JP2017053700A - 形態観察用試料の調製方法及びそれに用いる液体処理用器具、試料台 - Google Patents

Abstract

【課題】多数の試料を同時に処理することでき、液体を交換するための手間と処理する液体の量を削減し、コストが低減することを課題とする。【解決手段】試料を入れる複数の試料籠と、前記複数の試料籠を内側に保持する籠保持用外筒とを備えた液体処理用器具を用いた液体処理工程と、樹脂保持用の外周チューブを備えた試料台に前記試料をセットし、導電性樹脂を前記外周チューブ内に充填し、乾燥固化後に外周チューブを外す包埋工程とを備えたことを特徴とする形態観察用試料の調製方法。【選択図】図１

Description

本発明は、走査型電子顕微鏡による形態観察用試料の調製方法、及びそれに用いる液体処理用器具、試料台に関する。

電子顕微鏡による超微細形態の観察は医学・生物学において重要な役割を果たしている。特に臨床医学において電子顕微鏡観察は、主に透過型電子顕微鏡を用いて、腎臓などの生検組織や手術検体の観察による診断目的で行われてきた。しかしながらこうした診断などで用いられる生物組織の透過型電子顕微鏡(Transmission Electron Microscope：TEM)観察では、得られた組織を固定・脱水・樹脂包埋し、その後ダイヤモンドナイフなどを用いてごく薄い（100nm以下の）切片を作製し、その切片を観察する必要があった。こうした方法は時間がかかることに加え、包埋後の超薄切および染色が技術的に難しく、多くの時間と人的コストが必要であった。

近年、走査型電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope：SEM)を用いて合成樹脂に包埋された試料ブロックの表面を観察することで、薄切せずに生物組織の超微細形態の観察を可能にする技術が発展してきた。その一つであるSerial block-face SEM（SBF-SEM）は、組み込み式のミクロトームによる試料ブロックの表層切削と走査型電子顕微鏡による試料ブロック断面の表層部観察とを交互に反復させることにより，TEMによる連続超薄切片観察に類似したデジタル画像を比較的広い領域から自動で取得する方法である。こうした手法の普及によって、以前の透過型電子顕微鏡による連続切片観察に比較して非常に迅速に生物組織の3次元形態情報を取得することが可能になった。

しかしながら、SBF-SEMなどのSEMを用いた3次元微細構造解析では試料のチャージングを低減し、またコントラストの高い像を得るために重金属による強い電子染色を施す必要があり、そのため試料作製に様々な試薬による処理と洗浄の工程が必要であった。このため試料調整においては多大な人的資源と長い時間が必要とされ、多くのサンプルを処理する上で大きな障害になっていた。

また自動包埋装置も市販されているが、これらは多くの量(約20ml)の試薬を必要とするため、サンプルの数が十分にないと高価な試薬の浪費につながる上、異なる温度による処理など、SBF-SEM試料の作製のための一連の処理に対応することが困難であった。

SEMを用いた生物組織の3次元形態情報の取得は急速な広がりを見せており、世界的にも、また日本でも全国的に観察のための機器を導入する施設が増えてきていることから、こうした技術は生命科学研究のみならず、臨床医学への応用が今後は拡がると考えられる。したがって十分な電子顕微鏡観察技術を持たない研究者、病理医、技官が取り扱う機会も増加することから、特殊な技術や高価な器具を必要としない、簡便な試料作製方法は今後その需要が大きく高まることが予想される。

特許文献１には生体組織の固定、脱水、脂肪除去、パラフィン含浸をビーカー中やパラフィンバス中で処理する試料の調製方法が記載されている。

特表２００１−５１６８６９

特許文献１に記載のような各種の液体を入れたビーカーに試料を浸して処理するような方法、あるいはガラスやプラスチック製の小型のチューブやバイアルに入れられた個々の試料の液体を交換することで染色や脱水などの処理を行うような方法では、多数の試料を同時に処理することは困難であり、液体を交換するための手間が増え、処理する液体の量が増え、コストが高くなるという問題がある。

