JPWO2007097446A1 - Oligonucleic acid capping method - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、いわゆるキャッピング工程において、５’位水酸基を効率的にアシル化する方法を提供することにある。次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体の各リボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることを特徴とする、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体の製造方法。An object of the present invention is to provide a method for efficiently acylating a 5 'hydroxyl group in a so-called capping step. A phenoxyacetic acid derivative represented by the following general formula (11a) as an acylating agent in a capping step in which the 5′-position hydroxyl group of each ribose of the oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (2) is protected with an acyl group An oligonucleic acid represented by the following general formula (12), characterized in that an anhydride is used as an activator for the acylation reaction, a pyridine derivative represented by the following general formula (11b) or (11c): A method for producing a derivative.
Description
本発明は、オリゴ核酸の固相合成法におけるキャッピング工程に関するものである。 The present invention relates to a capping step in a solid phase synthesis method of oligonucleic acid.
オリゴ核酸を製造する方法として、固相合成法が一般に知られている（非特許文献１）。
固相合成法は、固相担体に担持されたオリゴ核酸誘導体とホスホロアミダイト化合物とをカップリングさせることによって、所望の鎖長のオリゴ核酸を製造する方法であるが、全ての固相担体に担持されたオリゴ核酸誘導体に対してホスホロアミダイト化合物が完全に反応するとは限らない。そこで、高純度のオリゴ核酸を固相合成法で製造するため、固相担体に担持された未反応であるオリゴ核酸誘導体の５’位水酸基を保護し、上記カップリング反応に関与しないようにする工程、いわゆるキャッピング工程を経由する必要がある。
キャッピング工程では、オリゴ核酸誘導体の５’位水酸基を保護するためのアシル化剤として酸無水物（例えば、無水酢酸、フェノキシ酢酸無水物）を、アシル化反応の活性化剤として、例えば、４−ジメチルアミノピリジン（以下、「４−ＤＭＡＰ」という。）やＮ−メチルイミダゾール（以下、「ＮＭＩ」という。）が一般に使用される。
しかし、アシル化反応の活性化剤として４−ＤＭＡＰを使用した場合には、核酸塩基であるグアニンと４−ＤＭＡＰとが反応し、グアニンが２，６−ジアミノプリン（以下、「２，６−ＤＡＰ」という。）へ変換されることが報告されている（非特許文献２）。
The solid-phase synthesis method is a method of producing an oligonucleic acid having a desired chain length by coupling an oligonucleic acid derivative supported on a solid-phase carrier and a phosphoramidite compound. The phosphoramidite compound does not always react completely with the supported oligonucleic acid derivative. Therefore, in order to produce a high-purity oligonucleic acid by the solid phase synthesis method, the 5′-position hydroxyl group of the unreacted oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier is protected so as not to participate in the coupling reaction. It is necessary to go through a process, a so-called capping process.
In the capping step, an acid anhydride (for example, acetic anhydride or phenoxyacetic anhydride) is used as an acylating agent for protecting the 5′-position hydroxyl group of the oligonucleic acid derivative, and an activator for the acylation reaction is, for example, 4- Dimethylaminopyridine (hereinafter referred to as “4-DMAP”) and N-methylimidazole (hereinafter referred to as “NMI”) are generally used.
However, when 4-DMAP is used as an activator for the acylation reaction, guanine, which is a nucleobase, reacts with 4-DMAP, and guanine is converted into 2,6-diaminopurine (hereinafter referred to as “2,6- (It is referred to as “DAP”) (non-patent document 2).
一方、ＮＭＩは、現在最も一般的に使用されているアシル化反応の活性化剤であるが、次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体につき、フェノキシ酢酸無水物と、ＮＭＩとを用いて、本発明者が、キャッピング工程を実施したところ、後述する試験例に示すように、満足できる効率で５’位水酸基にフェノキシアセチルが導入されず、その結果、高純度のオリゴ核酸を獲得するために、精製が煩雑になるという問題を見出した。
本発明の目的は、主として、いわゆるキャッピング工程において、リボースの５’位水酸基を効率的にアシル化する方法を提供することにある。On the other hand, NMI is the most commonly used activator of acylation reaction. However, for the oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (2), phenoxyacetic anhydride and NMI As shown in the test examples described later, the present inventor did not introduce phenoxyacetyl into the 5′-position hydroxyl group with satisfactory efficiency, and as a result, obtained a high purity oligonucleic acid. Therefore, the problem that purification becomes complicated was found.
An object of the present invention is to provide a method for efficiently acylating a 5′-hydroxyl group of ribose mainly in a so-called capping step.
本発明者は、鋭意検討した結果、次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることによって、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体を効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
各ＷＧ２は、電子吸引性基を表す。各Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は次の一般式（３）で表される置換基を表す。
Ｅは、アシル又は次の一般式（４）で表される置換基を表す。
Ｔは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ、上記一般式（３）で表される置換基又は上記一般式（４）で表される置換基を表す。但し、Ｅ又はＴのどちらか一方は、置換基（４）である。
Ｂｘに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシン、ウラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基を挙げることができる。
Ｂｘに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよく、なかでもアミノ基を有する核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシンは、アミノ基が保護されているのが好ましい。 かかる「アミノ基の保護基」としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレン等を挙げることができる。とりわけ、グアニンのアミノ基の保護基としては、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチルが好ましい。
ＢＸの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されている。
ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
ＢＸの修飾体に係る「アシル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜６のアルカノイル、炭素数７〜１３のアロイルを挙げることができる。具体的には、例えば、ホルミル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソプロピオニル、ｎ−ブチリル、イソブチリル、ｔｅｒｔ−ブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニル等を挙げることができる。
ＢＸの修飾体に係る「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜５のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル等を挙げることができる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されていてもよい。
ＢＸの修飾体における「アリールアルキル」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」の「アルキル」部分は、上記の「アルキル」と同じものを挙げることができる。
ＢＸの修飾体に係る「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜４のアルコキシを挙げることができる。具体的には、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等を挙げることができる。なかでも炭素数１〜３のものが好ましく、とりわけメトキシが好ましい。
ＢＸの修飾体に係る「アルコキシアルキル」の「アルコキシ」部分は、上記の「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
ＢＸの修飾体に係る「アリールアルキル」の「アリール」部分としては、例えば、炭素数６〜１２のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニル等を挙げることができる。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されていてもよい。
ＢＸの修飾体に係る「アルキル」、「アリール」の置換基である「ハロゲン」、「アルキル」及び「アルコキシ」としては、各々上記と同じものを挙げることができる。
ＷＧ１、ＷＧ２に係る「電子吸引性基」としては、例えば、シアノ、ニトロ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ハロゲンを挙げることができる。なかでも、シアノが好ましい。
ＷＧ１、ＷＧ２の「電子吸引性基」に係る「ハロゲン」としては、上記ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
ＷＧ１、ＷＧ２に係る「アルキルスルホニル」の「アルキル」部分は、上記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
ＷＧ１、ＷＧ２に係る「アリールスルホニル」の「アリール」部分は、上記ＢＸの修飾体に係る「アリールアルキル」の「アリール」部分と同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」又は「ジアルキルアミノ」は、前記ＢＸの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルコキシアルキルオキシ」、「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数２〜６のアルケニルを挙げることができる。具体的には、例えば、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−ペンテニル、１−ヘキセニル等を挙げることができる。
Ｒ４に係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数２〜４のアルキニルを挙げることができる。具体的には、例えば、エチニル、２−プロピニル、１−ブチニル等を挙げることができる。
Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃ、Ｒ６ｄ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ７ｃ、Ｒ７ｄに係る「アルキル」は、上記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３に係る「ハロゲン」は、上記ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
Ｅに係る「アシル」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アシル」と同じものを挙げることができる。
Ｔの「アシルオキシ」に係る「アシル」部分は、前記ＢＸの修飾体に係る「アシル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」としては、前記ＢＸの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルコキシアルキルオキシ」及び「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルケニル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルキニル」と同じものを挙げることができる。
Ｔに係る「アルキルアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」は保護されていてもよく、かかる保護基はアミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、例えば、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。特に、トリフルオロアセチルが好ましい。
リボースの５’位水酸基をキャッピングするための「アシル化剤」としては、例えば、上記式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を挙げることができる。例えば、フェノキシ酢酸無水物、４−イソプロピルフェノキシ酢酸無水物、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシ酢酸無水物、４−クロロフェノキシ酢酸無水物を挙げることができる。
上記アシル化剤による「アシル化反応の活性化剤」としては、例えば、ピリジン誘導体（１１ｂ）及び（１１ｃ）を挙げることができる。例えば、２−ジメチルアミノピリジン（２−ＤＭＡＰ）、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−4−ジメチルアミノピリジン、２，６−ジメチル−4−ジメチルアミノピリジンを挙げることができる。
また、本発明として、次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることによって、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程を含む、次の一般式（Ａ）で表されるオリゴ核酸（以下、「オリゴ核酸（Ａ）」という。）の製造方法を挙げることができる。
Ｂで表される核酸塩基としては特に限定されるものではなく、例えば、シトシン、ウラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基を挙げることができる。
Ｂの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、Ｂの「修飾体」に係る置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されている。
Ｂの修飾体に係る「ハロゲン」、「アシル」、「アルキル」、「アリールアルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「アミノ」、「モノアルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」としては、各々前記ＢＸの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」としては、前記ＢＸの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルコキシアルキルオキシ」及び「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルケニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルキニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒに係る「アルキルアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」は保護されていてもよく、かかる保護基はアミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、例えば、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。特に、トリフルオロアセチルが好ましい。As a result of intensive studies, the present inventor has shown that the following general formula (2) is used as an acylating agent in the capping step of protecting the 5′-position hydroxyl group of ribose of an oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (2) with an acyl group. By using the pyridine derivative represented by the following general formula (11b) or (11c) as the activator for the acylation reaction, the phenoxyacetic acid derivative anhydride represented by 11a) is used as the following general formula (12): It has been found that the oligonucleic acid derivative represented by the above can be efficiently produced, and the present invention has been completed.
Each WG 2 represents an electron withdrawing group. Each R 4 is independently H, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkenyloxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamino, alkynyloxy, alkynylthio, alkynylamino, dialkynylamino, It represents a substituent represented by alkoxyalkyloxy or the following general formula (3).
E represents acyl or a substituent represented by the following general formula (4).
T is H, acyloxy, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkenyloxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamino, alkynyloxy, alkynylthio, alkynylamino, dialkynylamino, alkoxyalkyloxy, the above The substituent represented by the general formula (3) or the substituent represented by the general formula (4) is represented. However, either E or T is a substituent (4).
The “nucleobase” related to Bx is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid synthesis, and examples thereof include pyrimidine bases such as cytosine, uracil and thymine, and purine bases such as adenine and guanine. .
The “nucleobase” according to Bx may be protected, and among them, a nucleic acid having an amino group, for example, adenine, guanine, and cytosine, preferably has an amino group protected. Such “amino-protecting group” is not particularly limited as long as it is used as a protecting group for nucleic acids. Specifically, for example, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, Examples thereof include phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, 4-isopropylphenoxyacetyl, (dimethylamino) methylene and the like. In particular, the protecting group for the amino group of guanine is preferably phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, or 4-isopropylphenoxyacetyl.
The "modified form" of B X, is a group nucleobases are substituted with any substituent, and examples of such substituents include, for example, halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, hydroxy, Mention may be made of amino, monoalkylamino, dialkylamino, carboxy, cyano, nitro, which are substituted 1 to 3 at any position.
According to modifications of B X "halogen" may include, for example, fluorine, chlorine, bromine, iodine.
According to modifications of B X "acyl" includes, for example, straight-chain or branched alkanoyl having 1 to 6 carbon atoms, may be mentioned aroyl of 7 to 13 carbon atoms. Specific examples include formyl, acetyl, n-propionyl, isopropionyl, n-butyryl, isobutyryl, tert-butyryl, valeryl, hexanoyl, benzoyl, naphthoyl, levulinyl and the like.
As "alkyl" of the modified form of B X, for example, a alkyl having 1 to 5 carbon atoms, straight-chain or branched. Specific examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl and the like. The alkyl may be substituted, and examples of the substituent include halogen, alkyl, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of these may be substituted at an arbitrary position.
"Alkyl" portion of "arylalkyl", "alkoxyalkyl", "monoalkylamino" and "dialkylamino" in the modified form of B X may include the same as the "alkyl" above.
According to modifications of B X as "alkoxy", for example, a straight-chain or branched alkoxy having 1 to 4 carbon atoms. Specific examples include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy and the like. Of these, those having 1 to 3 carbon atoms are preferred, and methoxy is particularly preferred.
According to modifications of B X "alkoxy" moiety of the "alkoxyalkyl", it may include the same as the "alkoxy" above.
According to modifications of B X as "aryl" portion of "arylalkyl" includes, for example, aryl having 6 to 12 carbon atoms. Specific examples include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, biphenyl, and the like. The aryl may be substituted, and examples of the substituent include halogen, alkyl, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of these may be substituted at any position.
According to modifications of B X "alkyl", as a substituent for the "aryl", "halogen", "alkyl" and "alkoxy" may each include the same as those described above.
Examples of the “electron withdrawing group” related to WG 1 and WG 2 include cyano, nitro, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, and halogen. Of these, cyano is preferred.
Of WG 1, WG 2 according to the "electron-withdrawing group" as the "halogen" may include the same as the "halogen" related to the modified form of the B X.
WG 1, according to the WG 2 "alkyl" moiety of "alkylsulfonyl" may include the same as the "alkyl" related to the modified form of the B X.
"Aryl" portion of the according to the WG 1, WG 2 "arylsulfonyl" may include the same as the "aryl" portion of "arylalkyl" related to the modified form of the B X.
According to R 4 "halogen", "alkoxy", "alkylamino" or "dialkylamino" may include the same as those according to the modifications of the B X.
According to R 4 "alkoxy alkyloxy", the "alkyl" moiety of the "alkylthio" may include the same as the "alkyl" related to the modified form of the B X.
According to R 4 as "alkoxy" and "alkoxyalkyl alkyloxy" may include the same as "alkoxy" related to the modified form of the B X.
Examples of the “alkenyl” moiety of “alkenyloxy”, “alkenylthio”, “alkenylamino” and “dialkenylamino” according to R 4 include, for example, linear or branched alkenyl having 2 to 6 carbon atoms. Can be mentioned. Specific examples include vinyl, allyl, 1-propenyl, isopropenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 1-pentenyl, 1-hexenyl and the like.
Examples of the “alkynyl” part of “alkynyloxy”, “alkynylthio”, “alkynylamino” and “dialkynylamino” according to R 4 include, for example, linear or branched alkynyl having 2 to 4 carbon atoms. Can be mentioned. Specific examples include ethynyl, 2-propynyl, 1-butynyl and the like.
R 51, R 52, R 53 , R 6a, R 6b, R 6c, R 6d, R 7a, R 7b, R 7c, according to R 7d "alkyl", according to the modifications of the B X "alkyl" The same thing can be mentioned.
According to R 51, R 52, R 53 "halogen" may include the same as the "halogen" related to the modified form of the B X.
According to E "acyl" may include the same "acyl" related to the modified form of the B X.
"Acyl" moiety of the "acyloxy" of T may include the same as the "acyl" related to the modified form of the B X.
According to T "halogen", as "alkoxy", "alkylamino" and "dialkylamino" may include the same as those according to the modifications of the B X.
According to T as an "alkyl" moiety of "alkoxyalkyloxy" and "alkylthio" may include the same as the "alkyl" related to the modified form of the B X.
According to T as "alkoxy" moiety of the "alkoxy alkyloxy" may include the same as "alkoxy" related to the modified form of the B X.
According to T "alkenyloxy", as the "alkenyl" moiety of "alkenylthio", "alkenylamino", "dialkenylamino amino" may include the same as "alkenyl" related to the R 4.
Examples of the “alkynyl” part of “alkynyloxy”, “alkynylthio”, “alkynylamino”, and “dialkynylamino” according to T include the same as “alkynyl” according to R 4 .
“Alkylamino”, “alkenylamino”, and “alkynylamino” according to T may be protected, and the protecting group is not particularly limited as long as it is used as a protecting group for an amino group. Fluoroacetyl, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, 4-isopropylphenoxyacetyl, (dimethylamino) methylene. In particular, trifluoroacetyl is preferred.
Examples of the “acylating agent” for capping the 5′-position hydroxyl group of ribose include phenoxyacetic acid derivative anhydrides represented by the above formula (11a). Examples thereof include phenoxyacetic anhydride, 4-isopropylphenoxyacetic anhydride, 4-tert-butylphenoxyacetic anhydride, and 4-chlorophenoxyacetic anhydride.
Examples of the “activator for acylation reaction” by the acylating agent include pyridine derivatives (11b) and (11c). Examples thereof include 2-dimethylaminopyridine (2-DMAP), 2,6-di-tert-butyl-4-dimethylaminopyridine, and 2,6-dimethyl-4-dimethylaminopyridine.
In the capping step of protecting the 5′-position hydroxyl group of ribose of the oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (2) with an acyl group, the present invention can be represented by the following general formula (11a) as an acylating agent. By using a pyridine derivative represented by the following general formula (11b) or (11c) as an activator of the acylation reaction, the phenoxyacetic acid derivative anhydride represented by the following general formula (12) The manufacturing method of the oligonucleic acid (henceforth "oligonucleic acid (A)") represented by the following general formula (A) including the process of manufacturing an oligonucleic acid derivative can be mentioned.
The nucleobase represented by B is not particularly limited, and examples thereof include pyrimidine bases such as cytosine, uracil and thymine, and purine bases such as adenine and guanine.
The “modified product” of B is a group in which the nucleobase is substituted with an arbitrary substituent. Examples of the substituents related to the “modified product” of B include, for example, halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy , Alkoxyalkyl, hydroxy, amino, monoalkylamino, dialkylamino, carboxy, cyano, nitro, which are substituted 1 to 3 at any position.
As the “halogen”, “acyl”, “alkyl”, “arylalkyl”, “alkoxy”, “alkoxyalkyl”, “amino”, “monoalkylamino” and “dialkylamino” related to the modified form of B, it can be cited the same as those according to the modifications of the B X.
According to R "halogen", as "alkoxy", "alkylamino" and "dialkylamino" may include the same as those according to the modifications of the B X.
According to R as "alkyl" portions of "alkoxy alkyloxy" and "alkylthio" may include the same as the "alkyl" related to the modified form of the B X.
According to R as "alkoxy" moiety of the "alkoxy alkyloxy" may include the same as "alkoxy" related to the modified form of the B X.
According to R "alkenyloxy", as the "alkenyl" moiety of "alkenylthio", "alkenylamino", "dialkenylamino amino" may include the same as "alkenyl" related to the R 4.
Examples of the “alkynyl” part of “alkynyloxy”, “alkynylthio”, “alkynylamino” and “dialkynylamino” according to R include the same “alkynyl” as the above-mentioned R 4 .
