JPWO2004016785A1 - Test method for atopic dermatitis - Google Patents

Abstract

In atopic dermatitis patients and psoriasis patients, a gene whose expression level was different between the rash and non-rash areas was found. In addition, we found genes whose expression levels are different between the non-rash area and normal subjects of these diseases. And it was clarified that these genes are useful as indicators in screening for atopic dermatitis or psoriasis and screening for therapeutic drugs. That is, the present invention provides a method for examining atopic dermatitis or psoriasis and a method for screening compounds for the treatment of these diseases based on the comparison of the expression levels of the indicator genes thus found.

Description

  The present invention relates to an inspection method for atopic dermatitis.

Allergic diseases such as atopic dermatitis are considered multifactorial diseases. These diseases are caused by the interaction of the expression of many different genes, and the expression of these individual genes is affected by several environmental factors. For this reason, it is very difficult to elucidate a specific gene causing a specific disease.
In addition, allergic diseases are thought to involve the expression of genes having mutations and defects, the overexpression of specific genes, and the reduction of the expression level. In order to elucidate the role that gene expression plays in relation to disease, it is necessary to understand how genes are involved in the onset and how external stimuli such as drugs change gene expression.
Now, in the diagnosis of allergic diseases, in general, an interview, a family history, and confirmation of the person's past medical condition are important factors. In addition, in order to diagnose allergy based on more objective information, a test method using blood as a sample and a method of observing a patient's immunological response to an allergen are also being carried out. Examples of the former include allergen-specific IgE measurement, leukocyte histamine release test, or lymphocyte blastogenesis test. The presence of allergen-specific IgE is evidence of an allergic reaction to that allergen. However, depending on the patient, it may not always be possible to detect allergen-specific IgE. In addition, due to the measurement principle, all allergens necessary for diagnosis must be tested. The leukocyte histamine release test and the lymphocyte rejuvenation test are methods for observing the response of the immune system to allergens in vitro. These methods are complicated to operate.
On the other hand, a method (the latter) in which an immune response observed when a patient is actually brought into contact with an allergen is useful for diagnosis of allergy is also known. Such tests include prick tests, scratch tests, patch tests, intradermal reactions, or induction tests. Although these tests can directly diagnose a patient's allergic reaction, it can be said that these tests involve an invasion that actually exposes a subject to an allergen.
In addition to this, test methods for demonstrating the involvement of allergic reactions have been attempted regardless of allergens. For example, if the serum IgE level is high, it can be estimated that the patient has an allergic reaction. The serum IgE value is information corresponding to the total amount of allergen-specific IgE. Although it is easy to determine the total amount of IgE regardless of the type of allergen, IgE may be low in patients with diseases such as non-atopic bronchitis asthma.
Accordingly, there has been a need for a diagnostic index that can be used for grasping the pathology of allergic patients and determining the treatment policy regardless of the allergen. Furthermore, it would be useful to provide a marker for allergic diseases that is less invasive to patients and can easily provide information necessary for diagnosis. Since such a marker is considered to be deeply involved in the development of allergic diseases, it may be an important target not only in diagnosis but also in control of allergic symptoms.

〔１０〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔１１〕遺伝子の発現レベルを、指標遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔１２〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アトピー性皮膚炎検査用試薬であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）〜ｄ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるアトピー性皮膚炎検査用試薬。
〔１３〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体からなる、アトピー性皮膚炎検査用試薬であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）〜ｄ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるアトピー性皮膚炎検査用試薬。
〔１４〕次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）〜ｄ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程、
（２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはｃ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群またはｄ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
〔１５〕細胞が株化皮膚細胞である〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬侯補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）〜ｄ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるキット。
〔１７〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）〜ｄ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるキット。
〔１８〕指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の皮膚における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアトピー性皮膚炎モデル動物であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）またはｃ）、並びに以下のＡ）またはＣ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるモデル動物。

〔１９〕非ヒト脊椎動物がマウスである〔１８〕に記載のモデル動物。
〔２０〕指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の皮膚における発現強度を低下させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアトピー性皮膚炎モデル動物であって、指標遺伝子が〔１〕におけるｂ）またはｄ）、並びに以下のＢ）またはＤ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるモデル動物。

Ｄ）以下の遺伝子からなる、ＤＮＦＢ反復塗布接触性皮膚炎モデルマウスの耳介皮膚における発現レベルがＤＮＦＢ反復塗布前のマウスの耳介皮膚に比べて低い指標遺伝子群：ｐｅｒｉｏｄ ｈｏｍｏｌｏｇ ３（ＡＩ０１９７７９）、およびｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ（Ｕ１１６８０）
〔２１〕非ヒト脊椎動物がマウスである〔２０〕に記載のモデル動物。
〔２２〕次の１）−４）のいずれかに記載の成分をマウスに投与する工程を含む、アトピー性皮膚炎モデル動物の製造方法。
１）〔１８〕におけるＡ）およびＣ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
２）〔１８〕におけるＡ）およびＣ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質
３）〔２０〕におけるＢ）およびＤ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドのアンチセンスまたはＲＮＡｉ
４）〔２０〕におけるＢ）およびＤ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質に結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片
〔２３〕〔２２〕における１）−４）のいずれかに記載の成分を有効成分として含む、マウスにアトピー性皮膚炎を誘導するための誘導剤。
〔２４〕次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）〜ｄ）のいずれか、並びに〔１８〕におけるＡ）およびＣ）、並びに〔２０〕におけるＢ）およびＤ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）前記被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群、ｃ）群、Ａ）群、並びにＣ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群、ｄ）群、Ｂ）群、並びにＤ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
〔２５〕次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）〜ｄ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはｃ）群の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群またはｄ）群の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程、
〔２６〕次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）〜ｄ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはｃ）群の指標遺伝子については前記活性を低下させる化合物を、またｂ）群またはｄ）群の指標遺伝子については前記活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔２７〕〔１４〕、〔２４〕、〔２５〕、および〔２６〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アトピー性皮膚炎の治療薬。
〔２８〕指標遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを有効成分として含むアトピー性皮膚炎の治療薬であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）またはｃ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
〔２９〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体を有効成分として含む、アトピー性皮膚炎の治療薬であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）またはｃ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
〔３０〕指標遺伝子、または指標遺伝子によってコードされる蛋白質を有効成分として含む、アトピー性皮膚炎の治療薬であって、指標遺伝子が〔１〕におけるｂ）またはｄ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
〔３１〕指標遺伝子を測定するためのプローブを固定したアトピー性皮膚炎の診断用ＤＮＡチップであって、指標遺伝子が〔１〕に記載されたａ）群〜ｄ）群のいずれかから選択された少なくとも１種類の遺伝子であるＤＮＡチップ。
あるいは本発明は、〔１４〕、〔２４〕、〔２５〕および〔２６〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を投与する工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療方法に関する。また本発明は、〔１４〕、〔２４〕、〔２５〕および〔２６〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物の、アトピー性皮膚炎の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
加えて本発明は、次の成分（ｉ）または（ｉｉ）を投与する工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療方法に関する。あるいは本発明は、次の成分（ｉ）または（ｉｉ）の、アトピー性皮膚炎の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
（ｉ）上記ａ）またはｃ）に記載の遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡ、
（ｉｉ）上記ａ）またはｃ）に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体
更に本発明は、次の成分（ｉｉｉ）または（ｉｖ）を投与する工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療方法に関する。あるいは本発明は、次の成分（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の、アトピー性皮膚炎の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
（ｉｉｉ）上記ｂ）またはｄ）に記載の遺伝子、
（ｉｖ）上記ｂ）またはｄ）に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質
また本発明は、以下の乾癬の検査方法、並びに乾癬治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。
〔３２〕次の工程（１）〜（３）を含む、乾癬の検査方法であって、指標遺伝子が次のｉ）〜ｉｖ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である方法。
（１）被検者の皮疹部および／または無疹部から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
（２）工程（１）で測定された発現レベルを、指標遺伝子がｉ）またはｉｉ）に記載された遺伝子である場合には、対照として同じ被検者の無疹部から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルと、また指標遺伝子がｉｉｉ）またはｉｖ）に記載された遺伝子である場合には、対照として健常者の生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
（３）（２）の比較の結果、指標遺伝子がｉ）またはｉｉｉ）に記載された遺伝子の場合には対照と比較して発現レベルが高い場合に、また指標遺伝子がｉｉ）またはｉｖ）に記載された遺伝子の場合には対照と比較して発現レベルが低い場合に、前記被検者は乾癬を有すると判定する工程

