JPWO2005068621A1 - アパタイト粒子及びその作製方法、遺伝子複合体、並びに遺伝子導入方法 - Google Patents
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Abstract
無機リン酸を含む溶液にカルシウムイオン及びマグネシウムイオンを加えた混合溶液を所定時間インキュベートすると、マグネシウムイオン濃度に応じて得られるアパタイト粒子のサイズが小さくなる。マグネシウムイオン濃度やインキュベーション時間を適切に制御したアパタイト粒子を用いることで、細胞への遺伝子導入効率及び細胞内での遺伝子発現効率を上昇させることができる。
Description
本発明は、例えば細胞への遺伝子導入に用いて好適なアパタイト粒子及びその作製方法、遺伝子複合体、並びに遺伝子導入方法に関する。
本出願は、米国において２００３年１２月２６日に出願された米国仮出願第６０／５３２，８４５号を基礎として優先権を主張するものであり、この出願は参照することにより、本出願に援用される。
本出願は、米国において２００３年１２月２６日に出願された米国仮出願第６０／５３２，８４５号を基礎として優先権を主張するものであり、この出願は参照することにより、本出願に援用される。
細胞への遺伝子導入は、遺伝子の構造、機能或いは制御機構を解析する際に不可欠な技術である。また、この技術は、医療分野で重要となるタンパク質の産業ベースでの生産、遺伝子治療、或いはＤＮＡワクチンにおいても極めて重要である。
従来、細胞に遺伝子を導入する方法としては、例えばウイルスＤＮＡに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウイルスを生成して遺伝子導入を行うものが知られている。この方法は導入効率が極めて高いため、各種遺伝性疾患や後天性疾患に対する遺伝子治療のための画期的な方法として注目されている。しかしながら、このようなウイルスＤＮＡを用いた遺伝子導入では、ウイルスが広範囲の細胞に非特異的に感染するため、目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。また、ウイルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予期せぬ副作用を引き起こす可能性がある。そこで、このようなウイルスベクタを用いたウイルス系システムに代わる非ウイルス系システムの構築が望まれている。
既存の非ウイルス系システムとしては、リポソーム等の合成脂質、ポリ−Ｌ−リジン等のペプチド、ポリアミドアミン等のデンドリマ、ポリエチレンイミン等の他のポリマ、或いはリン酸カルシウムを用いる方法等が知られている。その中でもリン酸カルシウムを用いる方法は、無機リン酸とカルシウムイオンとによって形成されたアパタイト粒子がＤＮＡと複合体を形成して共沈し、その複合体がエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる現象に基づいており、遺伝子治療など、細胞への遺伝子導入に際して一般的に用いられている（例えば、文献１「Fasbender, A. et al, 1998,“Incorporation of Adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo.”, J. Clin. Invest., 102, p.184-193」、文献２「Toyoda, K. et al, 2000,“Calcium phosphate precipitates augmennt adenovirus-mediated gene transfer to blood vessels in vitro and in vivo.”, Gene Ther., 7, p.1284-1291」、文献３「Urabe, M. et al, 2000,“DNA/calcium phosphate mixed with media are stable and maintain high transfection efficiency.”, Anal. Biochem., 278, p.91-92」を参照。）。
ところで、このリン酸カルシウムを用いた遺伝子導入方法は現在一般的となっているが、遺伝子導入効率が低いことがin vitro 及びin vivo の両方において遺伝子発現の障壁となっている。これは、無機リン酸とカルシウムイオンとのインキュベーション時間が長くなるに従ってアパタイト粒子のサイズが大きくなり、細胞への取り込みが低下するためであると考えられている。そこで、文献４「Jordan, M. et al, 1996,“Transfecting mammalian cells: optimization of crytical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.”, Nucleic Acids Res., 24, p.596-601」では、インキュベーション時間を短くすることでアパタイト粒子のサイズを制御する技術が提案されている。しかしながら、この技術は、例えば多量のプラスミドＤＮＡを一度に細胞に導入するために多量のアパタイト粒子が必要な場合に適用することは困難であるという問題があった。
