JPWO2005087924A1 - Dnaチップ並びに疾患関連遺伝子の抽出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 DNAチップを用いて、対象とする疾患に関連する遺伝子群を抽出する方法を提供すること、及びその方法により抽出された遺伝子群を備えたDNAチップを提供すること。【解決手段】 (A)非ヒトコントロール動物から調製したコントロールmRNAと、このコントロール動物に対象とする疾患を発生させた疾患動物から調製した疾患mRNAとに基づいて、DNAチップを利用して発現量の差違が認められる第1の遺伝子群を抽出し、(B)この疾患を治療または予防できる処置を施した制御動物から調製した制御mRNAと、コントロールmRNAとに基づいて、DNAチップを利用して発現量の差違が認められる第2の遺伝子群を抽出し、更に(C)第1の遺伝子群と第2の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示す遺伝子群を抽出することにより、対象とする疾患に関連する遺伝子群を抽出することができる。【選択図】 なし
Description
本発明は、DNAチップを用いて、対象とする疾患に関連する遺伝子群を抽出する方法およびこの方法によって抽出された遺伝子群を含むDNAチップに関し、特にパーキンソン病の発症に関連する遺伝子群を抽出する方法およびこの方法によって抽出された遺伝子群を含むDNAチップに関する。
DNAチップとは、ガラスなどの基板上に、多種類のDNA断片・合成オリゴヌクレオチドを互いに区画しつつ貼り付けたものであり、これを用いることにより、多種類の遺伝子発現の有無、特定の遺伝子の存在の有無、変異の有無等を一括して調べることが可能である。DNAチップを用いることにより、ヒト「健常者」から調製したmDNAと、対象とする疾患を有する者から調製したmRNAとの発現状態を比較することにより、その疾患に関与すると思われる遺伝子群を検出する技術が知られている。しかしながら、いわゆる「健常者」が、実際に健常者であるのか否かについては疑問の余地がある。すなわち、「健常者」の中には、実際に健常者である者の他に、その疾患になりうる形質を有しているものの、未だに健常である者が含まれている。このため、遺伝的に単一とは言い難いヒトの遺伝子発現状態を把握することは、個々人の個体差を広く認めつつ研究を進めなければならないため、データの解析に際して非常な困難を生じ、確定的な結果を得ることが難しい。このようにDNAチップを用いた研究開発は、飛躍的なスピードで進んでいるものの、未だに疾患関連遺伝子を特定する方法論については、確定的なものは開発されていない。
パーキンソン病とは、脳黒質内でのドパミン産生細胞の異常な低下とニューロンの変性を特徴とする脳疾患である。脳の黒質でつくられたドパミンは、線条体に送られ、アセチルコリンと協働して筋肉に運動の指令を送る。パーキンソン病になると、ドパミンをつくる黒質の神経細胞が何らかの原因で障害され、線条体にドパミンを充分に送ることができなくなり、線条体が正常に機能しなくなって、無動、筋硬直、振戦等の運動機能障害が生じる。パーキンソン病の原因は十分に解明されてはいないものの、脱ユビキチン化活性を有するプロテアーゼ、タウ(tau)、シヌクレイン(α―synuclein)等が関与しているとする報告が見られる(特開2003−189883号公報)。
また、農薬のロテノン(Rotenone)は、実験動物にパーキンソン病を発症させることが知られている。本発明者は、この実験動物を用いて、エゾウコギ(学名:Acanthopanaxsenticosus harms)の抽出物が、実験的パーキンソン病の予防及び治療に効果を有することを見出した(特開2002−284695号公報)。
また、農薬のロテノン(Rotenone)は、実験動物にパーキンソン病を発症させることが知られている。本発明者は、この実験動物を用いて、エゾウコギ(学名:Acanthopanaxsenticosus harms)の抽出物が、実験的パーキンソン病の予防及び治療に効果を有することを見出した(特開2002−284695号公報)。
パーキンソン病に関与する遺伝子の一部は知られているものの、全ての遺伝子群を把握する技術は開発されていなかった。本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、DNAチップを用いて、疾患に関連する遺伝子群を抽出する方法を提供すること(特に、その疾患がパーキンソン病である場合に適用することができる方法を提供すること)、及びその方法により抽出された遺伝子群を備えたDNAチップを提供することである。
本発明者は、鋭意努力して検討した結果、DNAチップを用いることにより、パーキンソン病に関与する遺伝子群を抽出する方法を開発することに成功し、更にこの方法が他の疾患(例えば、アルツハイマー病、糖尿病・動脈硬化などの生活習慣病)に関与する遺伝子群を抽出するためにも応用できることに思い至り、基本的には本発明を完成するに至った。すなわち、実験動物として系統が確立されている動物は、遺伝的にはヒトよりも揃った形質を備えている。さらに、同じ飼育環境下で、これらの実験動物を飼育することが容易でもある。このため、実験動物を用いて、対象とする疾患に関与する遺伝子群を効率的に抽出することができれば、その結果はヒトを用いたデータよりもはるかに信頼性が高く、時間の短縮にもつながり、ヒトへの応用も容易であると考えられる。
こうして、第1の発明に係る遺伝子群の抽出方法は、(A)非ヒトコントロール動物から調製したコントロールmRNAと、前記コントロール動物に対象とする疾患を発生させた疾患動物から調製した疾患mRNAとに基づいて、DNAチップを利用して発現量の比較を行い、疾患mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも多い第1発現量増加遺伝子群と疾患mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも少ない第1発現量減少遺伝子群とを含む第1の遺伝子群を抽出する工程、(B)前記疾患を治療または予防できる処置を施した制御動物から調製した制御mRNAと、前記コントロールmRNAとに基づいて、DNAチップを利用して発現量の比較を行い、制御mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも多い第2発現量増加遺伝子群と制御mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも少ない第2発現量減少遺伝子群とを含む第2の遺伝子群を抽出する工程、(C)前記第1の遺伝子群と第2の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示す遺伝子群である第1発現量減少遺伝子群と第2発現量増加遺伝子群との間で共通する第3の遺伝子群、及び第1発現量増加遺伝子群と第2発現量減少遺伝子群との間で共通する第4の遺伝子群を抽出する工程を備えたことを特徴とする。
「コントロール動物」とは、対象とする疾患を発生する遺伝的素養を持たない動物を意味している。すなわち、コントロール動物を通常に飼育した場合には、対象とする疾患をほとんど全く発生することなく、ライフサイクルを完了する。このような動物として、実験動物として系統が定まっているものを用いることが好ましい。コントロール動物としては、抽出された遺伝子群をヒトに適用することを考慮すると、遺伝的にヒトに近い動物、つまり哺乳動物(サル、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウスなど)を用いることが好ましく、更に比較的系統が固定されている哺乳動物(ラット、マウスなど)を用いることが好ましい。
「mRNA」とは、ゲノムDNAが転写された産物のうち、タンパク質に翻訳されるRNAを意味している。
「mRNA」とは、ゲノムDNAが転写された産物のうち、タンパク質に翻訳されるRNAを意味している。
「対象とする疾患を発生させた」とは、コントロール動物に外部から何らかの作用を与える(例えば、(1)低分子化合物、核酸、タンパク質等を投与する、(2)持続的な或いは単発的な刺激(例えば、狭い空間内に閉じこめた状態で飼育する、終日に渡って暗い状態で飼育する、電気刺激を与えるなど)を加える)ことにより、所定の疾患を発生させることを意味している。例えば、コントロール動物に、ロテノン(Rotenene,農薬の一種)を投与することにより、対象とする疾患であるパーキンソン病を発生させることができる。また、コントロール動物に、マンガン(重金属)、ベータアミロイド蛋白質、薬物(ハロぺリドール(ドパミン受容体2遮断薬)、ノメガーニトロ−L−アルギニンメチルエーテル(一酸化窒素合成阻害剤)を投与すること、または脳虚血手術を行うことにより、アルツハイマー病を発生させることができる。また、コントロール動物に、高脂肪食を与えることにより、糖尿病・高血圧・動脈硬化などの生活習慣病を発生させることができる。
「基づいて」とは、mRNAをそのまま叉はそれを増幅後アミノアリルRNAとしてDNAチップに供する場合を含むほかに、mRNAに基づいてcDNAを調製して、そのcDNAをDNAチップに供する場合を含む。
「基づいて」とは、mRNAをそのまま叉はそれを増幅後アミノアリルRNAとしてDNAチップに供する場合を含むほかに、mRNAに基づいてcDNAを調製して、そのcDNAをDNAチップに供する場合を含む。
疾患mRNAには、その疾患の発生の原因または結果として、コントロールmRNAの発現量とは異なるプロフィールを有する遺伝子群が存在しているはずである。このようにして抽出されたものを第1の遺伝子群とする。この第1の遺伝子群には、疾患によって発現量がコントロールよりも増加した遺伝子群(以下、「第1発現量増加遺伝子群」という)と、疾患によって発現量がコントロールよりも減少した遺伝子群(以下、「第1発現量減少遺伝子群」という)との両者が含まれている。
「DNAチップ」とは、固体(例えば、シリカ、表面誘導体化ガラス、ポリプロピレン、または活性化ポリアクリルアミドなど)の表面上に多種類のDNA断片や、複数種類(例えば、数十〜数万個程度)の既知オリゴヌクレオチドプローブを高密度で固定したマイクロアレイを意味しており、DNAマイクロアレイとも称することがある。DNAチップ上に標的塩基配列断片(DNAまたはRNA)を置くと、その標的塩基配列断片は塩基配列の相補性に従って、DNAチップ上のプローブにハイブリダイズする。従って、標的塩基配列断片を予め光学的、電気的、または放射化学的に検出可能なタグで標識しておくことにより、ハイブリダイズした標的塩基配列断片の有無、または発現量を分析することができる。DNAチップを利用して遺伝子群を抽出する方法としては、例えば競合法を用いることができるが、これに限られるものではない。