〔４１〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔３２〕に記載の検査方法。
〔４２〕遺伝子の発現レベルを、指標遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔３２〕に記載の検査方法。
〔４３〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、乾癬検査用試薬であって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉ）〜ｉｖ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である乾癬検査用試薬。
〔４４〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体からなる、乾癬検査用試薬であって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉ）〜ｉｖ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である乾癬検査用試薬。
〔４５〕次の工程を含む、乾癬の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉ）〜ｉｖ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程、
（２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ｉ）群またはｉｉｉ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｉｉ）群またはｉｖ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
〔４６〕細胞が株化皮膚細胞である〔４５〕に記載の方法。
〔４７〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞を含む、乾癬の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉ）〜ｉｖ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるキット。
〔４８〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞を含む、乾癬の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉ）〜ｉｖ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるキット。
〔４９〕指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の皮膚における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなる乾癬モデル動物であって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉ）群およびｉｉｉ）群に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるモデル動物。
〔５０〕非ヒト脊椎動物がマウスである〔４９〕に記載のモデル動物。
〔５１〕指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の皮膚における発現強度を低下させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなる乾癬モデル動物であって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉｉ）群およびｉｖ）群から選択されたいずれかの遺伝子であるモデル動物。
〔５２〕非ヒト脊椎動物がマウスである〔５１〕に記載のモデル動物。
〔５３〕次の工程を含む、乾癬の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉ）〜ｉｖ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ｉ）群またはｉｉｉ）群の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｉｉ）群またはｉｖ）群の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程、
〔５４〕次の工程を含む、乾癬の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉ）〜ｉｖ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ｉ）群またはｉｉｉ）群の指標遺伝子については前記活性を低下させる化合物を、またｉｉ）群またはｉｖ）群の指標遺伝子については前記活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔５５〕〔４５〕、〔５３〕、および〔５４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、乾癬の治療薬。
〔５６〕指標遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを有効成分として含む乾癬の治療薬であって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉ）またはｉｉｉ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
〔５７〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体を有効成分として含む、乾癬の治療薬であって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉ）またはｉｉｉ）のいずれかに記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
〔５８〕指標遺伝子、または指標遺伝子によってコードされる蛋白質を有効成分として含む、乾癬の治療薬であって、指標遺伝子が〔３２〕におけるｉｉ）またはｉｖ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
〔５９〕指標遺伝子を測定するためのプローブを固定した乾癬の診断用ＤＮＡチップであって、指標遺伝子が〔３２〕に記載されたｉ）〜ｉｖ）群のいずれかから選択された少なくとも１種類の遺伝子であるＤＮＡチップ。
あるいは本発明は、〔４５〕、〔５３〕、および〔５４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を投与する工程を含む、乾癬の治療方法に関する。また本発明は、〔４５〕、〔５３〕、および〔５４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物の、乾癬の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
加えて本発明は、次の成分（１）または（２）を投与する工程を含む、乾癬の治療方法に関する。あるいは本発明は、次の成分（１）または（２）の、乾癬の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
（１）上記ｉ）またはｉｉｉ）に記載の遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡ、
（２）上記ｉ）またはｉｉｉ）に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体
更に本発明は、次の成分（３）または（４）を投与する工程を含む、乾癬の治療方法に関する。あるいは本発明は、次の成分（３）または（４）の、乾癬の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
（３）上記ｉｉ）またはｉｖ）に記載の遺伝子、
（４）上記ｉｉ）またはｉｖ）に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のうち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本発明において、アトピー性皮膚炎の指標とすることができる遺伝子を、ＡＤ指標遺伝子という。またＡＤ指標遺伝子がコードするアミノ酸配列からなる蛋白質をＡＤ指標蛋白質という。ＡＤ指標遺伝子は特に断らない限り、ａ）−ｄ）、ならびにＡ）−Ｄ）に記載された遺伝子から選択されたいずれか１つまたは複数の任意の遺伝子を示す用語として用いられる。
本発明のＡＤ指標遺伝子において、次に示す遺伝子群から選択された遺伝子は、前記ａ）群またはｂ）群の遺伝子として好ましい。これらの遺伝子は、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部における発現レベルがアトピー性皮膚炎患者の無疹部に比べて高い−ａ）群−、または低い−ｂ）群−ＡＤ指標遺伝子群に含まれ、かつ乾癬患者の皮疹部と無疹部の比較においては発現レベルに有意な差が見られなかった遺伝子である。これらのＡＤ指標遺伝子は、アトピー性皮膚炎患者において特異的に発現レベルが変化している遺伝子である。

一方、本発明のＡＤ指標遺伝子において、次に示す遺伝子群から選択された遺伝子は、前記ｃ）群またはｄ）群の遺伝子として好ましい。これらの遺伝子は、アトピー性皮膚炎患者の無疹部における発現レベルが健常者に比べて高い−ｃ）群−、または低い−ｄ）群−ＡＤ指標遺伝子群に含まれ、かつ乾癬患者の無疹部と健常者の比較においては発現レベルに有意な差が見られなかった遺伝子である。これらのＡＤ指標遺伝子も、アトピー性皮膚炎患者において特異的に発現レベルが変化している遺伝子である。

また本発明において、乾癬の指標とすることができる遺伝子を、乾癬指標遺伝子という。また乾癬指標遺伝子がコードするアミノ酸配列からなる蛋白質を乾癬指標蛋白質という。乾癬指標遺伝子は特に断らない限り、ｉ）−ｉｖ）に記載された遺伝子から選択されたいずれか１つまたは複数の任意の遺伝子を示す用語として用いられる。更に、以降、特に疾患を特定せず、単に指標遺伝子または指標蛋白質と記載するときは、前記ＡＤ指標遺伝子（およびＡＤ指標蛋白質）と前記乾癬指標遺伝子（乾癬指標蛋白質）の両方を含む用語として用いる。
本発明の乾癬指標遺伝子において、次に示す遺伝子群から選択された遺伝子は、前記ｉ）群またはｉｉ）群の遺伝子として好ましい。これらの遺伝子は、乾癬患者の皮疹部における発現レベルが乾癬患者の無疹部に比べて高い−ｉ）群−、または低い−ｉｉ）群−乾癬指標遺伝子群に含まれ、かつアトピー性皮膚炎患者の皮疹部と無疹部の比較においては発現レベルに有意な差が見られなかった遺伝子である。これらの乾癬指標遺伝子は、乾癬患者において特異的に発現レベルが変化している遺伝子である。