“Alkylamino”, “alkenylamino”, and “alkynylamino” according to R may be protected, and the protecting group is not particularly limited as long as it is used as a protecting group for an amino group. Fluoroacetyl, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, 4-isopropylphenoxyacetyl, (dimethylamino) methylene. In particular, trifluoroacetyl is preferred.
以下、本発明を詳細に説明する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
以下に示す製法において、原料が反応に影響を及ぼす置換基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ）を有する場合は、原料をあらかじめ公知の方法に従い、適当な保護基で保護した後に反応を行う。保護基は、最終的に、接触還元、アルカリ処理、酸処理などの公知の方法に従い保護基を脱離することができる。
In the production method shown below, when the raw material has a substituent (for example, hydroxy, amino, carboxy) that affects the reaction, the reaction is performed after protecting the raw material with an appropriate protective group in accordance with a known method in advance. The protecting group can finally be removed according to a known method such as catalytic reduction, alkali treatment, acid treatment or the like.
Ｉ．オリゴ核酸（Ａ）の製造方法
オリゴ核酸（Ａ）の製造方法について、以下に詳述する。
オリゴ核酸（Ａ）の製法は、公知の方法に従い行うことができるが、例えば、次に示す工程Ａ〜工程Ｈの操作を実施することにより、段階的に３’から５’の方向へ核酸モノマー化合物を縮合することにより行うことができる。
下記工程に使用されている化合物及び試薬は、オリゴ核酸の合成に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。また、既存の核酸合成試薬を用いた場合と同様、すべての工程をマニュアル又は市販のＤＮＡ自動合成機を用いて製造することができる。自動合成機で行うことにより操作法の簡便化、また合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。
I. Production method of oligonucleic acid (A) The production method of oligonucleic acid (A) is described in detail below.
The production method of the oligonucleic acid (A) can be carried out according to a known method. For example, by performing the operations of the following steps A to H, the nucleic acid monomer is stepwise from 3 ′ to 5 ′. This can be done by condensing the compounds.
The compounds and reagents used in the following steps are not particularly limited as long as they are generally used for oligonucleic acid synthesis. Further, as in the case of using an existing nucleic acid synthesis reagent, all the steps can be produced using a manual or a commercially available DNA automatic synthesizer. A method using an automatic synthesizer is desirable from the viewpoint of simplification of the operation method by using an automatic synthesizer and the accuracy of synthesis.
（１）工程Ａ：
次の一般式（１）で表される（オリゴ）核酸誘導体に酸を作用させることによって、５’位の水酸基の保護基を脱離して、次の一般式（２）で表される（オリゴ）核酸誘導体を製造する工程。
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３に係る「アルコキシ」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
本工程は、固相担体に担持されている次の一般式（６ａ）、（６ｂ）で表される核酸誘導体（ｎ＝１である核酸誘導体（１））、又は、工程Ａ〜工程Ｄの操作を行うことにより製造される固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（ｎ＝２〜１００であるオリゴ核酸誘導体（１））（以下、「固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体」という。）に酸を作用させることにより実施することができる。
Ｒ２、Ｒ４ａの「アシルオキシ」に係る「アシル」部分としては、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチルを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「ハロゲン」、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」としては、前記Ｂｘの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルコキシアルキルオキシ」及び「アルキルチオ」の「アルキル」部分としては、前記Ｂｘの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分としては、前記Ｂｘの修飾体に係る「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルケニルオキシ」、「アルケニルチオ」、「アルケニルアミノ」、「ジアルケニルアミノ」の「アルケニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルケニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アルキニルオキシ」、「アルキニルチオ」、「アルキニルアミノ」、「ジアルキニルアミノ」の「アルキニル」部分としては、前記Ｒ４に係る「アルキニル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ４ａに係る「アミノ」、「アルキルアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」は保護されていてもよく、かかる保護基はアミノ基の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、例えば、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。特に、トリフルオロアセチルが好ましい。
「固相担体」としては、例えば、定孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）、オキサリル化−定孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，１５２７（１９９１）を参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３４，３３７３（１９９３）を参照）、Ｐｏｒｏｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
「リンカー」としては、例えば、３−アミノプロピル、スクシニル、２，２’−ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（ＬＣＡＡ）を挙げることができる。
核酸誘導体（６ａ）、核酸誘導体（６ｂ）は、公知の方法に従い製造される又は市販品として入手できる固相担体に担持されている核酸誘導体であり、好ましい態様としては、例えば、次の一般式（７）、（８）で表される核酸化合物を挙げることができる。
Ｒ４が置換基（３）である核酸化合物（７）、（８）は、後述するホスホロアミダイト化合物（Ｂ）から公知の方法に従い製造することができる。
本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸を挙げることができる。本工程に使用しうる酸は、１〜５％の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、水又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、（オリゴ）核酸誘導体（１）の種類、使用する酸の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されている（オリゴ）核酸誘導体に対して０．８〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。
(1) Process A:
By reacting an acid with the (oligo) nucleic acid derivative represented by the following general formula (1), the protecting group for the hydroxyl group at the 5′-position is eliminated, and represented by the following general formula (2) (oligo) ) A step of producing a nucleic acid derivative.
According to R 11, R 12, R 13 as "alkoxy" may include the same as "alkoxy" related to the modified form of the B X.
In this step, the nucleic acid derivative represented by the following general formulas (6a) and (6b) supported on the solid phase carrier (the nucleic acid derivative (1) where n = 1), or the steps A to D Oligonucleic acid derivative (oligonucleic acid derivative (1) where n = 2 to 100) carried on a solid phase carrier produced by performing the operation (hereinafter referred to as “oligonucleic acid derivative carried on a solid phase carrier”) It can be carried out by allowing an acid to act on.
Examples of the “acyl” moiety related to “acyloxy” of R 2 and R 4a include acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, 4 Mention may be made of -isopropylphenoxyacetyl.
Examples of “halogen”, “alkoxy”, “alkylamino” and “dialkylamino” according to R 4a include the same as those related to the modified form of Bx.
Examples of the “alkyl” part of “alkoxyalkyloxy” and “alkylthio” according to R 4a include the same “alkyl” as the modified Bx.
Examples of the “alkoxy” part of the “alkoxyalkyloxy” according to R 4a include the same “alkoxy” as the modified Bx.
Examples of the “alkenyl” moiety of “alkenyloxy”, “alkenylthio”, “alkenylamino”, and “dialkenylamino” according to R 4a include the same “alkenyl” as the above R 4 .
Examples of the “alkynyl” part of “alkynyloxy”, “alkynylthio”, “alkynylamino”, and “dialkynylamino” according to R 4a include the same “alkynyl” as the above R 4 .
“Amino”, “alkylamino”, “alkenylamino” and “alkynylamino” according to R 4a may be protected, and the protecting group is not particularly limited as long as it is used as a protecting group for an amino group. Examples include trifluoroacetyl, benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, 4-isopropylphenoxyacetyl, and (dimethylamino) methylene. be able to. In particular, trifluoroacetyl is preferred.
As the “solid phase carrier”, for example, controlled pore glass (CPG), oxalylated-constant glass (see, for example, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527 (1991)), TentaGel Supports-aminopolyethylene glycol derivatized supports (see, for example, Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)), Poros-polystyrene / divinylbenzene copolymers.
Examples of the “linker” include 3-aminopropyl, succinyl, 2,2′-diethanolsulfonyl, and long chain alkylamino (LCAA).
The nucleic acid derivative (6a) and the nucleic acid derivative (6b) are nucleic acid derivatives produced according to known methods or supported on a solid phase carrier that can be obtained as a commercial product. Preferred embodiments include, for example, the following general formula: The nucleic acid compound represented by (7), (8) can be mentioned.
The nucleic acid compounds (7) and (8) in which R 4 is the substituent (3) can be produced from the phosphoramidite compound (B) described later according to a known method.
Examples of the “acid” that can be used in this step include trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, and trichloroacetic acid. The acid that can be used in this step can be used after diluting with an appropriate solvent so as to have a concentration of 1 to 5%. The solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, water, and any mixed solvent thereof. The reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C. The reaction time varies depending on the type of (oligo) nucleic acid derivative (1), the type of acid used, the reaction temperature, etc., but usually 1 minute to 1 hour is appropriate. The amount of the reagent to be used is suitably 0.8 to 100-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on the (oligo) nucleic acid derivative supported on the solid phase carrier.
（２）工程Ｂ：
工程Ａにおいて製造される（オリゴ）核酸誘導体（２）に、活性化剤を用いて核酸モノマー化合物を縮合させ、次の一般式（９）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程。
本工程は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に核酸モノマー化合物と活性化剤とを作用させることにより実施することができる。
「核酸モノマー化合物」としては、次の一般式（Ｂ）で表されるホスホロアミダイト化合物（以下、「ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）」という。）又は次の一般式（Ｃ）で表される核酸化合物を挙げることができる。
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、同一若しくは異なって、アルキルを表すか、又は、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂが隣接する窒素原子と一緒になって形成する、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。かかる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を１個有していてもよい。ＷＧ１、ＷＧ２は、それぞれ、電子吸引性基を表す。(2) Process B:
A step of producing an oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (9) by condensing a nucleic acid monomer compound with the activator to the (oligo) nucleic acid derivative (2) produced in the step A.
This step can be performed by causing a nucleic acid monomer compound and an activator to act on the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier.
The “nucleic acid monomer compound” is represented by the following general formula (B) phosphoramidite compound (hereinafter referred to as “phosphoramidite compound (B)”) or the following general formula (C). A nucleic acid compound can be mentioned.
R 2a and R 2b are the same or different and each represents alkyl, or represents a 5- to 6-membered saturated amino ring group formed by R 2a and R 2b together with the adjacent nitrogen atom. Such a saturated amino ring group may have one oxygen atom or sulfur atom as a ring constituent atom in addition to the nitrogen atom. WG 1 and WG 2 each represent an electron-withdrawing group.
Ｂｚに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシン、ウラシル等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基を挙げることができる。
ＢＹに係る「核酸塩基」としては、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシン、ウラシル、チミン等のピリミジン塩基、アデニン、グアニン等のプリン塩基を挙げることができる。
Ｂｚ、ＢＹに係る「核酸塩基」は、保護されていてもよく、なかでもアミノ基を有する核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシンは、アミノ基が保護されているのが好ましい。かかる「アミノ基の保護基」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アミノ基の保護基」と同じものを挙げることができる。
Ｂｚ、ＢＹの「修飾体」とは、核酸塩基が任意の置換基で置換されている基であり、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されている。
Ｂｚ、ＢＹの修飾体に係る「ハロゲン」、「アシル」、「アルキル」、「アリールアルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「モノアルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」としては、各々前記Ｂｘのそれらと同じものを挙げることができる。The “nucleobase” related to Bz is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid synthesis, and examples thereof include pyrimidine bases such as cytosine and uracil, and purine bases such as adenine and guanine.
The “nucleic acid base” according to BY is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid synthesis, and examples thereof include pyrimidine bases such as cytosine, uracil and thymine, and purine bases such as adenine and guanine. it can.
“Nucleobase” according to Bz and BY may be protected, and among them, nucleobase having an amino group, for example, adenine, guanine and cytosine, preferably have an amino group protected. Examples of the "protecting group of amino group" may include the same as the "protective group for amino group" related to the modified form of the B X.
The “modified product” of Bz and BY is a group in which a nucleobase is substituted with an arbitrary substituent. Examples of such a substituent include halogen, acyl, alkyl, arylalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, Mention may be made of hydroxy, amino, monoalkylamino, dialkylamino, carboxy, cyano, nitro, which are substituted 1 to 3 at any position.
The “halogen”, “acyl”, “alkyl”, “arylalkyl”, “alkoxy”, “alkoxyalkyl”, “monoalkylamino” and “dialkylamino” related to the modified Bz and BY are The same thing as those of Bx can be mentioned.
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂに係る「アルキル」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂに係る「５〜６員の飽和アミノ環基」としては、例えば、ピロリジン−１−イル、ピペリジン−１−イル、モルホリン−１−イル、チオモルホリン−１−イルを挙げることができる。
R 2a, according to R 2b as "alkyl" may include the same as the "alkyl" related to the modified form of the B X.
Examples of the “5- to 6-membered saturated amino ring group” according to R 2a and R 2b include pyrrolidin-1-yl, piperidin-1-yl, morpholin-1-yl, and thiomorpholin-1-yl. Can do.
「活性化剤」としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジクロロイミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジニウムトリフラート、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、２，４，６−コリジン／Ｎ−メチルイミダゾールを挙げることができる。
反応溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（以下、「ＴＨＦ」という。）を挙げることができる。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（２）の種類、使用する活性化剤の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して１〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。
Examples of the “activator” include 1H-tetrazole, 5-ethylthiotetrazole, 5-benzylmercapto-1H-tetrazole, 4,5-dichloroimidazole, 4,5-dicyanoimidazole, benzotriazole triflate, imidazole triflate, Mention may be made of pyridinium triflate, N, N-diisopropylethylamine, 2,4,6-collidine / N-methylimidazole.
The reaction solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and tetrahydrofuran (hereinafter referred to as “THF”). The reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C. The reaction time varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (2), the type of activator used, the reaction temperature, and the like, but usually 1 minute to 1 hour is appropriate. The amount of the reagent to be used is appropriately 1 to 100 times, preferably 1 to 10 times the molar amount of the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier.
ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）は、２’位の水酸基に中性条件下において脱離可能なエーテル型保護基を有するホスホロアミダイト化合物である。また、２’位の水酸基に導入された基が直鎖状の置換基であり、３’位の水酸基に結合するリン原子の周りにおける立体が混み合っていないため、従来から使用されているホスホロアミダイト化合物と比較して、オリゴＲＮＡを合成する際、非常に短時間に縮合反応が進行し、縮合収率がよいという特徴を有する。
The phosphoramidite compound (B) is a phosphoramidite compound having an ether-type protecting group that can be removed under a neutral condition at the 2′-position hydroxyl group. In addition, since the group introduced into the hydroxyl group at the 2′-position is a linear substituent and the three-dimensional structure around the phosphorus atom bonded to the hydroxyl group at the 3′-position is not crowded, the conventionally used phospho Compared to loamidite compounds, when synthesizing oligo RNA, the condensation reaction proceeds in a very short time and the condensation yield is good.
（３）工程Ｃ：
工程Ｂにおいて未反応である（オリゴ）核酸誘導体（２）のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることによって、次の一般式（１２）で表される（オリゴ）核酸誘導体を製造する工程。
本工程は、工程Ｂにおいて未反応である（オリゴ）核酸誘導体（２）の５’位水酸基を保護する反応であり、固相担体に担持されている未反応であるオリゴ核酸誘導体（２）にフェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）とアシル化反応の活性化剤（１１ｂ）又は（１１ｃ）と塩基とを作用させることにより実施することができる。
アシル化剤は、０．０５〜１Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。アシル化剤の使用量の使用量としては、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（２）の種類等によって異なるが、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（２）のモル量に対して０．８〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１０〜３０倍モル量である。
アシル化反応の活性化剤の使用量としては、フェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）のモル量に対して、０．８〜５０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。
また、必要であれば、本工程における副生成物であるフェノキシ酢酸誘導体を捕捉するために、フェノキシ酢酸誘導体の捕捉剤として、例えば、ピリジン、２，６−ルチジン，２，４，６−コリジン又はこれら任意の混合物を添加することができる。とりわけ、２，６−ルチジンが好ましい。塩基の使用量としては、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（２）の種類、フェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）等によって異なるが、フェノキシ酢酸誘導体無水物（１１ａ）のモル量に対して、０．８〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１〜２０倍モル量である。
反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、ＴＨＦ又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。上記工程における反応温度は、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（２）の種類、使用するアシル化剤の種類、使用するアシル化反応の活性化剤、塩基、反応温度等によって異なるが、通常１分〜３０分が適当である。
(3) Process C:
A phenoxyacetic acid derivative represented by the following general formula (11a) as an acylating agent in the capping step of protecting the 5′-position hydroxyl group of ribose of the (oligo) nucleic acid derivative (2) unreacted in step B with an acyl group (Oligo) nucleic acid derivative represented by the following general formula (12) by using an anhydride as a pyridine derivative represented by the following general formula (11b) or (11c) as an activator for the acylation reaction Manufacturing process.
This step is a reaction for protecting the 5′-position hydroxyl group of the (oligo) nucleic acid derivative (2) that has not been reacted in step B, and the unreacted oligonucleic acid derivative (2) carried on the solid phase carrier The reaction can be carried out by allowing the phenoxyacetic acid derivative anhydride (11a), the acylation reaction activator (11b) or (11c), and a base to act.
The acylating agent can be used by diluting with an appropriate solvent so as to have a concentration of 0.05 to 1M. The amount of the acylating agent used varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (2) supported on the solid support, but the molar amount of the oligonucleic acid derivative (2) supported on the solid support. The amount is 0.8 to 100 times the molar amount, preferably 10 to 30 times the molar amount.
The amount of the activator used for the acylation reaction is suitably 0.8 to 50 times, preferably 1 to 10 times the molar amount of the phenoxyacetic acid derivative anhydride (11a). is there.
Further, if necessary, in order to capture the phenoxyacetic acid derivative which is a by-product in this step, as a phenoxyacetic acid derivative capturing agent, for example, pyridine, 2,6-lutidine, 2,4,6-collidine or Any of these mixtures can be added. In particular, 2,6-lutidine is preferable. The amount of base used varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (2) supported on the solid phase carrier, phenoxyacetic acid derivative anhydride (11a), etc., but relative to the molar amount of phenoxyacetic acid derivative anhydride (11a). In addition, 0.8 to 100-fold molar amount is appropriate, and preferably 1 to 20-fold molar amount.
The solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, THF, and any mixed solvent thereof. As for the reaction temperature in the said process, 20 to 50 degreeC is preferable. The reaction time varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (2), the type of acylating agent used, the activator of the acylation reaction used, the base, the reaction temperature, etc., but usually 1 to 30 minutes is appropriate. .
（４）工程Ｄ：
工程Ｂにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（９）に酸化剤を作用させることによって亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程。
本工程は、３価のリンから５価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を作用させることにより実施することができる。
「リンを酸素で酸化する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを使用することができる。該酸化剤は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ピリジン、ＴＨＦ、水又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン―ＴＨＦあるいはヨウ素／ピリジン―酢酸や過酸化剤（ｔ−ブチルヒドロパーオキシド／メチレンクロリドなど）を用いることができる。
また、リンを硫黄で酸化する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド）、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＡＤＴＴ）を使用することができる。該酸化剤は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれら任意の混合溶媒が挙げられる。
反応温度は、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（９）の種類、使用する酸化剤の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分〜３０分が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して１〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１０〜５０倍モル量である。
(4) Process D:
A step of converting a phosphite group into a phosphate group or a thiophosphate group by allowing an oxidizing agent to act on the oligonucleic acid derivative (9) produced in Step B.