「DNAチップ」とは、固体(例えば、シリカ、表面誘導体化ガラス、ポリプロピレン、または活性化ポリアクリルアミドなど)の表面上に多種類のDNA断片や、複数種類(例えば、数十〜数万個程度)の既知オリゴヌクレオチドプローブを高密度で固定したマイクロアレイを意味しており、DNAマイクロアレイとも称することがある。DNAチップ上に標的塩基配列断片(DNAまたはRNA)を置くと、その標的塩基配列断片は塩基配列の相補性に従って、DNAチップ上のプローブにハイブリダイズする。従って、標的塩基配列断片を予め光学的、電気的、または放射化学的に検出可能なタグで標識しておくことにより、ハイブリダイズした標的塩基配列断片の有無、または発現量を分析することができる。DNAチップを利用して遺伝子群を抽出する方法としては、例えば競合法を用いることができるが、これに限られるものではない。
「前記疾患を治療または予防できる処置を施し」とは、コントロール動物に外部から何らかの作用を与えることにより、対象とする疾患を治療または予防することを意味している。この作用としては、例えば薬物(低分子化合物、核酸、タンパク質など)を投与することが例示されるが、これには限られない。例えば、ロテノンを投与してパーキンソン病を発生させる試験系において、エゾウコギからの抽出物であるASHまたはMASH(後に詳述する)を投与することは、ロテノンによるパーキンソン病を治療または予防できる処置を施していることになる。また、アルツハイマー病を発生させる試験系において、エゾウコギ、イチョウ、DHA(ドコサヘキサエン酸)、L−アルギニン(一酸化窒素の前駆物質)、医薬品(フルオロキセチン(セロトニン取り込み抑制剤))等を投与することは、アルツハイマー病を治療または予防できる処置を施していることになる。また、生活習慣病を発生させる試験系において、エゾウコギ、マイタケ、アロエ、ニンニク、マメ(イソフラボン)、亜麻仁等を投与することは、生活習慣病を治療または予防できる処置を施していることになる。
「治療または予防」とは、完全に疾患の発生を押さえる他に、疾患を押さえる作用を行わない場合に比べて、より軽減する場合(つまり、コントロール動物に近い状態)を含む。
「治療または予防」とは、完全に疾患の発生を押さえる他に、疾患を押さえる作用を行わない場合に比べて、より軽減する場合(つまり、コントロール動物に近い状態)を含む。
制御mRNAには、対象とする疾患を治療または予防するために、コントロールmRNAの発現量とは異なるプロフィールを有する遺伝子群が存在しているはずである。このようにして抽出されたものを第2の遺伝子群とする。第2の遺伝子群には、コントロールよりも発現量が増加した遺伝子群(以下、「第2発現量増加遺伝子群」という)と、コントロールよりも発現量が減少した遺伝子群(以下、「第2発現量減少遺伝子群」という)との両者が含まれている。
第1の遺伝子群と第2の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示すもの、すなわち、(ア)第1発現量減少遺伝子群と第2発現量増加遺伝子群の間で共通する遺伝子群(第3の遺伝子群)、或いは(イ)第1発現量増加遺伝子群と第2発現量減少遺伝子群の間で共通する遺伝子群(第4の遺伝子群)には、対象とする疾患に対して、直接または間接に関与する遺伝子が多く含まれているはずである。そこで、第3の遺伝子群または第4の遺伝子群を精査することにより、対象とする疾患の原因を突き止め、治療することが可能となり得る。また、未だに疾患を発症していない「健常者」についても、第3の遺伝子群または第4の遺伝子群の発現状態を確認することにより、その疾患となる可能性を評価するためのデータとして用いることができる。
第1の遺伝子群と第2の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示すもの、すなわち、(ア)第1発現量減少遺伝子群と第2発現量増加遺伝子群の間で共通する遺伝子群(第3の遺伝子群)、或いは(イ)第1発現量増加遺伝子群と第2発現量減少遺伝子群の間で共通する遺伝子群(第4の遺伝子群)には、対象とする疾患に対して、直接または間接に関与する遺伝子が多く含まれているはずである。そこで、第3の遺伝子群または第4の遺伝子群を精査することにより、対象とする疾患の原因を突き止め、治療することが可能となり得る。また、未だに疾患を発症していない「健常者」についても、第3の遺伝子群または第4の遺伝子群の発現状態を確認することにより、その疾患となる可能性を評価するためのデータとして用いることができる。
なお、上記第3の遺伝子群と第4の遺伝子群とでは、第3の遺伝子群を用いることが好ましい。一般的に、家族性疾患と呼ばれる疾患原因を調査すると、多くの場合に特定の遺伝子の変異によって、その遺伝子の発現量が減少することで、その疾患が発生している。つまり、発現量の低下が疾患の原因となることが多いためである。しかしながら、特定の遺伝子の発現量が増加することによって、所定の疾患に罹患することもあり得る。そのような場合には、第4の遺伝子群を用いることが好ましい。
第1の発明において、(C)の工程は、(A)または(B)の工程の後に行われることが必要であるが、(A)または(B)の工程については、順序を問われない。このため、全体としては、(A)(B)(C)、または(B)(A)(C)の順に工程を実施することができる。
このように本発明によれば、対象とする疾患の発生または制御に係る遺伝子群を抽出することができる。
第1の発明において、(C)の工程は、(A)または(B)の工程の後に行われることが必要であるが、(A)または(B)の工程については、順序を問われない。このため、全体としては、(A)(B)(C)、または(B)(A)(C)の順に工程を実施することができる。
このように本発明によれば、対象とする疾患の発生または制御に係る遺伝子群を抽出することができる。
また、第3の遺伝子群または第4の遺伝子群に含まれないもの(つまり、第1の遺伝子群と第2の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示すものではないもの)であっても、第1発現量減少遺伝子群あるいは第2発現量増加遺伝子群として抽出された遺伝子の中には、対象とする疾患に関与する可能性が高いものが含まれていることが考え得る。このため、第2の発明に係る遺伝子群の抽出方法は、(A)非ヒトコントロール動物から調製したコントロールmRNAと、前記コントロール動物に所定の疾患を発生させた疾患動物から調製した疾患mRNAとに基づいて、DNAチップを利用して発現量の比較を行い、疾患mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも多い第1発現量増加遺伝子群と疾患mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも少ない第1発現量減少遺伝子群とを含む第1の遺伝子群を抽出する工程、(B)前記疾患を治療または予防できる処置を施した制御動物から調製した制御mRNAと、前記コントロールmRNAとに基づいて、DNAチップを利用して発現量の比較を行い、制御mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも多い第2発現量増加遺伝子群と制御mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも少ない第2発現量減少遺伝子群とを含む第2の遺伝子群を抽出する工程、(D)前記第1発現量減少遺伝子群と前記第2発現量増加遺伝子群とを抽出する工程を備えたことを特徴とする。
上記第1の発明または第2の発明においては、mRNAを抽出するために使用する組織としては、対象とする疾患において、顕著な病変を示す組織を用いることが好ましい。例えば、パーキンソン病・アルツハイマー病のように脳組織中に特異的な病変を認める場合には、脳あるいは脳の一部(パーキンソン病の場合には黒質、アルツハイマー病の場合には海馬)を用いてmRNAを抽出することが好ましい。
ここで、第1の発明及び第2の発明のように、非ヒト動物を用いた場合には、対象とする疾患に関与する遺伝子群を抽出する際に、特異的な病変が生じる組織を用いてmRNAを調製することは比較的容易に行いうる。しかしながら、その結果をヒトに外挿しようとした場合には、そのような組織(例えば、脳組織)を採取することが困難となることが考えられる。特に、ヒトが生存している場合には、更に困難な事態が想起される。非ヒト動物から得られた結果を容易にヒトに外挿できるようにするためには、ヒトにおいて簡単に採取できる血液を用いて、対象とする疾患に関与する遺伝子群を特定できることが好ましい。こうして、第3の発明は、第1の発明または第2の発明において、(1)対象とする疾患によって特異的な病変が生じる組織から調製されたmRNAを使用して前記(A)及び(B)の工程を経て、(C)または(D)の遺伝子群抽出工程を行い、(2)血液、特に白血球から調製されたmRNAを使用して前記(A)及び(B)の工程を経て、(C)または(D)の遺伝子群抽出工程を行い、前記(1)及び(2)の工程によって抽出された遺伝子群のうち重複する血液検出可能遺伝子群を抽出する工程を備えたことを特徴とする。
ここで、第1の発明及び第2の発明のように、非ヒト動物を用いた場合には、対象とする疾患に関与する遺伝子群を抽出する際に、特異的な病変が生じる組織を用いてmRNAを調製することは比較的容易に行いうる。しかしながら、その結果をヒトに外挿しようとした場合には、そのような組織(例えば、脳組織)を採取することが困難となることが考えられる。特に、ヒトが生存している場合には、更に困難な事態が想起される。非ヒト動物から得られた結果を容易にヒトに外挿できるようにするためには、ヒトにおいて簡単に採取できる血液を用いて、対象とする疾患に関与する遺伝子群を特定できることが好ましい。こうして、第3の発明は、第1の発明または第2の発明において、(1)対象とする疾患によって特異的な病変が生じる組織から調製されたmRNAを使用して前記(A)及び(B)の工程を経て、(C)または(D)の遺伝子群抽出工程を行い、(2)血液、特に白血球から調製されたmRNAを使用して前記(A)及び(B)の工程を経て、(C)または(D)の遺伝子群抽出工程を行い、前記(1)及び(2)の工程によって抽出された遺伝子群のうち重複する血液検出可能遺伝子群を抽出する工程を備えたことを特徴とする。
第3の発明によれば、対象とする疾患に関与する特定の遺伝子群のうち、血液中のmRNAの発現量に反映されるものを抽出することができる。このような遺伝子群を用いることにより、特異的な病変が生じる組織を摘出するまでもなく、ヒトの血液を採取すれば、対象とする疾患に対する情報(将来的な予測、疾患のプロフィールなど)を得ることができる。
現状では、DNAチップに固定される遺伝子数は、多い方が有効とされている。このため、数千〜数万種類の遺伝子を備えたチップを用いて評価を行うことが多いが、そのデータ解析を行うことは容易ではない。対象とする疾患について、関与する遺伝子群が特定された後には、主としてそのような遺伝子群を備えたDNAチップを用いる方が、データ解析にも経済的にも有利である。このため、第4の発明に係る対象とする疾患に関するプロフィールを検出するためのDNAチップは、第1の発明〜第3の発明に基づいて抽出された遺伝子群を主として含むことを特徴とする。第1の発明〜第3の発明によって抽出された遺伝子群(第3の遺伝子群、第4の遺伝子群、第1発現量減少遺伝子群、第2発現量増加遺伝子群、または血液検出可能遺伝子群)は、対象とする疾患に関与するものであるので、これらの遺伝子群をDNAチップに応用することにより、その疾患に関するプロフィールを検出することが容易に行える。