一方、本発明の乾癬指標遺伝子において、次に示す遺伝子群から選択された遺伝子は、前記ｉｉｉ）群またはｉｖ）群の遺伝子として好ましい。これらの遺伝子は、乾癬患者の無疹部における発現レベルが健常者に比べて高い−ｉｉｉ）群−、または低い−ｉｖ）群−乾癬指標遺伝子群に含まれ、かつアトピー性皮膚炎患者の無疹部と健常者の比較においては発現レベルに有意な差が見られなかった遺伝子である。これらの乾癬指標遺伝子も、乾癬患者において特異的に発現レベルが変化している遺伝子である。

本発明における指標遺伝子の塩基配列の一部はＥＳＴとして公知である。本発明における指標遺伝子の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が明らかにされているものもある。指標遺伝子の部分塩基配列データを得るためのＧｅｎＢａｎｋ登録番号を、指標遺伝子の名前とともに後にまとめた。
当業者はこれらの部分塩基配列情報に基づいて、指標遺伝子の全長塩基配列を明らかにすることができる。全長塩基配列は、たとえばｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングによって取得することができる。すなわち、公共データベースに集積されている膨大なＥＳＴ情報を対象として、指標遺伝子の一部を構成するＥＳＴの塩基配列（クエリー配列）を照合する。照合の結果に基づいて、クエリー配列と一定の長さに渡って塩基配列が一致する他のＥＳＴ情報を取得する。得られたほかのＥＳＴ情報を新たなクエリー配列として、更に他のＥＳＴ情報の取得を繰り返す。この操作の繰り返しによって、部分的な塩基配列を共有する複数のＥＳＴのセットを得ることができる。ＥＳＴのセットはクラスターと呼ばれる。クラスターを構成するＥＳＴの塩基配列を重ね合わせて一つの塩基配列に統合することにより、目的とする遺伝子の塩基配列を明らかにすることができる。
更に当業者は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングによって決定された塩基配列に基づいて、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを使ったＲＴ−ＰＣＲによって、設計どおりの長さを有する遺伝子断片が増幅されることを確認すれば、決定された塩基配列からなる遺伝子が実際に存在することを裏付けることができる。
あるいは、ノーザンブロッティングによって、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングの結果を評価することもできる。決定された塩基配列情報に基づいてデザインされたプローブを使ってノーザンブロッティングを行う。その結果、上記塩基配列情報と一致するバンドが検出できれば、決定された塩基配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏクローニングの他、実験的に目的とする遺伝子を単離することもできる。まず、ＥＳＴとして登録されている塩基配列情報を与えたｃＤＮＡクローンを入手し、そのクローンが有するｃＤＮＡの塩基配列の全てを決定する。その結果、ｃＤＮＡの全長配列を明らかにできる可能性がある。少なくとも、より長い塩基配列を明らかにすることができる。当該クローンが有するｃＤＮＡの長さは、ベクターの構造が明らかであれば予め実験的に確認することもできる。
またＥＳＴの塩基配列情報を与えたクローンが手元に無くとも、部分塩基配列に基づいて、当該遺伝子の塩基配列が未知の部分を取得する方法は公知である。たとえば、ＥＳＴをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、より長い塩基配列を明らかにできる場合がある。ｃＤＮＡライブラリーとして、全長ｃＤＮＡを多く含むライブラリーを用いれば、容易に全長ｃＤＮＡクローンを単離することができる。たとえば、オリゴキャップ法の原理に基づいて合成されたｃＤＮＡライブラリーは、全長ｃＤＮＡを多く含むとされている。
更に、部分的な塩基配列情報に基づいて、遺伝子の塩基配列が未知の領域を合成するための手法が公知である。たとえばＲＡＣＥ法は、未知塩基配列を含む遺伝子の単離のための代表的な手法である。ＲＡＣＥ法においては、ｃＤＮＡの末端に人為的にオリゴヌクレオチドリンカーが連結される。このオリゴヌクレオチドリンカーの塩基配列は予めわかっている。したがって、ＥＳＴとして既に塩基配列が明らかな領域と、オリゴヌクレオチドリンカーの塩基配列情報に基づいて、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。こうしてデザインされたプライマーを使ったＰＣＲによって、塩基配列が未知の領域が特異的に合成される。
本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、被検者の生体試料における各指標遺伝子の発現レベルを測定し、指標遺伝子が上記ａ）またはｂ）に記載された遺伝子である場合には、対照として同じ被検者の無疹部から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルと、また指標遺伝子が上記ｃ）またはｄ）に記載された遺伝子である場合には、対照として健常者の生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程を含む。指標遺伝子が上記ａ）またはｃ）に記載された遺伝子であれば、対照と比較して発現レベルが高い場合に被検者がアトピー性皮膚炎と判定される。また指標遺伝子が上記ｂ）またはｄ）に記載された遺伝子であれば、対照と比較して発現レベルが低い場合に被検者がアトピー性皮膚炎と判定される。
本発明の乾癬の検査方法は、被検者の生体試料における各指標遺伝子の発現レベルを測定し、指標遺伝子が上記ｉ）またはｉｉ）に記載された遺伝子である場合には、対照として同じ被検者の無疹部から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルと、また指標遺伝子が上記ｉｉｉ）またはｉｖ）に記載された遺伝子である場合には、対照として健常者の生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程を含む。指標遺伝子が上記ｉ）またはｉｉｉ）に記載された遺伝子であれば、対照と比較して発現レベルが高い場合に被検者が乾癬と判定される。また指標遺伝子が上記ｉｉ）またはｉｖ）に記載された遺伝子であれば、対照と比較して発現レベルが低い場合に被検者が乾癬と判定される。
発現レベルの比較のためには、通常、たとえば健常者における前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて、標準値が設定される。この標準値をもとに、たとえば±２Ｓ．Ｄ．の範囲が許容範囲とされる。指標遺伝子の測定値に基づいて、標準値や許容範囲を設定する手法は公知である。あるいは、同一患者の無疹部との発現レベルの比較においては、予め無疹部における指標遺伝子の発現レベルを測定して、その患者における無疹部の標準値を決定することができる。標準値を設定した後には、皮疹部の発現レベルのみを測定し、予め決定されたその患者の無疹部の標準値との比較に基づいて、本発明の検査方法を実施することもできる。
被検者における指標遺伝子が上記ａ）またはｃ）に記載された遺伝子である場合には、対照と比較して発現レベルが許容範囲よりも高ければ、被検者はアトピー性皮膚炎であると判定される。同様に、被検者における指標遺伝子が上記ｂ）またはｄ）に記載された遺伝子である場合には、対照と比較して発現レベルが許容範囲よりも低ければ、被検者はアトピー性皮膚炎であると判定される。指標遺伝子の発現レベルが許容範囲内であれば、アトピー性皮膚炎である可能性は低いと予想される。
被検者における指標遺伝子が上記ｉ）またはｉｉｉ）に記載された遺伝子である場合には、対照と比較して発現レベルが許容範囲よりも高ければ、被検者は乾癬であると判定される。同様に、被検者における指標遺伝子が上記ｉｉ）またはｉｖ）に記載された遺伝子である場合には、対照と比較して発現レベルが許容範囲よりも低ければ、被検者は乾癬であると判定される。指標遺伝子の発現レベルが許容範囲内であれば、乾癬である可能性は低いと予想される。
本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、該指標遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。従って本発明によるアトピー性皮膚炎の検査方法は、指標遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは該指標遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明におけるアトピー性皮膚炎または乾癬の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、例えばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の指標遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーは、指標遺伝子の塩基配列に基づいてデザインすることができる。指標遺伝子の塩基配列、および該指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の一部は公知である。本発明の各指標遺伝子の公知の塩基配列のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号は、下記データ１、データ２、データ５、およびデータ６（ヒト）、並びにデータ３、データ４、データ１１、およびデータ１２（マウス）に記載したとおりである。あるいは本発明による乾癬の検査方法における乾癬指標遺伝子の塩基配列、および該指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の一部は公知である。本発明の各指標遺伝子の公知の塩基配列のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号は、下記データ７〜データ１０（ヒト）に記載したとおりである。また本発明の指標遺伝子の一部については、その塩基配列と塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を以下の配列番号に示した。また、明らかにされた部分塩基配列情報に基づいて、遺伝子の全長塩基配列を取得することが可能であることも既に述べた。
なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配列が異なる遺伝子であっても、指標遺伝子と同様の活性を持ち、アトピー性皮膚炎に関与する遺伝子は、いずれも本発明の指標遺伝子に含まれる。
