JPWO2007010924A1 - 細胞ゲル化物及び高集積の、細胞又は組織アレイの作製システム - Google Patents
細胞ゲル化物及び高集積の、細胞又は組織アレイの作製システム Download PDFInfo
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Abstract
【課題】本発明は、細胞アレイの作製に使用する、検体自体の液成分などの媒体に分散させた細胞から細胞ブロックを作製する方法および高度に集積した細胞・組織アレイを作製するシステムを提供する。【解決手段】日常の細胞診等に提出される検体のうち、余剰分の細胞を媒体に分散させ、次いで分散液にムコ多糖を加えゲル化させた後、ホルマリン処理した細胞ゲル化物で細胞ブロックを作製する。この細胞ブロックおよび／または組織ブロックを利用し、多数の施設で、組織・細胞アレイ用のサンプルを採取・保存し、それらを一箇所に集め、高度に集積された組織・細胞アレイを作製するシステムを構築する。
Description
本発明は、細胞アレイを作製するための細胞ゲル化物および高度に集積した細胞・組織アレイを作製するシステムに関する。
組織アレイは、パラフィン包埋した組織から小切片を取り出し、１枚のスライドガラス上に複数配置したものである。
現在、Ｋｏｎｏｎｅｎらの開発した方法（非特許文献１）を応用した機器が市販されている。
また、Ｋｏｎｏｎｅｎらの方法の改良した方法の報告もなされている（非特許文献２、特許文献１、特許文献２）。
組織アレイは、通常、（１）パラフィン包埋した組織のドナーブロックから目的組織をシリンダー等で数ミリの円柱状に取り出す。
（２）取り出した円柱状の組織を受け取る穴を予め配置したレシピエントブロックに移す。
（３）レシピエントブロックを薄切りにしスライドガラスに載せる、といった工程により作製される（特許文献１）。
一方、組織の替わりに細胞を用いた細胞アレイは、例えば、外科処置や生検したサンプルから採取した細胞を凍結包埋材に懸濁し凍結させたものから作製する方法が知られている（特許文献１）。
現在、Ｋｏｎｏｎｅｎらの開発した方法（非特許文献１）を応用した機器が市販されている。
また、Ｋｏｎｏｎｅｎらの方法の改良した方法の報告もなされている（非特許文献２、特許文献１、特許文献２）。
組織アレイは、通常、（１）パラフィン包埋した組織のドナーブロックから目的組織をシリンダー等で数ミリの円柱状に取り出す。
（２）取り出した円柱状の組織を受け取る穴を予め配置したレシピエントブロックに移す。
（３）レシピエントブロックを薄切りにしスライドガラスに載せる、といった工程により作製される（特許文献１）。
一方、組織の替わりに細胞を用いた細胞アレイは、例えば、外科処置や生検したサンプルから採取した細胞を凍結包埋材に懸濁し凍結させたものから作製する方法が知られている（特許文献１）。
Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（７），８４４−８４７（１９９８）
医学検査，５２（６），８０６−８１１（２００３）
特表２００４−５００８９１
特開２００４−２５８０１７
パラフィン等に包埋させた組織から組織アレイを作製する技術はほぼ確立されている。
しかし、細胞診等に提出される検体の余剰分から細胞アレイを作製する技術として、例えば、特許文献１に記載の凍結包埋材に懸濁した細胞を用いて作製する方法があるものの、マイクロアレイ作製装置に冷却装置等を付加する必要がある。
また、均一な疾患群を相当数集めるには多数の施設で採取された検体を使用する必要があるが、多くの施設に特別な装置を置くことは合理的でない。
また、凍結検体は形態の保存性が低く顕微鏡下での微小な構造観察に向かない。
組織アレイや細胞アレイは、研究および治療・診断・予後の決定材料として必要不可欠なものであるが、それらの作製には特殊な機械とテクニックが必要である。
