JPWO2005062047A1 - 生体試料の分析方法、反応液、及び分析装置 - Google Patents
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Abstract
２種類以上の生体試料を合成し、合成された生体試料に、種類別に波長の異なる標識を付加し、それらの標識を検出することにより、生体試料を分析する。この分析において、生体試料の標識の検出強度を、生体試料の種類別に調整し、特に検出される標識のうち、波長帯域が他方の標識に影響を及ぼす度合いの大きい方の検出強度を弱める。具体的態様としては、２種類以上の生体試料を合成し、その合成に用いる物質（合成用物質）に、種類別に波長の異なる標識を付加するか或いは標識結合用媒体を付加することにより、生体試料を合成過程或いは合成後に標識化する。そして、少なくとも或る一種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体の量（付加率）を、他の種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体よりも少なくなるように調整して、生体試料を標識化する。このようにすれば、核酸などの生体試料の分析において、同時に複数種の標識を測定しても、標識同士の波長帯域の重なりを抑制して、定性は勿論のこと定量分析も精度良く行い得る。
Description
本発明は、生化学、分子生物学、医療分野などにおいて、診断，検査および研究に用いられる生体試料の分析方法、反応液、及び分析装置に関する。
微量の生体試料、主に核酸、タンパク質等を検出するための技術として、合成後または精製後のターゲットとなる生体試料を、蛍光体、発光体または放射性同位体で標識し、定性，定量等の分析をすることが行なわれている。
核酸の標識法として、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法において合成された標的核酸に、合成過程或いは合成後において蛍光体、発光体および放射性同位体で標識する技術が周知である。
例えば、ビオチンやジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を付加したプライマーを用いて増幅反応を行い、増幅（合成）後の核酸産物にビオチンやジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を介して蛍光体、発光体および放射性同位体等の標識を付加したり、或いは、合成後の核酸をアルカリフォスファターゼで処理後、放射性同位体のリン酸を付加することが知られている。
上記のような標識を付加した生体試料の検出法の中でも、特に蛍光体および発光体を用いた検出法は、近年開発が進み、検出を行うためのキットが販売されるなど簡便な方法となり、生体試料の高感度分析法として、感染症や遺伝病、ガンの診断などに利用されている。
さらに、現在では、標識として用いられている化学物質の開発や、分析装置の改良により、ごく微量の標識された生体試料でも検出が可能となっている。
また、（１）標識となる化学物質は、各々固有の波長帯を持っているため、複数種の生体試料に、種別ごとに異なる波長の標識を付加すれば、それらの波長スペクトルを同時に測定することにより、複数種の生体試料を１回の反応で同時に検出することができる。
特開平９−３２９５４９号公報には、核酸の塩基配列を検出する技術に関し、特に、一試料中の複数分析対象物（例えば、ＰＣＲ法による核酸生成物）を識別可能な複数種類の蛍光染料で標識し、試料を分離（例えばゲル電気泳動による分離）した後、複数の標的となる核酸を同時に検出する技術が開示されている。
また、（２）特開平５−１１８９９１号公報には、２種類の蛍光体の混合物（組合せ）を標識として使用し、これらの蛍光体の混合比率を変えることにより４種の標識を生成し、これらの標識を利用して４種の核酸（塩基配列）を判別する塩基配列検出方法が開示されている。ここで、４種の核酸に付加された標識（第１の蛍光体と第２の蛍光体の混合比率）は、核酸を種別ごとに分離した後（例えばゲル電気泳動法による分離）に、各核酸から励起される第１の蛍光体と第２の蛍光体の強度比を求めることにより（この強度比は、第１，第２の蛍光体の蛍光強度を２つの検出器により検出することで求まる）検出される。その強度比に基づき４種の核酸を判別している。核酸に標識される蛍光体の混合比率は、ＰＣＲ法による核酸生成に際し、第１の蛍光体を修飾したプライマー（或いはターミネータ）と第２の蛍光体を修飾したプライマー（或いはターミネータ）との混合比率を調整することにより、変えている。
上記した従来技術のうち、後者すなわち（２）の方式は塩基配列決定のような定性的な分析方法に適している。
複数種の生体試料（例えば標的核酸）を、同時に定量分析を可能にするには、前者すなわち（１）の方式を用いることが有効である。例えば、異なる波長の標識（例えば蛍光体）を標的試料の種類別に付加し、分離した標的試料の蛍光強度（スペクトル）を検出する方法が適している。この方法は、定性分析も可能である。
しかし、（１）の方式では、標識に用いる蛍光体、発光体等は、単一の波長ではなくピークの波長を中心にスロープ状の広がりをもった波長帯域を有するので、複数の検出試料の波長（標識）が近接すると、波長帯域の一部が重なる。それによって、検出される標識の強度に他の標識が影響を及ぼし、定量精度が低下するおそれがある。
このような問題を解消するためには、検出試料の波長帯が重ならないように標識を選択すればよいが、そのような標識はなかなか存在せず、選択に限度があった。また、検出の際にも、その波長の重なりの影響を最小限にするため、計算による補正などが必要とされる。
本発明は、これらの課題を解決することにより、多くの種類の標識（蛍光体、発光体、または放射性同位体）を使用可能にし、かつ、同時に複数種の標識を測定しても、標識同士の波長帯域の重なりを抑制して、定性は勿論のこと定量分析も精度良く行い得る分析方法、反応液、および分析装置を提供する。
核酸の標識法として、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法において合成された標的核酸に、合成過程或いは合成後において蛍光体、発光体および放射性同位体で標識する技術が周知である。
例えば、ビオチンやジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を付加したプライマーを用いて増幅反応を行い、増幅（合成）後の核酸産物にビオチンやジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を介して蛍光体、発光体および放射性同位体等の標識を付加したり、或いは、合成後の核酸をアルカリフォスファターゼで処理後、放射性同位体のリン酸を付加することが知られている。
上記のような標識を付加した生体試料の検出法の中でも、特に蛍光体および発光体を用いた検出法は、近年開発が進み、検出を行うためのキットが販売されるなど簡便な方法となり、生体試料の高感度分析法として、感染症や遺伝病、ガンの診断などに利用されている。
さらに、現在では、標識として用いられている化学物質の開発や、分析装置の改良により、ごく微量の標識された生体試料でも検出が可能となっている。
また、（１）標識となる化学物質は、各々固有の波長帯を持っているため、複数種の生体試料に、種別ごとに異なる波長の標識を付加すれば、それらの波長スペクトルを同時に測定することにより、複数種の生体試料を１回の反応で同時に検出することができる。
特開平９−３２９５４９号公報には、核酸の塩基配列を検出する技術に関し、特に、一試料中の複数分析対象物（例えば、ＰＣＲ法による核酸生成物）を識別可能な複数種類の蛍光染料で標識し、試料を分離（例えばゲル電気泳動による分離）した後、複数の標的となる核酸を同時に検出する技術が開示されている。