また、本発明において、指標遺伝子は、ヒトのみならず、他種におけるホモログも含む。従って、ヒト以外の種における指標遺伝子とは、特に断らないときには、その種に固有の指標遺伝子のホモログ、あるいはその個体に導入されている外来性の指標遺伝子を言う。
本発明においてヒト指標遺伝子のホモログとは、ヒト指標遺伝子をプローブとしてストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、ヒト以外の種に由来する遺伝子を言う。ストリンジェントな条件とは、一般的には以下のような条件を示すことができる。すなわち、４×ＳＳＣ、６５℃でハイブリダイゼーションさせ、０．１×ＳＳＣを用いて６５℃で１時間洗浄する。ストリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーションや洗浄の温度条件は、融解温度（Ｔｍ）に応じて調整することができる。Ｔｍはハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、ハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度、ホルムアミドやドデシル硫酸ナトリウム濃度）によって変動する。従って、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を実験または経験的に設定することができる。
プライマーあるいはプローブには、指標遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，Ｚｉｎｎ Ｋ，Ｇｒｅｅｎ ＭＲ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
ハイブリダイゼーション技術を利用したアトピー性皮膚炎の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の指標遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いることができる。
また本発明のアトピー性皮膚炎または乾癬の検査方法は、指標遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。このような検査方法としては、例えば、各指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
この検出に用いる指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば指標遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患または乾癬の検査を行うこともできる。指標蛋白質の活性とは、該蛋白質が備える生物学的な活性を言う。以下に各蛋白質の有する活性を測定するための一般的な方法を記載する。
［プロテアーゼ］
プロテアーゼサンプルをゼラチンなどの基質を共重合させたＳＤＳポリアクリルアミドゲルで非還元条件下に電気泳動を行い、泳動後に至適緩衝液中で３７℃、１６時間静置する。１６時間後にクマシーブリリアントブルーＲ２５０でゲルを染色し、プロテアーゼの泳動位置が染色されないこと、すなわちゼラチンが分解されていることでプロテアーゼ活性を評価できる。
Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｍ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，５１１３−５１２１（１９９１）
［プロテアーゼインヒビター］
プロテアーゼインヒビターをゼラチンなどのプロテアーゼ基質を共重合させたＳＤＳポリアクリルアミドゲルで非還元条件下に電気泳動を行い、泳動後にプロテアーゼを添加した至適緩衝液中で３７℃、１６時間静置する。１６時間後にクマシーブリリアントブルーＲ２５０でゲルを染色し、プロテアーゼインヒビターの泳動位置が染色されていること、すなわちゼラチンが分解されていないことでプロテアーゼインヒビター活性を評価できる。
Ｇｒｅｅｎｅ ＪらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３０３７５−３０３８０（１９９６）
［転写因子］
転写因子を^３２Ｐなどで標識した転写因子の標的配列を含む２本鎖オリゴＤＮＡと共に室温でインキュベートして結合させる。インキュベート後のサンプルはＳＤＳを含まない未変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、標識したオリゴＤＮＡの移動度を^３２Ｐの放射活性などを指標にして評価する。転写因子にオリゴＤＮＡに対する結合活性があれば、標識したオリゴＤＮＡの移動度が遅くなり、高分子量側にシフトする。標的配列に対する結合特異性は、過剰量の標識をしていない２本鎖オリゴＤＮＡにより転写因子と標識オリゴＤＮＡの結合が阻害されることにより確認できる。
また、転写因子による転写活性化能は、レポーター遺伝子発現ベクターと、転写因子発現ベクターの共形質転換によって、当該転写因子の活性を評価することができる。レポーター遺伝子発現ベクターは、その標的配列の下流にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーター遺伝子を連結した発現ベクターである。一方、活性を評価すべき転写因子は、転写因子遺伝子をヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の応答遺伝子プロモーターなどの下流に連結した転写因子発現ベクターによって発現させることができる。これらのベクターを、ＨｅｌａやＨＥＫ２９３などの細胞株に共遺伝子導入し、４８時間後に細胞破砕液を調製してＣＡＴの発現量を調べることにより転写活性を評価できる。
Ｚｈａｏ ＦらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４０７５５−４０７６０（２００１）
［キナーゼ］
キナーゼをｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎを基質として含む緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２ｍＭ ＭｎＣｌ_２，２ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ａｎｄ ２５μＭ ＡＴＰ）に添加し、更に［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰを添加して３７℃で１０分保温する。１０分後にＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で反応を止め、反応液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動後にゲルを乾燥させてリン酸化されたｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎの放射活性をＸ線フィルムにて検出する。
Ｐａｒｋ ＳＹらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１９７６８−１９７７７（２０００）
［フォスファターゼ］
フォスファターゼをｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰＰ）を基質として含む緩衝液（２５ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ５．５，１．６ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，１０ｍＭ ｐＮＰＰ）に添加し、３７℃で３０分間保温する。３０分後に１Ｎ ＮａＯＨを添加して反応を停止し、ｐＮＰＰの加水分解の結果生じた４０５ｎｍの吸光度を測定する。
Ａｏｙａｍａ ＫらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２７５７５−２７５８３（２００１）
［ケモカイン、ケモカインレセプター］
ケモカインレセプターを強制発現させた細胞を、カルシウム感受性蛍光色素ｆｕｒａ−２を含むＨａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎに懸濁し、ケモカインにより刺激を加える。ケモカイン刺激により引き起こされる細胞内カルシウム濃度の上昇をＬＳ５０Ｂ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）などの蛍光検出器で測定する。
Ｚｈｏｕ ＮらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４２８２６−４２８３３（２００１）
［サイトカイン、サイトカインレセプター］
サイトカインでサイトカインレセプターを発現する細胞を刺激し、これにより引き起こされる細胞増殖をチミジンの取り込みで評価する。
または、サイトカイン刺激によるサイトカインレセプター下流に位置する転写因子の活性化をルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の発現により評価することもできる。
Ｐｉｅｋ ＥらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６，１９９４５−１９９５３（２００１）
［イオンチャンネル］
先端の開口径が数μｍ^２のガラスピペットの先端にイオンチャンネルを含む形質膜を貼り付け、ピペット内外に電位差を与えてその時にチャンネルを通る電流を測定するパッチクランプ法により評価できる。
Ｈａｍｉｌｌ，Ｏ．Ｐ．らＰｆｌｕｅｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．３９１，８５−１００（１９８１）
［細胞接着因子］
細胞表面に接着分子を発現させた細胞をそのリガンドをコートしたプレート上でインキュベートし、接着した細胞数を評価する。
Ｆｕｊｉｗａｒａ ＨらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１７５５０−１７５５８（２００１）
［細胞外マトリックス蛋白質］
細胞外マトリックス蛋白質をコートしたプレートにインテグリンなどの細胞外マトリックス蛋白質に対する受容体を持つ細胞の懸濁液を加え、３７℃で１時間培養する。培養後に細胞を固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２などのＤＮＡ結合性蛍光色素を加えて反応させる。反応後にフルオロメーターを使用して蛍光強度を測定し、蛍光強度として定量化された接着細胞数を細胞外マトリックス蛋白質の活性として評価する。
