RU2415862C2 - Phosphoramidite derivative and method of producing rna oligo - Google Patents

Phosphoramidite derivative and method of producing rna oligo Download PDF

Info

Publication number
RU2415862C2
RU2415862C2 RU2007110823/04A RU2007110823A RU2415862C2 RU 2415862 C2 RU2415862 C2 RU 2415862C2 RU 2007110823/04 A RU2007110823/04 A RU 2007110823/04A RU 2007110823 A RU2007110823 A RU 2007110823A RU 2415862 C2 RU2415862 C2 RU 2415862C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
group
general formula
compound
following general
stage
Prior art date
Application number
RU2007110823/04A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2007110823A (en
Inventor
Тадааки ОХГИ (JP)
Тадааки ОХГИ
Коуити ИСИЯМА (JP)
Коуити ИСИЯМА
Ютака МАСУТОМИ (JP)
Ютака МАСУТОМИ
Original Assignee
Ниппон Синяку Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ниппон Синяку Ко., Лтд. filed Critical Ниппон Синяку Ко., Лтд.
Publication of RU2007110823A publication Critical patent/RU2007110823A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2415862C2 publication Critical patent/RU2415862C2/en

Links

Images

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

FIELD: chemistry.
SUBSTANCE: invention relates to phosphoramidite derivatives of general formula
Figure 00000059
where Bx denotes adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil, where the amine group of adenine, guanine and cytosine can be optionally protected by a protective group selected from acetyl and phenoxyacetyl; R1 is a substitute of general formula
Figure 00000060
in which R11, R12 and R13 are identical or different, and each denotes hydrogen or alkoxy; R2a and R2b are identical or different, and each denotes alkyl; and WG1, WG2 denote a cyano group. The invention also pertains to a multistep method of producing the said compounds. The invention also relates to intermediate compounds of the said method, namely: an intermediate ether compound of general formula
Figure 00000061
where L is a halogen or a C1-C5alkylthio group; WG1 is a cyano group; an intermediate compound of general formula
Figure 00000062
where Bx denotes adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil, where the amine group of adesine, guanine and cytosine can be optionally protected by a protective group selected from an acetyl group and a phenoxyacetyl group; and WG1 denotes a cyano group; an intermediate compound of general formula
Figure 00000063
where Bx is as described above; R1 is a substitute of general formula (2); an intermediate compound of general formula
Figure 00000064
where Bx is as described above; A is a silicon-containing substitute of general formula
Figure 00000065
or
Figure 00000066
where R6 denotes alkyl and WG1 denotes a cyano group. The invention also relates to a method of producing an oligonucleotide of general formula
Figure 00000067
where each B independently denotes adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine; each R independently denotes H or hydroxyl and at least one of R denotes hydroxyl; Z denotes H or a phosphate group; and n is an integer between 1 and 100, involving steps A-G, characterised by use of said phosphoramidite derivatives as a monomer compound of nucleic acid at step B.
EFFECT: high yield.
7 cl, 1 dwg, 21 ex

Description

Область техники Technical field

Настоящее изобретение относится к новому производному фосфорамидита, в которое введена новая защитная группа по 2'-гидроксильной группе, и к реагенту для введения этой защитной группы.The present invention relates to a new derivative of phosphoramidite, which introduced a new protective group on the 2'-hydroxyl group, and to a reagent for introducing this protective group.

Уровень техникиState of the art

Олигорибонуклеиновые кислоты (олиго-РНК) являются полезными в качестве РНК-зондов для генного анализа, фармацевтических веществ на основе РНК (антисмысловые РНК, рибозимы, РНК для РНК-опосредуемого регулирования экспрессии генов), искусственных ферментов, и аптамеров (олигонуклеотидов, которые проявляют специфическое связывание с молекулой-мишенью). Способ твердофазного синтеза для получения олиго-РНК создали в конце восьмидесятых годов. В первом сообщении, касающемся этого способа, использовали производные фосфорамидитов с трет-бутилдиметилсилильной группой (TBDMS) или триизопропилсилильной группой (TIPS) в качестве защитной группы для 2'-гидроксильной группы (непатентный документ 1).Oligoribonucleic acids (oligo-RNAs) are useful as RNA probes for gene analysis, RNA-based pharmaceuticals (antisense RNAs, ribozymes, RNAs for RNA-mediated regulation of gene expression), artificial enzymes, and aptamers (oligonucleotides that exhibit specific binding to the target molecule). The solid-phase synthesis method for producing oligo-RNA was created in the late eighties. In a first communication regarding this method, tert- butyldimethylsilyl group derivatives (TBDMS) or triisopropylsilyl group (TIPS) were used as a protecting group for the 2'-hydroxyl group (Non-Patent Document 1).

В химическом синтезе олиго-РНК присутствует намного больше проблем, чем в химическом синтезе олигодезоксирибонуклеиновых кислот (олиго-ДНК), состоящих только из дезоксирибонуклеотидов.In the chemical synthesis of oligo-RNA, there are much more problems than in the chemical synthesis of oligodeoxyribonucleic acids (oligo-DNA), consisting only of deoxyribonucleotides.

Например, использование группы TBDMS в качестве защитной группы для 2'-гидроксильной группы может вызывать побочную реакцию, в которой группа TBDMS, защищающая 2'-гидроксильную группу, мигрирует к 3'-гидроксильной группе во время фосфитилирования 3'-гидроксильной группы. Кроме того, использование объемного заместителя, такого как группа TBDMS, в качестве защитной группы для 2'-гидроксильной группы, может снизить скорость реакции конденсации при образовании межнуклеотидной связи вследствие пространственного затруднения около атома фосфора в 3'-положении, возможно приводя к разрыву или перегруппировке межнуклеотидной связи во время удаления защитной группы для 2'-гидроксильной группы после олигомеризации.For example, using the TBDMS group as a protecting group for the 2'-hydroxyl group may cause a side reaction in which the TBDMS protecting the 2'-hydroxyl group migrates to the 3'-hydroxyl group during the phosphitylation of the 3'-hydroxyl group. In addition, the use of a bulky substituent, such as a TBDMS group, as a protective group for the 2'-hydroxyl group, can reduce the rate of the condensation reaction during the formation of the internucleotide bond due to spatial difficulty near the phosphorus atom in the 3'-position, possibly leading to rupture or rearrangement internucleotide linkage during deprotection of the 2'-hydroxyl group after oligomerization.

Для того чтобы преодолеть вышеприведенные проблемы, в настоящий момент изучаются более эффективные способы синтеза олиго-РНК.In order to overcome the above problems, more efficient methods of oligo-RNA synthesis are currently being studied.

В качестве защитной группы для 2'-гидроксильной группы известна 1-(2-цианоэтокси)этильная (CEE) группа, которую удаляют вместе с 3'- и 5'-защитной бис-силильной группой в нейтральной среде, обеспечивающей удаление бис-силильной защитной группы (непатентный документ 2).As a protective group for the 2'-hydroxyl group, a 1- (2-cyanoethoxy) ethyl (CEE) group is known which is removed together with the 3'- and 5'-protective bis-silyl group in a neutral medium, which removes the bis-silyl protective groups (non-patent document 2).

На основе этой информации Wada разработал производное фосфорамидита для получения олиго-РНК, в котором группа CEE, которая может быть удалена в нейтральной среде, является введенной в 2'-гидроксигруппу (непатентный документ 3 и непатентный документ 4). Однако, поскольку введение группы СЕЕ в положение 2'-гидроксильной группы приводит к образованию нового асимметричного центра, олиго-РНК, в которых 2'-гидроксильные группы являются защищенными группой СЕЕ, представляют собой диастереоизомерную смесь. Следовательно, очищение и выделение желательной олиго-РНК являются более сложными. К тому же, поскольку олиго-РНК, в которые была введена группа СЕЕ, имеют метильную группу на углероде, присоединенном к атому кислорода в положении 2', следует ожидать возникновения некоторого пространственного затруднения вокруг атома фосфора, присоединенного к 3'-гидроксильной группе, вызывающего опасения относительно снижения эффективности конденсации и скорости реакции конденсации.Based on this information, Wada developed a phosphoramidite derivative to produce oligo RNA in which the CEE group, which can be removed in a neutral medium, is introduced into the 2'-hydroxy group (non-patent document 3 and non-patent document 4). However, since the introduction of the CEE group at the position of the 2'-hydroxyl group leads to the formation of a new asymmetric center, oligo-RNAs in which the 2'-hydroxyl groups are protected by the CEE group are a diastereoisomeric mixture. Therefore, purification and isolation of the desired oligo RNA are more complex. In addition, since the oligon RNAs into which the CEE group was introduced have a methyl group on a carbon attached to the oxygen atom at position 2 ', some spatial difficulty around the phosphorus atom attached to the 3'-hydroxyl group is expected to cause Concerns about reduced condensation efficiency and condensation reaction rate.

Непатентный документ 1: N.A. Usman et al., Journal of the American Chemical Society, Vol. 109, 7845 (1987).Non-Patent Document 1: N.A. Usman et al., Journal of the American Chemical Society, Vol. 109, 7845 (1987).

Непатентный документ 2: Wolfgang Pfleiderer et al., Helvetica Chimica Acta, Vol. 81, 1545 (1998).Non-Patent Document 2: Wolfgang Pfleiderer et al., Helvetica Chimica Acta, Vol. 81, 1545 (1998).

Непатентный документ 3: Takeshi Wada, Bioindustry, Vol. 21, No. 1, 17 (2004).Non-Patent Document 3: Takeshi Wada, Bioindustry, Vol. 21, No. 1, 17 (2004).

Непатентный документ 4: T. Umemoto et al., Tetrahedron Letters, Vol. 45, 9529 (2004).Non-Patent Document 4: T. Umemoto et al., Tetrahedron Letters, Vol. 45, 9529 (2004).

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Задача, которая должна быть решена с помощью изобретенияThe task that must be solved using the invention

Основная цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить полезное и новое производное фосфорамидита для простого и высокопродуктивного способа синтеза олиго-РНК. Другая цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить новое эфирное соединение, которое может быть использовано для присоединения защитной группы к 2'-гидроксильной группе рибозы, при этом защитная группа может быть удалена в нейтральной cреде.The main objective of the present invention is to provide a useful and novel phosphoramidite derivative for a simple and highly productive method for the synthesis of oligo-RNA. Another objective of the present invention is to provide a new ether compound that can be used to attach a protective group to the 2'-hydroxyl group of the ribose, while the protective group can be removed in a neutral environment.

СРЕДСТВА ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧMEANS FOR SOLVING TASKS

После интенсивных и настойчивых исследований авторы настоящего изобретения нашли соединение, посредством которого можно достигнуть вышеприведенных целей, и таким образом осуществить настоящее изобретение.After intensive and persistent research, the authors of the present invention have found a compound by which the above objectives can be achieved, and thus the present invention.

I. Производное фосфорамидита настоящего изобретенияI. Derived phosphoramidite of the present invention

Настоящее изобретение может включать производное фосфорамидита, представленное следующей общей формулой (1) (в дальнейшем в этом документе именуется как производное фосфорамидита настоящего изобретения).The present invention may include a phosphoramidite derivative represented by the following general formula (1) (hereinafter referred to as the phosphoramidite derivative of the present invention).

Figure 00000001
Figure 00000001

в которойwherein

Bx представляет собой нуклеиновое основание, которое может иметь защитную группу;B x is a nucleic base which may have a protective group;

R1 представляет собой заместитель, представленный следующей общей формулой (2)R 1 represents a substituent represented by the following general formula (2)

Figure 00000002
Figure 00000002

в которойwherein

R11, R12 и R13 являются одинаковыми или различными, и каждый представляет собой водород или алкоксигруппу.R 11 , R 12 and R 13 are the same or different, and each represents hydrogen or an alkoxy group.

R2a и R2b являются одинаковыми или различными, и каждый представляет собой алкильную группу, или R2a и R2b, взятые вместе со смежным атомом азота, могут образовывать 5-6-членную насыщенную циклическую аминогруппу, при этом циклическая аминогруппа необязательно имеет атом кислорода или серы в составе цикла в дополнение к смежному атому азота; и WG1 и WG2 являются одинаковыми или различными, и каждый представляет собой электроноакцепторную группу.R 2a and R 2b are the same or different, and each represents an alkyl group, or R 2a and R 2b , taken together with an adjacent nitrogen atom, can form a 5-6 membered saturated cyclic amino group, while the cyclic amino group optionally has an oxygen atom or sulfur in the composition of the cycle in addition to the adjacent nitrogen atom; and WG 1 and WG 2 are the same or different, and each represents an electron withdrawing group.

Примеры нуклеинового основания Вх специально не ограничивают до тех пор, пока оно представляет собой нуклеиновое основание, используемое в синтезе нуклеиновой кислоты, и могут включать, например, аденин, гуанин, цитозин, урацил или их модифицированную форму.Examples of the nucleic base B x are not specifically limited as long as it is the nucleic base used in the synthesis of nucleic acid, and may include, for example, adenine, guanine, cytosine, uracil, or a modified form thereof.

Модифицированная форма нуклеинового основания означает соединение, в котором нуклеиновое основание несет один или более произвольных заместителей.A modified form of a nucleic base means a compound in which the nucleic base carries one or more arbitrary substituents.

Примеры заместителя для модифицированной формы Вх могут включать галоген, ацильную группу, алкильную группу, арилалкильную группу, алкоксигруппу, алкоксиалкильную группу, гидроксигруппу, аминогруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, карбоксигруппу, цианогруппу и нитрогруппу. Модифицированная форма Вх может быть замещена одним-тремя такими заместителями.Examples of the substituent for the modified Form B x may include a halogen, an acyl group, an alkyl group, an arylalkyl group, an alkoxy group, an alkoxyalkyl group, a hydroxy group, an amino group, a monoalkylamino group, a dialkylamino group, a carboxy group, a cyano group and a nitro group. The modified form B x may be substituted with one to three such substituents.

Нуклеиновое основание Вх может быть защищенным. Особенно предпочтительно, чтобы была защищенной аминогруппа нуклеинового основания, имеющего аминогруппу, такого как аденин, гуанин и цитозин.The nucleic base B x may be protected. It is particularly preferred that the amino group of the nucleic base having an amino group, such as adenine, guanine and cytosine, be protected.

Защитную группу аминогруппы особо не ограничивают до тех пор, пока она представляет собой защитную группу, используемую в качестве защитной группы нуклеиновой кислоты, и она может включать, например, бензоильную группу, 4-метоксибензоильную группу, ацетильную группу, пропионильную группу, бутирильную группу, изобутирильную группу, фенилацетильную группу, феноксиацетильную группу, 4-трет-бутилфеноксиацетильную группу, 4-изопропилфеноксиацетильную группу и (диметиламино)метиленовую группу.The protecting group of an amino group is not particularly limited as long as it is a protecting group used as a protecting group of a nucleic acid, and it may include, for example, a benzoyl group, a 4-methoxybenzoyl group, an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyl group group, phenylacetyl group, phenoxyacetyl group, 4- tert- butylphenoxyacetyl group, 4-isopropylphenoxyacetyl group and (dimethylamino) methylene group.

Примеры насыщенных циклических аминогрупп R2 могут включать пирролидин-1-ильную группу, пиперидин-1-ильную группу, морфолин-1-ильную группу и тиоморфолин-1-ильную группу.Examples of saturated cyclic amino groups of R 2 may include a pyrrolidin-1-yl group, a piperidin-1-yl group, a morpholin-1-yl group and a thiomorpholin-1-yl group.

Электроноакцепторные группы WG1 и WG2 могут включать цианогруппу, нитрогруппу, алкилсульфогруппу и галоген. Среди них цианогруппа является предпочтительной.The electron withdrawing groups WG 1 and WG 2 may include a cyano group, a nitro group, an alkyl sulfo group, and a halogen. Among them, a cyano group is preferred.

Примеры галогена производного фосфорамидита настоящего изобретения могут включать фтор, хлор, бром и йод.Examples of the halogen derivative of the phosphoramidite of the present invention may include fluorine, chlorine, bromine and iodine.

Примеры ацильной группы производного фосфорамидита настоящего изобретения могут включать линейную или разветвленную алканоильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, и ароильную группу, имеющую 7-13 атомов углерода. Более конкретно, ацильная группа может включать, например, формильную группу, ацетильную группу, н-пропионильную группу, изопропионильную группу, н-бутироильную группу, изобутироильную группу, трет-бутироильную группу, валероильную группу, гексаноильную группу, бензоильную группу, нафтоильную группу и левулиноильную (ß-ацетилпропионильную) группу.Examples of the acyl group of the phosphoramidite derivative of the present invention may include a linear or branched alkanoyl group having 1-6 carbon atoms and an aroyl group having 7-13 carbon atoms. More specifically, the acyl group may include, for example, a formyl group, an acetyl group, an n-propionyl group, an isopropionyl group, an n-butyroyl group, an isobutyroyl group, a tert- butyroyl group, a valeroyl group, a hexanoyl group, a benzoyl group, a naphthoyl group, and a levulinoyl group (ß-acetylpropionyl) group.

Примеры алкильной группы производного фосфорамидита настоящего изобретения могут включать линейную или разветвленную алкильную группу, имеющую 1-5 атомов углерода. Более конкретно, алкильная группа может включать, например, метильную группу, этильную группу, н-пропильную группу, изопропильную группу, н-бутильную группу, изобутильную группу, втор-бутильную группу, трет-бутильную группу, н-пентильную группу, изопентильную группу, неопентильную группу и трет-пентильную группу. Алкильная группа может быть замещена, и примеры заместителя могут включать галоген, алкильную группу, алкоксигруппу, цианогруппу и нитрогруппу. Алкильная группа может быть замещена одним-тремя такими заместителями.Examples of the alkyl group of the phosphoramidite derivative of the present invention may include a linear or branched alkyl group having 1-5 carbon atoms. More specifically, an alkyl group may include, for example, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec- butyl group, a tert- butyl group, an n-pentyl group, an isopentyl group, neopentyl group and tert- pentyl group. An alkyl group may be substituted, and examples of a substituent may include a halogen, an alkyl group, an alkoxy group, a cyano group and a nitro group. An alkyl group may be substituted with one to three such substituents.

Примеры алкильной части арилалкильной группы, алкоксиалкильной группы, моноалкиламиногруппы, диалкиламиногруппы и алкилсульфогруппы в производном фосфорамидита настоящего изобретения могут включать алкильные группы, идентичные приведенным выше.Examples of the alkyl portion of the arylalkyl group, alkoxyalkyl group, monoalkylamino group, dialkylamino group and alkyl sulfo group in the phosphoramidite derivative of the present invention may include alkyl groups identical to the above.

Примеры алкоксигруппы производного фосфорамидита настоящего изобретения могут включать линейную или разветвленную алкоксигруппу, имеющую 1-4 атома углерода. Более конкретно, алкоксигруппа может включать, например, метоксигруппу, этоксигруппу, н-пропоксигруппу, изопропоксигруппу, н-бутоксигруппу, изобутоксигруппу, втор-бутоксигруппу и трет-бутоксигруппу. Среди них алкоксигруппы, имеющие 1-3 атома углерода, являются предпочтительными, а метоксигруппа является более предпочтительной.Examples of the alkoxy group of the phosphoramidite derivative of the present invention may include a linear or branched alkoxy group having 1-4 carbon atoms. More specifically, an alkoxy group may include, for example, a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, an n-butoxy group, an isobutoxy group, a sec -butoxy group and a t -butoxy group. Among them, alkoxy groups having 1 to 3 carbon atoms are preferred, and a methoxy group is more preferred.

Примеры алкоксичасти алкоксиалкильной группы производного фосфорамидита настоящего изобретения могут включать алкоксигруппы, идентичные приведенным выше.Examples of the alkoxy moieties of the alkoxyalkyl group of the phosphoramidite derivative of the present invention may include alkoxy groups identical to the above.

Примеры арильной части арилалкильной группы производного фосфорамидита настоящего изобретения могут включать арильные группы, имеющие 6-12 атомов углерода.Examples of the aryl portion of the arylalkyl group of the phosphoramidite derivative of the present invention may include aryl groups having 6-12 carbon atoms.

Конкретно, арильная группа может включать, например, фенильную группу, 1-нафтильную группу, 2-нафтильную группу и бифенильную группу. Арильная группа может быть замещена, и примеры заместителя могут включать галоген, алкильную группу, алкоксигруппу, цианогруппу и нитрогруппу. Арильная группа может быть замещена одним-тремя такими заместителями. Примеры галогена, алкильной группы и алкоксигруппы, которые являются заместителями алкильной или арильной группы производного фосфорамидита настоящего изобретения, могут включать, соответственно, группы, идентичные приведенным выше.Specifically, an aryl group may include, for example, a phenyl group, a 1-naphthyl group, a 2-naphthyl group, and a biphenyl group. An aryl group may be substituted, and examples of the substituent may include a halogen, an alkyl group, an alkoxy group, a cyano group and a nitro group. The aryl group may be substituted with one to three such substituents. Examples of a halogen, an alkyl group and an alkoxy group which are substituents of the alkyl or aryl group of the phosphoramidite derivative of the present invention may include, respectively, groups identical to the above.

Производное фосфорамидита настоящего изобретения может быть использовано в качестве реагента для получения олиго-РНК. Производное фосфорамидита настоящего изобретения представляет собой производное фосфорамидита, имеющее защитную группу эфирного типа в положении 2'-гидроксильной группы, которая может быть удалена в нейтральной среде. Кроме того, производное фосфорамидита настоящего изобретения отличается тем, что реакция конденсации протекает за более короткое время и приводит к лучшему выходу во время синтеза олиго-РНК по сравнению с традиционным производным фосфорамидита. Так происходит потому, что защитная группа эфирного типа, введенная в 2'-гидроксильную группу, является линейной защитной группой и, следовательно, не создает стерических затруднений в пространстве вокруг атома фосфора, присоединенного к 3'-гидроксильной группе. Производное фосфорамидита настоящего изобретения делает возможным получение олиго-РНК высокой степени чистоты способом, по существу идентичным способу, используемому в производстве олиго-ДНК.The phosphoramidite derivative of the present invention can be used as a reagent to produce oligo RNA. The phosphoramidite derivative of the present invention is a phosphoramidite derivative having an ether type protecting group at the position of the 2'-hydroxyl group, which can be removed in a neutral environment. In addition, the phosphoramidite derivative of the present invention is characterized in that the condensation reaction proceeds in a shorter time and leads to a better yield during oligo-RNA synthesis compared to the conventional phosphoramidite derivative. This is because the ester type protecting group introduced into the 2'-hydroxyl group is a linear protecting group and therefore does not create steric hindrances in the space around the phosphorus atom attached to the 3'-hydroxyl group. The phosphoramidite derivative of the present invention makes it possible to obtain high purity oligo-RNA in a manner substantially identical to that used in the production of oligo-DNA.

В настоящем документе термин «олиго-ДНК» означает олигонуклеиновую кислоту, имеющую только дезоксирибонуклеотиды. К тому же, в настоящем документе термин «олиго-РНК» означает олигонуклеиновую кислоту, содержащую, по меньшей мере, один рибонуклеотид, и которая также может иметь один или более дезоксирибонуклеотидов.As used herein, the term “oligo DNA” means an oligonucleic acid having only deoxyribonucleotides. Moreover, as used herein, the term “oligo-RNA” means an oligonucleic acid containing at least one ribonucleotide, and which may also have one or more deoxyribonucleotides.

Конкретные примеры производного фосфорамидита настоящего изобретения могут включать следующие соединения 1-5:Specific examples of the phosphoramidite derivative of the present invention may include the following compounds 1-5:

1.one.

N6-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит)N 6 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite)

2.2.

N2-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит)N 2 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite)

3.3.

N2-феноксиацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит)N 2 -phenoxyacetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite)

4.four.

N4-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит)N 4- Acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite)

5.5.

5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит)5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite)

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Чертеж показывает хроматограмму, полученную методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой.The drawing shows a chromatogram obtained by high performance liquid chromatography (HPLC) with reverse phase.

На чертеже вертикальная ось указывает время (мин) и горизонтальная ось указывает оптическое поглощение.In the drawing, the vertical axis indicates time (min) and the horizontal axis indicates optical absorption.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

II. Способ получения производного фосфорамидита настоящего изобретенияII. The method of obtaining the phosphoramidite derivative of the present invention

Производное фосфорамидита настоящего изобретения может быть получено следующим образом.The phosphoramidite derivative of the present invention can be prepared as follows.