また、（２）特開平５−１１８９９１号公報には、２種類の蛍光体の混合物（組合せ）を標識として使用し、これらの蛍光体の混合比率を変えることにより４種の標識を生成し、これらの標識を利用して４種の核酸（塩基配列）を判別する塩基配列検出方法が開示されている。ここで、４種の核酸に付加された標識（第１の蛍光体と第２の蛍光体の混合比率）は、核酸を種別ごとに分離した後（例えばゲル電気泳動法による分離）に、各核酸から励起される第１の蛍光体と第２の蛍光体の強度比を求めることにより（この強度比は、第１，第２の蛍光体の蛍光強度を２つの検出器により検出することで求まる）検出される。その強度比に基づき４種の核酸を判別している。核酸に標識される蛍光体の混合比率は、ＰＣＲ法による核酸生成に際し、第１の蛍光体を修飾したプライマー（或いはターミネータ）と第２の蛍光体を修飾したプライマー（或いはターミネータ）との混合比率を調整することにより、変えている。
上記した従来技術のうち、後者すなわち（２）の方式は塩基配列決定のような定性的な分析方法に適している。
複数種の生体試料（例えば標的核酸）を、同時に定量分析を可能にするには、前者すなわち（１）の方式を用いることが有効である。例えば、異なる波長の標識（例えば蛍光体）を標的試料の種類別に付加し、分離した標的試料の蛍光強度（スペクトル）を検出する方法が適している。この方法は、定性分析も可能である。
しかし、（１）の方式では、標識に用いる蛍光体、発光体等は、単一の波長ではなくピークの波長を中心にスロープ状の広がりをもった波長帯域を有するので、複数の検出試料の波長（標識）が近接すると、波長帯域の一部が重なる。それによって、検出される標識の強度に他の標識が影響を及ぼし、定量精度が低下するおそれがある。
このような問題を解消するためには、検出試料の波長帯が重ならないように標識を選択すればよいが、そのような標識はなかなか存在せず、選択に限度があった。また、検出の際にも、その波長の重なりの影響を最小限にするため、計算による補正などが必要とされる。
本発明は、これらの課題を解決することにより、多くの種類の標識（蛍光体、発光体、または放射性同位体）を使用可能にし、かつ、同時に複数種の標識を測定しても、標識同士の波長帯域の重なりを抑制して、定性は勿論のこと定量分析も精度良く行い得る分析方法、反応液、および分析装置を提供する。
本発明は、基本的には、２種類以上の生体試料を合成し、合成された生体試料に、種類別に波長の異なる標識を付加し、それらの標識を検出することにより、生体試料を分析する。そして、この分析において、生体試料の標識の検出強度を、生体試料の種類別に調整し、特に検出される標識のうち、波長帯域が他方の標識に影響を及ぼす度合いの大きい方の検出強度を弱める。このようにすれば、生体試料合成用の反応液中に、異なる標識（異なる生体試料）が混在しても、それらの標識を同時に検出した時に、それらの標識同士の重なりの影響をほとんどなくすことが可能である。
具体的態様としては、次のような標識化手法を提案する。
２種類以上の生体試料を合成し、その合成に用いる物質（合成用物質）に、種類別に波長の異なる標識を付加するか或いは標識結合用媒体を付加することにより、生体試料を合成過程或いは合成後に標識化する。そして、少なくとも或る一種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体の量（付加率）を、他の種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体よりも少なくなるように調整して、生体試料を標識化する。
複数種類の生体試料を、種類別に異なる検出波長（標識）により検出する場合、それらの波長帯域の重なりは、一方の試料に付加される標識の量の割合（付加率）を他方の試料のそれよりも小さくすることにより、小さくすることができる。すなわち、一方の試料の標識率を少なくすると、その少なくした方の検出波長帯域の検出強度（例えば、蛍光，発光などの波長帯域の波形）が弱まり、その波形のスロープも小さくなる。その結果、他方の試料（標識）の検出波長領域に影響を及ぼす度合いが小さくなる。
本発明は、上記したような波長帯域の重なり抑制の具体的手法として有効である。
この場合、量を少なくする方（付加率を小さくする方）の標識として、一部重なり合う標識のうち、一方の検出波長（極大波長：スペクトル）にまで影響を及ぼす度合いの大きい方を選択する。
なお、生体試料が核酸である場合には、２種以上の核酸を定量するに際しては、各核酸の標識（波長帯を持つ蛍光体、発光体または放射性同位体）の強度を測定する前に、電気泳動などで核酸を種別ごとに分離させる。そして、その標識の測定後に、得られた検出波形のピークの高さ、面積やバンドの輝度などをそのまま解析に用いる。
具体的態様としては、次のような標識化手法を提案する。
２種類以上の生体試料を合成し、その合成に用いる物質（合成用物質）に、種類別に波長の異なる標識を付加するか或いは標識結合用媒体を付加することにより、生体試料を合成過程或いは合成後に標識化する。そして、少なくとも或る一種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体の量（付加率）を、他の種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体よりも少なくなるように調整して、生体試料を標識化する。
複数種類の生体試料を、種類別に異なる検出波長（標識）により検出する場合、それらの波長帯域の重なりは、一方の試料に付加される標識の量の割合（付加率）を他方の試料のそれよりも小さくすることにより、小さくすることができる。すなわち、一方の試料の標識率を少なくすると、その少なくした方の検出波長帯域の検出強度（例えば、蛍光，発光などの波長帯域の波形）が弱まり、その波形のスロープも小さくなる。その結果、他方の試料（標識）の検出波長領域に影響を及ぼす度合いが小さくなる。
本発明は、上記したような波長帯域の重なり抑制の具体的手法として有効である。
この場合、量を少なくする方（付加率を小さくする方）の標識として、一部重なり合う標識のうち、一方の検出波長（極大波長：スペクトル）にまで影響を及ぼす度合いの大きい方を選択する。
なお、生体試料が核酸である場合には、２種以上の核酸を定量するに際しては、各核酸の標識（波長帯を持つ蛍光体、発光体または放射性同位体）の強度を測定する前に、電気泳動などで核酸を種別ごとに分離させる。そして、その標識の測定後に、得られた検出波形のピークの高さ、面積やバンドの輝度などをそのまま解析に用いる。
第１図は、本発明の実施形態に係る生体試料分析のフローチャートの一例である。第２図は、従来方式であり、プライマーＡ，Ｂひいては核酸Ａ´，Ｂ´についての標識Ｘ，Ｙの付加率は同程度で、核酸Ａ´，Ｂ´について同程度の蛍光強度が測定された場合の蛍光波長−蛍光強度特性を示す。第３図は、本実施例に係るもので、プライマーＡ，Ｂひいては核酸Ａ´，Ｂ´についての標識Ｘ，Ｙの付加率は１対１０で、Ａ´がＢ´の１／１０であった場合の蛍光波長−蛍光強度特性を示す。第４図は、従来方式による検出波長−蛍光強度特性を示すものであり、プライマーＡ，Ｂについての標識Ｘ，Ｙの付加率は同程度であるが、核酸Ｂ´の元々の生成量がＡ´よりもはるかに少ない場合を示す。第５図は、第４図における核酸Ａ´の蛍光強度を本発明により弱めた場合の検出波長−蛍光強度特性を示す図。第６図は、ＦＯＲＷＯＲＤプライマーとしてＲＯＸ−３０３ＦとＦＡＭ−３０４Ｆを用いて増幅したＰＣＲ産物を用いた場合の従来法式の検出結果を示す図。第７図は、ＦＯＲＷＯＲＤプライマーとしてＲＯＸ−３０３Ｆと３０４ＦＭＩＸを用いて増幅したＰＣＲ産物を用いた場合の検出結果を示す図。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例のみによって限定されるものではない。
第１図に、本発明の実施形態に係る生体試料分析のフローチャートの一例を示す。ここでは、生体試料として２種の核酸を一例にして説明する。
標的となる鋳型（標的核酸）を含むゲノムＤＮＡの抽出、およびプライマーセット後に（ステップＳ１，Ｓ２）、試料を含む溶液中にＰＣＲに用いるプライマー溶液を混合してサーマルサイクラーによりＰＣＲを実行する（ステップＳ３）。ゲノムＤＮＡの抽出、プライマーセットの具体例については、後述する。また、プライマーセットの説明については、ステップＳ３のＰＣＲシーケンスにて模式図を利用して説明する。