一方で、均一な疾患群を相当数集めるには多数の施設で採取された検体を使用する必要がある。
こういった背景から、実際上、数百および千を超える組織・細胞アレイの作製は困難であった。
しかし、細胞診等に提出される検体の余剰分から細胞アレイを作製する技術として、例えば、特許文献１に記載の凍結包埋材に懸濁した細胞を用いて作製する方法があるものの、マイクロアレイ作製装置に冷却装置等を付加する必要がある。
また、均一な疾患群を相当数集めるには多数の施設で採取された検体を使用する必要があるが、多くの施設に特別な装置を置くことは合理的でない。
また、凍結検体は形態の保存性が低く顕微鏡下での微小な構造観察に向かない。
組織アレイや細胞アレイは、研究および治療・診断・予後の決定材料として必要不可欠なものであるが、それらの作製には特殊な機械とテクニックが必要である。
一方で、均一な疾患群を相当数集めるには多数の施設で採取された検体を使用する必要がある。
こういった背景から、実際上、数百および千を超える組織・細胞アレイの作製は困難であった。
本発明者は、細胞アレイを作製するために、日常の細胞診等に提出される検体のうち、余剰分の細胞を媒体に分散させ、次いで分散液にムコ多糖を加えゲル化させた後、ホルマリン処理した細胞ゲル化物を使用して細胞ブロックを作成し、この細胞ブロックから細胞アレイを作製する方法を考案した。
さらに、多数の施設で採取された検体を効率よく一時保存しておく方法およびそれに用いる整理用容器、該容器に一時保存された細胞・組織標本を効率的に集め、集積度の高い細胞・組織アレイを作製するシステムを考案した。
以下、本発明を詳細に説明する。
さらに、多数の施設で採取された検体を効率よく一時保存しておく方法およびそれに用いる整理用容器、該容器に一時保存された細胞・組織標本を効率的に集め、集積度の高い細胞・組織アレイを作製するシステムを考案した。
以下、本発明を詳細に説明する。
細胞を分散させる媒体としては、例えば、検体自体の液成分、生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液などが挙げられる。
ムコ多糖としては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸およびそれらのアルカリ金属塩が挙げられる。
好ましいものとしてヒアルロン酸ナトリウムが挙げられる。
ムコ多糖の添加量は、細胞懸濁液がゲル化される量であればよく、例えば、細胞懸濁液に対して５〜２０倍量（Ｗ／Ｖ）であればよい。
ホルマリン処理は、例えば、ゲルの２〜１０倍量（Ｗ／Ｗ）の中性緩衝ホルマリンを使用し、室温で６〜１２時間行えばよい。
この間、容器を低回転で振ると更によい
ムコ多糖としては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸およびそれらのアルカリ金属塩が挙げられる。
好ましいものとしてヒアルロン酸ナトリウムが挙げられる。
ムコ多糖の添加量は、細胞懸濁液がゲル化される量であればよく、例えば、細胞懸濁液に対して５〜２０倍量（Ｗ／Ｖ）であればよい。
ホルマリン処理は、例えば、ゲルの２〜１０倍量（Ｗ／Ｗ）の中性緩衝ホルマリンを使用し、室温で６〜１２時間行えばよい。
この間、容器を低回転で振ると更によい
本発明の細胞ゲル化物および細胞ブロックは、例えば、以下の方法で作製することができる。
（１）細胞診用に採取された細胞のうち診断に使用した残余の細胞を遠心分離（２０００〜３０００ｒｐｍ ３〜５分）することで、細胞塊（ペレット）を形成させ、細胞塊と ほぼ同量の液成分を残して上澄みを捨てる。
ここで細胞塊が小さい場合は、上澄みを適量残す。
（２）ペレットと残ったほぼ同量の液成分を攪拌し、細胞を液内に均一に分布させる。
ここでゲルを見えやすくするため色素（希釈ヘマトキシリン等）を加えても良い。