従来、細胞に遺伝子を導入する方法としては、例えばウイルスＤＮＡに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウイルスを生成して遺伝子導入を行うものが知られている。この方法は導入効率が極めて高いため、各種遺伝性疾患や後天性疾患に対する遺伝子治療のための画期的な方法として注目されている。しかしながら、このようなウイルスＤＮＡを用いた遺伝子導入では、ウイルスが広範囲の細胞に非特異的に感染するため、目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。また、ウイルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予期せぬ副作用を引き起こす可能性がある。そこで、このようなウイルスベクタを用いたウイルス系システムに代わる非ウイルス系システムの構築が望まれている。
既存の非ウイルス系システムとしては、リポソーム等の合成脂質、ポリ−Ｌ−リジン等のペプチド、ポリアミドアミン等のデンドリマ、ポリエチレンイミン等の他のポリマ、或いはリン酸カルシウムを用いる方法等が知られている。その中でもリン酸カルシウムを用いる方法は、無機リン酸とカルシウムイオンとによって形成されたアパタイト粒子がＤＮＡと複合体を形成して共沈し、その複合体がエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる現象に基づいており、遺伝子治療など、細胞への遺伝子導入に際して一般的に用いられている（例えば、文献１「Fasbender, A. et al, 1998,“Incorporation of Adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo.”, J. Clin. Invest., 102, p.184-193」、文献２「Toyoda, K. et al, 2000,“Calcium phosphate precipitates augmennt adenovirus-mediated gene transfer to blood vessels in vitro and in vivo.”, Gene Ther., 7, p.1284-1291」、文献３「Urabe, M. et al, 2000,“DNA/calcium phosphate mixed with media are stable and maintain high transfection efficiency.”, Anal. Biochem., 278, p.91-92」を参照。）。
ところで、このリン酸カルシウムを用いた遺伝子導入方法は現在一般的となっているが、遺伝子導入効率が低いことがin vitro 及びin vivo の両方において遺伝子発現の障壁となっている。これは、無機リン酸とカルシウムイオンとのインキュベーション時間が長くなるに従ってアパタイト粒子のサイズが大きくなり、細胞への取り込みが低下するためであると考えられている。そこで、文献４「Jordan, M. et al, 1996,“Transfecting mammalian cells: optimization of crytical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.”, Nucleic Acids Res., 24, p.596-601」では、インキュベーション時間を短くすることでアパタイト粒子のサイズを制御する技術が提案されている。しかしながら、この技術は、例えば多量のプラスミドＤＮＡを一度に細胞に導入するために多量のアパタイト粒子が必要な場合に適用することは困難であるという問題があった。
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、粒子サイズがナノサイズに抑えられ、細胞に対して高効率に遺伝子を導入し、発現させることが可能なアパタイト粒子及びその作製方法、そのアパタイト粒子と遺伝子とが結合した遺伝子複合体、並びにそのアパタイト粒子を用いた遺伝子導入方法を提供することを目的とする。
本件発明者等は、上述した目的を達成するために、様々な観点から鋭意研究を重ねてきた。その結果、無機リン酸とカルシウムイオンとによってアパタイト粒子を形成する際に、さらにマグネシウムイオンを加えると粒子サイズがナノサイズに抑えられ、そのアパタイト粒子を遺伝子導入に用いることで、細胞への遺伝子導入効率と細胞内での遺伝子発現効率とが上昇することを見出した。
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明に係るアパタイト粒子は、分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）、又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであることを特徴とする。
また、本発明に係るアパタイト粒子の作製方法は、無機リン酸、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含む混合溶液を所定時間インキュベートし、分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）、又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであるアパタイト粒子を作製することを特徴とする。