現状では、DNAチップに固定される遺伝子数は、多い方が有効とされている。このため、数千〜数万種類の遺伝子を備えたチップを用いて評価を行うことが多いが、そのデータ解析を行うことは容易ではない。対象とする疾患について、関与する遺伝子群が特定された後には、主としてそのような遺伝子群を備えたDNAチップを用いる方が、データ解析にも経済的にも有利である。このため、第4の発明に係る対象とする疾患に関するプロフィールを検出するためのDNAチップは、第1の発明〜第3の発明に基づいて抽出された遺伝子群を主として含むことを特徴とする。第1の発明〜第3の発明によって抽出された遺伝子群(第3の遺伝子群、第4の遺伝子群、第1発現量減少遺伝子群、第2発現量増加遺伝子群、または血液検出可能遺伝子群)は、対象とする疾患に関与するものであるので、これらの遺伝子群をDNAチップに応用することにより、その疾患に関するプロフィールを検出することが容易に行える。
「疾患に関するプロフィール」とは、将来的に対象とする疾患に罹患する可能性があるか否か、現在罹患している疾患の状態・タイプ・将来的な推移などを意味している。
「主として」とは、DNAチップに載せられた遺伝子群の大部分が、対象とする疾患に関与する遺伝子群(つまり、第1の発明〜第3の発明によって抽出された遺伝子群)であることを意味しており、少なくともDNAチップ上の遺伝子群の80%以上(好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上)が、そのような遺伝子群から抽出されたものであることを意味している。
本発明において、DNAチップ上に載せる遺伝子群としては、全てを用いてもよいが、それらの遺伝子群から選択される1または2以上の遺伝子を用いることもできる。また、DNAチップに固定するDNAとしては、遺伝子全体を用いる必要はなく、その遺伝子の一部の塩基配列を用いて、被測定者の組織から調製されたmRNAに基づく塩基配列とハイブリダイズするものであればよい。
本発明のDNAチップを用いる際に、ヒトを対象とする場合には、被測定者の血液から調製されたmRNAを用いることが好ましい。このため、特に第3の発明によって抽出された遺伝子群(血液検出可能遺伝子群)を用いることが好ましい。
「主として」とは、DNAチップに載せられた遺伝子群の大部分が、対象とする疾患に関与する遺伝子群(つまり、第1の発明〜第3の発明によって抽出された遺伝子群)であることを意味しており、少なくともDNAチップ上の遺伝子群の80%以上(好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上)が、そのような遺伝子群から抽出されたものであることを意味している。
本発明において、DNAチップ上に載せる遺伝子群としては、全てを用いてもよいが、それらの遺伝子群から選択される1または2以上の遺伝子を用いることもできる。また、DNAチップに固定するDNAとしては、遺伝子全体を用いる必要はなく、その遺伝子の一部の塩基配列を用いて、被測定者の組織から調製されたmRNAに基づく塩基配列とハイブリダイズするものであればよい。
本発明のDNAチップを用いる際に、ヒトを対象とする場合には、被測定者の血液から調製されたmRNAを用いることが好ましい。このため、特に第3の発明によって抽出された遺伝子群(血液検出可能遺伝子群)を用いることが好ましい。
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
<ロテノンによるパーキンソン病の誘導>
農薬であるロテノン(Rotenone)を投与することにより、ラットにパーキンソン病の病態を発生できることが知られている。適当な数(例えば、3匹以上)のラットに適当用量(例えば、2mg/kg以上)のロテノンを一日一回、数週間に渡って腹腔内投与することにより、パーキンソン病を発症させる。ロテノンを投与したときの遺伝子発現パターンと、コントロール動物の遺伝子発現パターンとをDNAチップを用いて比較する。
<ロテノンによるパーキンソン病の誘導>
農薬であるロテノン(Rotenone)を投与することにより、ラットにパーキンソン病の病態を発生できることが知られている。適当な数(例えば、3匹以上)のラットに適当用量(例えば、2mg/kg以上)のロテノンを一日一回、数週間に渡って腹腔内投与することにより、パーキンソン病を発症させる。ロテノンを投与したときの遺伝子発現パターンと、コントロール動物の遺伝子発現パターンとをDNAチップを用いて比較する。
<パーキンソン病を予防する処置>
ロテノンの投与に際して、予め(例えばロテノン投与前、2〜4週間前)ASH/MASHと称するエゾウコギ抽出物(実施例中において詳述する)を経口投与しておく。すると、ロテノンを投与しても、パーキンソン病の発生を予防することができる。
そこで、パーキンソン病を治療または予防できる処置として、ASHまたはMASHを投与する。ASHまたはMASHを投与したときの遺伝子発現パターンと、コントロール動物の遺伝子発現パターンとをDNAチップを用いて比較する。
ロテノンの投与に際して、予め(例えばロテノン投与前、2〜4週間前)ASH/MASHと称するエゾウコギ抽出物(実施例中において詳述する)を経口投与しておく。すると、ロテノンを投与しても、パーキンソン病の発生を予防することができる。
そこで、パーキンソン病を治療または予防できる処置として、ASHまたはMASHを投与する。ASHまたはMASHを投与したときの遺伝子発現パターンと、コントロール動物の遺伝子発現パターンとをDNAチップを用いて比較する。
<脳黒質から抽出したmRNAを用いた解析>
(1)第1の遺伝子群の抽出
パーキンソン病では、レビュー小体と呼ばれる物質が脳黒質内に確認できる。つまり、パーキンソン病においては、黒質は特異的な病変が生じる組織である。そこで、ロテノンを投与してパーキンソン病を発症したラットの黒質を採取し、このサンプルから疾患mRNAを調製する。一方、ロテノンを投与していないラット(コントロール動物)の黒質からコントロールmRNAを調製する。これら二種類のmRNAをDNAチップ(多数、例えば2万種類以上の遺伝子の有無を検出可能なもの)にかけて、発現量の差違が認められる第1の遺伝子群を抽出する。
(1)第1の遺伝子群の抽出
パーキンソン病では、レビュー小体と呼ばれる物質が脳黒質内に確認できる。つまり、パーキンソン病においては、黒質は特異的な病変が生じる組織である。そこで、ロテノンを投与してパーキンソン病を発症したラットの黒質を採取し、このサンプルから疾患mRNAを調製する。一方、ロテノンを投与していないラット(コントロール動物)の黒質からコントロールmRNAを調製する。これら二種類のmRNAをDNAチップ(多数、例えば2万種類以上の遺伝子の有無を検出可能なもの)にかけて、発現量の差違が認められる第1の遺伝子群を抽出する。
ここで、DNAチップには、例えば競合法を用いることにより、両mRNAの発現量の差違を検出することができる。蛍光法を用いる場合には、二種類の蛍光試薬(赤色または緑色)のうち、いずれか一方のmRNA(例えば、コントロールmRNA)には一方側(例えば、緑色)の試薬を結合させ、他方のmRNA(例えば、疾患mRNA)には他方側(例えば、赤色)の試薬を結合させる。両mRNAの所定量をDNAチップに供することにより、mRNAの発現量の差違によって、蛍光色の異なるDNAを同定することができる。上記例では、両mRNAの発現量が同等である場合には黄色の蛍光が、コントロールmRNAの発現量が多い場合には緑色の蛍光が、疾患mRNAの発現量が多い場合には赤色の蛍光が認められる。なお、両mRNAにおいて発現が認められない場合には、蛍光がないので黒色となる。
図1には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるDNAを固定してある位置を示し、丸印内に大文字(A,B,C,E,H,K)を付したものは、疾患mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して減少した遺伝子(第1発現量減少遺伝子群)を示している。また、丸印内に小文字(j,m,n,q,u)を付したものは、疾患mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して増加した遺伝子(第1発現量増加遺伝子群)を示している。
図1には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるDNAを固定してある位置を示し、丸印内に大文字(A,B,C,E,H,K)を付したものは、疾患mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して減少した遺伝子(第1発現量減少遺伝子群)を示している。また、丸印内に小文字(j,m,n,q,u)を付したものは、疾患mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して増加した遺伝子(第1発現量増加遺伝子群)を示している。
(2)第2の遺伝子群の抽出
エゾウコギ抽出物を投与したときのラットの黒質を採取し、このサンプルから制御mRNAを調製する。前述のコントロールmRNAと制御mRNAとをDNAチップにかけて、発現量の差違が認められる第2の遺伝子群を抽出する。上記(1)と同様にして、DNAチップに、例えば競合法を用いると、両mRNAの発現量の差違を検出することができる。
図2には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるDNAを固定してある位置を示し、丸印内に大文字(A,B,C,E,I,K)を付したものは、制御mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して増加した遺伝子群(第2発現量増加遺伝子群)を示している。また、丸印内に小文字(d,g,n,p,r,s,u)を付したものは、制御mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して減少した遺伝子(第2発現量減少遺伝子群)を示している。
エゾウコギ抽出物を投与したときのラットの黒質を採取し、このサンプルから制御mRNAを調製する。前述のコントロールmRNAと制御mRNAとをDNAチップにかけて、発現量の差違が認められる第2の遺伝子群を抽出する。上記(1)と同様にして、DNAチップに、例えば競合法を用いると、両mRNAの発現量の差違を検出することができる。
図2には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるDNAを固定してある位置を示し、丸印内に大文字(A,B,C,E,I,K)を付したものは、制御mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して増加した遺伝子群(第2発現量増加遺伝子群)を示している。また、丸印内に小文字(d,g,n,p,r,s,u)を付したものは、制御mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して減少した遺伝子(第2発現量減少遺伝子群)を示している。