В следующем способе получения в тех случаях, когда исходные вещества имеют заместитель, который оказывает влияние на реакцию (например, гидроксильная группа, аминогруппа и карбоксигруппа), эти исходные вещества традиционно используют в реакции, защищая их соответствующей защитной группой в соответствии с известным способом.In the following preparation method, in cases where the starting materials have a substituent that affects the reaction (for example, a hydroxyl group, an amino group and a carboxy group), these starting materials are traditionally used in the reaction, protecting them with an appropriate protecting group in accordance with a known method.

После завершения реакции защитная группа может быть удалена известным способом, таким как каталитическое восстановление, щелочная обработка, кислотная обработка или т.п. Производное фосфорамидита настоящего изобретения может быть получено из известного соединения или промежуточного соединения, которое может быть легко получено, например, посредством следующих стадий а-h.After completion of the reaction, the protecting group can be removed in a manner known per se, such as catalytic reduction, alkaline treatment, acid treatment or the like. The phosphoramidite derivative of the present invention can be obtained from a known compound or intermediate, which can be easily obtained, for example, by the following steps a to h.

Способ получения производного фосфорамидита настоящего изобретения описан подробно ниже.A method for producing the phosphoramidite derivative of the present invention is described in detail below.

(1) Стадия а:(1) Stage a:

Процесс получения производного нуклеозида, представленного следующими общими формулами (15) и (15'), где защитную группу эфирного типа, которая может быть удалена в нейтральной среде, вводят по 2'-гидроксильной группе путем воздействия алкилирующего реагента на производное нуклеозида, представленное следующей общей формулой (14)The process of obtaining a nucleoside derivative represented by the following general formulas (15) and (15 '), where an ether type protecting group that can be removed in a neutral medium is introduced at the 2'-hydroxyl group by the action of an alkylating reagent on a nucleoside derivative represented by the following general formula (14)

Figure 00000003
Figure 00000003

гдеWhere

Вх, R1 и WG1 такие, как определено выше.In x , R 1 and WG 1 are as defined above.

Примеры алкилирующего реагента могут включать эфирное соединение, представленное следующей общей формулой (13)Examples of the alkylating reagent may include an ester compound represented by the following general formula (13)

Figure 00000004
Figure 00000004

в которойwherein

L представляет собой галоген, арилтиогруппу, алкилсульфоксидную группу или алкилтиогруппу; и WG1 такая, как определено выше.L represents a halogen, an arylthio group, an alkyl sulfoxide group or an alkylthio group; and WG 1 is as defined above.

Примеры галогена, арильной части арилтиогруппы, и алкильных частей алкилсульфоксидной группы и алкилтиогруппы L могут включать соответственно такие же галоген, арильную и алкильную группы, как галоген, арильная и алкильная группы производного фосфорамидита настоящего изобретения.Examples of the halogen, the aryl part of the arylthio group, and the alkyl parts of the alkyl sulfoxide group and the alkylthio group L may include, respectively, the same halogen, aryl and alkyl groups as the halogen, aryl and alkyl groups of the phosphoramidite derivative of the present invention.

Конкретные примеры эфирного соединения (13) могут включать следующие соединения 1 и 2:Specific examples of the ester compound (13) may include the following compounds 1 and 2:

1. Хлорметил 2-цианоэтиловый эфир 1. Chloromethyl 2-cyanoethyl ether

2. 2-Цианоэтилметилтиометиловый эфир 2.2 2-Cyanoethylmethylthiomethyl ether

Эфирное соединение (13) представляет собой новый алкилирующий реагент, который может вводить заместитель эфирного типа, который является удаляемым в нейтральной среде, в положение 2'-гидроксильной группы в щелочной среде, и который является полезным в качестве реагента для получения производного фосфорамидита настоящего изобретения.The ester compound (13) is a new alkylating reagent that can introduce an ether type substituent that is removable in a neutral medium to the position of the 2'-hydroxyl group in an alkaline medium, and which is useful as a reagent for preparing the phosphoramidite derivative of the present invention.

Эфирное соединение (13) может быть получено посредством следующих стадий 1-4.The ester compound (13) can be obtained by the following steps 1-4.

Стадия 1:Stage 1:

Процесс получения соединения, представленного следующей общей формулой (24), путем алкилтиометилирования спиртового соединения, представленного следующей общей формулой (20)The process of obtaining the compound represented by the following general formula (24) by alkylthiomethylation of an alcohol compound represented by the following general formula (20)

Figure 00000005
Figure 00000005

в которойwherein

WG1 такая, как определено выше; и WG 1 is as defined above; and

R3 представляет собой алкильную или арильную группу.R 3 represents an alkyl or aryl group.

Соединение (24) представляет собой эфирное соединение (13), где L является алкилтиогруппой.Compound (24) is an ester compound (13), where L is an alkylthio group.

Примеры алкильной группы для R3 могут включать такую же алкильную группу, как алкильная группа производного фосфорамидита настоящего изобретения.Examples of the alkyl group for R 3 may include the same alkyl group as the alkyl group of the phosphoramidite derivative of the present invention.

В тех случаях, когда R3 представляет собой метильную группу, примеры алкилтиометилирующего реагента могут включать смешанный растворитель, содержащий диметилсульфоксид, уксусный ангидрид и уксусную кислоту. Количество диметилсульфоксида, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 10-200 моль на моль соединения (20) и предпочтительно 20-100 моль на моль соединения. Количество уксусной кислоты, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 10-150 моль на моль соединения (20) и предпочтительно 20-100 моль на моль соединения. Количество уксусного ангидрида, которое должно быть использовано, может находиться в диапазоне 10-150 моль на моль соединения (20) и предпочтительно 20-100 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно колеблется в пределах диапазона 0-100ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 1 до 48 час.In those instances where R 3 is a methyl group, examples of the alkylthiomethylating reagent may include a mixed solvent containing dimethyl sulfoxide, acetic anhydride and acetic acid. The amount of dimethyl sulfoxide to be used can range from 10-200 mol per mol of compound (20) and preferably 20-100 mol per mol of compound. The amount of acetic acid to be used can range from 10-150 mol per mol of compound (20) and preferably 20-100 mol per mol of compound. The amount of acetic anhydride to be used may be in the range of 10-150 mol per mol of compound (20), and preferably 20-100 mol per mol of compound. The reaction temperature preferably ranges from 0-100 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 1 to 48 hours.

Стадия 2:Stage 2:

Процесс получения соединения, представленного следующей общей формулой (25), путем галогенирования соединения (24).The process of obtaining the compound represented by the following general formula (25) by halogenating the compound (24).

Figure 00000006
Figure 00000006

в которойwherein

WG1 и R3 такие, как определено выше; и WG 1 and R 3 are as defined above; and

X2 представляет собой галоген.X 2 is halogen.

Соединение (25) представляет собой соединение, где L эфирного соединения (13) является галогеном.Compound (25) is a compound wherein L of the ether compound (13) is halogen.

Примеры галогена в Х2 могут включать такой же галоген, как галоген производного фосфорамидита настоящего изобретения.Examples of the halogen in X 2 may include the same halogen as the halogen of the phosphoramidite derivative of the present invention.

Эта стадия может быть выполнена известным способом (например, T. Benneche et al., Synthesis 762 (1983)).This step can be performed in a known manner (e.g., T. Benneche et al., Synthesis 762 (1983)).

Примеры растворителя, который должен быть использован, особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, галогенированный углеводород, такой как дихлорметан, хлороформ, тетрахлорид углерода и 1,2-дихлорэтан.Examples of the solvent to be used are not particularly limited unless they are involved in the reaction and may include, for example, a halogenated hydrocarbon such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride and 1,2-dichloroethane.

Примеры галогенирующего агента могут включать сульфурилхлорид и оксихлорид фосфора.Examples of a halogenating agent may include sulfuryl chloride and phosphorus oxychloride.

Количество галогенирующего агента, которое должно быть использовано, соответственно может колебаться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (24) и предпочтительно 1-10 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно колеблется в пределах диапазона 0-100ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 30 мин до 24 час.The amount of halogenating agent to be used can accordingly vary within the range of 1-20 mol per mol of compound (24) and preferably 1-10 mol per mol of compound. The reaction temperature preferably ranges from 0-100 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 30 minutes to 24 hours.

Стадия 3:Stage 3:

Процесс получения соединения, представленного следующей общей формулой (25а), путем арилтиолирования соединения (25).The process of obtaining the compound represented by the following general formula (25a) by arylthiolation of the compound (25).

Figure 00000007
Figure 00000007

в которойwherein

WG1 и Х2 такие, как определено выше; и WG 1 and X 2 are as defined above; and

R представляет собой арильную группу.R 3a represents an aryl group.

Соединение (25а) представляет собой соединение класса эфирных соединений (13), где L является арилтиогруппой. Примеры арильной группы для R могут включать арильную группу, идентичную арильной группе производного фосфорамидита настоящего изобретения. Эта стадия может быть выполнена известным способом. Примеры растворителя, который должен быть использован, особенным образом не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, дихлорметан и ацетонитрил. Примеры арилтиолирующего реагента могут включать тиофенол и 4-метилтиофенол. Количество арилтиолирующего реагента, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (25) и предпочтительно 1-5 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно находится в диапазоне 0-100ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 1 до 48 час.Compound (25a) is a compound of the class of ether compounds (13), where L is an arylthio group. Examples of the aryl group for R 3a may include an aryl group identical to the aryl group of the phosphoramidite derivative of the present invention. This stage can be performed in a known manner. Examples of the solvent to be used are not particularly limited, unless they are involved in the reaction, and may include, for example, dichloromethane and acetonitrile. Examples of the arylthiol reagent may include thiophenol and 4-methylthiophenol. The amount of the arylthiol reagent to be used can range from 1-20 mol per mol of compound (25) and preferably 1-5 mol per mol of compound. The reaction temperature is preferably in the range of 0-100 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 1 to 48 hours.

Стадия 4:Stage 4:

Процесс получения соединения, представленного следующей общей формулой (24а), путем окисления соединения (24).The process of obtaining the compound represented by the following general formula (24a) by oxidizing the compound (24).

Figure 00000008
Figure 00000008

в которойwherein

WG1 и R3 такие, как определено выше.WG 1 and R 3 are as defined above.

Соединение (24а) представляет собой соединение класса эфирных соединений (13), где L является алкилсульфоксидной группой. Примеры алкильной группы R3 могут включать алкильную группу, идентичную алкильной группе производного фосфорамидита настоящего изобретения.Compound (24a) is a compound of the class of ether compounds (13), where L is an alkyl sulfoxide group. Examples of the alkyl group R 3 may include an alkyl group identical to the alkyl group of the phosphoramidite derivative of the present invention.

Эта стадия может быть выполнена известным способом. Примеры растворителя, который должен быть использован, особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, дихлорметан, хлороформ и метанол. Примеры окислителя могут включать метахлорпербензойную кислоту, метапериодатную соль и пероксид водорода. Количество окислителя, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-10 моль на моль соединения (24) и предпочтительно 1-2 моля на моль соединения. Температура реакции предпочтительно находится в диапазоне 0-100ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 1 до 48 час.This stage can be performed in a known manner. Examples of the solvent to be used are not particularly limited, except where it is involved in the reaction, and may include, for example, dichloromethane, chloroform and methanol. Examples of the oxidizing agent may include metachloroperbenzoic acid, metaperiodate salt and hydrogen peroxide. The amount of oxidizing agent to be used can range from 1-10 mol per mol of compound (24), and preferably 1-2 mol per mol of compound. The reaction temperature is preferably in the range of 0-100 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 1 to 48 hours.

В тех случаях, когда в качестве алкилирующего реагента используют соединение (25), эта стадия может быть выполнена следующим образом.In those cases where the compound (25) is used as the alkylating reagent, this step can be performed as follows.

Стадия может быть выполнена путем взаимодействия алкилирующего реагента и основания с соединением (14), которое имеется в продаже или является синтезированным в соответствии с известным способом.The step can be performed by reacting an alkylating reagent and a base with a compound (14), which is commercially available or synthesized in accordance with a known method.

Примеры растворителя, который должен быть использован, особенным образом не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, галогенированный углеводород, такой как дихлорметан, хлороформ, тетрахлорид углерода и 1,2-дихлорэтан. Количество алкилирующего реагента, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (14) и предпочтительно 1-10 моль на моль соединения. На этой стадии при необходимости алкилирующий реагент может быть подвергнут реакции посредством промежуточного соединения, получаемого взаимодействием металлсодержащего реагента и основания с соединением (14). Примеры металлсодержащего реагента могут включать дибутилоловодихлорид. Количество металлсодержащего реагента, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (14) и предпочтительно 1-10 моль на моль этого соединения. Примеры основания могут включать органическое основание, такое как пиридин, 2,6-диметилпиридин, 2,4,6-триметилпиридин, N-метилимидазол, триэтиламин, трибутиламин, N,N-диизопропилэтиламин и 1,8-диазабицикло[5.4.0]-7-ундецен. Количество основания, которое должно быть использовано, может находиться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (14) и предпочтительно 1-10 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно колеблется в пределах диапазона 0-120ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 30 мин до 24 час.Examples of the solvent to be used are not particularly limited, unless they are involved in the reaction, and may include, for example, a halogenated hydrocarbon such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride and 1,2-dichloroethane. The amount of alkylating reagent to be used can range from 1-20 mol per mol of compound (14), and preferably 1-10 mol per mol of compound. At this stage, if necessary, the alkylating reagent can be reacted with an intermediate compound obtained by reacting a metal-containing reagent and a base with compound (14). Examples of the metal-containing reagent may include dibutyltin dichloride. The amount of metal-containing reagent to be used can range from 1-20 mol per mol of compound (14) and preferably 1-10 mol per mol of this compound. Examples of the base may include an organic base such as pyridine, 2,6-dimethylpyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, N-methylimidazole, triethylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine and 1,8-diazabicyclo [5.4.0] - 7-undecene. The amount of base to be used may be within the range of 1-20 mol per mol of compound (14), and preferably 1-10 mol per mol of compound. The reaction temperature preferably ranges from 0-120 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 30 minutes to 24 hours.

В тех случаях, когда в качестве алкилирующего реагента используют соединение (24) или (25а), эта стадия может быть выполнена следующим образом.In cases where the compound (24) or (25a) is used as the alkylating reagent, this step can be performed as follows.

Стадия может быть выполнена путем взаимодействия алкилирующего реагента, кислоты и реагента для галогенирования атома серы с соединением (14), которое имеется в продаже или является синтезированным в соответствии с известным способом (например, M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 (1990)). Количество алкилирующего реагента, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-5 моль на моль соединения (14) и предпочтительно 1,05-3 моля на моль соединения. Примеры кислоты могут включать трифторметансульфокислоту, трифторметансульфонат серебра и триметилсилилтрифторметансульфонат. Количество кислоты, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 0,01-20 моль на моль соединения (14) и предпочтительно 0,02-10 моль на моль соединения. Примеры растворителя, который должен быть использован, особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, дихлорметан, хлороформ, тетрахлорид углерода, 1,2-дихлорэтан, бензол, толуол, ксилол, тетрагидрофуран, ацетонитрил и их смеси. Примеры реагента для галогенирования атома серы, который должен быть использован на этой стадии, могут включать N-бромсукцинимид (NBS) и N-йодсукцинимид (NIS). Количество реагента для галогенирования атома серы, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-10 моль на моль соединения (14) и предпочтительно 1,05-5 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона -78-30ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 5 мин до 5 час.The step can be performed by reacting an alkylating reagent, an acid and a halogenation reagent for sulfur atom with a compound (14), which is commercially available or synthesized in accordance with a known method (e.g., M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 ( 1990)). The amount of alkylating reagent to be used can range from 1-5 mol per mol of compound (14), and preferably 1.05-3 mol per mol of compound. Examples of the acid may include trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate. The amount of acid to be used can range from 0.01-20 mol per mol of compound (14), and preferably 0.02-10 mol per mol of compound. Examples of the solvent to be used are not particularly limited, except when it is involved in the reaction, and may include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, benzene, toluene, xylene, tetrahydrofuran, acetonitrile and mixtures thereof. Examples of a sulfur atom halogenation reagent to be used in this step may include N-bromosuccinimide (NBS) and N-iodosuccinimide (NIS). The amount of sulfur atom halogenation reagent to be used can range from 1-10 mol per mol of compound (14) and preferably 1.05-5 mol per mol of compound. The reaction temperature is preferably within the range of -78-30 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 5 minutes to 5 hours.

В тех случаях, когда в качестве алкилирующего реагента используют соединение (24а), эта стадия может быть выполнена следующим образом.In cases where the compound (24a) is used as the alkylating reagent, this step can be performed as follows.

Стадия может быть выполнена путем взаимодействия алкилирующего реагента, ангидрида кислоты и основания с соединением (14), которое имеется в продаже или является синтезированным в соответствии с известным способом. Количество алкилирующего реагента, которое должно быть использовано, может находиться в пределах диапазона 1-5 моль на моль соединения (14) и предпочтительно 1,05-3 моля на моль соединения. Примеры ангидрида кислоты могут включать ангидрид трифторметансульфокислоты и уксусный ангидрид. Количество ангидрида кислоты, которое должно быть использовано, может находиться в пределах диапазона 0,01-20 моль на моль соединения (14) и предпочтительно 0,02-10 моль на моль соединения. Примеры основания могут включать тетраметилмочевину и коллидин. Количество основания, которое должно быть использовано, может находиться в пределах диапазона 0,01-20 моль на моль соединения (14) и предпочтительно 0,02-10 моль на моль соединения. Примеры растворителя, который должен быть использован, особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, дихлорметан, хлороформ, тетрахлорид углерода, 1,2-дихлорэтан и их смеси. Температура реакции предпочтительно колеблется в пределах диапазона -78-30ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 5 мин до 24 час.The step can be performed by reacting an alkylating reagent, an acid anhydride and a base with a compound (14), which is commercially available or synthesized in accordance with a known method. The amount of alkylating reagent to be used may be within the range of 1-5 mol per mol of compound (14) and preferably 1.05-3 mol per mol of compound. Examples of acid anhydride may include trifluoromethanesulfonic anhydride and acetic anhydride. The amount of acid anhydride to be used may be within the range of 0.01-20 mol per mol of compound (14), and preferably 0.02-10 mol per mol of compound. Examples of the base may include tetramethylurea and collidine. The amount of base to be used may be within the range of 0.01-20 mol per mol of compound (14), and preferably 0.02-10 mol per mol of compound. Examples of the solvent to be used are not particularly limited, except where it is involved in the reaction, and may include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane and mixtures thereof. The reaction temperature preferably ranges from -78-30 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 5 minutes to 24 hours.

(2) Стадия b:(2) Stage b:

Процесс выделения и очистки производного нуклеозида (15), полученного посредством стадии (а)The process of isolation and purification of the nucleoside derivative (15) obtained through stage (a)

На этой стадии производное нуклеозида может быть выделено и очищено из смеси, полученной посредством стадии (а), путем использования стандартного метода выделения и очистки, такого как тонкослойная хроматография, колоночная хроматография на силикагеле или т.п.At this stage, the nucleoside derivative can be isolated and purified from the mixture obtained by step (a) by using a standard isolation and purification method, such as thin layer chromatography, silica gel column chromatography, or the like.

(3) Стадия с:(3) Stage with:

Процесс, который осуществляют отдельно от стадии b, для получения соединения рибонуклеиновой кислоты, представленного следующей общей формулой (17), где защитную группу эфирного типа, которая может быть удалена в нейтральной среде, вводят по 2'-гидроксильной группе путем воздействия алкилирующего реагента на соединение рибонуклеиновой кислоты, представленное следующей общей формулой (16)The process, which is carried out separately from step b, to produce a ribonucleic acid compound represented by the following general formula (17), wherein the ester type protecting group, which can be removed in a neutral medium, is introduced at the 2'-hydroxyl group by the action of an alkylating reagent on the compound ribonucleic acid represented by the following general formula (16)

Figure 00000009
Figure 00000009

в которойwherein

Вх и WG1 такие, как определено выше; и In x and WG 1 are as defined above; and

А представляет собой кремнесодержащий заместитель, представленный следующей общей формулой (18а) или (18b)A is a silicon-containing substituent represented by the following general formula (18a) or (18b)

Figure 00000010
Figure 00000010

в которойwherein

R6 представляет собой алкильную группу.R 6 represents an alkyl group.

Примеры алкильной группы для R6 могут включать алкильную группу, идентичную алкильной группе производного фосфорамидита настоящего изобретения.Examples of the alkyl group for R 6 may include an alkyl group identical to the alkyl group of the phosphoramidite derivative of the present invention.

Примеры алкилирующего реагента могут включать алкилирующие реагенты, идентичные приведенным выше.Examples of the alkylating reagent may include alkylating reagents identical to those given above.

В тех случаях, когда в качестве алкилирующего реагента используют соединение (25), эта стадия может быть выполнена следующим образом.In those cases where the compound (25) is used as the alkylating reagent, this step can be performed as follows.

Стадия может быть выполнена путем взаимодействия алкилирующего реагента и основания с соединением (16), которое имеется в продаже или является синтезированным в соответствии с известным способом.The step can be performed by reacting an alkylating reagent and a base with a compound (16), which is commercially available or synthesized in accordance with a known method.

Примеры растворителя, который должен быть использован, особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, галогенированный углеводород, такой как дихлорметан, хлороформ, тетрахлорид углерода и 1,2-дихлорэтан. Количество алкилирующего реагента, которое должно быть использовано, может находиться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (14) и предпочтительно 1-10 моль на моль соединения. На этой стадии при необходимости алкилирующий реагент может быть подвергнут реакции посредством промежуточного соединения, получаемого взаимодействием металлсодержащего реагента и основания с соединением (16). Примеры металлсодержащего реагента могут включать дибутилоловодихлорид и трет-бутилмагнийхлорид. Количество металлсодержащего реагента, которое должно быть использовано, может находиться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (16) и предпочтительно 1-10 моль на моль этого соединения. Примеры основания могут включать органическое основание, такое как пиридин, 2,6-диметилпиридин, 2,4,6-триметилпиридин, N-метилимидазол, триэтиламин, трибутиламин, N,N-диизопропилэтиламин и 1,8-диазабицикло[5.4.0]-7-ундецен. Количество основания, которое должно быть использовано, может находиться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (16) и предпочтительно 1-10 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона 0-120ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 30 мин до 24 час.Examples of the solvent to be used are not particularly limited unless they are involved in the reaction and may include, for example, a halogenated hydrocarbon such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride and 1,2-dichloroethane. The amount of alkylating reagent to be used may be within the range of 1-20 mol per mol of compound (14), and preferably 1-10 mol per mol of compound. At this stage, if necessary, the alkylating reagent can be reacted by means of an intermediate compound obtained by reacting a metal-containing reagent and a base with compound (16). Examples of the metal-containing reagent may include dibutyltin dichloride and tert-butyl magnesium chloride. The amount of metal-containing reagent to be used may be within the range of 1-20 mol per mol of compound (16), and preferably 1-10 mol per mol of this compound. Examples of the base may include an organic base such as pyridine, 2,6-dimethylpyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, N-methylimidazole, triethylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine and 1,8-diazabicyclo [5.4.0] - 7-undecene. The amount of base to be used may be within the range of 1-20 mol per mol of compound (16), and preferably 1-10 mol per mol of compound. The reaction temperature is preferably within the range of 0-120 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 30 minutes to 24 hours.

В тех случаях, когда в качестве алкилирующего реагента используют соединение (24) или (25а), эта стадия может быть выполнена следующим образом.In cases where the compound (24) or (25a) is used as the alkylating reagent, this step can be performed as follows.