（３）細胞懸濁液の一定量を採取して容器に移し、細胞懸濁液の５〜２０倍量（Ｗ／Ｖ）のムコ多糖を加え、更に攪拌する。
（４）４℃前後で１〜２時間放置。
（５）ゲル状に固まったことを確認後、静かに２〜１０倍量（Ｗ／Ｗ）の中性緩衝ホルマリンを加える。
（６）室温で一晩放置。
（７）得られた細胞ブロックを薬用スプーン等で掻き出し、通常の組織パラフィンブロック作成の過程に入れる。
また、通常の方法で手動にてパラフィン包埋を行う。
（１）細胞診用に採取された細胞のうち診断に使用した残余の細胞を遠心分離（２０００〜３０００ｒｐｍ ３〜５分）することで、細胞塊（ペレット）を形成させ、細胞塊と ほぼ同量の液成分を残して上澄みを捨てる。
ここで細胞塊が小さい場合は、上澄みを適量残す。
（２）ペレットと残ったほぼ同量の液成分を攪拌し、細胞を液内に均一に分布させる。
ここでゲルを見えやすくするため色素（希釈ヘマトキシリン等）を加えても良い。
（３）細胞懸濁液の一定量を採取して容器に移し、細胞懸濁液の５〜２０倍量（Ｗ／Ｖ）のムコ多糖を加え、更に攪拌する。
（４）４℃前後で１〜２時間放置。
（５）ゲル状に固まったことを確認後、静かに２〜１０倍量（Ｗ／Ｗ）の中性緩衝ホルマリンを加える。
（６）室温で一晩放置。
（７）得られた細胞ブロックを薬用スプーン等で掻き出し、通常の組織パラフィンブロック作成の過程に入れる。
また、通常の方法で手動にてパラフィン包埋を行う。
次に多施設から細胞アレイおよび／または組織アレイ用のサンプルを収集し、そのサンプルから高い集度の細胞アレイおよび／または組織アレイを作製する方法について説明する。
（ａ）ｎ列×ｍ列の直径１〜５ｍｍ、深さ１〜１０ｍｍの穴の開いたパラフィンブロック（縦３ｃｍ横４ｃｍ高さ１ｃｍの通常用いられる型またはこれより大きなものでもよい）を用意する。
ここで、ｎおよびｍは３〜１０の整数を意味する。
好ましいものはｎ＝５、ｍ＝５の計２５個で直径２ｍｍ、深さ５ｍｍのものである
（ｂ）試料採取用の内径１〜５ｍｍの中空針（バイオプシー針でも可）と、（ａ）のパラフィンブロック多くの病院等に配布しておく。
（ｃ）同時に（ａ）のパラフィンブロックを一時保存する容器として５列×５列または１０列×１０列で収納できる容器を渡しておく。
この容器は、パラフィンブロックがきっちりはまる大きさに仕切られ、５列×５列または１０列×１０列からなっている。
例えば、通常の型を使用したパラフィンブロックの場合、各仕切りが３．２ｃｍ×４．５ｃｍ大で箱全体の大きさは、およそ１６ｃｍ×２２．５ｃｍ×３．５ｃｍまたは３２ｃｍ×４５ｃｍ×３．５ｃｍのものである。
（ｄ）日常業務で標本が出てきたら、中空針でその部位を抜き取る。
（中空針の内容の内容物を押し出す機構を持つものを使用することが好ましい。）
（ｄ）抜き取ったコアを予め配布しておいた（ａ）のパラフィンブロックのｎ列×ｍ列の穴に埋め込む。
（ａ）ｎ列×ｍ列の直径１〜５ｍｍ、深さ１〜１０ｍｍの穴の開いたパラフィンブロック（縦３ｃｍ横４ｃｍ高さ１ｃｍの通常用いられる型またはこれより大きなものでもよい）を用意する。
ここで、ｎおよびｍは３〜１０の整数を意味する。
好ましいものはｎ＝５、ｍ＝５の計２５個で直径２ｍｍ、深さ５ｍｍのものである
（ｂ）試料採取用の内径１〜５ｍｍの中空針（バイオプシー針でも可）と、（ａ）のパラフィンブロック多くの病院等に配布しておく。
（ｃ）同時に（ａ）のパラフィンブロックを一時保存する容器として５列×５列または１０列×１０列で収納できる容器を渡しておく。
この容器は、パラフィンブロックがきっちりはまる大きさに仕切られ、５列×５列または１０列×１０列からなっている。
例えば、通常の型を使用したパラフィンブロックの場合、各仕切りが３．２ｃｍ×４．５ｃｍ大で箱全体の大きさは、およそ１６ｃｍ×２２．５ｃｍ×３．５ｃｍまたは３２ｃｍ×４５ｃｍ×３．５ｃｍのものである。
（ｄ）日常業務で標本が出てきたら、中空針でその部位を抜き取る。