This step is a reaction for converting trivalent phosphorus to pentavalent phosphorus using an oxidizing agent, and can be carried out by allowing an oxidizing agent to act on an oligonucleic acid derivative supported on a solid phase carrier. .
“When phosphorus is oxidized with oxygen, iodine, tert-butyl hydroperoxide, for example, can be used as the“ oxidant ”. The oxidizing agent can be used after being diluted with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.05 to 2M. The solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include pyridine, THF, water, and any mixed solvent thereof. For example, iodine / water / pyridine-THF or iodine / pyridine-acetic acid or a peroxide (t-butyl hydroperoxide / methylene chloride, etc.) can be used.
When phosphorus is oxidized with sulfur, examples of the “oxidant” include sulfur, Beaucage reagent (3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide), 3-amino-1 2,4-dithiazole-5-thione (ADTT) can be used. The oxidizing agent can be used after being diluted with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.05 to 2M. The solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, pyridine, and any mixed solvent thereof.
The reaction temperature is preferably 20 ° C to 50 ° C. The reaction time varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (9), the type of oxidizing agent used, the reaction temperature, and the like, but usually 1 to 30 minutes is appropriate. The amount of the reagent to be used is appropriately 1 to 100-fold mol amount, preferably 10 to 50-fold mol amount based on the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier.
（５）工程Ｅ：
工程Ｄにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１３）を固相担体から切り出し、各核酸塩基部及び各リン酸基の保護基を脱離する工程。
切り出し工程は、所望の鎖長のオリゴＲＮＡを切り出し剤によって、固相担体及びリンカーから外す反応であり、所望の鎖長のオリゴ核酸誘導体が担持された固体担体に切り出し剤を添加することにより実施することができる。本工程において、核酸塩基部の保護基を脱離することができる。
「切り出し剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる。本工程に使用しうる「切り出し剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、ＴＨＦ又はこれら任意の混合溶媒で希釈して使用することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。
反応温度は、１５℃〜７５℃が適当であり、好ましくは１５℃〜３０℃であり、より好ましくは１８℃〜２５℃である。脱保護反応時間は、１０分〜３０時間が適当であり、好ましくは３０分〜２４時間であり、より好ましくは１〜４時間である。脱保護に使用される溶液中の水酸化アンモニウムの濃度は、２０〜３０重量％が適当であり、好ましくは２５〜３０重量％であり、より好ましくは２８〜３０重量％である。使用する試薬の量は、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体（１３）に対して１〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１０〜５０倍モル量である。
(5) Process E:
A step of cleaving the oligonucleic acid derivative (13) produced in Step D from the solid phase carrier and removing the protecting groups for each nucleobase and each phosphate group.
The cleaving step is a reaction in which oligo RNA having a desired chain length is removed from the solid phase carrier and linker by a cleaving agent, and is performed by adding a cleaving agent to a solid carrier carrying an oligonucleic acid derivative having a desired chain length. can do. In this step, the protecting group of the nucleobase can be removed.
Examples of the “cutting agent” include concentrated aqueous ammonia and methylamine. The “cleaving agent” that can be used in this step can be used after diluted with water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, THF, or any mixed solvent thereof. Of these, ethanol is preferred.
The reaction temperature is suitably 15 ° C to 75 ° C, preferably 15 ° C to 30 ° C, more preferably 18 ° C to 25 ° C. The deprotection reaction time is suitably 10 minutes to 30 hours, preferably 30 minutes to 24 hours, and more preferably 1 to 4 hours. The concentration of ammonium hydroxide in the solution used for deprotection is appropriately 20 to 30% by weight, preferably 25 to 30% by weight, and more preferably 28 to 30% by weight. The amount of the reagent to be used is suitably 1 to 100-fold mol amount, preferably 10 to 50-fold mol amount based on the oligonucleic acid derivative (13) supported on the solid phase carrier.
（６）工程Ｆ：
工程Ｅにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１４）に、各リボースの２’位水酸基の保護基を脱離するための試薬を作用させることによって、次の一般式（１５）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程。
本工程は、オリゴ核酸誘導体（１４）に２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬を作用させることにより実施することができる。２’位の水酸基の保護基を脱離する工程は、「２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬」として、例えば、テトラブチルアンモニウムフロリド、トリエチルアミントリハイドロフロリドを作用させることにより行うことができる。使用する「２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬」の量は除去される保護基に対して１〜５００倍モル量が適当であり、好ましくは５〜１０倍モル量である。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ＴＨＦ、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、ジメチルスルホキシド又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。反応溶媒の使用量は、「２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬」に対して、０．８〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、２０℃〜８０℃が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（１４）の種類、使用する２’位の水酸基の保護基を脱離する試薬の種類、反応温度等によって異なるが、通常１時間〜１００時間が適当である。
また、必要であれば、本工程における副生成物であるアクリロニトリルを捕捉するために、アクリロニトリルの捕捉剤として、例えば、ニトロアルカン、アルキルアミン、アミジン、チオール、チオール誘導体又はこれら任意の混合物を添加することができる。「ニトロアルカン」としては、直鎖状の炭素数１〜６のニトロアルカンを挙げることができる。具体的には、例えば、ニトロメタン等を挙げることができる。例えば、「アルキルアミン」としては、例えば、直鎖状の炭素数１〜６のアルキルアミンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ペンチルアミン、ｎ−ヘキシルアミンを挙げることができる。「アミジン」としては、例えば、ベンズアミジン、ホルムアミジンを挙げることができる。「チオール」としては、例えば、直鎖状の炭素数１〜６のチオールを挙げることができる。具体的には、例えば、メタンチオール、エタンチオール、１−プロパンチオール、１−ブタンチオール、１−ペンタンチオール、１−ヘキサンチオールを挙げることができる。「チオール誘導体」としては、例えば、同一又は異なる直鎖状の炭素数１〜６のアルキルチオール基を有するアルコール又はエーテルを挙げることができる。具体的には、例えば、２−メルカプトエタノール、４−メルカプト−１−ブタノール、６−メルカプト−１−ヘキサノール、メルカプトメチルエーテル、２−メルカプトエチルエーテル、３−メルカプトプロピルエーテル、４−メルカプトブチルエーテル、５−メルカプトペンチルエーテル、６−メルカプトヘキシルエーテルを挙げることができる。
「アクリロニトリルの捕捉剤」の使用量としては、オリゴ核酸誘導体（１４）の種類等によって異なるが、オリゴ核酸誘導体（１４）の各リボースの２’位水酸基を保護している２−シアノエトキシメチルに対して、０．８〜５００倍モル量が適当であり、好ましくは1〜１０倍モル量である。
(6) Process F:
An oligonucleic acid represented by the following general formula (15) is allowed to act on the oligonucleic acid derivative (14) produced in step E by acting a reagent for removing the protecting group for the 2′-position hydroxyl group of each ribose. Producing a derivative;
This step can be performed by causing a reagent that removes the protecting group for the 2′-position hydroxyl group to act on the oligonucleic acid derivative (14). The step of removing the protecting group at the 2′-position hydroxyl group is performed by, for example, acting tetrabutylammonium fluoride or triethylamine trihydrofluoride as a “reagent for removing the protecting group at the 2′-position hydroxyl group”. It can be carried out. The amount of the “reagent for removing the protecting group for the hydroxyl group at the 2′-position” to be used is appropriately 1 to 500 times, preferably 5 to 10 times the amount of the protecting group to be removed. The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include THF, N-methylpyrrolidone, pyridine, dimethyl sulfoxide, and any mixed solvent thereof. The amount of the reaction solvent used is suitably 0.8 to 100-fold molar amount, preferably 1 to 10-fold molar amount with respect to the “reagent for removing the protecting group at the 2′-position hydroxyl group”. The reaction temperature is preferably 20 ° C to 80 ° C. The reaction time varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (14), the type of reagent for removing the protecting group of the 2′-position hydroxyl group used, the reaction temperature, etc., but usually 1 hour to 100 hours is appropriate.
If necessary, for example, nitroalkane, alkylamine, amidine, thiol, thiol derivative, or any mixture thereof is added as an acrylonitrile scavenger to capture acrylonitrile as a by-product in this step. be able to. Examples of the “nitroalkane” include linear nitroalkanes having 1 to 6 carbon atoms. Specifically, nitromethane etc. can be mentioned, for example. For example, examples of the “alkylamine” include linear alkylamines having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methylamine, ethylamine, n-propylamine, n-butylamine, n-pentylamine, and n-hexylamine. Examples of “amidine” include benzamidine and formamidine. Examples of the “thiol” include linear thiols having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methanethiol, ethanethiol, 1-propanethiol, 1-butanethiol, 1-pentanethiol, and 1-hexanethiol. Examples of the “thiol derivative” include alcohols or ethers having the same or different linear alkyl thiol group having 1 to 6 carbon atoms. Specifically, for example, 2-mercaptoethanol, 4-mercapto-1-butanol, 6-mercapto-1-hexanol, mercaptomethyl ether, 2-mercaptoethyl ether, 3-mercaptopropyl ether, 4-mercaptobutyl ether, 5 -Mercaptopentyl ether and 6-mercaptohexyl ether can be mentioned.
The amount of the “acrylonitrile scavenger” used varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (14) and the like, but 2-cyanoethoxymethyl protecting the 2′-position hydroxyl group of each ribose of the oligonucleic acid derivative (14) is used. On the other hand, 0.8-500 times mole amount is suitable, Preferably it is 1-10 times mole amount.
（７）工程Ｇ：
オリゴ核酸誘導体（１５）の５’位の水酸基を脱離する工程。
本工程は、最終的にオリゴ核酸誘導体（１５）の５’位水酸基の保護基を脱離する反応であり、固体担体から切り出されたオリゴＲＮＡに酸を作用させることにより実施することができる。
本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸を挙げることができる。本工程に使用しうる酸は、適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、水、ｐＨが２〜５の緩衝液又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液を挙げることができる。上記反応における反応温度は、２０℃〜５０℃が好ましい。反応時間は、オリゴ核酸誘導体（１５）の種類、使用する酸の種類、反応温度等によって異なるが、通常１分〜１時間が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に対して０．８〜１００倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。
(7) Process G:
Removing the 5′-position hydroxyl group of the oligonucleic acid derivative (15).
This step is a reaction that finally eliminates the protecting group for the 5′-position hydroxyl group of the oligonucleic acid derivative (15), and can be carried out by allowing an acid to act on the oligo RNA cleaved from the solid support.
Examples of the “acid” that can be used in this step include trichloroacetic acid, dichloroacetic acid, and acetic acid. The acid that can be used in this step can be diluted with an appropriate solvent. The solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, water, a buffer solution having a pH of 2 to 5, or any mixed solvent thereof. Examples of the buffer solution include an acetate buffer solution. The reaction temperature in the above reaction is preferably 20 ° C to 50 ° C. The reaction time varies depending on the type of oligonucleic acid derivative (15), the type of acid used, the reaction temperature, etc., but usually 1 minute to 1 hour is appropriate. The amount of the reagent to be used is suitably 0.8 to 100 times, preferably 1 to 10 times the molar amount of the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier.
（８）工程Ｈ：
工程Ｇにおいて製造されるオリゴ核酸（Ａ）を分離精製する工程。
「分離精製工程」とは、上記反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、Ｃ８からＣ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、Ｃ８からＣ１８逆相カートリッジカラム、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより、所望のオリゴＲＮＡを単離精製する工程である。
「溶出溶媒」としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、水の単独溶媒もしくは任意の比率の混合溶媒を挙げることができる。この場合添加物として、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、トリス塩酸、エチレンジアミン四酢酸を１ｍＭ〜２Ｍの濃度で添加し、溶液のｐＨを１〜９の範囲で調整することもできる。
(8) Process H:
A step of separating and purifying the oligonucleic acid (A) produced in the step G.
The “separation and purification step” refers to the usual separation and purification means from the above reaction mixture, for example, extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugation, recrystallization, C 8 to C 18 reverse phase column chromatography, C 8 By using means such as C18 reverse phase cartridge column, cation exchange column chromatography, anion exchange column chromatography, gel filtration column chromatography, high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, etc. alone or in combination, the desired This is a step of isolating and purifying oligo RNA.
Examples of the “elution solvent” include acetonitrile, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, water alone, or a mixed solvent of any ratio. In this case, for example, sodium phosphate, potassium phosphate, sodium chloride, potassium chloride, ammonium acetate, triethylammonium acetate, sodium acetate, potassium acetate, tris hydrochloric acid, ethylenediaminetetraacetic acid are added at a concentration of 1 mM to 2 M. The pH of the solution can be adjusted in the range of 1-9.
工程Ａ〜工程Ｄの操作を繰り返すことにより、所望の鎖長のオリゴ核酸（Ａ）を製造することができる。
また、上記オリゴ核酸の製造方法の工程Ｂにおいて、核酸モノマー化合物として少なくとも１回はホスホロアミダイト化合物（Ｂ）を用いることによって、各Ｒのうち少なくとも１つが水酸基であるオリゴ核酸（Ａ）を製造することができる。さらに、上記オリゴ核酸の製造方法の工程Ｂにおいて、核酸モノマー化合物として、全てホスホロアミダイト化合物（Ｂ）を用いることによって、各Ｒが全てＯＨであるオリゴ核酸（Ａ）を製造することができる。
ＩＩ．ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）の製法
ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）は、次のようにして製造することができる。
以下に示す製法において、原料が反応に影響を及ぼす置換基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ）を有する場合は、原料をあらかじめ公知の方法に従い、適当な保護基で保護した後に反応を行うことが一般的である。保護基は、反応後に、接触還元、アルカリ処理、酸処理などの公知の方法に従い保護基を脱離することができる。
ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）は、公知化合物又は容易に製造可能な中間体から、例えば、次の工程ａ〜工程ｈの操作を実施することにより製造することができる。
以下、詳細に説明する。By repeating the operations of Step A to Step D, an oligonucleic acid (A) having a desired chain length can be produced.
Further, in step B of the oligonucleic acid production method, at least one phosphoramidite compound (B) is used as the nucleic acid monomer compound to produce an oligonucleic acid (A) in which at least one of each R is a hydroxyl group. can do. Furthermore, in step B of the above oligonucleic acid production method, an oligonucleic acid (A) in which each R is all OH can be produced by using all phosphoramidite compounds (B) as nucleic acid monomer compounds.
II. Production Method of Phosphoramidite Compound (B) The phosphoramidite compound (B) can be produced as follows.
In the production method shown below, when the raw material has a substituent that affects the reaction (for example, hydroxy, amino, carboxy), the reaction may be performed after protecting the raw material with an appropriate protecting group in accordance with a known method in advance. It is common. The protecting group can be removed after the reaction according to a known method such as catalytic reduction, alkali treatment, acid treatment or the like.
The phosphoramidite compound (B) can be produced from a known compound or an easily manufacturable intermediate by carrying out the operations of the following steps a to h, for example.
Details will be described below.
（１）工程ａ：
次の一般式（１６）で表されるリボ核酸誘導体にアルキル化試薬を作用させることによって、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を２’位の水酸基に導入する、次の一般式（１７）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
「アルキル化試薬」として、例えば、次の一般式（１８）で表されるエーテル化合物を挙げることができる。
Ｌに係る「ハロゲン」、「アリールチオ基」の「アリール」、「アルキルスルホキシド基」及び「アルキルチオ基」の「アルキル」としては、前記ＢＸの修飾体に係るそれらと同じものを挙げることができる。
エーテル化合物（１８）の具体例としては、次の１．〜２．の化合物を挙げることができる。
１．クロロメチル ２−シアノエチルエーテル
２．２−シアノエチル メチルチオメチルエーテル
エーテル化合物（１８）は、中性条件下において脱離可能なエーテル型置換基を、２’位の水酸基に塩基性条件下において導入することができる新規なアルキル化試薬であり、ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）を製造するための試薬として有用である。
(1) Step a:
An ether-type protecting group that is eliminated under neutral conditions is introduced into the hydroxyl group at the 2 ′ position by allowing an alkylating reagent to act on the ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (16): A step of producing a ribonucleic acid derivative represented by (17).
Examples of the “alkylating reagent” include ether compounds represented by the following general formula (18).
According to L "halogen", "aryl" of the "arylthio group", the "alkyl" of the "alkylsulfoxide group" and "alkylthio group" may include the same as those according to the modifications of the B X .
Specific examples of the ether compound (18) include the following 1. ~ 2. Can be mentioned.
1. Chloromethyl 2-cyanoethyl ether 2.2-cyanoethyl methylthiomethyl ether In ether compound (18), an ether-type substituent that can be eliminated under neutral conditions is introduced into the hydroxyl group at the 2′-position under basic conditions. And is useful as a reagent for producing the phosphoramidite compound (B).
エーテル化合物（１８）は、次に示す工程１〜工程４を実施することにより製造することができる。
工程１：
次の一般式（１９）で表されるアルコール化合物をアルキルチオメチル化し、次の一般式（２０）で表される化合物を製造する工程。
化合物（２０）は、Ｌがアルキルチオ基であるエーテル化合物（１８）である。
Ｒ３に係る「アルキル」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アルキル」と同じものを挙げることができる。
Ｒ３がメチルである場合、アルキルチオメチル化試薬としては、例えば、ジメチルスルホキシド、無水酢酸及び酢酸の混合溶液を挙げることができる。「ジメチルスルホキシド」の使用量は、化合物（１９）のモル量に対して、１０〜２００倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。「酢酸」の使用量は、化合物（１９）のモル量に対して、１０〜１５０倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。「無水酢酸」の使用量は、化合物（１９）のモル量に対して、１０〜１５０倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。反応温度は、０℃〜１００℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１〜４８時間が適当である。
工程２：
化合物（２０）をハロゲン化し、次の一般式（２１）で表される化合物を製造する工程。
化合物（２１）は、エーテル化合物（１８）におけるＬがハロゲンである化合物である。
Ｘ２に係る「ハロゲン」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法（例えば、Ｔ．Ｂｅｎｎｅｃｈｅら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ７６２（１９８３））により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系炭化水素を挙げることができる。ハロゲン化試薬としては、例えば、塩化スルフリル、オキシ塩化リンを挙げることができる。「ハロゲン化試薬」の使用量は、化合物（２０）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１００℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
工程３：
化合物（２１）をアリールチオ化し、次の一般式（２２）で表される化合物を製造する工程。
化合物（２２）は、エーテル化合物（１８）におけるＬがアリールチオ基である化合物である。
Ｒ３ａに係る「アリール」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「アリール」と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリルを挙げることができる。アリールチオ化試薬としては、例えば、チオフェノール、４−メチルベンゼンチオールを挙げることができる。「アリールチオ化試薬」の使用量は、化合物（２１）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜５倍モル量である。反応温度は、０℃〜１００℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１〜４８時間が適当である。
工程４：
化合物（２０）を酸化し、次の一般式（２３）で表される化合物を製造する工程。
化合物（２３）は、エーテル化合物（１８）におけるＬがアルキルスルホキシド基である化合物である。
Ｒ３に係る「アルキル」としては、ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）における「アルキル」と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法により実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、メタノールを挙げることができる。酸化剤としては、例えば、メタクロロ過安息香酸、メタ過ヨウ素酸塩、過酸化水素を挙げることができる。「酸化剤」の使用量は、化合物（２０）のモル量に対して、０．８〜１０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜２倍モル量である。反応温度は、０℃〜１００℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１〜４８時間が適当である。
The ether compound (18) can be produced by performing the following steps 1 to 4.
