JPWO2005049825A1 - 発芽バキュロウィルスを用いたｇ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達の検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、発芽型バキュロウイルスを用いてリガンド刺激依存性のｃＡＭＰ産生を測定することにより、ＧＰＣＲ（Ｇ蛋白質共役型受容体）のシグナル伝達を検出する方法を開発することである。本発明によれば、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収し、該発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることを含む、Ｇ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法が提供される。
Description
本発明は、発芽バキュロウィルスを用いたＧ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法に関する。より詳細には、本発明は、宿主から放出される発芽バキュロウイルス中にＧ蛋白質共役型受容体蛋白質、Ｇ蛋白質及びアデニル酸シクラーゼを同時発現させ、この発芽バキュロウイルスを用いてＧ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法に関する。
バキュロウイルス発現系はバキュロウイルスの高発現蛋白質、特には多角体蛋白質（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子のプロモーターなどを利用して、目的遺伝子を昆虫細胞（Ｓｆ９細胞など）で組換えを起こさせて、大量に発現させる系である。多角体遺伝子に組換えタンパク質を導入し、発現したタンパク質を精製する系バキュロの発現系は、大腸菌やイースト菌を用いる発現系に比べ、膜蛋白質などの疎水性領域を多く持つ蛋白質でも発現タンパク質が凝集を作りにくく、また糖鎖の付加や金属イオンの配位などタンパクの機能に必要な翻訳後修飾がはいるなど利点が多いため膜受容体蛋白質の発現系として多用されている（Ｔａｔｅ ＣＧ，Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ Ｒ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９６，１４，ｐｐ４２６−４３０，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；及びＧｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ Ｒ，Ｔａｔｅ ＣＧ，Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １９９５，２８，ｐｐ３１５−４２２，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ）
バキュロウイルスには多角体蛋白質を被った多角体ウイルスとなって核内に存在する他にもう一つの生活環があり、ウイルスが増殖して他の細胞や個体に感染するために，発芽型のウイルス（Ｂｕｄｄｅｄ ｖｉｒｕｓ）となってＳｆ９細胞の細胞膜を被って細胞外にでる。この際に上記の多角体蛋白質に組換えた７回膜貫通型受容体がＳｆ９の細胞膜に発現され、発芽したバキュロウイルスのエンベロープ上に回収されることがＬｏｉｓｅｌらによって報告された（Ｌｏｉｓｅｌ ＴＰ，Ａｎｓａｎａｙ Ｈ，Ｓｔ−Ｏｎｇｅ Ｓ，Ｇａｙ Ｂ，Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ Ｐ，Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ ＡＤ，Ｍａｒｕｌｌｏ Ｓ，Ｂｏｕｖｉｅｒ Ｍ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，Ｎｏｖ．１５（１２），ｐｐ１３００−１３０４，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｅｔａ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。宿主細胞に発現された７回膜貫通型受容体は糖鎖構造など機能的でないものが多いのにくらべ、ウイルスエンベロープ上に回収される受容体は機能的な蛋白質のみであることが報告されている。
またＳＲＥＢＰ（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）２、ＨＭＧ−ＣｏＡ（ヒドロキシメチルクルタリルコエンザイムＡ）還元酵素、ＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＰ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｓ１Ｐ（ｓｉｔｅ １ ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの小胞体（ＥＲ）膜あるいはゴルジ体膜に分布する細胞内コレステロールフィードバック調節に関与する膜蛋白質群も機能を保ったままウイルスエンベロープ上に発現されることが報告された（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｇ．，Ｓｈｉｒａｉ，Ｈ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．，Ｈａｍａｋｕｂｏ，Ｔ．，ａｎｄ Ｋｏｄａｍａ，Ｔ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１５１，ｐ２９０，２０００，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）。
一方、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ；Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は創薬のターゲットとして重要であり、ゲノムベースで約７００種と報告され（Ｖｅｎｔｅｒ ＪＧ，Ａｄａｍｓ ＭＤ，Ｍｙｅｒｓ ＥＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１，ｐｐ１３０４−１３５１，２００１，Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ）、ホルモンのシグナル伝達機構の研究も進んでいる（Ｔａｔｅ ＣＧ，Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９６，１４，ｐｐ４２６−４３０，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。ＧＰＣＲは膜貫通ドメインを７つもち３量体Ｇ蛋白質と共役している。リガンド結合の際に共役（カップリング）するＧ蛋白質αサブユニットの種類は受容体ごとに決まっており，例えばロイコトリエンＢ４受容体の場合はＧｉあるいはＧｑである（Ｉｇａｒａｓｈｉ Ｔ，Ｙｏｋｏｍｉｚｏ Ｔ，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｏ，Ｔａｋｅｔａｎｉ Ｙ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｔ ａｎｄ Ｉｚｕｍｉ Ｔ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９，ｐｐ４１９−４２５，１９９９，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｕｋｏｔｉｅｎｅ Ｂ４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。アドレナリン受容体の場合はＧｓが共役することが知られており、Ｌｏｉｓｅｌらの報告によるとＳｆ９細胞由来のＧｓが共役して発現し、発芽ウイルス上にもコンプレックスを形成しているとされている（Ｌｏｉｓｅｌ ＴＰ，Ａｎｓａｎａｙ Ｈ，Ｓｔ−Ｏｎｇｅ Ｓ，Ｇａｙ Ｂ，Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ Ｐ，Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ ＡＤ，Ｍａｒｕｌｌｏ Ｓ，Ｂｏｕｖｉｅｒ Ｍ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，Ｎｏｖ．１５（１２），ｐｐ１３００−１３０４，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｅｔａ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。Ｓｆ９細胞には哺乳類細胞と同様にＧ蛋白質の各種のアイソフォームが発現しているとされているが、その量はＧ蛋白質の種類によって差がある（Ｌｅｏｐｏｌｄｔ Ｄ，Ｈａｒｔｅｎｅｃｋ Ｃ，Ｎｕｒｎｂｅｒｇ Ｒ，Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３５６，ｐｐ２１６−２２４，１９９７，Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｓｆ９ ｃｅｌｌｓ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。ＧｓはＳｆ９細胞には比較的多く存在しているため、Ｌｏｉｓｅｌらの系ではウイルスに発現したアドレナリン受容体が昆虫細胞由来のＧｓと共役し機能的な膜受容体が発現されたが、Ｓｆ９には比較的量が少ないＧｉ等の他のＧαアイソフォームと共役する受容体（例えば、ロイコトリエンＢ４受容体など）の場合には、そのまま発現させても親和性の高い機能的な受容体を得ることは困難である。
また、特開２００３−５２３７０号公報には、Ｇ蛋白質などの相互作用蛋白質をコードする遺伝子及びＧ蛋白質共役型受容体蛋白質などの膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に該相互作用蛋白質と該膜型受容体蛋白質とを同時発現させることを含む、機能を有する膜型受容体蛋白質を発現する方法が記載されている。しかしながら、発芽型バキュロウイルスを用いてリガンド刺激依存性のｃＡＭＰ産生を測定することにより、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のシグナル伝達を検出できることについては現在までの所、全く報告がない。