Стадия может быть выполнена путем взаимодействия алкилирующего реагента, кислоты и реагента для галогенирования атома серы с соединением (16), которое имеется в продаже или является синтезированным в соответствии с известным способом (например, M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 (1990)). Количество алкилирующего реагента, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-5 моль на моль соединения (16) и предпочтительно 1,05-3 моля на моль соединения. Примеры кислоты могут включать трифторметансульфокислоту, трифторметансульфонат серебра и триметилсилил-трифторметансульфонат. Количество кислоты, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 0,01-20 моль на моль соединения (16) и предпочтительно 0,02-10 моль на моль соединения. Примеры растворителя, который должен быть использован, особенно не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, дихлорметан, хлороформ, тетрахлорид углерода, 1,2-дихлорэтан, бензол, толуол, ксилол, тетрагидрофуран, ацетонитрил и их смеси. Примеры реагента для галогенирования атома серы, который должен быть использован на этой стадии, могут включать N-бромсукцинимид (NBS) и N-йодсукцинимид (NIS). Количество реагента для галогенирования атома серы, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-10 моль на моль соединения (16) и предпочтительно 1,05-5 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона -78-30ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 5 мин до 5 час.The step can be performed by reacting an alkylating reagent, an acid and a halogenation reagent for sulfur atom with a compound (16), which is commercially available or synthesized in accordance with a known method (e.g., M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol. 31, 2385 ( 1990)). The amount of alkylating reagent to be used can range from 1-5 mol per mol of compound (16) and preferably 1.05-3 mol per mol of compound. Examples of the acid may include trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate. The amount of acid to be used can range from 0.01-20 mol per mol of compound (16), and preferably 0.02-10 mol per mol of compound. Examples of the solvent to be used are not particularly limited, except where it is involved in the reaction, and may include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, benzene, toluene, xylene, tetrahydrofuran, acetonitrile and mixtures thereof. Examples of a sulfur atom halogenation reagent to be used in this step may include N-bromosuccinimide (NBS) and N-iodosuccinimide (NIS). The amount of halogenation reagent for the sulfur atom to be used can range from 1-10 mol per mol of compound (16) and preferably 1.05-5 mol per mol of compound. The reaction temperature is preferably within the range of -78-30 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 5 minutes to 5 hours.

В тех случаях, когда в качестве алкилирующего реагента используют соединение (24а), эта стадия может быть выполнена следующим образом.In cases where the compound (24a) is used as the alkylating reagent, this step can be performed as follows.

Стадия может быть выполнена путем взаимодействия алкилирующего реагента, ангидрида кислоты и основания с соединением (16), которое имеется в продаже или является синтезированным в соответствии с известным способом. Количество алкилирующего реагента, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-5 моль на моль соединения (16) и предпочтительно 1,05-3 моля на моль соединения. Примеры ангидрида кислоты могут включать ангидрид трифторметансульфокислоты и уксусный ангидрид. Количество ангидрида кислоты, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 0,01-20 моль на моль соединения (16) и предпочтительно 0,02-10 моль на моль соединения. Примеры основания могут включать тетраметилмочевину и коллидин. Количество основания, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 0,01-20 моль на моль соединения (16) и предпочтительно 0,02-10 моль на моль соединения. Примеры растворителя, который должен быть использован, особенно не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, дихлорметан, хлороформ, тетрахлорид углерода, 1,2-дихлорэтан и их смеси. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона -78-30ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 5 мин до 24 час.The step can be performed by reacting an alkylating reagent, an acid anhydride and a base with a compound (16), which is commercially available or synthesized in accordance with a known method. The amount of alkylating reagent to be used can range from 1-5 mol per mol of compound (16) and preferably 1.05-3 mol per mol of compound. Examples of acid anhydride may include trifluoromethanesulfonic anhydride and acetic anhydride. The amount of acid anhydride to be used can range from 0.01-20 mol per mol of compound (16), and preferably 0.02-10 mol per mol of compound. Examples of the base may include tetramethylurea and collidine. The amount of base to be used can range from 0.01-20 mol per mol of compound (16), and preferably 0.02-10 mol per mol of compound. Examples of the solvent to be used are not particularly limited, except where it is involved in the reaction, and may include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane and mixtures thereof. The reaction temperature is preferably within the range of -78-30 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 5 minutes to 24 hours.

(4) Стадия d:(4) Stage d:

Процесс, который осуществляют отдельно от стадий а-с, для получения соединения рибонуклеиновой кислоты, представленного следующей общей формулой (19), путем воздействия диметилсульфоксида, уксусной кислоты и уксусного ангидрида на соединение рибонуклеиновой кислоты (16)The process, which is carried out separately from steps a to c, to produce a ribonucleic acid compound represented by the following general formula (19) by exposing a ribonucleic acid compound to dimethyl sulfoxide, acetic acid and acetic anhydride (16)

Figure 00000011
Figure 00000011

в которыхin which

А и Вх такие, как определено выше.A and B x are as defined above.

Эта стадия может быть осуществлена путем взаимодействия диметилсульфоксида, уксусной кислоты и уксусного ангидрида с соединением (14), которое имеется в продаже или является синтезированным в соответствии с известным способом.This step can be carried out by reacting dimethyl sulfoxide, acetic acid and acetic anhydride with a compound (14), which is commercially available or synthesized in accordance with a known method.

Эта стадия может быть осуществлена путем взаимодействия диметилсульфоксида, уксусной кислоты и уксусного ангидрида с соединением (14), которое имеется в продаже или является синтезированным в соответствии с известным способом.This step can be carried out by reacting dimethyl sulfoxide, acetic acid and acetic anhydride with a compound (14), which is commercially available or synthesized in accordance with a known method.

Количество диметилсульфоксида, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона от 10 до 200 моль на моль соединения (16) и предпочтительно от 20- до 100-кратного количества моль на моль соединения.The amount of dimethyl sulfoxide to be used can range from 10 to 200 mol per mol of compound (16), and preferably from 20 to 100 times the mol per mol of compound.

Количество уксусной кислоты, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 10-150 моль на моль соединения (16) и предпочтительно 20-100 моль на моль соединения. Количество уксусного ангидрида, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 10-150 моль на моль соединения (16) и предпочтительно 20-100 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона 10-50ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 30 мин до 24 час.The amount of acetic acid to be used can range from 10-150 mol per mol of compound (16), and preferably 20-100 mol per mol of compound. The amount of acetic anhydride to be used can range from 10-150 mol per mol of compound (16) and preferably 20-100 mol per mol of compound. The reaction temperature is preferably within the range of 10-50 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 30 minutes to 24 hours.

(5) Стадия е:(5) Stage e:

Процесс получения соединения рибонуклеиновой кислоты, представленного следующей общей формулой (17), где защитную группу эфирного типа, которая может быть удалена в нейтральной среде, вводят по 2'-гидроксильной группе путем воздействия спиртового соединения, представленного следующей общей формулой (20), кислоты и реагента для галогенирования атома серы на производное нуклеозида (19), полученное посредством стадии d.The process of obtaining a ribonucleic acid compound represented by the following general formula (17), wherein an ether type protecting group that can be removed in a neutral medium is introduced at the 2'-hydroxyl group by exposure to an alcohol compound represented by the following general formula (20), an acid and a reagent for halogenating a sulfur atom to a nucleoside derivative (19) obtained by step d.

Figure 00000012
Figure 00000012

гдеWhere

А, Вх и WG1 такие, как определено выше.A, B x and WG 1 are as defined above.

Стадия может быть осуществлена путем взаимодействия спиртового соединения (20), кислоты и реагента для галогенирования атома серы с соединением рибонуклеиновой кислоты (19) в соответствии с известным способом. Примеры растворителя, который должен быть использован, особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, дихлорметан, хлороформ, тетрахлорид углерода, 1,2-дихлорэтан, бензол, толуол, ксилол, тетрагидрофуран, ацетонитрил и их смеси. Количество спиртового соединения (20), которое должно быть использовано, может находиться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (19) и предпочтительно 1-10 моль на моль соединения. Примеры кислоты могут включать трифторметансульфокислоту, трифторметансульфонат серебра и триметилсилил-трифторметансульфонат. Примеры реагента для галогенирования атома серы могут включать N-бромсукцинимид (NBS) и N-йодсукцинимид (NIS). Количество реагента для галогенирования атома серы, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 0,1-20 моль на моль соединения (19) и предпочтительно 0,2-10 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона -100-20ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 5 мин до 12 час.The step can be carried out by reacting an alcohol compound (20), an acid and a halogenation reagent for sulfur atom with a ribonucleic acid compound (19) in accordance with a known method. Examples of the solvent to be used are not particularly limited, except when it is involved in the reaction, and may include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, benzene, toluene, xylene, tetrahydrofuran, acetonitrile and mixtures thereof. The amount of alcohol compound (20) to be used may be within the range of 1-20 mol per mol of compound (19) and preferably 1-10 mol per mol of compound. Examples of the acid may include trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate and trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate. Examples of a sulfur atom halogenation reagent may include N-bromosuccinimide (NBS) and N-iodosuccinimide (NIS). The amount of halogenation reagent for the sulfur atom to be used can range from 0.1-20 mol per mol of compound (19) and preferably 0.2-10 mol per mol of compound. The reaction temperature is preferably within the range of -100-20 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 5 minutes to 12 hours.

(6) Стадия f:(6) Stage f:

Процесс получения соединения рибонуклеиновой кислоты, представленного следующей общей формулой (21), путем удаления защитных групп для 3'- и 5'-гидроксильных групп соединения рибонуклеиновой кислоты (17), полученного на стадии с или стадии е.The process of obtaining the ribonucleic acid compound represented by the following general formula (21) by removing the protecting groups for the 3'- and 5'-hydroxyl groups of the ribonucleic acid compound (17) obtained in step c or step e.

Figure 00000013
Figure 00000013

в которыхin which

А, Вх и WG1 такие, как определено выше.A, B x and WG 1 are as defined above.

Эта стадия может быть осуществлена путем растворения соединения (17) в органическом растворителе и взаимодействия с фторирующим агентом и кислотой в виде смеси с произвольным соотношением смешения. Примеры фторирующего агента, который должен быть использован на этой стадии, могут включать фторид аммония, фторид тетра-н-бутиламмония (TBAF), триэтиламин-тригидрофторид, пиридингидрофторид. Количество фторирующего агента, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 0,1-20 моль на моль соединения (17), и предпочтительно 0,2-10 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона 0-120ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 30 мин до 24 час.This step can be carried out by dissolving the compound (17) in an organic solvent and reacting with a fluorinating agent and an acid in the form of a mixture with an arbitrary mixing ratio. Examples of the fluorinating agent to be used in this step may include ammonium fluoride, tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF), triethylamine trihydrofluoride, pyridine hydrofluoride. The amount of fluorinating agent to be used can range from 0.1-20 mol per mol of compound (17), and preferably 0.2-10 mol per mol of compound. The reaction temperature is preferably within the range of 0-120 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 30 minutes to 24 hours.

(7) Стадия g:(7) Stage g:

Процесс получения соединения рибонуклеиновой кислоты (15) путем введения защитной группы (R1), которая может быть удалена в кислой среде, в 5'-гидроксильную группу соединения рибонуклеиновой кислоты (21), полученного посредством стадии f.The process of preparing the ribonucleic acid compound (15) by introducing a protecting group (R 1 ), which can be removed in an acidic medium, into the 5'-hydroxyl group of the ribonucleic acid compound (21) obtained by step f.

Figure 00000014
Figure 00000014

в которыхin which

А, Вх, R1 и WG1 такие, как определено выше; и A, B x , R 1 and WG 1 are as defined above; and

Х3 представляет собой галоген.X 3 is halogen.

Примеры галогена для Х3 могут включать галоген, идентичный галогенам производного фосфорамидита настоящего изобретения. Стадия может быть выполнена путем взаимодействия R1X3 с соединением (21) в соответствии с известным способом. Количество R1X3, которое должно быть использовано, может находиться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (21) и предпочтительно 1-10 моль на моль соединения. Примеры растворителя, который должен быть использован, особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, ацетонитрил и тетрагидрофуран. Примеры основания могут включать органическое основание, такое как пиридин, 2,6-диметилпиридин, 2,4,6-триметилпиридин, N-метилимидазол, триэтиламин, трибутиламин, N,N-диизопропилэтиламин и 1,8-диазабицикло[5.4.0]-7-ундецен. Количество основания, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (21) и предпочтительно 1-10 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона 0-120ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 30 мин до 24 час.Examples of halogen for X 3 may include a halogen identical to the halogens of the phosphoramidite derivative of the present invention. The step can be performed by reacting R 1 X 3 with the compound (21) in accordance with a known method. The amount of R 1 X 3 to be used may be within the range of 1-20 mol per mol of compound (21) and preferably 1-10 mol per mol of compound. Examples of the solvent to be used are not particularly limited, except where it is involved in the reaction, and may include, for example, acetonitrile and tetrahydrofuran. Examples of the base may include an organic base such as pyridine, 2,6-dimethylpyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, N-methylimidazole, triethylamine, tributylamine, N, N-diisopropylethylamine and 1,8-diazabicyclo [5.4.0] - 7-undecene. The amount of base to be used may range from 1-20 mol per mol of compound (21), and preferably 1-10 mol per mol of compound. The reaction temperature is preferably within the range of 0-120 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 30 minutes to 24 hours.

(8) Стадия h:(8) Stage h:

Процесс получения производного фосфорамидита настоящего изобретения фосфтилированием 3'-гидроксильной группы путем воздействия фосфитилирующего реагента и, при необходимости, активирующего агента на производное нуклеозида (15), полученное на стадии b или стадии f.The process of obtaining the phosphoramidite derivative of the present invention by phosphylation of a 3'-hydroxyl group by exposure to a phosphitylating reagent and, if necessary, an activating agent on the nucleoside derivative (15) obtained in stage b or stage f.

Figure 00000015
Figure 00000015

гдеWhere

Вх, R1, R2a, R2b, WG1 и WG2 такие, как определено выше.In x , R 1 , R 2a , R 2b , WG 1 and WG 2 are as defined above.

Примеры фосфитилирующего реагента могут включать соединения, представленные следующими общими формулами (22) и (23)Examples of a phosphitylating reagent may include compounds represented by the following general formulas (22) and (23)

Figure 00000016
Figure 00000016

в которыхin which

R2a, R2b и WG2 такие, как определено выше; и R 2a , R 2b and WG 2 are as defined above; and

Х1 представляет собой галоген.X 1 is halogen.

Примеры галогена для Х1 могут включать галоген, идентичный галогенам производного фосфорамидита настоящего изобретения. Эта стадия представляет собой реакцию фосфитилирования 3'-гидроксильной группы путем взаимодействия фосфитилирующего реагента с соединением (15) и может быть осуществлена в соответствии с известным способом. При необходимости может быть использован активирующий агент. Примеры растворителя, который должен быть использован, особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, ацетонитрил и тетрагидрофуран.Examples of halogen for X 1 may include a halogen identical to the halogens of the phosphoramidite derivative of the present invention. This step is a phosphitylation reaction of a 3'-hydroxyl group by reacting a phosphitylation reagent with compound (15) and can be carried out in accordance with a known method. If necessary, an activating agent may be used. Examples of the solvent to be used are not particularly limited, except where it is involved in the reaction, and may include, for example, acetonitrile and tetrahydrofuran.

Количество фосфитилирующего реагента, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (15) и предпочтительно 1-10 моль на моль соединения. Примеры активирующего агента могут включать 1Н-тетразол, 5-этилтиотетразол, 4,5-дихлоримидазол, 4,5-дицианоимидазол, бензотриазолтрифлат, имидазолтрифлат, пиридинийтрифлат, N,N-диизопропилэтиламин и 2,4,6-коллидин/N-метилимидазол. Количество активирующего агента, которое должно быть использовано, может находиться в пределах диапазона 1-20 моль на моль соединения (15) и предпочтительно 1-10 моль на моль соединения. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона 0-120ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа исходных веществ и температуры реакции и предпочтительно составляет от 30 мин до 24 час. Производное фосфорамидита настоящего изобретения, полученное таким образом, может быть выделено и очищено способом, известным по своей сути, таким как концентрирование, превращение в жидкой фазе, разделение, экстракция растворителем, кристаллизация, перекристаллизация, фракционная перегонка или хроматография.The amount of phosphitylating reagent to be used can range from 1-20 mol per mol of compound (15) and preferably 1-10 mol per mol of compound. Examples of an activating agent may include 1H-tetrazole, 5-ethylthiotetrazole, 4,5-dichlorimidazole, 4,5-dicyanoimidazole, benzotriazole triflate, imidazole triflate, pyridinium triflate, N, N-diisopropylethylamine and 2,4,6-collidine / N-methylimidazole. The amount of activating agent to be used may be within the range of 1-20 mol per mol of compound (15) and preferably 1-10 mol per mol of compound. The reaction temperature is preferably within the range of 0-120 ° C. The reaction time varies depending on the type of starting materials and the reaction temperature, and is preferably from 30 minutes to 24 hours. The phosphoramidite derivative of the present invention, thus obtained, can be isolated and purified by a method known per se, such as concentration, liquid phase conversion, separation, solvent extraction, crystallization, recrystallization, fractional distillation or chromatography.

III. Способ получения олиго-РНК III. The method of obtaining oligo RNA

Настоящее изобретение может включать способ получения олиго-РНК, представленных следующей общей формулой (3), включающий применение производного фосфорамидита настоящего изобретения.The present invention may include a method for producing oligo RNAs represented by the following general formula (3), comprising the use of the phosphoramidite derivative of the present invention.

Подробности описаны ниже.Details are described below.

Figure 00000017
Figure 00000017

в которойwherein

каждый В независимо представляет собой аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин или их модифицированную форму;each B independently represents adenine, guanine, cytosine, uracil, thymine, or a modified form thereof;

каждый R независимо представляет собой Н или гидроксильную группу, и, по меньшей мере, один из R является гидроксильной группой;each R independently represents H or a hydroxyl group, and at least one of R is a hydroxyl group;

Z представляет собой Н или фосфатную группу; иZ represents H or a phosphate group; and

n представляет собой целое число от 1 до 100.n is an integer from 1 to 100.

Предпочтительно n представляет собой целое число от 10 до 50, и более предпочтительно целое число от 15 до 30.Preferably, n is an integer from 10 to 50, and more preferably, an integer from 15 to 30.

Примеры заместителя для модифицированной формы В могут включать галоген, ацильную группу, алкильную группу, арилалкильную группу, алкоксигруппу, гидроксильную группу, аминогруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, карбоксигруппу, цианогруппу и нитрогруппу; и модифицированная форма В может быть замещена 1-3 такими заместителями. Примеры галогена, арильной группы, алкильной группы, арилалкильной группы, алкоксигруппы, алкоксиалкильной группы, аминогруппы, моноалкиламиногруппы и диалкиламиногруппы для модифицированной формы В могут включать группы, идентичные соответствующим группам производного фосфорамидита настоящего изобретения.Examples of the substituent for modified Form B may include a halogen, an acyl group, an alkyl group, an arylalkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, an amino group, a monoalkylamino group, a dialkylamino group, a carboxy group, a cyano group and a nitro group; and modified Form B may be substituted with 1-3 such substituents. Examples of the halogen, aryl group, alkyl group, arylalkyl group, alkoxy group, alkoxyalkyl group, amino group, monoalkylamino group and dialkylamino group for modified Form B may include groups identical to the corresponding groups of the phosphoramidite derivative of the present invention.

Способ получения олиго-РНК (3) с применением производного фосфорамидита настоящего изобретения может быть осуществлен известным способом и, например, может быть осуществлен путем конденсации соединения мономера нуклеиновой кислоты в направлении от 3' к 5' шаг за шагом в соответствии со следующими стадиями А-G.The method of producing oligo-RNA (3) using the phosphoramidite derivative of the present invention can be carried out in a known manner and, for example, can be carried out by condensing the nucleic acid monomer compound in the direction from 3 'to 5' step by step in accordance with the following steps A- G.

Соединения и реагенты, которые должны быть использованы в следующей стадии, за исключением производного фосфорамидита настоящего изобретения, особо не ограничивают, поскольку их, как правило, используют в синтезе олиго-РНК или олиго-ДНК. Кроме того, все стадии могут быть выполнены с использованием автоматического синтезатора для ДНК или вручную как в случае применения традиционных веществ для синтеза нуклеиновой кислоты. Использование автоматизированного синтезатора является желательным с точки зрения простоты и удобства способа и точности синтеза. Соединения и реагенты, описанные в следующих стадиях А-G, за исключением соединения мономера нуклеиновой кислоты, особо не ограничивают, поскольку их, как правило, используют в синтезе олиго-ДНК или олиго-РНК.The compounds and reagents to be used in the next step, with the exception of the phosphoramidite derivative of the present invention, are not particularly limited since they are usually used in the synthesis of oligo-RNA or oligo-DNA. In addition, all steps can be performed using an automatic synthesizer for DNA or manually, as in the case of the use of traditional substances for the synthesis of nucleic acids. The use of an automated synthesizer is desirable in terms of simplicity and convenience of the method and the accuracy of the synthesis. The compounds and reagents described in the following steps A to G, with the exception of the compound of the nucleic acid monomer, are not particularly limited since they are usually used in the synthesis of oligo DNA or oligo RNA.

(1) Стадия А:(1) Stage A:

Процесс получения соединения, представленного следующей общей формулой (5), путем удаления 5'-гидроксильной группы из соединения, представленного следующей общей формулой (4), под действием кислоты.The process of obtaining the compound represented by the following general formula (5) by removing the 5'-hydroxyl group from the compound represented by the following general formula (4) under the action of an acid.

Figure 00000018
Figure 00000018

в которойwherein

n, R1 и WG2 такие, как определено выше; n, R 1 and WG 2 are as defined above;

каждый В независимо представляет собой аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин или их модифицированную форму; и каждый R4 независимо представляет собой Н, ацилоксигруппу или заместитель, представленный следующей общей формулой (6)each B independently represents adenine, guanine, cytosine, uracil, thymine, or a modified form thereof; and each R 4 independently represents H, an acyloxy group or a substituent represented by the following general formula (6)

Figure 00000019
Figure 00000019

в которой wherein

WG1 такая, как определено выше; иWG 1 is as defined above; and

Е представляет собой ацильную группу или заместитель, представленный следующей общей формулой (7)E represents an acyl group or a substituent represented by the following general formula (7)

-Q-линкер-твердый носитель (7),-Q-linker-solid support (7),

в которойwherein

Q представляет собой одинарную связь или заместитель, представленный следующей общей формулой (8)Q represents a single bond or a substituent represented by the following general formula (8)

Figure 00000020
Figure 00000020

в которойwherein

WG2 такая, как определено выше; иWG 2 is as defined above; and

Т представляет собой Н, ацилоксигруппу, заместитель, представленный вышеприведенной общей формулой (6) или (7), с условием, что либо E, либо Т является заместителем (7).T represents H, an acyloxy group, a substituent represented by the above general formula (6) or (7), with the proviso that either E or T is a substituent (7).

Стадию осуществляют посредством действия кислоты на соединение, представленное следующей общей формулой (26а), (26b) [соединение (4), где n является 1], которое является присоединенным к твердому носителю, или на олиго-РНК или олиго-ДНК, полученную путем выполнения процессов стадии А - стадии D [соединение (4), где n является 2-100], которая является присоединенной к твердому носителю (в дальнейшем в этом документе именуется как соединение, присоединенное к твердому носителю).The step is carried out by the action of an acid on a compound represented by the following general formula (26a), (26b) [compound (4), where n is 1], which is attached to a solid support, or on oligo-RNA or oligo-DNA obtained by performing the processes of step A to step D [compound (4), where n is 2-100], which is attached to a solid carrier (hereinafter referred to as a compound attached to a solid carrier).

Figure 00000021
Figure 00000021

в которойwherein

Вх и R1 такие, как определено выше;In x and R 1 are as defined above;

R2L и R4L представляют собой заместитель (7);R 2L and R 4L are a substituent (7);

R2 представляет собой ацилоксигруппу; иR 2 represents an acyloxy group; and

R4 представляет собой Н, ацилоксигруппу или заместитель (6).R 4 represents H, an acyloxy group or a substituent (6).

