JPWO2004058965A1 - Ｇａｂａ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法 - Google Patents
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Abstract
癲癇症患者や分裂病患者の脳内でＧＡＢＡ作動性神経細胞が欠如ないしは減少した領域にＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を移植することにより、同疾患の治療を行うことを目的として、成体又は胎児神経組織中のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞、ないしは胚性幹細胞から誘導したＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を分離する方法を提示する。この出願の発明は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程、抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、生体でも検出できる蛍光を発するレポーター遺伝子をつないだＤＮＡを分散した細胞に導入する工程、レポーター蛋白の蛍光の有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、および増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程を含む。
Description
この出願の発明は、抑制性神経細胞を欠落した乃至は減少した領域の抑制性神経細胞の数を正常値に戻すことに用いる、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出すＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を分離する方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞の分離を可能にすることにより、ＧＡＢＡ作動性神経細胞を欠落した乃至は減少した領域を正常に戻すことにより、癲癇症や分裂病の治療を行う治療行為を可能にする医療用材料等としての前駆細胞分離方法に関するものである。
中枢神経系の神経細胞には興奮性の神経細胞と抑制性の神経細胞がある。両者の神経細胞が中枢神経の領域により異なる様々な比率で含まれていて、情報処理が行われている。大脳皮質では抑制性神経細胞は神経伝達物質としてγ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ）を使い、興奮性神経細胞はＧｌｕｔａｍａｔｅを使う。大脳皮質の抑制性神経細胞は神経細胞の２０％程度の比率で存在することにより、神経回路全体としては適度な活動度を維持することができ、スムーズな情報処理を営むことができる。しかしながら時として、全ての神経細胞が興奮し始め、結果として意識を失う癲癇発作が起きる。このような発作が起きる原因には、子供の間は脳の神経回路発達が未熟なために、発熱により神経細胞が興奮しやすくなって生じる熱性痙攣もあるが、多くは遺伝的背景があり、癲癇症患者の多くは、神経細胞の興奮に関わるチャンネル分子にポイント変異があり、興奮しやすくなっていると考えられている。また細胞移動の分子メカニズムに異常がある場合には大脳皮質の灰白質部が二分してしまい、入出力関係がアンバランスになり、癲癇様発作を繰り返す場合もある。いずれの場合も、神経回路に生じたショート様の異常状態であり、過発火により多量のカルシウムが細胞体に流入することにより細胞死に至ることが考えられる。しかし全ての神経細胞に起こるわけではなく、このようなショートの状態が起こるのを止める役目にある抑制性神経細胞が特に過大な入力を受け、他の興奮性神経細胞よりも先に死滅して行く。このような状態になると難治性の癲癇発作のフォーカスと呼ばれ、フォーカスにある抑制性神経細胞は激減していて、繰り返し癲癇発作の発祥元となる。このような状態にある難治性の癲癇症では治療薬では追いつかず、フォーカス領域を切除して癲癇発作の発生を抑える根治療法が行われる。しかし脳の一部を切除するため切除される脳が持っていた機能は失われる。このような癲癇発作フォーカスにＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を移植により供給して生着させることができたならば癲癇発作を抑えることが期待できる。この目的のために必要となるＧＡＢＡ作動性神経細胞はどの様なものであってもいいのではなく、百を超えるＧＡＢＡ作動性神経細胞のサブタイプの内の、大脳皮質の興奮性の神経細胞の活動を抑えることのできるＧＡＢＡ神経細胞でなければならない。例えば癲癇症の患者のフォーカスにはどのようなサブタイプのＧＡＢＡ作動性神経細胞を移植すれば良いかと言えば、興奮性神経細胞が興奮するつどに、周りの興奮性神経細胞からの戻されてくる興奮性入力に対抗し抑制できる、細胞体部分に抑制を加えるバスケット細胞や軸索起始部に抑制を加えるシャンデリア細胞が必要となる。
現在までのところ人間の大脳新皮質ＧＡＢＡ作動性神経細胞の起源は十分に理解されていなかった。この出願の発明者はこれまでに、げっ歯類の大脳皮質ＧＡＢＡ作動性神経細胞の起源は大脳基底核原基に起源を持つことを発見し、１９９７年に１１月１日に報告している（Ｔａｍａｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７：８３１３−８３２３ １９９７）。またこれとは別に、米国のＡｎｄｅｒｓｏｎ Ｓ．も、１９９７年に１０月２７日に同様の報告している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：４７４−４７６ １９９７）。さらにその起源は、大脳基底核原基の中でも内側基底核原基に限られることが報告されており（Ｌａｖｄａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９：７８８１−７８８８ １９９９）、大脳基底核原基の中でも内側に限られることは、胎児組織の移植によっても確認されている（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２８：３７５９−３７７１ ２００１）。しかし大脳基底核原基以外に起源が無いのかの点は確認されていなかった。そのような中、人間ではＧＡＢＡ作動性神経細胞の起源が大脳皮質にもあり、６５％は大脳皮質で、３５％は大脳基底核原基で作られるとする報告がある（Ｌｅｔｉｎｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１７：６４５−６４９ ２００２）。この報告にある６５％の大脳皮質由来のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞は、脳室帯ないし脳室下帯にある神経幹細胞の分裂により供給され、Ｍａｓｈｌ陽性で特徴付けられると考えた。しかし、このような観察結果は、この出願の発明者のげっ歯類でのＧＡＢＡ作動性神経細胞の起源を調べた最新の研究での個々の観察結果と一部一致するものであるが、起源に関する解釈は発明者の解釈と大きく異なるものである。この出願の発明者のげっ歯類での研究によれば、ＧＡＢＡ作動性神経細胞の起源は大脳基底核原基にあり、大脳皮質に移動したＧＡＢＡ作動性神経細胞の一部は前駆細胞に脱分化するか、大脳皮質に移動したＧＡＢＡ含有細胞の一部は前駆細胞であり、大脳皮質で新たにＧＡＢＡ作動性神経細胞を供給していると考えられる。人間の場合も、観察結果の同一性から考えて、大脳皮質のＧＡＢＡ作動性神経細胞は、大脳基底核原基の細胞に由来すると考えられる。
しかしＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞は大脳新皮質内のみで見られるものではない。ＥＳ細胞や神経幹細胞を培養する際に適当な培養条件を設けると、同細胞は神経前駆細胞に分化を始め、分化した神経前駆細胞の多くのものがＧＡＢＡ作動性神経細胞も産生するようになる。これらのＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を、癲癇症患者の発作フォーカスに移植により供給して生着させることができたならば癲癇発作を抑えることも期待できるが、これまでのところ培養条件下で得られたＧＡＢＡ作動性神経細胞はＧＡＢＡを含まない神経細胞、グリア細胞との混合物としてしか得ることができていない。
なお、この出願の発明に関連する刊行物としては、既に挙げたものを含め、以下がある。
刊行物リスト
１．Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＳＡ，Ｅｉｓｅｎｓｔａｔ ＤＤ，Ｓｈｉ Ｌ，Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ＪＬＲ．（１９９７）Ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ Ｄｌｘ ｇｅｎｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：４７４−４７６．
２．Ｄｕｐｕｙ ＳＴ，Ｈｏｕｓｅｒ ＣＲ．（１９９６）Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ．ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：６９１９−６９３２．
３．Ｇｒｉｔｔｉ Ａ，Ｐａｒａｔｉ ＥＡ，Ｃｏｖａ Ｌ，Ｆｒｏｌｉｃｈｓｔｈａｌ Ｐ，Ｇａｌｌｉ Ｒ，Ｗａｎｋｅ Ｅ，Ｆａｒａｖｅｌｌｉ Ｌ，Ｍｏｒａｓｓｕｔｔｉ ＤＪ，Ｒｏｉｓｅｎ Ｆ，Ｎｉｃｋｅｌ ＤＤ，Ｖｅｓｃｏｖｉ ＡＬ．（１９９６）Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ａｎｄ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １６：１０９１−１１００．
４．Ｊｉｎ Ｘ，Ｍａｔｈｅｒｓ ＰＨ，Ｓｚａｂｏ Ｇ，Ｋａｔａｒｏｖａ Ｚ，Ａｇｍｏｎ Ａ．（２００１）Ｖｅｒｔｉｃａｌ ｂｉａｓ ｉｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＧＡＤ６７−ＧＦＰ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ．１１：６６６−６７８．
５．Ｌａｖｄａｓ ＡＡ，Ｇｒｉｇｏｒｉｏｕ Ｍ，Ｐａｃｈｎｉｓ Ｖ，Ｐａｒｎａｖｅｌａｓ ＪＧ．（１９９９）Ｔｈｅ ｍｅｄｉａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ ｅｍｉｎｅｎｃｅ ｇｉｖｅｓ ｒｉｓｅ ｔｏ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９：７８８１−７８８８．
６．Ｌｅｔｉｎｉｃ Ｋ，Ｚｏｎｃｕ Ｒ，Ｒａｋｉｃ Ｐ．（２００２）Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ ４１７：６４５−６４９．