バキュロウイルスには多角体蛋白質を被った多角体ウイルスとなって核内に存在する他にもう一つの生活環があり、ウイルスが増殖して他の細胞や個体に感染するために，発芽型のウイルス（Ｂｕｄｄｅｄ ｖｉｒｕｓ）となってＳｆ９細胞の細胞膜を被って細胞外にでる。この際に上記の多角体蛋白質に組換えた７回膜貫通型受容体がＳｆ９の細胞膜に発現され、発芽したバキュロウイルスのエンベロープ上に回収されることがＬｏｉｓｅｌらによって報告された（Ｌｏｉｓｅｌ ＴＰ，Ａｎｓａｎａｙ Ｈ，Ｓｔ−Ｏｎｇｅ Ｓ，Ｇａｙ Ｂ，Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ Ｐ，Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ ＡＤ，Ｍａｒｕｌｌｏ Ｓ，Ｂｏｕｖｉｅｒ Ｍ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，Ｎｏｖ．１５（１２），ｐｐ１３００−１３０４，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｅｔａ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。宿主細胞に発現された７回膜貫通型受容体は糖鎖構造など機能的でないものが多いのにくらべ、ウイルスエンベロープ上に回収される受容体は機能的な蛋白質のみであることが報告されている。
またＳＲＥＢＰ（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）２、ＨＭＧ−ＣｏＡ（ヒドロキシメチルクルタリルコエンザイムＡ）還元酵素、ＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＰ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｓ１Ｐ（ｓｉｔｅ １ ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの小胞体（ＥＲ）膜あるいはゴルジ体膜に分布する細胞内コレステロールフィードバック調節に関与する膜蛋白質群も機能を保ったままウイルスエンベロープ上に発現されることが報告された（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｇ．，Ｓｈｉｒａｉ，Ｈ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．，Ｈａｍａｋｕｂｏ，Ｔ．，ａｎｄ Ｋｏｄａｍａ，Ｔ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１５１，ｐ２９０，２０００，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）。
一方、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ；Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は創薬のターゲットとして重要であり、ゲノムベースで約７００種と報告され（Ｖｅｎｔｅｒ ＪＧ，Ａｄａｍｓ ＭＤ，Ｍｙｅｒｓ ＥＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１，ｐｐ１３０４−１３５１，２００１，Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ）、ホルモンのシグナル伝達機構の研究も進んでいる（Ｔａｔｅ ＣＧ，Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９６，１４，ｐｐ４２６−４３０，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。ＧＰＣＲは膜貫通ドメインを７つもち３量体Ｇ蛋白質と共役している。リガンド結合の際に共役（カップリング）するＧ蛋白質αサブユニットの種類は受容体ごとに決まっており，例えばロイコトリエンＢ４受容体の場合はＧｉあるいはＧｑである（Ｉｇａｒａｓｈｉ Ｔ，Ｙｏｋｏｍｉｚｏ Ｔ，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｏ，Ｔａｋｅｔａｎｉ Ｙ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｔ ａｎｄ Ｉｚｕｍｉ Ｔ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９，ｐｐ４１９−４２５，１９９９，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｕｋｏｔｉｅｎｅ Ｂ４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。アドレナリン受容体の場合はＧｓが共役することが知られており、Ｌｏｉｓｅｌらの報告によるとＳｆ９細胞由来のＧｓが共役して発現し、発芽ウイルス上にもコンプレックスを形成しているとされている（Ｌｏｉｓｅｌ ＴＰ，Ａｎｓａｎａｙ Ｈ，Ｓｔ−Ｏｎｇｅ Ｓ，Ｇａｙ Ｂ，Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ Ｐ，Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ ＡＤ，Ｍａｒｕｌｌｏ Ｓ，Ｂｏｕｖｉｅｒ Ｍ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，Ｎｏｖ．１５（１２），ｐｐ１３００−１３０４，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｅｔａ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。Ｓｆ９細胞には哺乳類細胞と同様にＧ蛋白質の各種のアイソフォームが発現しているとされているが、その量はＧ蛋白質の種類によって差がある（Ｌｅｏｐｏｌｄｔ Ｄ，Ｈａｒｔｅｎｅｃｋ Ｃ，Ｎｕｒｎｂｅｒｇ Ｒ，Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３５６，ｐｐ２１６−２２４，１９９７，Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｓｆ９ ｃｅｌｌｓ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。ＧｓはＳｆ９細胞には比較的多く存在しているため、Ｌｏｉｓｅｌらの系ではウイルスに発現したアドレナリン受容体が昆虫細胞由来のＧｓと共役し機能的な膜受容体が発現されたが、Ｓｆ９には比較的量が少ないＧｉ等の他のＧαアイソフォームと共役する受容体（例えば、ロイコトリエンＢ４受容体など）の場合には、そのまま発現させても親和性の高い機能的な受容体を得ることは困難である。
また、特開２００３−５２３７０号公報には、Ｇ蛋白質などの相互作用蛋白質をコードする遺伝子及びＧ蛋白質共役型受容体蛋白質などの膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に該相互作用蛋白質と該膜型受容体蛋白質とを同時発現させることを含む、機能を有する膜型受容体蛋白質を発現する方法が記載されている。しかしながら、発芽型バキュロウイルスを用いてリガンド刺激依存性のｃＡＭＰ産生を測定することにより、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のシグナル伝達を検出できることについては現在までの所、全く報告がない。
本発明は上記した問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、発芽型バキュロウイルスを用いてリガンド刺激依存性のｃＡＭＰ産生を測定することにより、ＧＰＣＲ（Ｇ蛋白質共役型受容体）のシグナル伝達を検出する方法を開発することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特開２００３−５２３７０号公報に記載したバキュロウイルスへ機能的なＧＰＣＲとＧ蛋白質を発現する技術を用いて、ドパミン受容体Ｄ１、三量体Ｇ蛋白質のＧαｓ、Ｇβ、Ｇγサブユニット、更にエフェクターであるアデニル酸シクラーゼの各遺伝子を有するリコンビナントウイルスの共感染により、発芽型バキュロウイルスのエンベロープ上に受容体複合体を再構成し、リガンドであるドパミン刺激により活性化されたＧ蛋白質とアデニル酸シクラーゼとの相互作用を、活性化アデニル酸シクラーゼによるｃＡＭＰ産生を測定することによって、リガンド結合による受容体を介したシグナル伝達を測定できることを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収し、該発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることを含む、Ｇ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルス、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルス、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収し、該発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることを含む、Ｇ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法が提供される。
好ましくは、宿主は昆虫細胞又は昆虫幼虫である。
本発明においては、被験物質の存在下において発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることによってＧ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を分析し、該相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングすることができる。