また、本発明に係る遺伝子複合体は、分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）、又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであるアパタイト粒子に所定の遺伝子が結合していることを特徴とする。
また、本発明に係る遺伝子導入方法は、分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであるアパタイト粒子と所定の遺伝子との複合体を特定細胞とインキュベートすることにより、上記所定の遺伝子を上記特定細胞に導入することを特徴とする。
このように、マグネシウムイオンを加えることでアパタイト粒子のサイズをナノサイズに抑えることができ、その結果、細胞への遺伝子導入効率と細胞内での遺伝子発現効率とが上昇する点については、これまで全く報告されたことがなく、本件発明者等によって初めて見出されたものである。
本発明のさらに他の目的、本発明によって得られる具体的な利点は、以下に説明される実施例の説明から一層明らかにされるであろう。
本件発明者等は、上述した目的を達成するために、様々な観点から鋭意研究を重ねてきた。その結果、無機リン酸とカルシウムイオンとによってアパタイト粒子を形成する際に、さらにマグネシウムイオンを加えると粒子サイズがナノサイズに抑えられ、そのアパタイト粒子を遺伝子導入に用いることで、細胞への遺伝子導入効率と細胞内での遺伝子発現効率とが上昇することを見出した。
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明に係るアパタイト粒子は、分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）、又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであることを特徴とする。
また、本発明に係るアパタイト粒子の作製方法は、無機リン酸、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含む混合溶液を所定時間インキュベートし、分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）、又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであるアパタイト粒子を作製することを特徴とする。
また、本発明に係る遺伝子複合体は、分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）、又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであるアパタイト粒子に所定の遺伝子が結合していることを特徴とする。
また、本発明に係る遺伝子導入方法は、分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであるアパタイト粒子と所定の遺伝子との複合体を特定細胞とインキュベートすることにより、上記所定の遺伝子を上記特定細胞に導入することを特徴とする。
このように、マグネシウムイオンを加えることでアパタイト粒子のサイズをナノサイズに抑えることができ、その結果、細胞への遺伝子導入効率と細胞内での遺伝子発現効率とが上昇する点については、これまで全く報告されたことがなく、本件発明者等によって初めて見出されたものである。
本発明のさらに他の目的、本発明によって得られる具体的な利点は、以下に説明される実施例の説明から一層明らかにされるであろう。
以下、本発明を適用した実施の形態について、具体的な実験結果を参照しながら詳細に説明する。
アパタイト粒子の作製
先ず、参考のため、マグネシウムイオンを含まない従来のアパタイト粒子を作製した。具体的には、０．７５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含むＨＢＳ（HEPES Buffered Saline）溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５）に塩化カルシウムを最終濃度が１２５ｍＭとなるように加え、室温でインキュベートすることによりアパタイト粒子を作製した。その後、アパタイト粒子の沈殿物を遠心分離によって回収し、脱イオン水で繰り返し洗浄して凍結乾燥した。
このアパタイト粒子のフーリエ変換赤外線スペクトル（Fourier transform-infrated spectrum；ＦＴ−ＩＲ）を図１に示し、Ｘ線回折パターンを図２に示す。フーリエ変換赤外線スペクトルはFT/IR-230（JASCO社製）を用いて測定し、Ｘ線回折パターンはM18XHF-SRA（Mac Sci.社製）を用いて測定した。図１に示す赤外線スペクトルは、ヒドロキシアパタイトが形成されていることを示している。なお、１０００〜１１００ｃｍ−１及び５５０〜６５０ｃｍ−１のピークは、リン酸に由来するものである。また、図２に示すＸ線回折パターンも、典型的なアパタイトの特徴を示している。