７．Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ，Ｋｏｍｅｔａｎｉ Ｋ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｙ，Ｉｗａｓａｔｏ Ｔ，Ｏｂａｔａ Ｋ，Ｍｉｎａｔｏ Ｋ，Ｋａｎｅｋｏ Ｔ，Ｔａｍａｍａｋｉ Ｎ．（２００３）Ｉｍｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ ｅｍｉｎｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔ．３３ｔｈ．
８．Ｐｏｒｔｅｕｓ ＭＨ，Ｂｕｌｆｏｎｅ Ａ，Ｌｉｕ ＪＫ，Ｐｕｅｌｌｅｓ Ｌ，Ｌｏ ＬＣ，Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ＪＬ．（１９９４）ＤＬＸ−２，ＭＡＳＨ−１，ａｎｄ ＭＡＰ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｎｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １４：６３７０−６３８３．
９．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＢＡ，Ｗｅｉｓｓ Ｓ．（１９９２）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１７０７−１０．
１０．Ｔａｍａｍａｋｉ Ｎ，Ｆｎｊｉｍｏｒｉ Ｋ，Ｔａｋａｕｊｉ Ｒ．（１９９７）Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｒｏｕｔｅ ｏｆ ｔａｎｇｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｚｏｎｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７：８３１３−８３２３．
１１．Ｔａｍａｍａｋｉ Ｎ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｙ，Ｔａｎａｋａ Ｋ，Ｔａｋａｕｊｉ Ｒ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ ｅｍｉｎｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉ ｗｉｔｈ ＵＶ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｖｉａ ａ ｆｉｂｅｒ ｏｐｔｉｃ ｃａｂｌｅ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．３５：２４１−２５１．
１２．Ｔａｍａｍａｋｉ Ｎ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｙ，Ｔｏｍｉｏｋａ Ｒ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ．Ｏｂａｔａ Ｋ，Ｋａｎｅｋｏ Ｔ．（２００３）Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ，ｐａｒｂａｌｂｕｍｉｎ，ａｎｄ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｄ６７−ｇｆｐ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｏｕｓｅ．Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ４６７：６０−７９．
１３．Ｖｅｓｃｏｖｉ ＡＬ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＢＡ，Ｆｒａｓｅｒ ＤＤ，Ｗｅｉｓｓ Ｓ．（１９９３）ｂＦＧＦ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｆａｔｅ ｏｆ ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ（ｎｅｕｒｏｎａｌ）ａｎｄ ｂｉｐｏｔｅｎｔ（ｎｅｕｒｏｎａｌ／ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ）ＥＧＦ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＣＮＳ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｕｒｏｎ １１：９５１−９６６．
１４．Ｗｅｓｔｍｏｒｅｌａｎｄ ＪＪ，Ｈａｎｃｏｃｋ ＣＲ，Ｃｏｎｄｉｅ ＢＧ（２００１）Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２８４：６７４−６８０．
現在までのところ人間の大脳新皮質ＧＡＢＡ作動性神経細胞の起源は十分に理解されていなかった。この出願の発明者はこれまでに、げっ歯類の大脳皮質ＧＡＢＡ作動性神経細胞の起源は大脳基底核原基に起源を持つことを発見し、１９９７年に１１月１日に報告している（Ｔａｍａｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７：８３１３−８３２３ １９９７）。またこれとは別に、米国のＡｎｄｅｒｓｏｎ Ｓ．も、１９９７年に１０月２７日に同様の報告している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：４７４−４７６ １９９７）。さらにその起源は、大脳基底核原基の中でも内側基底核原基に限られることが報告されており（Ｌａｖｄａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９：７８８１−７８８８ １９９９）、大脳基底核原基の中でも内側に限られることは、胎児組織の移植によっても確認されている（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２８：３７５９−３７７１ ２００１）。しかし大脳基底核原基以外に起源が無いのかの点は確認されていなかった。そのような中、人間ではＧＡＢＡ作動性神経細胞の起源が大脳皮質にもあり、６５％は大脳皮質で、３５％は大脳基底核原基で作られるとする報告がある（Ｌｅｔｉｎｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１７：６４５−６４９ ２００２）。この報告にある６５％の大脳皮質由来のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞は、脳室帯ないし脳室下帯にある神経幹細胞の分裂により供給され、Ｍａｓｈｌ陽性で特徴付けられると考えた。しかし、このような観察結果は、この出願の発明者のげっ歯類でのＧＡＢＡ作動性神経細胞の起源を調べた最新の研究での個々の観察結果と一部一致するものであるが、起源に関する解釈は発明者の解釈と大きく異なるものである。この出願の発明者のげっ歯類での研究によれば、ＧＡＢＡ作動性神経細胞の起源は大脳基底核原基にあり、大脳皮質に移動したＧＡＢＡ作動性神経細胞の一部は前駆細胞に脱分化するか、大脳皮質に移動したＧＡＢＡ含有細胞の一部は前駆細胞であり、大脳皮質で新たにＧＡＢＡ作動性神経細胞を供給していると考えられる。人間の場合も、観察結果の同一性から考えて、大脳皮質のＧＡＢＡ作動性神経細胞は、大脳基底核原基の細胞に由来すると考えられる。
しかしＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞は大脳新皮質内のみで見られるものではない。ＥＳ細胞や神経幹細胞を培養する際に適当な培養条件を設けると、同細胞は神経前駆細胞に分化を始め、分化した神経前駆細胞の多くのものがＧＡＢＡ作動性神経細胞も産生するようになる。これらのＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を、癲癇症患者の発作フォーカスに移植により供給して生着させることができたならば癲癇発作を抑えることも期待できるが、これまでのところ培養条件下で得られたＧＡＢＡ作動性神経細胞はＧＡＢＡを含まない神経細胞、グリア細胞との混合物としてしか得ることができていない。
なお、この出願の発明に関連する刊行物としては、既に挙げたものを含め、以下がある。
刊行物リスト
１．Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＳＡ，Ｅｉｓｅｎｓｔａｔ ＤＤ，Ｓｈｉ Ｌ，Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ＪＬＲ．（１９９７）Ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ Ｄｌｘ ｇｅｎｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：４７４−４７６．
２．Ｄｕｐｕｙ ＳＴ，Ｈｏｕｓｅｒ ＣＲ．（１９９６）Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ．ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：６９１９−６９３２．
３．Ｇｒｉｔｔｉ Ａ，Ｐａｒａｔｉ ＥＡ，Ｃｏｖａ Ｌ，Ｆｒｏｌｉｃｈｓｔｈａｌ Ｐ，Ｇａｌｌｉ Ｒ，Ｗａｎｋｅ Ｅ，Ｆａｒａｖｅｌｌｉ Ｌ，Ｍｏｒａｓｓｕｔｔｉ ＤＪ，Ｒｏｉｓｅｎ Ｆ，Ｎｉｃｋｅｌ ＤＤ，Ｖｅｓｃｏｖｉ ＡＬ．（１９９６）Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ａｎｄ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １６：１０９１−１１００．
４．Ｊｉｎ Ｘ，Ｍａｔｈｅｒｓ ＰＨ，Ｓｚａｂｏ Ｇ，Ｋａｔａｒｏｖａ Ｚ，Ａｇｍｏｎ Ａ．（２００１）Ｖｅｒｔｉｃａｌ ｂｉａｓ ｉｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＧＡＤ６７−ＧＦＰ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ．１１：６６６−６７８．
５．Ｌａｖｄａｓ ＡＡ，Ｇｒｉｇｏｒｉｏｕ Ｍ，Ｐａｃｈｎｉｓ Ｖ，Ｐａｒｎａｖｅｌａｓ ＪＧ．（１９９９）Ｔｈｅ ｍｅｄｉａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ ｅｍｉｎｅｎｃｅ ｇｉｖｅｓ ｒｉｓｅ ｔｏ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９：７８８１−７８８８．
６．Ｌｅｔｉｎｉｃ Ｋ，Ｚｏｎｃｕ Ｒ，Ｒａｋｉｃ Ｐ．（２００２）Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ ４１７：６４５−６４９．