(3)第3の遺伝子群または第4の遺伝子群の抽出
上記(1)と(2)との結果より、両者において互いに逆の傾向を示す遺伝子群のうち、第1発現量減少遺伝子群と第2発現量増加遺伝子群との交わりである第3の遺伝子群は、A,B,C,E,Kである。また、第1発現量増加遺伝子群と第2発現量減少遺伝子群との交わりである第4の遺伝子群は、n,uである。
(4)その他の遺伝子群の抽出
また、第3の遺伝子群には含まれないが、第1発現量減少遺伝子群に含まれるものとしてHが、第2発現量増加遺伝子群に含まれるものとしてIがある。
上記(1)と(2)との結果より、両者において互いに逆の傾向を示す遺伝子群のうち、第1発現量減少遺伝子群と第2発現量増加遺伝子群との交わりである第3の遺伝子群は、A,B,C,E,Kである。また、第1発現量増加遺伝子群と第2発現量減少遺伝子群との交わりである第4の遺伝子群は、n,uである。
(4)その他の遺伝子群の抽出
また、第3の遺伝子群には含まれないが、第1発現量減少遺伝子群に含まれるものとしてHが、第2発現量増加遺伝子群に含まれるものとしてIがある。
<DNAチップの作製(1)脳黒質データ由来>
図3には、パーキンソン病に関するプロフィールを検出するためのDNAチップの模式図を示した。このDNAチップには、上記第3の遺伝子群(A,B,C,E,K)、第1発現量減少遺伝子群(H)、及び第2発現量増加遺伝子群(I)を含む遺伝子の発現を検出できるようにDNAが固定されている。
なお、この場合には、もちろん第3の遺伝子群(A,B,C,E,K)のみを固定したDNAチップを作製することもできる。また、第4の遺伝子群(n,u)を用いることもできる。なお、DNAチップには、ポジティブコントロールとして、適当な遺伝子(例えば、βアクチン、GAPDH、ユビキチンB、リボソーマルプロテインS18(Rps18)など)を用いることが好ましい。
図3には、パーキンソン病に関するプロフィールを検出するためのDNAチップの模式図を示した。このDNAチップには、上記第3の遺伝子群(A,B,C,E,K)、第1発現量減少遺伝子群(H)、及び第2発現量増加遺伝子群(I)を含む遺伝子の発現を検出できるようにDNAが固定されている。
なお、この場合には、もちろん第3の遺伝子群(A,B,C,E,K)のみを固定したDNAチップを作製することもできる。また、第4の遺伝子群(n,u)を用いることもできる。なお、DNAチップには、ポジティブコントロールとして、適当な遺伝子(例えば、βアクチン、GAPDH、ユビキチンB、リボソーマルプロテインS18(Rps18)など)を用いることが好ましい。
<血液から抽出したmRNAを用いた解析>
(1)第1の遺伝子群の抽出
ロテノンを投与してパーキンソン病を発症したラットの血液を採取し、このサンプルから疾患mRNAを調製する。一方、ロテノンを投与していないラット(コントロール動物)の血液からコントロールmRNAを調製する。これら二種類のmRNAをDNAチップにかけて、発現量の差違が認められる第1の遺伝子群を抽出する。
図4には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるDNAを固定してある位置を示し、丸印内に大文字(A,B,H)を付したものは、疾患mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して減少した遺伝子(血液中第1発現量減少遺伝子群)を示している。また、丸印内に小文字(j,k,m,n,q,u)を付したものは、疾患mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して増加した遺伝子(血液中第1発現量増加遺伝子群)を示している。
(1)第1の遺伝子群の抽出
ロテノンを投与してパーキンソン病を発症したラットの血液を採取し、このサンプルから疾患mRNAを調製する。一方、ロテノンを投与していないラット(コントロール動物)の血液からコントロールmRNAを調製する。これら二種類のmRNAをDNAチップにかけて、発現量の差違が認められる第1の遺伝子群を抽出する。
図4には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるDNAを固定してある位置を示し、丸印内に大文字(A,B,H)を付したものは、疾患mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して減少した遺伝子(血液中第1発現量減少遺伝子群)を示している。また、丸印内に小文字(j,k,m,n,q,u)を付したものは、疾患mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して増加した遺伝子(血液中第1発現量増加遺伝子群)を示している。
(2)第2の遺伝子群の抽出
エゾウコギ抽出物等を投与したラットの血液を採取し、このサンプルから制御mRNAを調製する。前述のコントロールmRNAと制御mRNAとをDNAチップにかけて、発現量の差違が認められる第2の遺伝子群を抽出する。DNAチップを利用して両mRNAの発現量の差違を検出する。
図5には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるDNAを固定してある位置を示し、丸印内に大文字(A,B,E,I,K)を付したものは、制御mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して増加した遺伝子群(血液中第2発現量増加遺伝子群)を示している。また、丸印内に小文字(s)を付したものは、制御mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して減少した遺伝子群(血液中第2発現量減少遺伝子群)を示している。
エゾウコギ抽出物等を投与したラットの血液を採取し、このサンプルから制御mRNAを調製する。前述のコントロールmRNAと制御mRNAとをDNAチップにかけて、発現量の差違が認められる第2の遺伝子群を抽出する。DNAチップを利用して両mRNAの発現量の差違を検出する。
図5には、この結果を模式的に示した。図中の丸印は、それぞれ異なるDNAを固定してある位置を示し、丸印内に大文字(A,B,E,I,K)を付したものは、制御mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して増加した遺伝子群(血液中第2発現量増加遺伝子群)を示している。また、丸印内に小文字(s)を付したものは、制御mRNAの発現量がコントロールmRNAの発現量に比較して減少した遺伝子群(血液中第2発現量減少遺伝子群)を示している。
(3)第3の遺伝子群または第4の遺伝子群の抽出
上記(1)と(2)との結果より、両者において互いに逆の傾向を示す遺伝子群のうち、血液中第1発現量減少遺伝子群と血液中第2発現量増加遺伝子群との交わりである第3の遺伝子群は、A,Bである。また、第1発現量増加遺伝子群と第2発現量減少遺伝子群との交わりである第4の遺伝子群は、この例中には存在しない。
(4)その他の遺伝子群の抽出
また、第3の遺伝子群には含まれないが、血液中第1発現量減少遺伝子群に含まれるものとしてHが、血液中第2発現量増加遺伝子群に含まれるものとしてE,I,Kがある。
上記(1)と(2)との結果より、両者において互いに逆の傾向を示す遺伝子群のうち、血液中第1発現量減少遺伝子群と血液中第2発現量増加遺伝子群との交わりである第3の遺伝子群は、A,Bである。また、第1発現量増加遺伝子群と第2発現量減少遺伝子群との交わりである第4の遺伝子群は、この例中には存在しない。
(4)その他の遺伝子群の抽出
また、第3の遺伝子群には含まれないが、血液中第1発現量減少遺伝子群に含まれるものとしてHが、血液中第2発現量増加遺伝子群に含まれるものとしてE,I,Kがある。
<DNAチップの作製(2)血液データ由来>
図6には、パーキンソン病に関するプロフィールを検出するためのDNAチップの模式図を示した。このDNAチップには、上記第3の遺伝子群(A,B)、血液中第1発現量減少遺伝子群(H)、及び血液中第2発現量増加遺伝子群(E,I,K)を含む遺伝子の発現を検出できるようにDNAが固定されている。
なお、遺伝子数を減少させるために、第3の遺伝子群(A,B)のみを用いてDNAチップを作製することもできる。
<血液検出可能遺伝子群の抽出>
上記工程より、黒質から調製されたmRNAに基づいて、第3の遺伝子群(A,B,C,E,K)、第1発現量減少遺伝子群(H)、及び第2発現量増加遺伝子群(I)が抽出される。また、血液から調製されたmRNAに基づいて、第3の遺伝子群(A,B)、血液中第1発現量減少遺伝子群(H)、及び血液中第2発現量増加遺伝子群(E,I,K)が抽出される。
次に、これらの工程によって抽出された遺伝子群のうち重複する血液検出可能遺伝子群を抽出する。第3の遺伝子群のうち重複する遺伝子群はA、Bであり、第1発現量減少遺伝子群のうち重複する遺伝子群はHであり、第2発現量増加遺伝子群のうち重複する遺伝子群はE,I,Kである。こうして、血液検出可能遺伝子群が抽出される。なお、実際のDNAチップを作製するに際しては、これらの遺伝子群(A,B,H,E,I,K)を適当に取捨選択して用いることができる。
図6には、パーキンソン病に関するプロフィールを検出するためのDNAチップの模式図を示した。このDNAチップには、上記第3の遺伝子群(A,B)、血液中第1発現量減少遺伝子群(H)、及び血液中第2発現量増加遺伝子群(E,I,K)を含む遺伝子の発現を検出できるようにDNAが固定されている。
なお、遺伝子数を減少させるために、第3の遺伝子群(A,B)のみを用いてDNAチップを作製することもできる。
<血液検出可能遺伝子群の抽出>
上記工程より、黒質から調製されたmRNAに基づいて、第3の遺伝子群(A,B,C,E,K)、第1発現量減少遺伝子群(H)、及び第2発現量増加遺伝子群(I)が抽出される。また、血液から調製されたmRNAに基づいて、第3の遺伝子群(A,B)、血液中第1発現量減少遺伝子群(H)、及び血液中第2発現量増加遺伝子群(E,I,K)が抽出される。
次に、これらの工程によって抽出された遺伝子群のうち重複する血液検出可能遺伝子群を抽出する。第3の遺伝子群のうち重複する遺伝子群はA、Bであり、第1発現量減少遺伝子群のうち重複する遺伝子群はHであり、第2発現量増加遺伝子群のうち重複する遺伝子群はE,I,Kである。こうして、血液検出可能遺伝子群が抽出される。なお、実際のDNAチップを作製するに際しては、これらの遺伝子群(A,B,H,E,I,K)を適当に取捨選択して用いることができる。
<実施例1>ASH/MASHを経口投与したラットにロテノンによるパーキンソン病疾患誘導を行なった場合の効果確認試験