次に、マグネシウムイオンを含むアパタイト粒子を作製した。具体的には、最終濃度が０，２０，４０，６０，８０，１００，１２０，１４０ｍＭとなるようにＨＢＳ溶液に塩化マグネシウムを加えた他は、上述と同様にしてアパタイト粒子を作製した。０，２０，４０，６０，８０，１００，１２０，１４０ｍＭの塩化マグネシウムを加えて得られたアパタイト粒子をそれぞれサンプル１，２，３，４，５，６，７，８とする。 各サンプルの元素分析結果を以下の表１，２に示す。なお、表１は各サンプル中におけるＭｇ、Ｃａ、Ｐの質量比を示したものであり、表２は同じくモル比を示したものである。Ｍｇ、Ｃａ、Ｐの量はSeiko SPS 1500VR 原子吸収分光測定器（Seiko社製）を用いて測定した。
表１に示すように、加えたマグネシウムイオンの濃度が増加するに従って、アパタイト粒子中のＭｇの量が最大で約３％まで増加し、同時にＣａの量が減少した。しかしながら、Ｐの量はほぼ一定であり、サンプル１〜３では約１２％、サンプル４〜８では約１６％であった。このことは、作製されたアパタイト粒子が２つのタイプからなることを示している。さらに、表２を参照することで、サンプル１〜３は分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）の構造をとるアパタイト粒子の集合であり、サンプル４〜８は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）のＯＣＰ（OctaCalcium Phosphate）型構造をとるアパタイト粒子の集合であることが判明した。すなわち、高濃度のマグネシウムイオンの存在により、ＯＣＰ型のアパタイト粒子の形成が促進されることが示された。
粒子の成長速度及びサイズの制御
続いて、マグネシウムイオンを加えることによるアパタイト粒子の成長速度の制御について検討した。ここで、粒子分散液の濁度を測定することで、過飽和溶液中におけるアパタイト核形成と時間依存的な粒子成長とを解析することができるため（上記文献４参照）、粒子分散液の濁度を測定した。具体的には、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含む３００μｌの２倍濃度ＨＢＳ溶液（ｐＨ７．０５）と２５０ｍＭ 塩化カルシウム及び０〜２８０ｍＭ 塩化マグネシウムを含む３００μｌの純水とを混合して粒子分散液を生成し、この粒子分散液の３２０ｎｍにおける濁度変化を１〜３０分間に亘って測定した。測定にはSmartSpecTM 3000（Bio-Rad社製）を用いた。
粒子分散液の濁度変化を図３に示す。図３に示すように、混合してから１分後の粒子分散液では、マグネシウムイオン濃度が増加するに従って濁度が低下した。これは、マグネシウムイオンの存在により粒子の成長が抑制されることを示している。さらに、５〜３０分間インキュベーションを続けると、マグネシウムイオン濃度の増加に従って濁度が上昇し、そして低下する様相を呈した。これは、マグネシウムイオン濃度を２０〜６０ｍＭと増加させることで、インキュベーション時間に依存して沈澱反応がより促進され、その結果、粒子数の増加によって濁度の上昇が引き起こされ、マグネシウムイオン濃度を８０〜１４０ｍＭとさらに増加させることで、粒子の成長が阻害されたためと説明できる。
続いて、マグネシウムイオンを加えることで粒子の成長が抑制され、粒子サイズの増大も抑制されるということをより明確に理解するため、粒子の成長段階におけるサイズ変化を観察した。具体的には、粒子の成長段階（１〜３０分間）における平均粒子直径を動的光散乱分光光度計（Photal, Otsuka Electronics社製）を用いて７５ｍＷ Ａｒレーザで見積もった。
アパタイト粒子のサイズ変化を図４に示す。図４に示すように、粒子形成開始から１〜３０分間の範囲では、マグネシウムイオン濃度を増加させることで、マイクロサイズからナノサイズへと粒子直径が小さくなることが分かる。
この図３，４から、粒子の成長速度に関する明確且つ信頼できる予測を行うことができる、すなわち、より高濃度のマグネシウムイオンが粒子に取り込まれることにより、粒子の成長がよりゆっくりとしたものに変化し、さらに粒子サイズがナノサイズに抑えられると予測できる。マグネシウムイオンによる粒子成長抑制効果は、アパタイト粒子中のカルシウムイオンがマグネシウムイオンに置き換わることによってヒドロキシアパタイトの分子構造に歪みが生じた結果と説明できる。
アパタイト粒子を用いて送達されたＤＮＡの細胞への取り込み
粒子の直径は、細胞への遺伝子導入において非常に重要な因子である。サイズの小さい粒子では遺伝子が効率的に送達されるが、急速に成長し、サイズが増大した粒子では（図４参照）、細胞への遺伝子送達と細胞内での遺伝子発現とが大きく阻害される。ここで、本実施の形態におけるアパタイト粒子では、粒子の成長と粒子サイズとを望ましいレベルでコントロールできるため、このアパタイト粒子を用いた細胞へのＤＮＡ送達を検討した。
具体的には、先ず、ＨｅＬａ細胞を７５ｃｍ２のボトルフラスコ内の培地中で５％ ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。培地としては、１０％ ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）、５０μｇ／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、及び１００μｇ／ｍｌ ネオマイシンを含むＤＭＥＭ（Dulbecco Modified Eagle Medium）培地（Gibco社製）を用いた。そして、ＤＮＡを導入する前日に、増殖過程に同調させた細胞を２４ウェルのシャーレ中に５００００個／ウェルとなるように播種し、５０％コンフルエントの状態で培養した。
