JP2014193118A - 脳活動の解析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】特定種類の細胞のみの脳活動を解析する方法を提供する。
【解決手段】ステップＳ１において、特定種類の細胞で発現する遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結された不完全な第１のレポーターの遺伝子を、細胞群に導入する。また、細胞の活性化により発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結された、不完全な第１のレポーターとの結合によって完全なレポーターが形成される不完全な第２のレポーターの遺伝子を細胞群に導入する。ステップＳ２で、遺伝子導入後の細胞を生存状態で維持し、ステップＳ３で、細胞の活性化を誘導する。ステップＳ４で、第１のレポーターと第２のレポーターとが結合することによって生ずるシグナルを、光学イメージングし、ステップＳ５で、取得された画像に基づいて、生じたシグナルの強度を定量的に決定する。これにより特定種類の細胞における発現の解析を行える。
【選択図】図１

Description

本発明は、脳活動を解析する方法に関する。

細胞外からの刺激により直ちに発現が誘導される最初期遺伝子は、多くの細胞種において発現することが知られている。このような最初期遺伝子には、ｃ−ｆｏｓ、ｚｉｆ２６８、ａｒｃ等がある。最初期遺伝子の発現量変化を観察すると、薬物などに対する細胞の感受性や反応性を評価することができる。また、これらの最初期遺伝子のプロモーターの下流に蛍光タンパク質や発光タンパク質といったレポーターの遺伝子を組み込んだ遺伝子発現カセットを細胞に導入するプロモーターアッセイ法が知られている。プロモーターアッセイ法によれば、細胞を生かした状態のまま、細胞の薬物に対する応答や細胞の活性化を観察することができる。

株化細胞のような均一な細胞を対象とする実験系におけるプロモーターアッセイ法による実験では、個々の細胞の種類等を同定する必要がなく、全細胞の平均値が評価対象とされる。しかしながら、初代培養やスライス培養など不均一な細胞集団を用いた実験系におけるプロモーターアッセイ法による実験では、注目する細胞から生じるシグナルとその他の細胞から生じるシグナルとが重なってしまうため、組織中に共存する性質が異なる細胞種のうち、注目する細胞のみの遺伝子発現量を評価することは困難である。さらに、比較的均一な性質をもつ株化細胞においても刺激に対する細胞の反応は個々に異なることが知られているので、生体組織などの不均一な細胞集団においては刺激に対する反応はより複雑であることが予想される。

脳組織には、神経細胞やグリア細胞など、複数種の細胞が混在している。神経細胞は、脳内における局在や、関わっている脳の高次機能、包含する伝達物質等によって、いくつかの種類に分類されることが知られている。例えば、隣接する神経細胞に信号を伝達する興奮性神経細胞の活動と、神経信号の伝達を抑制する抑制性神経細胞の活動とが巧妙に絡み合ってバランスをとって、複雑な脳機能が担われていることが知られている。多くの脳神経系の障害では、興奮性神経細胞と抑制性神経細胞との神経活動のバランスが崩れていることが示唆されており、脳神経疾患の病態の解明には、興奮性神経と抑制性神経との活動を検出できる技術が必要とされている。このため、興奮性神経細胞と抑制性神経細胞との活動をプロモーター活性のイメージングによってリアルタイムに評価できる技術の構築が求められている。

特許文献１には、スプリットルシフェラーゼ法を用いた特定細胞におけるプロモーター活性のイメージング法が開示されている。スプリットルシフェラーゼ法では、ルシフェラーゼ遺伝子をＮ末側とＣ末側とに分割し、これらに相互作用を引き起こすことが知られているＭｙｏＤ及びＩｄをそれぞれ融合した融合タンパクを細胞に発現させる。ルシフェラーゼは、分割したＮ末側又はＣ末側のみでは酵素活性を持たないために発光現象を生じさせない。しかしながら、融合させたＭｙｏＤ及びＩｄが結合すると、ルシフェラーゼのＮ末側とＣ末側とは会合し、酵素活性を有するようになる。特許文献１には、このようなスプリットルシフェラーゼ法を利用して特定細胞のみの評価を行えるプロモーターアッセイについて開示されている。

特開２００７−１５５５５８号公報

例えば特許文献１に開示されているような従来の方法では、例えば興奮性神経細胞と抑制性神経細胞とを区別して観察することについて考慮されていない。このため、例えば興奮性神経細胞又は抑制性神経細胞のみの遺伝子発現についてイメージングを行い評価を行うことはできていない。

そこで本発明は、特定種類の細胞のみの脳活動を解析する方法を提供することを目的とする。

前記目的を果たすため、本発明の一態様によれば、脳活動の解析方法は、特定種類の細胞で発現する遺伝子の第１のプロモーター領域に発現可能に連結された不完全な第１のレポーターの遺伝子を、前記細胞を含む細胞群に導入することと、前記細胞の活性化により発現が誘導される遺伝子の第２のプロモーター領域に発現可能に連結された、前記第１のレポーターとの結合によって完全なレポーターが形成される不完全な第２のレポーターの遺伝子を、前記細胞群に導入することと、前記細胞群を生存状態で維持することと、前記細胞の活性化を誘導することと、前記第１のレポーターと前記活性化によって発現した前記第２のレポーターとが結合することによって生ずる検出可能なシグナルを、前記細胞群を光学イメージングすることで画像として取得することと、前記画像に基づいて、前記シグナルの強度を定量的に決定することと、を具備する。