本例では、ＰＣＲによる標的核酸の合成（複製）を行う場合に、２本鎖ＤＮＡの標的となる部位を挟む２箇所の部位ａ，ｂを選択するが〔ステップＳ３（２）参照〕、単鎖（例えばＲＮＡ）の標的となる部位を選択してもよい。２本鎖ＤＮＡは、ステップＳ３（１）では、標的核酸一つのみを模式的に例示しているが、実際には、標的以外のゲノムＤＮＡも反応液中に含まれる。また標的核酸は、父親由来と母親由来のそれぞれ対応する一対の標的核酸（対立遺伝子）として存在する。
本例では、鋳型ＤＮＡの２本鎖を変性により１本づつに分離し〔ステップＳ３（２）〕、これらの鎖の標的となる部位を挟む２箇所の部位ａ，ｂに核酸の複製基点となるプライマー（オリゴマー）Ａ，Ｂをアニールさせる。
プライマーＡ，Ｂの塩基配列は、当然、対応する複製基点ａ，ｂと相補的な配列をなしている。
反応液中には、それぞれ異なる波長の標識（蛍光体、発光体、放射性同位体）Ｘ，Ｙまたは標識結合用物質（修飾基や抗原）を付加したプライマーが含まれている。ここでは、標識および標識結合用物質を総称して標識Ｘ，Ｙとする。標識Ｘは、プライマーＡを修飾し（このプライマーをＡＸとする）、標識Ｂは、プライマーＹを修飾する（このプライマーをＢＹとする）。
反応液中には、標識を修飾していないプライマーＡ、Ｂも含まれている。プライマーＡの総量（標識Ｘが付加されたプライマーＡＸと標識が付加されないプライマーＡとの和）とプライマーＢの総量（標識Ｙが付加されたプライマーＢＹと標識が付加されないプライマーＢとの和）とは、同量にしてある。ただし、プライマーＡに付加される標識Ｘの付加率と、プライマーＢに付加される標識Ｙの付加率は、異なる。標識Ｘ，Ｙのプライマーへの付加率（量比）は、Ｘ，Ｙが蛍光体、発光体、放射性同位体の場合には、その蛍光強度、発光強度、又は放射活性比により決定する。
プライマーＡＸとプライマーＢＹの比率は、例えば１対１０としてある。また、各種別ごとの核酸の標識化されたものと標識化されていないものの量比、すなわちＡＸとＡ、ＢＹとＢの量比は、それぞれ１：１〜１：５０好ましくは１：５〜１：１０の範囲で調整してある。
この調整は、プライマーセットの工程で予め種別ごとのプライマー溶液で調整される（具体例は、後述する）。
本例では、サーマルサイクルの繰り返しにおいて、ステップＳ３（２）のアニーリング及び増幅を経て標的核酸が複製される。アニーリングでは、標的核酸の複製基点ａには、プライマーＡＸおよびＡのいずれかが結合し、複製基点ｂには、プライマーＢＹおよびＢのいずれかが結合する。
複製される標的核酸には、標識の付いた核酸Ａ´Ｘ（プライマーＡＸに基づく標的産物）とＢ´Ｙ（プライマーＢＹに基づく標的核酸）、標識の付かない核酸Ａ´とＢ´が含まれる。本例では、Ａ´ＸとＢ´Ｙの比率は、プライマーＡＸ、ＢＹの比率とほぼ同じで、ほぼ１対１０になる。
以上のように、標識付きプライマーＡＸと標識無しプライマーＡ、標識付きＢＹと標識無しプライマーＢとの混合比率を調整することで、標識化された核酸プライマーＡＸ，ＢＹ同士（種類が異なる標識付きプライマー同士）の量比、ひいては標識化された核酸生成物Ａ´Ｘ，Ｂ´Ｙの量比を変えることができる。
本例のように、標識付きプライマー（または修飾基または抗体）ＡＸを標識付きプライマーＢＹよりも小さくなるように調整することにより、ＰＣＲの産物である標識付き核酸Ａ´ＸもＢ´Ｙより少なくなる〔ステップＳ３（５）〕。
ＰＣＲ法により生成された２種の核酸Ａ´（Ａ´Ｘを含む）、Ｂ´（Ｂ´Ｙを含む）は、電気泳動により分離される（ステップＳ４）。すなわち、それぞれの１本鎖ＤＮＡ（Ａ´、Ｂ´）は、それぞれ相補的な塩基配列をなし、それぞれの塩基配列に特異的な高次構造を有しているために（１本鎖ＤＮＡ高次構造多型：ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＳＣＰ）、電気泳動により異なる位置に分離される。また、ＤＮＡ断片内の一塩基が変異などで置換された場合には、１本鎖ＤＮＡの高次構造は変化する。このような変化が生じると、その泳動位置も変化する。このような泳動位置の変化を、例えば基準のものと比較することで、遺伝子の変異を検出することができる。この検出は、例えば、後述のＬＯＨ法（Ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）にて利用される。
泳動位置の検出は、標的核酸の標識の極大波長を分光器により検出し、その検出スペクトルを分析することにより求められる。この場合、スペクトル分析により、標的核酸の定性，定量を求めることができる（ステップＳ５，Ｓ６）。
標識付きプライマーＡＸ，ＢＹの比率は、標識Ｘ，Ｙが蛍光体、発光体、放射性同位体の場合は、その蛍光強度または放射活性比により決定する。また、Ｘ、Ｙが修飾基や抗原の場合は、Ｘ、Ｙに付加する蛍光体、発光体、放射性同位体の蛍光強度または放射活性比により決定する。
なお、Ｘ、Ｙが修飾基や抗原の場合は、ＰＣＲの反応後に、修飾基や抗原に、蛍光体、発光体および放射性同位体を付加する反応を行う。例えば、修飾基がビオチンの場合は、蛍光体、発光体および放射性同位体を付加したアビジン又はストレプトアビジンと、付加していないアビジンやストレプトアビジンの混合物を用いてビオチンに結合する処理を行う。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などの抗原の場合は、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など酵素を付加した抗体と、付加していない抗体の混合物とを用いて、抗体を抗原に結合後、発色基質を用いて処理を行う。
プライマーに結合される蛍光体としては、
ＣｙＤｙｅ、Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）、ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＥＸ）、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＲＯＸ）、ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＡＭＲＡ）、ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＴＥＴ）、スルホローダミン１０１酸クロリド（商品名：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ登録商標）などが考えられる。
発光体としては、例えば、
３−（２’ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（３”−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ（商品名：ＡＭＰＰＤ登録商標）、ＣＳＰＤＴＭ、ＭＤＰＴＭ、ＣＤＰＴＭなどが考えられる。
放射性同位体としては、例えば、３２Ｐ、１３１Ｉ、３５Ｓ、４５Ｃａ、３Ｈ、１４Ｃなどが考えられる。
核酸の標識となる蛍光体、発光体、放射性同位体または修飾基や抗原の量比は用いる標識となる化学物質によって設定する。
ここで、第２図および第３図により、上記の二箇所の部位ａ、ｂを複製（増幅）した核酸Ａ´（＝Ａ´Ｘ）、Ｂ´（＝Ｂ´Ｙ）がそれぞれ蛍光物質５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５−ＦＡＭ）と５−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（５−ＲＯＸ）を用いて標識されている場合の、測定スペクトルの形態を説明する。また、核酸Ａ´，Ｂ´をそれぞれの測定スペクトルを介して同時に、定量する場合を一例として、説明する。
第２図は、従来方式であり、プライマーＡ，Ｂひいては核酸Ａ´，Ｂ´についての標識Ｘ，Ｙの付加率は同程度で、核酸Ａ´，Ｂ´について同程度の蛍光強度が測定された場合の蛍光波長−蛍光強度特性を示す。第３図は、本実施例に係るもので、プライマーＡ，Ｂひいては核酸Ａ´，Ｂ´についての標識Ｘ，Ｙの付加率は１対１０で、Ａ´がＢ´の１／１０であった場合の蛍光波長−蛍光強度特性を示す。