また自動包埋装置のような機械的に多数のサンプルを扱う場合は大きな機械が必要である上、使用する溶液も20ml程度と多量で、また異なる温度を用いる処理への対応も困難であった。

本発明による形態観察用試料の調製方法は、試料を入れる複数の試料籠と、前記複数の試料籠を内側に保持する籠保持用外筒とを備えた液体処理用器具を用いた液体処理工程と、樹脂保持用の外周チューブを備えた試料台に前記試料をセットし、導電性樹脂を前記外周チューブ内に充填し、乾燥固化後に外周チューブを外す包埋工程とを備えたことを特徴とする。

また本発明による形態観察用試料の調製用の液体処理装置は、試料を入れる筒形の側面部と筒底にメッシュ板を備えた形状である試料籠と、液体の導入口と排出口を備え、内部に複数の前記試料籠を重ねて保持し、それぞれの前記メッシュ板を通して、順次それぞれの前記試料籠に液体を流すことができる籠保持用外筒とを備えたことを特徴とする。

また本発明による形態観察用試料の調製用の試料台は、金属リベットの上面部の表面に凹凸を設けた試料台と、前記試料台の上面部の外周にシリコーン製外周チューブを巻きつけられたことを特徴とする。

実施例の形態観察用試料の調製方法のフロー図 実施例の液体処理用器具の試料籠の説明図 実施例の液体処理用器具の説明図 実施例の試料台の説明図 実施例の液体処理用器具の液体処理性能を示す図 実施例の導電性樹脂の説明図 実施例の試料台と試料の接着性を示す図

本発明の実施の形態について図を参照して詳細に説明する。

本実施例の形態観察用試料の調製方法のフローを図１に示す。図１では、本発明による液体処理用器具を用いる工程と、本発明による試料台を用いる工程をそれぞれ破線で囲んで示している。なお本発明では複数の試料を同時に処理することを前提としている。

まず形態観察を行いたい生体試料を灌流固定法により前固定を行う。例えば対象動物を開腹処理後、アルデヒド系の固定剤を灌流して固定する。その後、形態観察を行いたい所望の部位を細片に切り出す。

切り出した試料の細片を本発明による液体処理用器具の試料籠に入れ、籠保持用外筒の内部に積み重ねる。

試料籠を図２を用いて説明する。図２（ａ）は試料籠１を斜め上から俯瞰した図であり、図２（ｂ）は斜め下から見上げた図である。図２（ｃ）は断面図である。試料籠１は図２（ｄ）に示す様に、側面部２とメッシュ板３を備えている。側面部２は円筒形の側面上の筒形状をしており、内部に試料を入れる容器を形成している。材質はガラス、プラスチック、金属など何であっても構わないが処理に用いる液体と反応しない材質でなければならない。本実施例では直径約4ｍｍのプラスチックのチューブを５ｍｍ程度の長さに切断したものを用いている。メッシュ板３は円形状の板に複数の穴を設けたもの、あるいは網目状の円形の板であってもよい。本実施例では網目状の金属製で目開き約０．３ｍｍの板を用いている。

液体処理用器具を図３を用いて説明する。図３(ａ)は本発明による液体処理用器具の俯瞰図であり、図３（ｂ）は断面図である。４は籠保持用外筒であり、内部に試料籠１を複数重ねて保持する事ができる。図では５つの試料籠を重ねた場合を示しているが、数十段の試料籠を重ねても構わない。本実施例では16段の試料籠を保持できる籠保持用外筒を用いた。籠保持用外套４は図のように容器蓋７を備えていてもよい。この場合は容器蓋７の上部に液体の導入口５を備え、籠保持用外筒４の下部に液体の排出口６を備えている。容器蓋７がない場合は籠保持用外套４の上部の大きな開口部を液体の導入口５とみなしてもよい。

