JPWO2005080953A1

JPWO2005080953A1 - 尿糖バイオセンサ

Info

Publication number: JPWO2005080953A1
Application number: JP2006510213A
Authority: JP
Inventors: 正男後藤; 秀明中村; 小出　哲; 哲小出; 史代来栖; 征夫輕部
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2004-02-25
Filing date: 2005-02-17
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2025-02-17
Also published as: WO2005080953A1; JP4247844B2

Abstract

pH測定器のpH電極部またはその付近に、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼとメディエーターを含浸させた担体、あるいはグルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼとメディエーターを封入した袋体からなる反応体を設置した尿糖バイオセンサ。この尿糖バイオセンサは、担体または袋体中の試薬は１回毎に使い捨てるため、試薬を乾燥状態で保存しても酵素の構造変化が少なく、センサの特性も安定化するようになる。その結果、反応体およびpH測定器はいずれも携帯できることから、従来の測定機器のように、保存用の緩衝液を付帯することなく、いつでもどこでも尿糖の測定が可能である。

Description

本発明は、尿糖バイオセンサに関する。さらに詳しくは、尿中のグルコース濃度を測定する尿糖バイオセンサに関する。

正常尿中にもグルコースが微量に存在し、尿の基本的データは、尿のpHが平均値6.3(4.8〜7.5)、尿糖が40〜85mg／日、尿量が600〜1600ml／日、尿糖濃度正常値が2〜20mg/dlである。糖質代謝異常によって血糖値が上昇した場合、上記尿糖濃度も上がりそれは糖尿病とよばれ、一般に尿糖値が100〜150mg/dlは生活習慣改善の目安とされ、それ以上検出された場合は医師への相談が必要とされている。糖尿病は、失明、手足の切断、神経障害、腎臓疾患等の原因の第一位であり、尿糖値を容易に判別できればそれらの重大な疾患を防ぎやすくなり、尿糖測定の臨床的意義はこの点にあるといえる。

従来の尿糖バイオセンサとしては、グルコースオキシダーゼ(GOD)を固定化した膜と電極を一体とし、発生する過酸化水素を電極で酸化し、その電流値を測定するバイオセンサがある。

しかし、従来の尿糖バイオセンサは、電極と酵素を固定化した膜を一体とし、尿糖を何回も測定できる構造であり、溶液中で使用した後、次の使用まで乾燥状態でおくと、溶液・乾燥の繰り返しになり、電極、膜、酵素の状態が不安定になって、センサとしての信頼性を欠くことになることから、電極部と酵素固定化膜は安定性を考慮して、常に緩衝液に浸した状態で保存しなければならず、携帯性に課題があった。
特開平９−１５９６４５号公報

本発明の目的は、携帯性にすぐれ、尿糖の測定表示機能を有する尿糖バイオセンサを提供することにある。

かかる本発明の目的は、pH測定器のpH電極部またはその付近に、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼとメディエーターを含浸させた担体、あるいはグルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼとメディエーターを封入した袋体からなる反応体を設置した尿糖バイオセンサによって達成される。

担体または袋体中の試薬は１回毎に使い捨てるため、試薬を乾燥状態で保存しても酵素の構造変化が少なく、センサの特性も安定化するようになる。その結果、反応体およびpH測定器はいずれも携帯できることから、従来の測定機器のように、保存用の緩衝液を付帯することなく、いつでもどこでも尿糖の測定が可能である。また、pH測定器に予め入力されていた濃度またはこれに対応したデータにより、結果の表示の際、測定結果に対する説明や対処法が提供されるので、日常の健康状態を知ることができ、健康管理に役立てることができる。

実施例１で得られた結果を示すグラフである。実施例２で得られた結果を示すグラフである。実施例３で得られた結果を示すグラフである。実施例４で得られた結果を示すグラフである。実施例５で得られた結果を示すグラフである。

グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼとともに用いられるメディエーター(電子伝達体)としては、水溶性のフェリシアン化カリウム、フェロセン、パラベンゾキノンなどが用いられる。これらを用いた反応体の形成は、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼ133〜13250単位およびメディエーター3〜280mgを水0.1〜10mlに溶解したもの10〜1000μlを、デスペンサなどにより担体上に滴下し、乾燥して、試薬を担体に含浸させる方法または試薬を袋体中にパックして、試薬を袋体に封入する方法等によって行われる。このとき、試薬の安定性の観点から、好ましくは乾燥剤などが適宜パックされる。ここで、担体としては、ろ紙などの紙、不織布等が挙げられ、袋体としては、ろ紙などの紙、不織布等を袋状としたもの等が挙げられ、例えば市販されている紅茶用パック、だし用パック等をそのまま用いることができる。また、乾燥剤としてはシリカゲル、活性アルミナ、ゼオライト、塩化カルシウム等が用いられる。

この反応体を尿中に完全に浸漬または反応体の全体をおおうように尿がかけられると、尿中の尿糖は、反応体中のグルコースオキシダーゼとフェリシアン化カリウムの作用によりグルコン酸を発生させる。

このグルコン酸の発生をpH電極で検知することにより、間接的に尿糖濃度を測定することができる。グルコースデヒドロゲナーゼも、同様の反応機構でグルコン酸を発生させる。

pH測定器は、pHを測定するといった目的を達成しうるものであれば特に限定されないが、好ましくは携帯性のものが使用される。このような携帯型pHメーターとしては、市販品、例えば堀場製作所製品簡易pHメーター Twin pH B-211（ガラス電極）などがそのまま用いられる。pH電極は、ガラス電極またはイオン感応性電界効果型トランジスター（ＩＳＦＥＴ）が好ましい。

尿糖濃度の測定は、例えばpH電極部がスプーン状の容器の底部に設置されている場合、酵素とメディエーターを含浸させた担体、もしくは酵素とメディエーターを含む袋体を電極上に静置し、そこに上述した如く反応体に完全に尿をかけ、または反応体を尿に浸漬し、一定時間後のpHを測定することにより行われる。また、適当な容器に尿を採取し、次いでpH電極を尿中に入れ、そこに反応体を入れて一定時間後のpHを測定することもできる。

ここで、尿糖にグルコースオキシダーゼを作用させて生じるグルコン酸をpHにより測定可能であることは理論的に示されており、非特許文献１には、ｐH電極を用いてその表面に膜を用いて酵素を固定化し、グルコースバイオセンサとすることが示されているものの、実際にはpH変化が小さく実用化できるものではなかった。
Anal. Chem., 57, 1920 (1985)

本発明は、メディエーターを用いることにより、酵素の作用をメディエーターで増幅し、pH変化を大きくして、感度よくpH測定器で測定可能としたものである。すなわち、通常グルコースオキシダーゼが一種のメディエーターとして使用している溶存酸素は、水溶液中での濃度が8ppm程度であり、しかも変動するものであるのに対し、本発明においては人工的にメディエーターを高濃度の状態で供給することにより、溶存酸素濃度に依存せず、グルコン酸の発生量を多くして、pH電極で検知できるようにしたものである。グルコースデヒドロゲナーゼの場合には、溶存酸素に依存しないが、やはりメディエーターの作用により、グルコン酸の発生量を多くする働きがある。

ここでpH測定器本体の表示値であるpHに代えて、pH測定器本体にpHと尿糖濃度の関係を示す検量線を記憶させておき、尿糖濃度にかえて表示する計測機器とすることもできる。また、尿のpHは個人差、採取時の環境差があるため、初期pHに対応した検量線を本体に入れておくことにより、具体的には尿のpHを最初にpH測定器本体で検知し、次いで一定時間後のpH値をあらかじめpH測定器本体に記憶されていた初期pH毎の検量線に適用して尿糖濃度を表示することにより、このような個人差を解消することができる。