本発明の別の側面によれば、上記のスクリーニングにより得られる、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害する物質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主から放出される発芽バキュロウイルスであって、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質、Ｇ蛋白質及びアデニル酸シクラーゼを機能的に提示している発芽バキュロウイルスが提供される。好ましくは、宿主は昆虫細胞又は昆虫幼虫である。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特開２００３−５２３７０号公報に記載したバキュロウイルスへ機能的なＧＰＣＲとＧ蛋白質を発現する技術を用いて、ドパミン受容体Ｄ１、三量体Ｇ蛋白質のＧαｓ、Ｇβ、Ｇγサブユニット、更にエフェクターであるアデニル酸シクラーゼの各遺伝子を有するリコンビナントウイルスの共感染により、発芽型バキュロウイルスのエンベロープ上に受容体複合体を再構成し、リガンドであるドパミン刺激により活性化されたＧ蛋白質とアデニル酸シクラーゼとの相互作用を、活性化アデニル酸シクラーゼによるｃＡＭＰ産生を測定することによって、リガンド結合による受容体を介したシグナル伝達を測定できることを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収し、該発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることを含む、Ｇ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルス、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルス、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収し、該発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることを含む、Ｇ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法が提供される。
好ましくは、宿主は昆虫細胞又は昆虫幼虫である。
本発明においては、被験物質の存在下において発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることによってＧ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を分析し、該相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングすることができる。
本発明の別の側面によれば、上記のスクリーニングにより得られる、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害する物質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主から放出される発芽バキュロウイルスであって、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質、Ｇ蛋白質及びアデニル酸シクラーゼを機能的に提示している発芽バキュロウイルスが提供される。好ましくは、宿主は昆虫細胞又は昆虫幼虫である。
図１は、受容体・Ｇ蛋白質・エフェクター蛋白質（アデニル酸シクラーゼ）共発現ウイルスでのリガンド刺激に伴うエフェクターの活性化を測定した結果を示す。ドパミン受容体（ＤＲＤ１）、Ｇαｓβγ、アデニレートシクラーゼ（ＡＣＶＩ）を共発現し、ドパミンで刺激し、Ｇαを活性化し、ＧαがＡＣＶＩに結合し、ＡＣＶＩが活性化し、ｃＡＭＰが産生する。
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
本発明は、発芽型バキュロウイルスによる膜蛋白質複合体の発現系を用いて、ウイルスにおけるリガンド刺激依存性のｃＡＭＰ産生を測定することにより、ＧＰＣＲ（Ｇ蛋白質共役型受容体）のシグナル伝達を検出する系に関するものである。
本明細書の下記実施例においては、特開２００３−５２３７０号公報に記載のバキュロウイルスへ機能的なＧＰＣＲとＧ蛋白質を発現する技術を利用して、ドパミン受容体Ｄ１、三量体Ｇ蛋白質のＧα、Ｇβ、Ｇγサブユニット、更にエフェクターであるアデニル酸シクラーゼの各遺伝子を有するリコンビナントウイルスの共感染により、発芽型バキュロウイルスのエンベロープ上に受容体複合体を再構成し、リガンドであるドパミン刺激により活性化されたＧ蛋白質とアデニル酸シクラーゼとの相互作用を、活性化アデニル酸シクラーゼによるｃＡＭＰ産生を測定することによって、リガンド結合による受容体を介したシグナル伝達を測定することに成功した。
本発明によるＧ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法は、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収し、該発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることを特徴とするものである。本発明では、上記のように３種類の蛋白質を共発現させるものであるが、上記３種類の蛋白質をコードする遺伝子は同一の組換えバキュロウィルス中に含めてもよいし、異なる組換えバキュロウイルス中に含めてもよい。
本明細書で言うＧ蛋白質共役型受容体とは、リガンドと相互作用（結合）する能力を有する受容体であって、リガンドとの相互作用に起因する情報をＧ蛋白質と共役することにより細胞内に伝達することができる蛋白質である。
Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲとも略記される）は、７回膜貫通型受容体とも呼ばれ、ホルモンや光、におい、味などの刺激に反応してシグナルを細胞内に伝達する膜型受容体である。ヒトゲノム上ににおい受容体を含めて７００種類程度の遺伝子が存在していることが知られている。これらの多くは、ホルモンやケモカインの受容体であることから、創薬のターゲットとして重要視されている。ＧＰＣＲはリガンドと結合して三量体Ｇ蛋白質を活性化し、三量体Ｇ蛋白質のＧαサブユニットは解離して、エフェクター蛋白質と相互作用を起こしてシグナルを伝播する。ＧＰＣＲはＧ蛋白質と共役することによって高親和性を保っており、このシグナルを検出することは、受容体に対するリガンドの特定や阻害剤のスクリーニングに重要である。
Ｇタンパク質共役型受容体においては、三量体Ｇタンパク質と受容体タンパク質との共役に加えて、β２アドレナリン受容体とβ−アレスチン（β−ａｒｒｅｓｔｉｎ）あるいはＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ，ＧＲＫ）との相互作用、メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍｇｌｕ）とホーマータンパク質（Ｈｏｍｅｒ）との相互作用、β２アドレナリン受容体とＮａ＋、Ｈ＋交換因子（Ｎａ＋，Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ）との相互作用など（Ｈｅｕｓｓ，Ｃ．ａｎｄ Ｇｅｒｂｅｒ，Ｕ．Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０００）２３，４６９−４７５）が挙げられる。
また、メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍｇｌｕ）とＲＧＳ４、インターロイキン８Ｂ受容体とＲＧＳ１２との結合など、ＲＧＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質とよばれるＧαサブユニットに結合するＲＧＳドメインを持つ一群の蛋白質（Ｈｅｐｌｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ＲＧＳ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．ＴｉＰＳ（１９９９）２０，３７６−３８２）とＧタンパク質あるいはその共役型受容体との相互作用がある。
Ｇ蛋白質の具体例としては、３量体Ｇ蛋白質が挙げられる。Ｇ蛋白質のαサブユニットとして次のものが挙げられる。ＧｓクラスのＧｓα、Ｇｏｌｆα。ＧｉクラスのＧｉ１α、Ｇｉ２α、Ｇｉ３α、Ｇｏ１α、Ｇｏ２α、Ｇｔ１α、Ｇｔ２α、Ｇｇｕｓｔα。ＧｑクラスのＧｑα、Ｇ１１α、Ｇ１４α、Ｇ１５α、Ｇ１６α。Ｇ１２クラスのＧ１２α、Ｇ１３α。またこれらαサブユニットと三量体を形成するβおよびγサブユニットとして、それぞれβ１からβ５までおよびγ１からγ１１まで挙げられる。
Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質（そのリガンドを括弧内に示す）の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（１）ロドプシン／βアドレナリン受容体様Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質として、ＢＬＴ１（ロイコトリエンＢ４），ＥＴＡ，ＥＴＢ（エンドセリン），ＡＴ１（アンギオテンシン），ＥＤＧ（スフィンゴシンリン酸），ＣＣＲ，ＣＸＣＲ（ケモカイン），α１、α２、β１、β２、β３（ノルエピネフリン）、Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３（アセチルコリン）、５−ＨＴ１Ａ（セロトニン）、ＮＫ−１（サブスタンスＰ）、Ｙ１（ニューロペプチドＹ）、Ｂ１，Ｂ２（ブラジキニン）、Ｖ１Ａ（バソプレッシン）、ＣＢ１，ＣＢ２（アナンダマイド），Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３（ドーパミン），におい受容体，ＭＴ１，ＭＴ２，ＭＴ３（メラトニン），光受容体などが挙げられる。
（２）グルカゴン／ＶＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）／カルシトニン受容体様Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質として、カルシトニン受容体（カルシトニン）、ＶＩＰ１，ＶＩＰ２（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＣＲＦ１（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ），ＰＴＨ受容体（パラトルモン）などが挙げられる。
（３）代謝型神経伝達物質／カルシウム受容体様Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質として、ｍｇｌｕ１，ｍｇｌｕ２（グルタミン酸）、ＧＡＢＡＢ（γ−アミノ酪酸），味受容体などが挙げられる。
（Ｇｅｔｈｅｒ，Ｕ．Ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０００）２１，９０−１１３）（１９９８ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８）