本発明によれば、特定種類の細胞のみの脳活動を解析する方法を提供できる。

一実施形態に係る脳活動の解析方法の概略を示すフローチャート。 スプリットルシフェラーゼ法について説明するための図。 一実施形態で用いられる光学イメージングシステムの構成例の概略を示す図。 遺伝子導入されて刺激を加えられた興奮性神経細胞と抑制性神経細胞とにおける反応を説明するための概略図。 遺伝子導入されて刺激を加えられた興奮性神経細胞と抑制性神経細胞とにおける反応を説明するための概略図。 ｐＣａＭＫＩＩα／ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃと、ｐｆｏｓ／ＮＬｕｃ−Ｉｄとを導入した培養海馬切片における発光画像。 興奮性神経細胞におけるＤＨＰＧ刺激に伴う細胞毎のｃ−ｆｏｓプロモーター活性の変化を表す図。 ｐＧＡＤ６７／ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃと、ｐｆｏｓ／ＮＬｕｃ−Ｉｄとを導入した培養海馬切片における発光画像。 抑制性神経細胞におけるＤＨＰＧ刺激に伴う細胞毎のｃ−ｆｏｓプロモーター活性の変化を表す図。

本発明の一実施形態について図面を参照して説明する。本実施形態に係る脳活動の解析方法の概略を図１に示す。

ステップＳ１において、特定細胞で発現する遺伝子のプロモーター（第１のプロモーター）に連結された不完全なレポーター遺伝子（第１のレポーターの遺伝子）と、細胞の活性化により発現が誘導される遺伝子のプロモーター（第２のプロモーター）に連結された不完全なレポーター遺伝子（第２のレポーターの遺伝子）とを細胞に導入する。

本実施形態では、特定の細胞の一例として、脳内に存在する興奮性神経細胞又は抑制性神経細胞が挙げられる。したがって、第１のプロモーター領域として、興奮性神経細胞又は抑制性神経細胞で特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域が利用される。ここでプロモーター領域とは、プロモーター活性を有するために必要な最小の塩基配列を含む任意の領域を意味する。例えば、プロモーター領域として、注目する遺伝子の転写部位に対して上流５００から４０００塩基の領域の一部又は全部が用いられ得る。

興奮性神経細胞特異的な遺伝子のプロモーターとして、カルモデュリン依存性キナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩα）遺伝子のプロモーター領域が用いられ得る。また、抑制性神経細胞特異的な遺伝子のプロモーターとして、グルタミン酸脱炭酸酵素６７（ＧＡＤ６７）遺伝子のプロモーター領域が用いられ得る。また、本実施形態で用いられるプロモーターには、上述のプロモーターの任意の動物種の対応物も含まれる。

本実施形態では、第２のプロモーターとして、細胞活性化により発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域が利用される。本実施形態で利用される細胞活性化により発現が誘導される遺伝子プロモーター領域としては、最初期遺伝子のプロモーターが挙げられる。本実施形態で用いられる最初期遺伝子のプロモーターの一例として、ｃ−ｆｏｓプロモーター領域が挙げられる。また、本実施形態で用いられるプロモーターとしては、前記プロモーターの任意の動物種の対応物も含まれる。

本実施形態において、レポーター遺伝子は、検出可能な発光等に係るレポータータンパク質をコードする遺伝子を意味する。レポーターには、例えば、ホタル又はウミシイタケ等に由来するルシフェラーゼが含まれる。ルシフェラーゼには、発光波長が異なる複数のルシフェラーゼが含まれ得る。異なる構成において、異なる波長の発光が起こるルシフェラーゼが用いられることによって、レポーター遺伝子の発現を発光色で分離することができる。

また、レポーター遺伝子には、例えば、βガラクトシダーゼをコードする遺伝子、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子等が含まれる。また、レポーター遺伝子には、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。ここで蛍光タンパク質には、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）や、その改変体が含まれる。なお、蛍光タンパク質が用いられれば、解像度よく蛍光画像が取得されるので、レポータータンパク質の細胞内における分布まで特定され得る。

不完全なレポーター遺伝子とは、上述のレポーター遺伝子の一部である。不完全なレポーター遺伝子がコードする不完全なレポーターと、別な不完全なレポーター遺伝子がコードする別な不完全なレポーターとが結合すると、完全なレポーターが形成され得る。このような不完全なレポーターの組み合わせの一例として、ホタルルシフェラーゼに由来するＮ末側ルシフェラーゼ（アミノ酸番号１−４１６）とＣ末側ルシフェラー（アミノ酸番号３９８−５５０）とが挙げられる。

本実施形態では、第１のレポーターの遺伝子又は第２のレポーターの遺伝子のうち一方として、例えば、Ｎ末側ルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）遺伝子（アミノ酸番号１−４１６）とマウスのＩｄ遺伝子（アミノ酸番号２９−１４８）との融合遺伝子（ＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子）が用いられる。また、第１のレポーターの遺伝子又は第２のレポーターの遺伝子のうち他方として、例えば、Ｃ末側ルシフェラーゼ（ＣＬｕｃ）遺伝子（アミノ酸番号３９８−５５０）とマウスのＭｙｏＤ遺伝子（アミノ酸番号１−３１８）との融合遺伝子（ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子）が用いられる。