Примеры ацильной части ацилоксигруппы R2 и R4 могут включать ацетильную группу, пропионильную группу, бутироильную группу, изобутироильную группу, бензоильную группу, 4-метоксибензоильную группу, фенилацетильную группу, феноксиацетильную группу, 4-трет-бутилфеноксиацетильную группу и 4-изопропилфеноксиацетильную группу. Примеры твердого носителя могут включать стекло с заданным размером пор (CPG), оксалильное стекло с заданным размером пор (oxalyl-controlled pore glass) (см., например, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol.19, 1527 (1991)), носитель TentaGel - носитель на основе производного аминополиэтиленгликоля (см., например, Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol.34, 3373 (1993)) и сополимер пористого полистирола и дивинилбензола. Примеры линкера могут включать 3-аминопропильную группу, сукцинильную группу, 2,2'-диэтаносульфогруппу и алкиламиногруппу с длинной цепью (LCAA). Соединения (26а) и (26b), которые являются присоединенными к твердому носителю, получают в соответствии с известным способом или приобретают в продаже, и примерами предпочтительного варианта осуществления являются соединения, представленные следующими общими формулами (27) или (28)Examples of the acyl portion of the acyloxy group R 2 and R 4 may include an acetyl group, a propionyl group, a butyroyl group, an isobutyroyl group, a benzoyl group, a 4-methoxybenzoyl group, a phenylacetyl group, a phenoxyacetyl group, a 4- tert- butylphenoxyacetyl group, and 4-isopropyl. Examples of a solid support may include glass with a predetermined pore size (CPG), oxalyl glass with a predetermined pore size (oxalyl-controlled pore glass) (see, for example, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol.19, 1527 (1991) ), the TentaGel carrier is a carrier based on an aminopolyethylene glycol derivative (see, for example, Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)) and a copolymer of porous polystyrene and divinylbenzene. Examples of the linker may include a 3-aminopropyl group, a succinyl group, a 2,2'-diethanosulfo group and a long chain alkylamino group (LCAA). Compounds (26a) and (26b) that are attached to a solid support are prepared according to a known method or are commercially available, and examples of a preferred embodiment are compounds represented by the following general formulas (27) or (28)

Figure 00000022
Figure 00000022

в которыхin which

Вх, R1, R4 и WG2 такие, как определено выше.In x , R 1 , R 4 and WG 2 are as defined above.

Соединения (27) и (28), где R4 является заместителем (6), могут быть получены из производного фосфорамидита настоящего изобретения в соответствии с известным способом. Примеры кислоты, которая должна быть использована на этой стадии, могут включать трифторуксусную кислоту, дихлоруксусную кислоту, трихлоруксусную кислоту. Кислота, которая должна быть использована на этой стадии, может быть разбавлена в подходящем растворителе так, чтобы иметь концентрацию 1-5%. Примеры растворителя особым образом не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, дихлорметан, ацетонитрил, воду и их смеси. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона 20-50ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа кислоты и температуры реакции, и предпочтительно составляет от 1 мин до 1 час.Compounds (27) and (28), where R 4 is a substituent (6), can be obtained from the phosphoramidite derivative of the present invention in accordance with a known method. Examples of the acid to be used in this step may include trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, trichloroacetic acid. The acid to be used in this step may be diluted in a suitable solvent so as to have a concentration of 1-5%. Examples of the solvent are not particularly limited, except where they are involved in the reaction, and may include, for example, dichloromethane, acetonitrile, water, and mixtures thereof. The reaction temperature is preferably within the range of 20-50 ° C. The reaction time varies depending on the type of acid and the reaction temperature, and is preferably from 1 minute to 1 hour.

Количество реагента, которое должно быть использовано, предпочтительно колеблется в пределах диапазона 1-100 моль на моль соединения, присоединенного к твердому носителю, и более предпочтительно 1-10 моль на моль соединения, присоединенного к твердому носителю.The amount of reagent to be used preferably ranges from 1-100 mol per mol of compound attached to the solid support, and more preferably 1-10 mol per mol of compound attached to the solid support.

(2) Стадия В:(2) Stage B:

Процесс получения соединения, представленного следующей общей формулой (9), путем конденсации мономерного соединения нуклеиновой кислоты с соединением, полученным посредством стадии А, с использованием активирующего агента.The process of obtaining the compound represented by the following general formula (9) by condensing a monomeric nucleic acid compound with the compound obtained by Step A using an activating agent.

Figure 00000023
Figure 00000023

гдеWhere

Вх, Е, n, R1, R4, T и WG2 такие, как определено выше.In x , E, n, R 1 , R 4 , T, and WG 2 are as defined above.

Эта стадия может быть осуществлена путем взаимодействия соединения мономера нуклеиновой кислоты и активирующего агента с соединением, присоединенным к твердому носителю. Примеры мономерного соединения нуклеиновой кислоты могут включать производное фосфорамидита настоящего изобретения и соединение, представленное следующей общей формулой (29), которое имеется в продаже.This step can be carried out by reacting a compound of a nucleic acid monomer and an activating agent with a compound attached to a solid support. Examples of a monomeric nucleic acid compound may include the phosphoramidite derivative of the present invention and a compound represented by the following general formula (29), which is commercially available.

Figure 00000024
Figure 00000024

в которойwherein

R1, R, R2b и WG2 такие, как определено выше; иR 1 , R 2a , R 2b and WG 2 are as defined above; and

Вy представляет собой нуклеиновое основание, которое может иметь защитную группу.In y represents a nucleic base, which may have a protective group.

Примеры нуклеинового основания Вy особо не ограничивают, поскольку оно представляет собой нуклеиновое основание, используемое для синтеза нуклеиновой кислоты, и могут включать, например, аденин, гуанин, цитозин, тимин и их модифицированную форму. Модифицированная форма является идентичной модифицированной форме, определенной выше для Вх. Примеры заместителя для модифицированной формы By могут включать галоген, алкильную группу, арилалкильную группу, алкоксигруппу, гидроксильную группу, аминогруппу, моноалкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, карбоксигруппу, цианогруппу и нитрогруппу; и модифицированная форма Ву может быть замещенной одним-тремя такими заместителями.Examples of the nucleic base B y are not particularly limited, since it is the nucleic base used for the synthesis of nucleic acid, and may include, for example, adenine, guanine, cytosine, thymine and their modified form. The modified form is identical to the modified form defined above for B x . Examples of the substituent for the modified form B y may include a halogen, an alkyl group, an arylalkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, an amino group, a monoalkylamino group, a dialkylamino group, a carboxy group, a cyano group and a nitro group; and the modified form B y may be substituted with one to three such substituents.

Примеры галогена, арильной группы, алкильной группы, арилалкильной группы, алкоксигруппы, алкоксиалкильной группы, аминогруппы, моноалкиламиногруппы и диалкиламиногруппы для модифицированной формы Ву могут включать группы, идентичные соответствующим группам производного фосфорамидита настоящего изобретения.Examples of the halogen, the aryl group, alkyl group, arylalkyl group, alkoxy group, alkoxyalkyl group, amino, monoalkylamino and dialkylamino groups for a modified form of B may include the group in identical respective groups phosphoramidite derivative of the present invention.

Нуклеиновое основание Вх может быть защищено, и, в частности, нуклеиновое основание, имеющее аминогруппу (например, аденин, гуанин, цитозин) предпочтительно может быть защищено по аминогруппе. Защитная группа аминогруппы в Ву может включать группы, идентичные защитным группам аминогруппы в Вх.The nucleic base B x may be protected, and in particular, the nucleic base having an amino group (e.g., adenine, guanine, cytosine) may preferably be protected at the amino group. The amino protecting group at B y may include groups identical to the amino protecting groups at B x .

Примеры активирующего агента могут включать активирующие агенты, идентичные приведенным выше.Examples of an activating agent may include activating agents identical to those described above.

Примеры растворителя для этой реакции особо не ограничивают, исключая только те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, ацетонитрил и тетрагидрофуран. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона 20-50ºС.Examples of the solvent for this reaction are not particularly limited, except where it is involved in the reaction, and may include, for example, acetonitrile and tetrahydrofuran. The reaction temperature is preferably within the range of 20-50 ° C.

Время реакции варьируется в зависимости от типа активирующего агента и температуры реакции и предпочтительно составляет от 1 мин до 1 час. Количество агента, которое должно быть использовано, предпочтительно колеблется в пределах диапазона 1-100 моль на моль соединения, присоединенного к твердому носителю, и более предпочтительно 1-10 моль на моль соединения, присоединенного к твердому носителю.The reaction time varies depending on the type of activating agent and the reaction temperature, and is preferably from 1 minute to 1 hour. The amount of agent to be used preferably ranges from 1-100 mol per mol of compound attached to a solid carrier, and more preferably 1-10 mol per mol of compound attached to a solid carrier.

(3) Стадия С:(3) Stage C:

Процесс кэппирования 5'-гидроксильной группы непрореагировавшего соединения (5) на стадии В.The process of capping the 5'-hydroxyl group of the unreacted compound (5) in step B.

Figure 00000025
Figure 00000025

гдеWhere

Bx, E, n, R4, T и WG2 такие, как определено выше; иB x , E, n, R 4 , T, and WG 2 are as defined above; and

R5 представляет собой метильную или феноксиметильную группу.R 5 represents a methyl or phenoxymethyl group.

Эта стадия представляет собой реакцию для введения защиты для 5'-гидроксильной группы, не прореагировавшей на стадии (В), и может быть осуществлена путем взаимодействия кэппирующего агента с соединением, присоединенным к твердому носителю. Примеры кэппирующего агента могут включать уксусный ангидрид и феноксиуксусный ангидрид. Кэппирующий агент, который должен быть использован, может быть разбавлен в подходящем растворителе так, чтобы иметь концентрацию 0,05-1 М. Примеры растворителя особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, пиридин, дихлорметан, ацетонитрил, тетрагидрофуран и их смеси. Кроме того, на этой стадии, при необходимости, могут быть использованы, например, 4-диметиламинопиридин, N-метилимидазол в качестве ускорителя реакции. Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона 20-50ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа кэппирующего агента и температуры реакции и предпочтительно составляет от 1 до 30 мин. Количество агента, которое должно быть использовано, предпочтительно колеблется в пределах диапазона 1-100 моль на моль соединения, присоединенного к твердому носителю, и более предпочтительно 1-10 моль на моль соединения, присоединенного к твердому носителю.This step is a reaction for introducing protection for the 5'-hydroxyl group that has not reacted in step (B), and can be carried out by reacting a capping agent with a compound attached to a solid support. Examples of a capping agent may include acetic anhydride and phenoxyacetic anhydride. The capping agent to be used may be diluted in a suitable solvent so as to have a concentration of 0.05-1 M. Examples of the solvent are not particularly limited unless they are involved in the reaction and may include, for example, pyridine , dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran and mixtures thereof. In addition, at this stage, if necessary, can be used, for example, 4-dimethylaminopyridine, N-methylimidazole as a reaction accelerator. The reaction temperature is preferably within the range of 20-50 ° C. The reaction time varies depending on the type of capping agent and the reaction temperature, and is preferably from 1 to 30 minutes. The amount of agent to be used preferably ranges from 1-100 mol per mol of compound attached to a solid carrier, and more preferably 1-10 mol per mol of compound attached to a solid carrier.

(4) Стадия D:(4) Stage D:

Процесс превращения фосфорильной группы в фосфатную группу путем взаимодействия окислителя с соединением (9), полученным на стадии В.The process of converting a phosphoryl group to a phosphate group by reacting an oxidizing agent with a compound (9) obtained in step B.

Figure 00000026
Figure 00000026

гдеWhere

Bx, E, n, R1, R4, T и WG2 такие, как определено выше.B x , E, n, R 1 , R 4 , T, and WG 2 are as defined above.

Эта стадия представляет собой реакцию для превращения трехвалентного фосфора в пятивалентный фосфор посредством окислителя и может быть осуществлена путем взаимодействия окислителя с соединением, присоединенным к твердому носителю. Примеры окислителя могут включать йод и трет-бутилгидропероксид.This step is a reaction for converting trivalent phosphorus to pentavalent phosphorus by means of an oxidizing agent and can be carried out by reacting the oxidizing agent with a compound attached to a solid support. Examples of the oxidizing agent may include iodine and tert-butyl hydroperoxide.

Кроме того, окислитель, который должен быть использован, может быть разбавлен в подходящем растворителе так, чтобы иметь концентрацию 0,05-1 М. Примеры растворителя особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, пиридин, тетрагидрофуран, воду и их смеси. Например, могут быть использованы йод/вода/пиридин-тетрагидрофуран, йод/пиридин-уксусная кислота и агент для перекисного окисления (трет-бутилгидропероксид/метиленхлорид и т.п.). Температура реакции предпочтительно находится в пределах диапазона 20-50ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа окислителя и температуры реакции и предпочтительно составляет от 1 до 30 мин. Количество агента, которое должно быть использовано, предпочтительно колеблется в пределах диапазона 1-100 моль на моль соединения, присоединенного к твердому носителю, и более предпочтительно 1-50 моль на моль соединения.In addition, the oxidizing agent to be used can be diluted in a suitable solvent so as to have a concentration of 0.05-1 M. Examples of the solvent are not particularly limited, unless they are involved in the reaction, and may include, for example , pyridine, tetrahydrofuran, water and mixtures thereof. For example, iodine / water / pyridine-tetrahydrofuran, iodine / pyridine-acetic acid and a peroxidizing agent ( tert-butyl hydroperoxide / methylene chloride and the like) can be used. The reaction temperature is preferably within the range of 20-50 ° C. The reaction time varies depending on the type of oxidizing agent and the reaction temperature, and is preferably from 1 to 30 minutes. The amount of agent to be used is preferably in the range of 1-100 mol per mol of compound attached to the solid support, and more preferably 1-50 mol per mol of compound.

(5) Стадия Е:(5) Stage E:

Процесс отщепления соединения (11), полученного на стадии D, от твердого носителя, и затем удаления защитных групп каждого нуклеинового основания и каждой 2'-гидроксильной группы.The process of cleaving the compound (11) obtained in step D from a solid support and then removing the protective groups of each nucleic base and each 2'-hydroxyl group.

Figure 00000027
Figure 00000027

гдеWhere

B, Bx, E, R, R1, R4, n, T, WG2 и Z такие, как определено выше.B, B x , E, R, R 1 , R 4 , n, T, WG 2 and Z are as defined above.

Cтадия отщепления представляет собой реакцию отщепления олиго-РНК, имеющей желательную длину цепи, от твердого носителя и линкера посредством отщепляющего агента и которую осуществляют путем добавления отщепляющего агента к твердому носителю, который содержит олиго-РНК, имеющую желательную длину цепи.The cleavage step is the reaction of cleaving an oligo RNA having a desired chain length from a solid support and a linker by means of a cleaving agent and which is carried out by adding a cleaving agent to a solid carrier that contains oligo RNA having a desired chain length.

На этой стадии может быть удалена защитная группа нуклеинового основания. Примеры отщепляющего агента могут включать концентрированный водный раствор аммиака и метиламин. Отщепляющий агент, который должен быть использован на этой стадии, может быть разбавлен, например, метанолом, этанолом, изопропиловым спиртом, ацетонитрилом, тетрагидрофураном и их смесями. Среди них этанол является предпочтительным. Температура реакции может быть в пределах диапазона 15-75°С, предпочтительно 15-30°С и более предпочтительно 18-25°С. Время реакции для снятия защитных групп может колебаться в пределах диапазона 1-30 час, предпочтительно 1-24 час и более предпочтительно 1-4 час. Концентрация гидроксида аммония в растворе, который должен быть использован для снятия защитных групп, может составлять 20-30% по массе, предпочтительно 25-30% по массе, более предпочтительно 28-30% по массе. Количество агента, которое должно быть использовано, может колебаться в пределах от 1 до 100 моль на моль соединения, присоединенного к твердому носителю, и предпочтительно от 10- до 50-кратного количества моль на моль соединения. Стадию удаления защитной группы для 2'-гидроксильной группы осуществляют посредством действия агента для удаления защитной группы для 2'-гидроксильной группы, такого как фторид тетрабутиламмония, тригидрофторид/соль триэтиламина. Примеры растворителя особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, тетрагидрофуран, N-метилпирролидон, пиридин, диметилсульфоксид и их смеси. При необходимости, в качестве дезактивирующего агента для акрилонитрила, который является побочным продуктом на этой стадии, могут быть добавлены алкиламин, амидин, тиол, производные тиола или их смеси. Примеры алкиламина могут включать неразветвленный алкиламин, имеющий 1-6 атомов углерода. В частности, алкиламин может включать, например, метиламин, этиламин, н-пропиламин, н-бутиламин, н-пентиламин и н-гексиламин. Примеры амидина могут включать бензамидин и формамидин. Примеры тиола могут включать неразветвленный тиол, имеющий 1-6 атомов углерода. В частности, тиол может включать, например, метантиол, этантиол, 1-пропантиол, 1-бутантиол, 1-пентантиол и 1-гексантиол. Примеры производного тиола могут включать одинаковые или различные спирт и эфир, содержащие неразветвленный алкилтиол, имеющий 1-6 атомов углерода. В частности, производное тиола может включать, например, 2-меркаптоэтанол, 4-меркапто-1-бутанол, 6-меркапто-1-гексанол, меркаптометиловый эфир, 2-меркаптоэтиловый эфир, 3-меркаптопропиловый эфир, 4-меркаптобутиловый эфир, 5-меркаптопентиловый эфир и 6-меркаптогексиловый эфир. Температура реакции предпочтительно может быть в пределах диапазона 20-80ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа агента для удаления защитной группы, который должен быть использован, и температуры реакции и предпочтительно колеблется в пределах диапазона 1-100 час. Количество агента, которое должно быть использовано, предпочтительно колеблется в пределах диапазона 50-500 моль на моль удаляемой защитной группы и более предпочтительно 50-100 моль на моль удаляемой защитной группы. Олиго-РНК, защищенная по 5'-гидроксильной группе, может быть выделена и очищена из вышеприведенной реакционной смеси посредством стандартных методов выделения и очистки, таких как экстракция, концентрирование, нейтрализация, фильтрация, центрифугирование, перекристаллизация, колоночная хроматография на силикагеле, тонкослойная хроматография, гидрофобная колоночная хроматография, ионообменная колоночная хроматография, гель-фильтрационная колоночная хроматография, диализ, ультрафильтрация и т.п.At this stage, the protective group of the nucleic base can be removed. Examples of the cleaving agent may include concentrated aqueous ammonia and methylamine. The cleaving agent to be used in this step can be diluted, for example, with methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, tetrahydrofuran and mixtures thereof. Among them, ethanol is preferred. The reaction temperature may be within the range of 15-75 ° C, preferably 15-30 ° C, and more preferably 18-25 ° C. The reaction time for deprotection may range from 1-30 hours, preferably 1-24 hours, and more preferably 1-4 hours. The concentration of ammonium hydroxide in the solution to be used to remove the protective groups may be 20-30% by weight, preferably 25-30% by weight, more preferably 28-30% by weight. The amount of agent to be used can range from 1 to 100 mol per mol of compound attached to a solid support, and preferably from 10 to 50 times the mol per mol of compound. The deprotection step for the 2'-hydroxyl group is carried out by the action of the deprotecting agent for the 2'-hydroxyl group, such as tetrabutylammonium fluoride, triethylamine trihydrofluoride / salt. Examples of the solvent are not particularly limited, except where it is involved in the reaction, and may include, for example, tetrahydrofuran, N-methylpyrrolidone, pyridine, dimethyl sulfoxide, and mixtures thereof. If necessary, alkylamine, amidine, thiol, thiol derivatives or mixtures thereof can be added as a deactivating agent for acrylonitrile, which is a by-product of this step. Examples of an alkylamine may include a straight chain alkylamine having 1-6 carbon atoms. In particular, an alkylamine may include, for example, methylamine, ethylamine, n-propylamine, n-butylamine, n-pentylamine and n-hexylamine. Examples of amidine may include benzamidine and formamidine. Examples of a thiol may include an unbranched thiol having 1-6 carbon atoms. In particular, a thiol may include, for example, methantiol, ethanethiol, 1-propanethiol, 1-butanethiol, 1-pentantiol and 1-hexantiol. Examples of a thiol derivative may include the same or different alcohol and ether containing unbranched alkylthiol having 1-6 carbon atoms. In particular, a thiol derivative may include, for example, 2-mercaptoethanol, 4-mercapto-1-butanol, 6-mercapto-1-hexanol, mercaptomethyl ether, 2-mercaptoethyl ether, 3-mercaptopropyl ether, 4-mercaptobutyl ether, 5- mercaptopentyl ether and 6-mercaptohexyl ether. The reaction temperature may preferably be within the range of 20-80 ° C. The reaction time varies depending on the type of agent to remove the protective group to be used and the reaction temperature, and preferably ranges from 1-100 hours. The amount of agent to be used preferably ranges from 50-500 mol per mole of the removable protecting group, and more preferably 50-100 mol per mole of the removable protecting group. The 5'-hydroxyl protected oligo RNA can be isolated and purified from the above reaction mixture by standard isolation and purification methods such as extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugation, recrystallization, silica gel column chromatography, thin layer chromatography, hydrophobic column chromatography, ion exchange column chromatography, gel filtration column chromatography, dialysis, ultrafiltration, and the like.

(6) Стадия F:(6) Stage F:

Процесс удаления 5'-гидроксильной группы в соединении (12), полученном на стадии Е.The process of removing the 5'-hydroxyl group in compound (12) obtained in step E.

Figure 00000028
Figure 00000028

гдеWhere

B, n, R, R1 и Z такие, как заместители, определенные выше.B, n, R, R 1 and Z are such as the substituents defined above.

Эта стадия представляет собой реакцию для заключительного удаления защитной группы для 5'-гидроксильной группы в олигорибонуклеотиде и может быть осуществлена посредством действия кислоты на олиго-РНК, отщепленную от твердого носителя. Примеры кислоты, которая должна быть использована на этой стадии, могут включать трихлоруксусную кислоту, дихлоруксусную кислоту и уксусную кислоту. На этой стадии может быть использована кислота, разбавленная в подходящем растворителе. Примеры растворителя особо не ограничивают, исключая те случаи, когда он является вовлеченным в реакцию, и могут включать, например, дихлорметан, ацетонитрил, воду, буферный раствор, рН которого колеблется в пределах от 2 до 5, и их смеси. Примеры буферного раствора могут включать ацетатный буферный раствор. Температура реакции предпочтительно колеблется в пределах диапазона 20-50ºС. Время реакции варьируется в зависимости от типа кислоты и температуры реакции и предпочтительно составляет от 1 мин до 1 час. Количество агента, которое должно быть использовано, предпочтительно колеблется в пределах диапазона 1-100 моль на моль соединения, присоединенного к твердому носителю, и более предпочтительно 1-10 моль на моль соединения.This step is a reaction for the final removal of the protective group for the 5'-hydroxyl group in the oligoribonucleotide and can be carried out by the action of an acid on oligo RNA cleaved from a solid support. Examples of the acid to be used in this step may include trichloroacetic acid, dichloroacetic acid and acetic acid. At this stage, an acid diluted in a suitable solvent may be used. Examples of the solvent are not particularly limited, except when it is involved in the reaction, and may include, for example, dichloromethane, acetonitrile, water, a buffer solution, the pH of which ranges from 2 to 5, and mixtures thereof. Examples of the buffer solution may include acetate buffer solution. The reaction temperature preferably ranges from 20-50 ° C. The reaction time varies depending on the type of acid and the reaction temperature, and is preferably from 1 minute to 1 hour. The amount of agent to be used is preferably in the range of 1-100 mol per mol of compound attached to a solid support, and more preferably 1-10 mol per mol of compound.

(7) Стадия G:(7) Stage G:

Процесс выделения и очистки соединения (3), полученного на стадии F.The process of isolation and purification of compound (3) obtained in stage F.

Стадия выделения и очистки представляет собой стадию выделения и очистки желательной олиго-РНК из приведенной выше реакционной смеси посредством известного способа выделения и очистки, который может включать, например, экстракцию, концентрирование, нейтрализацию, фильтрацию, разделение центрифугированием, перекристаллизацию, колоночную хроматографию с обращенной фазой (С818), картридж-колонку с обращенной фазой (С818), катионообменную колоночную хроматографию, анионообменную колоночную хроматографию, гель-фильтрационную колоночную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию, диализ, ультрафильтрацию и их комбинации. Примеры элюента могут включать ацетонитрил, метанол, этанол, изопропиловый спирт, воду и растворитель, полученный смешением в произвольном соотношении. В этом случае, например, рН раствора, который должен быть в пределах диапазона рН 1-9, может быть установлен путем добавления фосфата натрия, фосфата калия, хлорида натрия, хлорида калия, ацетата аммония, ацетата триэтиламмония, ацетата натрия, ацетата калия, трис-хлористоводородной кислоты или этилендиаминтетрауксусной кислоты в качестве добавки в концентрации 1 мМ-2 М.The isolation and purification step is the step of isolating and purifying the desired oligo-RNA from the above reaction mixture by a known isolation and purification method, which may include, for example, extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugal separation, recrystallization, reverse phase column chromatography (C 8 -C 18 ), reverse phase cartridge column (C 8 -C 18 ), cation exchange column chromatography, anion exchange column chromatography, gel filtration column full chromatography, high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, and combinations thereof. Examples of the eluent may include acetonitrile, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, water and a solvent obtained by mixing in an arbitrary ratio. In this case, for example, the pH of the solution, which should be within the range of pH 1-9, can be set by adding sodium phosphate, potassium phosphate, sodium chloride, potassium chloride, ammonium acetate, triethylammonium acetate, sodium acetate, potassium acetate, tris hydrochloric acid or ethylenediaminetetraacetic acid as an additive in a concentration of 1 mm-2 M.