本発明では、上記したような発現させるための蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを使用する。
昆虫に感染して病気を起こすウイルスであるバキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルスで、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。バキュロウイルスの中で、感染細胞の核内に多角体（ポリヒドラ）と呼ばれる封入体を大量につくる一群のウイルスが核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多角体は、分子量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより構成され、感染後期に大量につくられその中に多数のウイルス粒子を埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然界で生存するためには必須であるが、ウイルスの増殖そのものには必要ないので、多角体遺伝子の代わりに発現させたい外来遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障なく感染し増殖する。
本発明で用いられるバキュロウイルスとしては、ＮＰＶのキンウワバ亜科のオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）やカイコのボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）などのウイルスがベクターとして用いることができる。
ＡｃＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ細胞）などが挙げられ、ＢｍＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはＢｍＮ４細胞などが挙げられる。Ｓｆ細胞は、ＢｍＮ４細胞などに比べ増殖速度が速いこと、また、ＡｃＮＰＶはヒト肝細胞およびヒト胎児腎細胞などにも感染する能力を有することから、ＡｃＮＰＶ系のベクターが好ましい。
宿主としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統Ｓｆ９およびＳｆ２１などがＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ幼虫の卵巣組織から確立しており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社あるいはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、又はＡＴＣＣなどから入手可能である。さらに、生きている昆虫幼虫を宿主細胞系として使用することもできる。
本発明で用いる組換えウイルスを構築する方法は、常法に従って行えばよく、例えば次の手順で行うことができる。
先ず、発現させたい蛋白質の遺伝子（即ち、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子）をトランスファーベクターに挿入して組換えトランスファーベクターを構築する。
トランスファーベクターの全体の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度であり、そのうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アンピシリン等の抗生物質耐性遺伝子と細菌のＤＮＡ複製開始のシグナルを含んでいる。通常のトランスファーベクターではこの骨格以外に、多角体遺伝子の５’領域と３’領域をそれぞれ数ｋｂずつ含み、以下に述べるようなトランスフェクションを行った際に、この配列間で目的遺伝子と多角体遺伝子との間で相同組換えが引き起こる。また、トランスファーベクターには蛋白質遺伝子を発現させるためのプラモーターを含むことが好ましい。プロモーターとしては、多角体遺伝子のプロモーター、ｐ１０遺伝子のプロモーター、キャプシド遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
トランスファーベクターの種類は特に限定されない。トランスファーベクターの具体例としては、ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＥＶｍＸＩＶ２、ｐＡｃＳＧ１、ｐＶＬ１３９２／１３９３、ｐＡｃＭＰ２／３、ｐＡｃＪＰ１、ｐＡｃＵＷ２１、ｐＡｃＤＺ１、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＡｃＵＷ５１、ｐＡｃＡＢ３、ｐＡｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＴ−Ｂａｃ３３、ｐＡｃＵＷ１、ｐＡｃＵＷ４２／４３などが挙げられ、ＢｍＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＢＫ２８３、ｐＢＫ５、ｐＢＢ３０、ｐＢＥ１、ｐＢＥ２、ｐＢＫ３、ｐＢＫ５２、ｐＢＫｂｌｕｅ、ｐＢＫｂｌｕｅ２、ｐＢＦシリーズ（以上、フナコシ株式会社、藤沢薬品工業株式会社等から入手可能）などが挙げられる。
次に、組換えウイルスを作製するために、上記の組換えトランスファーベクターをウイルスと混合した後、宿主として用いる培養細胞に移入するか、あるいは予めウイルスで感染させた宿主として用いる培養細胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えトランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウイルスを構築する。
ここで宿主として用いる培養細胞とは、上記した宿主が挙げられ、通常、昆虫培養細胞（Ｓｆ９細胞やＢｍＮ細胞など）である。培養条件は、当業者により適宜決定されるが、具体的にはＳｆ９細胞を用いた場合は１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８℃前後で培養することが好ましい。このようにして構築された組み換えウイルスは、常法、例えばプラークアッセイなどによって精製することができる。なお、このようにして作製された組換えウイルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を形成することができないため、非組換えウイルスと容易に区別することが可能である。
本発明の方法では、前記の組換えバキュロウイルスを、上記した適当な宿主（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統Ｓｆ９およびＳｆ２１などの培養細胞、又は昆虫幼虫など）に感染させ、一定時間後（例えば、７２時間後等）に培養上清から細胞外発芽ウイルス（ｂｕｄｄｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＢＶ）を遠心などの分離操作によって回収する。なお、組換えバキュロウイルスは１種類のみ感染させてもよいし、２種類以上の組換えバキュロウイルスを組み合わせて共感染させてもよい。
細胞外発芽バキュロウイルスの回収は、例えば、以下のように行うことができる。
先ず感染細胞の培養液を５００〜１，０００ｇで遠心分離して、細胞外発芽バキュロウイルスを含む上清を回収する。この上清を約３０，０００〜５０，０００ｇで遠心分離して細胞外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を得ることができる。上記のようにして回収される発芽バキュロウイルスは、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質、Ｇ蛋白質、及びアデニル酸シクラーゼを生理活性を有する状態で含んでおり、当該発芽バキュロウイルス自体も本発明の範囲内である。即ち、当該発芽バキュロウイルスは、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質、Ｇ蛋白質及びアデニル酸シクラーゼを機能的に提示していることを特徴とする。
本発明においては、上記のようにして調製した発芽バキュロウイルスを使用し、被験物質の存在下において発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることによって、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を分析し、これにより該相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングすることができる。
生成するｃＡＭＰのアッセイ方法は特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。一例としては、エンザイムイムノアッセイの原理を用いて、固相に結合させた抗ｃＡＭＰ抗体へのペルオキシダーゼ標識ｃＡＭＰの結合を、活性化アデニル酸シクラーゼにより生成されたｃＡＭＰが競合的に阻害することを利用して、酵素反応による発色の減少を測定することにより、ｃＡＭＰをアッセイすることができる。なお、ｃＡＭＰのアッセイは、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ｃＡＭＰ Ｂｉｏｔｒａｋ Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍキットなどの市販のキットを使用して行うこともできる。
上記したスクリーニングに供される被験物質としては、例えばペプチド、ポリペプチド、合成化合物、微生物発酵物、生物体（植物又は動物の組織、微生物、又は細胞などを含む）からの抽出物、あるいはそれらのライブラリーが挙げられる。ライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。スクリーニングに供される化学物質は、天然物でも合成物でもよく、また候補となる単一の化学物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる化学物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。また、細胞抽出物のような混合物を分画したものについてスクリーニングを行い、分画を重ねて、所望の活性を有する物質を単離することも可能である。
これらの被験物質は、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害することが予想される物質であることが好ましい。
