JPWO2007086342A1 - ｃ−ｍｙｃ遺伝子転写抑制因子ＦＩＲのスプライシングバリアント又はイントロン２内の４塩基繰り返し配列による癌検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】癌、特に大腸癌に代表される消化器癌等のより有効で確実な検出・診断・治療を提供すること、及び、このような癌の遺伝子診断システムと遺伝子治療臨床研究システムの開発に利用される各種の生体分子を提供すること等を目的とする。【解決手段】c-myc遺伝子転写抑制因子FIRのスプライシングバリアント若しくはそれをコードするｃＤＮＡ又はそれに対応するｍＲＮＡ、ＦＩＲ遺伝子のイントロン２内の４塩基繰り返し配列を含むＤＮＡ、それらの存在を検出する癌検出方法、それに使用する測定キット。

Description

本発明は、c-myc遺伝子転写抑制因子FIRのスプライシングバリアント若しくはそれをコードするｃＤＮＡ又はそれに対応するｍＲＮＡ、ＦＩＲ遺伝子のイントロン２内の４塩基繰り返し配列を含むＤＮＡ、それらの存在を検出する癌検出方法、それに使用する測定キット等に関する。

c-Myc蛋白は細胞の生命活動に極めて重要であり、細胞の増殖、分化、細胞死（アポトーシス）を制御する転写因子であり、それ自身、細胞周期や分化に伴い、多くの転写因子によって厳密に制御されている。一方細胞内、外からの刺激に素早く対応し恒常性を維持するために、c-myc遺伝子には蛋白合成を介しない、転写により発生する２重鎖ＤＮＡの物理的・力学的変化を感知する未知のメカニズムが存在し、それによって転写レベルが一定に維持されていると考えられる。これまでに、c-myc遺伝子の上流のどの部位がc-myc遺伝子の転写に影響を与えるか調べられ、c-myc遺伝子の転写開始部位の1.5kb上流のわずか百数十baseの部位がc-myc遺伝子の転写に極めて重要であることが示されFUSE (Far Upstream Element)と名付けられた（1）。即ち転写の活性化によって発生する２重鎖ＤＮＡの物理的ひずみがプロモーターの上流にnegative supercoilingを生じさせ、これにより２重鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡにほどける部位があり、同部位がc-myc遺伝子の転写制御に極めて重要であることが報告された（1-7）。このFUSEに結合する蛋白質をoligonucleotide affinity chromatographyによって同定したところ、70kDaの分子量を有するFBP（FUSE結合蛋白；FUSE Binding Protein）であった。このFBP蛋白は強力な転写活性を有しており(2-4)、FIRはこのFBPに結合する蛋白質としてYeast Two-Hybrid System により同定された(5)。FIR（FBP Interacting Repressor）はTFIIHのhelicase活性を抑制することによりc-myc遺伝子の転写を抑制すると考えられている（6）。

このようなc-Myc蛋白は細胞内で増加しても減少してもアポトーシスを誘導するが、その詳細なメカニズムや癌化との関わりついては不明の点が多い。これまでに、本発明者自身の発明に関する国際特許出願PCT/JP2003/5046（特許文献１）及び PCT/JP2003/10676（特許文献２）において、抗ＦＩＲ抗体を用いたウエスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲにより癌組織でのＦＩＲの発現が増加していることが記載されている。

更に、PCT/JP2003/10676（特許文献２）には、大腸癌３例からのＦＩＲ配列決定によりＦＩＲアミノ酸配列の第１〜１３５番目における複数の塩基又はアミノ酸の置換が検出されたこと、FIRをHeLa細胞に発現誘導するとアポトーシスが誘導される一方、FIRの転写活性部位であるN末端７７個のアミノ酸を削除した変異FIR蛋白ではアポトーシスが誘導されず、c-Myc発現プラスミドを共発現させるとFIRによるアポトーシス誘導は阻害されたこと、更には、結腸直腸癌においてＦＩＲタンパク及びｍＲＮＡの発現が増加していること等が記載されている。
国際公開第ＷＯ２００４／０１８５１８号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００４／０１８６７９号パンフレット

本発明の目的は、癌、特に大腸癌に代表される消化器癌等のより有効で確実な検出・診断・治療を提供すること、及び、このような癌の遺伝子診断システムと遺伝子治療臨床研究システムの開発に利用される各種の生体分子を提供すること等を目的とする。

本発明者は上記課題を解決すべく、研究した結果、c-Mycの発現増大が認められる消化器（大腸）癌組織中では転写抑制部位を含むエクソン２を欠損したFIRスプライシングバリアント（FIRΔexon2）が癌特異的に発現増大していることを新たに見出し、更に、FIR遺伝子のスプライシング発現メカニズムを調べる過程で、FIRのイントロン２に４塩基の繰り返し配列（Microsatellite Instability (MIN)/Simple Sequence Repeat (SSR)）が存在することを発見した。本発明はこれらの新たな知見に基づき完成されたものである。