（中空針の内容の内容物を押し出す機構を持つものを使用することが好ましい。）
（ｄ）抜き取ったコアを予め配布しておいた（ａ）のパラフィンブロックのｎ列×ｍ列の穴に埋め込む。
（ｅ）コアの埋め込みが予定数に達したらパラフィンブロック（第１ブロック）を回収する。
回収は、ブロック単位または一時保存容器単位で行えばよい。
（ｆ）回収したパラフィンブロックに埋め込まれた組織・細胞を、アレイヤー、例えば、Ｂｅｅｃｈｅｒ ＴＭＡｒｒａｙｅｒで１０００個程度以上の組織・細胞アレイブロック（第２ブロック）に移植する。
（ｇ）一個のコア、例えば、２ｍｍのコアから０．６ｍｍのコアを３箇所採取した場合、同時に３つ同じ条件のブロックを作製することができる。
（ｈ）一個のブロックから約３００枚の使用可能な切片を作製することができる。
３つのブロックをあわせると９００から１０００枚程度の良質な組織・細胞アレイスライドが薄切可能である。
（ｉ）薄切時には テープによるトランスファーをおこなう。
薄切時に、一枚ずつテープを張り、４〜５μｍの厚さで薄切する。
（ｊ）切片のついたテープを水に浮かべ、接着加工されたスライドグラス（通常のシランコートやＭＡＳコートでよい。）で拾い、水分および気泡を端から押し出す。
（ｋ）そのまま２週間以上乾燥させる事で組織とスライドを強固に貼り付ける。
（ｌ）使用するまでテープを剥がさない。（これにより組織が保護される）
（ｍ）染色をする際にはキシレン内でテープを剥がし、そのまま通常のパラフィン切片と同様に染色過程に入る。
回収は、ブロック単位または一時保存容器単位で行えばよい。
（ｆ）回収したパラフィンブロックに埋め込まれた組織・細胞を、アレイヤー、例えば、Ｂｅｅｃｈｅｒ ＴＭＡｒｒａｙｅｒで１０００個程度以上の組織・細胞アレイブロック（第２ブロック）に移植する。
（ｇ）一個のコア、例えば、２ｍｍのコアから０．６ｍｍのコアを３箇所採取した場合、同時に３つ同じ条件のブロックを作製することができる。
（ｈ）一個のブロックから約３００枚の使用可能な切片を作製することができる。
３つのブロックをあわせると９００から１０００枚程度の良質な組織・細胞アレイスライドが薄切可能である。
（ｉ）薄切時には テープによるトランスファーをおこなう。
薄切時に、一枚ずつテープを張り、４〜５μｍの厚さで薄切する。
（ｊ）切片のついたテープを水に浮かべ、接着加工されたスライドグラス（通常のシランコートやＭＡＳコートでよい。）で拾い、水分および気泡を端から押し出す。
（ｋ）そのまま２週間以上乾燥させる事で組織とスライドを強固に貼り付ける。
（ｌ）使用するまでテープを剥がさない。（これにより組織が保護される）
（ｍ）染色をする際にはキシレン内でテープを剥がし、そのまま通常のパラフィン切片と同様に染色過程に入る。
本発明の第一の形態によれば、日常の細胞診に提出される検体の余剰検体から十分な細胞が得られない場合でも、細胞パラフィンブロックを作成することができる。
また本発明の第二の形態によれば、多数の施設で、組織・細胞アレイ用のサンプルを採取・保存し、それらを一箇所に集め、アレイを作製するシステムを容易に構築することができる。
また本発明の第二の形態によれば、多数の施設で、組織・細胞アレイ用のサンプルを採取・保存し、それらを一箇所に集め、アレイを作製するシステムを容易に構築することができる。
以下、本発明の実施の形態について実施例，試験例を挙げて説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
細胞診用に採取された細胞から診断に使用した残余の細胞を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、細胞塊（ペレット）を得る。
細胞塊とほぼ同量の液成分を残して上澄みを捨てる。