Step 1:
A step of alkylating an alcohol compound represented by the following general formula (19) to produce a compound represented by the following general formula (20).
Compound (20) is an ether compound (18) in which L is an alkylthio group.
According to R 3 as "alkyl" may include the same as the "alkyl" related to the modified form of the B X.
When R 3 is methyl, examples of the alkylthiomethylating reagent include a mixed solution of dimethyl sulfoxide, acetic anhydride and acetic acid. The amount of “dimethyl sulfoxide” used is suitably 10 to 200 times the molar amount, preferably 20 to 100 times the molar amount of the compound (19). The amount of “acetic acid” used is suitably 10 to 150 times the molar amount, preferably 20 to 100 times the molar amount of the compound (19). The amount of “acetic anhydride” used is suitably 10 to 150 times the molar amount, preferably 20 to 100 times the molar amount of the compound (19). The reaction temperature is suitably from 0 ° C to 100 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, and the like, but is usually 1 to 48 hours.
Step 2:
A step of producing a compound represented by the following general formula (21) by halogenating the compound (20).
The compound (21) is a compound in which L in the ether compound (18) is a halogen.
According to X 2 "halogen" may include the same as "halogen" related to the modified form of the B X.
This step can be performed by a known method (for example, T. Benneche et al., Synthesis 762 (1983)). The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include halogen-based hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, and 1,2-dichloroethane. Examples of the halogenating reagent include sulfuryl chloride and phosphorus oxychloride. The amount of the “halogenating reagent” to be used is suitably 0.8 to 20 times, preferably 1 to 10 times the amount of the compound (20). The reaction temperature is suitably from 0 ° C to 100 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
Step 3:
A step of producing a compound represented by the following general formula (22) by arylthiolating the compound (21).
Compound (22) is a compound in which L in the ether compound (18) is an arylthio group.
According to R 3a as "aryl" may include the same as the "aryl" related to the modified form of the B X.
This step can be performed by a known method. The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane and acetonitrile. Examples of the arylthiolation reagent include thiophenol and 4-methylbenzenethiol. The amount of the “arylthiolation reagent” to be used is suitably 0.8 to 20 times, preferably 1 to 5 times the amount of the compound (21). The reaction temperature is suitably from 0 ° C to 100 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, and the like, but is usually 1 to 48 hours.
Step 4:
A step of oxidizing the compound (20) to produce a compound represented by the following general formula (23).
The compound (23) is a compound in which L in the ether compound (18) is an alkyl sulfoxide group.
Examples of the “alkyl” related to R 3 include the same “alkyl” in the phosphoramidite compound (B).
This step can be performed by a known method. The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, chloroform, and methanol. Examples of the oxidizing agent include metachloroperbenzoic acid, metaperiodate, and hydrogen peroxide. The amount of the “oxidant” used is suitably 0.8 to 10 times the molar amount, preferably 1 to 2 times the molar amount of the compound (20). The reaction temperature is suitably from 0 ° C to 100 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw material used, reaction temperature, and the like, but is usually 1 to 48 hours.
「アルキル化試薬」として、化合物（２１）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（１６）にアルキル化試薬と塩基とを作用させることにより実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系炭化水素を挙げることができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。本工程において、必要に応じて、化合物（１６）に金属試薬と塩基を作用させ製造される中間体を経由した後、アルキル化試薬を作用させることもできる。かかる「金属試薬」として、例えば、二塩化ジブチルスズを挙げることができる。「金属試薬」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。「塩基」としては、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンなどの有機塩基を挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
When compound (21) is used as the “alkylating reagent”, it can be carried out as follows.
This step can be performed by reacting an alkylating reagent and a base with compound (16), which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature, according to a known method. The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include halogen-based hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, and 1,2-dichloroethane. The amount of the “alkylating reagent” to be used is appropriately 0.8 to 20 times, preferably 1 to 10 times the amount of the compound (16). In this step, if necessary, an alkylating reagent can be allowed to act on the compound (16) via an intermediate produced by reacting a metal reagent and a base. Examples of such “metal reagent” include dibutyltin dichloride. The amount of the “metal reagent” to be used is suitably 0.8 to 20 times, preferably 1 to 10 times the amount of the compound (16). Examples of the “base” include pyridine, 2,6-dimethylpyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, N-methylimidazole, triethylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine, 1,8-diazabicyclo [5.4. And organic bases such as .0] -7-undecene. The amount of the “base” used is suitably 0.8 to 20 times the molar amount, preferably 1 to 10 times the molar amount of the molar amount of the compound (16). The reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
「アルキル化試薬」として、化合物（２０）又は化合物（２２）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法（例えば、Ｍ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３１，２３８５（１９９０））に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（１６）に、アルキル化試薬と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜５倍モル量が適当であり、好ましくは１〜３倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを挙げることができる。「酸」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ＴＨＦ、アセトニトリル又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。本工程において使用する「硫黄原子に対するハロゲン化剤」として、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）を挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜１０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜５倍モル量である。反応温度は、−７８℃〜３０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分〜５時間が適当である。
When compound (20) or compound (22) is used as the “alkylating reagent”, it can be carried out as follows.
This step is carried out according to a known method (for example, M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 (1990)). It can be carried out by reacting a oxidant, an acid and a halogenating agent for the sulfur atom. The amount of the “alkylating reagent” to be used is appropriately 0.8 to 5 times, preferably 1 to 3 times the amount of the compound (16). Examples of the “acid” include trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate, and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate. The amount of the “acid” used is suitably 0.01 to 20 times the molar amount, preferably 0.02 to 10 times the molar amount of the compound (16). The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, benzene, toluene, xylene, THF, acetonitrile, or any mixed solvent thereof. Can do. Examples of the “halogenating agent for sulfur atom” used in this step include N-bromosuccinimide (NBS) and N-iodosuccinimide (NIS). The amount of the “halogenating agent for sulfur atom” to be used is suitably 0.8 to 10 times, preferably 1 to 5 times the amount of the compound (16). The reaction temperature is suitably -78 ° C to 30 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, the reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 5 hours is appropriate.
「アルキル化試薬」として、化合物（２３）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（１６）に、アルキル化試薬と酸無水物と塩基とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．８〜５倍モル量が適当であり、好ましくは１〜３倍モル量である。「酸無水物」としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、無水酢酸を挙げることができる。「酸無水物」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。塩基としては、例えば、テトラメチルウレア、コリジンを挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（１６）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、−７８℃〜３０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分〜２４時間が適当である。
When the compound (23) is used as the “alkylating reagent”, it can be carried out as follows.
This step can be performed by reacting an alkylating reagent, an acid anhydride, and a base with compound (16), which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature, according to a known method. . The amount of the “alkylating reagent” to be used is appropriately 0.8 to 5 times, preferably 1 to 3 times the amount of the compound (16). Examples of the “acid anhydride” include trifluoromethanesulfonic acid anhydride and acetic anhydride. The amount of the “acid anhydride” to be used is suitably 0.01 to 20-fold mol amount, preferably 0.02 to 10-fold mol amount based on the mol amount of Compound (16). Examples of the base include tetramethylurea and collidine. The amount of the “base” used is suitably 0.01 to 20 times the molar amount, preferably 0.02 to 10 times the molar amount of the compound (16). The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, and any mixed solvent thereof. The reaction temperature is suitably -78 ° C to 30 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 24 hours is appropriate.
（２）工程ｂ：
工程ａにおいて製造されるリボ核酸誘導体（１７）を単離精製する工程。
本工程は、工程ａにおいて製造される混合物から通常の分離精製手段、例えば、薄層クロマトグラフィー、シリガゲルクロマトグラフィーなどの手段を用いることにより単離精製することができる。
(2) Step b:
A step of isolating and purifying the ribonucleic acid derivative (17) produced in step a.
This step can be isolated and purified from the mixture produced in step a by using usual separation and purification means such as thin layer chromatography, silica gel chromatography and the like.
（３）工程ｃ：
工程ｂとは別に、次の一般式（２４）で表されるリボ核酸誘導体にアルキル化試薬を作用させることによって、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を２’位の水酸基に導入した、次の一般式（２５）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
Ａは、次の一般式（２６ａ）又は（２６ｂ）で表されるケイ素置換基を表す。
Ｒ６に係る「アルキル」としては、ホスホロアミダイト化合物（Ｂ）における「アルキル」と同じものを挙げることができる。
「アルキル化試薬」としては、前記と同じものを挙げることができる。(3) Step c:
Separately from step b, by introducing an alkylating reagent to the ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (24), an ether-type protecting group that is eliminated under neutral conditions is introduced to the 2′-position hydroxyl group. The process of manufacturing the ribonucleic acid derivative represented by following General formula (25).
A represents a silicon substituent represented by the following general formula (26a) or (26b).
Examples of the “alkyl” related to R 6 include the same “alkyl” in the phosphoramidite compound (B).
Examples of the “alkylating reagent” include the same as described above.
「アルキル化試薬」として、化合物（２１）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（２４）にアルキル化試薬と塩基とを作用させることにより実施することができる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン系炭化水素を挙げることができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。本工程において、必要に応じて、化合物（２４）に金属試薬と塩基を作用させ製造される中間体を経由した後、アルキル化試薬を作用させることもできる。かかる「金属試薬」として、例えば、二塩化ジブチルスズ、ｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロリドを挙げることができる。「金属試薬」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。「塩基」としては、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンなどの有機塩基を挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
When compound (21) is used as the “alkylating reagent”, it can be carried out as follows.
This step can be performed according to a known method by reacting an alkylating reagent and a base with compound (24) which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature. The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include halogen-based hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, and 1,2-dichloroethane. The amount of the “alkylating reagent” to be used is suitably 0.8 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on the mol amount of Compound (24). In this step, if necessary, an alkylating reagent can be allowed to act after passing through an intermediate produced by reacting compound (24) with a metal reagent and a base. Examples of such “metal reagent” include dibutyltin dichloride and tert-butylmagnesium chloride. The amount of the “metal reagent” to be used is appropriately 0.8 to 20 times, preferably 1 to 10 times the amount of the compound (24). Examples of the “base” include pyridine, 2,6-dimethylpyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, N-methylimidazole, triethylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine, 1,8-diazabicyclo [5.4. And organic bases such as .0] -7-undecene. The amount of the “base” to be used is suitably 0.8 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on the mol amount of Compound (24). The reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
「アルキル化試薬」として、化合物（２０）又は化合物（２２）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法（例えば、Ｍ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３１，２３８５（１９９０））に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（２４）に、アルキル化試薬と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜５倍モル量が適当であり、好ましくは１〜３倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを挙げることができる。「酸」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ＴＨＦ、アセトニトリル又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。本工程において使用する「硫黄原子に対するハロゲン化剤」として、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）を挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜１０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜５倍モル量である。反応温度は、−７８℃〜３０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分〜５時間が適当である。
When compound (20) or compound (22) is used as the “alkylating reagent”, it can be carried out as follows.
This step is carried out according to a known method (for example, M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 23, 385 (1990)), to a compound (24) that is commercially available or can be synthesized according to literature methods. It can be carried out by reacting a oxidant, an acid and a halogenating agent for the sulfur atom. The amount of the “alkylating reagent” to be used is appropriately 0.8 to 5 times, preferably 1 to 3 times the amount of the compound (24). Examples of the “acid” include trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate, and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate. The amount of the “acid” used is suitably 0.01 to 20 times the molar amount, preferably 0.02 to 10 times the molar amount of the compound (24). The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, benzene, toluene, xylene, THF, acetonitrile, or any mixed solvent thereof. Can do. Examples of the “halogenating agent for sulfur atom” used in this step include N-bromosuccinimide (NBS) and N-iodosuccinimide (NIS). The amount of the “halogenating agent for sulfur atom” is suitably 0.8 to 10 times, preferably 1 to 5 times the amount of the compound (24). The reaction temperature is suitably -78 ° C to 30 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, the reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 5 hours is appropriate.
「アルキル化試薬」として、化合物（２３）を使用する場合、以下のように実施することができる。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能である化合物（２４）に、アルキル化試薬と酸無水物と塩基とを作用させることにより実施することができる。「アルキル化試薬」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．８〜５倍モル量が適当であり、好ましくは１〜３倍モル量である。「酸無水物」としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、無水酢酸を挙げることができる。「酸無水物」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。塩基としては、例えば、テトラメチルウレア、コリジンを挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、０．０１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．０２〜１０倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。反応温度は、−７８℃〜３０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分〜２４時間が適当である。
When the compound (23) is used as the “alkylating reagent”, it can be carried out as follows.
This step can be carried out by reacting an alkylating reagent, an acid anhydride, and a base with compound (24) that is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature, according to a known method. . The amount of the “alkylating reagent” to be used is appropriately 0.8 to 5 times, preferably 1 to 3 times the amount of the compound (24). Examples of the “acid anhydride” include trifluoromethanesulfonic acid anhydride and acetic anhydride. The amount of the “acid anhydride” used is suitably 0.01 to 20 times the molar amount, preferably 0.02 to 10 times the molar amount of the compound (24). Examples of the base include tetramethylurea and collidine. The amount of the “base” used is suitably 0.01 to 20-fold mol amount, preferably 0.02 to 10-fold mol amount based on the mol amount of Compound (24). The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, and any mixed solvent thereof. The reaction temperature is suitably -78 ° C to 30 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 24 hours is appropriate.
（４）工程ｄ：
工程ａ〜工程ｃとは別に、リボ核酸誘導体（２４）にジメチルスルホキシドと酢酸と無水酢酸とを作用させることによって、次の一般式（２７）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
本工程は、公知の方法に従い、市販品として入手可能又は文献記載の方法に従い合成可能であるリボ核酸誘導体（２４）に、ジメチルスルホキシドと酢酸と無水酢酸とを作用させることにより実施することができる。
「ジメチルスルホキシド」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、１０〜２００倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。「酢酸」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、１０〜１５０倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。「無水酢酸」の使用量は、化合物（２４）のモル量に対して、１０〜１５０倍モル量が適当であり、好ましくは２０〜１００倍モル量である。反応温度は、１０℃〜５０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
(4) Step d:
A step of producing a ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (27) by allowing dimethyl sulfoxide, acetic acid and acetic anhydride to act on the ribonucleic acid derivative (24) separately from the steps a to c.
This step can be performed according to a known method by allowing dimethyl sulfoxide, acetic acid and acetic anhydride to act on a ribonucleic acid derivative (24) which is available as a commercial product or can be synthesized according to a method described in the literature. .
The amount of “dimethyl sulfoxide” used is suitably 10 to 200-fold mol amount, preferably 20 to 100-fold mol amount based on the mol amount of Compound (24). The amount of “acetic acid” used is suitably 10 to 150 times the molar amount, preferably 20 to 100 times the molar amount of the compound (24). The amount of “acetic anhydride” used is suitably 10 to 150 times the molar amount, preferably 20 to 100 times the molar amount of the compound (24). The reaction temperature is suitably 10 ° C to 50 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
（５）工程ｅ：
工程ｄにおいて製造されるリボ核酸誘導体（２７）に次の一般式（２８）で表されるアルコール化合物と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることによって、中性条件下において脱離するエーテル型保護基を２’位の水酸基に導入した、次の一般式（２５）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
本工程は、公知の方法に従い、リボ核酸誘導体（２７）に、アルコール化合物（２８）と酸と硫黄原子に対するハロゲン化剤とを作用させることにより実施することができる。
使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ＴＨＦ、アセトニトリル又はこれら任意の混合溶媒を挙げることができる。「アルコール化合物（２８）」の使用量は、化合物（２７）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。「酸」としては、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸銀、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」としては、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）を挙げることができる。「硫黄原子に対するハロゲン化剤」の使用量は、化合物（２７）のモル量に対して、０．１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．２〜１０倍モル量である。反応温度は、−１００℃〜２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常５分〜１２時間が適当である。
(5) Step e:
The ribonucleic acid derivative (27) produced in step d is eliminated under neutral conditions by allowing an alcohol compound represented by the following general formula (28), an acid and a halogenating agent for a sulfur atom to act. A step of producing a ribonucleic acid derivative represented by the following general formula (25) in which an ether-type protecting group is introduced into the 2′-position hydroxyl group.
This step can be performed by reacting the ribonucleic acid derivative (27) with an alcohol compound (28), an acid, and a halogenating agent for a sulfur atom according to a known method.
The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, benzene, toluene, xylene, THF, acetonitrile, or any mixed solvent thereof. Can do. The amount of the “alcohol compound (28)” to be used is suitably 0.8 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on the mol amount of the compound (27). Examples of the “acid” include trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate, and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate. Examples of the “halogenating agent for sulfur atom” include N-bromosuccinimide (NBS) and N-iodosuccinimide (NIS). The amount of the “halogenating agent for sulfur atom” is suitably 0.1 to 20 times the molar amount, preferably 0.2 to 10 times the molar amount of the compound (27). The reaction temperature is suitably -100 ° C to 20 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 5 minutes to 12 hours is appropriate.
（６）工程ｆ：
工程ｃ又は工程ｅにおいて製造されるリボ核酸誘導体（２５）の３’位と５’位の水酸基の保護基を脱離する反応を行うことによって、次の一般式（２９）で表されるリボ核酸誘導体を製造する工程。
本工程は、化合物（２５）を有機溶媒に溶解し、フッ素化剤単独又はフッ素化剤と酸（例えば、酢酸、塩酸、硫酸）とを任意の混合比の混合試薬として反応させることにより実施することができる。本工程に使用しうる「フッ素化剤」としては、例えば、フッ化アンモニウム、テトラブチルアンモニウムフロリド（以下、「ＴＢＡＦ」という。）、トリエチルアミントリヒドロフロリド、フッ化水素ピリジンを挙げることができる。「フッ素化剤」の使用量としては、化合物（２５）のモル量に対して、０．１〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは０．２〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
混合試薬におけるフッ素化剤と酸との混合比は、１：０．１〜１：２が適当であり、好ましくは１：１〜１：１．２である。
(6) Step f:
A ribonucleic acid derivative (25) produced in step c or step e is subjected to a reaction for eliminating the protecting groups at the 3′-position and the 5′-position of the ribonucleic acid derivative (25). Producing a nucleic acid derivative;
This step is carried out by dissolving compound (25) in an organic solvent and reacting the fluorinating agent alone or a fluorinating agent with an acid (for example, acetic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid) as a mixed reagent in any mixing ratio. be able to. Examples of the “fluorinating agent” that can be used in this step include ammonium fluoride, tetrabutylammonium fluoride (hereinafter referred to as “TBAF”), triethylamine trihydrofluoride, and hydrogen fluoride pyridine. . The amount of the “fluorinating agent” to be used is suitably 0.1 to 20 times the molar amount, preferably 0.2 to 10 times the molar amount of the compound (25). The reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
The mixing ratio of the fluorinating agent and the acid in the mixed reagent is suitably from 1: 0.1 to 1: 2, and preferably from 1: 1 to 1: 1.2.