即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
［態様１］ｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写抑制因子であるＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアントである蛋白質。
［態様２］以下のアミノ酸配列を有する蛋白質：
（１）配列番号１に示されたアミノ酸配列から成る蛋白質、又は
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、且つ、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同等の活性を有する蛋白質。
［態様３］態様１又は２記載の蛋白質をコードするｃＤＮＡ又はそれに対応するｍＲＮＡ。
［態様４］以下の塩基配列から成るｃＤＮＡ又はそれに対応するｍＲＮＡ：
（１）配列番号２に示された塩基配列、又は
（２）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、態様１又は２記載の蛋白質をコードする塩基配列 。
［態様５］ＦＩＲ遺伝子のイントロン２における４塩基繰り返し配列における遺伝子多型を示す塩基配列を含む連続した塩基配列から成るＤＮＡ。
［態様６］配列番号３（ＦＩＲ遺伝子のエクソン２及びイントロン２を含むゲノムＤＮＡ：合計２４８７ｂｐ）における１１８番目〜１５３番目の塩基配列に見られる４塩基の９回繰り返し配列、又は、その領域における該４塩基の５回若しくは６回繰り返し配列を含む、態様５記載のＤＮＡ。
［態様７］４塩基繰り返しの塩基配列がCCCG又はCCTGである、態様６記載のＤＮＡ。
［態様８］態様１若しくは２記載の蛋白質又はその断片ペプチド、態様３又は４記載のｃＤＮＡ若しくはそれに対応するｍＲＮＡ、又はそれらの一部からなるオリゴヌクレオチド、又は、態様５〜７のいずれか一項記載の４塩基繰り返し配列を含む連続した塩基配列から成るＤＮＡの存在を測定することから成る、癌の検出方法。
［態様９］ＦＩＲ又はそのスプライシングバリアントに特異的な抗体との抗原抗体反応を利用する、態様８記載の検出方法。
［態様１０］ウェスタンブロット法により測定することを特徴とする、態様９記載の検出方法。
［態様１１］態様３又は４記載のｃＤＮＡ若しくはそれに対応するｍＲＮＡ、又はそれらの一部からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸分子を増幅する為のプライマーセットを使用するＰＣＲを利用する、態様８記載の検出方法。
［態様１２］ＲＴ−ＰＣＲである態様１１記載の検出方法。
［態様１３］リアルタイム定量的ＰＣＲである態様１１記載の検出方法。
［態様１４］態様５〜７のいずれか一項記載のＤＮＡを含む核酸分子を増幅する為のプライマーセットを使用するＰＣＲを利用する、態様８記載の検出方法。
［態様１５］癌が消化器癌である、態様８〜１４のいずれか一項記載の検出方法。
［態様１６］癌が大腸癌である、態様８〜１４のいずれか一項記載の検出方法。
［態様１７］態様８〜１４のいずれか一項に記載の検出方法に使用する測定キット。
［態様１８］抗体ＦＩＲ又はそのスプライシングバリアントに特異的な抗体、又は、態様３〜７のいずれか一項記載の核酸分子を増幅する為のプライマーセットを要素として含む、態様１７記載の測定キット。

本発明のｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写抑制因子であるＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアント蛋白質は癌組織にのみに特異的に発現しており、外蛋白質及びそれをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）レベルで有意に検出することが出来る。更に、ＦＩＲ遺伝子のイントロン２における４塩基繰り返し配列における遺伝子多型に基づき、癌の検出・診断を行うことが出来る。

消化器（大腸）癌組織中ではc-myc遺伝子転写抑制部位であるエクソン２の欠損したFIRスプライシングバリアント（FIRΔexon2）が特異的に高発現していたことを示すＲＴ−ＰＣＲの結果（２．５％アガロースゲル電気泳動の写真）。 リアルタイム定量的ＰＣＲで測定した消化器癌患者におけるFIRΔexon2の発現の様子を示す。 FIRΔexon2はFIRと異なり内因性c-Mycの発現を増大させることを示す各種実験のデータである。Ａ：ＲＴ−ＰＣＲ、Ｂ：免疫組織化学染色、Ｃ及びＤ：フローサイトメトリー。 FIRΔexon2はアポトーシスを誘導することが出来ないことを示す各種実験のデータである。Ａ：免疫組織化学染色、Ｂ：フローサイトメトリー。 癌組織ではFIRΔexon2が特異的に発現することにより正常型FIRによるc-myc遺伝子転写抑制を競合阻害し、アポトーシス誘導阻害とc-Myc発現増大を同時に惹起することが、発癌の原因になっていることを示すイメージ図である。 FIRイントロン２(2400bp)にはCCCG(/CCTG)の９回繰り返し配列が存在する。FIRイントロン２の最初の部分（12-206）とイントロン１(4880bp)の最後部分(4682-4880)には、CCCG(/CCTG)の９回繰り返し配列を含み121bp/195bp=62.1%の高い相同性が認められた。 健常者と癌患者との間で有意の差が認められたFIRイントロン２のCCCG(/CCTG)の繰り返し配列の回数を示す。 図７に示した健常者及び癌患者におけるFIRイントロン２のCCCG(/CCTG)の繰り返し配列の詳細な構造を示す。

［態様１及び２］
ｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写抑制因子であるＦＩＲ（FBP Interacting Repressor）のスプライシングバリアントであって、エクソン２が欠失した蛋白質それ自体に関する。このような蛋白質の具体例として、配列番号１に示された５１３個のアミノ酸配列から成る蛋白質を挙げることが出来る。

［配列番号１：アミノ酸一文字表記］

ＭＡＴＡＴＩＡＬＧＴＤＳＩＫＭＥＮＧＱＳＴＡＡＫＬＧＬＰＰＬＴＰＥＱＱＥＡＬＱＫＡＫＫＹＡＭＥＱＳＩＫＳＶＬＶＫＱＴＩＡＨＱＱＱＱＬＴＮＬＱＭＡＡＱＲＱＲＡＬＡＩＭＣＲＶＹＶＧＳＩＹＹＥＬＧＥＤＴＩＲＱＡＦＡＰＦＧＰＩＫＳＩＤＭＳＷＤＳＶＴＭＫＨＫＧＦＡＦＶＥＹＥＶＰＥＡＡＱＬＡＬＥＱＭＮＳＶＭＬＧＧＲＮＩＫＶＧＲＰＳＮＩＧＱＡＱＰＩＩＤＱＬＡＥＥＡＲＡＦＮＲＩＹＶＡＳＶＨＱＤＬＳＤＤＤＩＫＳＶＦＥＡＦＧＫＩＫＳＣＴＬＡＲＤＰＴＴＧＫＨＫＧＹＧＦＩＥＹＥＫＡＱＳＳＱＤＡＶＳＳＭＮＬＦＤＬＧＧＱＹＬＲＶＧＫＡＶＴＰＰＭＰＬＬＴＰＡＴＰＧＧＬＰＰＡＡＡＶＡＡＡＡＡＴＡＫＩＴＡＱＥＡＶＡＧＡＡＶＬＧＴＬＧＴＰＧＬＶＳＰＡＬＴＬＡＱＰＬＧＴＬＰＱＡＶＭＡＡＱＡＰＧＶＩＴＧＶＴＰＡＲＰＰＩＰＶＴＩＰＳＶＧＶＶＮＰＩＬＡＳＰＰＴＬＧＬＬＥＰＫＫＥＫＥＥＥＥＬＦＰＥＳＥＲＰＥＭＬＳＥＱＥＨＭＳＩＳＧＳＳＡＲＨＭＶＭＱＫＬＬＲＫＱＥＳＴＶＭＶＬＲＮＭＶＤＰＫＤＩＤＤＤＬＥＧＥＶＴＥＥＣＧＫＦＧＡＶＮＲＶＩＩＹＱＥＫＱＧＥＥＥＤＡＥＩＩＶＫＩＦＶＥＦＳＩＡＳＥＴＨＫＡＩＱＡＬＮＧＲＷＦＡＧＲＫＶＶＡＥＶＹＤＱＥＲＦＤＮＳＤＬＳＡ