７．Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ，Ｋｏｍｅｔａｎｉ Ｋ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｙ，Ｉｗａｓａｔｏ Ｔ，Ｏｂａｔａ Ｋ，Ｍｉｎａｔｏ Ｋ，Ｋａｎｅｋｏ Ｔ，Ｔａｍａｍａｋｉ Ｎ．（２００３）Ｉｍｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ ｅｍｉｎｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔ．３３ｔｈ．
８．Ｐｏｒｔｅｕｓ ＭＨ，Ｂｕｌｆｏｎｅ Ａ，Ｌｉｕ ＪＫ，Ｐｕｅｌｌｅｓ Ｌ，Ｌｏ ＬＣ，Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ＪＬ．（１９９４）ＤＬＸ−２，ＭＡＳＨ−１，ａｎｄ ＭＡＰ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｎｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １４：６３７０−６３８３．
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１０．Ｔａｍａｍａｋｉ Ｎ，Ｆｎｊｉｍｏｒｉ Ｋ，Ｔａｋａｕｊｉ Ｒ．（１９９７）Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｒｏｕｔｅ ｏｆ ｔａｎｇｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｚｏｎｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７：８３１３−８３２３．
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１２．Ｔａｍａｍａｋｉ Ｎ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｙ，Ｔｏｍｉｏｋａ Ｒ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ．Ｏｂａｔａ Ｋ，Ｋａｎｅｋｏ Ｔ．（２００３）Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ，ｐａｒｂａｌｂｕｍｉｎ，ａｎｄ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｄ６７−ｇｆｐ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｏｕｓｅ．Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ４６７：６０−７９．
１３．Ｖｅｓｃｏｖｉ ＡＬ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＢＡ，Ｆｒａｓｅｒ ＤＤ，Ｗｅｉｓｓ Ｓ．（１９９３）ｂＦＧＦ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｆａｔｅ ｏｆ ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ（ｎｅｕｒｏｎａｌ）ａｎｄ ｂｉｐｏｔｅｎｔ（ｎｅｕｒｏｎａｌ／ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ）ＥＧＦ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＣＮＳ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｕｒｏｎ １１：９５１−９６６．
１４．Ｗｅｓｔｍｏｒｅｌａｎｄ ＪＪ，Ｈａｎｃｏｃｋ ＣＲ，Ｃｏｎｄｉｅ ＢＧ（２００１）Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２８４：６７４−６８０．
この出願は、前記の課題を解決する発明として、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のｃＤＮＡをつないだＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）レポーターの発するシグナルの有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
またこの出願の発明は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、薬剤耐性の性質を付与する蛋白のｃＤＮＡをつないだＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）薬剤耐性の有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
さらにこの出願の発明は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、遺伝子組み換え酵素のｃＤＮＡを結合したＤＮＡと、遺伝子組み換え後に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーターを発現するカセットＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）レポーター蛋白の蛍光の有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
さらにまた、この出願の発明は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、遺伝子組み換え酵素のｃＤＮＡを結合したＤＮＡと、遺伝子組み換え後に薬剤耐性の性質を付与する蛋白を発現するカセットＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）薬剤耐性の有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
前記の各発明においては、工程は（ａ）〜（ｄ）の順序で行うことが好ましいが、これに限定されるものではなく、各工程は適宜に変更することができる。例えば、（ａ）−（ｄ）−（ｂ）−（ｃ）といった順番でもよく、あるいは（ａ）−（ｂ）−（ｄ）−（ｃ）であってもよい。また、例えば発現カセットＤＮＡを導入遺伝子とするトランスジェニック動物の作出によって工程（ｂ）を行うことものでき、その場合には、（ｂ）−（ａ）−（ｃ）−（ｄ）や（ｂ）−（ａ）−（ｄ）−（ｃ）といった順番で各発明を実施することもできる。
また前記の各発明においては、工程（ａ）において、胚性幹細胞または神経幹細胞から誘導したＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製するか、またはドナーのＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む組織を分散して細胞集団を調製することを好ましい態様としている。
さらに前記の各発明においては、ＤＮＡ導入法が、ウイルスを介した形質転換、電気穿孔、リポソームを介した形質転換のいずれかを含むことを好ましい態様としている。
また前記の各発明においては、ドナーが哺乳動物であること、そして哺乳動物がヒトであることを別の好ましい態様としている。
またさらに、前記の各発明においては、さらに、ステップ（ｄ）で分離した細胞をレシピエントに移植することを含むことを好ましい態様としてもいる。
この出願の発明はさらに、前記発明のいずれかの方法により得られた、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞を提供する。
さらにまた、前記発明のいずれかの方法において、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞を得るために試用する試薬および細胞のキットを提供する。
なお以下の説明では、「ＧＡＤ６７遺伝子のプロモーター」を「ＧＡＤ６７ｐｒｏｍｏｔｅｒ」と、「ＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター」を「ＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ」と記載することがある。
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のｃＤＮＡをつないだＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）レポーターの発するシグナルの有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
またこの出願の発明は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、薬剤耐性の性質を付与する蛋白のｃＤＮＡをつないだＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）薬剤耐性の有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
さらにこの出願の発明は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、遺伝子組み換え酵素のｃＤＮＡを結合したＤＮＡと、遺伝子組み換え後に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーターを発現するカセットＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）レポーター蛋白の蛍光の有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
さらにまた、この出願の発明は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、遺伝子組み換え酵素のｃＤＮＡを結合したＤＮＡと、遺伝子組み換え後に薬剤耐性の性質を付与する蛋白を発現するカセットＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）薬剤耐性の有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
前記の各発明においては、工程は（ａ）〜（ｄ）の順序で行うことが好ましいが、これに限定されるものではなく、各工程は適宜に変更することができる。例えば、（ａ）−（ｄ）−（ｂ）−（ｃ）といった順番でもよく、あるいは（ａ）−（ｂ）−（ｄ）−（ｃ）であってもよい。また、例えば発現カセットＤＮＡを導入遺伝子とするトランスジェニック動物の作出によって工程（ｂ）を行うことものでき、その場合には、（ｂ）−（ａ）−（ｃ）−（ｄ）や（ｂ）−（ａ）−（ｄ）−（ｃ）といった順番で各発明を実施することもできる。
また前記の各発明においては、工程（ａ）において、胚性幹細胞または神経幹細胞から誘導したＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製するか、またはドナーのＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む組織を分散して細胞集団を調製することを好ましい態様としている。