試験方法:農薬であるロテノン(Rotenone)を投与することにより、ラットにパーキンソン病の病態を発生させられることが知られている。本試験では、このロテノンをモデル動物作製用に用いた。また、ロテノンによるパーキンソン病を予防するための薬物として、ASH(エゾウコギを100%エタノール、50%エタノール、蒸留水で順次抽出したエキスを混合した混合エキスであり、商品名リンパザイムとして市販されているもの)、またはMASH(エゾウコギを炭化するまで蒸焼した後に、抽出物を製造したもの。特開平5−186360号公報に開示の技術に基づいて製造されたものを用いた。)を用いた。
試験方法:農薬であるロテノン(Rotenone)を投与することにより、ラットにパーキンソン病の病態を発生させられることが知られている。本試験では、このロテノンをモデル動物作製用に用いた。また、ロテノンによるパーキンソン病を予防するための薬物として、ASH(エゾウコギを100%エタノール、50%エタノール、蒸留水で順次抽出したエキスを混合した混合エキスであり、商品名リンパザイムとして市販されているもの)、またはMASH(エゾウコギを炭化するまで蒸焼した後に、抽出物を製造したもの。特開平5−186360号公報に開示の技術に基づいて製造されたものを用いた。)を用いた。
ラットA1群:予備飼育し、ゾンデを用いて、ASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットA2群:予備飼育し、ゾンデを用いて、ASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。また、ASHの投与開始から2週間して、ロテノン(2.5mg/kg)を一日一回、4週間に渡って腹腔内注射した。
ラットB1群:予備飼育し、ゾンデを用いて、MASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットB2群:予備飼育し、ゾンデを用いて、MASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。また、MASHの投与開始から2週間して、ロテノン(2.5mg/kg)を一日一回、4週間に渡って腹腔内注射した。
ラットC1群(陰性コントロール):予備飼育し、通常に8週間に渡って飼育した。
ラットC2群(陽性コントロール):予備飼育し、2週間して、ロテノン(2.5mg/kg)を一日一回、4週間に渡って腹腔内注射した。
ラットA2群:予備飼育し、ゾンデを用いて、ASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。また、ASHの投与開始から2週間して、ロテノン(2.5mg/kg)を一日一回、4週間に渡って腹腔内注射した。
ラットB1群:予備飼育し、ゾンデを用いて、MASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットB2群:予備飼育し、ゾンデを用いて、MASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。また、MASHの投与開始から2週間して、ロテノン(2.5mg/kg)を一日一回、4週間に渡って腹腔内注射した。
ラットC1群(陰性コントロール):予備飼育し、通常に8週間に渡って飼育した。
ラットC2群(陽性コントロール):予備飼育し、2週間して、ロテノン(2.5mg/kg)を一日一回、4週間に渡って腹腔内注射した。
上記6群(1群当り7例)の各被験群について、試験開始時点(0)、試験開始後1、4、5、6、7及び8週目にポール試験を行なって運動機能を調べた。
ポール試験は、(1)被験ラットを上端部にグリップの付いた100cmのポールに上向きに掴ませ、その時点を試験開始時点とし、(2)試験開始時点からラットが下向きに方向転換するまでの時間(Timeto turn downward)、及び(3)ラットが下向きに方向を転換してからポールを降りて地面に達するまでの時間(Timetoreach the floor)を計測した。
ポール試験は、(1)被験ラットを上端部にグリップの付いた100cmのポールに上向きに掴ませ、その時点を試験開始時点とし、(2)試験開始時点からラットが下向きに方向転換するまでの時間(Timeto turn downward)、及び(3)ラットが下向きに方向を転換してからポールを降りて地面に達するまでの時間(Timetoreach the floor)を計測した。
試験結果:図7は、ラットが試験開始時点から下向きに方向転換するまでの時間を計測した結果を示したグラフである。グラフの縦軸はラットが方向転換に要した秒数(Timeto turn downward)を、横軸は飼育日数であって各被験群に投与を開始してから経過した日数(週:week)をそれぞれ示している。
図7において、ラットC1群(H2O)では、試験開始0週目〜6週目までに渡って、方向転換までに要した秒数は、ほぼ同等または学習効果による減少傾向を示した。また、ラットC2群(H2O+Rotenone(3.5mg/kg,ip))では、試験開始2週目(ロテノンの投与開始週)から秒数が増加し、6週目まで増加し続けた。6週目では、試験開始時(約8秒)の約4倍(約32秒)まで増加し、パーキンソン病の病態を発症していることが確認された。
図7において、ラットC1群(H2O)では、試験開始0週目〜6週目までに渡って、方向転換までに要した秒数は、ほぼ同等または学習効果による減少傾向を示した。また、ラットC2群(H2O+Rotenone(3.5mg/kg,ip))では、試験開始2週目(ロテノンの投与開始週)から秒数が増加し、6週目まで増加し続けた。6週目では、試験開始時(約8秒)の約4倍(約32秒)まで増加し、パーキンソン病の病態を発症していることが確認された。
その他の4群(A1群、A2群、B1群、B2群)については、ロテノンの投与を開始した2週目〜6週目のいずれの期間においても、試験開始0週目との間に大きな差違は認められなかった。このことより、ASH及びMASHのいずれにも、ロテノンが誘導するパーキンソン病を予防する効果があることが示された。
図8は、ラットが試験開始時点からポールを降りて地面に達するまでの時間を計測した結果を示したグラフである。グラフの縦軸はラットが地面に達するまでの秒数(Timeto reach the floor)を、横軸は飼育日数であって各被験群に投与を開始してから経過した日数(週:week)をそれぞれ示している。図8において、ラットC1群(H2O)では、試験開始0週目〜6週目までに渡って、やや増減は認められるものの、全体として、ほぼ同等の秒数を示した。また、ラットC2群(H2O+Rotenone(3.5mg/kg,ip))では、試験開始2週目(ロテノンの投与開始週)から徐々に秒数が増加し、5週目〜6週目まで顕著に増加した。6週目では、試験開始時(約12秒)の約3倍(約35秒)まで増加し、パーキンソン病の病態を発症していることが確認された。
図8は、ラットが試験開始時点からポールを降りて地面に達するまでの時間を計測した結果を示したグラフである。グラフの縦軸はラットが地面に達するまでの秒数(Timeto reach the floor)を、横軸は飼育日数であって各被験群に投与を開始してから経過した日数(週:week)をそれぞれ示している。図8において、ラットC1群(H2O)では、試験開始0週目〜6週目までに渡って、やや増減は認められるものの、全体として、ほぼ同等の秒数を示した。また、ラットC2群(H2O+Rotenone(3.5mg/kg,ip))では、試験開始2週目(ロテノンの投与開始週)から徐々に秒数が増加し、5週目〜6週目まで顕著に増加した。6週目では、試験開始時(約12秒)の約3倍(約35秒)まで増加し、パーキンソン病の病態を発症していることが確認された。
その他の4群(A1群、A2群、B1群、B2群)については、ロテノンの投与を開始した2週目〜6週目のいずれの期間においても、試験開始0週目との間に大きな差違は認められなかった。このことより、ASH及びMASHのいずれにも、ロテノンが誘導するパーキンソン病を予防する効果があることが示された。
なお、投与開始時(グラフの横軸が0)におけるポールを降りて地面に達するまでの秒数の各被験群間の差は統計学上有意な差ではない。このことから、予備飼育の段階で、個々のラットの運動能力差にかかる各被験群間の運動能力差が生じないように予め調整した後試験がなされていることが示される。
なお、投与開始時(グラフの横軸が0)におけるポールを降りて地面に達するまでの秒数の各被験群間の差は統計学上有意な差ではない。このことから、予備飼育の段階で、個々のラットの運動能力差にかかる各被験群間の運動能力差が生じないように予め調整した後試験がなされていることが示される。
<実施例2>ASH/MASHを経口投与したラットにロテノンによるパーキンソン病疾患誘導を行なった場合のカタレプシーに及ぼす効果確認試験
試験方法:薬物として、ASH及びMASHを用いた。
実施例1と同様にして飼育された6群のラット(A1群,A2群,B1群,B2群,C1群,C2群;各群について、N=7)を用意した後、各群について、試験開始時点(0)、試験開始後1、2、3、4、5、6及び7週目にカタレプシー(Catalepsy)試験を行なった。
カタレプシー試験は、不動化状態の試験であって、まず被験ラットの両後足が地面に着いた状態で両前足を箱の上に載せた時点を試験開始時点とし、ラットがその体姿勢をとり続ける不動状態時間(秒数)を計測した。
試験方法:薬物として、ASH及びMASHを用いた。
実施例1と同様にして飼育された6群のラット(A1群,A2群,B1群,B2群,C1群,C2群;各群について、N=7)を用意した後、各群について、試験開始時点(0)、試験開始後1、2、3、4、5、6及び7週目にカタレプシー(Catalepsy)試験を行なった。
カタレプシー試験は、不動化状態の試験であって、まず被験ラットの両後足が地面に着いた状態で両前足を箱の上に載せた時点を試験開始時点とし、ラットがその体姿勢をとり続ける不動状態時間(秒数)を計測した。
試験結果:図9は、カタレプシー試験の測定結果を示したグラフである。グラフの縦軸はラットの不動状態時間(Catalepsy)を、横軸は飼育日数であって各被験群に投与を開始してから経過した日数(週:week)をそれぞれ示している。
図9において、ラットC1群(H2O)では、試験開始0週目〜7週目までに渡って、不動状態時間は、ほとんど0秒に近いままであり、増加または減少は見られなかった(すなわち、被験ラットは、試験開始後、速やかに前足を箱から離して、通常の四足歩行の姿勢に戻った)。また、ラットC2群(H2O+Rotenone(3.5mg/kg,ip))では、試験開始6週目(ロテノンの投与開始から4週目)から秒数が顕著に増加した。6週目では、試験開始時の約0秒から約120秒まで増加し、うつ状態を示すことが確認された。
図9において、ラットC1群(H2O)では、試験開始0週目〜7週目までに渡って、不動状態時間は、ほとんど0秒に近いままであり、増加または減少は見られなかった(すなわち、被験ラットは、試験開始後、速やかに前足を箱から離して、通常の四足歩行の姿勢に戻った)。また、ラットC2群(H2O+Rotenone(3.5mg/kg,ip))では、試験開始6週目(ロテノンの投与開始から4週目)から秒数が顕著に増加した。6週目では、試験開始時の約0秒から約120秒まで増加し、うつ状態を示すことが確認された。