上記配列番号１における１〜８番目の「ＭＡＴＡＴＩＡＬ」がエクソン１であり、その後に続く２９個のアミノ酸からなるエクソン２「ＱＶＮＧＱＱＧＧＧＳＥＰＡＡＡＡＡＶＶＡＡＧＤＫＷＫＰＰＱ」が配列番号１では欠損している。尚、エクソン２中のアラニン連続配列「AAAAAVVAA」は転写抑制因子に特徴的配列である。

本発明の蛋白質には、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上、好ましくは９８％以上のアミノ酸配列からなり、且つ、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同等の活性を有する蛋白質が含まれる。

ここで、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994);Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、GCG プログラムパッケージ (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)) 、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990)) 等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができる。

本明細書において、「配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同等の活性」とは、蛋白質の生理的活性、生物学的活性及び物理化学的活性等の各種活性が実質的に同等又は同質であることを意味する。このような活性の具体例として、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、即ち、ＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアントと同一の抗原性（該スプライシングバリアントと反応する抗体と特異的に結合する）、並びに、c-myc遺伝子の発現増大、アポトーシス誘導阻害、細胞増殖及び癌化等の機能を挙げることが出来る。

［態様３及び４］
本発明のＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアントをコードするｃＤＮＡの塩基配列（コード領域）の具体例として以下の配列番号２を示す。

［配列番号２：１５４２ｂｐ］

atggcg acggcgacca tagctctc ggcac
agactccatc aagatggaga acgggcagag cacagccgcc aagctggggc tgcctcccct
gacgcccgag cagcaggagg cccttcagaa ggccaagaag tacgccatgg agcagagcat
caagagtgtg ctggtgaagc agaccatcgc gcaccagcag cagcagctca ccaacctgca
gatggcggct cagcggcagc gggcgctggc catcatgtgc cgcgtctacg tgggctctat
ctactatgag ctgggggagg acaccatccg ccaggccttt gccccctttg gccccatcaa
gagcatcgac atgtcctggg actccgtcac catgaagcac aagggctttg ccttcgtgga
gtatgaggtc cccgaagctg cacagctggc cttggagcag atgaactcgg tgatgctggg
gggcaggaac atcaaggtgg gcagacccag caacataggg caggcccagc ccatcataga
ccagttggct gaggaggcac gggccttcaa ccgcatctac gtggcctctg tgcaccagga
cctctcagac gatgacatca agagcgtgtt tgaggccttt ggcaagatca agtcctgcac
actggcccgg gaccccacaa ctggcaagca caagggctac ggcttcattg agtacgagaa
ggcccagtcg tcccaagatg ctgtgtcttc catgaacctc tttgacctgg gtggccagta
cttgcgggtg ggcaaggctg tcacaccgcc catgccccta ctcacaccag ccacgcctgg
aggcctccca cctgccgctg ctgtggcagc tgctgcagcc actgccaaga tcacagctca
ggaagcagtg gccggagcag cggtgctggg taccctgggc acacctggac tggtgtcccc
agcactgacc ctggcccagc ccctgggcac tttgccccag gctgtcatgg ctgcccaggc
acctggagtc atcacaggtg tgaccccagc ccgtcctcct atcccggtca ccatcccctc
ggtgggagtg gtgaacccca tcctggccag ccctccaacg ctgggtctcc tggagcccaa
gaaggagaag gaagaagagg agctgtttcc cgagtcagag cggccagaga tgctgagcga
gcaggagcac atgagcatct cgggcagtag cgcccgacac atggtgatgc agaagctgct
ccgcaagcag gagtctacag tgatggttct gcgcaacatg gtggacccca aggacatcga
tgatgacctg gaaggggagg tgacagagga gtgtggcaag ttcggggccg tgaaccgcgt
catcatctac caagagaaac aaggcgagga ggaggatgca gaaatcattg tcaagatctt
tgtggagttt tccatagcct ctgagactca taaggccatc caggccctca atggccgctg
gtttgctggc cgcaaggtgg tggctgaagt gtacgaccag gagcgttttg ataacagtga
cctctctgcg tga

尚、エクソン２をコードする塩基配列（配列番号４：８７ｂｐ）の一例は以下のとおりである：

CAGGTCAATGGCCAGCAAGGAGGGGGGTCCGAGCCGGCGGCGGCGGCGGCAGTGGTGGCAGCGGGAGACAAATGGAAACCTCCACAG。

本発明の蛋白質（又は、ポリペプチド）をコードするＤＮＡは当業者であれば、本明細書の記載及び当該技術分野における公知技術に基き容易に調製することが可能である。例えば、癌組織から調製されたｍＲＮＡを鋳型として使用するＲＴ−ＰＣＲ、及び、適当なｃＤＮＡライブラリーに対してその他のNASBA（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法、SDA（Strand Displacement Amplification）法及びICAN(isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids) 法等の当業者に公知の任意のＤＮＡ増幅技術を用いることにより、ｃＤＮＡとして容易に得ることが可能である。尚、エクソン２部分を含むヒトのＦＩＲ遺伝子は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録番号NM_014281として登録されている。従って、ＲＴ−ＰＣＲ等に使用するプライマーの塩基配列は、この登録された塩基配列、及び特許文献１又は特許文献２に開示された情報に基き適宜設計・選択することが出来る。

当業者に公知の部位特異的突然変異誘発に基づき、市販のミューテーションシステム等を用いて該ＤＮＡに塩基変異を導入して調製することも可能である。更には、ＰＣＲ又は適当な制限酵素で処理することによって得られる、このようなＤＮＡの一部から成るオリゴヌクレオチドも上記のＤＮＡに含まれる。

又、上記ＤＮＡは、公知の方法（例えば、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418;Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することもできる。また、本発明のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断する等の方法によって作製することもできる。

本明細書において、「ストリンジェント（stringent）な条件」とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。

従って、「ストリンジェントな条件」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度150〜900mM、好ましくは600〜900mM、pH 6〜8であるような条件を挙げることが出来る。ストリンジェントな条件の一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。

ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。

更に、こうして取得された本発明蛋白質をコードするＤＮＡを、プラスミドベクター、ファージベクター、及び各種の混成ベクター等の適当な組換え用ＤＮＡに挿入し、こうして得られた発現ベクターを用いて各種の細胞を形質転換させ、該形質転換体を適当な培養条件で培養することにより、本発明の蛋白質を産生させることが出来る。この組換え用ＤＮＡは、当業者に公知の通常の組換えＤＮＡ手法によって取り扱うことが可能な任意のベクターである。

本発明において蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターによって形質転換される宿主細胞に特に制限はないが、ＨｅＬａ等のヒト由来細胞、ＣＯＳ７、及びＣＨＯ細胞等の哺乳類細胞、昆虫細胞、並びに酵母等の真核細胞、更に、大腸菌及び枯草菌等の各種の細菌を含む各種の原核細胞を用いることができる。

或いは、ウサギ網状赤血球溶解物又は小麦胚芽抽出物などの当業者に公知の適当なインビトロ翻訳系を用いて本発明の蛋白質を産生させることも出来る。

尚、本発明の蛋白質は、精製操作及び検出等の便宜の為に、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、及びｍｙｃタグ等の当業者に公知の任意のタグとの融合蛋白質として産生させることも可能である。更には、蛋白質の測定・検出の便宜の為に、ＧＳＴなどの酵素、及び各種の蛍光蛋白質との融合蛋白質として産生することも可能である。

上記の発現ベクターには、使用する発現系、宿主細胞等に応じて、当業者に公知の、構成的発現プロモーター又は各種の誘導型発現プロモーター等の各種プロモーター、エンハンサー及びサイレンサー等の各種調節配列、リボソーム結合部位、シグナル配列、複製オリジン、クローニング部位、翻訳開始配列、ターミネーター部位、及びポリＡ付加部位等の各種要素ならびにその他の外来性あるいは内在性タンパク質をコードする遺伝子、各種薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子等を適宜含むことができる。

即ち、当業者に周知の任意の方法に従い、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを、これらのベクターは、その導入すべき宿主細胞に依存して適当に選択することが出来る。一例として、真核細胞系では、pCGNM2 ベクタープラスミド (6)、pKA1, pCDM8, 及びpSVK3等の当業者に公知のベクターを挙げることが出来る。このようなベクターは、宿主細胞の中に導入され、本発明の蛋白質を一過性で発現させたり、或いは、宿主細胞のゲノムの中にその全体あるいはその一部がゲノム中の１箇所以上に組込まれることができる。このようなベクターとして、当業者に公知の各種の市販のベクターを使用することが出来る。

上記発現ベクターの代わりに、ＰＣＲ増幅等により取得される本発明の蛋白質をコードする遺伝子を含む適当なＤＮＡ断片自体を用いて本発明の形質転換体を得ることも可能である。そのような場合には、かかるＤＮＡ断片に加えてさらに適当な緩衝液及びその他の助剤を任意に含む溶液等の組成物として形質転換に使用することができる。

本発明のＤＮＡを含む発現ベクター（組換え用ＤＮＡ）又はＤＮＡ断片自体、例えば、電気穿孔法（elctroporation）、Lipofectamine Plus reagents (Gibco BRL)、塩化カルシウム法、プロトプラスト‐ＰＥＧ法、Ｔｉプラスミド法、パーティクルガン法、バキュロウィルス法などの公知の任意の方法によって宿主細胞へと導入でき、形質転換体を作成することができる。更に、複数種の組換えＤＮＡを用いるコトランスフェクション法によっても可能である。

本発明の蛋白質を発現する転換体を該蛋白質の生産に好ましい条件で培養して該蛋白質を発現させ、その宿主細胞および／または培地から回収することにより製造することができる。宿主細胞の培養に用いる培地は、当業者に公知である任意の培地の中から、使用する発現ベクターの構成（プロモーターの種類等）及び宿主の種類等に応じて適当なものを適宜選択することができる。

宿主細胞により産生された本発明の蛋白質は、当業者に公知の任意の手段の適当な組み合わせ、例えば、遠心または濾過による培地と細胞の分離、および硫酸アンモニウムの様な塩による培地のタンパク質成分の沈殿、及びこれに続く疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又はその他のクロマトグラフィーの使用により培地から回収することができる。或いは、本発明の蛋白質は化学合成法により製造することも可能である。

［態様５〜７］
本発明のＦＩＲ遺伝子のイントロン２における４塩基繰り返し配列における遺伝子多型を示す塩基配列を含むＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）は、例えば、１〜２１００個（例えば、２０５８個程度）、好ましくは１〜１１００個（例えば、１０３２個程度）、より好ましくは１〜６００個、更に好ましくは４０〜６００個（例えば、５１３個程度）の連続した塩基配列から成る。このようなＤＮＡの例として、以下に示す配列番号３（ＦＩＲ遺伝子のエクソン２及びイントロン２を含むゲノムＤＮＡ）に含まれる配列をあげることが出来る。