Ｍｉｙａｚａｋｉ ＫらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，１１７６７（１９９３）
本発明の検査方法においては、被検者の皮膚組織を試料とする。皮膚組織試料の採取は、被検者に多少の痛みを伴う。一方で、皮膚組織は容易に採取できるため、診断材料としては有用である。
皮膚組織を採取する方法は公知である。皮膚組織は、例えば次のようにして採取することができる。すなわち、まず、局所麻酔薬により採取部位を麻酔する。生検個所の周囲の皮膚を引っ張ってたるみの無い状態とした後、パンチを皮膚の中に埋め込み、回転させて標本分の組織をパンチの中に入れる。パンチを引き出し、切り取られたパンチ内の皮膚を回収する。パンチは、中空の皮膚組織採取用の器具である。たとえば直径３ｍｍの皮膚組織の採取が可能な器具が一般に利用されている。
本発明において、皮膚組織とは、解剖学的には表皮および真皮を含む。皮膚組織には、皮膚固有の細胞のみならず、リンパ球、ランゲルハンス細胞、あるいはマスト細胞などの、皮膚組織において見出される皮膚以外の細胞が含まれる場合がある。これらの皮膚細胞とともに採取される細胞も皮膚組織試料に含まれる。
本発明において、皮疹部における指標遺伝子の発現レベルを決定するために、皮疹部の皮膚組織試料が用いられる。皮疹部とは、急性病変を形成している皮膚を言う。たとえば日本皮膚科学会誌１０４：１２１０（１９９４）に報告されている診断基準にしたがって、急性病変部を判定することができる。具体的には、たとえば次のような臨床所見が急性病変部の指標とされている。
急性病変：紅斑、湿潤性紅斑、丘疹、漿液性丘疹、鱗屑、痂皮
また患者の無疹部における指標遺伝子の発現レベルを決定するために、無疹部の皮膚組織試料が用いられる。患者における無疹部とは、上記病変を伴わない部位の皮膚である。更に、健常者の皮膚における指標遺伝子の発現レベルを決定するには、健常者の皮膚組織が用いられる。本発明における健常者とは、診断すべき疾患を有していないことが明らかなヒトを言う。すなわちアレルギー性疾患の検査においてはアレルギー性疾患を有していないヒトが健常者である。同様に、乾癬の検査方法においては乾癬を有していないヒトが健常者である。健常者は、診断すべき疾患以外の疾患を有することが許容される。しかし、好ましい健常者は、アレルギー性疾患および乾癬のいずれをも有していないヒトである。皮膚組織の採取は、患者の皮膚組織の採取と同様の手法によって採取することができる。指標遺伝子の発現レベルの比較においては、できるだけ同じ部位の皮膚を比較するのが望ましい。しかし同一患者の皮疹部／無疹部の比較においては、同じ部位に無疹部の皮膚を見出すのが困難であるケースも予想される。このようなケースでは、異なる部位の皮膚を比較に用いることもできる。
皮膚組織試料の採取は容易であるため、医療現場における簡便な検査が可能である。例えば、実施例に示す方法によって調製することができる。調製された皮膚組織を破壊してライセートとすれば、指標蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。
上記の生体試料からライセートを調製すれば、指標蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、指標遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。生体試料のライセートまたはｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。また指標蛋白質が血中に分泌されていれば、被検者の血液や血清などの体液試料に含まれる目的とする蛋白質の量を測定することによって、それをコードする遺伝子の発現レベルの比較が可能である。上記試料は、必要に応じて緩衝液等で希釈して本発明の方法に使用することができる。
ｍＲＮＡを測定する場合には、本発明における指標遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、上記生体試料における各細胞において、発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。発現レベルが大きく変動しない遺伝子の例としては、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ等を挙げることができる。
更に本発明は、本発明の検査方法のための試薬を提供する。すなわち本発明は、指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アトピー性皮膚炎の検査用試薬に関する。あるいは本発明は、指標蛋白質を認識する抗体からなる、アトピー性皮膚炎の検査用試薬に関する。本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な標識を結合することができる。あるいは本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な支持体に固定化しておくこともできる。また本発明の試薬は、前記オリゴヌクレオチドまたは前記抗体の他に、検査や保存に必要な付加的な要素と組み合せて検査用キットとすることもできる。キットを構成することができる付加的な要素を、以下に示す。これらの要素は、必要に応じて予め混合しておくこともできる。また、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
試薬や生体試料を希釈するための緩衝液
陽性対照
陰性対照
標識を測定するための基質
反応容器
アッセイプロトコルを記載した指示書
本発明におけるＡＤ指標遺伝子は、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部と同一の患者における無疹部、あるいはアトピー性皮膚炎患者の無疹部と健常者との比較において、各皮膚組織において発現量の変動が確認された。従って、ＡＤ指標遺伝子の発現レベルを指標として、アトピー性皮膚炎の検査を行うことができる。
本発明におけるアトピー性皮膚炎の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。アトピー性皮膚炎が疑われる症状を示しながら、一般的な検査ではアトピー性皮膚炎と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えばアトピー性皮膚炎の患者であるか否かを容易に判定することができる。より具体的には、アトピー性皮膚炎が疑われる症状を示す患者において、ＡＤ指標遺伝子がａ）またはｃ）に記載された遺伝子である場合、ＡＤ指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因がアトピー性皮膚炎である可能性が高いことを示している。また、アトピー性皮膚炎が疑われる症状を示す患者において、ＡＤ指標遺伝子がｂ）またはｄ）に記載された遺伝子である場合、ＡＤ指標遺伝子の発現の低下は、その症状の原因が同じくアトピー性皮膚炎である可能性が高いことを示している。
あるいは、アトピー性皮膚炎が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。つまり、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の判定に有用である。また、アトピー性皮膚炎と診断された患者において、ＡＤ指標遺伝子がａ）またはｃ）に記載された遺伝子である場合、ＡＤ指標遺伝子の発現の上昇は、アトピー性皮膚炎がさらに進行している可能性が高いことを示している。また、アトピー性皮膚炎と診断された患者において、ＡＤ指標遺伝子がｂ）またはｄ）に記載された遺伝子である場合、ＡＤ指標遺伝子の発現の低下は、同じくアトピー性皮膚炎がさらに進行している可能性が高いことを示している。
更に、発現レベルの違いに基づいてアトピー性皮膚炎の重症度を判定することもできる。すなわち、ＡＤ指標遺伝子がａ）またはｃ）に記載された遺伝子である場合、ＡＤ指標遺伝子の発現の上昇の程度は、アトピー性皮膚炎の重症度に相関する。あるいはＡＤ指標遺伝子がｂ）またはｄ）に記載された遺伝子である場合、ＡＤ指標遺伝子の発現の低下の程度が、アトピー性皮膚炎の重症度に相関する。
本発明における乾癬指標遺伝子は、乾癬患者の皮疹部と同一の患者における無疹部、あるいは乾癬患者の無疹部と健常者との比較において、各皮膚組織において発現量の変動が確認された。従って、乾癬指標遺伝子の発現レベルを指標として、乾癬の検査を行うことができる。
本発明における乾癬の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。乾癬が疑われる症状を示しながら、一般的な検査では乾癬と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えば乾癬の患者であるか否かを容易に判定することができる。より具体的には、乾癬が疑われる症状を示す患者において、乾癬指標遺伝子がｉ）またはｉｉｉ）に記載された遺伝子である場合、乾癬指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因が乾癬である可能性が高いことを示している。また、乾癬が疑われる症状を示す患者において、乾癬指標遺伝子がｉｉ）またはｉｖ）に記載された遺伝子である場合、乾癬指標遺伝子の発現の低下は、その症状の原因が同じく乾癬である可能性が高いことを示している。
あるいは、乾癬が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。つまり、乾癬に対する治療効果の判定に有用である。また、乾癬と診断された患者において、乾癬指標遺伝子がｉ）またはｉｉｉ）に記載された遺伝子である場合、乾癬指標遺伝子の発現の上昇は、乾癬がさらに進行している可能性が高いことを示している。また、乾癬と診断された患者において、乾癬指標遺伝子がｉｉ）またはｉｖ）に記載された遺伝子である場合、乾癬指標遺伝子の発現の低下は、同じく乾癬がさらに進行している可能性が高いことを示している。
更に、発現レベルの違いに基づいて乾癬の重症度を判定することもできる。すなわち、乾癬指標遺伝子がｉ）またはｉｉｉ）に記載された遺伝子である場合、乾癬指標遺伝子の発現の上昇の程度は、乾癬の重症度に相関する。あるいは乾癬指標遺伝子がｉｉ）またはｉｖ）に記載された遺伝子である場合、乾癬指標遺伝子の発現の低下の程度が、乾癬の重症度に相関する。
また本発明は、ａ）またはｃ）に記載のＡＤ指標遺伝子またはＡＤ指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の、皮膚における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト動物からなるアトピー性皮膚炎モデル動物に関する。