それぞれの蛍光物質の最大蛍光波長、すなわち検出波長は、５−ＦＡＭが５１８ｎｍ、５−ＲＯＸが６０４ｎｍである。この２つの蛍光物質を同程度の蛍光強度となるような量で標識された核酸の検出を行うと、第２図のように両者の重なり合う波長帯があり、５−ＲＯＸの検出波長である６０４ｎｍには、５−ＦＡＭの波長帯も含まれている。このため、Ｂ´の定量では、第２図からもわかるように、Ａ´の標識物質である５−ＦＡＭの検出波長における蛍光強度の約３割分が加算されて、Ｂ´の検出波長における蛍光強度として検出される。このような場合には、計算などで補正することによりＢ´の検出波長における蛍光強度からＡ´の蛍光強度分を除く処理が必要である。
これに対して、本実施例のように、例えば、検出対象となる核酸を増幅する反応において、予め５−ＦＡＭを付加したプライマーを、５−ＲＯＸを付加したプライマーに対して検出波長における蛍光強度が１／１０になるように用いて部位Ａを増幅すると、Ａ´の蛍光強度も略１／１０となる（この蛍光強度を第３図のＡ″で示す）。ここで、Ａ″とＢ´を同時に検出すると、第３図のように６０４ｎｍにおける蛍光強度は、補正をしなくても実際のＢ´の蛍光強度に近くなる。すなわち、Ａ´（Ａ″）の蛍光強度を、測定可能な範囲でＢ´よりも充分に小さくすることにより、Ａ″の長波長側のスロープが小さくなり、Ｂ´の検出波長にほとんど影響を及ぼさなくなる。
本実施形態では、第２図、第３図に示すように、標的核酸Ａ´，Ｂ´の標識は、検出スペクトルの極大波長を基準にして短波長側が急で長波長側がなだらかな勾配のスペクトルを持つ化合物である。この場合には、波長の短い方の標識が波長の長い方の標識に影響を及ぼすので、複数種のプライマー（合成用物質）に付加される標識（修飾基，抗原などの標識結合用媒体を含む）の量は、波長の短い方Ａ´を、波長の長い方Ｂ´よりも少なくする。
第４図も、従来方式による検出波長−蛍光強度特性を示すものである。この例は、プライマーＡ，Ｂについての標識Ｘ，Ｙの付加率は同程度であるが、５−ＲＯＸで標識された核酸Ｂ´の元々の生成量が５−ＦＡＭで標識さらた核酸Ａ´よりもはるかに少ない場合（例えばＢ´の検出波長における蛍光強度がＡ´の１０％であった場合）である。この場合にも、Ａ´の波長帯域の一部が、Ｂ´の検出波長（極大波長）に含まれ、Ｂ´の検出が困難になる。この場合も、上記と同様の方法で、プライマーＡへの標識付加率をプライマーＢの標識付加率よりも小さくすれば、第５図に示すように、Ａ´側の蛍光強度を弱めて、Ａ´の検出波長帯域がＢ´の検出波長（極大波長）に影響を及ぼすのをほとんどなくし、Ｂ´について、実際の蛍光強度に近づけることができる。
なお、分析装置は、２種の標的核酸の分析（解析）を行う場合には、いずれのデータも補正せず、そのまま解析演算するか、あるいは、定量演算を行う場合に、上記した標識の付加率に関するデータを入力可能にし、その付加率データと測定データに基づき各生体試料の定量を演算する。
このように、標識となる物質の量比を、生体試料に応じて変えることで、重なり合う波長帯を有する標識となる物質を用いての検出が可能となり、より多くの種類の核酸を同時に定量することができる。
以下に、本発明の具体的な実施例について説明する。
第１図に、本発明の実施形態に係る生体試料分析のフローチャートの一例を示す。ここでは、生体試料として２種の核酸を一例にして説明する。
標的となる鋳型（標的核酸）を含むゲノムＤＮＡの抽出、およびプライマーセット後に（ステップＳ１，Ｓ２）、試料を含む溶液中にＰＣＲに用いるプライマー溶液を混合してサーマルサイクラーによりＰＣＲを実行する（ステップＳ３）。ゲノムＤＮＡの抽出、プライマーセットの具体例については、後述する。また、プライマーセットの説明については、ステップＳ３のＰＣＲシーケンスにて模式図を利用して説明する。
本例では、ＰＣＲによる標的核酸の合成（複製）を行う場合に、２本鎖ＤＮＡの標的となる部位を挟む２箇所の部位ａ，ｂを選択するが〔ステップＳ３（２）参照〕、単鎖（例えばＲＮＡ）の標的となる部位を選択してもよい。２本鎖ＤＮＡは、ステップＳ３（１）では、標的核酸一つのみを模式的に例示しているが、実際には、標的以外のゲノムＤＮＡも反応液中に含まれる。また標的核酸は、父親由来と母親由来のそれぞれ対応する一対の標的核酸（対立遺伝子）として存在する。
本例では、鋳型ＤＮＡの２本鎖を変性により１本づつに分離し〔ステップＳ３（２）〕、これらの鎖の標的となる部位を挟む２箇所の部位ａ，ｂに核酸の複製基点となるプライマー（オリゴマー）Ａ，Ｂをアニールさせる。
プライマーＡ，Ｂの塩基配列は、当然、対応する複製基点ａ，ｂと相補的な配列をなしている。
反応液中には、それぞれ異なる波長の標識（蛍光体、発光体、放射性同位体）Ｘ，Ｙまたは標識結合用物質（修飾基や抗原）を付加したプライマーが含まれている。ここでは、標識および標識結合用物質を総称して標識Ｘ，Ｙとする。標識Ｘは、プライマーＡを修飾し（このプライマーをＡＸとする）、標識Ｂは、プライマーＹを修飾する（このプライマーをＢＹとする）。
反応液中には、標識を修飾していないプライマーＡ、Ｂも含まれている。プライマーＡの総量（標識Ｘが付加されたプライマーＡＸと標識が付加されないプライマーＡとの和）とプライマーＢの総量（標識Ｙが付加されたプライマーＢＹと標識が付加されないプライマーＢとの和）とは、同量にしてある。ただし、プライマーＡに付加される標識Ｘの付加率と、プライマーＢに付加される標識Ｙの付加率は、異なる。標識Ｘ，Ｙのプライマーへの付加率（量比）は、Ｘ，Ｙが蛍光体、発光体、放射性同位体の場合には、その蛍光強度、発光強度、又は放射活性比により決定する。
プライマーＡＸとプライマーＢＹの比率は、例えば１対１０としてある。また、各種別ごとの核酸の標識化されたものと標識化されていないものの量比、すなわちＡＸとＡ、ＢＹとＢの量比は、それぞれ１：１〜１：５０好ましくは１：５〜１：１０の範囲で調整してある。
この調整は、プライマーセットの工程で予め種別ごとのプライマー溶液で調整される（具体例は、後述する）。
本例では、サーマルサイクルの繰り返しにおいて、ステップＳ３（２）のアニーリング及び増幅を経て標的核酸が複製される。アニーリングでは、標的核酸の複製基点ａには、プライマーＡＸおよびＡのいずれかが結合し、複製基点ｂには、プライマーＢＹおよびＢのいずれかが結合する。
複製される標的核酸には、標識の付いた核酸Ａ´Ｘ（プライマーＡＸに基づく標的産物）とＢ´Ｙ（プライマーＢＹに基づく標的核酸）、標識の付かない核酸Ａ´とＢ´が含まれる。本例では、Ａ´ＸとＢ´Ｙの比率は、プライマーＡＸ、ＢＹの比率とほぼ同じで、ほぼ１対１０になる。
以上のように、標識付きプライマーＡＸと標識無しプライマーＡ、標識付きＢＹと標識無しプライマーＢとの混合比率を調整することで、標識化された核酸プライマーＡＸ，ＢＹ同士（種類が異なる標識付きプライマー同士）の量比、ひいては標識化された核酸生成物Ａ´Ｘ，Ｂ´Ｙの量比を変えることができる。
本例のように、標識付きプライマー（または修飾基または抗体）ＡＸを標識付きプライマーＢＹよりも小さくなるように調整することにより、ＰＣＲの産物である標識付き核酸Ａ´ＸもＢ´Ｙより少なくなる〔ステップＳ３（５）〕。
ＰＣＲ法により生成された２種の核酸Ａ´（Ａ´Ｘを含む）、Ｂ´（Ｂ´Ｙを含む）は、電気泳動により分離される（ステップＳ４）。すなわち、それぞれの１本鎖ＤＮＡ（Ａ´、Ｂ´）は、それぞれ相補的な塩基配列をなし、それぞれの塩基配列に特異的な高次構造を有しているために（１本鎖ＤＮＡ高次構造多型：ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＳＣＰ）、電気泳動により異なる位置に分離される。また、ＤＮＡ断片内の一塩基が変異などで置換された場合には、１本鎖ＤＮＡの高次構造は変化する。このような変化が生じると、その泳動位置も変化する。このような泳動位置の変化を、例えば基準のものと比較することで、遺伝子の変異を検出することができる。この検出は、例えば、後述のＬＯＨ法（Ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）にて利用される。
泳動位置の検出は、標的核酸の標識の極大波長を分光器により検出し、その検出スペクトルを分析することにより求められる。この場合、スペクトル分析により、標的核酸の定性，定量を求めることができる（ステップＳ５，Ｓ６）。
標識付きプライマーＡＸ，ＢＹの比率は、標識Ｘ，Ｙが蛍光体、発光体、放射性同位体の場合は、その蛍光強度または放射活性比により決定する。また、Ｘ、Ｙが修飾基や抗原の場合は、Ｘ、Ｙに付加する蛍光体、発光体、放射性同位体の蛍光強度または放射活性比により決定する。