さらに前記の各発明においては、ＤＮＡ導入法が、ウイルスを介した形質転換、電気穿孔、リポソームを介した形質転換のいずれかを含むことを好ましい態様としている。
また前記の各発明においては、ドナーが哺乳動物であること、そして哺乳動物がヒトであることを別の好ましい態様としている。
またさらに、前記の各発明においては、さらに、ステップ（ｄ）で分離した細胞をレシピエントに移植することを含むことを好ましい態様としてもいる。
この出願の発明はさらに、前記発明のいずれかの方法により得られた、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞を提供する。
さらにまた、前記発明のいずれかの方法において、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞を得るために試用する試薬および細胞のキットを提供する。
なお以下の説明では、「ＧＡＤ６７遺伝子のプロモーター」を「ＧＡＤ６７ｐｒｏｍｏｔｅｒ」と、「ＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター」を「ＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ」と記載することがある。
図１は、この発明の方法を実施するのに必要となるＤＮＡコンストラクトを１から５に示す。１−２は、直接ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒにＧＦＰ遺伝子やｎｅｏ ｍｙｃｉｎ耐性遺伝子をつないだもので、ＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞でＧＦＰやｎｅｏ ｍｙｃｉｎ耐性遺伝子が発現し、ＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を分離するために利用する。３−５はＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性によって発現するＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを利用して、ＧＦＰやｎｅｏ ｍｙｃｉｎ耐性遺伝子をＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞に発現させて、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を分離するために利用する。詳しくは、３は、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒにＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ＤＮＡをつないだコンストラクトであり、４はＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を、Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを介したＧＦＰの発現を利用して分離する方法に使うＤＮＡコンストラクトである。５はＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を、Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを介したｎｅｏ ｍｙｃｉｎ耐性遺伝子の発現を使って分離する方法に使うＤＮＡコンストラクトである。
図２は、発明の実施の形態の説明図である。（２−１）は、薬剤耐性遺伝子（ｎｅｏ ｍｙｃｉｎ耐性遺伝子）を利用したＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞の分離法を示す。図にある二種類のＤＮＡコンストラクト（図１の３番と５番）を細胞に導入した場合、ＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞ではＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性のためＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが発現し、ｓｔｏｐ ｓｉｇｎａｌ ＤＮＡは切り取られ、ｎｅｏ ｍｙｃｉｎ耐性を獲得するので、ｎｅｏ ｍｙｃｉｎ分解酵素の発現によりＧｅｎｅｔｉｃｉｎなどで選別することができる。遺伝子の導入には、レトロウイルスや一時的な発現せる真核細胞での複製オリジンを持つアデノウイルスなどによって導入が可能である。（２−２）は、生体細胞を可視化できるレポーターＤＮＡ（ＧＦＰ）を利用したＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞の分離法を示す。図にある二種類のＤＮＡコンストラクト（図１の３番と４番）を細胞に導入した場合、ＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞ではＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性のためＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが発現し、ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ配列は切り取られ、ＣＡプロモーターによりＧＦＰの発現が始まる。結果ＧＦＰ蛍光の有無によりセルソーターを使ってＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を選別することができる。上記遺伝子の導入には、レトロウイルスや一時的な発現をさせる真核細胞での複製オリジンを持つアデノウイルスなどによって導入が可能である。
図３は、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にＧＦＰ ｃＤＮＡを結合したＤＮＡをノックインしたマウスから、ＧＦＰ陽性ＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＦＰ陽性ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞をセルソーターを使って分離した際のデータを示す。左上は、細胞数とＧＦＰ蛍光強度の関係をグラフにしたもので、コントロールに比べて蛍光を有意に発している範囲の細胞を採集した。採集した細胞は、細胞増殖因子を加えただけの基本培養液を予め大脳皮質と大脳基底核原基を一日培養して調整した培養液中で培養した。さらにＢｒｄＵを添加して細胞増殖の際のＤＮＡ合成を検出した。右上の図にあるようにＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞はＢｒｄＵを取り込んだが、ＤＮＡ合成阻害剤を加えるとＤＮＡへの取り込みは見られなかった。下の図はＧＦＰ陽性のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞がＢｒｄＵを二つの核中のＤＮＡに取り込んで、分裂しているところの像である。
図２は、発明の実施の形態の説明図である。（２−１）は、薬剤耐性遺伝子（ｎｅｏ ｍｙｃｉｎ耐性遺伝子）を利用したＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞の分離法を示す。図にある二種類のＤＮＡコンストラクト（図１の３番と５番）を細胞に導入した場合、ＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞ではＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性のためＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが発現し、ｓｔｏｐ ｓｉｇｎａｌ ＤＮＡは切り取られ、ｎｅｏ ｍｙｃｉｎ耐性を獲得するので、ｎｅｏ ｍｙｃｉｎ分解酵素の発現によりＧｅｎｅｔｉｃｉｎなどで選別することができる。遺伝子の導入には、レトロウイルスや一時的な発現せる真核細胞での複製オリジンを持つアデノウイルスなどによって導入が可能である。（２−２）は、生体細胞を可視化できるレポーターＤＮＡ（ＧＦＰ）を利用したＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞の分離法を示す。図にある二種類のＤＮＡコンストラクト（図１の３番と４番）を細胞に導入した場合、ＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞ではＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性のためＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅが発現し、ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ配列は切り取られ、ＣＡプロモーターによりＧＦＰの発現が始まる。結果ＧＦＰ蛍光の有無によりセルソーターを使ってＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を選別することができる。上記遺伝子の導入には、レトロウイルスや一時的な発現をさせる真核細胞での複製オリジンを持つアデノウイルスなどによって導入が可能である。
図３は、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にＧＦＰ ｃＤＮＡを結合したＤＮＡをノックインしたマウスから、ＧＦＰ陽性ＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＦＰ陽性ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞をセルソーターを使って分離した際のデータを示す。左上は、細胞数とＧＦＰ蛍光強度の関係をグラフにしたもので、コントロールに比べて蛍光を有意に発している範囲の細胞を採集した。採集した細胞は、細胞増殖因子を加えただけの基本培養液を予め大脳皮質と大脳基底核原基を一日培養して調整した培養液中で培養した。さらにＢｒｄＵを添加して細胞増殖の際のＤＮＡ合成を検出した。右上の図にあるようにＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞はＢｒｄＵを取り込んだが、ＤＮＡ合成阻害剤を加えるとＤＮＡへの取り込みは見られなかった。下の図はＧＦＰ陽性のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞がＢｒｄＵを二つの核中のＤＮＡに取り込んで、分裂しているところの像である。