さらに表示内容としては、尿糖濃度の他に、尿糖濃度に対応した文章、単語、図形、記号、例えば「正常値です」などのよう文章を尿糖濃度とともに／または単独で表示することもできる。

また、pH測定器に無線または有線の通信機能を付加することにより、パソコンへのデータ格納、インターネット、携帯電話などを用いた病院への連絡なども可能となる。

実施例１
グルコースオキシダーゼ(シグマ社製品G-7016）1325単位、フェリシアン化カリウム(和光純薬工業製品)28mgを純水1mlに溶かした水溶液を調製し、この水溶液100μlを、1×1cmのろ紙(東洋濾紙製品定性ろ紙No.１)に滴下して浸み込ませ、冷蔵庫で一晩乾燥させて、担体とした。

コントロール尿(バイオ・ラッドラボラトリーズ社製品Quantitative Urine Control “Nomal”)に19.2、28.6、48.1、53、98および200.8mg/dlとなるようにグルコース(シグマ社製品)を加え、異なるグルコース濃度の尿標準サンプルを作成した。なお、すべての尿標準サンプルの初期pHは、6.1であった。

pH測定機器として、底部にpH電極が設置されている簡易pHメーター(堀場製作所製品Twin pH B-211)を用い、このサンプル採取部分(底部)に、上記担体を設置し、尿標準サンプルを400μl滴下した後、pH変化を30(●)、60(■)、120(□)、180(△)、240(×)、300(○)秒ごとに記録した。得られた結果は、図１に示される。このグラフより、120秒の測定値で検量性がみられることが確認された。

実施例２
実施例１において、グルコースオキシダーゼおよびフェリシアン化カリウムの試薬量が1.5倍に変更されて用いられた。得られた結果は、図２に示され、60秒後の測定値で検量性がみられることが確認された。

実施例３
実施例１において、グルコースオキシダーゼおよびフェリシアン化カリウムの試薬量が2倍に変更されて用いられた。得られた結果は、図３に示され、30秒後の測定値で検量性がみられることが確認された。

実施例４
実施例１において、グルコースオキシダーゼおよびフェリシアン化カリウムの試薬量が3倍に変更されて用いられた。得られた結果は、図４に示され、全体として60秒後には濃度毎のはっきりとした差が現われ、尿糖濃度を測定できることが判った。検量範囲は、約50から200mg／dlであった。

実施例５
実施例１において、担体の代わりにグルコースオキシダーゼ(G-7016)3975単位、フェリシアン化カリウム84mgを紅茶用パック(リプトン社製品)に封入したものが用いられた。得られた結果は、図５に示され、全体として60秒後には濃度ごとのはっきりとした差が現われ、尿糖濃度を測定できることが判った。検量範囲は約30から200mg／dlであった。

Claims

pH測定器のpH電極部またはその付近に、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼとメディエーターを含浸させた担体、あるいはグルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼとメディエーターを封入した袋体からなる反応体を設置した尿糖バイオセンサ。
グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼとメディエーターと共に乾燥剤が用いられた請求項１記載の尿糖バイオセンサ。
担体または袋体が紙または不織布である請求項１記載の尿糖バイオセンサ。
メディエーターがフェリシアン化カリウム、フェロセンまたはパラベンゾキノンである請求項１記載の尿糖バイオセンサ。
pH測定器の表示が尿糖濃度および／または尿糖濃度に対応した文章、単語、図形、記号である請求項１記載の尿糖バイオセンサ。
pH測定器として、尿の初期pHに基づく検量線を記憶させたものが用いられた請求項１記載の尿糖バイオセンサ。
水溶液としたグルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼとメディエーターを担体に滴下した後、乾燥させて含浸することを特徴とする請求項１記載の尿糖バイオセンサの製造方法。
pH電極がガラス電極またはイオン感応性電界効果型トランジスターである請求項１記載の尿糖バイオセンサ。
pH測定器に無線または有線の通信機能が付加された請求項１記載の尿糖バイオセンサ。