続いて、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含む３００μｌの２倍濃度ＨＢＳ溶液（ｐＨ７．０５）と、６μｇのＰＩ（蛍光プローブ）をインターカレータとした６μｇのＤＮＡ（ＰＩとＤＮＡとの重量比＝１：１）、２５０ｍＭ 塩化カルシウム及び０〜２８０ｍＭ 塩化マグネシウムを含む３００μｌの純水とを混合し、１〜３０分間のインキュベーションの後、各１００μｌをサンプリングした。そして、サンプリングした粒子溶液を１０％の血清を含有した培地１ｍｌ中に添加し、３７℃で４時間インキュベーションした後、細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）溶液で洗浄し、蛍光観察を行った。
蛍光観察結果を図５に示す。図５中のスケールバーは５０μｍである。図５に示すように、マグネシウムイオンを加えていないアパタイト粒子を用いた場合、細胞へのＤＮＡの取り込みは非効率的であり、さらに、粒子の成長により、時間経過に従って取り込みが最低レベルまで減少した。一方、粒子の成長を十分に抑制することが可能な濃度（図４参照）のマグネシウムイオンを加えたアパタイト粒子を用いた場合、細胞の内部でＰＩラベルされたＤＮＡの強い蛍光が観察された。すなわち、マグネシウムイオンの存在により粒子の成長が抑制された結果、ＤＮＡとアパタイト粒子との複合体が効率的にエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれることが明らかになった。なお、より高濃度のマグネシウムイオンを加えて作製したアパタイト粒子を用いた場合に、細胞へのＤＮＡの取り込みが低下したのは、マグネシウムイオンが多くなることで、沈澱反応が発生するレベルのアパタイト粒子が形成されなくなったことに起因すると考えられる。
アパタイト粒子を用いて送達された遺伝子の細胞内での発現
最後に、本実施の形態におけるアパタイト粒子を用いてルシフェラーゼ遺伝子を細胞に導入した場合における細胞内での遺伝子発現状況について検討した。
具体的には、先ず、ＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞のそれぞれを７５ｃｍ２のボトルフラスコ内の培地中で５％ ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。培地としては、１０％ ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、及び１００μｇ／ｍｌ ネオマイシンを含むＤＭＥＭ培地（Gibco社製）を用いた。そして、ＤＮＡを導入する前日に、増殖過程に同調させた細胞を２４ウェルのシャーレ中に５００００個／ウェルとなるように播種し、５０％コンフルエントの状態で培養した。
続いて、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含む３００μｌの２倍濃度ＨＢＳ溶液（ｐＨ７．０５）と、６μｇのＰＩをインターカレータとしたルシフェラーゼ遺伝子（pGL3, Promega社製）を含む６μｇのプラスミドＤＮＡ（ＰＩとＤＮＡとの重量比＝１：１）、２５０ｍＭ 塩化カルシウム及び０〜２８０ｍＭ 塩化マグネシウムを含む３００μｌの純水とを混合し、１〜３０分間のインキュベーションの後、各１００μｌをサンプリングした。そして、サンプリングした粒子溶液を１０％の血清を含有した培地１ｍｌ中に添加し、３７℃で４時間インキュベーションした後、新鮮な培地に交換して、さらに１日培養を継続した。その後、ＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況をコマーシャルキット（Promega社製）と光量子カウンタ（TD-20/20 Luminometer, Promega社製）とを用いて確認した。
ＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況をそれぞれ図６，７に示す。この図６，７は、遺伝子導入実験を３回行い、遺伝子発現効率を細胞タンパク質１ｍｇ当たりの平均発光量で表したものである。図６，７に示すように、マグネシウムイオンを加えたアパタイト粒子を用いた場合には、マグネシウムイオンを加えていないアパタイト粒子を用いた場合と比較して、マグネシウムイオンの濃度、インキュベーション時間、細胞の種類に依存して、少なくとも１０〜１００倍高い遺伝子発現が観察された。このように、遺伝子導入効率が高いのは、適切な濃度のマグネシウムイオンを加えることでアパタイト粒子の成長を効果的に抑制し、粒子サイズをナノサイズに抑えることができるためである。
なお、マグネシウムイオン濃度はインキュベーション時間、細胞の種類に応じて設定することが望ましい。例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞の場合、図７から分かるように、インキュベーション時間が１分間、５分間、１０分間、３０分間の場合には、それぞれマグネシウムイオン濃度を４０ｍＭ、６０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭとすることが望ましい。図４から分かるように、マグネシウムイオン濃度が４０ｍＭでインキュベーション時間が１分間の場合には粒子直径が約２５０ｎｍのアパタイト粒子が得られ、マグネシウムイオン濃度が６０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭでインキュベーション時間が５分間、１０分間、３０分間の場合には粒子直径がそれぞれ約４００ｎｍのアパタイト粒子が得られる。粒子直径としては３０ｎｍ乃至２５００ｎｍとすることが遺伝子導入効率及び遺伝子発現効率の観点から好ましく、より好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍである。