ついで、細胞塊と残ったほぼ同量の液成分を攪拌し、細胞を液内に均一に分布させる（細胞塊が小さい場合は、上澄み２００μＬを残す）。
細胞懸濁液２００μＬを採取して１．５ｍＬチューブに移す。
ヒアルロン酸ナトリウム５ｍｇを加え、さらに攪拌した後、４℃で１時間放置する。
細胞懸濁液がゲル状に固まったことを確認後、静かに１ｍＬの中性緩衝ホルマリンを加え、室温で一晩放置する。
固定したゲル塊を薬用スプーン等で掻き出し、通常の病理組織の場合と同様の手順でパラフィンブロックに包埋する。
その後、中空針でコアを抜き取り、予め用意したパラフィンブロック（直径２ｍｍ、深さ５ｍｍの穴が５列×５列で配列した縦３０ｍｍ×横４０ｍｍ×高さ１０ｍｍのもの：ドナーブロック）に移す。
実施例１
細胞診用に採取された細胞から診断に使用した残余の細胞を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、細胞塊（ペレット）を得る。
細胞塊とほぼ同量の液成分を残して上澄みを捨てる。
ついで、細胞塊と残ったほぼ同量の液成分を攪拌し、細胞を液内に均一に分布させる（細胞塊が小さい場合は、上澄み２００μＬを残す）。
細胞懸濁液２００μＬを採取して１．５ｍＬチューブに移す。
ヒアルロン酸ナトリウム５ｍｇを加え、さらに攪拌した後、４℃で１時間放置する。
細胞懸濁液がゲル状に固まったことを確認後、静かに１ｍＬの中性緩衝ホルマリンを加え、室温で一晩放置する。
固定したゲル塊を薬用スプーン等で掻き出し、通常の病理組織の場合と同様の手順でパラフィンブロックに包埋する。
その後、中空針でコアを抜き取り、予め用意したパラフィンブロック（直径２ｍｍ、深さ５ｍｍの穴が５列×５列で配列した縦３０ｍｍ×横４０ｍｍ×高さ１０ｍｍのもの：ドナーブロック）に移す。
実施例２
以下の手順で、細胞ブロックまたは組織ブロックから簡便にアレイ用のサンプルを作製した。
１．組織を含まない通常のパラフィンブロックに、直径２ｍｍの針を用い、直径２ｍｍ、深さ５ｍｍの穴を縦５個、横５個の計２５個開ける（ドナーブロック）。（写真１）
２．直径２ｍｍの中空針または２ｍｍコアのバイオプシー針およびドナーブロックを他施設に配布しておく。
同時に、５列×５列でドナーブロックがきっちりはまる大きさの仕切り（各仕切りは、３，２ｃｍ×４．５ｃｍ）の容器（１６ｃｍ×２２．５ｃｍ×３．５ｃｍ）も配布する。
３．ドナーブロックが配布された施設では、細胞診や摘出組織等から研究目的に合致する細胞や組織標本が出た場合、細胞では実施例１の方法等で細胞ブロックを作製し、または組織ブロック自体から、必要とする部分を内径２ｍｍの中空針またはバイオプシー針で抜取り、中身をドナーブロックの穴に入れる。
４．穴が試料で埋まり、他施設から送り返されたドナーブロックから、試料をアレイ作製装置、例えば、Ｂｅｅｃｈｅｒ ＴＭＡｒｒａｙｅｒ（ビーチャーインスツルメンツ社製）で１０００個程度以上の組織・細胞アレイブロック（以下、レシピエントブロックと称する）に移植する。
以下の手順で、細胞ブロックまたは組織ブロックから簡便にアレイ用のサンプルを作製した。
１．組織を含まない通常のパラフィンブロックに、直径２ｍｍの針を用い、直径２ｍｍ、深さ５ｍｍの穴を縦５個、横５個の計２５個開ける（ドナーブロック）。（写真１）
２．直径２ｍｍの中空針または２ｍｍコアのバイオプシー針およびドナーブロックを他施設に配布しておく。
同時に、５列×５列でドナーブロックがきっちりはまる大きさの仕切り（各仕切りは、３，２ｃｍ×４．５ｃｍ）の容器（１６ｃｍ×２２．５ｃｍ×３．５ｃｍ）も配布する。
３．ドナーブロックが配布された施設では、細胞診や摘出組織等から研究目的に合致する細胞や組織標本が出た場合、細胞では実施例１の方法等で細胞ブロックを作製し、または組織ブロック自体から、必要とする部分を内径２ｍｍの中空針またはバイオプシー針で抜取り、中身をドナーブロックの穴に入れる。