したがって、本実施形態では、ホタルルシフェラーゼ由来のＮ末側ルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）遺伝子（アミノ酸番号１−４１６）とマウスのＩｄ遺伝子（アミノ酸番号２９−１４８）との融合遺伝子（ＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子）が調整される。また、ホタルルシフェラーゼ由来のＣ末側ルシフェラーゼ（ＣＬｕｃ）遺伝子（アミノ酸番号３９８−５５０）とマウスのＭｙｏＤ遺伝子（アミノ酸番号１−３１８）との融合遺伝子（ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子）が調製される。

ＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子に基づくＩｄ部位とＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子に基づくＭｙｏＤ部位とは、相互作用して結合する。したがって、ＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子とＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子とが導入された細胞において、ＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子とＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子とが発現すると、図２に示されるように、細胞内で発現したＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子に基づくＩｄ部位とＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子に基づくＭｙｏＤ部位とが相互作用して結合する。その結果、Ｎ末端側ルシフェラーゼと、Ｃ末端側ルシフェラーゼとが結合する。結合したルシフェラーゼでは、完全なレポーターとして発光酵素活性が回復し、例えばルシフェリンといった発光基質の添加によって検出可能な発光シグナルを出すための機能を備える。

本実施形態では、調製されたＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子に基づいて、物質を細胞に接触させる刺激によって発現が誘導される最初期遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子が用意される。ここで、最初期遺伝子のプロモーター領域としては、例えば、ｃ−ｆｏｓ遺伝子のプロモーター領域が用いられ得る。

また、本実施形態では、調整されたＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子に基づいて、細胞特異的な発現をする遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子が用意される。ここで、細胞特異的な発現をする遺伝子のプロモーター領域は、例えば、興奮性神経細胞を観察したい場合には興奮性神経細胞特異的に発現するカルモデュリン依存性キナーゼＩＩアルファ（ＣａＭＫＩＩα）遺伝子のプロモーター領域であり、抑制性神経細胞を観察したい場合には抑制性神経細胞特異的に発現するグルタミン酸脱炭酸酵素６７（ＧＡＤ６７）遺伝子のプロモーター領域である。

本実施形態では、動物細胞が用いられる場合、遺伝子発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいることが好ましい。また、発現ベクターは、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、タンパク質をコードする遺伝子の５´側若しくは３´側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー領域、又は複製可能単位等を含んでいてもよい。

これら、最初期遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子と、細胞特異的な発現をする遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子とは、培養した複数の細胞種からなる細胞群に、公知の遺伝子導入方法を用いて導入される。ここで、細胞群には、複数の細胞種として、例えば興奮性神経細胞と抑制性神経細胞とが含まれている。

あるいは、物質を細胞に接触させる刺激により発現が誘導される最初期遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子が用意される。さらに、細胞特異的な発現をする遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子が用意される。これら、最初期遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子と、細胞特異的な発現をする遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子とは、混合培養した複数の細胞種からなる細胞群に、公知の遺伝子導入方法を用いて導入される。

遺伝子を細胞へ導入する方法として、塩化カルシウム法若しくは塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法等が用いられ得る。本実施形態で使用される遺伝子導入した細胞は、一過性発現細胞と安定発現細胞との何れでもよい。

ステップＳ２において、遺伝子導入された細胞が生存し続けられる状態で維持される。所定数の遺伝子導入された細胞は、例えば所望の細胞培養が可能な器具を用いて所望の栄養培地中で培養される。遺伝子導入された細胞の数は、例えば、１乃至１×１０^６個、好ましくは１×１０^３乃至１×１０^６個である。細胞培養が可能な器具としては、例えばシャーレ、多数のウェルを有するマルチプレートが用いられ得る。栄養培地には、例えばＤ−ＭＥＭ培地が用いられる。ここで細胞群は、特定の研究又は止むを得ない緊急の検査において、生体中に維持された状態で生存し続ける場合であってもよい。いわゆる小動物（マウス、ラット、ウサギ）を含む非ヒト動物においては、生体から各種神経細胞を含む組織を摘出することなく各種レポーター遺伝子による撮像を行うことができる。

図３は、本実施形態で用いられる光学イメージングシステム１０の概略を示す。光学イメージングシステム１０は、細胞１を収容するための容器１１と、容器１１を収容する培養装置部１２と、撮像装置１３と、解析装置１４とを備える。容器１１は、例えば上述のシャーレやマルチプレート等である。容器１１として、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体等も用いられ得る。培養装置部１２には、温度調整機構や、湿度調整機構が設けられている。培養装置部１２内では、容器１１に内の細胞１は、生存した状態で維持され得る。撮像装置１３は、例えば発光顕微鏡に設けられたデジタルカメラである。解析装置１４は、例えばパーソナルコンピュータである。図３においては、撮像装置１３は、細胞の下に配置されているが、細胞の上に配置されてもよいことは勿論である。

遺伝子導入された所定数の細胞を含む試料は、予め細胞にとって最適な温度に保温され、試料の乾燥を防ぐため水を注入して保湿された光学イメージングシステム１０の培養装置部１２に設置される。最適な温度は、２５〜３７℃、好ましくは３５〜３７℃である。発光顕微鏡に設けられた例えばデジタルカメラである撮像装置１３は、対物レンズを介して、培養装置部１２に設置された細胞１の発光イメージを撮像し記録することができる。光学イメージングに発光顕微鏡が用いられることにより、微弱な光が画像化され得る。したがって、レポーターの微弱な光の位置情報が取得され得る。