液体処理用器具に試料を入れた後、種々の液体処理を行う。図１の本実施例では、まず０．０１Ｍリン酸緩衝液による洗浄を行う。次に、後固定として、２％四酸化オスミウム含有１．５％フェロシアン酸カリウム溶液に６０分浸漬する。さらに蒸留水による１５分の洗浄後、１％チオカルボヒドラジド溶液で２０分間の浸漬処理を行う。さらに１５分の蒸留水洗浄を経て、２％四酸化オスミウム溶液での３０分間の処理を行い、また１５分の蒸留水洗浄を行う。これにより、試料の物理的、化学的に安定な状態とする事ができる。

電子染色としては酢酸ウランのメタノール溶液に浸漬することでウラン染色を行うこともあるが、本実施例では省略する。次に、ＰＨ５．０の０．０３Ｍアスパラギン酸鉛溶液に６０℃で３０分浸漬することで鉛染色を行い、さらに１５分の蒸留水洗浄を行なう。

最後に希釈系列のアルコール（６０%、８０％、９０％、９５%、１００％）とアセトンを順次用い、脱水を行う。

次に、液体処理用器具から固定、染色済の試料を取り出し、本発明によるシリコーン製外周チューブを上部に巻きつけた試料台に試料を載せ、導電性樹脂をシリコーン製外周チューブの内側に注入し、試料に浸透させる。これにより、導電性樹脂が試料内部に取り込まれ重合が進行する。あるいは通常の絶縁性樹脂を浸透させ、その後導電性樹脂に包埋してもよい。

本発明による試料台を図４（ａ）を用いて説明する。本実施例による試料台８はアルミ製のリベットを用いている。円筒形の軸の上部に直径２ｍｍ又は４ｍｍの円形状の板がついており、上部の表面上に試料を載せることができる。上部の円形状の外周にシリコーン製の外周チューブ９を試料の大きさよりもやや大きい程度に切り出したものを巻きつけている。シリコーンの弾力性を利用してリベット上部の直径程度の内径のチューブ（内径：２〜３ｍｍ、外径：４〜５ｍｍ）を用いている。外周チューブを巻きつけた試料台の断面図を図４（ｂ）に、内部に試料１０と導電性樹脂１１を載せた試料台の断面図を図４（ｃ）に示す。

また試料台の上部の表面には図４（ｄ）、（ｅ）に示す様に凹凸を設けている。凹凸は表面に溝１２を形成することにより設けており、（ｄ）は縦横に直交する方向に設けた例であり、（ｅ）は放射線状に設けた例である。

最後に、導電性樹脂が十分重合、包埋できた後、外周チューブを取り外し、試料表面に金蒸着などを施し、表面を導電性にして試料の調製が終了する。

＜液体処理用器具の液体交換性＞
試料籠を１６個積層出来る液体処理用器具を作製し、液体処理の性能を確認した結果を図５に示す。図５Ａは液体処理用器具に液体を注入、排出する様子を模式的に示したものであり、図５Ｂは試料籠を示した図である。図５Ｅには１６個の試料籠を用いた１６個の試料の位置を示している。本発明の液体処理用器具を用いた場合と、従来の方法を用いた場合とで試料数が増えた場合の溶液（液体）交換時間をプロットしたグラフを図５Ｃに示す。従来の方法では試料数に比例して交換時間が増加するが、本実施例では１６個を同時に処理できるため、約２ｍｌ／１６個の液量で処理が可能であり、従来の方法に比べて約一桁以上の低減が可能であることが分る。また１６個の試料をほぼ同時に処理できるため、時間、労力がともに約１/１６に低減できる。さらにＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ希釈液を用いた流出液の濃度変化を示すグラフを図５Ｄに示すが、試薬の充填の際には流出する試薬の濃度は速やかに上昇し、また洗浄の際にも蒸留水注入に伴い、試薬の濃度は速やかに減少する。図５Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉは実際に１６個同時に作製した試料の下から１、１６、１２、１５番目の試料のＳＥＭ写真であり、液体処理用器具の異なる場所で明らかな染色や包埋の際の問題はみられなかった。