４．穴が試料で埋まり、他施設から送り返されたドナーブロックから、試料をアレイ作製装置、例えば、Ｂｅｅｃｈｅｒ ＴＭＡｒｒａｙｅｒ（ビーチャーインスツルメンツ社製）で１０００個程度以上の組織・細胞アレイブロック（以下、レシピエントブロックと称する）に移植する。
以下の手順で行う。
（１）ドナーブロックの一個のコア（２ｍｍ）から０．６ｍｍのコアを３箇所採取し、０．６ｍｍのコアを９９０個配列した３個のレシピエントブロックにそれぞれ移植する。
（２）ミクロトームでレシピエントブロックからスライド用薄切を作製する。
薄切時には、一枚ずつテープを張り、４〜５μｍの厚さで薄切する。
（３）切片のついたテープを水に浮かべ、接着加工されたスライドグラス（通常のシランコートやＭＡＳコートでよい。）で拾い、水分および気泡を端から押し出す。
（４）そのまま２週間以上乾燥させる。
なお、乾燥後も組織を保護するため、染色等を行うまでテープを剥がさない。
（５）染色をする際にはキシレン内でテープを剥がし、そのまま通常のパラフィン切片と同様に染色を行う。
（１）ドナーブロックの一個のコア（２ｍｍ）から０．６ｍｍのコアを３箇所採取し、０．６ｍｍのコアを９９０個配列した３個のレシピエントブロックにそれぞれ移植する。
（２）ミクロトームでレシピエントブロックからスライド用薄切を作製する。
薄切時には、一枚ずつテープを張り、４〜５μｍの厚さで薄切する。
（３）切片のついたテープを水に浮かべ、接着加工されたスライドグラス（通常のシランコートやＭＡＳコートでよい。）で拾い、水分および気泡を端から押し出す。
（４）そのまま２週間以上乾燥させる。
なお、乾燥後も組織を保護するため、染色等を行うまでテープを剥がさない。
（５）染色をする際にはキシレン内でテープを剥がし、そのまま通常のパラフィン切片と同様に染色を行う。
各疾患（特に癌）における蛋白質プロファイルが作成可能で、これらのクラスターにより治療、診断、予後を決定する因子を解明し、新しい治療選択・疾患分類に貢献する。
治療前の病巣と治療後の病巣を比較することは組織では困難であるが細胞であれば、簡便に検体を確保できることが多い。
薬剤への耐性の判断、メカニズムの解明、または二次薬選択の判断材料として応用可能である。
治療前の病巣と治療後の病巣を比較することは組織では困難であるが細胞であれば、簡便に検体を確保できることが多い。
薬剤への耐性の判断、メカニズムの解明、または二次薬選択の判断材料として応用可能である。
【０００３】
ムコ多糖の添加量は、細胞懸濁液がゲル化される量であればよく、例えば、細胞懸濁液に対して５〜２５倍量（Ｗ／Ｖ）であればよい。
ホルマリン処理は、例えば、ゲルの２〜１０倍量（Ｗ／Ｗ）の中性緩衝ホルマリンを使用し、室温で６〜１２時間行えばよい。
この間、容器を低回転で振ると更によい
［０００７］
本発明の細胞ゲル化物および細胞ブロックは、例えば、以下の方法で作製することができる。
（１）細胞診用に採取された細胞のうち診断に使用した残余の細胞を遠心分離（２０００〜３０００ｒｐｍ ３〜５分）することで、細胞塊（ペレット）を形成させ、細胞塊と ほぼ同量の液成分を残して上澄みを捨てる。
ここで細胞塊が小さい場合は、上澄みを適量残す。
（２）ペレットと残ったほぼ同量の液成分を攪拌し、細胞を液内に均一に分布させる。
ここでゲルを見えやすくするため色素（希釈ヘマトキシリン等）を加えても良い。
（３）細胞懸濁液の一定量を採取して容器に移し、細胞懸濁液の５〜２５倍量（Ｗ／Ｖ）のムコ多糖を加え、更に攪拌する。
（４）４℃前後で１〜２時間放置。
（５）ゲル状に固まったことを確認後、静かに２〜１０倍量（Ｗ／Ｗ）の中性緩衝ホルマリンを加える。
（６）室温で一晩放置。
（７）得られた細胞ブロックを薬用スプーン等で掻き出し、通常の組織パラフィンブロック作成の過程に入れる。
また、通常の方法で手動にてパラフィン包埋を行う。
［０００８］