その他の4群(A1群、A2群、B1群、B2群)については、ロテノンの投与を開始した2週目〜6週目のいずれの期間においても、試験開始0週目との間に差違は認められなかった。このことより、ASH及びMASHのいずれにも、ロテノンが誘導するうつ状態を予防する効果があることが示された。また、黒質線条体系とうつ行動との関係が示唆された。
<実施例3>DNAチップを利用した遺伝子発現の確認試験−1
試験方法:ロテノン、またはエゾウコギ抽出物(ASH、MASH)を投与したラットを以下のように処理した。
ラットA群:予備飼育し、ゾンデを用いて、ASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットB群:予備飼育し、ゾンデを用いて、MASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットC1群(陰性コントロール):予備飼育し、通常に8週間に渡って飼育した。
ラットC2群(陽性コントロール):予備飼育し、2週間して、ロテノン(3.5mg/kg)を一日一回、4週間に渡って腹腔内注射した。
これら4群(A群、B群、C1群、及びC2群。各群について、N=7)について、試験開始から6週間経過後に、ラットの黒質及び血液を採取した。黒質及び血液サンプルを各群毎に4叉は3例づつ混合した後、mRNAを抽出し、DNAチップによって発現遺伝子のプロフィールを検出した。DNAチップ試験には、競合法を用い、それぞれ(1)C1群(H2O)とC2群(ロテノン投与)、(2)C1群(H2O)とA群(ASH投与)、及び(3)C1群(H2O)とB群(MASH投与)の遺伝子発現プロフィールを比較検討した。
試験方法:ロテノン、またはエゾウコギ抽出物(ASH、MASH)を投与したラットを以下のように処理した。
ラットA群:予備飼育し、ゾンデを用いて、ASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットB群:予備飼育し、ゾンデを用いて、MASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットC1群(陰性コントロール):予備飼育し、通常に8週間に渡って飼育した。
ラットC2群(陽性コントロール):予備飼育し、2週間して、ロテノン(3.5mg/kg)を一日一回、4週間に渡って腹腔内注射した。
これら4群(A群、B群、C1群、及びC2群。各群について、N=7)について、試験開始から6週間経過後に、ラットの黒質及び血液を採取した。黒質及び血液サンプルを各群毎に4叉は3例づつ混合した後、mRNAを抽出し、DNAチップによって発現遺伝子のプロフィールを検出した。DNAチップ試験には、競合法を用い、それぞれ(1)C1群(H2O)とC2群(ロテノン投与)、(2)C1群(H2O)とA群(ASH投与)、及び(3)C1群(H2O)とB群(MASH投与)の遺伝子発現プロフィールを比較検討した。
なお、mRNAの抽出方法及び、DNAチップの処理方法は、ラットDNA chip(アジレント社製)に添付された説明書に基づいて行った。また、DNAチップのデータ読み取りにはマイクロアレイスキャナ(Affymetrix428 scanner:Affymetrix社製)を使用し、データ解析には、DNAsis array(日立ソフト社製)を使用した。また、リアルタイムPCR(real time PCR)には、Bio−Rad iCycler Real time PCR(Bio−RAD社製)を用いた。
表1には、(1)C1群(H2O)とC2群(ロテノン投与)、及び(2)C1群(H2O)とA群(ASH投与)の結果をまとめたデータを示した。表1中の記号のうち、「R<1」はロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が減少したもの(第1発現量減少遺伝子群)を、「R>1」はロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が増加したもの(第1発現量増加遺伝子群)をそれぞれ意味している。「ASH≧1.5」、「ASH≧1.2」または「ASH>1」は、ASHを投与したときにコントロールと比較して発現量が増加したもの(第2発現量増加遺伝子群)のうち、増加量によって区画したもの(1.5倍以上、1.2倍以上、または1倍より大)を意味している。
なお、一般には、コントロール群(本実施例では、H2O)の発現量に対して、処置群(本実施例では、ASHまたはMASH)の発現量が2倍以上のものからリアルタイムPCR解析を行うことが多い。また、DNAチップに関する研究者の中には、発現量の差違が2倍以下の場合には、信頼に足りるデータではないとみなす者もいる。しかしながら、本発明者は、DNAチップ全体の情報を効率的に有用な形にする目的で、コントロール群よりも少しだけ高い発現量を示した遺伝子も見のがしたくないと考え、R<1またはASH>1等を含めている。そして、UCCR(処置群において、1より大であるが、1.5以下)のリアルタイムPCRの結果を見ると、今回のDNAチップ解析でのUCCRの発現量上昇が正確であることを示す一例となっていることから、本発明者の上記目的が達成されていると考える。
なお、一般には、コントロール群(本実施例では、H2O)の発現量に対して、処置群(本実施例では、ASHまたはMASH)の発現量が2倍以上のものからリアルタイムPCR解析を行うことが多い。また、DNAチップに関する研究者の中には、発現量の差違が2倍以下の場合には、信頼に足りるデータではないとみなす者もいる。しかしながら、本発明者は、DNAチップ全体の情報を効率的に有用な形にする目的で、コントロール群よりも少しだけ高い発現量を示した遺伝子も見のがしたくないと考え、R<1またはASH>1等を含めている。そして、UCCR(処置群において、1より大であるが、1.5以下)のリアルタイムPCRの結果を見ると、今回のDNAチップ解析でのUCCRの発現量上昇が正確であることを示す一例となっていることから、本発明者の上記目的が達成されていると考える。
また、「ASH<1」、「ASH≦0.8」または「ASH≦0.6」は、ASHを投与したときにコントロールと比較して発現量が減少したもの(第2発現量減少遺伝子群)のうち、減少量によって区画したもの(1倍より小、0.8倍以下、または0.6倍以下)を意味している。また、表1において、左側3列は、ロテノン投与によって発現量が減少したもの(第1発現量減少遺伝子群)と、ASH投与によって発現量が増加したもの(第2発現量増加遺伝子群)との交わりである第3の遺伝子群の数を意味しており、右側3列は、ロテノン投与によって発現量が増加したもの(第1発現量増加遺伝子群)と、ASH投与によって発現量が減少したもの(第2発現量減少遺伝子群)との交わりである第4の遺伝子群の数を意味している。また、表1中の「一致」と示した行(3行分)は、黒質と血液とのデータが一致したもの(血液検出可能遺伝子群)を意味している。更に、「一致かつPD関連」と示した行(最下行)は、現在公表されているパーキンソン病(PD)に関連する遺伝子について、今回の試験結果のうち「一致」中のものと同じものを示している。第3の遺伝子群または第4の遺伝子群の一部には、現在知られているPD関連遺伝子が含まれていることから、本実施形態の方法が有効に疾患関連遺伝子群を抽出できることを示している。
表2には、(1)C1群(H2O)とC2群(ロテノン投与)、及び(3)C1群(H2O)とB群(MASH投与)の結果をまとめたデータを示した。表2中の記号は、上記表1中の記号の意味と同様である。
表1中の第3列、第4列、表2中の第2列〜第4列の「一致かつPD関連」には、それぞれ6個、3個、2個、9個、及び1個の遺伝子が認められた。表3には、表1及び表2中の「一致かつPD関連」として示した(*1)〜(*5)の遺伝子名を示した。これらの遺伝子については、アクセションナンバー(Accession Number)に基づいて、塩基配列等を確認することができる。
表1中の第3列、第4列、表2中の第2列〜第4列の「一致かつPD関連」には、それぞれ6個、3個、2個、9個、及び1個の遺伝子が認められた。表3には、表1及び表2中の「一致かつPD関連」として示した(*1)〜(*5)の遺伝子名を示した。これらの遺伝子については、アクセションナンバー(Accession Number)に基づいて、塩基配列等を確認することができる。
表4には、(1)ロテノン投与によって発現量が減少したもの(R<1,第1発現量減少遺伝子群)とASH投与によって発現量が増加したもの(ASH>1,第2発現量増加遺伝子群)との交わりである第3の遺伝子群、及びロテノン投与によって発現量が増加したもの(R>1,第1発現量増加遺伝子群)とASH投与によって発現量が減少したもの(第2発現量減少遺伝子群)との交わりである第4の遺伝子群(表1における第3列と第4列との合計)と、(2)ロテノン投与によって発現量が減少したもの(R<1,第1発現量減少遺伝子群)とMASH投与によって発現量が増加したもの(MASH>1,第2発現量増加遺伝子群)との交わりである第3の遺伝子群、及びロテノン投与によって発現量が増加したもの(R>1,第1発現量増加遺伝子群)とMASH投与によって発現量が減少したもの(第2発現量減少遺伝子群)との交わりである第4の遺伝子群(表2における第3列と第4列との合計)とを示した。
表5には、表4の最下行に示した「一致かつPD関連」に属する遺伝子名をアクセションコードと共に示した。
なお、表中において、「unknown」と記載された遺伝子は、現段階において、名前も機能も同定されていない遺伝子であり、EST(expressed sequence tag)の中からDNAチップ用に使用された遺伝子を示している。つまり、「unknown」は、未知の物質であるものの、パーキンソン病の発症に関連している可能性が高いものであることが予想できるものである。但し、未だクローニングされていないので、名前が存在せず、機能も不明である。しかし、別の方向からこの結果を見ると、パーキンソン病関連新規機能物質をクローニングする優先順位叉はクローニング候補を示していると考えられる。そして、これらのunknownは、今後のパーキンソン病の治療のターゲット遺伝子となる可能性を秘めている。
なお、ESTとは、cDNAライブラリーからランダムに選んだクローンの5'末端(あるいは3'末端)から数百塩基の配列を決定したものをデータベースに登録したものであり、遺伝子解析の過程において、断片的なcDNAしか保持していない場合に、ESTをPCR用プライマーとして利用して全長を得ることができる。
表5には、表4の最下行に示した「一致かつPD関連」に属する遺伝子名をアクセションコードと共に示した。
なお、表中において、「unknown」と記載された遺伝子は、現段階において、名前も機能も同定されていない遺伝子であり、EST(expressed sequence tag)の中からDNAチップ用に使用された遺伝子を示している。つまり、「unknown」は、未知の物質であるものの、パーキンソン病の発症に関連している可能性が高いものであることが予想できるものである。但し、未だクローニングされていないので、名前が存在せず、機能も不明である。しかし、別の方向からこの結果を見ると、パーキンソン病関連新規機能物質をクローニングする優先順位叉はクローニング候補を示していると考えられる。そして、これらのunknownは、今後のパーキンソン病の治療のターゲット遺伝子となる可能性を秘めている。