Олиго-РНК, имеющая желательную длину цепи, может быть получена путем повторения стадий А-D.Oligo RNA having the desired chain length can be obtained by repeating steps AD.

Кроме того, в этом способе, применяют соединение (26а), где R4 представляет собой заместитель (6), соединение (26а), где R4 представляет собой Н или ацилоксигруппу, или соединение (26b), где R2 представляет собой алкилоксигруппу и т.д.In addition, in this method, a compound (26a) is used where R 4 is a substituent (6), a compound (26a) where R 4 is H or an acyloxy group, or a compound (26b) where R 2 is an alkyloxy group and etc.

При использовании соединения (26а), где R4 представляет собой Н или ацилоксигруппу, или соединения (26b), где R2 представляет собой алкилоксигруппу в качестве исходного вещества, необходимо применять одно или более производных фосфорамидита настоящего изобретения в качестве соединения мономера нуклеиновой кислоты.When using compound (26a) where R 4 is H or an acyloxy group, or compound (26b) where R 2 is an alkyloxy group as a starting material, one or more phosphoramidite derivatives of the present invention must be used as the nucleic acid monomer compound.

К тому же, в этом способе выделение и очистку олиго-РНК также осуществляют путем проведения процессов стадии F перед проведением процессов стадии E, и затем процессов стадии G.In addition, in this method, the isolation and purification of oligo RNAs is also carried out by carrying out the processes of stage F before carrying out the processes of stage E, and then the processes of stage G.

ПРИМЕРЫ EXAMPLES

Теперь настоящее изобретение будет описано более подробно, ссылаясь на примеры, которыми, однако, не ограничено настоящее изобретение.Now the present invention will be described in more detail, referring to examples, which, however, are not limited to the present invention.

Пример 1Example 1

Хлорметил-2-цианоэтиловый эфирChloromethyl-2-cyanoethyl ether

Стадия 1Stage 1

Получение метилтиометил-2-цианоэтилового эфираPreparation of methylthiomethyl-2-cyanoethyl ether

3-Гидроксипропионитрил (32 г, 450 ммоль) растворяют в 450 мл диметилсульфоксида, и к этому добавляют 324 мл уксусного ангидрида и 231 мл уксусной кислоты, и реакционный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 24 час.3-Hydroxypropionitrile (32 g, 450 mmol) was dissolved in 450 ml of dimethyl sulfoxide, and 324 ml of acetic anhydride and 231 ml of acetic acid were added thereto, and the reaction solution was stirred at room temperature for 24 hours.

Бикарбонат натрия (990 г) растворяют в 4,5 л воды и реакционный раствор добавляют по каплям к водному раствору бикарбоната натрия в течение 1 час. Реакционный раствор перемешивают в течение 1 час и подвергают экстракции этилацетатом, и экстракт сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель отгоняют. Полученный маслянистый продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением 41 г метилтиометил-2-цианоэтилового эфира в виде бесцветного маслянистого продукта (выход 70%).Sodium bicarbonate (990 g) was dissolved in 4.5 L of water, and the reaction solution was added dropwise to an aqueous solution of sodium bicarbonate over 1 hour. The reaction solution was stirred for 1 hour and subjected to extraction with ethyl acetate, and the extract was dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off. The resulting oily product was purified by silica gel column chromatography to obtain 41 g of methylthiomethyl-2-cyanoethyl ether as a colorless oily product (70% yield).

1Н-ЯМР (CDCl3): 2,18 (с, 3Н); 2,66 (т, 2Н, J=6,3 Гц); 3,77 (т, 2Н, J=6,3 Гц); 4,69 (с, 2Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.18 (s, 3H); 2.66 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 3.77 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 4.69 (s, 2H)

Стадия 2Stage 2

Получение хлорметил-2-цианоэтилового эфираPreparation of chloromethyl-2-cyanoethyl ether

Метилтиометил-2-цианоэтиловый эфир (3,3 г, 25 ммоль) растворяют в 70 мл метиленхлорида, и добавляют по каплям 2 мл сульфурилхлорида (25 ммоль), и далее реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 час.Methylthiomethyl-2-cyanoethyl ether (3.3 g, 25 mmol) was dissolved in 70 ml of methylene chloride, and 2 ml of sulfuryl chloride (25 mmol) was added dropwise, and then the reaction was carried out at room temperature for 1 hour.

После завершения реакции растворитель отгоняют при пониженном давлении с получением 2,5 г целевого соединения в виде бесцветного маслянистого продукта (выход 85%).After completion of the reaction, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 2.5 g of the target compound as a colorless oily product (yield 85%).

Температура кипения: 84-85ºС (0,3 Торр)Boiling point: 84-85ºС (0.3 Torr)

1Н-ЯМР (CDCl3): 2,72 (т, 2Н, J=6,3 Гц); 3,92 (т, 2Н, J=6,3 Гц); 5,52 (с, 2Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.72 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 3.92 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 5.52 (s, 2H)

Пример 2Example 2

5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит)5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite)

Стадия 1Stage 1

Получение 5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридинаPreparation of 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine

5'-О-(4,4'-диметокситритил)уридин (546 мг, 1 ммоль) растворяют в 4 мл 1,2-дихлорэтана, и к этому добавляют 452 мг диизопропилэтиламина (3,5 ммоль), и далее к этому добавляют 365 мг дибутилоловодихлорида (1,2 ммоль). Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 час.5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) uridine (546 mg, 1 mmol) was dissolved in 4 ml of 1,2-dichloroethane, and 452 mg of diisopropylethylamine (3.5 mmol) was added thereto, and then added to this 365 mg dibutyltin dichloride (1.2 mmol). The reaction is carried out at room temperature for 1 hour.

Потом реакцию проводят при 80ºС и добавляют по каплям 155,4 мг хлорметил-2-цианоэтилового эфира (1,3 ммоль), реакционный раствор перемешивают в течение 30 мин.Then the reaction was carried out at 80 ° C and 155.4 mg of chloromethyl-2-cyanoethyl ether (1.3 mmol) was added dropwise, the reaction solution was stirred for 30 minutes.

После завершения реакции реакционный раствор добавляют в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия, и подвергают экстракции метиленхлоридом, и экстракт сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на 30 г силикагеля с получением 5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридина (197 мг; выход 34%).After completion of the reaction, the reaction solution was added to a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, and it was extracted with methylene chloride, and the extract was dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by column chromatography on 30 g of silica gel to give 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine (197 mg; 34% yield).

1Н-ЯМР (CDCl3): 2,47 (д, 1Н, J=7,8 Гц); 2,69 (т, 2Н, J=6,3 Гц); 3,55 (дд, 1Н, J=11,3, 2,2 Гц); 3,62 (дд, 1Н, J=11,3, 2,2 Гц); 3,83 (с, 6Н); 3,87 (т, 2Н, J=6,3 Гц); 4,07-4,08 (м, 1Н); 4,32 (дд, 1Н, J=5,3, 1,9 Гц); 4,54 (кв., 1Н, J=5,3 Гц); 4,94, 5,11 (2д, 2Н, J=6,9 Гц); 5,32 (д, 1Н, J=8,2 Гц); 6,00 (д, 1Н, J=1,9 Гц); 6,85-6,88 (м, 4Н); 7,29-7,41 (м, 9Н); 8,02 (д, 1Н, J=8,2 Гц); 8,53 (ушир.с, 1Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.47 (d, 1H, J = 7.8 Hz); 2.69 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 3.55 (dd, 1H, J = 11.3, 2.2 Hz); 3.62 (dd, 1H, J = 11.3, 2.2 Hz); 3.83 (s, 6H); 3.87 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 4.07-4.08 (m, 1H); 4.32 (dd, 1H, J = 5.3, 1.9 Hz); 4.54 (q, 1H, J = 5.3 Hz); 4.94, 5.11 (2d, 2H, J = 6.9 Hz); 5.32 (d, 1H, J = 8.2 Hz); 6.00 (d, 1H, J = 1.9 Hz); 6.85-6.88 (m, 4H); 7.29-7.41 (m, 9H); 8.02 (d, 1H, J = 8.2 Hz); 8.53 (br s, 1H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 652 [M+Na]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 652 [M + Na] +

Стадия 2Stage 2

Получение 5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит) Preparation of 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite )

5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридин (209 г, 0,332 ммоль), полученный на стадии 1, растворяют в 2 мл ацетонитрила, и добавляют по каплям 23 мг тетразола (0,332 ммоль) и 150 мг 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита (0,498 ммоль), и реакцию проводят при 45ºС в течение 1,5 час.5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine (209 g, 0.332 mmol) obtained in step 1 is dissolved in 2 ml of acetonitrile and 23 mg is added dropwise. tetrazole (0.332 mmol) and 150 mg of 2-cyanoethyl N, N, N ', N'-tetraisopropylphosphorodiamidite (0.498 mmol), and the reaction was carried out at 45 ° C for 1.5 hours.

После завершения реакции реакционный раствор смешивают с насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, и подвергают экстракции этилацетатом, и экстракт сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на 20 г силикагеля с получением целевого соединения (200 мг; выход 73%).After completion of the reaction, the reaction solution was mixed with saturated aqueous sodium bicarbonate, and subjected to extraction with ethyl acetate, and the extract was dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by column chromatography on 20 g of silica gel to give the desired compound (200 mg; 73% yield).

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 852 [M+Na]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 852 [M + Na] +

Пример 3Example 3

2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридин2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine

Стадия 1Stage 1

Получение 3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридинаPreparation of 3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine

3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)уридин (150 мг, 0,3 ммоль) растворяют в 7 мл тетрагидрофурана в атмосфере аргона, и добавляют 54 мг метилтиометил-2-цианоэтилового эфира (0,4 ммоль) и 100 мг молекулярных сит 4Å, и реакционный раствор перемешивают в течение 10 мин.3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) uridine (150 mg, 0.3 mmol) was dissolved in 7 ml of tetrahydrofuran under argon atmosphere and 54 mg of methylthiomethyl-2-cyanoethyl ether (0.4 mmol) and 100 mg of 4Å molecular sieves, and the reaction solution was stirred for 10 minutes.

Реакцию проводят при 0ºС и добавляют 2 мл раствора трифторметансульфокислоты (10 мг, 0,06 ммоль) в тетрагидрофуране. Затем добавляют 92 мг N-йодсукцинимида (0,4 ммоль) и реакционный раствор перемешивают в течение 1 час.The reaction is carried out at 0 ° C and 2 ml of a solution of trifluoromethanesulfonic acid (10 mg, 0.06 mmol) in tetrahydrofuran are added. Then, 92 mg of N-iodosuccinimide (0.4 mmol) was added and the reaction solution was stirred for 1 hour.

После завершения реакции реакционный раствор фильтруют через целит и промывают метиленхлоридом и полученный органический слой промывают 1 М водным раствором гидротиосульфата натрия. Органический слой промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, и сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель отгоняют.After completion of the reaction, the reaction solution was filtered through celite and washed with methylene chloride, and the resulting organic layer was washed with a 1 M aqueous solution of sodium hydrothiosulfate. The organic layer was washed with saturated aqueous sodium bicarbonate, and dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off.

Полученный твердый остаток очищают тонкослойной хроматографией с получением 3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридина (150 мг; выход 85%).The resulting solid residue was purified by thin layer chromatography to give 3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine (150 mg; 85% yield).

1Н-ЯМР (CDCl3): 0,97-1,12 (м, 28Н); 2,68-2,73 (м, 2Н); 3,78-3,86 (м, 1Н); 3,96-4,05 (м, 2Н); 4,12-4,30 (м, 4Н); 5,0-5,04 (м, 2Н); 5,70 (д, 1Н, J=8,2 Гц); 5,75 (с, 1Н); 7,90 (д, 1Н, J=8,2 Гц); 9,62 (ушир.с, 1Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 0.97-1.12 (m, 28H); 2.68-2.73 (m, 2H); 3.78-3.86 (m, 1H); 3.96-4.05 (m, 2H); 4.12-4.30 (m, 4H); 5.0-5.04 (m, 2H); 5.70 (d, 1H, J = 8.2 Hz); 5.75 (s, 1H); 7.90 (d, 1H, J = 8.2 Hz); 9.62 (broad s, 1H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 570 [M+Н]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 570 [M + H] +

Стадия 2Stage 2

Получение 2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридинаPreparation of 2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine

3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридин (200 мг, 0,35 ммоль), полученный на стадии 1, растворяют в 2 мл метанола, и к этому добавляют 65 мг фторида аммония (1,76 ммоль), и реакционный раствор перемешивают при нагревании при 50ºС в течение 5 час.3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine (200 mg, 0.35 mmol) obtained in stage 1 is dissolved in 2 ml of methanol, and 65 mg of ammonium fluoride (1.76 mmol) was added to this, and the reaction solution was stirred under heating at 50 ° C. for 5 hours.

После охлаждения воздухом к реакционному раствору добавляют ацетонитрил. Раствор перемешивают, и фильтруют, и концентрируют.After cooling with air, acetonitrile was added to the reaction solution. The solution was stirred and filtered and concentrated.

Полученный твердый остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением целевого соединения (108 мг; выход 94%).The resulting solid residue was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound (108 mg; yield 94%).

1H-ЯМР (CD3OD): 2,72-2,76 (т, 2Н, J=6,2 Гц); 3,68-3,92 (м, 4Н); 4,00-4,03 (м, 1Н); 4,26-4,32 (м, 2Н); 4,81-4,95 (м, 2Н); 5,71 (д, 1Н, J=8,1 Гц); 6,00 (д, 1Н, J=3,3 Гц); 8,10 (д, 1Н, J=8,1 Гц) 1 H-NMR (CD 3 OD): 2.72-2.76 (t, 2H, J = 6.2 Hz); 3.68-3.92 (m, 4H); 4.00-4.03 (m, 1H); 4.26-4.32 (m, 2H); 4.81-4.95 (m, 2H); 5.71 (d, 1H, J = 8.1 Hz); 6.00 (d, 1H, J = 3.3 Hz); 8.10 (d, 1H, J = 8.1 Hz)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 350 [M+Na]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 350 [M + Na] +

Пример 4Example 4

Получение 5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридинаPreparation of 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine

2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридин (14 г, 43 ммоль) подвергают азеотропной перегонке с пиридином и затем сушат вакуумным насосом в течение 30 мин.2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine (14 g, 43 mmol) was subjected to azeotropic distillation with pyridine and then dried by a vacuum pump for 30 minutes.

Твердый остаток растворяют в 300 мл тетрагидрофурана, и добавляют в атмосфере аргона 68 г пиридина (856 ммоль) и 20 г молекулярных сит 4Å, и смесь перемешивают в течение 10 мин.The solid residue was dissolved in 300 ml of tetrahydrofuran, and 68 g of pyridine (856 mmol) and 20 g of molecular sieves 4Å were added under argon atmosphere, and the mixture was stirred for 10 minutes.

К реакционному раствору добавляют тремя порциями каждый 1 час 19,6 г 4,4'-диметокситритилхлорида (57,8 ммоль) и смесь дополнительно перемешивают в течение 1 час.19.6 g of 4,4'-dimethoxytrityl chloride (57.8 mmol) was added in three portions every 1 hour to the reaction solution, and the mixture was further stirred for 1 hour.

После добавления 10 мл метанола и перемешивания реакционного раствора в течение 2 мин реакционный раствор фильтруют через целит и промывают этилацетатом. After adding 10 ml of methanol and stirring the reaction solution for 2 minutes, the reaction solution was filtered through celite and washed with ethyl acetate.

После концентрирования фильтрата твердый остаток растворяют в этилацетате и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия.After concentrating the filtrate, the solid residue was dissolved in ethyl acetate and washed with saturated aqueous sodium bicarbonate.

После промывания органического слоя насыщенным рассолом (насыщенным раствором NaCl) и сушки над безводным сульфатом магния растворитель отгоняют.After washing the organic layer with saturated brine (saturated NaCl) and drying over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off.

Полученный твердый остаток очищают хроматографией на силикагеле с получением целевого соединения (26,5 г, выход 98%).The obtained solid residue was purified by silica gel chromatography to obtain the target compound (26.5 g, yield 98%).

Пример 5Example 5

NN 4four -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит)-acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite)

Стадия 1Stage 1

Получение NGetting N 4four -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидина-acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine

N4-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)цитидин (588 мг, 1 ммоль) растворяют в 4 мл 1,2-дихлорэтана, и к этому добавляют 452 мг диизопропилэтиламина (3,5 ммоль), и затем еще добавляют 365 мг дибутилоловодихлорида (1,2 ммоль). Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 час.N 4- Acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) cytidine (588 mg, 1 mmol) was dissolved in 4 ml of 1,2-dichloroethane, and 452 mg of diisopropylethylamine (3.5 mmol) was added thereto. and then still add 365 mg of dibutyltin dichloride (1.2 mmol). The reaction is carried out at room temperature for 1 hour.

Затем реакцию проводят при 80ºС, и добавляют по каплям 155,4 мг хлорметил-2-цианоэтилового эфира (1,3 ммоль), и реакционный раствор перемешивают в течение 60 мин.Then the reaction was carried out at 80 ° C, and 155.4 mg of chloromethyl-2-cyanoethyl ether (1.3 mmol) was added dropwise, and the reaction solution was stirred for 60 minutes.

После завершения реакции реакционный раствор добавляют в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагируют метиленхлоридом. Экстракт сушат над безводным сульфатом магния и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на 30 г силикагеля с получением N4-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидина (219 мг; выход 35%).After completion of the reaction, the reaction solution was added to saturated aqueous sodium bicarbonate and extracted with methylene chloride. The extract was dried over anhydrous magnesium sulfate and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by column chromatography on 30 g of silica gel to give N 4 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine (219 mg; yield 35%).

1Н-ЯМР (CDCl3): 2,19 (с, 3Н); 2,56 (д, 1Н, J=8,8 Гц); 2,65 (т, 2Н, J=6,2 Гц); 3,55 (дд, 1Н, J=10,5, 2,5 Гц); 3,63 (дд, 1Н, J=10,5, 2,5 Гц); 3,82 (с, 6Н); 3,86 (т, 2Н, J=6,2 Гц); 4,09-4,14 (м, 1Н); 4,28 (д, 1Н, J=5,1 Гц); 4,44-4,49 (м, 1Н); 4,97, 5,24 (2д, 2Н, J=6,9 Гц); 5,96 (с, 1Н); 6,86-6,88 (м, 4Н); 7,09 (д, 1Н, J=6,9 Гц); 7,26-7,42 (м, 9Н); 8,48 (д, 1Н, J=6,9 Гц); 8,59 (ушир.с, 1Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.19 (s, 3H); 2.56 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 2.65 (t, 2H, J = 6.2 Hz); 3.55 (dd, 1H, J = 10.5, 2.5 Hz); 3.63 (dd, 1H, J = 10.5, 2.5 Hz); 3.82 (s, 6H); 3.86 (t, 2H, J = 6.2 Hz); 4.09-4.14 (m, 1H); 4.28 (d, 1H, J = 5.1 Hz); 4.44-4.49 (m, 1H); 4.97, 5.24 (2d, 2H, J = 6.9 Hz); 5.96 (s, 1H); 6.86-6.88 (m, 4H); 7.09 (d, 1H, J = 6.9 Hz); 7.26-7.42 (m, 9H); 8.48 (d, 1H, J = 6.9 Hz); 8.59 (br s, 1H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 693 [M+Na]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 693 [M + Na] +

Стадия 2Stage 2

Получение N 4 -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит) Preparation of N 4- Acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite )

N4-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидин (205 мг, 0,306 ммоль), полученный на стадии 1, растворяют в 2 мл метиленхлорида, и добавляют 105 мг диизопропилэтиламина (0,812 ммоль), и добавляют по каплям 116 мг 2-цианоэтил N,N-диизопропилхлорфосфорамидита (0,49 ммоль). Реакционный раствор подвергают реакции при комнатной температуре в течение 1 час.N 4 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine (205 mg, 0.306 mmol) obtained in step 1 is dissolved in 2 ml of methylene chloride, and 105 mg of diisopropylethylamine (0.812 mmol) was added and 116 mg of 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite (0.49 mmol) was added dropwise. The reaction solution was reacted at room temperature for 1 hour.

После завершения реакции растворитель отгоняют и полученную смесь очищают колоночной хроматографией на 20 г силикагеля с получением целевого соединения (242 мг; выход 91%).After completion of the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting mixture was purified by column chromatography on 20 g of silica gel to obtain the target compound (242 mg; yield 91%).

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 871 [M+Н]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 871 [M + H] +

Пример 6Example 6

NN 4four -ацетил-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидин-acetyl-2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine

Стадия 1Stage 1

Получение NGetting N 4four -ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидина-acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine

N4-ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)цитидин (1,00 г, 1,89 ммоль) и метилтиометил-2-цианоэтиловый эфир (500 мг, 3,79 ммоль) смешивают и смесь растворяют в растворителе, смешанном из 10 мл толуола и 10 мл тетрагидрофурана.N 4 -acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) cytidine (1.00 g, 1.89 mmol) and methylthiomethyl-2-cyanoethyl ether (500 mg, 3.79 mmol) mixed and the mixture was dissolved in a solvent mixed from 10 ml of toluene and 10 ml of tetrahydrofuran.

Потом добавляют 975 мг трифторметансульфоната серебра и сушат при добавлении молекулярных сит 4Å.Then add 975 mg of trifluoromethanesulfonate silver and dried by adding molecular sieves 4Å.

При охлаждении льдом добавляют 370 мг N-бромсукцинимида (2,08 ммоль) и раствор перемешивают в течение 10 мин в реакционном сосуде, защищенном от света. Кроме того, добавляют 70 мг N-бромсукцинимида (0,39 ммоль) и перемешивают в течение 25 мин.Under ice-cooling, 370 mg of N-bromosuccinimide (2.08 mmol) was added and the solution was stirred for 10 minutes in a light-protected reaction vessel. In addition, 70 mg of N-bromosuccinimide (0.39 mmol) was added and stirred for 25 minutes.

После завершения реакции реакционный раствор разбавляют метиленхлоридом и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением N4-ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидина (936 мг; выход 81%).After completion of the reaction, the reaction solution was diluted with methylene chloride and washed with saturated aqueous sodium bicarbonate. The extract was dried over anhydrous sodium sulfate and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain N 4 -acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine (936 mg; 81% yield )

1Н-ЯМР (CDCl3): 0,90-1,11 (м, 28Н); 2,28 (с, 3Н); 2,62-2,79 (м, 2Н); 3,78-3,89 (м, 1Н); 3,96-4,04 (м, 2Н); 4,19-4,23 (м, 3Н); 4,30 (д, 1Н, J=13,6 Гц); 5,00 (д, 1Н, J=6,8 Гц); 5,09 (д, 1Н, J=6,8 Гц); 5,77 (с, 1Н); 7,44 (д, 1Н, J=7,5 Гц); 8,30 (д, 1Н, J=7,5 Гц); 10,13 (с, 1Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 0.90-1.11 (m, 28H); 2.28 (s, 3H); 2.62-2.79 (m, 2H); 3.78-3.89 (m, 1H); 3.96-4.04 (m, 2H); 4.19-4.23 (m, 3H); 4.30 (d, 1H, J = 13.6 Hz); 5.00 (d, 1H, J = 6.8 Hz); 5.09 (d, 1H, J = 6.8 Hz); 5.77 (s, 1H); 7.44 (d, 1H, J = 7.5 Hz); 8.30 (d, 1H, J = 7.5 Hz); 10.13 (s, 1H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 611 [M+Н]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 611 [M + H] +

Стадия 2Stage 2

Получение NGetting N 4four -ацетил-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидина-acetyl-2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine

N4-ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидин (500 мг, 0,819 ммоль), полученный на стадии 1, растворяют в растворителе, смешанном из 2,5 мл тетрагидрофурана и 2,5 мл метанола, и добавляют 150 мг фторида аммония (4,10 ммоль), и затем реакционный раствор подвергают реакции при 50ºС в течение 4 час.N 4 -acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine (500 mg, 0.819 mmol) obtained in stage 1 is dissolved in a solvent mixed from 2.5 ml of tetrahydrofuran and 2.5 ml of methanol, and 150 mg of ammonium fluoride (4.10 mmol) are added, and then the reaction solution is reacted at 50 ° C. for 4 hours.