（７）工程ｇ：
工程ｆにおいて製造されるリボ核酸誘導体（２９）の５’位の水酸基に酸性条件下において脱離する保護基（Ｒ１）を導入する、リボ核酸誘導体（１７）を製造する工程。
Ｘ３に係る「ハロゲン」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
本工程は、公知の方法に従い、化合物（２９）にＲ１Ｘ３（３０）を作用させることにより実施することができる。Ｒ１Ｘ３の使用量は、化合物（２９）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ＴＨＦを挙げることができる。「塩基」としては、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセンなどの有機塩基を挙げることができる。「塩基」の使用量は、化合物（２９）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
(7) Step g:
A step of producing a ribonucleic acid derivative (17), wherein a protecting group (R 1 ) that is eliminated under acidic conditions is introduced into the 5′-position hydroxyl group of the ribonucleic acid derivative (29) produced in the step f.
According to X 3 "halogen" may include the same as "halogen" related to the modified form of the B X.
This step can be performed by reacting compound (29) with R 1 X 3 (30) according to a known method. The amount of R 1 X 3 used is suitably 0.8 to 20-fold mol amount, preferably 1 to 10-fold mol amount based on the mol amount of Compound (29). The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and THF. Examples of the “base” include pyridine, 2,6-dimethylpyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, N-methylimidazole, triethylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine, 1,8-diazabicyclo [5.4. And organic bases such as .0] -7-undecene. The amount of the “base” to be used is suitably 0.8 to 20 times, preferably 1 to 10 times the amount of the compound (29). The reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
（８）工程ｈ：
工程ｂ又は工程ｆにおいて製造されるリボ核酸誘導体（１７）にホスホロアミダイト化試薬と、必要に応じて活性化剤とを作用させることによって、３’位の水酸基がホスホロアミダイト化されたホスホロアミダイト化合物（Ｂ）を製造する工程。
「ホスホロアミダイト化試薬」としては、例えば、次の一般式（３１ａ）、（３１ｂ）で表される化合物を挙げることができる。
Ｘ１に係る「ハロゲン」としては、前記ＢＸの修飾体に係る「ハロゲン」と同じものを挙げることができる。
本工程は、化合物（１７）にホスホロアミダイト試薬を作用させて、３’位の水酸基をホスホロアミダイト化する反応であり、公知の方法に従い実施することができる。必要に応じて、活性化剤を使用することもできる。使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ＴＨＦを挙げることができる。
「ホスホロアミダイト化試薬」の使用量は、化合物（１７）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。「活性化剤」としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジクロロイミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジニウムトリフラート、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、２，４，６−コリジン／Ｎ−メチルイミダゾールを挙げることができる。「活性化剤」の使用量は、化合物（１７）のモル量に対して、０．８〜２０倍モル量が適当であり、好ましくは１〜１０倍モル量である。反応温度は、０℃〜１２０℃が適当である。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常３０分〜２４時間が適当である。
このようにして、製造されるホスホロアミダイト化合物（Ｂ）は、それ自体公知の手段、例えば、濃縮、液性変換、転溶、溶媒抽出、結晶化、再結晶、分留、クロマトグラフィー等により分離精製することができる。
(8) Step h:
A phosphoramidite-modified phosphonucleic acid derivative (17) produced in step b or step f is allowed to react with a phosphoramidite-forming reagent and, if necessary, an activator, so that the 3′-position hydroxyl group is phosphoramidite-modified. The process of manufacturing a loamidite compound (B).
Examples of the “phosphoramidation reagent” include compounds represented by the following general formulas (31a) and (31b).
According to X 1 "halogen" may include the same as "halogen" related to the modified form of the B X.
This step is a reaction in which a phosphoramidite reagent is allowed to act on compound (17) to convert the hydroxyl group at the 3 ′ position to phosphoramidite, and can be performed according to a known method. An activator can also be used as needed. The solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile and THF.
The amount of the “phosphoramidation reagent” used is suitably 0.8 to 20 times, preferably 1 to 10 times the molar amount of the compound (17). Examples of the “activator” include 1H-tetrazole, 5-ethylthiotetrazole, 5-benzylmercapto-1H-tetrazole, 4,5-dichloroimidazole, 4,5-dicyanoimidazole, benzotriazole triflate, imidazole triflate, Mention may be made of pyridinium triflate, N, N-diisopropylethylamine, 2,4,6-collidine / N-methylimidazole. The amount of the “activator” used is suitably 0.8 to 20 times, preferably 1 to 10 times the amount of the compound (17). The reaction temperature is suitably from 0 ° C to 120 ° C. The reaction time varies depending on the type of raw materials used, reaction temperature, etc., but usually 30 minutes to 24 hours is appropriate.
Thus, the produced phosphoramidite compound (B) is obtained by means known per se, for example, concentration, liquid conversion, phase transfer, solvent extraction, crystallization, recrystallization, fractional distillation, chromatography, etc. It can be separated and purified.
以下に参考例及び試験例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されない。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference examples and test examples, but the present invention is not limited thereto.
参考例１ クロロメチル ２−シアノエチルエーテル
工程１ メチルチオメチル ２−シアノエチルエーテルの製造
３−ヒドロキシプロピオニトリル３２ｇ（４５０ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド４５０ｍｌに溶解し、無水酢酸３２４ｍＬ、酢酸２３１ｍＬを加え室温で２４時間攪拌した。炭酸水素ナトリウム９９０ｇを水４．５Ｌに溶解したものを調製し、これに反応液を一時間かけて滴下した。そのまま一時間攪拌し、反応液を酢酸エチルにて抽出し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、無色油状物のメチルチオメチル ２−シアノエチルエーテルを４１ｇ得た（収率７０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ２．１８（ｓ，３Ｈ）；２．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；３．７７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；４．６９（ｓ，２Ｈ）
工程２ クロロメチル ２−シアノエチルエーテルの製造
工程１で得られたメチルチオメチル ２−シアノエチルエーテル３．３ｇ（２５ｍｍｏｌ）を７０ｍＬの塩化メチレンに溶解させ、氷冷下２ｍＬ（２５ｍｍｏｌ）の塩化スルフリルを滴下し、さらに室温にて一時間反応させた。反応後、溶媒を留去し真空中にて蒸留し、目的化合物を無色油状物として２．５ｇ得た（収率８５％）。
沸点：８４−８５℃（０．３Ｔｏｒｒ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ２．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；３．９２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；５．５２（ｓ，２Ｈ）
Reference Example 1 Chloromethyl 2-cyanoethyl ether Step 1 Preparation of methylthiomethyl 2-cyanoethyl ether 32 g (450 mmol) of 3-hydroxypropionitrile was dissolved in 450 ml of dimethyl sulfoxide, and 324 mL of acetic anhydride and 231 mL of acetic acid were added to room temperature. For 24 hours. What melt | dissolved 990 g of sodium hydrogencarbonate in the water 4.5L was prepared, and the reaction liquid was dripped at this over 1 hour. The reaction solution was extracted with ethyl acetate, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off. The resulting oily product was purified by silica gel column chromatography to obtain a colorless oily methylthiomethyl 2- 41 g of cyanoethyl ether was obtained (yield 70%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.18 (s, 3H); 2.66 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 3.77 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 69 (s, 2H)
Boiling point: 84-85 ° C. (0.3 Torr)
1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.72 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 3.92 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 5.52 (s, 2H)
参考例２ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン５４６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン４ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４５２ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ）を加え、ついで３６５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。その後８０℃にしクロロメチル ２−シアノエチルエーテル１５５．４ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を滴下、そのまま３０分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンを得た（１９７ｍｇ；収率３４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ２．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）；２．６９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；３．５５（ｄｄ，１Ｈ，１１．３，２．２Ｈｚ）；３．６２（ｄｄ，１Ｈ，１１．３，２．２Ｈｚ）；３．８３（ｓ，６Ｈ）；３．８７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；４．０７−４．０８（ｍ，１Ｈ）；４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３，１．９Ｈｚ）；４．５４（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；４．９４，５．１１（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；５．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；６．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ）；６．８５−６．８８（ｍ，４Ｈ）；７．２９−７．４１（ｍ，９Ｈ）；８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；８．５３（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６５２［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
工程１で得られた５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン２０９ｍｇ（０．３３２ｍｍｏｌ）、テトラゾール２３ｍｇ（０．３３２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル２ｍＬに溶解し１５０ｍｇの（０．４９８ｍｍｏｌ）の２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを滴下し、４５℃で１．５時間反応させた。反応後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸エチルにて抽出し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し得られた混合物を２０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（２００ｍｇ；収率７３％）。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：８５２［Ｍ＋Ｎａ］＋
Reference Example 2 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl phosphoramidite)
Step 1 Preparation of 5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl ) uridine 546 mg (1 mmol) of 5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) uridine ) Was dissolved in 4 mL of 1,2-dichloroethane, 452 mg (3.5 mmol) of diisopropylethylamine was added, and then 365 mg (1.2 mmol) of dibutyltin dichloride was added, followed by reaction at room temperature for 1 hour. Thereafter, the temperature was raised to 80 ° C., and 155.4 mg (1.3 mmol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether was added dropwise, followed by stirring for 30 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was added to a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, extracted with methylene chloride, dried over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off, and the resulting mixture was purified by 30 g of silica gel column chromatography. '-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine was obtained (197 mg; yield 34%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.47 (d, 1H, J = 7.8 Hz); 2.69 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 3.55 (dd, 1H, 11.3) 2.22); 3.62 (dd, 1H, 11.3, 2.2 Hz); 3.83 (s, 6H); 3.87 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 4.07 -4.08 (m, 1H); 4.32 (dd, 1H, J = 5.3, 1.9 Hz); 4.54 (q, 1H, J = 5.3 Hz); 4.94, 5. 11 (2d, 2H, J = 6.9 Hz); 5.32 (d, 1H, J = 8.2 Hz); 6.00 (d, 1H, J = 1.9 Hz); 6.85-6.88 (M, 4H); 7.29-7.41 (m, 9H); 8.02 (d, 1H, J = 8.2 Hz); 8.53 (br.s, 1H)
ESI-Mass: 652 [M + Na] +
ESI-Mass: 852 [M + Na] +
参考例３ ２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン
工程１ ３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン１５０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下ＴＨＦ７ｍＬに溶解し、メチルチオメチル ２−シアノエチルエーテル５４ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ１００ｍｇを加え、１０分攪拌した。０℃にしトリフルオロメタンスルホン酸１０ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ２ｍＬ溶液を加え攪拌した後、Ｎ−ヨードスクシンイミド９２ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）を加え、１時間攪拌した。反応液をセライトろ過し、塩化メチレンにて洗浄した後、有機相を１Ｍのチオ硫酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去した。得られた残渣を薄層クロマトグラフィーにて精製し、３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンを得た（１５０ｍｇ；収率８５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ０．９７−１．１２（ｍ，２８Ｈ）；２．６８−２．７３（ｍ，２Ｈ）；３．７８−３．８６（ｍ，１Ｈ）；３．９６−４．０５（ｍ，２Ｈ）；４．１２−４．３０（ｍ，４Ｈ）；５．０−５．０４（ｍ，２Ｈ）；５．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；５．７５（ｓ，１Ｈ）；７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）；９．６２（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：５７０［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２ ２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
工程１で得られた３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン２００ｍｇ（０．３５ｍｍｏｌ）をメタノール２ｍＬに溶解し、フッ化アンモニウム６５ｍｇ（１．７６ｍｍｏｌ）を加え５０℃にて５時間加熱攪拌した。放冷後アセトニトリルを加え攪拌し、ろ過濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（１０８ｍｇ；収率９４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）： ２．７２−２．７６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；３．６８−３．９２（ｍ，４Ｈ）；４．００−４．０３（ｍ，１Ｈ）；４．２６−４．３２（ｍ，２Ｈ）；４．８１−４．９５（ｍ，２Ｈ）；５．７１（ｄ，１Ｈ， Ｊ＝８．１Ｈｚ）；６．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ）；８．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：３５０［Ｍ＋Ｎａ］＋
Reference Example 3 2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine Step 1 3 ', 5'-O- (Tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2 -Production of cyanoethoxymethyl ) uridine 3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) uridine 150 mg (0.3 mmol) was dissolved in 7 mL of THF under an argon atmosphere, and methylthiomethyl 2-cyanoethyl ether 54 mg (0.4 mmol) and 100 mg of molecular sieves 4A were added and stirred for 10 minutes. The mixture was brought to 0 ° C., 2 mL of THF solution of 10 mg (0.06 mmol) of trifluoromethanesulfonic acid was added and stirred, and then 92 mg (0.4 mmol) of N-iodosuccinimide was added and stirred for 1 hour. The reaction solution was filtered through Celite and washed with methylene chloride, and then the organic phase was washed with 1M aqueous sodium hydrogensulfate solution, washed with saturated aqueous sodium hydrogencarbonate solution, dried over anhydrous magnesium sulfate and evaporated. . The obtained residue was purified by thin layer chromatography to obtain 3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine. (150 mg; 85% yield).
1 H-NMR (CDCl 3 ): 0.97-1.12 (m, 28H); 2.68-2.73 (m, 2H); 3.78-3.86 (m, 1H); 96-4.05 (m, 2H); 4.12-4.30 (m, 4H); 5.0-5.04 (m, 2H); 5.70 (d, 1H, J = 8.2 Hz) ); 5.75 (s, 1 H); 7.90 (d, 1 H, J = 8.2 Hz); 9.62 (br. S, 1 H)
ESI-Mass: 570 [M + H] +
1 H-NMR (CD 3 OD): 2.72-2.76 (t, 2H, J = 6.2 Hz); 3.68-3.92 (m, 4H); 4.00-4.03 ( m, 1H); 4.26-4.32 (m, 2H); 4.81-4.95 (m, 2H); 5.71 (d, 1H, J = 8.1 Hz); 6.00 ( d, 1H, J = 3.3 Hz); 8.10 (d, 1H, J = 8.1 Hz)
ESI-Mass: 350 [M + Na] +
参考例４ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジンの製造
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン１４ｇ（４３ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸し真空ポンプで３０分乾燥した。ＴＨＦ３００ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン６８ｇ（８５６ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ２０ｇを加え１０分攪拌した。これに４，４’−ジメトキシトリチルクロライド１９．６ｇ（５７．８ｍｍｏｌ）を３回に分けて１時間ごとに加え、さらに１時間攪拌した。メタノール１０ｍＬを加え２分攪拌した後、セライトろ過し酢酸エチルにて洗浄した。ろ液を濃縮後、残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（２６．５ｇ；収率９８％）。
Reference Example 4 Production of 5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl)
参考例５ Ｎ ４ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１ Ｎ ４ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンの製造
Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン５８８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン４ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４５２ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ）を加え、ついで３６５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。その後８０℃にしクロロメチル ２−シアノエチルエーテル１５５．４ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を滴下、そのまま６０分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンを得た（２１９ｍｇ；収率３５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ２．１９（ｓ，３Ｈ）；２．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）；２．６５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；３．５５（ｄｄ，１Ｈ，１０．５，２．５Ｈｚ）；３．６３（ｄｄ，１Ｈ，１０．５，２．５Ｈｚ）；３．８２（ｓ，６Ｈ）；３．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；４．０９−４．１４（ｍ，１Ｈ）；４．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）；４．４４−４．４９（ｍ，１Ｈ）；４．９７，５．２４（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；５．９６（ｓ，１Ｈ）；６．８６−６．８８（ｍ，４Ｈ）；７．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；７．２６−７．４２（ｍ，９Ｈ）；８．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；８．５９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６９３［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２ Ｎ ４ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
工程１で得られたＮ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル） シチジン２０５ｍｇ（０．３０６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１０５ｍｇ（０．８１２ｍｍｏｌ）を加え２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト１１６ｍｇ（０．４９ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を２０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（２４２ｍｇ；収率９１％）。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：８７１［Ｍ＋Ｈ］＋
Reference Example 5 N 4 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine 3′-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl Phosphoramidite)
Step 1 Preparation of N 4 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine N 4 -acetyl-5′-O— (4 588 mg (1 mmol) of 4′-dimethoxytrityl) cytidine is dissolved in 4 mL of 1,2-dichloroethane, 452 mg (3.5 mmol) of diisopropylethylamine is added, and then 365 mg (1.2 mmol) of dibutyltin dichloride is added. For 1 hour. Thereafter, the temperature was raised to 80 ° C., and 155.4 mg (1.3 mmol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether was added dropwise, followed by stirring for 60 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was added to a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, extracted with methylene chloride, dried over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off, and the resulting mixture was purified by 30 g of silica gel column chromatography. 4 -Acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine was obtained (219 mg; yield 35%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.19 (s, 3H); 2.56 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 2.65 (t, 2H, J = 6.2 Hz); 55 (dd, 1H, 10.5, 2.5 Hz); 3.63 (dd, 1H, 10.5, 2.5 Hz); 3.82 (s, 6H); 3.86 (t, 2H, J 4.09-4.14 (m, 1H); 4.28 (d, 1H, J = 5.1 Hz); 4.44-4.49 (m, 1H); 4.97. 5.24 (2d, 2H, J = 6.9 Hz); 5.96 (s, 1H); 6.86-6.88 (m, 4H); 7.09 (d, 1H, J = 6. 7.26-7.42 (m, 9H); 8.48 (d, 1H, J = 6.9 Hz); 8.59 (br.s, 1H)
ESI-Mass: 693 [M + Na] +
Step 2 N 4 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine 3′-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphospho N 4 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine 205 mg (0.306 mmol) obtained in production step 1 Was dissolved in 2 mL of methylene chloride, 105 mg (0.812 mmol) of diisopropylethylamine was added, 116 mg (0.49 mmol) of 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite was added dropwise, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the solvent was distilled off and the resulting mixture was purified by 20 g of silica gel column chromatography to obtain the target compound (242 mg; yield 91%).