なお、Ｘ、Ｙが修飾基や抗原の場合は、ＰＣＲの反応後に、修飾基や抗原に、蛍光体、発光体および放射性同位体を付加する反応を行う。例えば、修飾基がビオチンの場合は、蛍光体、発光体および放射性同位体を付加したアビジン又はストレプトアビジンと、付加していないアビジンやストレプトアビジンの混合物を用いてビオチンに結合する処理を行う。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などの抗原の場合は、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など酵素を付加した抗体と、付加していない抗体の混合物とを用いて、抗体を抗原に結合後、発色基質を用いて処理を行う。
プライマーに結合される蛍光体としては、
ＣｙＤｙｅ、Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）、ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＥＸ）、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＲＯＸ）、ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＡＭＲＡ）、ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＴＥＴ）、スルホローダミン１０１酸クロリド（商品名：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ登録商標）などが考えられる。
発光体としては、例えば、
３−（２’ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（３”−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ（商品名：ＡＭＰＰＤ登録商標）、ＣＳＰＤＴＭ、ＭＤＰＴＭ、ＣＤＰＴＭなどが考えられる。
放射性同位体としては、例えば、３２Ｐ、１３１Ｉ、３５Ｓ、４５Ｃａ、３Ｈ、１４Ｃなどが考えられる。
核酸の標識となる蛍光体、発光体、放射性同位体または修飾基や抗原の量比は用いる標識となる化学物質によって設定する。
ここで、第２図および第３図により、上記の二箇所の部位ａ、ｂを複製（増幅）した核酸Ａ´（＝Ａ´Ｘ）、Ｂ´（＝Ｂ´Ｙ）がそれぞれ蛍光物質５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５−ＦＡＭ）と５−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（５−ＲＯＸ）を用いて標識されている場合の、測定スペクトルの形態を説明する。また、核酸Ａ´，Ｂ´をそれぞれの測定スペクトルを介して同時に、定量する場合を一例として、説明する。
第２図は、従来方式であり、プライマーＡ，Ｂひいては核酸Ａ´，Ｂ´についての標識Ｘ，Ｙの付加率は同程度で、核酸Ａ´，Ｂ´について同程度の蛍光強度が測定された場合の蛍光波長−蛍光強度特性を示す。第３図は、本実施例に係るもので、プライマーＡ，Ｂひいては核酸Ａ´，Ｂ´についての標識Ｘ，Ｙの付加率は１対１０で、Ａ´がＢ´の１／１０であった場合の蛍光波長−蛍光強度特性を示す。
それぞれの蛍光物質の最大蛍光波長、すなわち検出波長は、５−ＦＡＭが５１８ｎｍ、５−ＲＯＸが６０４ｎｍである。この２つの蛍光物質を同程度の蛍光強度となるような量で標識された核酸の検出を行うと、第２図のように両者の重なり合う波長帯があり、５−ＲＯＸの検出波長である６０４ｎｍには、５−ＦＡＭの波長帯も含まれている。このため、Ｂ´の定量では、第２図からもわかるように、Ａ´の標識物質である５−ＦＡＭの検出波長における蛍光強度の約３割分が加算されて、Ｂ´の検出波長における蛍光強度として検出される。このような場合には、計算などで補正することによりＢ´の検出波長における蛍光強度からＡ´の蛍光強度分を除く処理が必要である。
これに対して、本実施例のように、例えば、検出対象となる核酸を増幅する反応において、予め５−ＦＡＭを付加したプライマーを、５−ＲＯＸを付加したプライマーに対して検出波長における蛍光強度が１／１０になるように用いて部位Ａを増幅すると、Ａ´の蛍光強度も略１／１０となる（この蛍光強度を第３図のＡ″で示す）。ここで、Ａ″とＢ´を同時に検出すると、第３図のように６０４ｎｍにおける蛍光強度は、補正をしなくても実際のＢ´の蛍光強度に近くなる。すなわち、Ａ´（Ａ″）の蛍光強度を、測定可能な範囲でＢ´よりも充分に小さくすることにより、Ａ″の長波長側のスロープが小さくなり、Ｂ´の検出波長にほとんど影響を及ぼさなくなる。
本実施形態では、第２図、第３図に示すように、標的核酸Ａ´，Ｂ´の標識は、検出スペクトルの極大波長を基準にして短波長側が急で長波長側がなだらかな勾配のスペクトルを持つ化合物である。この場合には、波長の短い方の標識が波長の長い方の標識に影響を及ぼすので、複数種のプライマー（合成用物質）に付加される標識（修飾基，抗原などの標識結合用媒体を含む）の量は、波長の短い方Ａ´を、波長の長い方Ｂ´よりも少なくする。
第４図も、従来方式による検出波長−蛍光強度特性を示すものである。この例は、プライマーＡ，Ｂについての標識Ｘ，Ｙの付加率は同程度であるが、５−ＲＯＸで標識された核酸Ｂ´の元々の生成量が５−ＦＡＭで標識さらた核酸Ａ´よりもはるかに少ない場合（例えばＢ´の検出波長における蛍光強度がＡ´の１０％であった場合）である。この場合にも、Ａ´の波長帯域の一部が、Ｂ´の検出波長（極大波長）に含まれ、Ｂ´の検出が困難になる。この場合も、上記と同様の方法で、プライマーＡへの標識付加率をプライマーＢの標識付加率よりも小さくすれば、第５図に示すように、Ａ´側の蛍光強度を弱めて、Ａ´の検出波長帯域がＢ´の検出波長（極大波長）に影響を及ぼすのをほとんどなくし、Ｂ´について、実際の蛍光強度に近づけることができる。
なお、分析装置は、２種の標的核酸の分析（解析）を行う場合には、いずれのデータも補正せず、そのまま解析演算するか、あるいは、定量演算を行う場合に、上記した標識の付加率に関するデータを入力可能にし、その付加率データと測定データに基づき各生体試料の定量を演算する。
このように、標識となる物質の量比を、生体試料に応じて変えることで、重なり合う波長帯を有する標識となる物質を用いての検出が可能となり、より多くの種類の核酸を同時に定量することができる。
以下に、本発明の具体的な実施例について説明する。
１．検体からの鋳型ＤＮＡの抽出工程（ステップＳ１）
検体として、ヒト抹消血（全血）、バイオプシーによる組織片、尿などが使用できる。ここで述べるゲノムＤＮＡの抽出は、周知の方法により行われる。
例えば、ヒト抹消血の場合、ＱＩＡＧＥＮ社のＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用すればよい。具体的には、キットの標準プロトコールに従うが、１．５ｍＬμチューブに、ヒト全血２００μＬ、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ２０μＬを加える。次いで、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬ ２００μＬを加えて、ｖｏｌｔｅｘを用いて十分に撹拌後、５６℃、１０分間のインキュベーションを行う。その後、マイクロチューブを遠心して液を集め、エタノール２００μＬを加えて再びｖｏｌｔｅｘを用いて十分に撹拌する。その混合液全量をコレクションチューブ中のスピンカラムに注入し、８０００ｒｐｍ、１分間遠心して、液をカラムに通し、ゲノムＤＮＡをカラム内に補足する。その後、同じスピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、ふたを開けてスピンカラムにＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１ ５００μＬを注入して８０００ｒｐｍで１分間遠心する。再び、スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、次にＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２ ５００μＬを注入して１４０００ｒｐｍで３分間遠心し、カラムの洗浄を行う。スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥ １００μＬを注入し、８０００ｒｐｍ、１分間遠心し、補足したゲノムＤＮＡを溶出させ、ゲノムＤＮＡ溶液を得る。なお、溶出ゲノムＤＮＡを吸光度計を用いて測定することにより、溶出液中の核酸量を定量する。