［配列番号３：２４８６ｂｐ］

Exon2-CAGGTCAATGGCCAGCAAGGAGGGGGGTCCGAGCCGGCGGCGGCGGCGGCAGTGGTGGCAGCGGGAGACAAATGGAAACCTCCACAGgtactgaccttaagcatcctctccctcagg[cccgcccgcctgcccgcccgcccgcccgcctgcctg]tgcgtccctgggcccagagagggctggctgggggcggggcgggaggaacctcgggaacccttctctgcctctgggcagacaactgcccgcaggaccacggccctctccccgcaccagccctgcaccctccccacccaggcactgagctggcctttgccctctgcatctgccctgctccaagcaccaggcggggcctgttgacagtctggctgggcggggacgccggggcctggagctcgcgcgttcttaggcatgagcgtcttgcaggaagggtgggccaagcttcccagaactcgcagtgcttgaggagccagaaggacagatttcatttcagacctctgtgttttcatttaaataaaacagtgaagcaatgcgcaagtcaaagcacaggtctggttgggactcagccctccccatcttttttcggccccaggctccagagtgggtgcaggtgggtcttggtctgttcgatggcccagccttgggagcaggtcctctcagaggtggagctgggcctgtggctgggtagttgggttctttgtgcttctccatggtagcgcccgcctccagagcattccagtggggcctcagcaaggtggcctggcagcctcttggggctgggccctcctcttggtcccccaggcacactcagggggtgggactgggacatggtatgcagcttggatcctgggagatgtgggggctggtgctccctggcccttggctggcgcccagccggccattggttggtgggagaagggccttttgtttaccaagacaaagaggagattgaaaaatgtctgggggctgagggggttggcattgattaccatggtgacagcctgctctcaagtcccagcctctggctcttgggccctctttcccactaaggaggaatgggcttggggccagctgtgagggtggtgaggacaggcctagtgtgagccggactggggcacctggtgctgagggtggtgaggacaggcctagtgtgagccggactggggcacctggtgctgagggtggtgaagacaggcctagtgtgagccggactggggcacctggtgctgagggtgattaggacaggcctggtgtgagccggactggggcacctggtgccacccacagccagcctttgaccttcagggactggttggggctctggttgcctggggaggggtctccagggcttcctgccctttgagcctgggccagcatcccagcacttggcaggcaggagggggttcttggggcttgggccagcctgtcccttcctgcctcctgtgtccctctgtccttgctcatcacttctgtgctggggacccttctctcttctctgctgtccctcaaggctgtgtctggaagtctcggagggcccggttggtgggccagtgatctttgtgcttgctgagctggaggacaggcgcaggcatgctgtttgcccatcccacactctgatgggcctgctagccatgcctccctgctcacacagctgcgttcttccctctgcaaaaagcttagagatggattttgacaggagggacgtaaacataatcctggttggcatcagcttgggtctgcagtggctgtgactgcccaagggcctcttggtccccaggcccacctggctagggtgccagtggggtctgctcctggcttctcccagtgggccaggcaaagcccatgcaagagtgtgtggaagtgagctggagccctcttcagggcttgtgtggcccgagagaggcctgtgttctctgggaggtgtgcacagtgcctgcggggacggtggggggagcactgttgggagagaggcccttgtattagctccttgggtgggccccttgaaactccagggaagctgagcctgtgtctgtggcagggactgtgaggaagcctggaggagcctgggagcaaggagtcccagaacgtccagagagccgtggcccttttctcctgccttggaggacggctgaggctggctctcctgccgggcatgtgatagcagctctggggtcagactgacaacaaggggctggaccccttttctgcctccagctgtttatcttggtggttcccgaggaggccactgtggcctgggccccacaactgctcgggttggcccagggcctccagggcacctgcctgcctcagtctgtgttctaccccatgggtcccgggggagacagtggcctgggctggggacagcaatgtcagaagggctggcctgagtacaggccaggcaggggacagtctgtgctaggggtggccctcctggggccacgtgaaggagaacttgagcttgctgctgatggattcccctgctcccttaccag

上記の配列番号３において、大文字で示した最初の配列がエクソン２（８７ｂｐ）であり、それに続く小文字で表した配列がイントロン２の配列（２３９９ｂｐ）である。更に、括弧で囲まれた部分が４塩基繰り返し（９回）配列における遺伝子多型を示す配列である。

この４塩基繰り返し配列には、９回、６回、及び５回の繰り返しが見られ、４塩基繰り返しの塩基配列の具体例として、CCCG又はCCTGをあげることが出来る。尚、図８に示されるように、これらの４塩基繰り返し配列は、その繰り返し回数又は繰り返し単位の塩基配列の種類においてホモ又はヘテロの場合が見られる。

以下の実施例に示されるように、ＦＩＲは癌組織のみならず、正常組織においても発現している例がみられるのに対して、ＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアントである本発明の蛋白質は、癌患者の癌組織細胞においてのみ発現され、癌組織に隣接する正常組織細胞又は血液細胞では発現していない。従って、このような蛋白質及びそれをコードするｃＤＮＡ若しくは対応するｍＲＮＡ又はそれらの一部からなるオリゴヌクレオチドは、癌の検出・診断等において非常に特異的な癌の検出マーカーとしての有用性を有する物質である。

更に、癌組織において、ＦＩＲ遺伝子のイントロン２における４塩基繰り返し配列において９回の繰り返しのホモ（繰り返し単位の塩基配列の種類におけるヘテロを含む）の存在する割合が正常組織と比較して有意に高い為、このような遺伝子多型を示す塩基配列を含む上記のＤＮＡも、癌の検出・診断等において癌の検出マーカーとして有用な物質である。

［態様８〜１８］
従って、以上のＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアント蛋白質又はその断片ペプチド、それらをコードするｃＤＮＡ若しくはそれに対応するｍＲＮＡ、又はそれらの一部からなるオリゴヌクレオチド、又は、ＦＩＲ遺伝子のイントロン２における４塩基繰り返し配列における遺伝子多型を示す塩基配列を含む連続した塩基配列から成るＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）の存在を測定することによって、癌を有意に検出又は診断することが可能となる。対象となる癌の種類に特に制限はないが、特に、大腸癌等に代表される消化器癌が好適である。

癌の検出は、例えば、癌組織における上記のスプライシングバリアント蛋白質、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）又はオリゴヌクレオチドの発現量を測定し、これを同一の癌患者由来の正常組織又は正常人の組織における発現量を測定し、これらの値を比較すること等によって行うことが出来る。尚、このような発現量の測定は、測定方法・原理に応じて、定量的、半定量的、又は定性的であり得る。特に、本発明のＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアント蛋白質又はそれをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）は癌組織のみにおいて特異的に発現しているので、癌を簡便に且つ高感度（高特異性）で検出することが可能となる。

スプライシングバリアント蛋白質の発現量は当業者に公知の任意の方法で測定することが可能である。例として、例えば、適当な抗体を用いたウエスタンブロット法、免疫染色及びＥＩＡ等の各種の免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサー等ペプチドのアミノ酸配列分析法、更には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ及びＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳ法等に代表される質量分析によって検出することが出来る。

上記の方法の中でも、ＦＩＲ又はそのスプライシングバリアントに特異的な抗体との抗原抗体反応によって該白質の発現量を測定する検査方法が好適である。このような抗体には、例えば、ＦＩＲ及びＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアントの双方を抗原として認識する抗体が含まれる。その他に、例えば、ＦＩＲのエクソン２に特異的な抗体及びエクソン５に特異的な抗体等の複数種類の抗体を組み合わせて測定し、それらの結果から該白質の発現を検出することも可能である。

従って、上記抗体は、ＦＩＲ若しくはＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアント蛋白質、又はその適当な部分ポリペプチド（ペプチド断片）又はそれらの各種誘導体又は複合体等を抗原物質又は免疫原として用いて、当業者に公知の適当な方法で調製することが可能である。例えば、ポリクローナル抗体の場合には、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリ等の適当な動物に投与し、その抗血清から調製することが可能である。或いは、モノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）等に記載の公知の細胞融合を用いる方法でモノクローナル抗体として調製することも可能である。例えば、特許文献１又は特許文献２に記載の方法で調製することが可能である。