なお、ESTとは、cDNAライブラリーからランダムに選んだクローンの5'末端(あるいは3'末端)から数百塩基の配列を決定したものをデータベースに登録したものであり、遺伝子解析の過程において、断片的なcDNAしか保持していない場合に、ESTをPCR用プライマーとして利用して全長を得ることができる。
<実施例4>DNAチップとリアルタイムPCRとを用いた黒質中UCCRの発現量比較試験
試験方法:薬物として、ロテノン、ASH、及びMASHを用いた。実施例1と同様に6群(A1,A2,B1,B2,C1,C2)を用意し、試験開始から6週間後に、各群のラット黒質中のユビキノールチトクロームCレダクターゼ複合体コア蛋白2(Ubiquinol-cytochrome C reductase complex core protein 2。以下、「UCCR」という)mRNA量をDNAチップとリアルタイムPCRとで比較した。UCCRは、実施例3の結果を示した表1または表2中において、(*1)または(*4)の遺伝子群に含まれている。
試験方法:薬物として、ロテノン、ASH、及びMASHを用いた。実施例1と同様に6群(A1,A2,B1,B2,C1,C2)を用意し、試験開始から6週間後に、各群のラット黒質中のユビキノールチトクロームCレダクターゼ複合体コア蛋白2(Ubiquinol-cytochrome C reductase complex core protein 2。以下、「UCCR」という)mRNA量をDNAチップとリアルタイムPCRとで比較した。UCCRは、実施例3の結果を示した表1または表2中において、(*1)または(*4)の遺伝子群に含まれている。
試験結果:図10には、上記6群中のラット黒質内に発現されたUCCR mRNA量をDNAチップ(マイクロアレイ)及びリアルタイムPCRで測定したときの結果を棒グラフで示した。
図より明らかなように、黒質UCCR mRNAの発現量は、C1群(H2O)を100%としたときに、C2群(H2O+ロテノン)では減少し、A1群(ASH)及びB1群(MASH)で増加していた。この結果は、実施例3で示した表1及び表2と一致している。また、UCCR mRNA発現量は、A2群(ASH+ロテノン)及びB2群(MASH+ロテノン)においては、それぞれA1群及びB1群よりも多く増加することが判った。
また、6群のいずれにおいても、UCCR mRNA発現量は、DNAチップ及びリアルタイムPCRの両者で良好な一致を示していることから、本発明者の試験系が精度良く行われていることが示された。
図より明らかなように、黒質UCCR mRNAの発現量は、C1群(H2O)を100%としたときに、C2群(H2O+ロテノン)では減少し、A1群(ASH)及びB1群(MASH)で増加していた。この結果は、実施例3で示した表1及び表2と一致している。また、UCCR mRNA発現量は、A2群(ASH+ロテノン)及びB2群(MASH+ロテノン)においては、それぞれA1群及びB1群よりも多く増加することが判った。
また、6群のいずれにおいても、UCCR mRNA発現量は、DNAチップ及びリアルタイムPCRの両者で良好な一致を示していることから、本発明者の試験系が精度良く行われていることが示された。
<実施例5>DNAチップを利用した遺伝子発現の確認試験−2
試験方法:ロテノン、セサミン、またはエゾウコギ抽出物(ASH、MASH)を投与したルイス(Lewis)ラットを以下のように処理した。
ラットA群:予備飼育し、ゾンデを用いて、ASH(5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットB群:予備飼育し、ゾンデを用いて、セサミン(30mg/kg)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットC群:予備飼育し、ゾンデを用いて、ASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットD群:予備飼育し、ゾンデを用いて、MASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットE1群(陰性コントロール):予備飼育し、通常に8週間に渡って飼育した。
ラットE2群(陽性コントロール):予備飼育し、2週間して、ロテノン(3.5mg/kg)を一日一回、4週間に渡って腹腔内注射した。
これら6群(A群、B群、C群、D群、E1群及びE2群について、試験開始から6週間経過後に、ラットの黒質及び血液を採取した。黒質及び血液サンプルを各群毎に4叉は3例づつ混合した後、mRNAを抽出し、DNAチップによって発現遺伝子のプロフィールを検出した。DNAチップ試験には、競合法を用い、それぞれ(1)E1群(H2O)とE2群(ロテノン投与)、(2)E1群(H2O)とA群(ASH(5%)投与)(3)E1群とB群(セサミン投与:S30)、(4)E1群とC群(ASH(0.5%)投与)、及び(5)E1群とD群(MASH投与)の遺伝子発現プロフィールを比較検討した。
試験方法:ロテノン、セサミン、またはエゾウコギ抽出物(ASH、MASH)を投与したルイス(Lewis)ラットを以下のように処理した。
ラットA群:予備飼育し、ゾンデを用いて、ASH(5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットB群:予備飼育し、ゾンデを用いて、セサミン(30mg/kg)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットC群:予備飼育し、ゾンデを用いて、ASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットD群:予備飼育し、ゾンデを用いて、MASH(0.5%)を一日一回、6週間に渡って経口投与した。
ラットE1群(陰性コントロール):予備飼育し、通常に8週間に渡って飼育した。
ラットE2群(陽性コントロール):予備飼育し、2週間して、ロテノン(3.5mg/kg)を一日一回、4週間に渡って腹腔内注射した。
これら6群(A群、B群、C群、D群、E1群及びE2群について、試験開始から6週間経過後に、ラットの黒質及び血液を採取した。黒質及び血液サンプルを各群毎に4叉は3例づつ混合した後、mRNAを抽出し、DNAチップによって発現遺伝子のプロフィールを検出した。DNAチップ試験には、競合法を用い、それぞれ(1)E1群(H2O)とE2群(ロテノン投与)、(2)E1群(H2O)とA群(ASH(5%)投与)(3)E1群とB群(セサミン投与:S30)、(4)E1群とC群(ASH(0.5%)投与)、及び(5)E1群とD群(MASH投与)の遺伝子発現プロフィールを比較検討した。
なお、mRNAの抽出方法及び、DNAチップの処理方法は、ラットDNA chip(アジレント社製)に添付された説明書に基づいて行った。また、DNAチップのデータ読み取りにはマイクロアレイスキャナ(Affymetrix428 scanner:Affymetrix社製)を使用し、データ解析には、DNAsis array(日立ソフト社製)を使用した。また、リアルタイムPCR(real time PCR)には、Bio−Rad iCycler Real time PCR(Bio−RAD社製)を用いた。
表6には、全群の結果をまとめたデータを示した。表6中、「Lewis04」及び「Lewis03」は、それぞれ試験を行った時期と一群当りの個体数(N)が異なることを示している。すなわち、「Lewis04」と記載したA群、B群(及び、対応するE1群、E2群)については、2004年に5匹/群を用いた試験の結果を、「Lewis03」と記載したC群、D群(及び、対応するE1群、E2群)については、2003年に6匹/群を用いた試験の結果をそれぞれ示した。
本実施例の解析では、個々の遺伝子発現について、バックグラウンドデータを引くという標準化の操作を行った。表中の記号のうち、グループ(I)〜グループ(VI)の意味は次の通りである。
グループ(I)は、黒質において、各評価物質X(ASH(5%又は0.5%)、S30、またはMASH(0.5%))を投与したときにコントロールと比較して発現量が1.3以上に上昇し(第2発現量増加遺伝子群)、かつロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が1/1.3(=0.769)以下に減少したもの(第1発現量減少遺伝子群)において重複した第3の遺伝子群を意味する。
グループ(II)は、黒質において、各評価物質Xを投与したときにコントロールと比較して発現量が1/1.3(=0.769)以下に減少したもの(第2発現量減少遺伝子群)、かつロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が1.3以上に増加したもの(第1発現量増加遺伝子群)において重複した第4の遺伝子群を意味する。
本実施例の解析では、個々の遺伝子発現について、バックグラウンドデータを引くという標準化の操作を行った。表中の記号のうち、グループ(I)〜グループ(VI)の意味は次の通りである。
グループ(I)は、黒質において、各評価物質X(ASH(5%又は0.5%)、S30、またはMASH(0.5%))を投与したときにコントロールと比較して発現量が1.3以上に上昇し(第2発現量増加遺伝子群)、かつロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が1/1.3(=0.769)以下に減少したもの(第1発現量減少遺伝子群)において重複した第3の遺伝子群を意味する。
グループ(II)は、黒質において、各評価物質Xを投与したときにコントロールと比較して発現量が1/1.3(=0.769)以下に減少したもの(第2発現量減少遺伝子群)、かつロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が1.3以上に増加したもの(第1発現量増加遺伝子群)において重複した第4の遺伝子群を意味する。
グループ(III)は、グループ(I)のなかで、血液において、ロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が1/1.3(=0.769)以下に減少した血液検出可能遺伝子群を意味する。
グループ(IV)は、グループ(II)のなかで、血液において、ロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が1.3以上に増加した血液検出可能遺伝子群を意味する。
グループ(V)は、グループ(I)のなかで、血液において、各評価物質Xを投与したときにコントロールと比較して発現量が1.3以上に増加した血液検出可能遺伝子群を意味する。
また、グループ(VI)は、グループ(II)のなかで、各評価物質Xを投与したときにコントロールと比較して発現量が1/1.3(=0.769)以下に減少した血液検出可能遺伝子群を意味する。