尿の場合は、まず、遠心管に採取した尿を１０００ｒｐｍで５分間遠心して沈渣のみを集め、さらにその沈渣に生理用食塩水を加えて再分散させて洗浄し、再度１０００ｒｐｍで５分間遠心して沈渣を集めて試料とする。その後、周知のプロテイナーゼＫ消化し、フェノール／クロロホルム抽出などでゲノムＤＮＡを抽出する。組織切片も同様にできる。また、尿審査物、組織片、血液の白血球を−８０℃で凍結保存した試料を使ってもよい。
２．標的核酸部を増幅するためのプライマーセットの調製工程（ステップ２）
ＰＣＲ増幅用のプライマーとして以下の６種類のポリヌクレオチドを使用した。
ＲＯＸ−３０３Ｆプライマーと３０３Ｆプライマー、ＴＥＴ−３０４Ｆプライマーと３０４Ｆプライマーは、それぞれともに同じ配列を有するポリヌクレオチドである。
ＲＯＸ−３０３Ｆプライマーと３０３Ｆプライマーは、９番染色体上の３０３遺伝子領域の一部とハイブリダイズする。ＴＥＴ−３０４Ｆプライマーと３０４Ｆプライマーは、９番染色体上の３０４遺伝子の一部とハイブリダイズする。
これらは共にＰＣＲ増幅反応の際のＦＯＲＷＡＲＤプライマーとして使用する。
また、ＲＯＸ−３０３Ｆプライマーは、その５’末端に蛍光体であるＲＯＸを、ＴＥＴ−３０４Ｆプライマーは、その５’末端に蛍光体であるＴＥＴを結合させた標識ポリヌクレオチドであり、蛍光検出により検出できる。
３０３Ｆプライマーと３０４Ｆプライマーは、非標識のポリヌクレオチドである。蛍光体のポリヌクレオチドへの結合は周知の方法により行うことができる。
３０３Ｒプライマーと３０４Ｒプライマーは、それぞれ９番染色体上の３０３遺伝子または３０４遺伝子の一部とハイブリダイズし、ＰＣＲ増幅反応の際のＲＥＶＥＲＳＥプライマーとして使用する。
ＰＣＲ増幅反応のＦＯＲＷＡＲＤプライマー溶液には、ＲＯＸ−３０３Ｆプライマーと３０３Ｆプライマー、ＴＥＴ−３０４Ｆプライマーと３０４Ｆプライマーをそれぞれ１：１０の濃度比で全体として１００μＭの濃度になるように調製した（それぞれ３０３ＦＭＩＸプライマー溶液、３０４ＦＭＩＸプライマー溶液とする。）。
ＲＥＶＥＲＳＥプライマー溶液には、３０３Ｒプライマーと３０４Ｒプライマーをそれぞれ１００μＭの濃度になるように調製したものを使用した。
３．増幅反応工程（ステップＳ３）
本工程では、前述のプライマーを用いてＰＣＲ増幅反応を行う。
鋳型となるゲノムＤＮＡ ０．１μｇ、１．２５ｍＭのｄＮＴＰ混合溶液 ４μＬ、１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ ０．１２５μＬ、前述の３０３ＦＭＩＸプライマー溶液、３０４ＦＭＩＸプライマー溶液、３０３Ｒプライマー溶液、３０４Ｒプライマー溶液をそれぞれ１μＬ、滅菌水を全量２５μＬになるように加えて混合する。ＰＣＲ反応条件は、最初の変性条件を９５℃で５分間、増幅温度サイクルは、９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０回繰り返し、最後に伸長反応を７２℃で７分間行う。反応後、周知のゲル電気泳動で増幅を確認した。
４．ＰＣＲ産物の３’末端平滑化
０．５ｕｎｉｔｓのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを、ＰＣＲ反応溶液５μＬに添加し、３７℃で３０分間反応した。反応後、１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を１μＬ添加した。
５．検出工程（ステップＳ５）
本工程では、上記工程で調製した生成ＤＮＡを検出する。検出方法・装置は種々適用できるが、本実施例ではキャピラリー電気泳動装置によりＳＳＣＰ解析を実施する場合について説明する。
キャピラリー電気泳動装置として、キャピラリーアレイを１６本装着し、同時に電気泳動できるものを使用した。同程度の性能の装置で市販されているものでは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒなどがある。この装置で、独自に作成した内径７５μｍ、検出長３６ｃｍのキャピラリーを使用し、同社製のＧｅｎｅＳｃａｎポリマーを独自に濃縮調整したものを充填して検出する。
上記増幅反応工程および３’末端平滑化を行った生成ＤＮＡを含む反応液３μＬに、周知の標識されたフラグメントマーカー（既知の塩基長のオリゴマー）を適量含むホルムアミド３７μＬを混合し、９４℃で２分間熱変性を行う。その後、氷令し、キャピラリー電気泳動用の試料溶液とする。生成ＤＮＡを含む反応液は必要に応じて希釈して用いる。電気泳動条件は、キャピラリーの制御温度を２２．５℃、試料注入条件を２０ＫＶ、５秒、泳動分離を１５ＫＶ、７０分間行う。なお、解析する信号強度は、標準で得られる泳動データをもとに、ベースライン、振幅を独自に変更して使用する。
６．ＬＯＨ（Ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）の解析（ステップＳ６）
第６図、第７図において、実線は３０３、破線は３０４の遺伝子から増幅した生成ＤＮＡのピークである。鋳型がゲノムＤＮＡであり、父親由来と母親由来の両者のゲノムから標的核酸が増幅されるため、遺伝子３０３，３０４は、それぞれ２つのピークとなって現れる。この２つのピークを解析することによって診断などを行うことができる。そして、第６図では３０４から得られるピーク強度と３０３から得られるピーク強度はほぼ同等だが、第７図では３０４から得られるピーク強度は３０３から得られるピーク強度よりも低くなっている。２つのピークのうち、時間的に先に検出されるピークの高さをＡ１、あとに検出されるピークの高さをＡ２とすると、
ｍｉｎ．（Ａ１，Ａ２）／ｍａｘ．（Ａ１，Ａ２）・・・・（１）
の計算式からＬＯＨの割合を調べることができる。
第６図では、変換式を用いて、それぞれのピークの影響を最小限にしてから（１）の計算を行った。
第７図では、得られたピークの高さを用いてそのまま（１）の計算を行った。
この結果、表１のように両者ともほぼ同じ計算結果を得ることができた。
なお、本解析では行わなかったが、実際には正常遺伝子の割合も考慮して診断などを行う（特開平９−２０１１９９など）。例えば、がん組織に含まれるがん細胞由来の遺伝子の割合は、
｛Ａ１／Ａ２（正常組織からの遺伝子）−Ａ１／Ａ２（がん組織からの遺伝子）｝／｛Ａ１／Ａ２（正常組織からの遺伝子）｝
で計算する。また、診断などにおいては、ある一定の割合を設定し、その値を判定の基準として利用する。この際、計算結果にはお互いのピークの影響（例えば、実施例で用いた３０３と３０４）を考慮して、設定値を中心として一定の範囲を擬陽性または擬陰性とする必要がある。
なお、上記実施例では、生体試料として核酸を例示したが、本発明はこれに限定されるものではなく、その他の生体試料でも本発明で提示した課題を有するものについては、適用することが可能である。
検体として、ヒト抹消血（全血）、バイオプシーによる組織片、尿などが使用できる。ここで述べるゲノムＤＮＡの抽出は、周知の方法により行われる。