本発明によって、ａ）に記載のＡＤ指標遺伝子の発現強度が、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部において上昇することが明らかとなった。同様に、ｃ）に記載のＡＤ指標遺伝子の発現強度が、アトピー性皮膚炎患者の無疹部において上昇することが明らかとなった。したがって、皮膚において、ａ）またはｃ）に記載のＡＤ指標遺伝子またはＡＤ指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、アトピー性皮膚炎のモデル動物として利用することができる。
また本発明は、ｂ）またはｄ）に記載のＡＤ指標遺伝子またはＡＤ指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の、皮膚における発現強度を低下させたトランスジェニック非ヒト動物からなるアトピー性皮膚炎モデル動物に関する。
本発明によって、ｂ）に記載のＡＤ指標遺伝子の発現強度が、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部において低下することが明らかとなった。同様に、ｄ）に記載のＡＤ指標遺伝子の発現強度が、アトピー性皮膚炎患者の無疹部において低下することが明らかとなった。したがって、皮膚において、ｂ）またはｄ）に記載のＡＤ指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に低下させた動物は、アトピー性皮膚炎のモデル動物として利用することができる。
また本発明は、ｉ）またはｉｉｉ）に記載の乾癬指標遺伝子または乾癬指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の、皮膚における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト動物からなる乾癬モデル動物に関する。
本発明によって、ｉ）に記載の乾癬指標遺伝子の発現強度が、乾癬患者の皮疹部において上昇することが明らかとなった。同様に、ｉｉｉ）に記載の乾癬指標遺伝子の発現強度が、乾癬患者の無疹部において上昇することが明らかとなった。したがって、皮膚において、ｉ）またはｉｉｉ）に記載の乾癬指標遺伝子または乾癬指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、乾癬のモデル動物として利用することができる。
また本発明は、ｉｉ）またはｉｖ）に記載の乾癬指標遺伝子または乾癬指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の、皮膚における発現強度を低下させたトランスジェニック非ヒト動物からなる乾癬モデル動物に関する。
本発明によって、ｉｉ）に記載の乾癬指標遺伝子の発現強度が、乾癬患者の皮疹部において低下することが明らかとなった。同様に、ｉｖ）に記載の乾癬指標遺伝子の発現強度が、乾癬患者の無疹部において低下することが明らかとなった。したがって、皮膚において、ｉｉ）またはｉｖ）に記載の乾癬指標遺伝子または乾癬指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に低下させた動物は、乾癬のモデル動物として利用することができる。
本発明において機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。たとえば前記Ａ）群−Ｄ）群に記載の遺伝子は、マウスにおける機能的に同等な遺伝子である。Ａ）群−Ｄ）群に記載された遺伝子は、本発明に基づくスクリーニングをマウスを用いて実施するときに望ましい指標遺伝子である。
更に本発明は、ａ）−ｄ）に記載のＡＤ指標遺伝子のマウスにおけるカウンターパートを明らかにした。ａ）−ｄ）に記載のＡＤ指標遺伝子に対するマウスカウンターパートは、それぞれＡ）−Ｄ）として記載した。これらのカウンターパートは、感作マウス耳介皮膚と非感作マウス耳介皮膚における遺伝子の発現レベルを比較したときに、２倍以上の差が見られた遺伝子である。
したがって、これらのカウンターパートの発現レベルの調節や、投与によって、アトピー性皮膚炎モデル動物を作り出すことができる。すなわち本発明は、Ａ）−Ｄ）に記載の遺伝子群の発現レベルの調節による、アトピー性皮膚炎モデル動物の製造方法に関する。あるいは本発明は、Ａ）−Ｄ）に記載の遺伝子群によってコードされるタンパク質そのもの、または該タンパク質の抗体を非ヒト動物に投与する工程を含む、アトピー性皮膚炎モデル動物の製造方法に関する。
まず、Ａ）またはＣ）に記載された遺伝子群は、ａ）またはｃ）に記載の遺伝子群と同様に、発現レベルの上昇によってアトピー性皮膚炎を誘導することができる。あるいはこれらの遺伝子群から選択された遺伝子や、その遺伝子がコードするタンパク質の投与によって、アトピー性皮膚炎モデル動物を作り出すことができる。これらのカウンターパートはいずれもマウスの遺伝子であることから、遺伝子やタンパク質を投与する場合には、マウスに投与するのが望ましい。
また、Ｂ）またはＤ）に記載された遺伝子群は、ｂ）またはｄ）に記載の遺伝子群と同様に、発現レベルの抑制によって、アトピー性皮膚炎を誘導することができる。あるいはこれらの遺伝子群から選択された遺伝子の発現や、その遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制することによって、アトピー性皮膚炎を作り出すことができる。発現の抑制には、アンチセンス核酸、あるいはＲＮＡｉを利用することができる。タンパク質の活性の調節には、抗体などの活性阻害物質の投与が有効である。すなわち、Ｂ）またはＤ）に記載の遺伝子群を先天的に有する動物、すなわちマウスに、これらの成分を投与することによってアトピー性皮膚炎が誘導される。
該アトピー性皮膚炎モデル動物は、アトピー性皮膚炎における生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、該アトピー性皮膚炎モデル動物を使用することにより、指標遺伝子のさらなる機能を解明すること、および該遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。
また本発明によるアトピー性皮膚炎モデル動物は、アトピー性皮膚炎のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。たとえば本発明によるアトピー性皮膚炎モデル動物が皮膚炎を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
本発明において、発現レベルの上昇とは、指標遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、あるいは被験動物が本来備えている指標遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。
本発明において、発現レベルの低下とは、被験動物が備える指標遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が阻害されている状態、あるいは翻訳産物である蛋白質の分解が促進された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すようなＤＮＡチップにおけるシグナル強度の差により確認することができる。また翻訳産物である蛋白質の活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
代表的なトランスジェニック動物は、指標遺伝子を導入し強制発現させた動物、または指標遺伝子をノックアウトした動物、他の遺伝子と置換（ノックイン）した動物等を示すことができる。また、指標遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、リボザイムをコードするＤＮＡ、あるいはデコイ核酸として機能するＤＮＡ等を導入したトランスジェニック動物も、本発明におけるトランスジェニック動物として用いることができる。その他、たとえば指標遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強あるいは抑制したり、あるいは分解されにくいあるいは分解されやすいアミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。アミノ酸配列の変異として、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、本発明の指標遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．ＬａｖｉｔｒａｎｏｅｔらＣｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
発現ベクターに使用するプロモーターとして、適当な薬剤等の物質により転写が調節されるプロモーターを用いれば、該物質の投与によってトランスジェニック動物における外来性の指標遺伝子の発現レベルを調整することができる。
本発明のアトピー性皮膚炎または乾癬のモデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
さらに本発明は、アトピー性皮膚炎治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明において、ＡＤ指標遺伝子はａ）〜ｄ）のいずれかに記載の群から選択された遺伝子である。ａ）に記載の群から選択された遺伝子は、アトピー性皮膚炎患者の無疹部に比較して同一の患者の皮疹部において有意に発現レベルが上昇している。ｂ）に記載の群から選択された遺伝子は、アトピー性皮膚炎患者の無疹部に比較して同一の患者の皮疹部において有意に発現レベルが低下している。ｃ）に記載の群から選択された遺伝子は、健常者と比較してアトピー性皮膚炎患者の無疹部において有意に発現レベルが上昇している。そしてｄ）に記載の群から選択された遺伝子は、健常者と比較してアトピー性皮膚炎患者の無疹部において有意に発現レベルが低下している。
したがって、ａ）群あるいはｃ）群のＡＤ指標遺伝子については、前記ＡＤ指標遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、アトピー性皮膚炎の治療薬を得ることができる。一方ｂ）群あるいはｄ）群のＡＤ指標遺伝子については、前記ＡＤ指標遺伝子の発現レベルを上昇させることができる化合物を選択することによって、アトピー性皮膚炎の治療薬を得ることができる。
本発明によるアトピー性皮膚炎治療薬候補化合物のスクリーニング方法において、ＡＤ指標遺伝子として好ましい遺伝子として以下に記載の遺伝子を示すことができる。