次に多施設から細胞アレイおよび／または組織アレイ用のサンプルを収集し、そのサンプルから高い集度の細胞アレイおよび／または組織アレイを作製する方法について説明する。
（ａ）ｎ列×ｍ列の直径１〜５ｍｍ、深さ１〜１０ｍｍの穴の開いたパラフィンブロック（縦３ｃｍ横４ｃｍ高さ１ｃｍの通常用いられる型またはこれより大きなものでもよい）を用
ムコ多糖の添加量は、細胞懸濁液がゲル化される量であればよく、例えば、細胞懸濁液に対して５〜２５倍量（Ｗ／Ｖ）であればよい。
ホルマリン処理は、例えば、ゲルの２〜１０倍量（Ｗ／Ｗ）の中性緩衝ホルマリンを使用し、室温で６〜１２時間行えばよい。
この間、容器を低回転で振ると更によい
［０００７］
本発明の細胞ゲル化物および細胞ブロックは、例えば、以下の方法で作製することができる。
（１）細胞診用に採取された細胞のうち診断に使用した残余の細胞を遠心分離（２０００〜３０００ｒｐｍ ３〜５分）することで、細胞塊（ペレット）を形成させ、細胞塊と ほぼ同量の液成分を残して上澄みを捨てる。
ここで細胞塊が小さい場合は、上澄みを適量残す。
（２）ペレットと残ったほぼ同量の液成分を攪拌し、細胞を液内に均一に分布させる。
ここでゲルを見えやすくするため色素（希釈ヘマトキシリン等）を加えても良い。
（３）細胞懸濁液の一定量を採取して容器に移し、細胞懸濁液の５〜２５倍量（Ｗ／Ｖ）のムコ多糖を加え、更に攪拌する。
（４）４℃前後で１〜２時間放置。
（５）ゲル状に固まったことを確認後、静かに２〜１０倍量（Ｗ／Ｗ）の中性緩衝ホルマリンを加える。
（６）室温で一晩放置。
（７）得られた細胞ブロックを薬用スプーン等で掻き出し、通常の組織パラフィンブロック作成の過程に入れる。
また、通常の方法で手動にてパラフィン包埋を行う。
［０００８］
次に多施設から細胞アレイおよび／または組織アレイ用のサンプルを収集し、そのサンプルから高い集度の細胞アレイおよび／または組織アレイを作製する方法について説明する。
（ａ）ｎ列×ｍ列の直径１〜５ｍｍ、深さ１〜１０ｍｍの穴の開いたパラフィンブロック（縦３ｃｍ横４ｃｍ高さ１ｃｍの通常用いられる型またはこれより大きなものでもよい）を用
Claims (6)
- 細胞の分散液に、ムコ多糖を加えゲル化させた後に、ホルマリン処理して得られたものであることを特徴とする細胞ゲル化物。
- ムコ多糖は、ヒアルロン酸であることを特徴とする請求の範囲１記載の細胞ゲル化物。
- 請求の範囲１又は２記載の細胞ゲル化物から試料を採取し、採取した試料をパラフィン包埋したものであることを特徴とする細胞ブロック。
- 予め下記第１ブロック（Ａ）および容器（Ｂ）をシステム構築する施設に配布しておき、配布された施設では第１ブロック（Ａ）を一時保存するため容器（Ｂ）を使用し、第１ブロック（Ａ）が予定数に達した後、該容器（Ｂ）を回収した後、回収した第１ブロック（Ａ）から複数の第２ブロックを作製し、次いで第２ブロックから、細胞又は組織アレイを作製することを特徴とする高集積の、細胞又は組織アレイの作製システム。
（Ａ）：請求の範囲３記載の細胞ブロックおよび／または組織標本を収容する第１ブロック。
（Ｂ）：（Ａ）を整列して収容するための容器。 - 第１ブロックは、ｎ列×ｍ列（ｎおよびｍは３〜１０の整数）の直径１〜５ｍｍ、深さ１〜１０ｍｍの穴が開いたパラフィンブロックであることを特徴とする請求の範囲４記載の高集積の、細胞又は組織アレイの作製システム。
- 容器（Ｂ）は、５列×５列または１０列×１０列で仕切られた容器であることを特徴とする請求の範囲４記載の高集積の、細胞又は組織アレイの作製システム。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
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| JP2005210737 | 2005-07-21 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2007010924A1 true JPWO2007010924A1 (ja) | 2009-01-29 |