例えば、ヒト抹消血の場合、ＱＩＡＧＥＮ社のＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用すればよい。具体的には、キットの標準プロトコールに従うが、１．５ｍＬμチューブに、ヒト全血２００μＬ、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ２０μＬを加える。次いで、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬ ２００μＬを加えて、ｖｏｌｔｅｘを用いて十分に撹拌後、５６℃、１０分間のインキュベーションを行う。その後、マイクロチューブを遠心して液を集め、エタノール２００μＬを加えて再びｖｏｌｔｅｘを用いて十分に撹拌する。その混合液全量をコレクションチューブ中のスピンカラムに注入し、８０００ｒｐｍ、１分間遠心して、液をカラムに通し、ゲノムＤＮＡをカラム内に補足する。その後、同じスピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、ふたを開けてスピンカラムにＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１ ５００μＬを注入して８０００ｒｐｍで１分間遠心する。再び、スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、次にＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２ ５００μＬを注入して１４０００ｒｐｍで３分間遠心し、カラムの洗浄を行う。スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥ １００μＬを注入し、８０００ｒｐｍ、１分間遠心し、補足したゲノムＤＮＡを溶出させ、ゲノムＤＮＡ溶液を得る。なお、溶出ゲノムＤＮＡを吸光度計を用いて測定することにより、溶出液中の核酸量を定量する。
尿の場合は、まず、遠心管に採取した尿を１０００ｒｐｍで５分間遠心して沈渣のみを集め、さらにその沈渣に生理用食塩水を加えて再分散させて洗浄し、再度１０００ｒｐｍで５分間遠心して沈渣を集めて試料とする。その後、周知のプロテイナーゼＫ消化し、フェノール／クロロホルム抽出などでゲノムＤＮＡを抽出する。組織切片も同様にできる。また、尿審査物、組織片、血液の白血球を−８０℃で凍結保存した試料を使ってもよい。
２．標的核酸部を増幅するためのプライマーセットの調製工程（ステップ２）
ＰＣＲ増幅用のプライマーとして以下の６種類のポリヌクレオチドを使用した。
ＲＯＸ−３０３Ｆプライマーと３０３Ｆプライマーは、９番染色体上の３０３遺伝子領域の一部とハイブリダイズする。ＴＥＴ−３０４Ｆプライマーと３０４Ｆプライマーは、９番染色体上の３０４遺伝子の一部とハイブリダイズする。
これらは共にＰＣＲ増幅反応の際のＦＯＲＷＡＲＤプライマーとして使用する。
また、ＲＯＸ−３０３Ｆプライマーは、その５’末端に蛍光体であるＲＯＸを、ＴＥＴ−３０４Ｆプライマーは、その５’末端に蛍光体であるＴＥＴを結合させた標識ポリヌクレオチドであり、蛍光検出により検出できる。
３０３Ｆプライマーと３０４Ｆプライマーは、非標識のポリヌクレオチドである。蛍光体のポリヌクレオチドへの結合は周知の方法により行うことができる。
３０３Ｒプライマーと３０４Ｒプライマーは、それぞれ９番染色体上の３０３遺伝子または３０４遺伝子の一部とハイブリダイズし、ＰＣＲ増幅反応の際のＲＥＶＥＲＳＥプライマーとして使用する。
ＰＣＲ増幅反応のＦＯＲＷＡＲＤプライマー溶液には、ＲＯＸ−３０３Ｆプライマーと３０３Ｆプライマー、ＴＥＴ−３０４Ｆプライマーと３０４Ｆプライマーをそれぞれ１：１０の濃度比で全体として１００μＭの濃度になるように調製した（それぞれ３０３ＦＭＩＸプライマー溶液、３０４ＦＭＩＸプライマー溶液とする。）。
ＲＥＶＥＲＳＥプライマー溶液には、３０３Ｒプライマーと３０４Ｒプライマーをそれぞれ１００μＭの濃度になるように調製したものを使用した。
３．増幅反応工程（ステップＳ３）
本工程では、前述のプライマーを用いてＰＣＲ増幅反応を行う。
鋳型となるゲノムＤＮＡ ０．１μｇ、１．２５ｍＭのｄＮＴＰ混合溶液 ４μＬ、１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ ０．１２５μＬ、前述の３０３ＦＭＩＸプライマー溶液、３０４ＦＭＩＸプライマー溶液、３０３Ｒプライマー溶液、３０４Ｒプライマー溶液をそれぞれ１μＬ、滅菌水を全量２５μＬになるように加えて混合する。ＰＣＲ反応条件は、最初の変性条件を９５℃で５分間、増幅温度サイクルは、９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０回繰り返し、最後に伸長反応を７２℃で７分間行う。反応後、周知のゲル電気泳動で増幅を確認した。
４．ＰＣＲ産物の３’末端平滑化
０．５ｕｎｉｔｓのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを、ＰＣＲ反応溶液５μＬに添加し、３７℃で３０分間反応した。反応後、１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を１μＬ添加した。
５．検出工程（ステップＳ５）
本工程では、上記工程で調製した生成ＤＮＡを検出する。検出方法・装置は種々適用できるが、本実施例ではキャピラリー電気泳動装置によりＳＳＣＰ解析を実施する場合について説明する。
キャピラリー電気泳動装置として、キャピラリーアレイを１６本装着し、同時に電気泳動できるものを使用した。同程度の性能の装置で市販されているものでは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒなどがある。この装置で、独自に作成した内径７５μｍ、検出長３６ｃｍのキャピラリーを使用し、同社製のＧｅｎｅＳｃａｎポリマーを独自に濃縮調整したものを充填して検出する。
上記増幅反応工程および３’末端平滑化を行った生成ＤＮＡを含む反応液３μＬに、周知の標識されたフラグメントマーカー（既知の塩基長のオリゴマー）を適量含むホルムアミド３７μＬを混合し、９４℃で２分間熱変性を行う。その後、氷令し、キャピラリー電気泳動用の試料溶液とする。生成ＤＮＡを含む反応液は必要に応じて希釈して用いる。電気泳動条件は、キャピラリーの制御温度を２２．５℃、試料注入条件を２０ＫＶ、５秒、泳動分離を１５ＫＶ、７０分間行う。なお、解析する信号強度は、標準で得られる泳動データをもとに、ベースライン、振幅を独自に変更して使用する。
６．ＬＯＨ（Ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）の解析（ステップＳ６）
第６図、第７図において、実線は３０３、破線は３０４の遺伝子から増幅した生成ＤＮＡのピークである。鋳型がゲノムＤＮＡであり、父親由来と母親由来の両者のゲノムから標的核酸が増幅されるため、遺伝子３０３，３０４は、それぞれ２つのピークとなって現れる。この２つのピークを解析することによって診断などを行うことができる。そして、第６図では３０４から得られるピーク強度と３０３から得られるピーク強度はほぼ同等だが、第７図では３０４から得られるピーク強度は３０３から得られるピーク強度よりも低くなっている。２つのピークのうち、時間的に先に検出されるピークの高さをＡ１、あとに検出されるピークの高さをＡ２とすると、
ｍｉｎ．（Ａ１，Ａ２）／ｍａｘ．（Ａ１，Ａ２）・・・・（１）
の計算式からＬＯＨの割合を調べることができる。
第６図では、変換式を用いて、それぞれのピークの影響を最小限にしてから（１）の計算を行った。
第７図では、得られたピークの高さを用いてそのまま（１）の計算を行った。
この結果、表１のように両者ともほぼ同じ計算結果を得ることができた。
｛Ａ１／Ａ２（正常組織からの遺伝子）−Ａ１／Ａ２（がん組織からの遺伝子）｝／｛Ａ１／Ａ２（正常組織からの遺伝子）｝
で計算する。また、診断などにおいては、ある一定の割合を設定し、その値を判定の基準として利用する。この際、計算結果にはお互いのピークの影響（例えば、実施例で用いた３０３と３０４）を考慮して、設定値を中心として一定の範囲を擬陽性または擬陰性とする必要がある。
なお、上記実施例では、生体試料として核酸を例示したが、本発明はこれに限定されるものではなく、その他の生体試料でも本発明で提示した課題を有するものについては、適用することが可能である。
本発明は、従来の方法と比較して、複数の標識された核酸およびタンパク質を精度よく検出および定量することができる。特に、波長帯が重なり合う蛍光および発光体を用いた場合に大きな効果が得られる。
標識するための蛍光体、発光体および放射性同位体の使用量が下がり、分析１回あたりの検体数が増やせるため、標識された生体試料の生成と分析のためのコストダウンが図れる。