ESI-Mass: 871 [M + H] +
参考例６ Ｎ ４ −アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン
工程１ Ｎ ４ −アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンの製造
Ｎ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）シチジン１．００ｇ（１．８９ｍｍｏｌ）とメチルチオメチル ２−シアノエチルエーテル５００ｍｇ（３．７９ｍｍｏｌ）を混合し、トルエン１０ｍＬとＴＨＦ１０ｍＬの混合溶媒に溶解した。ついでトリフルオロメタンスルホン酸銀９７５ｍｇ（３．７９ｍｍｏｌ）を加え、モレキュラーシーブス４Ａを加え、乾燥した。氷冷下、Ｎ−ブロモスクシンイミド３７０ｍｇ（２．０８ｍｍｏｌ）を加え、反応容器を遮光し、１０分間撹拌した。さらにＮ−ブロモスクシンイミド７０ｍｇ（０．３９ｍｍｏｌ）を追加し、２５分間撹拌した。反応終了後、塩化メチレンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンを得た。（９３６ｍｇ；収率８１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ０．９０−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．２８（ｓ，３Ｈ）；２．６２−２．７９（ｍ，２Ｈ）；３．７８−３．８９（ｍ，１Ｈ）；３．９６−４．０４（ｍ，２Ｈ）；４．１９−４．２３（ｍ，３Ｈ）；４．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ）；５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．７７（ｓ，１Ｈ）；７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；８．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；１０．１３（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６１１［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２ Ｎ ４ −アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンの製造
工程１で得られたＮ４−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン５００ｍｇ（０．８１９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２．５ｍＬとメタノール２．５ｍＬの混合溶媒に溶解し、フッ化アンモニウム１５０ｍｇ（４．１０ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で４時間反応させた。反応終了後、アセトニトリルにて希釈、濾過し、溶媒を留去し得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（２１０ｍｇ；収率７０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）： ２．１３（ｓ，３Ｈ）；２．６６−２．７１（ｍ，２Ｈ）；３．７２−３．７８（ｍ，３Ｈ）；３．９０（ｄｄ，１Ｈ，１３．０，２．６Ｈｚ）；４．０６−４．１１（ｍ，１Ｈ）；４．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１，５．２Ｈｚ）；４．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１，２．９Ｈｚ）；４．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；４．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；５．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ）；７．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）；８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：３９１［Ｍ＋Ｎａ］＋
Reference Example 6 N 4 - acetyl -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) cytidine <br/> Step 1 N 4 - acetyl -3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3 Preparation of diyl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl ) cytidine 1.00 g of N 4 -acetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) cytidine (1. 89 mmol) and 500 mg (3.79 mmol) of methylthiomethyl 2-cyanoethyl ether were mixed and dissolved in a mixed solvent of 10 mL of toluene and 10 mL of THF. Then, 975 mg (3.79 mmol) of silver trifluoromethanesulfonate was added, and molecular sieves 4A was added and dried. Under ice cooling, 370 mg (2.08 mmol) of N-bromosuccinimide was added, and the reaction vessel was shielded from light and stirred for 10 minutes. Further, 70 mg (0.39 mmol) of N-bromosuccinimide was added and stirred for 25 minutes. After completion of the reaction, the reaction mixture was diluted with methylene chloride, washed with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, dried over anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off, and the resulting mixture was purified by silica gel column chromatography. 4 -Acetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine was obtained. (936 mg; 81% yield).
1 H-NMR (CDCl 3 ): 0.90-1.11 (m, 28H); 2.28 (s, 3H); 2.62-2.79 (m, 2H); 3.78-3. 4.89 (m, 1H); 3.96-4.04 (m, 2H); 4.19-4.23 (m, 3H); 4.30 (d, 1H, J = 13.6 Hz); 00 (d, 1H, J = 6.8 Hz); 5.09 (d, 1H, J = 6.8 Hz); 5.77 (s, 1H); 7.44 (d, 1H, J = 7.5 Hz) ); 8.30 (d, 1H, J = 7.5 Hz); 10.13 (s, 1H)
ESI-Mass: 611 [M + H] +
1 H-NMR (D 2 O): 2.13 (s, 3H); 2.66-2.71 (m, 2H); 3.72-3.78 (m, 3H); 3.90 (dd , 1H, 13.0, 2.6 Hz); 4.06-4.11 (m, 1H); 4.20 (dd, 1H, J = 7.1, 5.2 Hz); 4.29 (dd, 1H, J = 5.1, 2.9 Hz); 4.83 (d, 1H, J = 7.2 Hz); 4.94 (d, 1H, J = 7.2 Hz); 5.95 (d, 1H) , J = 2.9 Hz); 7.25 (d, 1H, J = 7.6 Hz); 8.25 (d, 1H, J = 7.6 Hz)
ESI-Mass: 391 [M + Na] +
参考例７ Ｎ ４ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジンの製造
２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン９．９ｇ（２６．８ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸し真空ポンプで３０分乾燥した。ＴＨＦ１９０ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン４３ｇ（５３８ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ２０ｇを加え１０分攪拌した。これに４，４’−ジメトキシトリチルクロライド１１．８ｇ（３４．９ｍｍｏｌ）を３回に分けて１時間ごとに加え、さらに１時間攪拌した。メタノール２ｍＬを加え２分攪拌した後、セライトろ過し酢酸エチルにて洗浄した。ろ液をエバポレーターで濃縮後残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（１５ｇ；収率８３％）。
Reference Example 7 Production of N 4 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl)
参考例８ Ｎ ２ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１ Ｎ ２ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
Ｎ２−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン６２７ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン４ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４５２ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ）を加え、ついで３６５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。その後８０℃にしクロロメチル ２−シアノエチルエーテル１５５．４ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を滴下、そのまま６０分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ２−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンを得た（４５０ｍｇ；収率６３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： １．９２（ｓ，３Ｈ）；２．４７−２．５１（ｍ，２Ｈ）；２．６８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；３．３０（ｄｄ，１Ｈ，１０．７，３．８Ｈｚ）；３．４７（ｄｄ，１Ｈ，１０．７，３．８Ｈｚ）；３．５５−３．６０（ｍ，１Ｈ）；３．６５−３．７０（ｍ，１Ｈ）；３．７４，３．７５（２ｓ，６Ｈ）；４．２２−４．２３（ｍ，１Ｈ）；４．５５−４．５８（ｍ，１Ｈ）；４．７８，４．８３（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；５．０１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）；５．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）；６．７６−６．７９（ｍ，４Ｈ）；７．１７−７．４４（ｍ，９Ｈ）；７．８８（ｓ，１Ｈ）；８．３６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；１２．０６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
工程２ Ｎ ２ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
工程１で得られたＮ２−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン４００ｍｇ（０．５６３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１８１ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）を加え２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト１６１ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を２０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（４７１ｍｇ；収率９２％）。
Reference Example 8 N 2 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine 3′-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl Phosphoramidite)
Step 1 N 2 - acetyl -5'-O- (4,4'- dimethoxytrityl) -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) production of guanosine N 2 - acetyl -5'-O- (4, 627 mg (1 mmol) of 4′-dimethoxytrityl) guanosine is dissolved in 4 mL of 1,2-dichloroethane, 452 mg (3.5 mmol) of diisopropylethylamine is added, and then 365 mg (1.2 mmol) of dibutyltin dichloride is added. For 1 hour. Thereafter, the temperature was raised to 80 ° C., and 155.4 mg (1.3 mmol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether was added dropwise, followed by stirring for 60 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was added to a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, extracted with methylene chloride, dried over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off, and the resulting mixture was purified by 30 g of silica gel column chromatography. 2 -Acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine was obtained (450 mg; yield 63%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): 1.92 (s, 3H); 2.47-2.51 (m, 2H); 2.68 (br.s, 1H); 3.30 (dd, 1H, 3.47 (dd, 1H, 10.7, 3.8 Hz); 3.55-3.60 (m, 1H); 3.65-3.70 (m, 1H) 3.74, 3.75 (2s, 6H); 4.22-4.23 (m, 1H); 4.55-4.58 (m, 1H); 4.78, 4.83 (2d) , 2H, J = 7.0 Hz); 5.01 (t, 1H, J = 5.1 Hz); 5.99 (d, 1H, J = 5.1 Hz); 6.76-6.79 (m, 4H); 7.17-7.44 (m, 9H); 7.88 (s, 1H); 8.36 (br.s, 1H); 12.06 (br.s, 1H)
Step 2 N 2 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine 3′-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphospho Ramidite) 400 mg (0.563 mmol) of N 2 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine obtained in production step 1 Was dissolved in 2 mL of methylene chloride, 181 mg (1.4 mmol) of diisopropylethylamine was added, and 161 mg (0.68 mmol) of 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite was added dropwise and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the solvent was distilled off and the resulting mixture was purified by 20 g of silica gel column chromatography to obtain the target compound (471 mg; yield 92%).
参考例９ Ｎ ６ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１ Ｎ ６ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
Ｎ６−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）アデノシン２２．０ｇ（３６．０ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン１７０ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１６．３ｇ（１２６ｍｍｏｌ）を加え、ついで１２．１ｇ（３９．７ｍｍｏｌ）の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。その後８０℃にし１５分間撹拌後、クロロメチル ２−シアノエチルエーテル４．３０ｇ（３６．０ｍｍｏｌ）を滴下、そのまま３０分間撹拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ６−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンを得た。（７．４７ｇ；収率３３％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ２．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；２．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ）；２．６１（ｓ，３Ｈ）；３．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．７，４．０Ｈｚ）；３．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．７，３．２Ｈｚ）；３．６２−３．７９（ｍ，２Ｈ）；３．７９（ｓ，６Ｈ）；４．２５（ｂｒ．ｑ，１Ｈ，Ｊ〜４．６Ｈｚ）；４．５９（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；４．８７−４．９４（ｍ，３Ｈ）；６．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ）；６．８０−６．８３（ｍ，４Ｈ）；７．２２−７．３２（ｍ，７Ｈ）；７．４０−７．４３（ｍ，２Ｈ）；８．２０（ｓ，１Ｈ）；８．６１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；８．６２（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６９５［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２ Ｎ ６ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
工程１で得られたＮ６−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン１０．０ｇ（１４．４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン７５ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４．７ｇ（３６ｍｍｏｌ）を加え２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト４．８２ｇ（２０．３ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させた。反応後、溶媒を３０ｍＬ程度残して留去し得られた反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（１２．０ｇ；収率９３％）。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：８９５［Ｍ＋Ｈ］＋
Reference Example 9 N 6 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine 3′-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl Phosphoramidite)
Step 1 Preparation of N 6 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine N 6 -acetyl-5′-O— (4 4'-dimethoxytrityl) adenosine (22.0 g, 36.0 mmol) was dissolved in 1,2-dichloroethane (170 mL), diisopropylethylamine (16.3 g, 126 mmol) was added, and then 12.1 g (39.7 mmol) dibutyltin dichloride. And then reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the mixture was heated to 80 ° C. and stirred for 15 minutes, and then 4.30 g (36.0 mmol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether was added dropwise and stirred as it was for 30 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was added to a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, extracted with methylene chloride, dried over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off, the resulting mixture was purified by silica gel column chromatography, and N 6- Acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine was obtained. (7.47 g; 33% yield)
1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.51 (t, 2H, J = 6.2 Hz); 2.58 (d, 1H, J = 5.5 Hz); 2.61 (s, 3H); 45 (dd, 1H, J = 10.7, 4.0 Hz); 3.54 (dd, 1H, J = 10.7, 3.2 Hz); 3.62-3.79 (m, 2H); 3 .79 (s, 6H); 4.25 (br. Q, 1 H, J to 4.6 Hz); 4.59 (q, 1 H, J = 5.2 Hz); 4.87-4.94 (m, 3H); 6.23 (d, 1H, J = 4.4 Hz); 6.80-6.83 (m, 4H); 7.22-7.32 (m, 7H); 7.40-7. 43 (m, 2H); 8.20 (s, 1H); 8.61 (br.s, 1H); 8.62 (s, 1H)
ESI-Mass: 695 [M + H] +
Step 2 N 6 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine 3′-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphospho N obtained in the production process 1 of Roamidaito) 6 - acetyl -5'-O- (4,4'- dimethoxytrityl) -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) adenosine 10.0 g (14. 4 mmol) is dissolved in 75 mL of methylene chloride, 4.7 g (36 mmol) of diisopropylethylamine is added, and 4.82 g (20.3 mmol) of 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite is added dropwise and reacted at room temperature for 1 hour. It was. After the reaction, the reaction mixture obtained by distilling off the solvent leaving about 30 mL was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound (12.0 g; yield 93%).
ESI-Mass: 895 [M + H] +
参考例１０ Ｎ ６ −アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン
工程１ Ｎ ６ −アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
Ｎ−ヨードスクシンイミド２４５ｍｇ（１．０９ｍｍｏｌ）とトリフルオロメタンスルホン酸銀２８０ｍｇ（１．０９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン８ｍＬに懸濁させ、モレキュラーシーブス４Ａを加え、乾燥した。ここに、Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン４００ｍｇ（０．７３ｍｍｏｌ）とメチルチオメチル ２−シアノエチルエーテル１４５ｍｇ（１．１１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン４ｍＬに溶解し、氷冷下で加えた。そのまま３時間撹拌した。反応終了後、塩化メチレンを加えて希釈し、チオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンを得た。（２０１ｍｇ；収率４５％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ０．９８−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．６２（ｓ，３Ｈ）；２．６９（ｔｄ，２Ｈ，６．５，Ｊ＝１．５Ｈｚ）；３．８１−３．８９（ｍ，１Ｈ）；４．０２−４．０９（ｍ，２Ｈ）；４．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ）；４．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ）；４．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ）；４．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，４．５Ｈｚ）；５．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；６．１０（ｓ，１Ｈ）；８．３４（ｓ，１Ｈ）；８．６６（ｓ，１Ｈ）；８．６７（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６３６［Ｍ＋Ｈ］＋
工程２ Ｎ ６ −アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
工程１で得られたＮ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン３００ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）を、酢酸０．１ｍＬと０．５ＭＴＢＡＦのＴＨＦ溶液２ｍＬの混合溶液に溶解し、室温で２時間撹拌した。反応終了後、得られた反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た。（１６０ｍｇ；収率８６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）： ２．２５（ｓ，３Ｈ）；２．５３−２．６８（ｍ，２Ｈ）；３．４１−３．４６（ｍ，１Ｈ）；３．５６−３．６４（ｍ，２Ｈ）；３．６９−３．７３（ｍ，１Ｈ）；４．００−４．０１（ｍ，１Ｈ）；４．３６−４．３７（ｍ，１Ｈ）；４．７２−４．７８（ｍ，３Ｈ）；５．２０（ｂｔ，２Ｈ）；５．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；６．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）；８．６６（ｓ，１Ｈ）；８．７２（ｓ，１Ｈ）；１０．７２（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：４１５［Ｍ＋Ｎａ］＋
Reference Example 10 N 6 - acetyl -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) adenosine <br/> Step 1 N 6 - acetyl -3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3 Preparation of diyl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine 245 mg (1.09 mmol) of N-iodosuccinimide and 280 mg (1.09 mmol) of silver trifluoromethanesulfonate were suspended in 8 mL of methylene chloride and molecular. Sieves 4A was added and dried. To this, 400 mg (0.73 mmol) of N 6 -acetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) adenosine and 145 mg (1.11 mmol) of methylthiomethyl 2-cyanoethyl ether were chlorinated. Dissolved in 4 mL of methylene and added under ice cooling. The mixture was stirred for 3 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture is diluted with methylene chloride, washed with an aqueous sodium thiosulfate solution and a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent is distilled off. The resulting mixture is subjected to silica gel column chromatography. To obtain N 6 -acetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine. (201 mg; yield 45%)
1 H-NMR (CDCl 3 ): 0.98-1.11 (m, 28H); 2.62 (s, 3H); 2.69 (td, 2H, 6.5, J = 1.5 Hz); 3.81-3.89 (m, 1H); 4.02-4.09 (m, 2H); 4.17 (d, 1H, J = 9.4 Hz); 4.28 (d, 1H, J = 13.4 Hz); 4.50 (d, 1 H, J = 4.5 Hz); 4.67 (dd, 1 H, J = 8.8, 4.5 Hz); 5.02 (d, 1 H, J = 7.0 Hz); 5.08 (d, 1H, J = 7.0 Hz); 6.10 (s, 1H); 8.34 (s, 1H); 8.66 (s, 1H); 8.67 (S, 1H)
ESI-Mass: 636 [M + H] +
1 H-NMR (DMSO-d6): 2.25 (s, 3H); 2.53 to 2.68 (m, 2H); 3.41 to 3.46 (m, 1H); 3.56-3 .64 (m, 2H); 3.69-3.73 (m, 1H); 4.00-4.01 (m, 1H); 4.36-4.37 (m, 1H); 4.72 −4.78 (m, 3H); 5.20 (bt, 2H); 5.41 (d, 1H, J = 5.2 Hz); 6.17 (d, 1H, J = 5.7 Hz); 8 .66 (s, 1H); 8.72 (s, 1H); 10.72 (s, 1H)
ESI-Mass: 415 [M + Na] +
参考例１１ Ｎ ６ −アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
Ｎ６−アセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン９．５０ｇ（２４．２ｍｍｏｌ）を脱水ピリジン１００ｍＬに溶解し、濃縮して乾燥した後、アルゴン雰囲気下、脱水ピリジン１００ｍＬに溶解した。氷冷下、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド１０．７ｇ（３１．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間２０分反応した。反応終了後、塩化メチレンにて希釈し、水にて洗浄を行い無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た。（１３．８ｇ；収率８２％）
Reference Example 11 Production of N 6 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine N 6 -acetyl-2′-O— (2 -Cyanoethoxymethyl) adenosine 9.50 g (24.2 mmol) was dissolved in 100 mL of dehydrated pyridine, concentrated and dried, and then dissolved in 100 mL of dehydrated pyridine under an argon atmosphere. Under ice-cooling, 10.7 g (31.2 mmol) of 4,4′-dimethoxytrityl chloride was added and reacted at room temperature for 1 hour and 20 minutes. After completion of the reaction, the reaction mixture was diluted with methylene chloride, washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound. (13.8 g; 82% yield)
参考例１２ Ｎ ２ −フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
工程１ Ｎ ２ −フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
Ｎ２−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン７２０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン４ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン４５２ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ）を加え、ついで３６５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の二塩化ジブチルスズを加えた後、室温で一時間反応した。その後８０℃にしクロロメチル ２−シアノエチルエーテル１５５．４ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を滴下、そのまま６０分間攪拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を加え塩化メチレンにて抽出を行い無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ２−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンを得た（３８４ｍｇ；収率４８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ２．４７−２．５１（ｍ，２Ｈ）；２．５８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；３．４２（ｄｄ，１Ｈ，１０．１，３．８Ｈｚ）；３．４６（ｄｄ，１Ｈ，１０．１，３．８Ｈｚ）；３．５３−３．５７（ｍ，１Ｈ）；３．６９−３．７３（ｍ，１Ｈ）；３．７７（ｓ，６Ｈ）；４．２４−４．２６（ｍ，１Ｈ）；４．４８−４．５０（ｍ，１Ｈ）；４．６１−４．６５（ｍ，２Ｈ）；４．８３，４．８７（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；４．８８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）；６．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）；６．８０−６．８２（ｍ，４Ｈ）；６．９２−６．９６（ｍ，３Ｈ）；７．０７−７．１１（ｍ，２Ｈ）；７．２０−７．４２（ｍ，９Ｈ）；７．８４（ｓ，１Ｈ）；８．９９（ｓ，１Ｈ）；１１．８１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：８２５［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２ Ｎ ２ −フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトの製造
工程１で得られたＮ２−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン３２０ｍｇ（０．３９９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン４ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１２８．８ｍｇ（０．９９６ｍｍｏｌ）を加え２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト１４１．５ｍｇ（０．５９８ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し得られた混合物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（３１６ｍｇ；収率７９％）。
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：１００３［Ｍ＋Ｈ］＋
Reference Example 12 N 2 - phenoxyacetyl -5'-O- (4,4'- dimethoxytrityl) -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) guanosine 3'-O- (2- cyanoethyl N, N- Diisopropyl phosphoramidite)
Step 1 Preparation of N 2 -phenoxyacetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine N 2 -phenoxyacetyl-5′-O— ( After 720 mg (1 mmol) of 4,4′-dimethoxytrityl) guanosine was dissolved in 4 mL of 1,2-dichloroethane, 452 mg (3.5 mmol) of diisopropylethylamine was added, and then 365 mg (1.2 mmol) of dibutyltin dichloride was added. For 1 hour at room temperature. Thereafter, the temperature was raised to 80 ° C., and 155.4 mg (1.3 mmol) of chloromethyl 2-cyanoethyl ether was added dropwise, followed by stirring for 60 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was added to a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, extracted with methylene chloride, dried over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off, and the resulting mixture was purified by 30 g of silica gel column chromatography. 2 -Phenoxyacetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine was obtained (384 mg; 48% yield).