本発明のスクリーニング方法により、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質に対する阻害薬または活性化薬物をスクリーニングすることが可能である。本発明のスクリーニング方法により得られる、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害する物質も本発明の範囲内である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
本発明は、発芽型バキュロウイルスによる膜蛋白質複合体の発現系を用いて、ウイルスにおけるリガンド刺激依存性のｃＡＭＰ産生を測定することにより、ＧＰＣＲ（Ｇ蛋白質共役型受容体）のシグナル伝達を検出する系に関するものである。
本明細書の下記実施例においては、特開２００３−５２３７０号公報に記載のバキュロウイルスへ機能的なＧＰＣＲとＧ蛋白質を発現する技術を利用して、ドパミン受容体Ｄ１、三量体Ｇ蛋白質のＧα、Ｇβ、Ｇγサブユニット、更にエフェクターであるアデニル酸シクラーゼの各遺伝子を有するリコンビナントウイルスの共感染により、発芽型バキュロウイルスのエンベロープ上に受容体複合体を再構成し、リガンドであるドパミン刺激により活性化されたＧ蛋白質とアデニル酸シクラーゼとの相互作用を、活性化アデニル酸シクラーゼによるｃＡＭＰ産生を測定することによって、リガンド結合による受容体を介したシグナル伝達を測定することに成功した。
本発明によるＧ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法は、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収し、該発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることを特徴とするものである。本発明では、上記のように３種類の蛋白質を共発現させるものであるが、上記３種類の蛋白質をコードする遺伝子は同一の組換えバキュロウィルス中に含めてもよいし、異なる組換えバキュロウイルス中に含めてもよい。
本明細書で言うＧ蛋白質共役型受容体とは、リガンドと相互作用（結合）する能力を有する受容体であって、リガンドとの相互作用に起因する情報をＧ蛋白質と共役することにより細胞内に伝達することができる蛋白質である。
Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲとも略記される）は、７回膜貫通型受容体とも呼ばれ、ホルモンや光、におい、味などの刺激に反応してシグナルを細胞内に伝達する膜型受容体である。ヒトゲノム上ににおい受容体を含めて７００種類程度の遺伝子が存在していることが知られている。これらの多くは、ホルモンやケモカインの受容体であることから、創薬のターゲットとして重要視されている。ＧＰＣＲはリガンドと結合して三量体Ｇ蛋白質を活性化し、三量体Ｇ蛋白質のＧαサブユニットは解離して、エフェクター蛋白質と相互作用を起こしてシグナルを伝播する。ＧＰＣＲはＧ蛋白質と共役することによって高親和性を保っており、このシグナルを検出することは、受容体に対するリガンドの特定や阻害剤のスクリーニングに重要である。
Ｇタンパク質共役型受容体においては、三量体Ｇタンパク質と受容体タンパク質との共役に加えて、β２アドレナリン受容体とβ−アレスチン（β−ａｒｒｅｓｔｉｎ）あるいはＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ，ＧＲＫ）との相互作用、メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍｇｌｕ）とホーマータンパク質（Ｈｏｍｅｒ）との相互作用、β２アドレナリン受容体とＮａ＋、Ｈ＋交換因子（Ｎａ＋，Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ）との相互作用など（Ｈｅｕｓｓ，Ｃ．ａｎｄ Ｇｅｒｂｅｒ，Ｕ．Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０００）２３，４６９−４７５）が挙げられる。
また、メタボトロピックグルタミン酸受容体（ｍｇｌｕ）とＲＧＳ４、インターロイキン８Ｂ受容体とＲＧＳ１２との結合など、ＲＧＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質とよばれるＧαサブユニットに結合するＲＧＳドメインを持つ一群の蛋白質（Ｈｅｐｌｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ＲＧＳ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．ＴｉＰＳ（１９９９）２０，３７６−３８２）とＧタンパク質あるいはその共役型受容体との相互作用がある。
Ｇ蛋白質の具体例としては、３量体Ｇ蛋白質が挙げられる。Ｇ蛋白質のαサブユニットとして次のものが挙げられる。ＧｓクラスのＧｓα、Ｇｏｌｆα。ＧｉクラスのＧｉ１α、Ｇｉ２α、Ｇｉ３α、Ｇｏ１α、Ｇｏ２α、Ｇｔ１α、Ｇｔ２α、Ｇｇｕｓｔα。ＧｑクラスのＧｑα、Ｇ１１α、Ｇ１４α、Ｇ１５α、Ｇ１６α。Ｇ１２クラスのＧ１２α、Ｇ１３α。またこれらαサブユニットと三量体を形成するβおよびγサブユニットとして、それぞれβ１からβ５までおよびγ１からγ１１まで挙げられる。
Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質（そのリガンドを括弧内に示す）の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（１）ロドプシン／βアドレナリン受容体様Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質として、ＢＬＴ１（ロイコトリエンＢ４），ＥＴＡ，ＥＴＢ（エンドセリン），ＡＴ１（アンギオテンシン），ＥＤＧ（スフィンゴシンリン酸），ＣＣＲ，ＣＸＣＲ（ケモカイン），α１、α２、β１、β２、β３（ノルエピネフリン）、Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３（アセチルコリン）、５−ＨＴ１Ａ（セロトニン）、ＮＫ−１（サブスタンスＰ）、Ｙ１（ニューロペプチドＹ）、Ｂ１，Ｂ２（ブラジキニン）、Ｖ１Ａ（バソプレッシン）、ＣＢ１，ＣＢ２（アナンダマイド），Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３（ドーパミン），におい受容体，ＭＴ１，ＭＴ２，ＭＴ３（メラトニン），光受容体などが挙げられる。
（２）グルカゴン／ＶＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）／カルシトニン受容体様Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質として、カルシトニン受容体（カルシトニン）、ＶＩＰ１，ＶＩＰ２（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＣＲＦ１（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ），ＰＴＨ受容体（パラトルモン）などが挙げられる。
（３）代謝型神経伝達物質／カルシウム受容体様Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質として、ｍｇｌｕ１，ｍｇｌｕ２（グルタミン酸）、ＧＡＢＡＢ（γ−アミノ酪酸），味受容体などが挙げられる。
（Ｇｅｔｈｅｒ，Ｕ．Ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０００）２１，９０−１１３）（１９９８ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８）
本発明では、上記したような発現させるための蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを使用する。
昆虫に感染して病気を起こすウイルスであるバキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルスで、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。バキュロウイルスの中で、感染細胞の核内に多角体（ポリヒドラ）と呼ばれる封入体を大量につくる一群のウイルスが核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多角体は、分子量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより構成され、感染後期に大量につくられその中に多数のウイルス粒子を埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然界で生存するためには必須であるが、ウイルスの増殖そのものには必要ないので、多角体遺伝子の代わりに発現させたい外来遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障なく感染し増殖する。
本発明で用いられるバキュロウイルスとしては、ＮＰＶのキンウワバ亜科のオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）やカイコのボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）などのウイルスがベクターとして用いることができる。
ＡｃＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ細胞）などが挙げられ、ＢｍＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはＢｍＮ４細胞などが挙げられる。Ｓｆ細胞は、ＢｍＮ４細胞などに比べ増殖速度が速いこと、また、ＡｃＮＰＶはヒト肝細胞およびヒト胎児腎細胞などにも感染する能力を有することから、ＡｃＮＰＶ系のベクターが好ましい。
宿主としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統Ｓｆ９およびＳｆ２１などがＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ幼虫の卵巣組織から確立しており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社あるいはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、又はＡＴＣＣなどから入手可能である。さらに、生きている昆虫幼虫を宿主細胞系として使用することもできる。