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| WO2008123410A1 (ja) * | 2007-03-29 | 2008-10-16 | National University Corporation University Of Toyama | 検体薄片の保存具及びこれを備えた顕微鏡観察用具 |
| JP2009002768A (ja) * | 2007-06-21 | 2009-01-08 | Japan Health Science Foundation | 組織マイクロアレイ作製方法 |
| JP2011013050A (ja) * | 2009-06-30 | 2011-01-20 | Pathology Institute | 生体試料標本の作製方法 |
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| JP2004500891A (ja) * | 2000-06-22 | 2004-01-15 | クリノミクス バイオサイエンシズ，インク． | 凍結組織マイクロアレイ及びその使用法 |
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|---|---|---|---|---|
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| IT1301994B1 (it) * | 1998-08-05 | 2000-07-20 | Jasper Ltd Liability Co | Derivati dell'acido ialuronico. |
-
2006
- 2006-07-19 JP JP2007526026A patent/JPWO2007010924A1/ja active Pending
- 2006-07-19 WO PCT/JP2006/314237 patent/WO2007010924A1/ja active Application Filing
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004500891A (ja) * | 2000-06-22 | 2004-01-15 | クリノミクス バイオサイエンシズ，インク． | 凍結組織マイクロアレイ及びその使用法 |
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| JPN6012005597; Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． Ｖｏｌ．４， Ｎｏ．７, 1998, ｐ．８４４-８４７ * |
| JPN6012005600; Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．７５, 2003, ｐ．５７８３-５７８９ * |
| JPN6012005602; Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．６０, 2002, ｐ．１９６-２０５ * |
| JPN6012005607; 人工臓器 Ｖｏｌ．２９， Ｎｏ．２, 2000, ｐ．４４６-４５１ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| WO2007010924A1 (ja) | 2007-01-25 |
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