以上、具体的な実験結果を参照しながら本発明を実施するための最良の形態について説明したが、本発明は、図面を参照して説明した上述の実施例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲及びその主旨を逸脱することなく、様々な変更、置換又はその同等のものを行うことができることは当業者にとって明らかである。
アパタイト粒子の作製
先ず、参考のため、マグネシウムイオンを含まない従来のアパタイト粒子を作製した。具体的には、０．７５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含むＨＢＳ（HEPES Buffered Saline）溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５）に塩化カルシウムを最終濃度が１２５ｍＭとなるように加え、室温でインキュベートすることによりアパタイト粒子を作製した。その後、アパタイト粒子の沈殿物を遠心分離によって回収し、脱イオン水で繰り返し洗浄して凍結乾燥した。
このアパタイト粒子のフーリエ変換赤外線スペクトル（Fourier transform-infrated spectrum；ＦＴ−ＩＲ）を図１に示し、Ｘ線回折パターンを図２に示す。フーリエ変換赤外線スペクトルはFT/IR-230（JASCO社製）を用いて測定し、Ｘ線回折パターンはM18XHF-SRA（Mac Sci.社製）を用いて測定した。図１に示す赤外線スペクトルは、ヒドロキシアパタイトが形成されていることを示している。なお、１０００〜１１００ｃｍ−１及び５５０〜６５０ｃｍ−１のピークは、リン酸に由来するものである。また、図２に示すＸ線回折パターンも、典型的なアパタイトの特徴を示している。
次に、マグネシウムイオンを含むアパタイト粒子を作製した。具体的には、最終濃度が０，２０，４０，６０，８０，１００，１２０，１４０ｍＭとなるようにＨＢＳ溶液に塩化マグネシウムを加えた他は、上述と同様にしてアパタイト粒子を作製した。０，２０，４０，６０，８０，１００，１２０，１４０ｍＭの塩化マグネシウムを加えて得られたアパタイト粒子をそれぞれサンプル１，２，３，４，５，６，７，８とする。 各サンプルの元素分析結果を以下の表１，２に示す。なお、表１は各サンプル中におけるＭｇ、Ｃａ、Ｐの質量比を示したものであり、表２は同じくモル比を示したものである。Ｍｇ、Ｃａ、Ｐの量はSeiko SPS 1500VR 原子吸収分光測定器（Seiko社製）を用いて測定した。
表１に示すように、加えたマグネシウムイオンの濃度が増加するに従って、アパタイト粒子中のＭｇの量が最大で約３％まで増加し、同時にＣａの量が減少した。しかしながら、Ｐの量はほぼ一定であり、サンプル１〜３では約１２％、サンプル４〜８では約１６％であった。このことは、作製されたアパタイト粒子が２つのタイプからなることを示している。さらに、表２を参照することで、サンプル１〜３は分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）の構造をとるアパタイト粒子の集合であり、サンプル４〜８は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）のＯＣＰ（OctaCalcium Phosphate）型構造をとるアパタイト粒子の集合であることが判明した。すなわち、高濃度のマグネシウムイオンの存在により、ＯＣＰ型のアパタイト粒子の形成が促進されることが示された。
粒子の成長速度及びサイズの制御
続いて、マグネシウムイオンを加えることによるアパタイト粒子の成長速度の制御について検討した。ここで、粒子分散液の濁度を測定することで、過飽和溶液中におけるアパタイト核形成と時間依存的な粒子成長とを解析することができるため（上記文献４参照）、粒子分散液の濁度を測定した。具体的には、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含む３００μｌの２倍濃度ＨＢＳ溶液（ｐＨ７．０５）と２５０ｍＭ 塩化カルシウム及び０〜２８０ｍＭ 塩化マグネシウムを含む３００μｌの純水とを混合して粒子分散液を生成し、この粒子分散液の３２０ｎｍにおける濁度変化を１〜３０分間に亘って測定した。測定にはSmartSpecTM 3000（Bio-Rad社製）を用いた。
粒子分散液の濁度変化を図３に示す。図３に示すように、混合してから１分後の粒子分散液では、マグネシウムイオン濃度が増加するに従って濁度が低下した。これは、マグネシウムイオンの存在により粒子の成長が抑制されることを示している。さらに、５〜３０分間インキュベーションを続けると、マグネシウムイオン濃度の増加に従って濁度が上昇し、そして低下する様相を呈した。これは、マグネシウムイオン濃度を２０〜６０ｍＭと増加させることで、インキュベーション時間に依存して沈澱反応がより促進され、その結果、粒子数の増加によって濁度の上昇が引き起こされ、マグネシウムイオン濃度を８０〜１４０ｍＭとさらに増加させることで、粒子の成長が阻害されたためと説明できる。