尚、このような抗体は、その元来の抗体活性を失わない限り、遺伝子工学（ＤＮＡ組換え技術）により、例えば、Fab、F(ab')₂、Fv断片等の完全な抗体由来の各種誘導体を含む、当業者に公知の様々な形態に改変された誘導体、組換え体又はフラグメントであっても良い。尚、このような抗体等には、酵素、放射性同位体蛍光色素、及び金属原子等の当業者に公知の各種の標識物質で標識されているものも含まれる。

抗ＦＩＲ抗体との抗原抗体反応として、例えば、ウェスタンブロット法により測定する場合には、ＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアント蛋白質（５１３個のアミノ酸）とＦＩＲ（５４２個のアミノ酸）とを分子量に相違によって特異的に検出することが可能となる。

更に、ＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアント蛋白質にのみ特異的に反応する抗体を使用して、例えば、ＥＩＡ等の酵素免疫測定法により測定することが可能である。

このようなＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアントをコードするｃＤＮＡ又はそれに対応するｍＲＮＡ、又はそれらの一部からなるオリゴヌクレオチド、又は、ＦＩＲ遺伝子のイントロン２における４塩基繰り返し配列における遺伝子多型を示す塩基配列を含む連続した塩基配列から成るＤＮＡを含む核酸分子は、ＲＴ−ＰＣＲ法及びリアルタイム定量的ＰＣＲ等の各種ＰＣＲ法、並びに各種のマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）法等の当業者に公知の方法で増幅することが出来る。

例えば、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ又はそれらの一部からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸分子を増幅する為のプライマーセットを使用するＲＴ−ＰＣＲ法によって上記の各ＤＮＡを含む核酸分子を増幅し、電気泳動と組み合わせて測定されるそれらの分子量から、当該核酸分子の検出・同定をすることができる。リアルタイム定量的ＰＣＲ（インターカレーター法、TaqManプローブ、サイクリングプローブ等）では、ＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアントに対応するｍＲＮＡの塩基配列（例えば、実質的にＦＩＲのエクソン１及びエクソン３をコードする連続する塩基配列から成るオリゴヌクレオチド又はその部分オリゴヌクレオチド）のみを含む核酸分子を特異的に増幅するようなプライマーを使用することによって、このような核酸分子を直接定量的に測定することが可能となる。さらには、増幅されたＤＮＡの塩基配列を直接決定する方法（シークエンス法）を用いることも可能である。

上記のＲＴ−ＰＣＲ等に使用するプライマーの塩基配列は、既に記載したようなGenBankに登録されたＦＩＲの塩基配列、及び特許文献１又は特許文献２に開示された情報に基き適宜設計・選択することが出来る。尚、プライマーの設計に際しては、鋳型との特異的な結合が可能となるような塩基数、例えば、１５−４０塩基、より具体的には、１５−２５塩基程度を有することが好ましく、更には、プライマー内でヘアピン構造をとったり、センス鎖とアンチセンス鎖とが互いにアニーリングしないような塩基配列とすることも重要である。例えば、OligoTM(National Bioscience Inc.製)のような市販のプライマー設計用のソフトウェアを使用することも可能である。

本発明の検出方法に使用される測定キットは、測定対象又は測定原理等に応じて、適当な構成をとることが出来る。該キットは、その構成要素として、例えば、抗ＦＩＲ抗体、ＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアント蛋白質に対する抗体、各種の二次抗体（標識抗体）、上記のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の増幅用プライマー及びＤＮＡチップ等で使用するハイブリダイゼーション用のプローブ（例えば、１０〜１００個程度の連続した塩基配列から成る）を含むことが出来る。更に、上記キットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い、実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。

ヒト癌組織標本・癌細胞株・健常者末梢血単核球の採取
原発性大腸癌の治療目的で千葉大学病院に入院した患者から、術前に文書による同意を得て癌部と非癌組織を採取し、マイナス８０℃に保存した 。各種ヒト癌細胞株はATCC Cell Biology Collection（http://www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBiology.cfm）から入手した。健常者ボランティアは千葉大学医学研究院および千葉大学医学部附属病院に勤務する健常者から文書による同意を得て採取した。

プラスミド
癌組織から得られたＦＩＲ（完全長ＦＩＲ）ｃＤＮＡ及びＦＩＲのエクソン２が欠失したスプライシングバリアントｃＤＮＡ（HA-FIRΔexon2）をpCGNM2ベクタープラスミド(9)に導入して、ヘマグルチニン(HA)タグがそのＮ末端に付加された、HA-FIR及びHA-FIRΔexon2を発現されるようにした。ヒトc-Myc発現ベクターは市販のpcDNA3.1-c-myc, GeneStorm Expression-Ready Clones (Invitrogen Co., AL) を使用した。

免疫組織化学的染色およびフローサイトメトリー解析
HeLa細胞をカバーグラス上で培養しLipofectamine Plus reagents (Gibco BRL)によりHA-FIRとHA-FIRΔexon2遺伝子を含む上記のベクター（150 fmol）を導入しc-Mycの発現変化を調べた。用いた一次抗体はmouse monoclonal 抗HA抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA)とrabbit polyclonal抗c-Myc抗体(Upstate Biotechnology, NY)でそれぞれ500倍、1,000倍希釈にて使用した。二次抗体rhodamine-conjugated anti-mouse IgG (Roche)、fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma)はそれぞれ1,000倍、500倍希釈して使用した。フローサイトメトリーは遺伝子導入後２２時間後のHeLa細胞をtrypsine処理し、上記の一次抗体を用いてFIRとc-Mycをそれぞれ染色した。二次抗体はFITC-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma)とR-PE-conjugated anti-mouse IgG (PharMingen)をそれぞれ200倍希釈で用いた(km)。10,000個の細胞をカウントしc-Myc-FITCをFL1チャンネルHA-PE をFL2チャンネルで検出した。PE陽性細胞をＸ軸で表示した。