本実施形態に係る光学イメージングでは、レポーター遺伝子を導入した細胞において、レポーター遺伝子により発せられる検出可能なシグナルの存在、不在又は強度をモニタリングし、記録し、分析する。光学イメージングを行うためには、レポーター遺伝子により発せられるシグナルを細胞の外部から分析できるように、そのシグナルの強度は十分に高い必要がある。光学イメージングは、自動化することが容易である。このため、多数の遺伝子の発現を同時にモニタリングすることに用いられ得る。

ステップＳ３において、細胞の活性化の誘導を行う。すなわち、細胞には、刺激を与えるための物質が所望の濃度となるように加えられる。物質の濃度は、例えば、１ｐＭ〜１Ｍ、好ましくは１００ｎＭ〜１ｍＭである。使用される物質には、自然界に存在する天然の物質や、人工的に調製される任意の物質が含まれる。具体的には、例えば、化学的に合成された任意の化合物が挙げられる。この化合物の種類及び分子量等は、特に限定されない。この物質がタンパク質又はペプチドである場合には、生体組織や細胞から単離されるもの、及び遺伝子組換えや化学的合成により調製されるものが含まれる。さらに、それらの化学修飾体も含まれる。

本実施形態では、例えばＧタンパク質共役型受容体を介する刺激として、代謝型グルタミン酸受容体アゴニストであるＤＨＰＧを添加する刺激が用いられ得る。ＤＨＰＧの終濃度は、例えば１００μＭとする。細胞の活性化がＧタンパク質共役型受容体を介して行われることにより、薬剤により細胞を活性化させることができる。したがって、薬剤の刺激によってレポーター遺伝子を発現させることができる。刺激には、Ｇタンパク質共役型受容体を介する刺激として、ＤＨＰＧ以外の物質が用いられてもよいし、Ｇタンパク質共役型受容体を介さない他の刺激が用いられてもよい。

また、刺激を与えるための物質の他に、例えば発光イメージングを行うために必要な物質が投与されてもよい。発光イメージングに必要な物質は、例えばルシフェラーゼが用いられる場合のルシフェリンである。このような刺激を与えるため以外の物質は、刺激を与えるための物質の添加の前に添加しても、後に添加しても、同時に添加してもよい。この時期は、実験に応じて適宜決定され得る。

ステップＳ４において、光学イメージングシステム１０を用いて、光学イメージングを行う。光学イメージングシステム１０は、ルシフェラーゼに基づく発光を撮像することができる。光学イメージングは、ルシフェラーゼ以外が用いられた発光を撮像するものでもよいし、発光に限らず、例えば蛍光タンパク質に由来する蛍光を撮像するものでもよい。光学イメージングシステム１０は、所望の時間間隔で細胞１を撮像して記録できる。撮像の時間間隔は、例えば５分間〜５時間であり、好ましくは１０分間〜１時間である。レポーターによるシグナルを光学イメージングによって画像化することがで、レポーターのシグナルの位置情報が取得され得る。

遺伝子導入されて刺激を加えられた興奮性神経細胞と抑制性神経細胞とにおいて生ずる現象を、図４及び図５に示す模式図を参照して説明する。例えば、ＣａＭＫＩＩα遺伝子のプロモーター領域発現可能に連結されたＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子と、ｃ−ｆｏｓ遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子とが、興奮性神経細胞２０と抑制性神経細胞３０とに導入された場合の模式図を図４に示す。

図４に示されるように、興奮性神経細胞２０においては、ＮＬｕｃ−Ｉｄ２１が発現する。また、興奮性神経細胞では、物質添加による細胞刺激によってＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ２２の発現が誘導される。その結果、この誘導によりルシフェラーゼの酵素活性が増強し検出可能なシグナルが発せられる。これに対して、抑制性神経細胞３０においては、ＮＬｕｃ−Ｉｄが発現しない。したがって、抑制性神経細胞では、物質添加による細胞刺激によってＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ３２の発現が誘導されても、ルシフェラーゼの酵素活性は増強せず、検出可能なシグナルは発せられない。

ＣａＭＫＩＩα遺伝子のプロモーター領域発現可能に連結されるのがＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子であり、ｃ−ｆｏｓ遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されるのがＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子であっても同様である。すなわち、興奮性神経細胞では、物質添加による細胞刺激によってシグナルが検出され、抑制性神経細胞では、物質添加による細胞刺激によってもシグナルが検出されない。

一方、例としてＧＡＤ６７遺伝子のプロモーター領域発現可能に連結されたＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子と、ｃ−ｆｏｓ遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子とが、興奮性神経細胞２０と抑制性神経細胞３０とに導入された場合の模式図を図５に示す。

図５に示されるように、興奮性神経細胞２０においては、ＮＬｕｃ−Ｉｄが発現しない。したがって、興奮性神経細胞２０では、物質添加による細胞刺激によってＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ２７の発現が誘導されても、ルシフェラーゼの酵素活性は増強せず、検出可能なシグナルは発せられない。一方、抑制性神経細胞３０においては、ＮＬｕｃ−Ｉｄ３６が発現する。したがって、抑制性神経細胞３０では、物質添加による細胞刺激によってＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ３７の発現が誘導されると、この誘導によりルシフェラーゼの酵素活性が増強し検出可能なシグナルが発せられる。