これらの遺伝子はいずれも、乾癬患者では発現レベルの変化が見られなかった遺伝子である。つまりアトピー性皮膚炎患者において特異的に発現レベルが変化していた遺伝子と言うことができる。これらのＡＤ指標遺伝子の利用によって、アトピー性皮膚炎症状に特異的な治療効果を評価することができる。
さらに本発明は、乾癬治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明において、乾癬指標遺伝子はｉ）〜ｉｖ）のいずれかに記載の群から選択された遺伝子である。ｉ）に記載の群から選択された遺伝子は、乾癬患者の無疹部に比較して同一の患者の皮疹部において有意に発現レベルが上昇している。ｉｉ）に記載の群から選択された遺伝子は、乾癬患者の無疹部に比較して同一の患者の皮疹部において有意に発現レベルが低下している。ｉｉｉ）に記載の群から選択された遺伝子は、健常者と比較して乾癬患者の無疹部において有意に発現レベルが上昇している。そしてｉｖ）に記載の群から選択された遺伝子は、健常者と比較して乾癬患者の無疹部において有意に発現レベルが低下している。
したがって、ｉ）群あるいはｉｉｉ）群の乾癬指標遺伝子については、前記乾癬指標遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、乾癬の治療薬を得ることができる。一方ｉｉ）群あるいはｉｖ）群の乾癬指標遺伝子については、前記乾癬指標遺伝子の発現レベルを上昇させることができる化合物を選択することによって、乾癬の治療薬を得ることができる。
本発明による乾癬治療薬候補化合物のスクリーニング方法において、乾癬指標遺伝子として好ましい遺伝子として以下に記載の遺伝子を示すことができる。