После завершения реакции реакционный раствор разбавляют ацетонитрилом, и фильтруют, и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением целевого соединения (210 мг; выход 70%).After completion of the reaction, the reaction solution was diluted with acetonitrile, and filtered, and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound (210 mg; 70% yield).

1Н-ЯМР (D2О): 2,13 (с, 3Н); 2,66-2,71 (м, 2Н); 3,72-3,78 (м, 3Н); 3,90 (дд, 1Н, J=13,0, 2,6 Гц); 4,06-4,11 (м, 1Н); 4,20 (дд, 1Н, J=7,1, 5,2 Гц); 4,29 (дд, 1Н, J=5,1, 2,9 Гц); 4,83 (д, 1Н, J=7,2 Гц); 4,94 (д, 1Н, J=7,2 Гц); 5,95 (д, 1Н, J=2,9 Гц); 7,25 (д, 1Н, J=7,6 Гц); 8,25 (д, 1Н, J=7,6 Гц) 1 H-NMR (D 2 O): 2.13 (s, 3H); 2.66-2.71 (m, 2H); 3.72-3.78 (m, 3H); 3.90 (dd, 1H, J = 13.0, 2.6 Hz); 4.06-4.11 (m, 1H); 4.20 (dd, 1H, J = 7.1, 5.2 Hz); 4.29 (dd, 1H, J = 5.1, 2.9 Hz); 4.83 (d, 1H, J = 7.2 Hz); 4.94 (d, 1H, J = 7.2 Hz); 5.95 (d, 1H, J = 2.9 Hz); 7.25 (d, 1H, J = 7.6 Hz); 8.25 (d, 1H, J = 7.6 Hz)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 391 [M+Na]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 391 [M + Na] +

Пример 7Example 7

Получение NGetting N 4four -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидина-acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine

2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидин (9,9 г, 26,8 ммоль) подвергают азеотропной перегонке с пиридином и затем сушат вакуумным насосом в течение 30 мин. Твердый остаток растворяют в 190 мл тетрагидрофурана, и добавляют в атмосфере аргона 43 г пиридина (538 ммоль) и 20 г молекулярных сит 4Å, и смесь перемешивают в течение 10 мин.2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine (9.9 g, 26.8 mmol) was subjected to azeotropic distillation with pyridine and then dried by a vacuum pump for 30 minutes. The solid residue was dissolved in 190 ml of tetrahydrofuran, and 43 g of pyridine (538 mmol) and 20 g of molecular sieves 4Å were added under argon atmosphere, and the mixture was stirred for 10 minutes.

К реакционному раствору добавляют тремя порциями каждый 1 час 11,8 г 4,4'-диметокситритилхлорида (34,9 ммоль) и смесь дополнительно перемешивают в течение 1 час.11.8 g of 4,4'-dimethoxytrityl chloride (34.9 mmol) was added in three portions every 1 hour to the reaction solution, and the mixture was further stirred for 1 hour.

После добавления 2 мл метанола и перемешивания реакционного раствора в течение 2 мин реакционный раствор фильтруют через целит и промывают этилацетатом.After adding 2 ml of methanol and stirring the reaction solution for 2 minutes, the reaction solution was filtered through celite and washed with ethyl acetate.

После концентрирования фильтрата путем выпаривания твердый остаток растворяют в этилацетате и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия.After concentrating the filtrate by evaporation, the solid residue was dissolved in ethyl acetate and washed with saturated aqueous sodium bicarbonate.

После промывания органического слоя насыщенным рассолом (насыщенным раствором NaCl) и сушки над безводным сульфатом магния растворитель отгоняют.After washing the organic layer with saturated brine (saturated NaCl) and drying over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off.

Полученный твердый остаток очищают хроматографией на силикагеле с получением целевого соединения (15 г, выход 83%).The obtained solid residue was purified by silica gel chromatography to obtain the target compound (15 g, yield 83%).

Пример 8Example 8

N 2 -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит) N 2 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite )

Стадия 1Stage 1

Получение NGetting N 22 -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозина-acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine

N2-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)гуанозин (627 мг, 1 ммоль) растворяют в 4 мл 1,2-дихлорэтана, и добавляют 452 мг диизопропилэтиламина (3,5 ммоль), и затем добавляют 365 мг дибутилоловодихлорида (1,2 ммоль). И затем реакционный раствор подвергают реакции при комнатной температуре в течение 1 час.N 2 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) guanosine (627 mg, 1 mmol) was dissolved in 4 ml of 1,2-dichloroethane and 452 mg of diisopropylethylamine (3.5 mmol) was added and then 365 mg of dibutyltin dichloride (1.2 mmol) are added. And then the reaction solution is reacted at room temperature for 1 hour.

Затем реакционный раствор нагревают вплоть до 80ºС, и добавляют по каплям 155,4 мг хлорметил-2-цианоэтилового эфира (1,3 ммоль), и раствор перемешивают в течение 60 мин.Then the reaction solution is heated up to 80 ° C, and 155.4 mg of chloromethyl-2-cyanoethyl ether (1.3 mmol) are added dropwise, and the solution is stirred for 60 minutes.

После завершения реакции реакционный раствор смешивают с насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и подвергают экстракции метиленхлоридом. Экстракт сушат над безводным сульфатом магния и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на 30 г силикагеля с получением N2-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозина (450 мг; выход 63%).After completion of the reaction, the reaction solution was mixed with saturated aqueous sodium bicarbonate and subjected to extraction with methylene chloride. The extract was dried over anhydrous magnesium sulfate and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by column chromatography on 30 g of silica gel to give N 2 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine (450 mg; 63% yield).

1Н-ЯМР (CDCl3): 1,92 (с, 3Н); 2,47-2,51 (м, 2Н); 2,68 (ушир.с, 1Н); 3,30 (дд, 1Н, J=10,7, 3,8 Гц); 3,47 (дд, 1Н, J=10,7, 3,8 Гц); 3,55-3,60 (м, 1Н); 3,65-3,70 (м, 1Н); 3,74, 3,75 (2с, 6Н); 4,22-4,23 (м, 1Н); 4,55-4,58 (м, 1Н); 4,78, 4,83 (2д, 2Н, J=7,0 Гц); 5,01 (т, 1Н, J=5,1 Гц); 5,99 (д, 1Н, J=5,1 Гц); 6,76-6,79 (м, 4Н); 7,17-7,44 (м, 9Н); 7,88 (с, 1Н); 8,36 (ушир.с, 1Н); 12,06 (ушир.с, 1Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 1.92 (s, 3H); 2.47-2.51 (m, 2H); 2.68 (broad s, 1H); 3.30 (dd, 1H, J = 10.7, 3.8 Hz); 3.47 (dd, 1H, J = 10.7, 3.8 Hz); 3.55-3.60 (m, 1H); 3.65-3.70 (m, 1H); 3.74, 3.75 (2s, 6H); 4.22-4.23 (m, 1H); 4.55-4.58 (m, 1H); 4.78, 4.83 (2d, 2H, J = 7.0 Hz); 5.01 (t, 1H, J = 5.1 Hz); 5.99 (d, 1H, J = 5.1 Hz); 6.76-6.79 (m, 4H); 7.17-7.44 (m, 9H); 7.88 (s, 1H); 8.36 (br s, 1H); 12.06 (br s, 1H)

Стадия 2Stage 2

Получение N 2 -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин 3'-О-(2-цианоэтил-N,N-диизопропилфосфорамидит) Preparation of N 2 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine 3'-O- (2-cyanoethyl-N, N-diisopropylphosphoramidite )

N2-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин (400 мг, 0,563 ммоль), полученный на стадии 1, растворяют в 2 мл метиленхлорида, и добавляют 181 мг диизопропилэтиламина (1,4 ммоль), и добавляют по каплям 161 мг 2-цианоэтил N,N-диизопропилхлорфосфорамидита (0,68 ммоль). Затем реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 час.N 2 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine (400 mg, 0.563 mmol) obtained in stage 1 is dissolved in 2 ml of methylene chloride, and 181 mg of diisopropylethylamine (1.4 mmol) was added and 161 mg of 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite (0.68 mmol) was added dropwise. Then the reaction is carried out at room temperature for 1 hour.

После завершения реакции растворитель отгоняют и полученную смесь очищают колоночной хроматографией на 20 г силикагеля с получением целевого соединения (471 мг; выход 92%).After completion of the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting mixture was purified by column chromatography on 20 g of silica gel to obtain the target compound (471 mg; yield 92%).

Пример 9Example 9

N 6 -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит) N 6 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite )

Стадия 1Stage 1

Получение NGetting N 66 -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозина-acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine

N6-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)аденозин (22,0 г, 36,0 ммоль) растворяют в 170 мл 1,2-дихлорэтана, и добавляют 16,3 г диизопропилэтиламина (126 ммоль), и потом добавляют 12,1 г дибутилоловодихлорида (39,7 ммоль). Затем реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 час.N 6 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) adenosine (22.0 g, 36.0 mmol) was dissolved in 170 ml of 1,2-dichloroethane and 16.3 g of diisopropylethylamine (126 mmol) was added. ), and then 12.1 g of dibutyltin dichloride (39.7 mmol) are added. Then the reaction is carried out at room temperature for 1 hour.

Затем реакционный раствор нагревают вплоть до 80ºС, и добавляют по каплям 4,30 г хлорметил-2-цианоэтилового эфира (36,0 ммоль), и раствор перемешивают в течение 30 мин.Then, the reaction solution is heated up to 80 ° C, and 4.30 g of chloromethyl-2-cyanoethyl ether (36.0 mmol) are added dropwise, and the solution is stirred for 30 minutes.

После завершения реакции реакционный раствор добавляют к насыщенному водному раствору бикарбоната натрия и подвергают экстракции метиленхлоридом. Экстракт сушат над безводным сульфатом магния и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением N6-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозина (7,47 г; выход 33%).After completion of the reaction, the reaction solution was added to a saturated aqueous sodium bicarbonate solution and subjected to extraction with methylene chloride. The extract was dried over anhydrous magnesium sulfate and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain N 6 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine (7.47 g; yield 33%).

1Н-ЯМР (CDCl3): 2,51 (т, 2Н, J=6,2 Гц); 2,58 (д, 1Н, J=5,5 Гц); 2,61 (с, 3Н); 3,45 (дд, 1Н, J=10,7, 4,0 Гц); 3,54 (дд, 1Н, J=10,7, 3,2 Гц); 3,62-3,79 (м, 2Н); 3,79 (с, 6Н); 4,25 (ушир.кв., 1Н, J=4,6 Гц); 4,59 (кв., 1Н, J=5,2 Гц); 4,87-4,94 (м, 3Н); 6,23 (д, 1Н, J=4,4 Гц); 6,80-6,83 (м, 4Н); 7,22-7,32 (м, 7Н); 7,40-7,43 (м, 2Н); 8,20 (с, 1Н); 8,61 (ушир.с, 1Н); 8,62 (с, 1Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.51 (t, 2H, J = 6.2 Hz); 2.58 (d, 1H, J = 5.5 Hz); 2.61 (s, 3H); 3.45 (dd, 1H, J = 10.7, 4.0 Hz); 3.54 (dd, 1H, J = 10.7, 3.2 Hz); 3.62-3.79 (m, 2H); 3.79 (s, 6H); 4.25 (broad s, 1H, J = 4.6 Hz); 4.59 (q, 1H, J = 5.2 Hz); 4.87-4.94 (m, 3H); 6.23 (d, 1H, J = 4.4 Hz); 6.80-6.83 (m, 4H); 7.22-7.32 (m, 7H); 7.40-7.43 (m, 2H); 8.20 (s, 1H); 8.61 (br s, 1H); 8.62 (s, 1H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 695 [M+Н]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 695 [M + H] +

Стадия 2Stage 2

Получение N 6 -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит) Preparation of N 6 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite )

N6-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозин (10,0 г, 14,4 ммоль), полученный на стадии 1, растворяют в 75 мл метиленхлорида, и добавляют 4,7 г диизопропилэтиламина (36 ммоль), и добавляют по каплям 4,82 г 2-цианоэтил N,N-диизопропилхлорфосфорамидита (20,3 ммоль). Затем реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 час.N 6 -acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine (10.0 g, 14.4 mmol) obtained in stage 1 is dissolved in 75 ml of methylene chloride, and 4.7 g of diisopropylethylamine (36 mmol) was added, and 4.82 g of 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite (20.3 mmol) was added dropwise. Then the reaction is carried out at room temperature for 1 hour.

После завершения реакции растворитель отгоняют и полученную смесь, в которой остается приблизительно 30 мл растворителя, очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением целевого соединения (12,0 г; выход 93%).After completion of the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting mixture, in which approximately 30 ml of solvent remained, was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound (12.0 g; yield 93%).

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 895 [M+Н]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 895 [M + H] +

Пример 10Example 10

NN 66 -ацетил-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозин-acetyl-2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine

Стадия 1Stage 1

Получение NGetting N 66 -ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозина-acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine

В 8 мл метиленхлорида суспендируют 245 мг N-йодсукцинимида (1,09 ммоль) и 280 мг трифторметансульфоната серебра (1,09 ммоль) и раствор сушат путем добавления молекулярных сит 4Å.245 mg of N-iodosuccinimide (1.09 mmol) and 280 mg of silver trifluoromethanesulfonate (1.09 mmol) are suspended in 8 ml of methylene chloride and the solution is dried by adding 4Å molecular sieves.

К реакционному раствору добавляют раствор N6-ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)аденозина (400 мг, 0,73 ммоль) и 145 мг метилтиометил-2-цианоэтилового эфира (1,11 ммоль) в 4 мл метиленхлорида при охлаждении льдом и реакционную смесь перемешивают в течение 3 час.To the reaction solution was added a solution of N 6 -acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) adenosine (400 mg, 0.73 mmol) and 145 mg of methylthiomethyl-2-cyanoethyl ether (1.11 mmol) in 4 ml of methylene chloride under ice-cooling and the reaction mixture was stirred for 3 hours.

После завершения реакции реакционную смесь разбавляют метиленхлоридом и промывают водным раствором тиосульфата натрия и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Экстракт сушат над безводным сульфатом магния и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением N6-ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозина (201 мг; выход 45%).After completion of the reaction, the reaction mixture was diluted with methylene chloride and washed with an aqueous solution of sodium thiosulfate and a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate. The extract was dried over anhydrous magnesium sulfate and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain N 6 -acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine (201 mg; 45% yield )

1Н-ЯМР (CDCl3): 0,98-1,11 (м, 28Н); 2,62 (с, 3Н); 2,69 (тд, 2Н, J=6,5, 1,5 Гц); 3,81-3,89 (м, 1Н); 4,02-4,09 (м, 2Н); 4,17 (д, 1Н, J=9,4 Гц); 4,28 (д, 1Н, J=13,4 Гц); 4,50 (д, 1Н, J=4,5 Гц); 4,67 (дд, 1Н, J=8,8, 4,5 Гц); 5,02 (д, 1Н, J=7,0 Гц); 5,08 (д, 1Н, J=7,0 Гц); 6,10 (с, 1Н); 8,34 (с, 1Н); 8,66 (с, 1Н); 8,67 (с, 1Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 0.98-1.11 (m, 28H); 2.62 (s, 3H); 2.69 (td, 2H, J = 6.5, 1.5 Hz); 3.81-3.89 (m, 1H); 4.02-4.09 (m, 2H); 4.17 (d, 1H, J = 9.4 Hz); 4.28 (d, 1H, J = 13.4 Hz); 4.50 (d, 1H, J = 4.5 Hz); 4.67 (dd, 1H, J = 8.8, 4.5 Hz); 5.02 (d, 1H, J = 7.0 Hz); 5.08 (d, 1H, J = 7.0 Hz); 6.10 (s, 1H); 8.34 (s, 1H); 8.66 (s, 1H); 8.67 (s, 1H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 636 [M+Н]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 636 [M + H] +

Стадия 2Stage 2

Получение NGetting N 66 -ацетил-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозина-acetyl-2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine

N6-ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозин (300 мг, 0,47 ммоль), полученный на стадии 1, растворяют в растворителе, смешанном из 0,1 мл уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора фторида тетрабутиламмония, и реакционный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 2 час.N 6 -acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine (300 mg, 0.47 mmol) obtained in step 1 is dissolved in a solvent mixed from 0.1 ml of acetic acid and 2 ml of a 0.5 M tetrabutylammonium fluoride solution, and the reaction solution was stirred at room temperature for 2 hours.

После завершения реакции полученную реакционную смесь очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением целевого соединения (160 мг; выход 86%).After completion of the reaction, the resulting reaction mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound (160 mg; 86% yield).

1Н-ЯМР (DMSO-d6): 2,25 (с, 3Н); 2,53-2,68 (м, 2Н); 3,41-3,46 (м, 1Н); 3,56-3,64 (м, 2Н); 3,69-3,73 (м, 1Н); 4,00-4,01 (м, 1Н); 4,36-4,37 (м, 1Н); 4,72-4,78 (м, 3Н); 5,20 (ушир.т, 2Н); 5,41 (д, 1Н, J=5,2 Гц); 6,17 (д, 1Н, J=5,7 Гц); 8,66 (с, 1Н); 8,72 (с, 1Н); 10,72 (с, 1Н) 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): 2.25 (s, 3H); 2.53-2.68 (m, 2H); 3.41-3.46 (m, 1H); 3.56-3.64 (m, 2H); 3.69-3.73 (m, 1H); 4.00-4.01 (m, 1H); 4.36-4.37 (m, 1H); 4.72-4.78 (m, 3H); 5.20 (br t, 2H); 5.41 (d, 1H, J = 5.2 Hz); 6.17 (d, 1H, J = 5.7 Hz); 8.66 (s, 1H); 8.72 (s, 1H); 10.72 (s, 1H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 415 [M+Na]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 415 [M + Na] +

Пример 11Example 11

Получение NGetting N 66 -ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозина-acetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine

N6-ацетил-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозин (9,50 г, 24,2 ммоль) растворяют в 100 мл безводного пиридина и затем сушат путем концентрирования. Затем твердый остаток растворяют в 100 мл дегидратированного пиридина в атмосфере аргона.N 6 -acetyl-2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine (9.50 g, 24.2 mmol) was dissolved in 100 ml of anhydrous pyridine and then dried by concentration. The solid residue is then dissolved in 100 ml of dehydrated pyridine in an argon atmosphere.

При охлаждении льдом добавляют 10,7 г 4,4'-диметокситритилхлорида (31,2 ммоль) и реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 час 20 мин.Under ice cooling, 10.7 g of 4,4'-dimethoxytrityl chloride (31.2 mmol) was added and the reaction was carried out at room temperature for 1 hour 20 minutes.

После завершения реакции реакционный раствор разбавляют метиленхлоридом и промывают водой. Экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением целевого соединения (13,8 г; выход 82%).After completion of the reaction, the reaction solution was diluted with methylene chloride and washed with water. The extract was dried over anhydrous sodium sulfate and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound (13.8 g; 82% yield).

Пример 12Example 12

N 2 -Феноксиацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит) N 2 -Phenoxyacetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite )

Стадия 1Stage 1

Получение NGetting N 22 -феноксиацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозина-phenoxyacetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine

N2-феноксиацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)гуанозин (720 мг, 1 ммоль) растворяют в 4 мл 1,2-дихлорэтана, и добавляют 452 мг диизопропилэтиламина (3,5 ммоль), и потом добавляют 365 мг дибутилоловодихлорида (1,2 ммоль). Затем реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 час.N 2 -phenoxyacetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) guanosine (720 mg, 1 mmol) was dissolved in 4 ml of 1,2-dichloroethane and 452 mg of diisopropylethylamine (3.5 mmol) was added, and then 365 mg of dibutyltin dichloride (1.2 mmol) are added. Then the reaction is carried out at room temperature for 1 hour.

Затем реакцию проводят при 80ºС, и добавляют по каплям 155,4 мг хлорметил-2-цианоэтилового эфира (1,3 ммоль), и раствор перемешивают в течение 60 мин.Then the reaction was carried out at 80 ° C, and 155.4 mg of chloromethyl-2-cyanoethyl ether (1.3 mmol) was added dropwise, and the solution was stirred for 60 minutes.

После завершения реакции реакционный раствор смешивают с насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и подвергают экстракции метиленхлоридом. Экстракт сушат над безводным сульфатом магния и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на 30 г силикагеля с получением N2-феноксиацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозина (384 мг; выход 48%).After completion of the reaction, the reaction solution was mixed with saturated aqueous sodium bicarbonate and subjected to extraction with methylene chloride. The extract was dried over anhydrous magnesium sulfate and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by column chromatography on 30 g of silica gel to give N 2 -phenoxyacetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine (384 mg; 48% yield).

1Н-ЯМР (CDCl3): 2,47-2,51 (м, 2Н); 2,58 (ушир.с, 1Н); 3,42 (дд, 1Н, J=10,1, 3,8 Гц); 3,46 (дд, 1Н, J=10,1, 3,8 Гц); 3,53-3,57 (м, 1Н); 3,69-3,73 (м, 1Н); 3,77 (с, 6Н); 4,24-4,26 (м, 1Н); 4,48-4,50 (м, 1Н); 4,61-4,65 (м, 2Н); 4,83, 4,87 (2д, 2Н, J=7,0 Гц); 4,88 (т, 1Н, J=5,7 Гц); 6,05 (д, 1Н, J=5,7 Гц); 6,80-6,82 (м, 4Н); 6,92-6,96 (м, 3Н); 7,07-7,11 (м, 2Н); 7,20-7,42 (м, 9Н); 7,84 (с, 1Н); 8,99 (с, 1Н); 11,81 (ушир.с, 1Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 2.47-2.51 (m, 2H); 2.58 (br s, 1H); 3.42 (dd, 1H, J = 10.1, 3.8 Hz); 3.46 (dd, 1H, J = 10.1, 3.8 Hz); 3.53-3.57 (m, 1H); 3.69-3.73 (m, 1H); 3.77 (s, 6H); 4.24-4.26 (m, 1H); 4.48-4.50 (m, 1H); 4.61-4.65 (m, 2H); 4.83, 4.87 (2d, 2H, J = 7.0 Hz); 4.88 (t, 1H, J = 5.7 Hz); 6.05 (d, 1H, J = 5.7 Hz); 6.80-6.82 (m, 4H); 6.92-6.96 (m, 3H); 7.07-7.11 (m, 2H); 7.20-7.42 (m, 9H); 7.84 (s, 1H); 8.99 (s, 1H); 11.81 (broad s, 1H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 825 [M+Na]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 825 [M + Na] +

Стадия 2Stage 2

Получение N 2 -феноксиацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит) Preparation of N 2 -phenoxyacetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite )

N2-феноксиацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин (320 мг, 0,399 ммоль), полученный на стадии 1, растворяют в 4 мл метиленхлорида, и добавляют 128,8 мг диизопропилэтиламина (0,996 ммоль), и добавляют по каплям 141,5 мг 2-цианоэтил N,N-диизопропилхлорфосфорамидита (0,598 ммоль). Затем реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 час.N 2 -phenoxyacetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine (320 mg, 0.399 mmol) obtained in stage 1 is dissolved in 4 ml of methylene chloride, and 128.8 mg of diisopropylethylamine (0.996 mmol) are added and 141.5 mg of 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite (0.598 mmol) is added dropwise. Then the reaction is carried out at room temperature for 1 hour.

После завершения реакции растворитель отгоняют и полученную смесь очищают колоночной хроматографией на 30 г силикагеля с получением целевого соединения (316 мг; выход 79%).After completion of the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting mixture was purified by column chromatography on 30 g of silica gel to obtain the target compound (316 mg; yield 79%).

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 1003 [M+Н]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 1003 [M + H] +

Пример 13Example 13

NN 22 -феноксиацетил-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин-phenoxyacetyl-2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine

Стадия 1Stage 1

Получение NGetting N 22 -феноксиацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозина-phenoxyacetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine

N2-феноксиацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)гуанозин (2,0 г, 3,0 ммоль) растворяют в 16 мл тетрагидрофурана, и добавляют 0,99 г метилтиометил-2-цианоэтилового эфира (7,6 ммоль) и 1,0 г молекулярных сит 4Å, и реакционный раствор перемешивают при -45ºС в течение 10 мин в атмосфере аргона.N 2 -phenoxyacetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) guanosine (2.0 g, 3.0 mmol) was dissolved in 16 ml of tetrahydrofuran, and 0.99 g of methylthiomethyl-2- was added cyanoethyl ether (7.6 mmol) and 1.0 g of molecular sieves 4 Å, and the reaction solution was stirred at -45 ° C for 10 min in an argon atmosphere.