ＧＡＤ６７遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されるのがＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子であり、ｃ−ｆｏｓ遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されるのがＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子であっても同様である。すなわち、興奮性神経細胞では、物質添加による細胞刺激によってもシグナルが検出されず、抑制性神経細胞では、物質添加による細胞刺激によってシグナルが検出される。

ここでは、興奮性神経細胞や抑制性神経細胞におけるシグナル検出を例に挙げたが、細胞種はこれに限らず、例えばグリア細胞といった脳内に混在し得る他の細胞種にも本実施形態は適用され得る。また、比較したい細胞種については、それぞれの細胞に特異的に発現する遺伝子を有する場合であれば、あらゆる細胞同士の解析が可能である。

ステップＳ５において、ステップＳ４で記録された画像に基づいて、シグナル強度の定量化を行う。記録された画像の解析には、一般的に用いられている画像解析ソフト（例えば、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ；ユニバーサルイメージング社製など）が用いられ得る。例えば、画像内の所望の領域における輝度値が取得される。レポーターが生ずるシグナルの強度を輝度値として数値で取得することにより、定量的な評価が行われ得る。

さらに、発光イメージと同視野において明視野イメージを記録し、前記の画像解析ソフトを用いて発光イメージと明視野イメージを重ね合わせて、発光している細胞が同定され得る。このイメージの重ね合わせにより、シグナルの位置情報と細胞の位置情報とが比較され得る。すなわち、レポーター遺伝子に基づくシグナルを発している細胞が同定され得る。

本実施形態によれば、興奮性神経細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域が用いられることにより、興奮性神経細胞においてのみ下流の遺伝子の発現が誘導される。これにより、興奮性神経細胞においてのみレポーター遺伝子を発現させられる。その結果、興奮性神経細胞における発現を特異的に検出できる。例えば、カルモデュリン依存性キナーゼＩＩアルファ（ＣａＭＫＩＩα）遺伝子のプロモーター領域が用いられることにより、興奮性神経細胞におけるレポーター遺伝子の発現を特異的に検出できる。

また、抑制性神経細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域が用いられることにより、抑制性神経細胞においてのみ下流の遺伝子の発現が誘導される。これにより、抑制性神経細胞においてのみレポーター遺伝子を発現させられる。その結果、抑制性神経細胞における発現を特異的に検出できる。例えば、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６７）遺伝子のプロモーター領域が用いられることにより、抑制性神経細胞におけるレポーター遺伝子の発現を特異的に検出できる。

本実施形態によれば、最初期遺伝子のプロモーター領域が用いられることにより、細胞の活性化により下流の遺伝子の発現が誘導される。例えば、最初期遺伝子のプロモーター領域として、ヒト由来のｃ−ｆｏｓ遺伝子のプロモーター領域が用いられることにより、細胞の活性化により下流の遺伝子の発現が誘導される。これにより、細胞の活性化に伴って検出可能なレポーター遺伝子の発現量が変化する。

レポーターの遺伝子として発光タンパク質の遺伝子配列の全部又は一部を含むことにより、レポーター遺伝子の発現によって発光反応が起こる。したがって、レポーター遺伝子の発現が、発光の観察によって検出され得る。この発光タンパク質がホタル由来のルシフェラーゼであることにより、ルシフェリンを発光基質として添加することで、レポーター遺伝子の発現によって発光反応がおこる。また、発光タンパク質に発光波長が異なる複数のルシフェラーゼが用いられることにより、レポーター遺伝子の発現によって異なる波長を持つ発光反応が起こる。したがって、レポーター遺伝子の発現を、発光波長に応じて異なる波長を透過する光学フィルターを用いて撮像することにより、発光色で分離できる。

実施例として、薬剤刺激に対応した興奮性神経細胞及び抑制性神経細胞のｃ−ｆｏｓプロモーター活性測定について説明する。
［発現ベクター］
まず、Ｎ末側発光酵素（ＮＬｕｃ）遺伝子とＣ末側発光酵素（ＣＬｕｃ）遺伝子を作製するために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを調整した。合成オリゴＤＮＡの配列を以下に示す。
（ＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１）:５´−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴ−３´
ＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号２）：５´−ＣＡＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＴＴ−３´
（ＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号３）:５´−ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧ−３´
ＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号４）:５´−ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴ−３´

また、ＭｙｏＤ遺伝子及びＩｄ遺伝子のクローニングのために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを調整した。合成オリゴＤＮＡの配列を以下に示す。
（ＭｙｏＤ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＭｙｏＤ＿Ｆｗ（配列番号５）：５´−ＧＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＴＣ−３´
ＭｙｏＤ＿Ｒｖ（配列番号６）：５´−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＧＣＡＴＴ−３´
（Ｉｄ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
Ｉｄ＿Ｆｗ（配列番号７）：５´−ＧＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＣＧＧＡＧＣＡＡＡＧＣ−３´
Ｉｄ＿Ｒｖ（配列番号８）：５´−ＧＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＡＧＡＴＧＣＧＡＴ−３´

そして、ｐＧＬ４．１０（プロメガ（株）製）を鋳型とし、ＮＬｕｃ＿Ｆｗ及びＮＬｕｃ＿Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｎ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ＮＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の１番目から４１６番目のアミノ酸を含む。）をＰＣＲにより増幅した。また、ｐＧＬ４．１０（プロメガ（株）製）を鋳型とし、ＣＬｕｃ＿Ｆｗ及びＣＬｕｃ＿Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｃ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の３９９番目から５５０番目のアミノ酸を含む。）をＰＣＲにより増幅した。