本発明で用いる組換えウイルスを構築する方法は、常法に従って行えばよく、例えば次の手順で行うことができる。
先ず、発現させたい蛋白質の遺伝子（即ち、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子）をトランスファーベクターに挿入して組換えトランスファーベクターを構築する。
トランスファーベクターの全体の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度であり、そのうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アンピシリン等の抗生物質耐性遺伝子と細菌のＤＮＡ複製開始のシグナルを含んでいる。通常のトランスファーベクターではこの骨格以外に、多角体遺伝子の５’領域と３’領域をそれぞれ数ｋｂずつ含み、以下に述べるようなトランスフェクションを行った際に、この配列間で目的遺伝子と多角体遺伝子との間で相同組換えが引き起こる。また、トランスファーベクターには蛋白質遺伝子を発現させるためのプラモーターを含むことが好ましい。プロモーターとしては、多角体遺伝子のプロモーター、ｐ１０遺伝子のプロモーター、キャプシド遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
トランスファーベクターの種類は特に限定されない。トランスファーベクターの具体例としては、ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＥＶｍＸＩＶ２、ｐＡｃＳＧ１、ｐＶＬ１３９２／１３９３、ｐＡｃＭＰ２／３、ｐＡｃＪＰ１、ｐＡｃＵＷ２１、ｐＡｃＤＺ１、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＡｃＵＷ５１、ｐＡｃＡＢ３、ｐＡｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＴ−Ｂａｃ３３、ｐＡｃＵＷ１、ｐＡｃＵＷ４２／４３などが挙げられ、ＢｍＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＢＫ２８３、ｐＢＫ５、ｐＢＢ３０、ｐＢＥ１、ｐＢＥ２、ｐＢＫ３、ｐＢＫ５２、ｐＢＫｂｌｕｅ、ｐＢＫｂｌｕｅ２、ｐＢＦシリーズ（以上、フナコシ株式会社、藤沢薬品工業株式会社等から入手可能）などが挙げられる。
次に、組換えウイルスを作製するために、上記の組換えトランスファーベクターをウイルスと混合した後、宿主として用いる培養細胞に移入するか、あるいは予めウイルスで感染させた宿主として用いる培養細胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えトランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウイルスを構築する。
ここで宿主として用いる培養細胞とは、上記した宿主が挙げられ、通常、昆虫培養細胞（Ｓｆ９細胞やＢｍＮ細胞など）である。培養条件は、当業者により適宜決定されるが、具体的にはＳｆ９細胞を用いた場合は１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８℃前後で培養することが好ましい。このようにして構築された組み換えウイルスは、常法、例えばプラークアッセイなどによって精製することができる。なお、このようにして作製された組換えウイルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を形成することができないため、非組換えウイルスと容易に区別することが可能である。
本発明の方法では、前記の組換えバキュロウイルスを、上記した適当な宿主（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統Ｓｆ９およびＳｆ２１などの培養細胞、又は昆虫幼虫など）に感染させ、一定時間後（例えば、７２時間後等）に培養上清から細胞外発芽ウイルス（ｂｕｄｄｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＢＶ）を遠心などの分離操作によって回収する。なお、組換えバキュロウイルスは１種類のみ感染させてもよいし、２種類以上の組換えバキュロウイルスを組み合わせて共感染させてもよい。
細胞外発芽バキュロウイルスの回収は、例えば、以下のように行うことができる。
先ず感染細胞の培養液を５００〜１，０００ｇで遠心分離して、細胞外発芽バキュロウイルスを含む上清を回収する。この上清を約３０，０００〜５０，０００ｇで遠心分離して細胞外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を得ることができる。上記のようにして回収される発芽バキュロウイルスは、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質、Ｇ蛋白質、及びアデニル酸シクラーゼを生理活性を有する状態で含んでおり、当該発芽バキュロウイルス自体も本発明の範囲内である。即ち、当該発芽バキュロウイルスは、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質、Ｇ蛋白質及びアデニル酸シクラーゼを機能的に提示していることを特徴とする。
本発明においては、上記のようにして調製した発芽バキュロウイルスを使用し、被験物質の存在下において発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることによって、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を分析し、これにより該相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングすることができる。
生成するｃＡＭＰのアッセイ方法は特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。一例としては、エンザイムイムノアッセイの原理を用いて、固相に結合させた抗ｃＡＭＰ抗体へのペルオキシダーゼ標識ｃＡＭＰの結合を、活性化アデニル酸シクラーゼにより生成されたｃＡＭＰが競合的に阻害することを利用して、酵素反応による発色の減少を測定することにより、ｃＡＭＰをアッセイすることができる。なお、ｃＡＭＰのアッセイは、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ｃＡＭＰ Ｂｉｏｔｒａｋ Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍキットなどの市販のキットを使用して行うこともできる。
上記したスクリーニングに供される被験物質としては、例えばペプチド、ポリペプチド、合成化合物、微生物発酵物、生物体（植物又は動物の組織、微生物、又は細胞などを含む）からの抽出物、あるいはそれらのライブラリーが挙げられる。ライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。スクリーニングに供される化学物質は、天然物でも合成物でもよく、また候補となる単一の化学物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる化学物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。また、細胞抽出物のような混合物を分画したものについてスクリーニングを行い、分画を重ねて、所望の活性を有する物質を単離することも可能である。
これらの被験物質は、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害することが予想される物質であることが好ましい。
本発明のスクリーニング方法により、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質に対する阻害薬または活性化薬物をスクリーニングすることが可能である。本発明のスクリーニング方法により得られる、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害する物質も本発明の範囲内である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］ドパミン受容体Ｄ１を発現する組換えバキュロウイルスの調製
（１）細胞の培養と感染、および発芽型バキュロウイルスの収集
ヒト胎児脳ｃＤＮＡからＰＣＲ法により増幅して得られたヒトドパミン受容体Ｄ１（ＤＲ−Ｄ１）全長ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ０００７９４）をｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ組み込み、ｐＢｌｕＢａｃ−Ｈｉｓ−ＤＲ−Ｄ１を作成した。Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は完全培地（１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＧｒａｃｅ’ｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））で２７℃で１０ｃｍ径ディッシュに継代培養した。大量培養は１Ｌ容量のスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）にて完全培地に０．００１％ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を添加して行なった。組み換えバキュロウイルスの作成は説明書（Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｓｆ９細胞にＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡ（ＡｐＭＮＰＶ由来）とｐＢｌｕＢａｃ−Ｈｉｓ−ＤＲ−Ｄ１とを共感染させ組み換えウイルスを作成した。
（２）発芽型バキュロウイルスにおける受容体発現のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔによる解析
