステロールの減少を生じさせる食品または食品添加物などを開発することができるので、医薬／製薬の分野においても有用である。By using the present invention, it is possible to synthesize new oligosaccharides other than Glc-Man. Therefore, in the food field, functional foods (for example, non-caloric or low-calorie foods, or minerals (especially Ca 2+ etc.) absorption) Excellent food) at a low price. By using the present invention, it is possible to develop foods or food additives that cause a decrease in blood cholesterol, which is also useful in the pharmaceutical / pharmaceutical field.

本発明を用いれば、Ｇｌｃ−Ｍａｎなど新規オリゴ糖を合成するので、特にエピラクトースの場合は、食品分野において、機能性食材（例えば、腸内環境改善作用を有する食品、ノンカロリーもしくは低カロリーの食品、またはミネラル（特にＣａ２＋など）吸収に優れた食品）を低価格で提供することができる。また、本発明を用いれば、血中コレステロールの減少を生じさせる食品または食品添加物などを開発することができるので、医薬／製薬の分野においても有用である。According to the present invention, since a novel oligosaccharide such as Glc-Man is synthesized, particularly in the case of epilactose, in the food field, functional foods (for example, food having an intestinal environment improving effect, non-caloric or low-calorie) Foods or minerals (especially foods excellent in absorption of Ca 2+ ) can be provided at a low price. In addition, if the present invention is used, it is possible to develop foods or food additives that cause a decrease in blood cholesterol, which is also useful in the pharmaceutical / pharmaceutical field.

Claims (28)

（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失された、アミノ酸配列；または
（Ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と５１％以上の相同性を有するアミノ酸配列。A polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of (A) to (C), and having an epimerase activity for an oligosaccharide having at least a β-1,4 bond:
(A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(B) an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are substituted, added or deleted; or (C) 51% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence having homology. （Ａ）〜（Ｄ）に示される生物学的性状を有していることを特徴とするポリペプチド：（Ａ）ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌由来である；
（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの分子量が４０〜４２ｋＤａである；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列をＮ末端に有する；
（Ｄ）少なくともβ−１，４結合を有するオリゴ糖に対する２−エピメラーゼ活性を有する。(A) a polypeptide having the biological properties shown in (D): (A) derived from a bacterium of the genus Ruminococcus;
(B) Apparent molecular weight by SDS-PAGE is 40-42 kDa;
(C) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 at the N-terminus;
(D) It has 2-epimerase activity with respect to an oligosaccharide having at least a β-1,4 bond. 請求項１または２に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。   A polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1 or 2. （Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、オリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列中の１個もしくは数個のヌクレオチドが置換、付加もしくは欠失された、塩基配列；または
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、塩基配列。A polynucleotide comprising any one of the base sequences of (A) to (C), which encodes a polypeptide having epimerase activity for oligosaccharides:
(A) the base sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) a base sequence in which one or several nucleotides in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted, added or deleted; or (C) a complementary sequence and a string of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 A nucleotide sequence that hybridizes under gentle conditions. 請求項３または４に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とするベクター。   A vector comprising the polynucleotide according to claim 3 or 4. β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産する生産方法であって、請求項５に記載のベクターを用いることを特徴とする生産方法。   A production method for producing a polypeptide having epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond, wherein the vector according to claim 5 is used. β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産するためのキットであって、請求項５に記載のベクターを備えていることを特徴とするキット。   A kit for producing a polypeptide having an epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond, the kit comprising the vector according to claim 5. 請求項３または４に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする形質転換体。   A transformant comprising the polynucleotide according to claim 3 or 4. ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌であることを特徴とする請求項８に記載の形質転換体。   The transformant according to claim 8, wherein the transformant is a bacterium of the genus Ruminococcus. ルミノコッカス アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）であることを特徴とする請求項９に記載の形質転換体。   The transformant according to claim 9, wherein the transformant is Ruminococcus albus. β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産する生産方法であって、請求項８に記載の形質転換体を用いることを特徴とする生産方法。   A production method for producing a polypeptide having epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond, wherein the transformant according to claim 8 is used. β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産するためのキットであって、請求項８に記載の形質転換体を備えていることを特徴とするキット。   A kit for producing a polypeptide having epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond, the kit comprising the transformant according to claim 8. 請求項１または２に記載のポリペプチドと特異的に結合することを特徴とする抗体。   An antibody that specifically binds to the polypeptide according to claim 1 or 2. β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産する生産方法であって、請求項１３に記載の抗体を用いることを特徴とする生産方法。   A production method for producing a polypeptide having epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond, wherein the antibody according to claim 13 is used. β−１，４結合を有するオリゴ糖に対するエピメラーゼ活性を有するポリペプチドを生産するためのキットであって、請求項１３に記載の抗体を備えていることを特徴とするキット。   A kit for producing a polypeptide having epimerase activity for an oligosaccharide having a β-1,4 bond, the kit comprising the antibody according to claim 13. 請求項１または２に記載のポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖と反応させる工程を包含することを特徴とするヘテロオリゴ糖を合成する方法。   A method for synthesizing a hetero-oligosaccharide comprising the step of reacting the polypeptide according to claim 1 or 2 with an oligosaccharide having a β-1,4 bond. 請求項１または２に記載のポリペプチドを備えていることを特徴とするヘテロオリゴ糖を合成するための試薬キット。   A reagent kit for synthesizing a hetero-oligosaccharide comprising the polypeptide according to claim 1 or 2. β−１，４結合を有するオリゴ糖をさらに備えていることを特徴とする請求項１７に記載の試薬キット。   The reagent kit according to claim 17, further comprising an oligosaccharide having a β-1,4 bond. 請求項１または２に記載のポリペプチドを含んでいることを特徴とするヘテロオリゴ糖を合成するための試薬組成物。   A reagent composition for synthesizing a hetero-oligosaccharide comprising the polypeptide according to claim 1 or 2. 機能性食品を製造する方法であって、
請求項１または２に記載のポリペプチドを、β−１，４結合を有するオリゴ糖と反応させる工程；および
反応生成物を食品に添加する工程
を包含することを特徴とする方法。A method for producing a functional food,
A method comprising reacting the polypeptide according to claim 1 or 2 with an oligosaccharide having a β-1,4 bond; and adding a reaction product to food. ４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする腸内環境改善用機能性食品。   A functional food for improving the intestinal environment, comprising 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose. ビフィズス菌の増殖を促進することで腸内環境を改善するための、請求項２１に記載の機能性食品。   The functional food according to claim 21, which improves the intestinal environment by promoting the growth of bifidobacteria. ４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする脂質代謝改善用機能性食品。   A functional food for improving lipid metabolism, comprising 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose. 血中コレステロール量を減少させることで脂質代謝を改善するための、請求項２３に記載の機能性食品。   The functional food according to claim 23 for improving lipid metabolism by reducing blood cholesterol level. ４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とするミネラル吸収能促進用機能性食品。   A functional food for promoting mineral absorption, comprising 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose. ４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする糖尿病患者用機能性食品。   A functional food for diabetic patients, comprising 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose. ４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする低カロリー性低甘味料。   A low-calorie low-sweetener characterized by containing 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose. ４−O−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−マンノースを含有することを特徴とする便秘改善剤。   A constipation improving agent comprising 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-mannose.
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