また、マウス骨格筋ｃＤＮＡライブラリ（タカラバイオ（株）製）を鋳型とし、ＭｙｏＤ＿Ｆｗ及びＭｙｏＤ＿Ｒｖをプライマーとして用いて、ＭｙｏＤ遺伝子（マウスのＭｙｏＤ遺伝子の１番目から３１８番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む。）をＰＣＲにより増幅した。また、マウス骨格筋ｃＤＮＡライブラリ（タカラバイオ（株）製）を鋳型とし、Ｉｄ＿Ｆｗ及びＩｄ＿Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｉｄ遺伝子（マウスのＩｄ遺伝子の２９番目から１４８番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む。）をＰＣＲにより増幅した。

そして、ＰＣＲで増幅させたＮＬｕｃ遺伝子及びＭｙｏＤ遺伝子を、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングした。その後、ＮＬｕｃ遺伝子の下流に存在するＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位の間にＩｄ遺伝子を挿入した。また、ＭｙｏＤ遺伝子の下流に存在するＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位の間にＣＬｕｃ遺伝子を挿入した。このようにして、融合遺伝子（ＮＬｕｃ−Ｉｄ、及び、ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ）を作製した。

そして、ｐＧＬ４．１０ベクター（プロメガ（株）製）のルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれＮＬｕｃ−Ｉｄ及びＭｙｏＤ−ＣＬｕｃに入れ換えた発現ベクターを作製した。

また、ｃ−ｆｏｓプロモーター領域及びＣａＭＫＩＩαプロモーター領域、ＧＡＤ６７プロモーター領域のクローニングのために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを調整した。合成オリゴＤＮＡの配列を以下に示す。
（ｃ−ｆｏｓプロモーター領域作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
ｃ−ｆｏｓ＿ｐｒｏ＿Ｆｗ（配列番号９）：５´−ＡＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＡＧＴＴＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＣＴ−３´
ｃ−ｆｏｓ＿ｐｒｏ＿Ｒｖ（配列番号１０）：５´−ＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＡＧＡＡＣＡＡ−３´
（ＣａＭＫＩＩαプロモーター領域作成用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＣａＭＫＩＩα＿ｐｒｏ＿Ｆｗ（配列番号１１）：５´−ＡＧＡＴＣＴＴＧＴＧＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＴＧＣ−３´
ＣａＭＫＩＩα＿ｐｒｏ＿Ｒｖ（配列番号１２）：５´−ＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＡＧＧＣＴＴＧＧＧ−３´
（ＧＡＤ６７プロモーター領域作成用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＧＡＤ６７＿ｐｒｏ＿Ｆｗ（配列番号１３）：５´−ＣＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＡＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧ−３´
ＧＡＤ６７＿ｐｒｏ＿Ｒｖ（配列番号１４）：５´−ＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＧＴＴＣＴ−３´

そして、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｃ−ｆｏｓ＿ｐｒｏ＿Ｆｗ及びｃ−ｆｏｓ＿ｐｒｏ＿Ｒｖをプライマーとして用いて、ヒトのｃ−ｆｏｓプロモーター領域をＰＣＲにより増幅した。また、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＣａＭＫＩＩα＿ｐｒｏ＿Ｆｗ及びＣａＭＫＩＩα＿ｐｒｏ＿Ｒｖをプライマーとして用いて、ＣａＭＫＩＩαプロモーター領域をＰＣＲにより増幅した。また、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＧＡＤ６７＿ｐｒｏ＿Ｆｗ及びＧＡＤ６７＿ｐｒｏ＿Ｒｖをプライマーとして用いて、ＧＡＤ６７プロモーター領域をＰＣＲにより増幅した。

そして、ＰＣＲで増幅させたヒトのｃ−ｆｏｓプロモーター領域、ＣａＭＫＩＩαプロモーター領域、及びＧＡＤ６７プロモーター領域を、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングした。

興奮性神経細胞特異的プロモーターとしてのＣａＭＫＩＩαプロモーターによってＭｙｏＤ−ＣＬｕｃが発現誘導されるように構成された、ＣａＭＫＩＩαプロモーター領域に発現可能に連結されたＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子を含む第１の発現ベクター（ｐＣａＭＫＩＩα／ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ）を次のように構築した。すなわち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングされたＣａＭＫＩＩαプロモーター領域を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子の上流に存在するＢｇｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入して、ＣａＭＫＩＩαプロモーター誘導型ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子発現ベクター（ｐＣａＭＫＩＩα／ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ）を作製した。

また、抑制性神経細胞特異的プロモーターとしてのＧＡＤ６７プロモーターによってＭｙｏＤ−ＣＬｕｃが発現誘導されるように構成された、ＧＡＤ６７プロモーター領域に発現可能に連結されたＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子を含む第２の発現ベクター（ｐＧＡＤ６７／ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ）を次のように構築した。すなわち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングされたＧＡＤ６７プロモーター領域を制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子の上流に存在するＸｈｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入して、ＧＡＤ６７プロモーター誘導型ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ遺伝子発現ベクター（ｐＧＡＤ６７／ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ）を作製した。