Ｓｆ９細胞を１Ｌ容量のスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）に２ｘ１０６個／ｍｌ濃度で５００ｍｌ培養し、上記（１）で作成した組み換えウイルスをＭＯＩ＝５で感染させ、７２時間後の培養液を実験に用いた。培養液は８００ｘｇ、１０分間遠心し、沈澱および上清に分離した。８００ｘｇの遠心後の上清を４０，０００ｘｇ、２５分遠心し、沈澱をＰＢＳに懸濁後、再度４０，０００ｘｇ、２５分遠心した。 沈澱をＰＢＳに懸濁し，８００ｘｇ，１０分遠心して凝集物を除いた後に、再度、４０，０００ｘｇ、２５分遠心して得られた沈澱をＰＢＳに懸濁して、発芽型ウイルス画分（ＢＶ画分）とした。ＢＶ画分におけるＤＲ−Ｄ１の発現はＨｉｓ−ｔａｇを認識する抗Ｈｉｓ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにより確認した。
（３）発芽型バキュロウイルスにおける受容体に対するリガンド結合能解析
ＢＶ画分のリガンド結合能は、７，８−３Ｈ−Ｄｏｐａｍｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）結合実験により確認した。３Ｈ−Ｄｏｐａｍｉｎｅ結合実験は、７，８−３Ｈ−Ｄｏｐａｍｉｎｅを含むｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｆｒｅｅ ＢＳＡ）にＤＲ−Ｄ１ ＢＶ画分を加えて反応液量５００・ｌとし、室温で９０分、反応させて行なった。反応液をフタル酸ジ−ｎ−ブチル／フタル酸ジオクチル１：１混合液５００μｌ上に重層し、１５，０００ｘｇ，１０分間、室温にて遠心して、ウイルスを沈澱として回収した。沈澱をｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄、風乾後、液体シンチレーションカウンターで、沈澱物中に含まれるトリチウムの量を測定することにより、受容体と結合した３Ｈ−ｄｏｐａｍｉｎｅの量を算出した。３Ｈ−ｄｏｐａｍｉｎｅの結合量は、反応液中に加えた標識ｄｏｐａｍｉｎｅの濃度依存的に増加した。更にこの３Ｈ−ｄｏｐａｍｉｎｅの結合は、非標識ｄｏｐａｍｉｎｅまたはアンタゴニストにより、阻害された。以上より、発芽型バキュロウイルス上に発現したＤＲ−Ｄ１は、リガンド結合活性を有することが確認された。
［実施例２］発芽型バキュロウイルスにおけるＧタンパク質共役型受容体とリガンドの結合に伴うＧタンパク質によるアデニル酸シクラーゼ活性化の検出
Ｇタンパク質は、共役する受容体への特異的リガンド結合により活性化され、活性化後にエフェクタータンパク質と総称される各種酵素と相互作用しそれら酵素分子の活性を調節する。アデニル酸シクラーゼは活性型Ｇｓ様Ｇタンパク質と相互作用することによりサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）産生を上昇させるエフェクタータンパク質である。ドパミン受容体はＧｓ様Ｇタンパク質と共役し、ドパミンの特異的結合によって活性型となったＧｓ様Ｇタンパク質はアデニル酸シクラーゼと相互作用し酵素活性を上昇させることが報告されている。
（１）アデニル酸シクラーゼ組み換えバキュロウイルスの作成
ヒトＶＩ型アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ ＶＩ）ｃＤＮＡは、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲによってクローニングした（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ０１５２７０）。蛍光蛋白ＥＣＦＰとアデニル酸シクラーゼを融合発現するため、クローニングしたＡＣ ＶＩ ｃＤＮＡをｐＥＣＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に組込み、ＥＣＦＰ遺伝子をＡＣ ＶＩ遺伝子３‘末端に融合させた。さらにこのＥＣＦＰ融合ＡＣＶＩ ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ組込んだ。実施例１（１）で示した組換えバキュロウイルスの作成法により、ＥＣＦＰ融合ＡＣ ＶＩ（ＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰ）組換えバキュロウイルスを調製した。
（２）受容体、Ｇ蛋白質、アデニル酸シクラーゼを共発現する発芽型バキュロウイルスにおけるリガンド刺激依存性ｃＡＭＰ産生の検出
２ｘ１０６細胞／ｍｌ濃度のＳｆ９細胞２００ｍｌに、ＤＲ−Ｄ１およびラットＧαｓ、Ｇβ１＋Ｇγ２（Ｇβ１とＧγ２遺伝子を同一ウイルスゲノム上に直列に持つウイルス）、ＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰの各組換えバキュロウイルスをそれぞれＭＯＩ＝２．５：１．５：０．５：：４．０で共感染させ、７２時間後にＢＶ画分を調製しＴＢＳへ懸濁した。また同様に、Ｇαｓを除いたＤＲ−Ｄ１およびＧβ１＋Ｇγ２、ＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰの各組換えバキュロウイルスをそれぞれＭＯＩ＝２．５：：０．５：：４．０でＳｆ９細胞に共感染させ、発芽型バキュロウイルスを調製した。更に、野生型バキュロウイルスをＭＯＩ＝２でＳｆ９細胞に感染させ、発芽型バキュロウイルスを調製した。
各組み合わせで調製した発芽型バキュロウイルス懸濁液によるｃＡＭＰ産生は、下記のようにして測定した。ＤＲ−Ｄ１，Ｇαｓ，Ｇβ１，Ｇγ２，ＡＣＶＩ−ＥＣＦＰ共発現ウイルス画分１０μｇをａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０，０．６ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ ＭｇＧｌ２，１ｍＭ ＩＢＭＸ，０．０１％ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｆｒｅｅ ＢＳＡ，３ｍＭ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ３Ｎａ，５ｕ／ｍｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ，５ｕ／ｍｌ ｍｙｏｋｉｎａｓｅ，１ｍＭ ＡＴＰ，５０μＭ ＧＴＰ，０．０２％ｓａｐｏｎｉｎ）に加えて、総体積を９０μｌとし、更に１０μｌの１００μＭ ｄｏｐａｍｉｎｅ（終濃度１０μＭ），あるいは５００μＭ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（終濃度 ５０μＭ）を添加して、３７℃で３０分間、反応させた。反応は１／９容のＬｙｓｉｓ ｒｅａｇｅｎｔ １Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製 ｃＡＭＰ Ｂｉｏｔｒａｋ Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍキットに付属）を加えることにより、停止させた。反応液中に産生されたｃＡＭＰは上記のｃＡＭＰ測定キットを用いて、説明書に従いＥＬＩＳＡ法により定量した。
ＤＲ−Ｄ１およびＧαｓ、Ｇβ、Ｇγ、ＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰの組換えバキュロウイルスを共感染させ得られた発芽型バキュロウイルスについて１０μＭドパミン（Ｓｉｇｍａ）による刺激を行なった場合、ｃＡＭＰ産生の上昇が確認された（図１）。一方、野生型の発芽型バキュロウイルスでは１０μＭドパミン刺激によるｃＡＭＰ産生の上昇は認められなかった（図１）。更にＧαｓを除くＤＲＤ１、Ｇβ＋Ｇγ、およびＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰの組換えバキュロウイルスを共感染させて得られた発芽型バキュロウイルスでもドパミン刺激によるｃＡＭＰ産生の上昇は認められなかった。以上のことから、発芽型バキュロウイルスにおけるドパミンのＤＲ−Ｄ１受容体への特異的結合によるＧαｓおよびＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰの相互作用、すなわち特異的リガンド刺激による受容体活性化後のシグナル伝達現象の検出が可能であることが確認された。
（１）細胞の培養と感染、および発芽型バキュロウイルスの収集
ヒト胎児脳ｃＤＮＡからＰＣＲ法により増幅して得られたヒトドパミン受容体Ｄ１（ＤＲ−Ｄ１）全長ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ０００７９４）をｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ組み込み、ｐＢｌｕＢａｃ−Ｈｉｓ−ＤＲ−Ｄ１を作成した。Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は完全培地（１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＧｒａｃｅ’ｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））で２７℃で１０ｃｍ径ディッシュに継代培養した。大量培養は１Ｌ容量のスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）にて完全培地に０．００１％ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を添加して行なった。組み換えバキュロウイルスの作成は説明書（Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｓｆ９細胞にＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡ（ＡｐＭＮＰＶ由来）とｐＢｌｕＢａｃ−Ｈｉｓ−ＤＲ−Ｄ１とを共感染させ組み換えウイルスを作成した。
（２）発芽型バキュロウイルスにおける受容体発現のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔによる解析
Ｓｆ９細胞を１Ｌ容量のスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）に２ｘ１０６個／ｍｌ濃度で５００ｍｌ培養し、上記（１）で作成した組み換えウイルスをＭＯＩ＝５で感染させ、７２時間後の培養液を実験に用いた。培養液は８００ｘｇ、１０分間遠心し、沈澱および上清に分離した。８００ｘｇの遠心後の上清を４０，０００ｘｇ、２５分遠心し、沈澱をＰＢＳに懸濁後、再度４０，０００ｘｇ、２５分遠心した。 沈澱をＰＢＳに懸濁し，８００ｘｇ，１０分遠心して凝集物を除いた後に、再度、４０，０００ｘｇ、２５分遠心して得られた沈澱をＰＢＳに懸濁して、発芽型ウイルス画分（ＢＶ画分）とした。ＢＶ画分におけるＤＲ−Ｄ１の発現はＨｉｓ−ｔａｇを認識する抗Ｈｉｓ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにより確認した。