1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.47-1.51 (m, 2H); 2.58 (br.s, 1H); 3.42 (dd, 1H, 10.1, 3.8 Hz); 3.46 (dd, 1H, 10.1, 3.8 Hz); 3.53-3.57 (m, 1H); 3.69-3.73 (m, 1H); 3.77 (s, 6H) 4.24-4.26 (m, 1H); 4.48-4.50 (m, 1H); 4.61-4.65 (m, 2H); 4.83, 4.87 (2d) , 2H, J = 7.0 Hz); 4.88 (t, 1H, J = 5.7 Hz); 6.05 (d, 1H, J = 5.7 Hz); 6.80-6.82 (m, 4H); 6.92-6.96 (m, 3H); 7.07-7.11 (m, 2H); 7.20-7.42 (m, 9H); 7.84 (s, 1H) 8.99 (s, 1H); 11 .81 (br.s, 1H)
ESI-Mass: 825 [M + Na] +
Step 2 N 2 -phenoxyacetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine 3′-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl 320 mg (0.399 mmol) of N 2 -phenoxyacetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine obtained in production step 1 of phosphoramidite ) Is dissolved in 4 mL of methylene chloride, 128.8 mg (0.996 mmol) of diisopropylethylamine is added, and 141.5 mg (0.598 mmol) of 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite is added dropwise and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting mixture was subjected to 30 g of silica gel column chromatography. , To thereby obtain the desired compound (316 mg; 79% yield).
ESI-Mass: 1003 [M + H] +
参考例１３ Ｎ ２ −フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン
工程１ Ｎ ２ −フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
Ｎ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）グアノシン２．０ｇ（３．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１６ｍＬに溶解し、メチルチオメチル ２−シアノエチルエーテル０．９９ｇ（７．６ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ１．０ｇを加え、アルゴン雰囲気下−４５℃で１０分攪拌した。トリフルオロメタンスルホン酸０．６８ｇ（４．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ５ｍＬ溶液を加え攪拌した後、Ｎ−ヨードスクシンイミド１．０２ｇ（４．５ｍｍｏｌ）を加え、１５分攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ろ過後酢酸エチルにて抽出、有機相を１Ｍのチオ硫酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄、水、次いで飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンを得た（２．０ｇ；収率８９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ０．９９−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．５９−２．７７（ｍ，２Ｈ）；３．８２−４．０５（ｍ，３Ｈ）；４．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；４．２５−４．３５（ｍ，２Ｈ）；４．５２−４．５６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３，４．３Ｈｚ）；５．００，５．０７（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；５．９５（ｓ，１Ｈ）６．９９−７．１２（ｍ，３Ｈ）；７．３５−７．４０（ｍ，２Ｈ）；８．０９（ｓ，１Ｈ）；９．３８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；１１．８５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：７６６［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２ Ｎ ２ −フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
１ＭＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液２．８３ｍＬ（２．８３ｍｍｏｌ）に酢酸０．１４ｍＬ（０．１４ｍｍｏｌ）を加えた溶液を調整する。工程１で得られたＮ２−フェノキシアセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン１．０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２．８３ｍＬに溶解し、上で調整した溶液を加えアルゴン雰囲気下室温で１時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮後、塩化メチレンに溶解しシリカゲルクロマトグラフィーにのせ精製し、目的化合物を得た。（０．６７ｇ；収率９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）： ２．５９−２．６６（ｍ，２Ｈ）；３．４１−３．６３（ｍ，４Ｈ）；３．９８（ｍ，１Ｈ）；４．３２（ｍ，１Ｈ）；４．５８−４．６２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；４．７１−４．７８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１３．１，６．８Ｈｚ）；４．８７（ｓ，２Ｈ）；５．１２（ｓ，１Ｈ）５．３７（ｓ，１Ｈ）；５．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）６．９６−６．９９（ｍ，３Ｈ）；７．２８−７．３４（ｍ，２Ｈ）；８．３０（ｓ，１Ｈ）；１１．７８（ｂｒ．ｓ，２Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：５００［Ｍ−Ｈ］−
Reference Example 13 N 2 - phenoxyacetyl -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) guanosine <br/> Step 1 N 2 - phenoxyacetyl -3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1, Preparation of 3-diyl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl ) guanosine 2.0 g of N 2 -phenoxyacetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) guanosine (3.0 mmol) was dissolved in 16 mL of THF, 0.99 g (7.6 mmol) of methylthiomethyl 2-cyanoethyl ether and 1.0 g of molecular sieves 4A were added, and the mixture was stirred at −45 ° C. for 10 minutes in an argon atmosphere. A solution of 0.68 g (4.5 mmol) of trifluoromethanesulfonic acid in 5 mL of THF was added and stirred, and then 1.02 g (4.5 mmol) of N-iodosuccinimide was added and stirred for 15 minutes. Saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added to the reaction solution, and after filtration, extracted with ethyl acetate, the organic phase was washed with 1M aqueous sodium thiosulfate solution, washed with water, then saturated aqueous sodium chloride solution, and anhydrous magnesium sulfate. Dried and evaporated. The obtained residue was purified by silica gel chromatography, and N 2 -phenoxyacetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2′-O- (2-cyanoethoxy) was obtained. Methyl) guanosine was obtained (2.0 g; yield 89%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): 0.99-1.11 (m, 28H); 2.59-2.77 (m, 2H); 3.82-4.05 (m, 3H); 15 (d, 1H, J = 9.3 Hz); 4.25-4.35 (m, 2H); 4.52-4.56 (dd, 1H, J = 9.3, 4.3 Hz); 5 0.000, 5.07 (2d, 2H, J = 7.2 Hz); 5.95 (s, 1H) 6.99-7.12 (m, 3H); 7.35-7.40 (m, 2H) 8.09 (s, 1H); 9.38 (br.s, 1H); 11.85 (br.s, 1H)
ESI-Mass: 766 [M + Na] +
1 H-NMR (DMSO-d6): 2.59-2.66 (m, 2H); 3.41-3.63 (m, 4H); 3.98 (m, 1H); 4.32 (m , 1H); 4.58-4.62 (t, 1H, J = 5.3 Hz); 4.71-4.78 (dd, 2H, J = 13.1, 6.8 Hz); 4.87 ( s, 2H); 5.12 (s, 1H) 5.37 (s, 1H); 5.97 (d, 1H, J = 6.1 Hz) 6.96-6.99 (m, 3H); 7 28-7.34 (m, 2H); 8.30 (s, 1H); 11.78 (br.s, 2H)
ESI-Mass: 500 [M−H] −
参考例１４ Ｎ ２ −フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシンの製造
Ｎ２−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン６６０ｍｇ（１．３２ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸し真空ポンプで３０分乾燥した。ＴＨＦ９ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下ピリジン２．１ｇ（２６．４ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ６００ｍｇを加え１０分攪拌した。これに４，４’−ジメトキシトリチルクロライド５４０ｍｇ（１．５８ｍｍｏｌ）を３回に分けて１時間ごとに加え、さらに１時間攪拌した。メタノール２ｍＬを加え２分攪拌した後、セライトろ過し酢酸エチルにて洗浄した。ろ液をエバポレーターで濃縮後残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と分液した。有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た（８００ｍｇ；収率７５％）。
Reference Example 14 Production of N 2 -phenoxyacetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine N 2 -phenoxyacetyl-2′-O— 660 mg (1.32 mmol) of (2-cyanoethoxymethyl) guanosine was azeotroped with pyridine and dried with a vacuum pump for 30 minutes. It melt | dissolved in THF9mL, 2.1g (26.4 mmol) of pyridine and 600 mg of molecular sieves 4A were added under argon atmosphere, and it stirred for 10 minutes. To this, 540 mg (1.58 mmol) of 4,4′-dimethoxytrityl chloride was added in three portions every hour, and the mixture was further stirred for 1 hour. After adding 2 mL of methanol and stirring for 2 minutes, the mixture was filtered through Celite and washed with ethyl acetate. The filtrate was concentrated with an evaporator and the residue was dissolved in ethyl acetate and separated with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution. The organic phase was washed with a saturated aqueous sodium chloride solution, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off. The obtained residue was purified by silica gel chromatography to obtain the target compound (800 mg; yield 75%).
参考例１５ Ｎ ６ −アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン
工程１ Ｎ ６ −アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシンの製造
Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン２．００ｇ（３．６２ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド２５ｍＬに溶解し、無水酢酸１７．５ｍＬ、酢酸１２．５ｍＬを加え室温で１４時間撹拌した。反応終了後、水２００ｍＬに反応液を加え、酢酸エチルにて抽出を行い、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、Ｎ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシンを得た。（１．３６ｇ；収率６１％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： ０．９６−１．１１（ｍ，２８Ｈ）；２．２０（ｓ，３Ｈ）；２．６１（ｓ，３Ｈ）；４．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４，２．４Ｈｚ）；４．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）；４．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ）；４．６３−４．７１（ｍ，２Ｈ）；５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）；５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）；６．０９（ｓ，１Ｈ）；８．３１（ｓ，１Ｈ）；８．６５（ｓ，１Ｈ）；８．６９（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−Ｍａｓｓ：６３５［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程２ Ｎ ６ −アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシンの製造
工程１で得られたＮ６−アセチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシン１．００ｇ（１．６３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ２５ｍＬに溶解した。３−ヒドロキシプロピオニトリル５．８８ｇ（８２．７ｍｍｏｌ）を加え、モレキュラーシーブス４Ａを加えて乾燥し、−４５℃に冷却した。Ｎ−ヨードスクシンイミド４４０ｍｇ（１．９６ｍｍｏｌ）を加え、ついでトリフルオロメタンスルホン酸４９０ｍｇ（３．２６ｍｍｏｌ）を加えた後、−４５℃で１５分間撹拌した。反応終了後、冷却したままトリエチルアミンを加えて中和し、塩化メチレンにて希釈、チオ硫酸ナトリウム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥、溶媒留去し、得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的化合物を得た。（７２２ｍｇ；収率７１％）。
試験例１ キャッピング工程において使用するアシル化反応の活性化剤及びフェノキシ酢酸誘導体の捕捉剤の効果１
市販の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンを担持したＣＰＧ固相担体（３３３ｍｇ，１５μｍｏｌ）をグラスフィルター付きカラムに入れ、核酸自動合成機（ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ：アプライドバイオシステムズ社）を使用して、オリゴ核酸（アデニリル−[３’→５’]−シチジリル−[３’→５’]−ウリジリル−[３’→５’]−グアニリル−[３’→５’]−アデニリル−[３’→５’]−シチジリル−[３’→５’]−ウリジリル−[３’→５’]−グアニリル−[３’→５’]−アデニリル−[３’→５’]−シチジリル−[３’→５’]−ウリジリル−[３’→５’]−グアニリル−[３’→５’]−アデニリル−[３’→５’]−シチジリル−[３’→５’]−ウリジリル−[３’→５’]−グアニリル−[３’→５’]−アデニリル−[３’→５’]−シチジリル−[３’→５’]−ウリジリル−[３’→５’]−グアニリル−[３’→５’]−チミジン）の合成を行った。
核酸モノマー化合物として、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、Ｎ４−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）を、縮合触媒としてベンジルメルカプトテトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キャッピング工程に使用する試薬として次の表１に記載の４種類の試薬を使用し、核酸モノマー化合物を２０回縮合させた。
図１は、上記１の試薬を使用して製造した未精製のオリゴ核酸について、図２は、上記２の試薬を使用して製造した未精製のオリゴ核酸について、図３は、上記３の試薬を使用して製造した未精製のオリゴ核酸について、図４は、上記４の試薬を使用して製造した未精製のオリゴ核酸について、それぞれ下記測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った結果である。
測定条件：
ＨＰＬＣ装置
送液ユニット：ＬＣ−１０ＡＴ ＶＰ（島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ−１０ＡＶＰ （島津製作所社製）
陰イオン交換ＨＰＬＣカラム
ＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００＜４ｍｍφ ｘ ２５０ ｍｍ＞（ＤＩＯＮＥＸ社製）
カラム温度：５０℃
移動相
グラジエント：リニアグラジエント２０分（Ｂ液：５−２５％）
Ａ液：１０％アセトニトリルを含む２５ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
Ｂ液：１０％アセトニトリル、７００ｍＭ 過塩素酸ナトリウムを含む２５ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
移動相の流量：１ｍｌ／分
紫外線可視分光器検出波長：２６０ｎｍ
次に、各反応溶液をエタノール中に滴下し、沈殿を生成させた後、母液と沈殿を遠心分離した。デカンテーションによって母液を除去し、沈殿を陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ）にて不要ピークを除去後、溶出溶媒（１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液を含む１０ｍＭリン酸緩衝液）を用いて精製した。溶液を透析処理後、目的化合物を得た。滅菌水でおよそ２０ ＯＤ／ｍｌ程度に希釈したサンプル２００μｌに対し、ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ１（０．５ｕｎｉｔｓ）を添加し、３７°Ｃで４８時間反応させた後、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ）と緩衝液（１ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２，１ｍＭ スペルミジンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ ９．３）を３７°Ｃで２４時間反応させて酵素分解を行った。それぞれについて酵素分解したものを下記測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った（図５，６，７参照）。
図５は、上記２の試薬を使用して製造したオリゴ核酸の酵素分解生成物について、図６は、上記３の試薬を使用して製造したオリゴ核酸の酵素分解生成物について、図７は、上記４の試薬を使用して製造した製造したオリゴ核酸の酵素分解生成物について、それぞれ下記測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った結果である。
測定条件：
ＨＰＬＣ装置
送液ユニット：ＬＣ−１０ＡＳ（島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
逆相ＨＰＬＣカラム
Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＵＧ−５ ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ ｃｏｌｕｍｎ ＜４．６ｍｍφ ｘ ２５０ ｍｍ＞（野村化学社製）
カラム温度：４０℃
移動相
グラジエント：アイソクラティック２０分
５０ｍＭ リン酸二水素カリウム水溶液（ｐＨ３．０）：メタノール＝２０：１
移動相の流量：１ｍｌ／分
紫外線可視分光器検出波長：２６０ｎｍ
図１〜４の結果から、アシル化反応を促進するための活性化剤として２−ＤＭＡＰを使用した場合、ＮＭＩや４−ＤＭＡＰを使用した場合と比較してキャッピング効率が良好であることが明らかである。また、フェノキシ酢酸誘導体の捕捉剤としてピリジンを使用するよりも２，６−ルチジンを使用したほうが、キャッピング効率が優れていることも確認された。
図５〜７の結果から、アシル化反応の活性化剤としてＮＭＩや４−ＤＭＡＰを使用した場合、少量ではあるが、保持時間が約８．５分のところに見られるグアノシン由来の２，６−ジアミノプリン体の生成が確認できた。一方、アシル化反応の活性化剤として２−ＤＭＡＰを使用した場合、顕著に２，６−ジアミノプリン体の生成が低減され、さらに、塩基をピリジンから２，６−ルチジンに変更することによって、２，６−ジアミノプリン体の生成が確認できなかった。
試験例２ キャッピング工程において使用するアシル化反応の活性化剤及びフェノキシ酢酸誘導体の捕捉剤の効果２
市販の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンを担持したＣＰＧ固相担体（３３３ｍｇ，１５μｍｏｌ）をグラスフィルター付きカラムに入れ、核酸自動合成機（ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ：アプライドバイオシステムズ社）を使用して、オリゴ核酸（シチジリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−アデニリル−［３’→５’］−シチジリル−［３’→５’］−グアニリル−［３’→５’］−シチジリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−グアニリル−［３’→５’］−アデニリル−［３’→５’］−グアニリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−アデニリル−［３’→５’］−シチジリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−ウリジリル−［３’→５’］−シチジリル−［３’→５’］−グアニリル−［３’→５’］−アデニリル−［３’→５’］−チミジル−［３’→５’］−チミジン）の合成を行った。
核酸モノマー化合物として、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）アデノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）シチジン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）ウリジン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）、Ｎ４−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエトキシメチル）グアノシン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスオロアミダイト）を、縮合触媒としてベンジルメルカプトテトラゾールを、酸化剤としてヨウ素溶液を、キャッピング工程に使用する試薬として下記表２に記載の３種類の試薬を使用し、核酸モノマー化合物を２０回縮合させた。
上記条件で製造した各オリゴＲＮＡに対し、切り出し剤としてアンモニア水：エタノール＝３：１を用いて、４０℃で４時間かけてＣＰＧ固相担体からの切り出し及び各リン酸部位、塩基部位の保護基の脱離反応を行った。各反応混合物をろ過後、ろ液を減圧下、濃縮後、ニトロメタン１％を含む１ＭのＴＢＡＦ ＴＨＦ溶液を用いて室温下、３時間反応させ、２’位水酸基の保護基の脱離反応を行った。次に、各反応溶液をエタノール中に滴下し、沈殿を生成させた後、母液と沈殿を遠心分離した。デカンテーションによって母液を除去し、沈殿を陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ）にて不要ピークを除去後、溶出溶媒（１．０Ｍ 塩化ナトリウム水溶液を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液）を用いて精製した。溶液を透析処理後、目的化合物を得た。上記各試薬を使用した場合におけるオリゴ核酸の収量及び収率を以下に示す。
以上から、キャッピング工程において、アシル化反応の活性化剤として２−ＤＭＡＰを、フェノキシ酢酸誘導体の捕捉剤として２，６−ルチジンを使用することにより、オリゴ核酸の単離収率が格段に向上することが明らかとなった。
Reference Example 15 N 6 - acetyl -3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) adenosine <br/> Step 1 N 6 Preparation of N-acetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane- 1,3-diyl) -2′-O-methylthiomethyladenosine N 6 -acetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyl Disiloxane-1,3-diyl) adenosine (2.00 g, 3.62 mmol) was dissolved in dimethyl sulfoxide (25 mL), acetic anhydride (17.5 mL) and acetic acid (12.5 mL) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 14 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was added to 200 mL of water, extracted with ethyl acetate, washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off. Purification by chromatography gave N 6 -acetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2′-O-methylthiomethyladenosine. (1.36 g; 61% yield)
1 H-NMR (CDCl 3 ): 0.96-1.11 (m, 28H); 2.20 (s, 3H); 2.61 (s, 3H); 4.03 (dd, 1H, J = 13.4, 2.4 Hz); 4.18 (d, 1H, J = 9.1 Hz); 4.27 (d, 1H, J = 13.4 Hz); 4.63-4.71 (m, 2H) ); 5.00 (d, 1H, J = 11.5 Hz); 5.07 (d, 1H, J = 11.5 Hz); 6.09 (s, 1H); 8.31 (s, 1H); 8.65 (s, 1H); 8.69 (s, 1H)
ESI-Mass: 635 [M + Na] +
Step 2 N 6 -Acetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine produced in Step 1 1.00 g (1.63 mmol) of 6 -acetyl-3 ′, 5′-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2′-O-methylthiomethyladenosine was dissolved in 25 mL of THF. 3-Hydroxypropionitrile (5.88 g, 82.7 mmol) was added, and molecular sieves 4A was added, dried, and cooled to -45 ° C. After adding 440 mg (1.96 mmol) of N-iodosuccinimide, and then adding 490 mg (3.26 mmol) of trifluoromethanesulfonic acid, the mixture was stirred at −45 ° C. for 15 minutes. After completion of the reaction, the reaction mixture was cooled and neutralized by adding triethylamine, diluted with methylene chloride, washed with aqueous sodium thiosulfate and saturated aqueous sodium bicarbonate, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound. (722 mg; 71% yield).