После добавления раствора 0,68 г трифторметансульфокислоты (4,5 ммоль) в 5 мл тетрагидрофурана и перемешивания реакционного раствора добавляют 1,02 г N-йодсукцинимида (4,5 ммоль) и реакционный раствор перемешивают в течение 15 мин.After adding a solution of 0.68 g of trifluoromethanesulfonic acid (4.5 mmol) in 5 ml of tetrahydrofuran and stirring the reaction solution, 1.02 g of N-iodosuccinimide (4.5 mmol) was added and the reaction solution was stirred for 15 minutes.

После добавления насыщенного водного раствора бикарбоната натрия к реакционному раствору и затем фильтрации реакционного раствора органический слой промывают 1 М водным раствором гидротиосульфата натрия.After adding a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate to the reaction solution and then filtering the reaction solution, the organic layer was washed with a 1 M aqueous solution of sodium hydrothiosulfate.

Далее, реакционный раствор последовательно промывают водой и насыщенным рассолом (насыщенный раствор NaCl), и экстракт сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель отгоняют.Next, the reaction solution was washed successively with water and saturated brine (saturated NaCl solution), and the extract was dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off.

Полученный твердый остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением N2-феноксиацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозина (2,0 г; выход 89%).The obtained solid residue was purified by silica gel column chromatography to obtain N 2 -phenoxyacetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine (2.0 g; yield 89%).

1Н-ЯМР (CDCl3): 0,99-1,11 (м, 28Н); 2,59-2,77 (м, 2Н); 3,82-4,05 (м, 3Н); 4,15 (д, 1Н, J=9,3 Гц); 4,25-4,35 (м, 2Н); 4,52-4,56 (дд, 1Н, J=9,3, 4,3 Гц); 5,00-5,07 (2д, 2Н, J=7,2 Гц); 5,95 (с, 1Н); 6,99-7,12 (м, 3Н); 7,35-7,40 (м, 2Н); 8,09 (с, 1Н); 9,38 (ушир.с, 1Н); 11,85 (ушир.с, 1Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 0.99-1.11 (m, 28H); 2.59-2.77 (m, 2H); 3.82-4.05 (m, 3H); 4.15 (d, 1H, J = 9.3 Hz); 4.25-4.35 (m, 2H); 4.52-4.56 (dd, 1H, J = 9.3, 4.3 Hz); 5.00-5.07 (2d, 2H, J = 7.2 Hz); 5.95 (s, 1H); 6.99-7.12 (m, 3H); 7.35-7.40 (m, 2H); 8.09 (s, 1H); 9.38 (br s, 1H); 11.85 (broad s, 1H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 766 [M+Na]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 766 [M + Na] +

Стадия 2Stage 2

Получение NGetting N 22 -феноксиацетил-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозина-phenoxyacetyl-2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine

Готовят раствор, состоящий из 0,14 мл уксусной кислоты (0,14 ммоль) и 2,83 мл 1 М раствора фторида тетрабутиламмония в тетрагидрофуране (2,83 ммоль).A solution is prepared consisting of 0.14 ml of acetic acid (0.14 mmol) and 2.83 ml of a 1 M solution of tetrabutylammonium fluoride in tetrahydrofuran (2.83 mmol).

N2-феноксиацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин (1,0 г, 1,35 ммоль), полученный на стадии 1, растворяют в 2,83 мл тетрагидрофурана, и добавляют раствор, приготовленный выше, и реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 час в атмосфере аргона.N 2 -phenoxyacetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine (1.0 g, 1.35 mmol) obtained in step 1 dissolved in 2.83 ml of tetrahydrofuran, and the solution prepared above is added, and the reaction is carried out at room temperature for 1 hour under argon atmosphere.

Реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении, и остаток растворяют в метиленхлориде, и очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением целевого соединения (0,67 г; выход 99%).The reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the residue was dissolved in methylene chloride and purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound (0.67 g; 99% yield).

1Н-ЯМР (DMSO-d6): 2,59-2,66 (м, 2Н); 3,41-3,63 (м, 4Н); 3,98 (м, 1Н); 4,32 (м, 1Н); 4,58-4,62 (т, 1Н, J=5,3 Гц); 4,71-4,78 (дд, 2Н, J=13,1, 6,8 Гц); 4,87 (с, 2Н); 5,12 (с, 1Н); 5,37 (с, 1Н); 5,97 (д, 1Н, J=6,1 Гц); 6,96-6,99 (м, 3Н); 7,28-7,34 (м, 2Н); 8,30 (с, 1Н); 11,78 (ушир.с, 2Н) 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): 2.59-2.66 (m, 2H); 3.41-3.63 (m, 4H); 3.98 (m, 1H); 4.32 (m, 1H); 4.58-4.62 (t, 1H, J = 5.3 Hz); 4.71-4.78 (dd, 2H, J = 13.1, 6.8 Hz); 4.87 (s, 2H); 5.12 (s, 1H); 5.37 (s, 1H); 5.97 (d, 1H, J = 6.1 Hz); 6.96-6.99 (m, 3H); 7.28-7.34 (m, 2H); 8.30 (s, 1H); 11.78 (br s, 2H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 500 [M-Н]- Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 500 [M-H] -

Пример 14Example 14

NN 22 -феноксиацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин-phenoxyacetyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine

N2-феноксиацетил-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин (660 мг, 1,32 ммоль) подвергают азеотропной перегонке с пиридином и затем сушат вакуумным насосом в течение 30 мин.N 2 -phenoxyacetyl-2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine (660 mg, 1.32 mmol) was subjected to azeotropic distillation with pyridine and then dried by a vacuum pump for 30 minutes.

Твердый остаток растворяют в 9 мл тетрагидрофурана, и добавляют в атмосфере аргона 2,1 г пиридина (26,4 ммоль) и 600 мг молекулярных сит 4Å, и реакционный раствор перемешивают в течение 10 мин.The solid residue was dissolved in 9 ml of tetrahydrofuran, and 2.1 g of pyridine (26.4 mmol) and 600 mg of 4Å molecular sieves were added under argon atmosphere, and the reaction solution was stirred for 10 minutes.

К реакционному раствору добавляют тремя порциями каждый 1 час 540 мг 4,4'-диметокситритилхлорида (1,58 ммоль) и реакционный раствор дополнительно перемешивают в течение 1 час.540 mg of 4,4'-dimethoxytrityl chloride (1.58 mmol) was added in three portions every 1 hour to the reaction solution, and the reaction solution was further stirred for 1 hour.

После добавления 2 мл метанола и перемешивания реакционного раствора в течение 2 мин реакционный раствор фильтруют через целит и промывают этилацетатом.After adding 2 ml of methanol and stirring the reaction solution for 2 minutes, the reaction solution was filtered through celite and washed with ethyl acetate.

После концентрирования фильтрата путем выпаривания остаток растворяют в этилацетате и разделяют посредством насыщенного водного раствора бикарбоната натрия.After concentrating the filtrate by evaporation, the residue was dissolved in ethyl acetate and separated by saturated aqueous sodium bicarbonate.

После промывания органического слоя насыщенным рассолом (насыщенный раствор NaCl) и сушки над безводным сульфатом магния растворитель отгоняют.After washing the organic layer with saturated brine (saturated NaCl) and drying over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off.

Полученный твердый остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением целевого соединения (800 мг, выход 75%).The obtained solid residue was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound (800 mg, 75% yield).

Пример 15Example 15

NN 66 -ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозин-acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine

Стадия 1Stage 1

Получение NGetting N 66 -ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-метилтиометиладенозина-acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O-methylthiomethyladenosine

N6-ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)аденозин (2,00 г, 3,62 ммоль) растворяют в 25 мл диметилсульфоксида, и добавляют 17,5 мл уксусного ангидрида и 12,5 мл уксусной кислоты, и реакционный раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 14 час.N 6 -acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) adenosine (2.00 g, 3.62 mmol) was dissolved in 25 ml of dimethyl sulfoxide, and 17.5 ml of acetic anhydride and 12 were added. , 5 ml of acetic acid, and the reaction solution was stirred at room temperature for 14 hours.

После завершения реакции реакционный раствор добавляют к 200 мл воды, экстрагируют этилацетатом и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением N6-ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-метилтиометиладенозина (1,36 г; выход 61%).After completion of the reaction, the reaction solution was added to 200 ml of water, extracted with ethyl acetate and washed with saturated aqueous sodium bicarbonate. The extract was dried over anhydrous sodium sulfate and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain N 6 -acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O-methylthiomethyladenosine (1.36 g; 61% yield).

1Н-ЯМР (CDCl3): 0,96-1,11 (м, 28Н); 2,20 (с, 3Н); 2,61 (с, 3Н); 4,03 (дд, 1Н, J=13,4, 2,4 Гц); 4,18 (д, 1Н, J=9,1 Гц); 4,27 (д, 1Н, J=13,4 Гц); 4,63-4,71 (м, 2Н); 5,00 (д, 1Н, J=11,5 Гц); 5,07 (д, 1Н, J=11,5 Гц); 6,09 (с, 1Н); 8,31 (с, 1Н); 8,65 (с, 1Н); 8,69 (с, 1Н) 1 H-NMR (CDCl 3 ): 0.96-1.11 (m, 28H); 2.20 (s, 3H); 2.61 (s, 3H); 4.03 (dd, 1H, J = 13.4, 2.4 Hz); 4.18 (d, 1H, J = 9.1 Hz); 4.27 (d, 1H, J = 13.4 Hz); 4.63-4.71 (m, 2H); 5.00 (d, 1H, J = 11.5 Hz); 5.07 (d, 1H, J = 11.5 Hz); 6.09 (s, 1H); 8.31 (s, 1H); 8.65 (s, 1H); 8.69 (s, 1H)

Масс-спектрометрия с ионизацией в искровом или тлеющем разряде (ESI-Mass): 635 [M+Na]+ Mass spectrometry with ionization in a spark or glow discharge (ESI-Mass): 635 [M + Na] +

Стадия 2Stage 2

Получение NGetting N 66 -ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозина-acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyl disiloxane-1,3-diyl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine

N6-ацетил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2'-О-метилтиометиладенозин (1,00 г, 1,63 ммоль), полученный на стадии 1, растворяют в 25 мл тетрагидрофурана.N 6 -acetyl-3 ', 5'-O- (tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl) -2'-O-methylthiomethyladenosine (1.00 g, 1.63 mmol) obtained in step 1 is dissolved in 25 ml tetrahydrofuran.

К реакционному раствору добавляют 5,88 г 3-гидроксипропионитрила (82,7 ммоль), и этот раствор сушат путем добавления молекулярных сит 4Å, и охлаждают до -45ºС.5.88 g of 3-hydroxypropionitrile (82.7 mmol) was added to the reaction solution, and this solution was dried by adding 4 Å molecular sieves and cooled to -45 ° C.

К реакционному раствору добавляют 440 мг N-йодсукцинимида (1,96 ммоль) и затем 490 мг трифторметансульфокислоты (3,26 ммоль) и реакционный раствор перемешивают при -45ºС в течение 15 мин.To the reaction solution was added 440 mg of N-iodosuccinimide (1.96 mmol) and then 490 mg of trifluoromethanesulfonic acid (3.26 mmol) and the reaction solution was stirred at -45 ° C for 15 minutes.

После завершения реакции реакционный раствор нейтрализуют путем добавления триэтиламина при охлаждении и разбавляют метиленхлоридом. Реакционный раствор промывают водным раствором тиосульфата натрия и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель отгоняют. Полученную смесь очищают колоночной хроматографией на силикагеле с получением целевого соединения (722 мг; выход 71%).After completion of the reaction, the reaction solution was neutralized by adding triethylamine under cooling and diluted with methylene chloride. The reaction solution was washed with an aqueous solution of sodium thiosulfate and a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate, the extract was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off. The resulting mixture was purified by silica gel column chromatography to obtain the target compound (722 mg; 71% yield).

Пример 16Example 16

Уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридинUridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridine

Олиго-РНК соединения, указанного в заглавии, синтезируют путем ввода имеющегося в продаже твердого носителя СPG (стекло с заданным размером пор) (37 мг, 1 мкмоль), содержащего 2'/3'-О-бензоил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)уридин, в колонку со стеклянным фильтром и путем использования автоматического синтезатора нуклеиновой кислоты (ExpediteTM: Applied Biosystems (Прикладные Биосистемы)).The oligo-RNA of the title compound is synthesized by introducing a commercially available solid support CPG (glass with a predetermined pore size) (37 mg, 1 μmol) containing 2 '/ 3'-O-benzoyl-5'-O- ( 4,4'-dimethoxytrityl) uridine, in a column with a glass filter and by using an automated nucleic acid synthesizer (Expedite TM : Applied Biosystems).

Используют 5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит) в качестве соединения мономера нуклеиновой кислоты, тетразол в качестве катализатора конденсации, раствор йода в качестве окислителя, раствор уксусного ангидрида и N-метилимидазола в качестве кэппирующего раствора.Use 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite) as the nucleic acid monomer compound, tetrazole as a condensation catalyst, a solution of iodine as an oxidizing agent, a solution of acetic anhydride and N-methylimidazole as a capping solution.

После 20-кратной конденсации соединений мономера нуклеиновой кислоты олиго-РНК отщепляют посредством действия 10 М водно-этанольного раствора метиламина в качестве отщепляющего агента при комнатной температуре в течение 1-2 час и защитные группы каждой фосфатной части удаляют.After a 20-fold condensation of the nucleic acid monomer compounds, the oligo RNAs are cleaved off by the action of a 10 M aqueous ethanol solution of methylamine as a cleaving agent at room temperature for 1-2 hours and the protective groups of each phosphate moiety are removed.

После концентрирования реакционной смеси при пониженном давлении и удаления ненужных пиков при помощи колонки с обращенной фазой (ODS) реакционный раствор очищают элюентом (50 мМ триэтиламин - ацетатный буферный раствор в ацетонитриле).After concentrating the reaction mixture under reduced pressure and removing unnecessary peaks using a reverse phase column (ODS), the reaction solution was purified with an eluent (50 mM triethylamine - acetate buffer solution in acetonitrile).

После концентрирования остатка при пониженном давлении остаток подвергают реакции с 1 М раствором фторида тетрабутиламмония в тетрагидрофуране при комнатной температуре в течение 1 час для удаления защитной группы для 2'-гидроксильной группы.After the residue was concentrated under reduced pressure, the residue was reacted with a 1 M solution of tetrabutylammonium fluoride in tetrahydrofuran at room temperature for 1 hour to remove the protective group for the 2'-hydroxyl group.

После обессоливания реакционного раствора защитную группу для 5'-концевой группы удаляют посредством 80% раствора уксусной кислоты (обработка при комнатной температуре в течение 10 мин).After desalting the reaction solution, the protective group for the 5'-terminal group is removed with 80% acetic acid solution (treatment at room temperature for 10 minutes).

После концентрирования при пониженном давлении водный слой промывают эфиром и получают целевое соединение высокой степени чистоты без очистки.After concentration under reduced pressure, the aqueous layer was washed with ether and the target compound of high purity was obtained without purification.

Времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбционной ионизацией (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass-Spectroscopy (MALDI-TOF-MS)):Time-of-flight mass spectrometry with matrix laser desorption ionization (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass-Spectroscopy (MALDI-TOF-MS)):

Вычисленное значение 6367,52 [М+Н]+ The calculated value is 6367.52 [M + H] +

Найденное значение 6366,50 [М+Н]+ Found Value 6366.50 [M + H] +

Из аналитических данных ВЭЖХ с обращенной фазой, представленных на чертеже, ясно, что полученное соединение имеет высокую степень чистоты.From the analytical data of the reverse phase HPLC presented in the drawing, it is clear that the obtained compound has a high degree of purity.

Условия измерений являются следующими:The measurement conditions are as follows:

Прибор для Высокоэффективной Жидкостной Хроматографии (ВЭЖХ)High Performance Liquid Chromatography Instrument (HPLC)

Устройство для аспирации: LC -6A (SHIMADZU CORPORATION)Suction device: LC -6A (SHIMADZU CORPORATION)

Детектор: SPD-6A (SHIMADZU CORPORATION)Detector: SPD-6A (SHIMADZU CORPORATION)

Колонка ВЭЖХ с обращенной фазой: Mightysil RP-18GP <4,6 мм ⌀×15 см> (KANTO KAGAKU)Reverse phase HPLC column: Mightysil RP-18GP <4.6 mm ⌀ × 15 cm> (KANTO KAGAKU)

Температура колонки: 35ºСColumn temperature: 35ºС

Градиент подвижной фазы: линейный градиент, 20 мин (раствор В: 0-70%)Mobile phase gradient: linear gradient, 20 min (solution B: 0-70%)

Раствор А: 50 мМ триэтиламин-ацетатный буферный раствор, содержащий 5% ацетонитрилаSolution A: 50 mM triethylamine acetate buffer solution containing 5% acetonitrile

Раствор В: 50 мМ триэтиламин-ацетатный буферный раствор, содержащий 90% ацетонитрилаSolution B: 50 mM triethylamine acetate buffer solution containing 90% acetonitrile

Скорость потока подвижной фазы: 1 мл/минMobile phase flow rate: 1 ml / min

Длина волны для детектирования спектрофотометром в ультрафиолетовой видимой области: 260 нмWavelength for detection by a spectrophotometer in the ultraviolet visible region: 260 nm

Пример 17Example 17

Цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридинCytidylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - uridine

Олиго-РНК соединения, указанного в заглавии, синтезируют путем ввода имеющегося в продаже твердого носителя СPG (стекло с заданным размером пор) (37 мг, 1 мкмоль), содержащего 2'/3'-О-бензоил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)уридин, в колонку со стеклянным фильтром и путем использования автоматического синтезатора нуклеиновой кислоты (ExpediteTM: Applied Biosystems (Прикладные Биосистемы)).The oligo-RNA of the title compound is synthesized by introducing a commercially available solid support CPG (glass with a predetermined pore size) (37 mg, 1 μmol) containing 2 '/ 3'-O-benzoyl-5'-O- ( 4,4'-dimethoxytrityl) uridine, in a column with a glass filter and by using an automated nucleic acid synthesizer (Expedite TM : Applied Biosystems).

Используют 5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)уридин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит), N4-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)цитидин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит), N4-ацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)аденозин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит) и N2-феноксиацетил-5'-О-(4,4'-диметокситритил)-2'-О-(2-цианоэтоксиметил)гуанозин 3'-О-(2-цианоэтил N,N-диизопропилфосфорамидит) в качестве соединения мономера нуклеиновой кислоты; 5-этилтиотетразол в качестве катализатора конденсации; раствор йода в качестве окислителя; раствор феноксиуксусного ангидрида и N-метилимидазола в качестве кэппирующего раствора.Use 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) uridine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite), N 4 -acetyl-5'- O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) cytidine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite), N 4 -acetyl-5'-O- (4 , 4'-dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) adenosine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite) and N 2 -phenoxyacetyl-5'-O- (4,4'- dimethoxytrityl) -2'-O- (2-cyanoethoxymethyl) guanosine 3'-O- (2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite) as the nucleic acid monomer compound; 5-ethylthiotetrazole as a condensation catalyst; iodine solution as an oxidizing agent; a solution of phenoxyacetic anhydride and N-methylimidazole as a capping solution.

После 19-кратной конденсации соединений мономеров нуклеиновой кислоты защитную группу для 5'-концевой гидроксильной группы удаляют на твердой фазе. Затем олиго-РНК отщепляют посредством действия смеси концентрированного водного раствора аммиака и этанола (3:1) в качестве отщепляющего агента при 40ºС в течение 4 час и защитные группы каждой фосфатной части и основания удаляют.After a 19-fold condensation of the nucleic acid monomer compounds, the protective group for the 5'-terminal hydroxyl group is removed in the solid phase. Then the oligo-RNA is cleaved by the action of a mixture of concentrated aqueous ammonia and ethanol (3: 1) as a cleaving agent at 40 ° C for 4 hours and the protective groups of each phosphate part and base are removed.

После концентрирования реакционной смеси при пониженном давлении остаток подвергают реакции с 1 М раствором фторида тетрабутиламмония в тетрагидрофуране, содержащим 10% н-пропиламина и 0,6% 2-меркаптоэтилового эфира, при комнатной температуре в течение 1 час для удаления защитной группы для 2'-гидроксильной группы.After the reaction mixture was concentrated under reduced pressure, the residue was reacted with a 1 M solution of tetrabutylammonium fluoride in tetrahydrofuran containing 10% n-propylamine and 0.6% 2-mercaptoethyl ether at room temperature for 1 hour to remove the protective group for 2'- hydroxyl group.

После обессоливания реакционного раствора реакционный раствор очищают посредством ДЭАЭ-ионообменной смолы (TOYOPEARLDEAE-650) для получения целевого соединения высокой степени чистоты (112 OD260; выход 58%).After desalting the reaction solution, the reaction solution is purified by DEAE-ion exchange resin (TOYOPEARLDEAE-650) to obtain the target compound of high purity (112 OD 260 ; yield 58%).

Здесь поглощение ультрафиолетового излучения с длиной волны 260 нм (OD260) показывает выход целевого соединения.Here, the absorption of ultraviolet radiation with a wavelength of 260 nm (OD 260 ) shows the yield of the target compound.

В дальнейшем в этом документе поглощение (OD260) означает выход целевого соединения.Hereinafter, absorption (OD 260 ) means the yield of the target compound.

Масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбционной ионизацией, времяпролетная (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass-Spectroscopy (MALDI-TOF-MS)):Mass spectrometry with matrix laser desorption ionization, time of flight (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass-Spectroscopy (MALDI-TOF-MS)):

Вычисленное значение 6305,9 [М+Н]+ The calculated value of 6305.9 [M + H] +

Найденное значение 6304,8 [М+Н]+ Found Value 6304.8 [M + H] +

Пример 18Example 18

Аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-уридинAdenylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - cytidilyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - uridilyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - uridine

Целевое соединение синтезируют аналогично тому, как это делают в примере 17 (92 OD260; выход 31%).The target compound is synthesized in the same manner as in Example 17 (92 OD 260 ; yield 31%).

MALDI-TOF-MS:MALDI-TOF-MS:

Вычисленное значение 9519,8 [М+Н]+ The calculated value is 9519.8 [M + H] +

Найденное значение 9520,4 [М+Н]+ Found Value 9520.4 [M + H] +

Пример 19Example 19

Уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридинUridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - ridilil- [3 '→ 5'] - uridilil- [3 '→ 5'] - uridine

Целевое соединение синтезируют аналогично тому, как это делают в примере 17 (254 OD260; выход 65%).The target compound is synthesized in the same way as in Example 17 (254 OD 260 ; yield 65%).

MALDI-TOF-MS:MALDI-TOF-MS:

Вычисленное значение 12185,8 [М+Н]+ The calculated value is 12185.8 [M + H] +

Найденное значение 12183,3 [М+Н]+ Found Value 12183.3 [M + H] +

Пример 20Example 20

Аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-тимидинAdenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - uridilyl- [3 '→ 5'] - cytidilyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - cytidilyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cyrididyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidilyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidi lyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - thymidine

Целевое соединение синтезируют аналогично тому, как это делают в примере 17 (75 OD260; выход 19%).The target compound is synthesized in the same manner as in Example 17 (75 OD 260 ; 19% yield).

MALDI-TOF-MS:MALDI-TOF-MS:

Вычисленное значение 12731,8 [М+Н]+ The calculated value is 12731.8 [M + H] +

Найденное значение 12731,7 [М+Н]+ Found Value 12731.7 [M + H] +

Пример 21Example 21

Уридилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-гуанилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-цитидилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-уридилил-[3'→5']-аденилил-[3'→5']-тимидинUridylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ ™ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] adenylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] -uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] -guanylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidilyl- [3 '→ 5'] -guanylyl- [3 '→ 5'] - uridilyl- [3 '→ 5'] - cytidilyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] adenylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] -guanylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - guanylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] adenylyl- [3 '→ 5'] - adenyl l- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - cytidylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - uridylyl- [3 '→ 5'] - adenylyl- [3 '→ 5'] - thymidine

Целевое соединение синтезируют аналогично тому, как это делают в примере 17 (83 OD260; выход 15%).The target compound is synthesized in the same manner as in Example 17 (83 OD 260 ; yield 15%).