アポトーシスの検出
アポトーシスはTUNEL assayにより検出した(Apoptosis Detection System, Fluorescein. Promega, WI, USA)。Two-color analysisは、FITC-ラベルしたdUTPを含む50 μl のterminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) buffer中で反応させた(MEBSTAIN Apoptosis Kit: Medical & Biological Laboratories, JAPAN)。最後に250μg of DNase-free RNase Aを含む 0.5 ml のpropidium iodide (PI) 溶液 (freshly diluted to 5 μg/ml in PBS) に細胞を混和した。10,000 個の細胞をカウントし、FITCをFL1に、PIをFL2に対応させた。アポトーシス細胞はY軸に示されるFITC-陽性細胞として示された。さらにMouse monoclonal anti-caspase 9 (Upstate biotechnology, NY)を用いたウエスタンブロット法によりcaspase 9 の断片化を調べた。

蛋白質の抽出とウエスタン法
凍結組織からの蛋白質の抽出はlysis buffer (7M urea, 2M thiourea, 2% 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio-] 1-propanesulfate (CHAPS), 0.1 M Dithiothreitol (DTT), 2% IPG buffer (Amersham Phrmacia Biothech, Backinghampshire, UK), 40 mM Tris) 中で 500mgの凍結組織をPolytron homogenizer (Kinematica, Switzerland) を用いて溶解し、100,000 x gで1時間 4^oCで高速遠沈しその上清を用いた。ウエスタンブロットに用いた一次抗体はウサギ ポリクローナル抗-FIR 抗体 (5) とヤギポリクローナル抗 β-actin 抗体 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) で、それぞれ1,000倍、500倍で使用した。２次抗体はヤギ 抗ウサギ IgG horseradish peroxidase conjugate (HRP) (Jackson, west Grove, PA) で3,000 倍希釈、ウサギ 抗ヤギIgG HRP (Cappel, West Chester, PA)は500倍希釈で使用した。抗原はECL^TM detection reagents (Amersham Pharmacia Biothech)で検出し、発現レベルは NIH Imageにより定量化した。因みに、ポリクローナル抗-FIR 抗体は２種類の合成ペプチド（C(訂正)DKWKPPQGTDSIKME(アミノ酸30-45) 及びC(追加)EVYDQERFDNSDLSA(アミノ酸528-542)）を同時に免疫して作製したものである。

Reverse transcriptase RT-PCRとReal-time quantitative PCR
Total RNA とgenomic DNA は癌部、非癌部からRNeasy^TM Mini Kit and DNeasy^TM Tissues Kit (Qiagen)を用いて抽出した。cDNA はtotal RNAから 1^st strand cDNA Synthesis Kit を用いて合成した (Roche, Mannheim, Germany)。 作製されたcDNA を用いてRT-PCR によりFIR cDNAを増幅した。使用したprimerは: forward 5’-GGCCCCATCAAGAGCATC -3’（配列番号５）、reverse 5’-GGGGCTGGGCCAGGGTCAG -3’ （配列番号６）である。コントロールとして GAPDH cDNA を用いた。
同時にReal-time quantitative PCR により増幅されたFIR cDNAを LightCycler^TM (Roche, Mannheim, Germany) により正確に定量した。 プライマーの至適条件の評価はGene research laboratories Inc (Sendai, Japan)に依頼した。 FIR cDNA 増幅の為のプライマーは (PCR product size is 275 base pairs): forward 5’-GCACCTGGAGTCATCACA-3’（配列番号７）, reverse 5’-CGCAGAACCATCACTGTAG-3’ （配列番号８）を用いた。ヒトc-myc cDNA および ヒト β-actin cDNA のプライマーはそれぞれ: forward 5’-GCCTCAGAGTGCATCGAC-3’（配列番号９）, reverse 5’-TCCACAGAAACAACATCG-3’ （配列番号１０） (c-myc), forward 5’-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3’ （配列番号１１）, reverse 5’-AATGGTGATGACCTGGCCGT-3’（配列番号１２）(β-actin)を用いた。

FIRイントロン２の繰り返し配列の検出
FIRイントロン２の繰り返し配列検出には以下のプライマーセットを用いた。
1F: 5’-ATCTCCTTCCTGCCTGCAGCAGGT-3’（配列番号１３）
R04: 5’-AAGCCCATTCCTCCTTA-3’（配列番号１４）
R05: 5’-TTTGACTTGCGCATTGC-3’（配列番号１５）
最初に1F-R04のプライマーセットを用いてPCRを行い、1F-R05のプライマーセットで2nd PCRを行った。このPCR産物を常法に従い直接DNAシークエンスした。PCR条件はいずれも95 ℃;5min, [95℃;30 sec-56℃; 30 sec-72℃; 1 min]x35 cycles, 72 ℃; 2 minで行った。DNAポリメラーゼはPfu DNA polymerase (Stratagene, La Jolla, CA)を使用した。DNAシークエンスは1Fプライマーを使用した。

結果（１）：
我々は癌組織では転写抑制部位であるエクソン２の欠失した変異FIR（FIRΔexon2）が特異的に発現していることを見出した（図１及び図２）。興味あることに、この変異FIR（FIRΔexon2）は内因性c-Myc蛋白の発現を抑制せず（図３Ａ）、逆に内因性c-Myc蛋白の発現を亢進させることが示された（図３Ｂ、Ｃ）。又、FIRΔexon2はアポトーシスを誘導することが出来ないことが確認された（図４Ａ，Ｂ）。更に、FIRとFIRΔexon2を共発現させると、c-Myc蛋白の発現を抑制しないのみならず、FIRのアポトーシス誘導活性が阻害されることも判明した（図３Ｄ、図４Ｂ）。
以上の結果から癌では転写抑制部位であるエクソン２を欠失したFIRΔexon2が特異的に発現することにより、c-myc遺伝子の転写抑制が働かず、発現増大をもたらし、アポトーシス誘導阻害、細胞増殖および癌化に結びついているのではないかと考えられた（図５）。

結果（２）：
FIRのスプライシングバリアントの発現メカニズムを解析する過程で、スプライシングを起こすエクソン周囲のイントロンを調べたところ、先に述べたように4塩基の繰り返し配列(MSI/SSR)が存在し、このMSI/SSRには極めて多くの多様性（繰り返し数・塩基配列の違い）が認められた（図６）。
FIR遺伝子のイントロン２内にある繰り返し配列は健常者末梢血単核急由来のゲノムDNAと大腸癌組織由来のゲノムDNAで有意にその繰り返し回数が異なっていた（図７、図８）。即ち、健常者と較べて癌患者では９回繰り返し配列（ホモ）をもつ人の割合が有意に多かった。
この結果から、FIR遺伝子のイントロン２内に存在する繰り返し配列の回数を調べることにより癌の検出・診断を行うことが出来ると考えられる。