＜導電性樹脂＞
本実施例で用いた導電性樹脂は従来ＴＥＭ観察用の試料作製に用いられてきたエポキシ系樹脂にカーボンブラックを添加して作製した。具体的にはエポキシ系樹脂として、日新ＥＭ製「Quetol812」を用い、カーボンブラックとしてはKetjen Blackを用いた。添加したカーボンブラックの濃度を横軸に、表面抵抗値を縦軸にとったグラフを図６Ａに示す。グラフからは５％で数ＫΩ／□程度の表面抵抗値が得られているが、チャージアップの電荷を流すためであれば十分な抵抗値である。また濃度が高くなるに連れ樹脂の粘度が増加し包埋処理が困難になるため、実際には個々の樹脂の粘度やＳＥＭ観察のチャージアップの程度も考慮して、１〜１９％の濃度の樹脂が好ましい。図６Ｂは従来用いられてきたエポキシ系の樹脂による包埋と、エポキシ系樹脂にカーボンブラックを添加した導電性樹脂による包埋を模式的に示す図である。

＜試料台の接着性＞
図７Ａは包埋した試料を載せた試料台の模式図であり、図７Ｂはシリコーン製の外周チューブを巻いた試料台の写真、図７Ｃは試料を載せた試料台の写真である。図７Ｄのグラフは試料台と試料の接着性を示している。左は４ｍｍ径の試料台、右は２ｍｍ径の試料台である。横軸の数字は凹凸の数を示しており、０は凹凸のない平坦な形状、放射状は放射状に溝を設けて凹凸を形成した例を示している。縦軸は試料が剥離する頻度を示している。左側の図からは平坦な試料台ではすべての試料が剥離してしまうが、凹凸を増やすと剥離しにくくなり、放射状の溝を設けた場合には剥離は生じないことを表している。右側のグラフからは、同様に凹凸を増やすと剥離しにくくなり、放射状の溝を設けた場合には剥離は生じないことを表している。従って、放射状の溝を設けた試料台を用いることが好ましい。

＜処理能力、工程時間短縮効果＞
本実施例で実際に試料調製を行った結果、液体処理工程については、処理能力がほぼ１６倍になり、液体使用料も１/１６に低減した。また包埋工程については、樹脂の浸透、重合、試料のトリミングとマウントにそれぞれ、１日、３日、１日要していた処理時間が、３時間程度に短縮する事ができた。トータルでは数十のサンプルを同時に処理でき、１週間程度必要であった工程を１日程度に短縮する事ができるという効果が得られた。

＜生命科学研究における３次元的超微細形態観察のコストの減少＞
現在の数日以上にわたる３次元超微形態解析の必要期間を短縮し、また多数のサンプルを同時に調整することを可能にするため、多数の実験群から採取した組織の試料作製や、翌日の実験のための迅速な形態評価など、３次元形態観察の応用を大きく促進する技術となりうる。

＜腎組織診断の迅速化＞
腎生検は６００万人ともいわれる慢性腎疾患患者の診断と治療に重要な位置を占め、正確な診断には光学顕微鏡所見とともに電子顕微鏡所見の報告が重要である。しかし電子顕微鏡所見の報告は同じ施設に診断用の観察・診断部門を持つ場合で数日、部門を持たないところが外注すれば数週間かかることもあり、電子顕微鏡所見をふまえた正確な診断と治療方針の決定ができない場合も多かった。本発明により迅速・簡便な電子顕微鏡観察が可能になることで、光学顕微鏡所見が出る３〜４日目までに電子顕微鏡所見を報告することが可能になると考えられ、より早い診断や正確な予後予測を実現し、慢性腎疾患の治療に資することで、約２９万人の透析患者の減少に寄与すると予想される。