グループ(IV)は、グループ(II)のなかで、血液において、ロテノンを投与してパーキンソン病を発生させたときにコントロールと比較して発現量が1.3以上に増加した血液検出可能遺伝子群を意味する。
グループ(V)は、グループ(I)のなかで、血液において、各評価物質Xを投与したときにコントロールと比較して発現量が1.3以上に増加した血液検出可能遺伝子群を意味する。
また、グループ(VI)は、グループ(II)のなかで、各評価物質Xを投与したときにコントロールと比較して発現量が1/1.3(=0.769)以下に減少した血液検出可能遺伝子群を意味する。
本実施例では、(A)バックグラウンドデータを考慮したデータの標準化操作に加え、(B)遺伝子のカットオフライン(コントロールと比較して、発現量が増加、または減少)を1.3以上、または1/1.3(=0.769)以下とした。このため、抽出される遺伝子数は減少したものの、その信頼度は向上し、更にリアルタイムPCRによる確認作業後の再現性が高められている。
表7には、上記グループ(III)〜グループ(VI)において、評価物質Xとして、ASH(5%、及び0.5%)、及びセサミン(S30)を投与したときに、両物質投与群で共に抽出された遺伝子数(上段)、またはASH及びMASHを投与したときに、両物質投与群で共に抽出された遺伝子数(下段)を示した。
表7には、上記グループ(III)〜グループ(VI)において、評価物質Xとして、ASH(5%、及び0.5%)、及びセサミン(S30)を投与したときに、両物質投与群で共に抽出された遺伝子数(上段)、またはASH及びMASHを投与したときに、両物質投与群で共に抽出された遺伝子数(下段)を示した。
また、表8〜表11には、表6において、評価物質X(ASH(5%)、S30、ASH(0.5%)、及びMASH(0.5%))を投与したときに、グループ(I)〜グループ(VI)として抽出された既知遺伝子のうち、パーキンソン病関連遺伝子(表中、( )内に示す数字)をまとめた。具体的には、表8にはASH(5%)投与群での遺伝子を、表9にはS30における遺伝子を、表11にはASH(0.5%)を、表12にはMASH(0.5%)をそれぞれ示した。なお、これらの遺伝子については、アクセションナンバー(AccessionNumber)に基づいて、塩基配列等を確認することができる。
各遺伝子として、現在知られているPD関連遺伝子が含まれていることから、本実施形態の方法が有効に疾患関連遺伝子群を抽出できることを示している。
各遺伝子として、現在知られているPD関連遺伝子が含まれていることから、本実施形態の方法が有効に疾患関連遺伝子群を抽出できることを示している。
なお、表中において、「unknown function」と記載された遺伝子数は、現段階において、名前も機能も同定されていない遺伝子である。つまり、「unknown function」は、未知の物質であるものの、パーキンソン病の発症に関連している可能性が高いものであることが予想できるものである。但し、未だクローニングされていないので、名前が存在せず、機能も不明である。しかし、別の方向からこの結果を見ると、パーキンソン病関連新規機能物質をクローニングする優先順位叉はクローニング候補を示していると考えられる。そして、これらの「unknown function」は、今後のパーキンソン病の治療のターゲット遺伝子となる可能性を秘めている。
実施例3では、黒質から抽出した遺伝子と血液から抽出した遺伝子との間で一致した遺伝子を評価した。本実施例においても、そのようにするのが良いと考えられた。しかし、その方法を用いると、本実施例のデータでは、数個の遺伝子しか抽出されなかった。そこで、黒質から抽出した遺伝子(実施例3と同じ方法。上記グループ(I)及びグループ(II)に相当する。)の状況を血液から抽出した遺伝子で確認することが出来れば良いと考えた。具体的には、グループ(III)では、グループ(I)で抽出された遺伝子のうち、血液で同じ動きをするR≦1/1.3の遺伝子数、グループ(IV)では、グループ(II)で抽出された遺伝子のうち、血液で同じ動きをするR≧1.3の遺伝子数を示した。これは、ロテノンという農薬が動物(ヒトも含む)の体内に入り、脳の神経機能を障害する効果をグループ(III)及びグループ(IV)の遺伝子を用いて末梢から容易に評価する(言い換えると、どれだけ農薬の影響を受けているのかを評価する)ことが可能であることを意味している。
グループ(V)では、グループ(I)で抽出された遺伝子のうち、血液で同じ動きをするX≧1.3の遺伝子数、グループ(VI)では、グループ(II)で抽出された遺伝子のうち、血液で同じ動きをするX≦1/1.3の遺伝子数を示した。これは、Xという生薬(エゾウコギ(ASH)、セサミン(S)、及び修治加工エゾウコギ(MASH))の抗パーキンソン病効果をグループ(V)及びグループ(VI)で抽出された遺伝子を用いて末梢から容易に評価することが可能であることを示している。
つまり、グループ(III)〜グループ(VI)の遺伝子の変動を観察することにより、そのヒトのPDの発症度合いとその生薬(機能性食品や医薬品)の効果の度合いを末梢血から評価できることを意味している。
本方法によれば、実施例3では抽出されなかった遺伝子も評価対象となり得るため、より的確な環境中の農薬暴露での脳機能の状況を把握できる。また、この方法では、その状況を改善あるいは予防できる機能性食品が判明することが、まさにテーラーメイド機能性食品であることを意味している。
つまり、グループ(III)〜グループ(VI)の遺伝子の変動を観察することにより、そのヒトのPDの発症度合いとその生薬(機能性食品や医薬品)の効果の度合いを末梢血から評価できることを意味している。
本方法によれば、実施例3では抽出されなかった遺伝子も評価対象となり得るため、より的確な環境中の農薬暴露での脳機能の状況を把握できる。また、この方法では、その状況を改善あるいは予防できる機能性食品が判明することが、まさにテーラーメイド機能性食品であることを意味している。
<まとめ>
本実施例によれば、非ヒトコントロール動物であるラットを用いて、パーキンソン病を発生させる処置(ロテノン投与)、またはパーキンソン病の発生を押さえる処置(エゾウコギ抽出物の投与)を行ったときの遺伝子発現プロフィールをDNAチップにより検出し、コントロール群と比べて増加または減少している遺伝子群を適宜選択することによって、パーキンソン病に関連する遺伝子群を抽出できた。
この方法は、その他の疾患(例えば、アルツハイマー病、生活習慣病等)に応用することが可能である。
また、この方法によって、抽出された疾患関連遺伝子群をDNAチップに適用することで、対象とする疾患に対する個々人のデータを容易に採取することができる。
本実施例によれば、非ヒトコントロール動物であるラットを用いて、パーキンソン病を発生させる処置(ロテノン投与)、またはパーキンソン病の発生を押さえる処置(エゾウコギ抽出物の投与)を行ったときの遺伝子発現プロフィールをDNAチップにより検出し、コントロール群と比べて増加または減少している遺伝子群を適宜選択することによって、パーキンソン病に関連する遺伝子群を抽出できた。
この方法は、その他の疾患(例えば、アルツハイマー病、生活習慣病等)に応用することが可能である。
また、この方法によって、抽出された疾患関連遺伝子群をDNAチップに適用することで、対象とする疾患に対する個々人のデータを容易に採取することができる。
Claims (5)
- (A)非ヒトコントロール動物から調製したコントロールmRNAと、前記コントロール動物に対象とする疾患を発生させた疾患動物から調製した疾患mRNAとに基づいて、DNAチップを利用して発現量の比較を行い、疾患mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも多い第1発現量増加遺伝子群と疾患mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも少ない第1発現量減少遺伝子群とを含む第1の遺伝子群を抽出する工程、(B)前記疾患を治療または予防できる処置を施した制御動物から調製した制御mRNAと、前記コントロールmRNAとに基づいて、DNAチップを利用して発現量の比較を行い、制御mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも多い第2発現量増加遺伝子群と制御mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも少ない第2発現量減少遺伝子群とを含む第2の遺伝子群を抽出する工程、(C)前記第1の遺伝子群と第2の遺伝子群とにおいて、互いに逆の傾向を示す遺伝子群である第1発現量減少遺伝子群と第2発現量増加遺伝子群との間で共通する第3の遺伝子群、及び第1発現量増加遺伝子群と第2発現量減少遺伝子群との間で共通する第4の遺伝子群を抽出する工程を備えたことを特徴とする遺伝子群の抽出方法。
- (A)非ヒトコントロール動物から調製したコントロールmRNAと、前記コントロール動物に所定の疾患を発生させた疾患動物から調製した疾患mRNAとに基づいて、DNAチップを利用して発現量の比較を行い、疾患mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも多い第1発現量増加遺伝子群と疾患mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも少ない第1発現量減少遺伝子群とを含む第1の遺伝子群を抽出する工程、(B)前記疾患を治療または予防できる処置を施した制御動物から調製した制御mRNAと、前記コントロールmRNAとに基づいて、DNAチップを利用して発現量の比較を行い、制御mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも多い第2発現量増加遺伝子群と制御mRNAにおける発現量がコントロールmRNAにおける発現量よりも少ない第2発現量減少遺伝子群とを含む第2の遺伝子群を抽出する工程、(D)前記第1発現量減少遺伝子群と前記第2発現量増加遺伝子群とを抽出する工程を備えたことを特徴とする遺伝子群の抽出方法。
- 請求項1または請求項2において、前記疾患がパーキンソン病であり、前記コントロールmRNA、疾患mRNA、及び制御mRNAが脳黒質から調製されたものであることを特徴とする遺伝子群の抽出方法。
- (1)対象とする疾患によって特異的な病変が生じる組織から調製されたmRNAを使用して前記(A)及び(B)の工程を経て、(C)または(D)の遺伝子群抽出工程を行い、
(2)血液から調製されたmRNAを使用して前記(A)及び(B)の工程を経て、(C)または(D)の遺伝子群抽出工程を行い、
前記(1)及び(2)の工程によって抽出された遺伝子群のうち重複する血液検出可能遺伝子群を抽出する工程を備えたことを特徴とする請求項1〜請求項3のいずれかに記載の遺伝子群の抽出方法。 - 請求項1〜請求項4のいずれかの方法によって抽出された遺伝子群を主として含むことを特徴とするDNAチップ。
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