この出願の前記発明において、神経幹細胞は、中枢神経系を構成する全ての種の細胞を供給することのできる細胞であるのに対し、「前駆細胞」とは、神経幹細胞から生み出され、増殖することができるが、限られた細胞種に分化しうる細胞のことをいう。例えば、希突起膠細胞の前駆細胞として、Ｏ−２Ａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌが知られているし、ＧＡＢＡ作動性神経細胞の前駆細胞としては、嗅球顆粒細胞を供給する前脳胞脳室下帯の前駆細胞が知られている。しかしこれまでに、大脳新皮質の実質内に大脳新皮質のＧＡＢＡ作動性神経細胞を生み出す前駆細胞が存在することは知られていなかった。この出願の発明者による以下の観察結果は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞の前駆細胞が大脳皮質脳実質内に存在する直接および間接証拠である。
１．胎児期Ｅ１６のマウスにＢｒｄＵを取り込ませ、直ちに還流固定してＢｒｄＵ、ＭＡＰ２の二重標識をすると、中間帯のＭＡＰ２陽性移動細胞がＢｒｄＵ免疫活性と重なるものが見つかる。これは、中間帯のＭＡＰ２陽性移動神経細胞（ＧＡＢＡ含有神経細胞）が、細胞分裂に備えてＤＮＡを複製していたことを意味する。
２．誕生直ぐのＧＡＤ６７−ＧＦＰ ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスに同様のＢｒｄＵパルスラベルを行っても、ＧＦＰ陽性ＧＡＢＡ作動性神経細胞の中にもＢｒｄＵ免疫活性を持つものがあり、二重標識されて確認される。二重標識されたＧＦＰ陽性神経細胞は、細胞分裂に備えてＤＮＡを複製していたことを意味する。
３．発明者が行った実験によると、胎児大脳側脳室にＧＡＰ４３−ＥＧＦＰを発現させるアデノウイルスを注入し、脳室帯に感染させ、生後２０日目にＧＦＰ陽性神経細胞を見ると、Ｅ１７以前にウイルスを注入したときにはＧＡＢＡ作動性神経細胞と思われる非錐体細胞が多く観察されるが、Ｅ１７以降にウイルスを注入しても非錐体細胞は観察されなくなる。それに対し、幾つかの他の研究室からの報告によると、ＢｒｄＵ注入による実験では、ＧＡＢＡ作動性神経細胞はＥ１４以降、出産後まで続けて分裂増殖しているとされている。この二つの実験の意味するところは、Ｅ１７以降大脳皮質にＧＡＢＡ神経細胞を供給する前駆細胞は、アデノウイルスが側脳室から感染できる脳室帯には存在しなくなるが、脳実質内の何処かで分裂し続けていることを意味する。
４．マウスＥ１５胎児の大脳側脳室にアデノウイルスを胎児大脳側脳室に注入したときに見られるＧＡＢＡ作動性神経細胞と思われる非錐体細胞は、様々な形態を持つサブタイプに分かれる。それぞれのタイプは、異なる幹細胞から生み出されたと考えられている。ＳＶ４０ ｏｒｉｇｉｎを持たず、細胞増殖の際に増えることの無いアデノウイルスを感染させたときには、ほとんど同一のサブタイプの非錐体細胞を同一サンプルで観察することは少なく、近傍に同一のサブタイプの非錐体細胞を観察することは無い。それに対し、ＳＶ４０ ｏｒｉｇｉｎを入れた、細胞増殖の際に細胞とともに増えるアデノウイルスを感染させたときには、頻繁に複数の同一サブタイプの非錐体細胞が近接して分布するのを観察した。この観察結果の意味するところは、ひとつのＧＡＢＡ作動性神経細胞の前駆細胞は、同一サブタイプの非錐体細胞を大脳実質内で生み出していることを示唆している。
この出願の発明者は、大脳基底核原基の脳室帯にある神経幹細胞はＧＡＤ６７陰性であるのに対し、大脳皮質のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のように神経回路を形成してＧＡＢＡを分泌しているわけでもないにも拘らず、ＧＡＢＡ合成酵素ＧＡＤ６７陽性であることを発見した。この発見は、大脳皮質ＧＡＢＡ作動性神経細胞の分化の細胞系譜において、多種類の細胞を生み出す神経幹細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出すＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を区別する明らかな形質の違いであった。
この様なＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性を使ってＧＦＰを発現させる試みは、ＧＡＢＡ作動性神経細胞にＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒにＧＦＰ ｃＤＮＡをつないだＤＮＡをジーンガンで導入した例が報告されている（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ ２００１ １１：６６６−６７８）。また、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にＧＦＰ ｃＤＮＡをつないで染色体上に組み込んだＧＡＤ６７−ＧＦＰ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｏｕｓｅでは、ＧＦＰがほぼ１００％の精度でＧＡＤ６７陽性細胞に発現していた（Ｔａｍａｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。このマウスを使ってＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を観察したところ、緑色蛍光を発しているところが観察された（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。のこの違いを利用して、神経幹細胞や他の種の細胞から、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を分離し、さらにＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞のみを分離する。加えて、ＧＡＤ６７とＧＡＤ６５遺伝子は、胎児期より大脳皮質のほとんどの細胞で共存することが知られていたので（Ｄｕｐｕｙ ａｎｄ Ｈｏｕｓｅｒ，１９９６）、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒの代わりにＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒを用いても、ほとんど同様の結果が得られる。
生体内のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞がＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性を持つことが申請者らの研究で示されており（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３）、胚性幹細胞や神経幹細胞から誘導された細胞中にもＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性を持つものがあることが報告されている（Ｗｅｓｔｍｏｒｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
ＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５のプロモーター下流に生体でも検出できる蛍光を発するレポーター遺伝子や薬剤耐性遺伝子を繋ぎ、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を含む細胞集団に導入することで、レポーター蛋白の蛍光や薬剤耐性でＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を確認することができる。蛍光を放つＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞はセルソーターで分離ができるし、薬剤耐性のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞は薬剤を培養液に加えることにより分離できる。このとき培養液中で永く培養増殖させれば、分裂能のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞のみを得ることができる。
例えば、緑色の蛍光を発するくらげ蛋白、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）ｃＤＮＡをＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒにつないだＤＮＡ（図１の１）を、ＤＮＡ細胞内導入試薬やウイルス、電気穿孔法などで導入するとＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞が緑色蛍光を発する。ＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒを使用した場合も同様の効果が得られる。このＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む組織を切り出し、０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎｅ−ＥＤＴＡで処理することで個々の細胞を分散させ、細胞捲濁液をセルソーターにかけることでＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を分離することができる。分離した細胞を、大脳皮質と大脳基底核原基を含む脳のスライスを培養したｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍを用いて分離したＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を培養増殖させると、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞は増殖し、ＧＡＢＡ作動性神経細胞は暫時その数を減らしていく。
ＧＦＰの代わりに、ｎｅｏ ｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子を ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒまたはＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒにつなぎ（図１の２）、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞群に導入する。同細胞群を分散培養する際の培養液にＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）を入れて培養をすることで、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性を持つＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞以外は死滅するので、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞のみを選び出すことができる。