続いて、マグネシウムイオンを加えることで粒子の成長が抑制され、粒子サイズの増大も抑制されるということをより明確に理解するため、粒子の成長段階におけるサイズ変化を観察した。具体的には、粒子の成長段階（１〜３０分間）における平均粒子直径を動的光散乱分光光度計（Photal, Otsuka Electronics社製）を用いて７５ｍＷ Ａｒレーザで見積もった。
アパタイト粒子のサイズ変化を図４に示す。図４に示すように、粒子形成開始から１〜３０分間の範囲では、マグネシウムイオン濃度を増加させることで、マイクロサイズからナノサイズへと粒子直径が小さくなることが分かる。
この図３，４から、粒子の成長速度に関する明確且つ信頼できる予測を行うことができる、すなわち、より高濃度のマグネシウムイオンが粒子に取り込まれることにより、粒子の成長がよりゆっくりとしたものに変化し、さらに粒子サイズがナノサイズに抑えられると予測できる。マグネシウムイオンによる粒子成長抑制効果は、アパタイト粒子中のカルシウムイオンがマグネシウムイオンに置き換わることによってヒドロキシアパタイトの分子構造に歪みが生じた結果と説明できる。
アパタイト粒子を用いて送達されたＤＮＡの細胞への取り込み
粒子の直径は、細胞への遺伝子導入において非常に重要な因子である。サイズの小さい粒子では遺伝子が効率的に送達されるが、急速に成長し、サイズが増大した粒子では（図４参照）、細胞への遺伝子送達と細胞内での遺伝子発現とが大きく阻害される。ここで、本実施の形態におけるアパタイト粒子では、粒子の成長と粒子サイズとを望ましいレベルでコントロールできるため、このアパタイト粒子を用いた細胞へのＤＮＡ送達を検討した。
具体的には、先ず、ＨｅＬａ細胞を７５ｃｍ２のボトルフラスコ内の培地中で５％ ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。培地としては、１０％ ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）、５０μｇ／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、及び１００μｇ／ｍｌ ネオマイシンを含むＤＭＥＭ（Dulbecco Modified Eagle Medium）培地（Gibco社製）を用いた。そして、ＤＮＡを導入する前日に、増殖過程に同調させた細胞を２４ウェルのシャーレ中に５００００個／ウェルとなるように播種し、５０％コンフルエントの状態で培養した。
続いて、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含む３００μｌの２倍濃度ＨＢＳ溶液（ｐＨ７．０５）と、６μｇのＰＩ（蛍光プローブ）をインターカレータとした６μｇのＤＮＡ（ＰＩとＤＮＡとの重量比＝１：１）、２５０ｍＭ 塩化カルシウム及び０〜２８０ｍＭ 塩化マグネシウムを含む３００μｌの純水とを混合し、１〜３０分間のインキュベーションの後、各１００μｌをサンプリングした。そして、サンプリングした粒子溶液を１０％の血清を含有した培地１ｍｌ中に添加し、３７℃で４時間インキュベーションした後、細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）溶液で洗浄し、蛍光観察を行った。
蛍光観察結果を図５に示す。図５中のスケールバーは５０μｍである。図５に示すように、マグネシウムイオンを加えていないアパタイト粒子を用いた場合、細胞へのＤＮＡの取り込みは非効率的であり、さらに、粒子の成長により、時間経過に従って取り込みが最低レベルまで減少した。一方、粒子の成長を十分に抑制することが可能な濃度（図４参照）のマグネシウムイオンを加えたアパタイト粒子を用いた場合、細胞の内部でＰＩラベルされたＤＮＡの強い蛍光が観察された。すなわち、マグネシウムイオンの存在により粒子の成長が抑制された結果、ＤＮＡとアパタイト粒子との複合体が効率的にエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれることが明らかになった。なお、より高濃度のマグネシウムイオンを加えて作製したアパタイト粒子を用いた場合に、細胞へのＤＮＡの取り込みが低下したのは、マグネシウムイオンが多くなることで、沈澱反応が発生するレベルのアパタイト粒子が形成されなくなったことに起因すると考えられる。
アパタイト粒子を用いて送達された遺伝子の細胞内での発現
最後に、本実施の形態におけるアパタイト粒子を用いてルシフェラーゼ遺伝子を細胞に導入した場合における細胞内での遺伝子発現状況について検討した。
具体的には、先ず、ＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞のそれぞれを７５ｃｍ２のボトルフラスコ内の培地中で５％ ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。培地としては、１０％ ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、及び１００μｇ／ｍｌ ネオマイシンを含むＤＭＥＭ培地（Gibco社製）を用いた。そして、ＤＮＡを導入する前日に、増殖過程に同調させた細胞を２４ウェルのシャーレ中に５００００個／ウェルとなるように播種し、５０％コンフルエントの状態で培養した。