MALDI-TOF-MS:MALDI-TOF-MS:

Вычисленное значение 17476,6 [М+Н]+ The calculated value is 17476.6 [M + H] +

Найденное значение 17474,6 [М+Н]+ Found Value 17474.6 [M + H] +

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬINDUSTRIAL APPLICABILITY

Производное фосфорамидита настоящего изобретения имеет защитную группу эфирного типа, которую вводят по 2'-гидроксильной группе. Защитная группа эфирного типа представляет собой линейную защитную группу, и пространственная структура вокруг атома фосфора, присоединенного к 3'-гидроксильной группе, не является затрудненной, и, следовательно, производное фосфорамидита настоящего изобретения делает возможным протекание реакции конденсации за более короткое время и получение лучшего выхода в реакции конденсации в процессе синтезирования олиго-РНК по сравнению с традиционным производным фосфорамидита.The phosphoramidite derivative of the present invention has an ether type protecting group which is introduced at the 2'-hydroxyl group. The ether type protecting group is a linear protecting group, and the spatial structure around the phosphorus atom attached to the 3'-hydroxyl group is not difficult, and therefore, the phosphoramidite derivative of the present invention allows the condensation reaction to proceed in a shorter time and obtain a better yield in the condensation reaction in the process of synthesizing oligo-RNA in comparison with the traditional derivative of phosphoramidite.

Применение производного фосфорамидита настоящего изобретения делает возможным получение олиго-РНК высокой степени чистоты с использованием способа, по существу идентичного способу, применяемому в производстве олиго-ДНК.The use of the phosphoramidite derivative of the present invention makes it possible to obtain high purity oligo RNAs using a method essentially identical to the method used in the production of oligo DNA.

Claims (7)

1. Производное фосфорамидита, представленное следующей общей формулой (1)
Figure 00000029
,
в которой
Вx представляет собой аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, где аминогруппа аденина, гуанина и цитозина может быть необязательно защищена защитной группой, выбранной из ацетильной группы и феноксиацетильной группы;
R1 представляет собой заместитель, представленный следующей общей формулой (2)
Figure 00000030
,
в которой
R11, R12 и R13 являются одинаковыми или различными, и каждый представляет собой водород или С1-С4алкоксигруппу;
R2a и R2b являются одинаковыми или различными, и каждый представляет собой С1-С5алкильную группу; и
каждый из WG1 и WG2 представляет собой цианогруппу.
1. The phosphoramidite derivative represented by the following general formula (1)
Figure 00000029
,
wherein
In x represents adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil, where the amino group of adenine, guanine and cytosine may optionally be protected by a protecting group selected from an acetyl group and a phenoxyacetyl group;
R 1 represents a substituent represented by the following general formula (2)
Figure 00000030
,
wherein
R 11 , R 12 and R 13 are the same or different, and each represents hydrogen or a C1-C4 alkoxy group;
R 2a and R 2b are the same or different, and each represents a C1-C5 alkyl group; and
each of WG 1 and WG 2 represents a cyano group.
2. Способ получения олигонуклеотида, представленного следующей общей формулой (3), включающий следующие стадии A-G, отличающийся использованием производного фосфорамидита по п.1 в качестве мономерного соединения нуклеиновой кислоты на следующей стадии В
Figure 00000031

в которой
каждый В независимо представляет собой аденин, гуанин, цитозин, урацил или тимин;
каждый R независимо представляет собой Н или гидроксильную группу, и, по меньшей мере, один из R представляет собой гидроксильную группу;
Z представляет собой Н или фосфатную группу; и
n представляет собой целое число в пределах от 1 до 100,
стадия А: получение соединения, представленного следующей общей формулой (5), путем удаления 5'-гидроксильной группы взаимодействием кислоты с соединением, представленным следующей общей формулой (4)
Figure 00000032

в которой
n такое, как определено выше;
каждый Вх независимо представляет собой аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, где аминогруппа аденина, гуанина и цитозина может быть необязательно защищена защитной группой, выбранной из ацетильной группы и феноксиацетильной группы; и
R1 представляет собой заместитель, представленный следующей общей формулой (2)
Figure 00000030
,
в которой
R11, R12 и R13 являются одинаковыми или различными, и каждый представляет собой водород или С1-С4алкоксигруппу;
каждый WG2 представляет собой цианогруппу;
каждый R4 независимо представляет собой Н, ацилоксигруппу, где ацильный фрагмент представляет собой C1-С6алканоильную группу или С7-С13ароильную группу, или заместитель, представленный следующей общей формулой (6)
Figure 00000033
,
в которой
WG1 представляет собой цианогруппу; и
Е представляет собой C1-6алканоильную группу или С7-С13ароильную группу или заместитель, представленный следующей общей формулой (7)
Figure 00000034
,
в которой
Q представляет собой одинарную связь или заместитель, представленный следующей общей формулой (8)
Figure 00000035
,
в которой
WG2 такой как WG2, определенный выше; и
Т представляет собой Н или ацилоксигруппу, где ацильный фрагмент представляет собой C1-С6алканоильную группу или С7-С13ароильную группу, при условии, что либо Е, либо Т является заместителем (7),
причем кислота представляет собой трифторуксусную кислоту, дихлоруксусную кислоту или трихлоруксусную кислоту,
стадия В: получение соединения, представленного следующей общей формулой (9), путем конденсации мономерного соединения нуклеиновой кислоты с соединением, полученным на стадии А, с использованием активирующего агента
Figure 00000036

в которой
Вх, Е, n, R1, R4, Т и WG2 такие, как определено выше; и
активирующий агент представляет собой 1H-тетразол, 5-этилтиотетразол, 5-бензилмеркапто-1Н-тетразол, 4,5-дихлоримидазол, 4,5-дицианоимидазол, бензотриазолтрифлат, имидазолтрифлат, пиридинийтрифлат, N,N-диизопропилэтиламин или 2,4,6-коллидин/N-метилимидазол;
стадия С: кэппирование 5'-гидроксильной группы непрореагировавшего соединения (5) на стадии В с использованием кэппирующего агента
Figure 00000037

где Вх, Е, n, R4, Т и WG2 такие, как определено выше; и
R5 представляет собой метильную или феноксиметильную группу; и кэппирующий агент представляет собой уксусный ангидрид или феноксиуксусный ангидрид,
стадия D: превращение фосфорильной группы в фосфатную группу путем взаимодействия окислителя с соединением (9), которое получают на стадии В
Figure 00000038

где Bx, E, n, R1, R4, Т и WG2 такие, как определено выше; и
окислитель представляет собой йод или трет-бутилгидропероксид;
стадия E: повторение стадий A-D для получения олигонуклеотида, имеющего требуемую длину цепи,
стадия F: отщепление соединения (11), полученного на стадии D, от твердого носителя и затем удаление защитных групп каждого нуклеинового основания и каждой 2'-гидроксильной группы с использованием отщепляющего агента, агента для удаления защитной группы 2'-гидроксильной группы и дезактивирующего агента
Figure 00000039

где В, Bx, E, n, R, R1, R4, Т, WG2 и Z такие, как определено выше,
отщепляющий агент представляет собой концентрированный водный раствор аммиака или метиламин;
агент для удаления защитной группы 2'-гидроксильной группы представляет собой фторид тетрабутиламмония или тригидрофторид/соль триэтиламина; и дезактивирующий агент представляет собой алкиламин, амидин, тиол, производные тиола или их смеси,
стадия G: удаление 5'-гидроксильной группы соединения (12), полученного на стадии F
Figure 00000040

где В, n, R, R1 и Z такие, как определено выше,
стадия H: выделение и очистка олигонуклеотида (3), полученного на стадии G.
2. A method of producing an oligonucleotide represented by the following general formula (3), comprising the following steps AG, characterized in using the phosphoramidite derivative according to claim 1 as a monomeric nucleic acid compound in the next step B
Figure 00000031

wherein
each B independently represents adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine;
each R independently represents H or a hydroxyl group, and at least one of R represents a hydroxyl group;
Z represents H or a phosphate group; and
n is an integer ranging from 1 to 100,
Step A: Preparation of a compound represented by the following general formula (5) by removal of the 5'-hydroxyl group by reaction of an acid with a compound represented by the following general formula (4)
Figure 00000032

wherein
n is as defined above;
each B x independently represents adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil, where the amino group of adenine, guanine and cytosine may optionally be protected by a protecting group selected from an acetyl group and a phenoxyacetyl group; and
R 1 represents a substituent represented by the following general formula (2)
Figure 00000030
,
wherein
R 11 , R 12 and R 13 are the same or different, and each represents hydrogen or a C1-C4 alkoxy group;
each WG 2 represents a cyano group;
each R 4 independently represents H, an acyloxy group, wherein the acyl moiety is a C1-C6 alkanoyl group or a C7-C13 aroyl group, or a substituent represented by the following general formula (6)
Figure 00000033
,
wherein
WG 1 represents a cyano group; and
E represents a C1-6 alkanoyl group or a C7-C13 aroyl group or a substituent represented by the following general formula (7)
Figure 00000034
,
wherein
Q represents a single bond or a substituent represented by the following general formula (8)
Figure 00000035
,
wherein
WG 2 such as WG 2 as defined above; and
T represents H or an acyloxy group, where the acyl moiety is a C1-C6 alkanoyl group or a C7-C13 aroyl group, provided that either E or T is a substituent (7),
moreover, the acid is trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid or trichloroacetic acid,
step B: preparing a compound represented by the following general formula (9) by condensing a monomeric nucleic acid compound with the compound obtained in step A using an activating agent
Figure 00000036

wherein
In x , E, n, R 1 , R 4 , T and WG 2 are as defined above; and
the activating agent is 1H-tetrazole, 5-ethylthiotetrazole, 5-benzyl mercapto-1H-tetrazole, 4,5-dichlorimidazole, 4,5-dicyanoimidazole, benzotriazole triflate, imidazole triflate, pyridinium triflate, N, N-diisopropylethylamine or 2,4,6 collidine / N-methylimidazole;
step C: capping the 5'-hydroxyl group of the unreacted compound (5) in step B using a capping agent
Figure 00000037

where B x , E, n, R 4 , T and WG 2 are as defined above; and
R 5 represents a methyl or phenoxymethyl group; and the capping agent is acetic anhydride or phenoxyacetic anhydride,
stage D: the conversion of a phosphoryl group to a phosphate group by reacting an oxidizing agent with a compound (9), which is obtained in stage B
Figure 00000038

where B x , E, n, R 1 , R 4 , T and WG 2 are as defined above; and
the oxidizing agent is iodine or tert-butyl hydroperoxide;
stage E: repeating stages AD to obtain an oligonucleotide having the desired chain length,
step F: cleavage of the compound (11) obtained in step D from a solid support and then removing the protective groups of each nucleic base and each 2'-hydroxyl group using a cleaving agent, an agent to remove the protective group of the 2'-hydroxyl group and a deactivating agent
Figure 00000039

where B, B x , E, n, R, R 1 , R 4 , T, WG 2 and Z are as defined above,
the cleaving agent is a concentrated aqueous solution of ammonia or methylamine;
the deprotecting agent of the 2'-hydroxyl group is tetrabutylammonium fluoride or triethylamine trihydrofluoride / salt; and the deactivating agent is an alkylamine, amidine, thiol, thiol derivatives or mixtures thereof,
stage G: removal of the 5'-hydroxyl group of the compound (12) obtained in stage F
Figure 00000040

where B, n, R, R 1 and Z are as defined above,
stage H: isolation and purification of the oligonucleotide (3) obtained in stage G.
3. Эфирное соединение, представленное следующей общей формулой (13)
Figure 00000041
,
в которой
L представляет собой галоген или С1-С5алкилтиогруппу;
WG1 представляет собой цианогруппу.
3. An ester compound represented by the following general formula (13)
Figure 00000041
,
wherein
L represents halogen or a C1-C5 alkylthio group;
WG 1 is a cyano group.
4. Способ получения производного фосфорамидита по п.1, включающий следующие стадии a-h,
стадия а: получение нуклеозида, представленного следующими общими формулами (15) и (15'), где защитную группу эфирного типа, которая может быть удалена в нейтральной среде, вводят по 2'-гидроксильной группе путем воздействия алкилирующего реагента на нуклеозид, представленный следующей общей формулой (14)
Figure 00000042
,
где Вх представляет собой аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, где аминогруппа аденина, гуанина и цитозина может быть необязательно защищена защитной группой, выбранной из ацетильной группы и феноксиацетильной группы;
R1 и WG1 такие, как определено в п.1; и
алкилирующий реагент представляет собой эфирное соединение, представленное следующей общей формулой (13)
Figure 00000043

в которой
L представляет собой галоген или С1-С5алкилтиогруппу; и WG1 представляет собой цианогруппу,
стадия b: выделение и очистка производного нуклеозида (15), полученного на стадии (а),
стадия с: осуществляемое отдельно от стадии b получение нуклеозида, представленного следующей общей формулой (17), где защитную группу эфирного типа, которая может быть удалена в нейтральной среде, вводят по 2'-гидроксильной группе путем воздействия алкилирующего реагента на нуклеозид, представленный следующей общей формулой (16)
Figure 00000044
,
в которой
Bx и WG1 такие, как определено выше; и
А представляет собой кремнесодержащий заместитель, представленный следующей общей формулой (18а) или (18b)
Figure 00000045
Figure 00000046
,
в которой
R6 представляет собой С1-С5алкильную группу; и алкилирующий реагент такой, как определено выше,
стадия d: осуществляемое отдельно от стадий а-с получение нуклеозида, представленного следующей общей формулой (19), путем воздействия диметилсульфоксида, уксусной кислоты и уксусного ангидрида на соединение рибонуклеиновой кислоты (16)
Figure 00000047
,
где А и Вх такие, как определено выше,
стадия е: получение нуклеозида, представленного следующей общей формулой (17), где защитную группу эфирного типа, которая может быть удалена в нейтральной среде, вводят по 2'-гидроксильной группе, путем воздействия спиртового соединения, представленного следующей общей формулой (20), кислоты и реагента для галогенирования атома серы на нуклеозид (19), полученный на стадии d
Figure 00000048

где А, Вх и WG1 такие, как определено выше;
кислота представляет собой трифторметансульфоновую кислоту, трифторметансульфонат серебра или триметилсилил трифторметансульфонат; и реагент для галогенирования атома серы представляет собой N-бромсукцинимид (NBS) или N-йодсукцинимид (NIS),
стадия f: получение нуклеозида, представленного следующей общей формулой (21), путем удаления защитных групп для 3'- и 5'-гидроксильных групп нуклеозида (17), полученного на стадии с или на стадии е
Figure 00000049
,
где А, Вх и WG1 такие, как определено выше,
стадия g: получение нуклеозида (15) путем введения защитной группы (R1), которая может быть удалена в кислой среде, по 5'-гидроксильной группе нуклеозида (21), полученного на стадии f
Figure 00000050
,
где Вх, R1 и WG1 такие, как определено выше; и
Х3 представляет собой галоген,
стадия h: получение производного фосфорамидита, представленного следующей общей формулой (1), фосфитилированием 3'-гидроксильной группы путем воздействия фосфитилирующего реагента и, при необходимости, активирующего агента на нуклеозид (15), полученный на стадии b или стадии g
Figure 00000051

где Bx, R1 и WG1 такие, как определено выше;
каждый из R2a и R2b представляет собой С1-С5алкильную группу;
WG2 представляет собой цианогруппу;
активирующий агент представляет собой 1H-тетразол, 5-этилтиотетразол, 5-бензилмеркапто-1Н-тетразол, 4,5-дихлоримидазол, 4,5-дицианоимидазол, бензотриазолтрифлат, имидазолтрифлат, пиридинийтрифлат, N,N-диизопропилэтиламин или 2,4,6-кoллидин/N-мeтилимидaзoл;
фосфитилирующий реагент представляет собой соединение, представленное следующей общей формулой (22) или (23)
Figure 00000052
Figure 00000053
,
в которых
каждый из R2a и R2b представляет собой С1-С5алкильную группу;
WG2 представляет собой цианогруппу; и
X1 представляет собой галоген.
4. The method of obtaining the phosphoramidite derivative according to claim 1, comprising the following steps ah,
stage a: obtaining a nucleoside represented by the following general formulas (15) and (15 '), where an ether-type protecting group that can be removed in a neutral medium is introduced at the 2'-hydroxyl group by the action of an alkylating reagent on a nucleoside represented by the following general formula (14)
Figure 00000042
,
where B x represents adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil, where the amino group of adenine, guanine and cytosine may optionally be protected by a protecting group selected from an acetyl group and a phenoxyacetyl group;
R 1 and WG 1 are as defined in claim 1; and
the alkylating reagent is an ether compound represented by the following general formula (13)
Figure 00000043

wherein
L represents halogen or a C1-C5 alkylthio group; and WG 1 represents a cyano group,
step b: isolation and purification of the nucleoside derivative (15) obtained in step (a),
step c: separately from step b, the preparation of a nucleoside represented by the following general formula (17), wherein an ether type protecting group that can be removed in a neutral medium is introduced at the 2'-hydroxyl group by the action of an alkylating reagent on a nucleoside represented by the following general formula (16)
Figure 00000044
,
wherein
B x and WG 1 are as defined above; and
A is a silicon-containing substituent represented by the following general formula (18a) or (18b)
Figure 00000045
Figure 00000046
,
wherein
R 6 represents a C1-C5 alkyl group; and an alkylating reagent as defined above,
stage d: carried out separately from stages a-c, the production of a nucleoside represented by the following general formula (19) by the action of dimethyl sulfoxide, acetic acid and acetic anhydride on a ribonucleic acid compound (16)
Figure 00000047
,
where A and B x are as defined above,
stage e: obtaining a nucleoside represented by the following general formula (17), where an ether type protecting group that can be removed in a neutral medium is introduced at the 2'-hydroxyl group by exposure to an alcohol compound represented by the following general formula (20), an acid and a reagent for halogenating a sulfur atom to a nucleoside (19) obtained in step d
Figure 00000048

where A, B x and WG 1 are as defined above;
the acid is trifluoromethanesulfonic acid, silver trifluoromethanesulfonate or trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate; and the sulfur atom halogenation reagent is N-bromosuccinimide (NBS) or N-iodosuccinimide (NIS),
stage f: obtaining a nucleoside represented by the following general formula (21) by removing the protective groups for the 3'- and 5'-hydroxyl groups of the nucleoside (17) obtained in stage c or stage e
Figure 00000049
,
where A, B x and WG 1 are as defined above,
stage g: obtaining a nucleoside (15) by introducing a protective group (R 1 ), which can be removed in an acidic environment, on the 5'-hydroxyl group of the nucleoside (21) obtained in stage f
Figure 00000050
,
where In x , R 1 and WG 1 are as defined above; and
X 3 is halogen,
step h: preparation of a phosphoramidite derivative represented by the following general formula (1) by phosphitylation of a 3'-hydroxyl group by exposure to a phosphitylation reagent and, if necessary, an activating agent on a nucleoside (15) obtained in step b or step g
Figure 00000051

where B x , R 1 and WG 1 are as defined above;
each of R 2a and R 2b represents a C1-C5 alkyl group;
WG 2 represents a cyano group;
the activating agent is 1H-tetrazole, 5-ethylthiotetrazole, 5-benzyl mercapto-1H-tetrazole, 4,5-dichlorimidazole, 4,5-dicyanoimidazole, benzotriazole triflate, imidazole triflate, pyridinium triflate, N, N-diisopropylethylamine or 2,4,6 collidin / N-methylimidazole;
a phosphitylating reagent is a compound represented by the following general formula (22) or (23)
Figure 00000052
Figure 00000053
,
in which
each of R 2a and R 2b represents a C1-C5 alkyl group;
WG 2 represents a cyano group; and
X 1 is halogen.
5. Нуклеозид, представленный следующей общей формулой (21)
Figure 00000054
,
где Bx представляет собой аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, где аминогруппа аденина, гуанина и цитозина может быть необязательно защищена защитной группой, выбранной из ацетильной группы и феноксиацетильной группы; и
WG1 представляет собой цианогруппу.
5. A nucleoside represented by the following general formula (21)
Figure 00000054
,
where B x represents adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil, where the amino group of adenine, guanine and cytosine may optionally be protected by a protecting group selected from an acetyl group and a phenoxyacetyl group; and
WG 1 is a cyano group.
6. Нуклеозид, представленный следующей общей формулой (15)
Figure 00000055
,
где Вх представляет собой аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, где аминогруппа аденина, гуанина и цитозина может быть необязательно защищена защитной группой, выбранной из ацетильной группы и феноксиацетильной группы;
R1 представляет собой заместитель, представленный следующей общей формулой (2)
Figure 00000030
,
где R11, R12 и R13, одинаковые или различные, каждый представляет собой водород или С1-С4алкоксигруппу; и
WG1 представляет собой цианогруппу.
6. A nucleoside represented by the following general formula (15)
Figure 00000055
,
where B x represents adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil, where the amino group of adenine, guanine and cytosine may optionally be protected by a protecting group selected from an acetyl group and a phenoxyacetyl group;
R 1 represents a substituent represented by the following general formula (2)
Figure 00000030
,
where R 11 , R 12 and R 13 , the same or different, each represents hydrogen or a C1-C4 alkoxy group; and
WG 1 is a cyano group.
7. Нуклеозид, представленный следующей общей формулой (17)
Figure 00000056
,
где Вх представляет собой аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил, где аминогруппа аденина, гуанина и цитозина может быть необязательно защищена защитной группой, выбранной из ацетильной группы и феноксиацетильной группы;
А представляет собой кремнесодержащий заместитель, представленный следующей общей формулой (18а) или (18b)
Figure 00000057
Figure 00000046
,
где R6 представляет собой С1-С5алкильную группу и
WG1 представляет собой цианогруппу.
7. A nucleoside represented by the following general formula (17)
Figure 00000056
,
where B x represents adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil, where the amino group of adenine, guanine and cytosine may optionally be protected by a protecting group selected from an acetyl group and a phenoxyacetyl group;
A is a silicon-containing substituent represented by the following general formula (18a) or (18b)
Figure 00000057
Figure 00000046
,
where R 6 represents a C1-C5 alkyl group and
WG 1 is a cyano group.
RU2007110823/04A 2004-08-26 2005-08-25 Phosphoramidite derivative and method of producing rna oligo RU2415862C2 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-246185 2004-08-26
JP2004246185 2004-08-26
JP2005-110817 2005-04-07
JP2005110817 2005-04-07
JP2005-193313 2005-07-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2007110823A RU2007110823A (en) 2008-10-10
RU2415862C2 true RU2415862C2 (en) 2011-04-10

Family

ID=39927014

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2007110823/04A RU2415862C2 (en) 2004-08-26 2005-08-25 Phosphoramidite derivative and method of producing rna oligo

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2415862C2 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2550000A4 (en) * 2010-03-24 2014-03-26 Advirna Inc Reduced size self-delivering rnai compounds

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.F.Normant et al//Tetrahedron Letters. N.26, pp.2407-2408, 1973. *
Tadaaki Ohgi et al.//Org. Lett., 7(16), 3477-3480, 2005. George A. Olah et al//The journal of organic chemistry. V.46, N.3, 1981. P.571-577. *
US 3,229,001 (BAYERAG), 11.01.1966. А.В.Черемис, В.А.Вахитов/Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Академия наук Республики Башкортостан. Уфа, 2002. - 80 с. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2007110823A (en) 2008-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1795536B1 (en) Phosphoramidite compound and method for producing oligo-rna
EP1995253B1 (en) Method for detaching protecting group on nucleic acid
EP1995252A1 (en) Method for removal of nucleic acid-protecting group
EP2017282A1 (en) Method of capping oligonucleic acid
RU2415862C2 (en) Phosphoramidite derivative and method of producing rna oligo
EP2053054B1 (en) Method for introducing nucleic-acid-protecting group
CN102827225B (en) A kind of Nucleotide and/or oligonucleotide and preparation method thereof
WO2011090052A1 (en) Phosphorylation reagent

Legal Events

Date Code Title Description
FA92 Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted)

Effective date: 20100824

FZ9A Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal)

Effective date: 20100909

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20160826