しかし、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒやＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性はＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞の細胞周期に伴い変化するのに加え、概してＧＡＢＡ作動性神経細胞のそれより常に低い。そのままＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒまたはＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒをＧＦＰやｎｅｏのＤＮＡにつないでも、現在我々が細胞系譜に従って分類しているｐｒｉｍａｒｙ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ，ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒによってＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒやＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性の強さが異なることがあり、ＧＡＢＡ神経細胞前駆細胞の種類によって採取効率に影響が出ることが考えられる。この影響を除くため、図１の３−５にあるようなＤＮＡコンストラクを準備する。図１の３では、ＤＮＡ組み換え蛋白としてＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを用いているが、これは使用できるＤＮＡ組み換え蛋白をＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅに限ることを意味しているのではない。図１の４−５に、ＤＮＡ組み換え酵素が認識するＤＮＡ配列（例えばｌｏｘＰ）が順方向に二つ並ぶ間に、生体細胞を可視化できるレポーターＤＮＡ（例えばＧＦＰ）や、薬剤耐性遺伝子ＤＮＡ（例えばｎｅｏ ｍｙｃｉｎ耐性遺伝子）を配置し、強制発現プロモーター（例えばＣＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、日本特許番号２８２４４３３、２８２４４３４）を含むＤＮＡに結合させておく。この二つのＤＮＡコンストラクト（３と４、乃至は３と５）を、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞群に導入する。ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞ではＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性があるので、ＤＮＡ組み換え酵素が発現し、二つのＤＮＡ組み換え酵素が認識するＤＮＡ配列の間で組み換えが起こり、その間にあったｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎは除去される。その結果、生体細胞を可視化できるレポーター（例えばＧＦＰ）を発現させた場合は、セルソーターを用いてＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を分離することができ、薬剤耐性蛋白を発現させた場合は、培養液中に薬剤（例えばＧｅｎｅｔｉｓｉｎ）を入れることでＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞だけが選別される（図２）。さらに大脳皮質と大脳基底核原基を含む脳のスライスを培養したｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍを用いて培養を続けると、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞は増殖し、ＧＡＢＡ作動性神経細胞は暫時その数を減らしていく。
これまで、胚性幹細胞や神経幹細胞の培養条件を調節することで、ＧＡＢＡ作動性神経細胞を始め様々な細胞が誘導されてきた。しかし何れの条件でも、単一種の細胞のみを産生する系はなく、治療に用いる前に再度の分離が必要となり、細胞活性を損なうこととなっていた。この出願の発明によって、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞が純度高く得られる。ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞はＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５陽性であり、ＧＡＤ６７陽性およびＧＡＤ６５陽性の細胞を産生するので、脳内ではＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５陽性細胞はＧＡＢＡ作動性神経細胞だけであることを考えると、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を培養することにより、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す系が提供される。
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
１．胎児期Ｅ１６のマウスにＢｒｄＵを取り込ませ、直ちに還流固定してＢｒｄＵ、ＭＡＰ２の二重標識をすると、中間帯のＭＡＰ２陽性移動細胞がＢｒｄＵ免疫活性と重なるものが見つかる。これは、中間帯のＭＡＰ２陽性移動神経細胞（ＧＡＢＡ含有神経細胞）が、細胞分裂に備えてＤＮＡを複製していたことを意味する。
２．誕生直ぐのＧＡＤ６７−ＧＦＰ ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスに同様のＢｒｄＵパルスラベルを行っても、ＧＦＰ陽性ＧＡＢＡ作動性神経細胞の中にもＢｒｄＵ免疫活性を持つものがあり、二重標識されて確認される。二重標識されたＧＦＰ陽性神経細胞は、細胞分裂に備えてＤＮＡを複製していたことを意味する。
３．発明者が行った実験によると、胎児大脳側脳室にＧＡＰ４３−ＥＧＦＰを発現させるアデノウイルスを注入し、脳室帯に感染させ、生後２０日目にＧＦＰ陽性神経細胞を見ると、Ｅ１７以前にウイルスを注入したときにはＧＡＢＡ作動性神経細胞と思われる非錐体細胞が多く観察されるが、Ｅ１７以降にウイルスを注入しても非錐体細胞は観察されなくなる。それに対し、幾つかの他の研究室からの報告によると、ＢｒｄＵ注入による実験では、ＧＡＢＡ作動性神経細胞はＥ１４以降、出産後まで続けて分裂増殖しているとされている。この二つの実験の意味するところは、Ｅ１７以降大脳皮質にＧＡＢＡ神経細胞を供給する前駆細胞は、アデノウイルスが側脳室から感染できる脳室帯には存在しなくなるが、脳実質内の何処かで分裂し続けていることを意味する。
４．マウスＥ１５胎児の大脳側脳室にアデノウイルスを胎児大脳側脳室に注入したときに見られるＧＡＢＡ作動性神経細胞と思われる非錐体細胞は、様々な形態を持つサブタイプに分かれる。それぞれのタイプは、異なる幹細胞から生み出されたと考えられている。ＳＶ４０ ｏｒｉｇｉｎを持たず、細胞増殖の際に増えることの無いアデノウイルスを感染させたときには、ほとんど同一のサブタイプの非錐体細胞を同一サンプルで観察することは少なく、近傍に同一のサブタイプの非錐体細胞を観察することは無い。それに対し、ＳＶ４０ ｏｒｉｇｉｎを入れた、細胞増殖の際に細胞とともに増えるアデノウイルスを感染させたときには、頻繁に複数の同一サブタイプの非錐体細胞が近接して分布するのを観察した。この観察結果の意味するところは、ひとつのＧＡＢＡ作動性神経細胞の前駆細胞は、同一サブタイプの非錐体細胞を大脳実質内で生み出していることを示唆している。
この出願の発明者は、大脳基底核原基の脳室帯にある神経幹細胞はＧＡＤ６７陰性であるのに対し、大脳皮質のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のように神経回路を形成してＧＡＢＡを分泌しているわけでもないにも拘らず、ＧＡＢＡ合成酵素ＧＡＤ６７陽性であることを発見した。この発見は、大脳皮質ＧＡＢＡ作動性神経細胞の分化の細胞系譜において、多種類の細胞を生み出す神経幹細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出すＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を区別する明らかな形質の違いであった。
この様なＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性を使ってＧＦＰを発現させる試みは、ＧＡＢＡ作動性神経細胞にＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒにＧＦＰ ｃＤＮＡをつないだＤＮＡをジーンガンで導入した例が報告されている（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ ２００１ １１：６６６−６７８）。また、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にＧＦＰ ｃＤＮＡをつないで染色体上に組み込んだＧＡＤ６７−ＧＦＰ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｏｕｓｅでは、ＧＦＰがほぼ１００％の精度でＧＡＤ６７陽性細胞に発現していた（Ｔａｍａｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。このマウスを使ってＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を観察したところ、緑色蛍光を発しているところが観察された（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。のこの違いを利用して、神経幹細胞や他の種の細胞から、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を分離し、さらにＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞のみを分離する。加えて、ＧＡＤ６７とＧＡＤ６５遺伝子は、胎児期より大脳皮質のほとんどの細胞で共存することが知られていたので（Ｄｕｐｕｙ ａｎｄ Ｈｏｕｓｅｒ，１９９６）、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒの代わりにＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒを用いても、ほとんど同様の結果が得られる。
生体内のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞がＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性を持つことが申請者らの研究で示されており（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３）、胚性幹細胞や神経幹細胞から誘導された細胞中にもＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性を持つものがあることが報告されている（Ｗｅｓｔｍｏｒｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
ＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５のプロモーター下流に生体でも検出できる蛍光を発するレポーター遺伝子や薬剤耐性遺伝子を繋ぎ、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を含む細胞集団に導入することで、レポーター蛋白の蛍光や薬剤耐性でＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を確認することができる。蛍光を放つＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞はセルソーターで分離ができるし、薬剤耐性のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞は薬剤を培養液に加えることにより分離できる。このとき培養液中で永く培養増殖させれば、分裂能のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞のみを得ることができる。
例えば、緑色の蛍光を発するくらげ蛋白、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）ｃＤＮＡをＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒにつないだＤＮＡ（図１の１）を、ＤＮＡ細胞内導入試薬やウイルス、電気穿孔法などで導入するとＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞が緑色蛍光を発する。ＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒを使用した場合も同様の効果が得られる。このＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む組織を切り出し、０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎｅ−ＥＤＴＡで処理することで個々の細胞を分散させ、細胞捲濁液をセルソーターにかけることでＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を分離することができる。分離した細胞を、大脳皮質と大脳基底核原基を含む脳のスライスを培養したｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍを用いて分離したＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を培養増殖させると、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞は増殖し、ＧＡＢＡ作動性神経細胞は暫時その数を減らしていく。
ＧＦＰの代わりに、ｎｅｏ ｍｙｃｉｎｅ耐性遺伝子を ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒまたはＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒにつなぎ（図１の２）、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞群に導入する。同細胞群を分散培養する際の培養液にＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）を入れて培養をすることで、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性を持つＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞以外は死滅するので、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞のみを選び出すことができる。
しかし、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒやＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性はＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞の細胞周期に伴い変化するのに加え、概してＧＡＢＡ作動性神経細胞のそれより常に低い。そのままＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒまたはＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒをＧＦＰやｎｅｏのＤＮＡにつないでも、現在我々が細胞系譜に従って分類しているｐｒｉｍａｒｙ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ，ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒによってＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒやＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性の強さが異なることがあり、ＧＡＢＡ神経細胞前駆細胞の種類によって採取効率に影響が出ることが考えられる。この影響を除くため、図１の３−５にあるようなＤＮＡコンストラクを準備する。図１の３では、ＤＮＡ組み換え蛋白としてＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを用いているが、これは使用できるＤＮＡ組み換え蛋白をＣｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅに限ることを意味しているのではない。図１の４−５に、ＤＮＡ組み換え酵素が認識するＤＮＡ配列（例えばｌｏｘＰ）が順方向に二つ並ぶ間に、生体細胞を可視化できるレポーターＤＮＡ（例えばＧＦＰ）や、薬剤耐性遺伝子ＤＮＡ（例えばｎｅｏ ｍｙｃｉｎ耐性遺伝子）を配置し、強制発現プロモーター（例えばＣＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、日本特許番号２８２４４３３、２８２４４３４）を含むＤＮＡに結合させておく。この二つのＤＮＡコンストラクト（３と４、乃至は３と５）を、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞群に導入する。ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞ではＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性があるので、ＤＮＡ組み換え酵素が発現し、二つのＤＮＡ組み換え酵素が認識するＤＮＡ配列の間で組み換えが起こり、その間にあったｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎは除去される。その結果、生体細胞を可視化できるレポーター（例えばＧＦＰ）を発現させた場合は、セルソーターを用いてＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を分離することができ、薬剤耐性蛋白を発現させた場合は、培養液中に薬剤（例えばＧｅｎｅｔｉｓｉｎ）を入れることでＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞だけが選別される（図２）。さらに大脳皮質と大脳基底核原基を含む脳のスライスを培養したｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍを用いて培養を続けると、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞は増殖し、ＧＡＢＡ作動性神経細胞は暫時その数を減らしていく。
これまで、胚性幹細胞や神経幹細胞の培養条件を調節することで、ＧＡＢＡ作動性神経細胞を始め様々な細胞が誘導されてきた。しかし何れの条件でも、単一種の細胞のみを産生する系はなく、治療に用いる前に再度の分離が必要となり、細胞活性を損なうこととなっていた。この出願の発明によって、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞が純度高く得られる。ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞はＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５陽性であり、ＧＡＤ６７陽性およびＧＡＤ６５陽性の細胞を産生するので、脳内ではＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５陽性細胞はＧＡＢＡ作動性神経細胞だけであることを考えると、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を培養することにより、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す系が提供される。
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒの直ぐ下流にＧＦＰ ｃＤＮＡをつないだコンストラクトをｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ方を用いてゲノムＤＮＡ中に相同組み換えを利用して挿入したマウス、ＧＡＤ６７−ＧＦＰ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｏｕｓｅを用いて、その大脳皮質内のＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を分離した。このマウスのゲノム上には図１の１にあるＤＮＡを導入したのと同じ状態が全ての細胞に形成されている。それ故、ＧＡＤ６７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性のある細胞は全てＧＦＰを発現しており、また逆に、ＧＦＰを発現している細胞は全てＧＡＤ６７陽性であり、脳内ではＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞と見なしうることは、先に調べて報告済みである（Ｔａｍａｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）。