また、ｃ−ｆｏｓプロモーターによってＮＬｕｃ−Ｉｄが発現誘導されるように構成された、ｃ−ｆｏｓプロモーター領域に発現可能に連結されたＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子を含む第３の発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＮＬｕｃ−Ｉｄ）を次のように構築した。すなわち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングされたｃ−ｆｏｓプロモーター領域を制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子の上流に存在するＸｈｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入して、ｃ−ｆｏｓプロモーター誘導型ＮＬｕｃ−Ｉｄ遺伝子発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＮＬｕｃ−Ｉｄ）を作製した。

［細胞調整］
複数種類の神経細胞が混在している試料として、ラットの海馬のスライス試料を用いた。すなわち、本測定では、ｉｎ ｖｉｔｒｏに近い状態で、興奮性神経細胞及び抑制性神経細胞のｃ−ｆｏｓプロモーター活性測定を行った。

まず、７−９日齢のＳＤラットから全脳を採取し、海馬を含む部位をリニアスライサーＰｒｏ７（堂坂イーエム（株）製）を用いて４００μｍの厚さにスライスした。海馬スライスはミリセルカルチャーインサート（ミリポア（株）製）上に置いて、２５％の馬血清及び２５％のＨａｎｋ’ｓ液を含むＥａｒｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地中にて５％ ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。培養開始から５−７日後にサンプルを２つのグループに分けた。一方のグループのラット海馬切片の神経細胞には、エレクトロポレーション法により、第１の発現ベクター（ｐＣａＭＫＩＩα／ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ）及び第３の発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＮＬｕｃ−Ｉｄ）を遺伝子導入した。他方のグループのラット海馬切片の神経細胞には、エレクトロポレーション法により、第２の発現ベクター（ｐＧＡＤ６７／ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ）及び第３の発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＮＬｕｃ−Ｉｄ）を遺伝子導入した。遺伝子導入した切片サンプルを、２５％の馬血清及び２５％のＨａｎｋ’ｓ液を含むＥａｒｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地中にて５％ ＣＯ_２インキュベーター内で一晩培養した。

［刺激及び撮像］
一晩の培養後、培地を無血清のＣＯ_２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ培養液（インビトロジェン（株）製）に交換し、４時間インキュベートした。その後、ルシフェリンを終濃度１ｍＭとなるように加えて、さらに１時間インキュベートした。

切片を含む培養ディッシュを発光顕微鏡（ＬＶ−２００；オリンパス（株）製）にセットした。撮像装置１３として、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ；Ａｎｄｏｒ（株）製）を用いて発光画像の取得を行った。取得した画像を、解析装置１４としてのパーソナルコンピュータに取り込んだ。Ｇタンパク質共役型受容体を介する刺激として、代謝型グルタミン酸受容体アゴニストであるＤＨＰＧ（終濃度１００μＭ）で刺激を行った。刺激直後から、ＬＶ−２００によって発光画像を１０分おきに連続的に取得した。発光画像の解析は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。

［結果］
興奮性神経細胞特異的プロモーター（ＣａＭＫＩＩαプロモーター）によって発現誘導されるＣ末側スプリットルシフェラーゼ遺伝子を含む第１の発現ベクター（ｐＣａＭＫＩＩα／ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ）と、第３の発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＮＬｕｃ−Ｉｄ）とを導入した培養海馬切片において得られた発光画像を図７に示す。図６（Ａ）はＤＨＰＧ刺激から４時間後の発光画像を示し、図６（Ｂ）はＤＨＰＧ刺激から１３時間後の発光画像を示し、図６（Ｃ）はＤＨＰＧ刺激から２０時間後の発光画像を示す。図６（Ａ）において四角形の枠は、輝度の評価を行った関心領域（ＲＯＩ）を示す。

また、取得した発光画像に基づいて、興奮性神経細胞におけるＤＨＰＧ刺激に伴う細胞毎のｃ−ｆｏｓプロモーター活性を表す発光強度の変化を解析した。この発光強度変化を図７に示す。図７において横軸は時間であり、縦軸は、相対的な発光強度を表す。図７における各曲線は、各細胞の発光強度変化を示す。

図７に示されるように、興奮性神経細胞では、ＤＨＰＧ刺激後直ちにｃ−ｆｏｓプロモーター活性が上昇していく細胞と、ＤＨＰＧ刺激後８時間程たってからｃ−ｆｏｓプロモーター活性が上昇していく細胞とが存在した。このように、興奮性神経細胞では、ＤＨＰＧ刺激後のｃ−ｆｏｓプロモーター活性の経時変化について細胞間での差が大きかった。

抑制性神経細胞特異的プロモーター（ＧＡＤ６７プロモーター）によって発現誘導されるＣ末側スプリットルシフェラーゼ遺伝子を含む第２の発現ベクター（ｐＧＡＤ６７／ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ）と、第３の発現ベクター（ｐｆｏｓ／ＮＬｕｃ−Ｉｄ）とを導入した培養海馬切片において得られた発光画像を図８に示す。図８（Ａ）はＤＨＰＧ刺激から２時間後の発光画像を示し、図８（Ｂ）はＤＨＰＧ刺激から９時間後の発光画像を示し、図８（Ｃ）はＤＨＰＧ刺激から２０時間後の発光画像を示す。図８（Ａ）において四角形の枠は、輝度の評価を行った関心領域（ＲＯＩ）を示す。