標識するための蛍光体、発光体および放射性同位体の使用量が下がり、分析１回あたりの検体数が増やせるため、標識された生体試料の生成と分析のためのコストダウンが図れる。
Claims (16)
- ２種類以上の生体試料を合成し、合成された生体試料に、種類別に波長の異なる標識を付加し、それらの標識を検出することにより、生体試料を分析する方法において、
前記生体試料の標識の検出強度を、生体試料の種類別に調整し、特に検出される標識のうち、波長帯域が他方の標識に影響を及ぼす度合いの大きい方の検出強度を弱めることにより、生体試料を分析する生体試料の分析方法。 - ２種類以上の生体試料を合成し、その合成に用いる物質（以下、「合成用物質」と称する）に、種類別に波長の異なる標識を付加する或いは標識結合用媒体を付加することにより、生体試料を合成過程或いは合成後に標識化し、それらの標識を検出することにより、生体試料を分析する方法において、
少なくとも或る一種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体の量を、他の種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体よりも少なくなるように調整して、生体試料を標識化する生体試料の分析方法。 - 請求項２において、２種類以上の前記生体試料は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と称する）法により合成される核酸であり、前記合成用物質は、プライマーであり、前記標識は、蛍光体または発光体または放射性同位体であり、前記標識結合用媒体は、修飾基或いは抗体である生体試料の分析方法。
- 請求項２において、前記標識は、極大波長を基準にして短波長側が急で長波長側がなだらかな勾配のスペクトルを持つ標識化合物で、複数種の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体の量は、波長の短い方の標識或いは該標識と結合する標識結合用媒体を、波長の長い方の標識或いは該標識と結合する標識結合用媒体よりも少なくする生体試料の分析方法。
- 請求項２において、少なくとも或る一種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体と、他の種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体との量比を、１：２〜１：５０好ましくは１：５〜１：１０に設定する生体試料の分析方法。
- 請求項２において、２種類以上の前記生体試料は、ポリメラーゼ連鎖反応法により合成される核酸であり、
生体試料を合成する反応液中には、前記合成用物質として、前記標識または前記標識結合用媒体となる修飾基または抗体を修飾したプライマーと、前記標識または前記修飾基または前記抗体を有さないプライマーとが含まれている生体試料の分析方法。 - 請求項２において、２種類以上の前記生体試料は、ポリメラーゼ連鎖反応法により合成される核酸であり、
生体試料を合成する反応液中には、前記合成用物質として、前記標識または前記標識結合用媒体となる修飾基または抗体を修飾したプライマーと、前記標識または前記修飾基または前記抗体を有さないプライマーとが、種類別に１：１〜１：５０，好ましくは、１：５〜１：１０の量比で調整されている生体試料の分析方法。 - 請求項２において、前記標識は、蛍光体であり、
この蛍光体は、ＣｙＤｙｅ、Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）、ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＥＸ）、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＲＯＸ）、ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＡＭＲＡ）、ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＴＥＴ）、スルホローダミン１０１酸クロリド（商品名：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ登録商標）のいずれかである生体試料の分析方法。 - 請求項２において、前記標識は、発光体であり、
この発光体試料は、
３−（２’ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（３”−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ（商品名：ＡＭＰＰＤ登録商標）、ＣＳＰＤＴＭ、ＭＤＰＴＭ、ＣＤＰＴＭのいずれかである生体試料の分析方法。 - 請求項２において、前記標識は、生体試料に修飾される放射性同位体であり、
この放射性同位体は、３２Ｐ、１３１Ｉ、３５Ｓ、４５Ｃａ、３Ｈ、１４Ｃのいずれかである生体試料の分析方法。 - ２種類以上の生体試料の合成に用いる物質（以下、「合成用物質」と称する）を含む反応液で、反応液中には、生体試料の種類を識別するための標識或いはその標識の結合用媒体が付加された合成用物質と、付加されない合成用物質とが含まれ、前記標識は、波長により識別される物質であり、
少なくとも或る一種類の合成用物質の標識或いは標識結合用媒体の付加率を、他の種類の合成用物質の標識或いは標識結合用媒体の付加率よりも小さくなるように調整されている生体試料の反応液。 - 請求項１１において、前記反応液は、ＰＣＲ法に用いるプライマーであり、前記標識は、蛍光体または発光体または放射性同位体であり、前記標識結合用媒体は、修飾基或いは抗体である生体試料の反応液。
- 請求項１１において、前記標識は、極大波長を基準にして短波長側が急で長波長側がなだらかな勾配のスペクトルを持つ標識化合物で、前記付加率の小さい方は、波長の短い方の標識或いはその標識結合用媒体である生体試料の反応液。
- 請求項１１において、少なくとも或る一種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体と、他の種類の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体との量比を、１：２〜１：５０好ましくは１：５〜１：１０に設定する生体試料の反応液。
- 合成された生体試料を、生体試料に付加された標識を介して測定する検出器と、前記検出器で測定されたスペクトルに基づき１以上の生体試料を分析する機能を有する演算装置とを備えた生体試料の分析装置において、
前記演算装置は、混在する２種類以上の生体試料を分析する場合に、少なくとも或る一種類の生体試料の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体の付加率を、他の種類の生体試料の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体の付加率よりも小さくしたときに、それらの標識の測定データを補正せずそのまま分析計算式に用いる生体試料の分析装置。 - 合成された生体試料を、生体試料に付加された標識を介して測定する検出器と、前記検出器で測定されたスペクトルに基づき１以上の生体試料を分析する機能を有する演算装置とを備えた生体試料の分析装置において、
前記演算装置は、混在する２種類以上の生体試料を分析する場合に、少なくとも或る一種類の生体試料の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体の付加率を、他の種類の生体試料の合成用物質に付加される標識或いは標識結合用媒体の付加率よりも小さくしたときに、それらの付加率に関するデータを入力可能にし、その付加率データと測定データに基づき各生体試料の定量を演算する生体試料の分析装置。
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| PCT/JP2003/016572 WO2005062047A1 (ja) | 2003-12-24 | 2003-12-24 | 生体試料の分析方法、反応液、及び分析装置 |
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