Test Example 1 Effect 1 of acylation reaction activator and phenoxyacetic acid derivative scavenger used in the capping step 1
A commercially available CPG solid phase carrier (333 mg, 15 μmol) supporting 5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) thymidine was placed in a column with a glass filter, and an automatic nucleic acid synthesizer (Expedite ™ : Applied Biosystems). Is used to generate oligonucleic acid (adenylyl- [3 ′ → 5 ′]-cytidylyl- [3 ′ → 5 ′]-uridylyl- [3 ′ → 5 ′]-guanylyl- [3 ′ → 5 ′]-adenylyl- [3 ′ → 5 ′]-cytidylyl- [3 ′ → 5 ′]-uridylyl- [3 ′ → 5 ′]-guanylyl- [3 ′ → 5 ′]-adenylyl- [3 ′ → 5 ′]-cytidylyl- [3 ′ → 5 ′]-uridylyl- [3 ′ → 5 ′]-guanylyl- [3 ′ → 5 ′]-adenylyl- [3 ′ → 5 ′]-cytidylyl- [3 ′ → 5 ′]-uridylyl [3 ′ → 5 ′]-guanylyl- [3 ′ → 5 ′]-adenylyl- [3 ′ → 5 ′]-cytidylyl- [3 ′ → 5 ′]-uridylyl [3 ′ → 5 ′]-guanyl Anilyl- [3 ′ → 5 ′]-thymidine) was synthesized.
As a nucleic acid monomer compound, N 4 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine 3′-O- (2-cyanoethyl N, N - diisopropylphosphoramidite Oro amidite), N 4 - acetyl -5'-O- (4,4'- dimethoxytrityl) -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) cytidine 3'-O- (2- cyanoethyl N , N-diisopropyl phosphoramidite), 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N- diisopropylphosphoramidite Oro amidite), N 4 - phenoxyacetyl -5'-O- (4,4'- dimethoxytrityl) -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) guanosine 3'-O- (2 Cyanoethyl N, N-diisopropyl phosphoramidite), benzyl mercaptotetrazole as a condensation catalyst, iodine solution as an oxidizing agent, and four types of reagents listed in Table 1 below as reagents used in the capping step, The monomer compound was condensed 20 times.
FIG. 1 shows an unpurified oligonucleic acid produced using the reagent 1 above, FIG. 2 shows an unpurified oligonucleic acid produced using the
Measurement condition:
HPLC equipment
Liquid feeding unit: LC-10AT VP (manufactured by Shimadzu Corporation)
Detector: SPD-10AVP (manufactured by Shimadzu Corporation)
Anion exchange HPLC column DNAPac PA-100 <4 mmφ x 250 mm> (manufactured by DIONEX)
Column temperature: 50 ° C
Mobile phase Gradient:
Solution A: 25 mM Tris-HCl buffer containing 10% acetonitrile Solution B: 25 mM Tris-HCl buffer containing 10% acetonitrile, 700 mM sodium perchlorate Mobile phase flow rate: 1 ml / min UV-visible spectrometer Detection wavelength: 260 nm
Next, each reaction solution was dropped into ethanol to form a precipitate, and then the mother liquor and the precipitate were centrifuged. The mother liquor was removed by decantation, and the precipitate was purified with an elution solvent (10 mM phosphate buffer containing 1.0 M sodium chloride aqueous solution) after removing unnecessary peaks with an anion exchange column (DEAE). The target compound was obtained after dialysis treatment of the solution. Nuclease P1 (0.5 units) is added to 200 μl of a sample diluted to about 20 OD / ml with sterilized water, reacted at 37 ° C. for 48 hours, then alkaline phosphatase (5 units) and buffer (1 mM MgCl 2). 2 , 50 mM Tris-HCl buffer (pH 9.3) containing 0.1 mM ZnCl 2 and 1 mM spermidine was reacted at 37 ° C. for 24 hours for enzymatic degradation. Each of them was subjected to HPLC analysis under the following measurement conditions (see FIGS. 5, 6 and 7).
FIG. 5 shows an enzymatic degradation product of an oligonucleic acid produced using the
Measurement condition:
HPLC equipment
Liquid feeding unit: LC-10AS (manufactured by Shimadzu Corporation)
Detector: SPD-6AV (manufactured by Shimadzu Corporation)
Reversed phase HPLC column Develosil ODS-UG-5 reverse-phase column <4.6 mmφ x 250 mm> (manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.)
Column temperature: 40 ° C
Mobile phase Gradient:
Mobile phase flow rate: 1 ml / min UV-visible spectrometer detection wavelength: 260 nm
From the results of FIGS. 1 to 4, it is clear that when 2-DMAP is used as an activator for promoting the acylation reaction, the capping efficiency is better than when NMI or 4-DMAP is used. It is. It was also confirmed that capping efficiency was better when 2,6-lutidine was used than when pyridine was used as a scavenger for the phenoxyacetic acid derivative.
From the results of FIGS. 5 to 7, when NMI or 4-DMAP is used as an activator for the acylation reaction, a small amount of guanosine-derived 2,6 can be seen at a retention time of about 8.5 minutes. -Formation of diaminopurine was confirmed. On the other hand, when 2-DMAP is used as an activator for the acylation reaction, the production of 2,6-diaminopurine is significantly reduced, and further, by changing the base from pyridine to 2,6-lutidine, The production of 2,6-diaminopurine could not be confirmed.
Test Example 2
A commercially available CPG solid phase carrier (333 mg, 15 μmol) supporting 5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) thymidine was placed in a column with a glass filter, and an automatic nucleic acid synthesizer (Expedite ™ : Applied Biosystems). Is used to generate oligonucleic acid (cytidylyl- [3 ′ → 5 ′]-uridylyl- [3 ′ → 5 ′]-uridylyl- [3 ′ → 5 ′]-adenylyl- [3 ′ → 5 ′]-cytidylyl- [3 ′ → 5 ′]-guanylyl- [3 ′ → 5 ′]-cytidylyl- [3 ′ → 5 ′]-uridylyl- [3 ′ → 5 ′]-guanylyl- [3 ′ → 5 ′]-adenylyl- [3 ′ → 5 ′]-guanylyl- [3 ′ → 5 ′]-uridylyl- [3 ′ → 5 ′]-adenylyl- [3 ′ → 5 ′]-cytidylyl- [3 ′ → 5 ′]-uridylyl- [3 ′ → 5 ′]-Uridylyl- [3 ′ → 5 ′]-Cytidylyl- [3 ′ → 5 ′]-g Anilyl- [3 ′ → 5 ′]-adenylyl- [3 ′ → 5 ′]-thymidyl- [3 ′ → 5 ′]-thymidine) was synthesized.
As a nucleic acid monomer compound, N 4 -acetyl-5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine 3′-O- (2-cyanoethyl N, N - diisopropylphosphoramidite Oro amidite), N 4 - acetyl -5'-O- (4,4'- dimethoxytrityl) -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) cytidine 3'-O- (2- cyanoethyl N , N-diisopropyl phosphoramidite), 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N- diisopropylphosphoramidite Oro amidite), N 4 - phenoxyacetyl -5'-O- (4,4'- dimethoxytrityl) -2'-O- (2- cyano ethoxymethyl) guanosine 3'-O- (2 Cyanoethyl N, N-diisopropyl phosphoramidite), benzyl mercaptotetrazole as a condensation catalyst, iodine solution as an oxidizing agent, and three types of reagents listed in Table 2 below as reagents used in the capping step, The compound was condensed 20 times.
For each oligo RNA produced under the above conditions, using ammonia water: ethanol = 3: 1 as a cleaving agent, cleaving from a CPG solid phase carrier at 40 ° C. for 4 hours and protecting each phosphate site and base site A group elimination reaction was performed. After each reaction mixture was filtered, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and then reacted at room temperature for 3 hours using 1M TBAF THF solution containing 1% of nitromethane to remove the protecting group at the 2′-position hydroxyl group. It was. Next, each reaction solution was dropped into ethanol to form a precipitate, and then the mother liquor and the precipitate were centrifuged. The mother liquor was removed by decantation, and the precipitate was purified by using an elution solvent (10 mM phosphate buffer containing 1.0 M sodium chloride aqueous solution) after removing unnecessary peaks with an anion exchange column (DEAE). The target compound was obtained after dialysis treatment of the solution. The yield and yield of oligonucleic acid when each of the above reagents is used are shown below.
From the above, by using 2-DMAP as an activator for acylation reaction and 2,6-lutidine as a phenoxyacetic acid derivative scavenger in the capping step, the isolation yield of oligonucleic acid is remarkably improved. It became clear.
本発明のキャッピング工程によれば、オリゴ核酸誘導体（２）に対して、十分満足できる効率でリボース５’位水酸基がアシル基で保護されたオリゴ核酸誘導体（１２）を製造することができる。
また、本発明のキャッピング工程によれば、アシル化反応の活性化剤として４−ＤＭＡＰを使用する場合のように、副生成物である２，６−ＤＡＰを生じない。
以上のとおり、本発明のキャッピング工程によれば、高純度でかつ簡便なオリゴ核酸の製造が可能である。
According to the capping step of the present invention, the oligonucleic acid derivative (12) in which the ribose 5′-hydroxyl group is protected with an acyl group can be produced with sufficient efficiency with respect to the oligonucleic acid derivative (2).
In addition, according to the capping step of the present invention, 2,6-DAP which is a by-product is not generated as in the case where 4-DMAP is used as an activator for the acylation reaction.
As described above, according to the capping step of the present invention, a highly pure and simple oligonucleic acid can be produced.
Claims (17)
各Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は次の一般式（３）で表される置換基を表す。
Ｅは、アシル又は次の一般式（４）で表される置換基を表す。
Ｔは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ、上記一般式（３）で表される置換基又は上記一般式（４）で表される置換基を表す。但し、Ｅ又はＴのどちらか一方は、置換基（４）である。In the capping step of protecting the 5′-position hydroxyl group of ribose of the oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (2) with an acyl group, an anhydrous phenoxyacetic acid derivative represented by the following general formula (11a) is used as an acylating agent. An oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (12), wherein a pyridine derivative represented by the following general formula (11b) or (11c) is used as an activator for an acylation reaction Manufacturing method.
Each R 4 is independently H, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkenyloxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamino, alkynyloxy, alkynylthio, alkynylamino, dialkynylamino, It represents a substituent represented by alkoxyalkyloxy or the following general formula (3).
E represents acyl or a substituent represented by the following general formula (4).
T is H, acyloxy, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkenyloxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamino, alkynyloxy, alkynylthio, alkynylamino, dialkynylamino, alkoxyalkyloxy, the above The substituent represented by the general formula (3) or the substituent represented by the general formula (4) is represented. However, either E or T is a substituent (4).
工程：
次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることを特徴とする、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程。
各Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は次の一般式（３）で表される置換基を表す。
Ｅは、アシル又は次の一般式（４）で表される置換基を表す。
Ｔは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ、上記一般式（３）で表される置換基又は上記一般式（４）で表される置換基を表す。但し、Ｅ又はＴのどちらか一方は、置換基（４）である。The manufacturing method of the oligonucleic acid represented by the following general formula (A) including the following process.
Process:
In the capping step of protecting the 5′-position hydroxyl group of ribose of the oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (2) with an acyl group, an anhydrous phenoxyacetic acid derivative represented by the following general formula (11a) is used as an acylating agent. An oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (12), wherein a pyridine derivative represented by the following general formula (11b) or (11c) is used as an activator for an acylation reaction Manufacturing process.
Each R 4 is independently H, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkenyloxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamino, alkynyloxy, alkynylthio, alkynylamino, dialkynylamino, It represents a substituent represented by alkoxyalkyloxy or the following general formula (3).
E represents acyl or a substituent represented by the following general formula (4).
T is H, acyloxy, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkenyloxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamino, alkynyloxy, alkynylthio, alkynylamino, dialkynylamino, alkoxyalkyloxy, the above The substituent represented by the general formula (3) or the substituent represented by the general formula (4) is represented. However, either E or T is a substituent (4).
工程Ａ：
次の一般式（１）で表されるオリゴ核酸誘導体に酸を作用させることによって、５’位の水酸基の保護基を脱離して、次の一般式（２）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程、
各ＷＧ２は、電子吸引性基を表す。各Ｒ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ又は次の一般式（３）で表される置換基を表す。
Ｅは、アシル又は次の一般式（４）で表される置換基を表す。
Ｔは、Ｈ、アシルオキシ、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルオキシ、アルケニルチオ、アルケニルアミノ、ジアルケニルアミノ、アルキニルオキシ、アルキニルチオ、アルキニルアミノ、ジアルキニルアミノ、アルコキシアルキルオキシ、上記一般式（３）で表される置換基又は上記一般式（４）で表される置換基を表す。但し、Ｅ又はＴのどちらか一方は、置換基（４）である。
工程Ｂ：
工程Ａにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（２）に、活性化剤を用いて核酸モノマー化合物を縮合させ、次の一般式（９）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程、
工程Ｃ：
工程Ｂにおいて未反応であるオリゴ核酸誘導体（２）のリボースの５’位水酸基をアシル基で保護するキャッピング工程において、アシル化剤として次の一般式（１１ａ）で表されるフェノキシ酢酸誘導体無水物を、アシル化反応の活性化剤として次の一般式（１１ｂ）又は（１１ｃ）で表されるピリジン誘導体を用いることを特徴とする、次の一般式（１２）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程、
工程Ｄ：
工程Ｂにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（９）に酸化剤を作用させることによって亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程、
工程Ｅ：
工程Ｄにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１３）を固相担体から切り出し、各核酸塩基部及び各リン酸基の保護基を脱離する工程、
工程Ｆ：
工程Ｅにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１４）に、各リボースの２’位水酸基の保護基を脱離するための試薬を作用させることによって、次の一般式（１５）で表されるオリゴ核酸誘導体を製造する工程、
工程Ｇ：
工程Ｆにおいて製造されるオリゴ核酸誘導体（１５）の５’位の水酸基を脱離する工程、
工程Ｇにおいて製造されるオリゴ核酸（Ａ）を分離精製する工程。The manufacturing method of the oligonucleic acid represented by the following general formula (A) including the following process AH.
Process A:
By reacting the oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (1) with an acid, the 5′-position hydroxyl protecting group is eliminated, and the oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (2) is obtained. Manufacturing process,
Each WG 2 represents an electron withdrawing group. Each R 4 is independently H, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkenyloxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamino, alkynyloxy, alkynylthio, alkynylamino, dialkynylamino, It represents a substituent represented by alkoxyalkyloxy or the following general formula (3).
E represents acyl or a substituent represented by the following general formula (4).
T is H, acyloxy, halogen, alkoxy, alkylthio, alkylamino, dialkylamino, alkenyloxy, alkenylthio, alkenylamino, dialkenylamino, alkynyloxy, alkynylthio, alkynylamino, dialkynylamino, alkoxyalkyloxy, the above The substituent represented by the general formula (3) or the substituent represented by the general formula (4) is represented. However, either E or T is a substituent (4).
Process B:
A step of condensing a nucleic acid monomer compound with an activating agent to the oligonucleic acid derivative (2) produced in step A to produce an oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (9);
Process C:
An phenoxyacetic acid derivative anhydride represented by the following general formula (11a) as an acylating agent in the capping step of protecting the 5′-position hydroxyl group of ribose of the oligonucleic acid derivative (2) unreacted in step B with an acyl group An oligonucleic acid derivative represented by the following general formula (12), wherein a pyridine derivative represented by the following general formula (11b) or (11c) is used as an activator for the acylation reaction: Manufacturing process,
Process D:
A step of converting a phosphite group into a phosphate group or a thiophosphate group by allowing an oxidant to act on the oligonucleic acid derivative (9) produced in the step B,
Process E:
Cleaving the oligonucleic acid derivative (13) produced in the step D from the solid phase carrier, and removing the protecting group of each nucleobase and each phosphate group,
Process F:
An oligonucleic acid represented by the following general formula (15) is allowed to act on the oligonucleic acid derivative (14) produced in step E by acting a reagent for removing the protecting group for the 2′-position hydroxyl group of each ribose. Producing a derivative;
Process G:
Removing the 5′-position hydroxyl group of the oligonucleic acid derivative (15) produced in step F,
A step of separating and purifying the oligonucleic acid (A) produced in the step G.
Ｒ１は、次の一般式（１０）で表される置換基を表す。
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、同一若しくは異なって、アルキルを表すか、又は、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂが隣接する窒素原子と一緒になって形成する、５〜６員の飽和アミノ環基を表す。かかる飽和アミノ環基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子又は硫黄原子を１個有していてもよい。ＷＧ１、ＷＧ２は、同一又は異なって、電子吸引性基を表す。In the process B, at least one uses the compound represented by the following general formula (B) as a nucleic acid monomer compound, The manufacturing method of the oligonucleic acid of Claim 11 characterized by the above-mentioned.
R 1 represents a substituent represented by the following general formula (10).
R 2a and R 2b are the same or different and each represents alkyl, or represents a 5- to 6-membered saturated amino ring group formed by R 2a and R 2b together with the adjacent nitrogen atom. Such a saturated amino ring group may have one oxygen atom or sulfur atom as a ring constituent atom in addition to the nitrogen atom. WG 1 and WG 2 are the same or different and represent an electron-withdrawing group.
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