また、取得した発光画像に基づいて、抑制性神経細胞におけるＤＨＰＧ刺激に伴う細胞毎のｃ−ｆｏｓプロモーター活性を表す発光強度の変化を解析した。この発光強度変化を図９に示す。図９において横軸は時間であり、縦軸は、相対的な発光強度を表す。図９における各曲線は、各細胞の発光強度変化を示す。

図９に示されるように、抑制性神経細胞では、多くの細胞でＤＨＰＧ刺激後２時間経過後頃からｃ−ｆｏｓプロモーター活性が上昇し、この経時変化の細胞間での差は小さかった。

本実施例では、興奮性神経細胞と抑制性神経細胞とが混在するサンプルを用いながら、興奮性神経細胞の活動と抑制性神経細胞の活動とを分離して解析することができた。図７と図９との比較から明らかなように、興奮性神経細胞と抑制性神経細胞とでは、代謝型グルタミン酸受容体刺激（ＤＨＰＧ刺激）に対する最初期遺伝子の発現パターンが異なることが明らかになった。

本発明に係る脳活動の解析方法は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で用いられ得る。

１…細胞、１０…光学イメージングシステム、１１…容器、１２…培養装置部、１３…撮像装置、１４…解析装置、２０…興奮性神経細胞、２１…ＮＬｕｃ−Ｉｄ、２２…ＭｙｏＤ-ＣＬｕｃ、２７…ＭｙｏＤ-ＣＬｕｃ、３０…抑制性神経細胞、３２…ＭｙｏＤ-ＣＬｕｃ、３６…ＮＬｕｃ−Ｉｄ、３７…ＭｙｏＤ-ＣＬｕｃ。

Claims (17)

1. 特定種類の細胞で発現する遺伝子の第１のプロモーター領域に発現可能に連結された不完全な第１のレポーターの遺伝子を、前記細胞を含む細胞群に導入することと、
   前記細胞の活性化により発現が誘導される遺伝子の第２のプロモーター領域に発現可能に連結された、前記第１のレポーターとの結合によって完全なレポーターが形成される不完全な第２のレポーターの遺伝子を、前記細胞群に導入することと、
   前記細胞群を生存状態で維持することと、
   前記細胞の活性化を誘導することと、
   前記第１のレポーターと前記活性化によって発現した前記第２のレポーターとが結合することによって生ずる検出可能なシグナルを、前記細胞群を光学イメージングすることで画像として取得することと、
   前記画像に基づいて、前記シグナルの強度を定量的に決定することと、
   を具備する脳活動の解析方法。
2. 前記細胞は神経細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１のプロモーター領域は、興奮性神経細胞又は抑制性神経細胞に特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域である、請求項２に記載の方法。
4. 前記第１のプロモーター領域は、前記興奮性神経細胞に特異的に発現するカルモデュリン依存性キナーゼＩＩアルファ（ＣａＭＫＩＩα）遺伝子のプロモーター領域である、請求項３に記載の方法。
5. 前記第１のプロモーター領域は、前記抑制性神経細胞に特異的に発現するグルタミン酸脱炭酸酵素６７（ＧＡＤ６７）遺伝子のプロモーター領域である、請求項３に記載の方法。
6. 前記第２のプロモーター領域は、最初期遺伝子のプロモーター領域である、請求項１乃至５のうち何れか１項に記載の方法。
7. 前記最初期遺伝子は、ヒト由来ｃ−ｆｏｓ遺伝子である、請求項６に記載の方法。
8. 前記第１のレポーターの遺伝子及び前記第２のレポーターの遺伝子は、発光タンパク質の遺伝子配列の一部からなる、請求項１乃至７のうち何れか１項に記載の方法。
9. 前記発光タンパク質は、ホタル由来のルシフェラーゼである、請求項８に記載の方法。
10. 前記ルシフェラーゼは、光学的に分離される複数の異なる発光波長を有するルシフェラーゼのうちから選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記光学イメージングは、発光顕微鏡を用いた撮像を含み、
    前記撮像には、前記発光波長に応じて異なる波長を透過する光学フィルターが用いられる、
    請求項１０に記載の方法。
12. 前記活性化は、Ｇタンパク質共役型受容体を介して行われる、請求項１乃至１１のうち何れか１項に記載の方法。
13. 前記第１のレポーターと前記第２のレポーターとが結合するように、前記第１のレポーターの遺伝子には第１の相互作用タンパク質の遺伝子が結合されており、前記第２のレポーターの遺伝子には前記第１の相互作用タンパク質と相互作用する第２の相互作用タンパク質の遺伝子が結合されている、請求項１乃至１２のうち何れか１項に記載の方法。
14. 前記第１の相互作用タンパク質は、ＭｙｏＤ又はＩｄのうち一方であり、前記第２の相互作用タンパク質は、ＭｙｏＤ又はＩｄのうち他方である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記光学イメージングは発光顕微鏡を用いた撮像を含む、請求項１乃至１３のうち何れか１項に記載の方法。
16. 前記シグナルの強度を定量的に決定することは、前記画像に含まれる輝度値を取得することを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記細胞群の明視野像を取得することと、
    前記光学イメージングにより取得した前記画像と、前記明視野像とを比較して、前記シグナルを生じている前記細胞を同定することと、
    をさらに具備する請求項１乃至１６のうち何れか１項に記載の方法。

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