［引用文献］
１．Avigan, M., I., Strober, B., and Levens, D. A far upstream element stimulates c-myc expression in differentiated leukemia cells. J. Biol. Chem., 265:18538-18545, 1990.
２．Bazar, L., Meighen, D., Harris, V., Duncan, R., Levens, D., and Avigan, M. Targeted melting and binding of a DNA regulatory element by a transactivator of c-myc. J. Biol. Chem., 270: 8241-8248, 1995.
３．Duncan, R., Bazar, L., Michelotti, G., Tomonaga, T., Krutzsch, H., Avigan, M., and Levens, D. A sequence-specific, single-strand binding protein activates the far upstream element of c-myc and defines a new DNA-binding motif. Genes Dev., 8: 465-480, 1994.
４．Michelotti, G. A., Michelotti, E. F., Pullner, A., Duncan, R. C., Eick, D., and Levens, D. Multiple single-stranded cis elements are associated with activated chromatin of the human c-myc gene in vivo. Mol. Cell. Biol., 16: 2656-2669, 1996.
５．Liu, J., He, L., Collins, I., Ge, H., Libutti, D., Li, J., Egly, J., and Levens, D. The FBP Interacting repressor targets TFIIH to inhibit activated transcription. Mol. Cell, 5: 331-341, 2000.
６．Liu, J., Akoulitchev, S., Weber, A., Ge, H., Chuikov, S., Libutti, D., Wang, X. W., Conaway, J. W., Harris, C. C., Conaway, R. C., Reinberg, D., and Levens, D. Defective interplay of activators and repressors with TFIIH in xeroderma pigmentosum. Cell, 104: 353-363, 2001.
７．Tomonaga, T., and Levens, D. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K is a DNA-binding transactivator. J. Biol. Chem., 270: 4875-4881, 1995.
８．Pelengaris, S., Khan, M., and Evan, G. I. Suppression of Myc-induced apoptosis in beta cells exposes multiple oncogenic properties of Myc and triggers carcinogenic progression. Cell, 109: 321-334, 2002.
９．Leveillard, T., Andera, L., Bissonnette, N., Schaeffer, L., Bracco, L., Egly, J. M., and Wasylyk, B. Functional interactions between p53 and the TFIIH complex are affected by tumor asiciated mutations. EMBO J., 15: 1615-1624, 1996.
１０．Robles, A. I., Wang, X. W., Harris, C. C. Drug-induced apoptosis is delayed and reduced in XPD lymphoblastoid cell lines: possible role of TFIIH in p53-mediated apoptotic cell death. Oncogene, 18: 4681-4688, 1999.
１１．Bazan, V., Migliavacca, M., Tubiolo, C., et al. Have p53 gene mutations and protein expression a different biological significance in colorectal cancer? J. Cell Physiol., 191: 237-246, 2002.

本発明は、癌、特に大腸癌に代表される消化器癌等のより有効で確実な検出・診断・治療を提供するに加え、癌の遺伝子診断システムと遺伝子治療臨床研究システムの開発に利用される各種の生体分子を提供する。

更に、c-myc遺伝子転写抑制因子FIRのスプライシングバリアントは、その発現を抑制・低下させるような物質のスクリーニング法に使用することが可能であり、このような物質は、アポトーシスを誘導し、癌を抑制阻害する作用があるものと考えられる。

Claims (18)

1. ｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写抑制因子であるＦＩＲ（FBP Interacting Repressor）のエクソン２が欠失したスプライシングバリアントである蛋白質。
2. 以下のアミノ酸配列を有する蛋白質：
   （１）配列番号１に示されたアミノ酸配列から成る蛋白質、又は
   （２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、且つ、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同等の活性を有する蛋白質。
3. 請求項１又は２記載の蛋白質をコードするｃＤＮＡ又はそれに対応するｍＲＮＡ。
4. 以下の塩基配列から成るｃＤＮＡ又はそれに対応するｍＲＮＡ：
   （１）配列番号２に示された塩基配列、又は
   （２）配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、請求項１又は２記載の蛋白質をコードする塩基配列 。
5. ＦＩＲ遺伝子のイントロン２における４塩基繰り返し配列における遺伝子多型を示す塩基配列を含む連続した塩基配列から成るＤＮＡ。
6. 配列番号３における１１８番目〜１５３番目の塩基配列に見られる４塩基の９回繰り返し配列、又は、その領域における該４塩基の５回若しくは６回繰り返し配列を含む、請求項５記載のＤＮＡ。
7. ４塩基繰り返しの塩基配列がCCCG又はCCTGである、請求項６記載のＤＮＡ。
8. 請求項１若しくは２記載の蛋白質又はその断片ペプチド、請求項３又は４記載のｃＤＮＡ若しくはそれに対応するｍＲＮＡ、又はそれらの一部からなるオリゴヌクレオチド、又は、請求項５〜７のいずれか一項記載の４塩基繰り返し配列を含む連続した塩基配列から成るＤＮＡの存在を測定することから成る、癌の検出方法。
9. ＦＩＲ又はそのスプライシングバリアントに特異的な抗体との抗原抗体反応を利用する、請求項８記載の検出方法。
10. ウェスタンブロット法により測定することを特徴とする、請求項９記載の検出方法。
11. 請求項３又は４記載のｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ又はそれらの一部からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸分子を増幅する為のプライマーセットを使用するＰＣＲを利用する、請求項８記載の検出方法。
12. ＲＴ−ＰＣＲである請求項１１記載の検出方法。
13. リアルタイム定量的ＰＣＲである請求項１１記載の検出方法。
14. 請求項５〜７のいずれか一項記載のＤＮＡを含む核酸分子を増幅する為のプライマーセットを使用するＰＣＲを利用する、請求項８記載の検出方法。
15. 癌が消化器癌である、請求項８〜１４のいずれか一項記載の検出方法。
16. 癌が大腸癌である、請求項８〜１４のいずれか一項記載の検出方法。
17. 請求項８〜１４のいずれか一項に記載の検出方法に使用する測定キット。
18. ＦＩＲ又はそのスプライシングバリアントに特異的な抗体、又は、請求項３〜７のいずれか一項記載の核酸分子を増幅する為のプライマーセットを要素として含む、請求項１７記載の測定キット。
    

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