（３）発芽型バキュロウイルスにおける受容体に対するリガンド結合能解析
ＢＶ画分のリガンド結合能は、７，８−３Ｈ−Ｄｏｐａｍｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）結合実験により確認した。３Ｈ−Ｄｏｐａｍｉｎｅ結合実験は、７，８−３Ｈ−Ｄｏｐａｍｉｎｅを含むｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｆｒｅｅ ＢＳＡ）にＤＲ−Ｄ１ ＢＶ画分を加えて反応液量５００・ｌとし、室温で９０分、反応させて行なった。反応液をフタル酸ジ−ｎ−ブチル／フタル酸ジオクチル１：１混合液５００μｌ上に重層し、１５，０００ｘｇ，１０分間、室温にて遠心して、ウイルスを沈澱として回収した。沈澱をｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄、風乾後、液体シンチレーションカウンターで、沈澱物中に含まれるトリチウムの量を測定することにより、受容体と結合した３Ｈ−ｄｏｐａｍｉｎｅの量を算出した。３Ｈ−ｄｏｐａｍｉｎｅの結合量は、反応液中に加えた標識ｄｏｐａｍｉｎｅの濃度依存的に増加した。更にこの３Ｈ−ｄｏｐａｍｉｎｅの結合は、非標識ｄｏｐａｍｉｎｅまたはアンタゴニストにより、阻害された。以上より、発芽型バキュロウイルス上に発現したＤＲ−Ｄ１は、リガンド結合活性を有することが確認された。
［実施例２］発芽型バキュロウイルスにおけるＧタンパク質共役型受容体とリガンドの結合に伴うＧタンパク質によるアデニル酸シクラーゼ活性化の検出
Ｇタンパク質は、共役する受容体への特異的リガンド結合により活性化され、活性化後にエフェクタータンパク質と総称される各種酵素と相互作用しそれら酵素分子の活性を調節する。アデニル酸シクラーゼは活性型Ｇｓ様Ｇタンパク質と相互作用することによりサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）産生を上昇させるエフェクタータンパク質である。ドパミン受容体はＧｓ様Ｇタンパク質と共役し、ドパミンの特異的結合によって活性型となったＧｓ様Ｇタンパク質はアデニル酸シクラーゼと相互作用し酵素活性を上昇させることが報告されている。
（１）アデニル酸シクラーゼ組み換えバキュロウイルスの作成
ヒトＶＩ型アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ ＶＩ）ｃＤＮＡは、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲによってクローニングした（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ０１５２７０）。蛍光蛋白ＥＣＦＰとアデニル酸シクラーゼを融合発現するため、クローニングしたＡＣ ＶＩ ｃＤＮＡをｐＥＣＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に組込み、ＥＣＦＰ遺伝子をＡＣ ＶＩ遺伝子３‘末端に融合させた。さらにこのＥＣＦＰ融合ＡＣＶＩ ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ組込んだ。実施例１（１）で示した組換えバキュロウイルスの作成法により、ＥＣＦＰ融合ＡＣ ＶＩ（ＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰ）組換えバキュロウイルスを調製した。
（２）受容体、Ｇ蛋白質、アデニル酸シクラーゼを共発現する発芽型バキュロウイルスにおけるリガンド刺激依存性ｃＡＭＰ産生の検出
２ｘ１０６細胞／ｍｌ濃度のＳｆ９細胞２００ｍｌに、ＤＲ−Ｄ１およびラットＧαｓ、Ｇβ１＋Ｇγ２（Ｇβ１とＧγ２遺伝子を同一ウイルスゲノム上に直列に持つウイルス）、ＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰの各組換えバキュロウイルスをそれぞれＭＯＩ＝２．５：１．５：０．５：：４．０で共感染させ、７２時間後にＢＶ画分を調製しＴＢＳへ懸濁した。また同様に、Ｇαｓを除いたＤＲ−Ｄ１およびＧβ１＋Ｇγ２、ＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰの各組換えバキュロウイルスをそれぞれＭＯＩ＝２．５：：０．５：：４．０でＳｆ９細胞に共感染させ、発芽型バキュロウイルスを調製した。更に、野生型バキュロウイルスをＭＯＩ＝２でＳｆ９細胞に感染させ、発芽型バキュロウイルスを調製した。
各組み合わせで調製した発芽型バキュロウイルス懸濁液によるｃＡＭＰ産生は、下記のようにして測定した。ＤＲ−Ｄ１，Ｇαｓ，Ｇβ１，Ｇγ２，ＡＣＶＩ−ＥＣＦＰ共発現ウイルス画分１０μｇをａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０，０．６ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ ＭｇＧｌ２，１ｍＭ ＩＢＭＸ，０．０１％ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｆｒｅｅ ＢＳＡ，３ｍＭ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ３Ｎａ，５ｕ／ｍｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ，５ｕ／ｍｌ ｍｙｏｋｉｎａｓｅ，１ｍＭ ＡＴＰ，５０μＭ ＧＴＰ，０．０２％ｓａｐｏｎｉｎ）に加えて、総体積を９０μｌとし、更に１０μｌの１００μＭ ｄｏｐａｍｉｎｅ（終濃度１０μＭ），あるいは５００μＭ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（終濃度 ５０μＭ）を添加して、３７℃で３０分間、反応させた。反応は１／９容のＬｙｓｉｓ ｒｅａｇｅｎｔ １Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製 ｃＡＭＰ Ｂｉｏｔｒａｋ Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍキットに付属）を加えることにより、停止させた。反応液中に産生されたｃＡＭＰは上記のｃＡＭＰ測定キットを用いて、説明書に従いＥＬＩＳＡ法により定量した。
ＤＲ−Ｄ１およびＧαｓ、Ｇβ、Ｇγ、ＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰの組換えバキュロウイルスを共感染させ得られた発芽型バキュロウイルスについて１０μＭドパミン（Ｓｉｇｍａ）による刺激を行なった場合、ｃＡＭＰ産生の上昇が確認された（図１）。一方、野生型の発芽型バキュロウイルスでは１０μＭドパミン刺激によるｃＡＭＰ産生の上昇は認められなかった（図１）。更にＧαｓを除くＤＲＤ１、Ｇβ＋Ｇγ、およびＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰの組換えバキュロウイルスを共感染させて得られた発芽型バキュロウイルスでもドパミン刺激によるｃＡＭＰ産生の上昇は認められなかった。以上のことから、発芽型バキュロウイルスにおけるドパミンのＤＲ−Ｄ１受容体への特異的結合によるＧαｓおよびＡＣ ＶＩ−ＥＣＦＰの相互作用、すなわち特異的リガンド刺激による受容体活性化後のシグナル伝達現象の検出が可能であることが確認された。
本発明によれば、発芽型バキュロウイルスを用いてリガンド刺激依存性のｃＡＭＰ産生を測定することにより、ＧＰＣＲ（Ｇ蛋白質共役型受容体）のシグナル伝達を簡便に検出することが可能になった。
Claims (7)
- Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収し、該発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることを含む、Ｇ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法。
- Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルス、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルス、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む組換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収し、該発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることを含む、Ｇ蛋白質共役型受容体のシグナル伝達を検出する方法。
- 宿主が昆虫細胞又は昆虫幼虫である、請求項１又は２に記載の方法。
- 被験物質の存在下において発芽バキュロウイルスとリガンドとを接触させ、生成するｃＡＭＰをアッセイすることによってＧ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を分析し、該相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングする、請求項１から３の何れかに記載の方法。
- 請求項４に記載の方法により得られる、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害する物質。
- Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質をコードする遺伝子、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子、及びアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿主から放出される発芽バキュロウイルスであって、Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質、Ｇ蛋白質及びアデニル酸シクラーゼを機能的に提示している発芽バキュロウイルス。
- 宿主が昆虫細胞又は昆虫幼虫である、請求項６に記載の発芽バキュロウイルス。
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| JP2003052370A (ja) * | 2001-08-16 | 2003-02-25 | Sentan Kagaku Gijutsu Incubation Center:Kk | 発芽バキュロウィルスを用いた機能を有する膜型受容体蛋白質の発現法 |
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