＜移植用の組織のサンプリング解析＞
生命科学技術の進歩により、iPS細胞や細胞シートなどの生体移植組織の体外構築とその移植が急速に進展している。半導体分野では以前より電子顕微鏡を用いた質の評価が行われてきたが、生物組織においても今後、こうした精緻な移植組織が正確に生体に適合する組織を形成しているか、形態情報を含めた多角的な質の評価が重要となってくると考えられる。しかし従来の形態学的手法では試料調整に多くの時間と労力が必要であり、迅速なサンプリングと質の評価は困難であったことから、本発明により簡便・迅速な評価が可能になることで、広く医療応用に貢献できると予想される。

＜迅速な形態学的スクリーニング法の確立＞
超微形態学的ミトコンドリアの断片化やクリステの変化、オートファゴソームの形成など、多くの情報が得られる。これまでは多くのサンプルの試料作製を行うことが技術的に困難かつ多大な労力が必要であり、多数の実験群を扱うスクリーニングは困難であったが、本発明により超微形態解析に必要な労力が減少することで、例えば多数の臓器における薬剤投与による変化の解析などが可能になり、様々な実験におけるアウトプットとして超微形態情報を用いることができるようになる。

上述のように研究分野のみならず、診断・治療に関わる医療分野の様々な局面において本発明は適用が可能である。

１ 試料籠
２ 側面部
３ メッシュ板
４ 籠保持用外筒
５ 液体の導入口
６ 液体の排出口
７ 容器蓋
８ 試料台
９ 外周チューブ
１０ 試料
１１ 導電性樹脂
１２ 溝

Claims (9)

1. 試料を入れる複数の試料籠と、前記複数の試料籠を内側に保持する籠保持用外筒とを備えた液体処理用器具を用いた液体処理工程と、
   樹脂保持用の外周チューブを備えた試料台に前記試料をセットし、導電性樹脂を前記外周チューブ内に充填し、乾燥固化後に外周チューブを外す包埋工程と、
   を備えたことを特徴とする形態観察用試料の調製方法。
2. 前記試料籠は、試料を入れる筒形の側面部と、筒底にメッシュ板を備えた形状であることを特徴とする請求項1に記載の形態観察用試料の調製方法。
3. 前記籠保持用外筒は、液体の導入口と排出口を備え、内部に複数の前記試料籠を重ねて保持し、それぞれの前記メッシュ板を通して、順次それぞれの前記試料籠に液体を流すことができる事を特徴とする請求項1又は2のいずれかに記載の形態観察用試料の調製方法。
4. 前記導電性樹脂は、エポキシ系樹脂にカーボンブラックを添加したものであることを特徴とする請求項1から３のいずれかに記載の形態観察用試料の調製方法。
5. 前記カーボンブラックの添加量は１％以上１９％以下であることを特徴とする請求項1から４のいずれかに記載の形態観察用試料の調製方法。
6. 前記外周チューブは、シリコーン製外周チューブであり、前記試料台の上面部の外周に巻きつけたことを特徴とする請求項1から５のいずれかに記載の形態観察用試料の調製方法。
7. 前記試料台は、金属リベットの上面部の表面に凹凸を設けたものであることを特徴とする請求項1から６のいずれかに記載の形態観察用試料の調製方法。
8. 試料を入れる筒形の側面部と、筒底にメッシュ板を備えた形状である試料籠と、
   液体の導入口と排出口を備え、内部に複数の前記試料籠を重ねて保持し、それぞれの前記メッシュ板を通して、順次それぞれの前記試料籠に液体を流すことができる籠保持用外筒と、
   を備えたことを特徴とする形態観察用試料作製用の液体処理用器具。
9. 金属リベットの上面部の表面に凹凸を設けた試料台と、
   前記試料台の上面部の外周にシリコーン製外周チューブを巻きつけられたことを特徴とする形態観察用試料作製用の外周チューブ付き試料台。