大脳皮質ではＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞がＧＡＢＡ作動性神経細胞を産生し続けている出産直後ないしは、胎生１８日目のＧＡＤ６７−ＧＦＰ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｏｕｓｅの大脳皮質を取り出し、０．５％トリプシン蛋白分解酵素で処理をすることで細胞外基質と細胞接着分子を部分分解することにより、細胞を分散させた。分散させた細胞をＰＢＳで浸し、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）に通し、ＧＦＰ陽性細胞を培養液に受け取った（図２−２）。この際、採取された細胞のＧＦＰ蛍光強度は図３の左上に示されている。採取したＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を培養するのに用いた培養液は、ニューロスフェア法（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，１９９２；Ｖｅｓｃｏｖｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｇｒｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）にある細胞増殖因子を加えただけの基本培養液で大脳皮質と大脳基底核原基を一日培養した後にフィルターで細胞を除いて得た調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）であった。
細胞採取後、培養液中でＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞の一部は、細胞分裂をはじめた。図３の下の図は、分裂した細胞であるが、細胞分裂した細胞を確認するために培養液中に混ぜておいたＢｒｄＵを核内ＤＮＡに取り込んでいた。この時ＤＮＡ合成阻害剤を培養液に加えておくと、図３の右上の図にあるようにＢｒｄＵはＤＮＡに取り込まれなかったことから、細胞増殖によるＢｒｄＵの取り込みであったことが確かめられた。また分裂した後の二つの娘細胞は、両方ともＧＦＰ陽性であり、二つの一次ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞、ないしは一つの一次ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞と一つの二次ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞、ないしは二つの二次ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞、ないしは二つのＧＡＢＡ作動性神経細胞を生み出したと考えられる。何れの場合であっても、それ以降培養条件が整えられていれば、ＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞関連細胞のみが生み出し続けられることが期待された。
大脳皮質ではＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞がＧＡＢＡ作動性神経細胞を産生し続けている出産直後ないしは、胎生１８日目のＧＡＤ６７−ＧＦＰ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｏｕｓｅの大脳皮質を取り出し、０．５％トリプシン蛋白分解酵素で処理をすることで細胞外基質と細胞接着分子を部分分解することにより、細胞を分散させた。分散させた細胞をＰＢＳで浸し、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）に通し、ＧＦＰ陽性細胞を培養液に受け取った（図２−２）。この際、採取された細胞のＧＦＰ蛍光強度は図３の左上に示されている。採取したＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞を培養するのに用いた培養液は、ニューロスフェア法（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，１９９２；Ｖｅｓｃｏｖｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｇｒｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）にある細胞増殖因子を加えただけの基本培養液で大脳皮質と大脳基底核原基を一日培養した後にフィルターで細胞を除いて得た調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）であった。
細胞採取後、培養液中でＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞の一部は、細胞分裂をはじめた。図３の下の図は、分裂した細胞であるが、細胞分裂した細胞を確認するために培養液中に混ぜておいたＢｒｄＵを核内ＤＮＡに取り込んでいた。この時ＤＮＡ合成阻害剤を培養液に加えておくと、図３の右上の図にあるようにＢｒｄＵはＤＮＡに取り込まれなかったことから、細胞増殖によるＢｒｄＵの取り込みであったことが確かめられた。また分裂した後の二つの娘細胞は、両方ともＧＦＰ陽性であり、二つの一次ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞、ないしは一つの一次ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞と一つの二次ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞、ないしは二つの二次ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞、ないしは二つのＧＡＢＡ作動性神経細胞を生み出したと考えられる。何れの場合であっても、それ以降培養条件が整えられていれば、ＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞関連細胞のみが生み出し続けられることが期待された。
これまで、胚性幹細胞や神経幹細胞の培養条件を調節することで、ＧＡＢＡ作動性神経細胞を始め様々な細胞が誘導されてきた。しかし何れの条件でも、単一種の細胞のみを産生する系はなく、治療に用いる前に再度の分離が必要となり、細胞活性を損なうこととなっていた。この出願の発明によって、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞が純度高く得られる。ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞はＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５陽性であり、ＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５陽性の細胞を産生するので、脳内ではＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５陽性細胞はＧＡＢＡ作動性神経細胞だけであることを考えると、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を培養することにより、ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す系が提供される。
Claims (16)
- ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のｃＤＮＡをつないだＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）レポーターの発するシグナルの有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、薬剤耐性の性質を付与する蛋白のｃＤＮＡをつないだＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）薬剤耐性の有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、遺伝子組み換え酵素のｃＤＮＡを結合したＤＮＡと、遺伝子組み換え後に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白を発現するカセットＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）レポーターの発するシグナルの有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞の分離方法であって、以下の工程：
（ａ）ＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する工程；
（ｂ）抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成酵素ＧＡＤ６７遺伝子またはＧＡＤ６５遺伝子のプロモーター下流に、遺伝子組み換え酵素のｃＤＮＡを結合したＤＮＡと、遺伝子組み換え後に薬剤耐性の性質を付与する蛋白を発現するカセットＤＮＡを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
（ｃ）薬剤耐性の有無によりＧＡＢＡ作動性神経細胞とＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程；
（ｄ）増殖能を持つことによりＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 工程（ａ）において、胚性幹細胞または神経幹細胞から誘導したＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む細胞集団を調製する請求項１から４のいずれかの方法。
- 工程（ａ）において、ドナーのＧＡＢＡ作動性神経細胞前駆細胞を含む組織を分散して細胞集団を調製する請求項１から４のいずれかの方法。
- 工程（ｂ）におけるＤＮＡ導入法が、ウイルスを介した形質転換を含む、請求項１から４のいずれかの方法。
- 工程（ｂ）におけるＤＮＡ導入法が、電気穿孔を含む、請求項１から４のいずれかの方法。
- 工程（ｂ）におけるＤＮＡ導入法が、リポソームを介した形質転換を含む、請求項１から４のいずれいかの方法。
- 胚性幹細胞または神経幹細胞が哺乳動物由来である、請求項５の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項１０の方法。
- ドナーが哺乳動物である、請求項６の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項１２の方法。
- さらに、ステップ（ｄ）で分離した細胞をレシピエントに移植することを含む、請求項１から４のいずれかの方法。
- 請求項１から１４のいずれかの方法により得られた、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞。
- 請求項１から１４のいずれかの方法において、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のみを生み出す前駆細胞を得るために試用する試薬および細胞のキット。
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