続いて、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏを含む３００μｌの２倍濃度ＨＢＳ溶液（ｐＨ７．０５）と、６μｇのＰＩをインターカレータとしたルシフェラーゼ遺伝子（pGL3, Promega社製）を含む６μｇのプラスミドＤＮＡ（ＰＩとＤＮＡとの重量比＝１：１）、２５０ｍＭ 塩化カルシウム及び０〜２８０ｍＭ 塩化マグネシウムを含む３００μｌの純水とを混合し、１〜３０分間のインキュベーションの後、各１００μｌをサンプリングした。そして、サンプリングした粒子溶液を１０％の血清を含有した培地１ｍｌ中に添加し、３７℃で４時間インキュベーションした後、新鮮な培地に交換して、さらに１日培養を継続した。その後、ＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況をコマーシャルキット（Promega社製）と光量子カウンタ（TD-20/20 Luminometer, Promega社製）とを用いて確認した。
ＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況をそれぞれ図６，７に示す。この図６，７は、遺伝子導入実験を３回行い、遺伝子発現効率を細胞タンパク質１ｍｇ当たりの平均発光量で表したものである。図６，７に示すように、マグネシウムイオンを加えたアパタイト粒子を用いた場合には、マグネシウムイオンを加えていないアパタイト粒子を用いた場合と比較して、マグネシウムイオンの濃度、インキュベーション時間、細胞の種類に依存して、少なくとも１０〜１００倍高い遺伝子発現が観察された。このように、遺伝子導入効率が高いのは、適切な濃度のマグネシウムイオンを加えることでアパタイト粒子の成長を効果的に抑制し、粒子サイズをナノサイズに抑えることができるためである。
なお、マグネシウムイオン濃度はインキュベーション時間、細胞の種類に応じて設定することが望ましい。例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞の場合、図７から分かるように、インキュベーション時間が１分間、５分間、１０分間、３０分間の場合には、それぞれマグネシウムイオン濃度を４０ｍＭ、６０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭとすることが望ましい。図４から分かるように、マグネシウムイオン濃度が４０ｍＭでインキュベーション時間が１分間の場合には粒子直径が約２５０ｎｍのアパタイト粒子が得られ、マグネシウムイオン濃度が６０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭでインキュベーション時間が５分間、１０分間、３０分間の場合には粒子直径がそれぞれ約４００ｎｍのアパタイト粒子が得られる。粒子直径としては３０ｎｍ乃至２５００ｎｍとすることが遺伝子導入効率及び遺伝子発現効率の観点から好ましく、より好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍである。
以上、具体的な実験結果を参照しながら本発明を実施するための最良の形態について説明したが、本発明は、図面を参照して説明した上述の実施例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲及びその主旨を逸脱することなく、様々な変更、置換又はその同等のものを行うことができることは当業者にとって明らかである。
上述した本発明によれば、粒子サイズがナノサイズに抑えられたアパタイト粒子を得ることができるため、このアパタイト粒子を遺伝子と結合させることで、細胞に高効率に遺伝子を導入し、発現させることができる。
Claims (4)
- １．分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであることを特徴とするアパタイト粒子。
- ２．無機リン酸、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含む混合溶液を所定時間インキュベートし、分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであるアパタイト粒子を作製することを特徴とするアパタイト粒子の作製方法。
- ３．分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであるアパタイト粒子に所定の遺伝子が結合していることを特徴とする遺伝子複合体。
- ４．分子式Ｃａ１０−ｘＭｇｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２（ｘ＝１，２，・・・，９）又は分子式Ｃａ８−ｘＭｇｘＨ２（ＰＯ４)６（ｘ＝１，２，・・・，７）で表され、粒子直径が３０ｎｍ乃至２５００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ乃至１０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ乃至３００ｎｍであるアパタイト粒子と所定の遺伝子との複合体を特定細胞とインキュベートすることにより、上記所定の遺伝子を上記特定細胞に導入することを特徴とする遺伝子導入方法。
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