これらの遺伝子はいずれも、アトピー性皮膚炎患者では発現レベルの変化が見られなかった遺伝子である。つまり乾癬患者において特異的に発現レベルが変化していた遺伝子と言うことができる。これらの乾癬指標遺伝子の利用によって、乾癬の症状に特異的な治療効果を評価することができる。
本発明において遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、およおび蛋白質の活性発現のいずれかのステップに対して促進的に作用する作用を持つ化合物である。また本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、これらのステップのいずれかに対して阻害的に作用する作用を持つ化合物である。
本発明のアレルギー性疾患（または乾癬）治療候補化合物のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで行うこともｉｎ ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、例えば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、
（２）前記被検動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子としては、上記ａ）〜ｄ）のいずれか（乾癬についてはｉ）−ｉｖ）のいずれか）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子と機能的に同等な遺伝子を利用することができる。本発明において機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、例えばアトピー性皮膚炎モデル動物を利用することができる。アトピー性皮膚炎モデル動物は公知である。たとえば人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このマウスの耳介にダニ抗原（５μｇ／耳）を２−３日間隔で計８回投与すると、２週間以降にはヒトのアトピー性皮膚炎に酷似した症状を誘発することができる。この系に候補化合物を投与し、本発明の指標遺伝子の発現レベルの変化を追跡することによって本発明によるスクリーニングを実施することができる。
このようにして被験動物に薬剤候補化合物を接触させ、被験動物由来の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を評価することができる。被験動物の由来の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同様の手法によってモニターすることができる。更にこの評価の結果に基づいて、指標遺伝子がａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）に記載の遺伝子である場合には発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を、指標遺伝子がｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）に記載の遺伝子である場合には発現レベルを上昇させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
より具体的には、被験動物から、皮膚組織試料を採取し、指標遺伝子の発現レベルを候補化合物を接触させない対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。皮膚組織試料の採取方法、および調製方法は公知である。
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
指標遺伝子がａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）に記載の遺伝子である場合：
・指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の抑制
・指標遺伝子の転写活性の抑制
・指標遺伝子の転写産物の安定化阻害もしくは分解の促進等
指標遺伝子がｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）に記載の遺伝子である場合：
・指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の活性化、
・指標遺伝子の転写活性の促進、
・指標遺伝子の転写産物の安定化や分解の阻害等
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、指標遺伝子がａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）に記載の遺伝子である場合には発現レベルを低下させる化合物を、指標遺伝子がｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）に記載の遺伝子である場合には発現レベルを上昇させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、例えば以下のような工程に従って実施することができる。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）に記載の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）に記載の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
本発明において、指標遺伝子を発現する細胞は、指標遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、本発明の指標遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法においては、指標遺伝子を発現する細胞として、皮膚細胞に加えて、ランゲルハンス細胞、マスト細胞、Ｔ細胞、好酸球、Ｂ細胞、好中球、あるいは好塩基球等の皮膚組織に見出される細胞を用いることができる。
ヒト表皮角化細胞（ケラチノサイト）の初代培養細胞ＮＨＥＫ（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）に対してＴＧＦ−βあるいはｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｅにより刺激を加えることにより分化を誘導することができるという報告がある（例えばＧｅｎｇ Ｗａｎｇら、ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＣＥＬＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １９８，２７−３０（１９９２））。分化に伴いｃｏｒｎｉｆｉｅｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ（ＣＥ）という細胞内構造物が形成される。ＣＥの形成あるいはＣＥ構成分子（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ，ｌｏｒｉｃｒｉｎなど）の遺伝子発現を指標として分化を確認することができる。こうして分化した細胞は、本発明におけるスクリーニングに有用である。
皮膚組織に見出される細胞として、皮膚細胞、Ｔ細胞、好酸球、マスト細胞、好塩基球、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞、好中球を利用することもできる。株化皮膚細胞は、均質な細胞を大量に入手できること、培養が容易なことなどの点で、本発明のスクリーニング方法に好適である。以下に本発明に利用できる皮膚細胞株の例を示す。
−株化皮膚細胞：ＨａＣａＴ，Ａ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５５）
−株化Ｔ細胞：Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２），Ｍｏｌｔ−４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８２），Ｈ９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１７６）
−株化好酸球：ＡＭＬ１４．３Ｄ１０
−株化マスト細胞：ＨＭＣ−１
−株化好塩基球：ＫＵ−８１２
−株化Ｂ細胞：ＤＮＤ３９，Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８６）
−（株化）ランゲルハンス細胞：ＭＵＴＺ−３
−（株化）好中球：ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）
株化にカッコをつけたものは、使用に先だって上記株化細胞から分化させる。ランゲルハンス細胞（Ａｌｌａｎ Ｊ．ＭａｓｔｅｒｓｏｎらＢｌｏｏｄ ２００２ Ｊｕｌ １５；１００（２）：７０１−３）、あるいは好中球（Ｓａｎｔｏｓ−Ｂｅｎｅｉｔ ＡＭらＪ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ２０００ Ｍａｙ；６７（５）：７１２−２４）の分化は公知である。
スクリーニングの方法は、まず前記株化皮膚細胞に候補化合物を接触させる。その後、該株化皮膚細胞における指標遺伝子の発現レベルを測定し、候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）に記載の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）に記載の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する。
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、該遺伝子がコードする蛋白質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルを比較するためには、蛋白質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡや蛋白質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
すなわち本発明は、次の工程を含む、アトピー性皮膚炎または乾癬の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、ａ）〜ｄ）のいずれか（乾癬の場合はｉ）−ｉｖ）のいずれか）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）に記載の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）に記載の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。
またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
あるいは本発明における各指標遺伝子の転写調節領域を、次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示したｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、本発明で開示したｃＤＮＡの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）に記載の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）に記載の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択することにより本発明のスクリーニングを行うことができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アトピー性皮膚炎または乾癬の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がａ）〜ｄ）のいずれか（乾癬の場合はｉ）−ｉｖ）のいずれか）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）に記載の指標遺伝子については前記活性を低下させる化合物を、またｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）に記載の指標遺伝子については前記活性を上昇させる化合物を選択する工程
本発明における指標蛋白質が有する活性を指標として、ａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）に記載の指標遺伝子については、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、ａ）群またはｃ）群（乾癬の場合はｉ）群またはｉｉｉ）群）に記載の各指標遺伝子の働きを抑制する。その結果、皮膚において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、アトピー性皮膚炎（または乾癬）を制御することができる。
またｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）に記載の指標遺伝子については、その活性を促進する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、ｂ）群またはｄ）群（乾癬の場合はｉｉ）群またはｉｖ）群）に記載の指標遺伝子の働きを促進する。その結果、皮膚において発現が阻害された指標蛋白質の促進を通じて、アトピー性皮膚炎（または乾癬）を制御することができる。
これらスクリーニングに用いる被験候補物質としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アトピー性皮膚炎の治療薬として有用である。あるいは、ａ）およびｃ）に記載のいずれかのＡＤ指標遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡも、アトピー性皮膚炎の治療薬として有用である。
さらに、ａ）またはｃ）に記載されたいずれかのＡＤ指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体も、アトピー性皮膚炎の治療薬として有用である。ａ）またはｃ）に記載されたＡＤ指標遺伝子は、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部において発現が上昇する遺伝子である。したがってこれらの遺伝子の発現、あるいはこれら遺伝子によってコードされる蛋白質の機能を抑制することによって、アトピー性皮膚炎の治療効果を期待することができる。
加えてｂ）またはｄ）に記載されたいずれかのＡＤ指標遺伝子、並びに該遺伝子によってコードされる蛋白質そのものも、アトピー性皮膚炎の治療薬として有用である。
また本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、乾癬の治療薬として有用である。あるいは、ｉ）およびｉｉｉ）に記載のいずれかの乾癬指標遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡも、乾癬の治療薬として有用である。
さらに、ｉ）またはｉｉｉ）に記載されたいずれかの乾癬指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体も、乾癬の治療薬として有用である。ｉ）またはｉｉｉ）に記載された指標遺伝子は、乾癬患者の皮疹部において発現が上昇する遺伝子である。したがってこれらの遺伝子の発現、あるいはこれら遺伝子によってコードされる蛋白質の機能を抑制することによって、乾癬の治療効果を期待することができる。
加えてｉｉ）またはｉｖ）に記載されたいずれかの乾癬指標遺伝子、並びに該遺伝子によってコードされる蛋白質そのものも、乾癬の治療薬として有用である。
本発明のアレルギー性疾患または乾癬の治療薬は、スクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患または乾癬の治療剤は、アレルギー症状または乾癬の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
あるいはアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをアレルギー疾患患者の単核球細胞へ導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンスを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成することができる。単核球細胞への発現ベクターの導入としては、ｉｎ ｖｉｖｏ、あるいはｅｘ ｖｉｖｏで行う方法が公知である。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
また本発明は、ａ）群〜ｄ）群のいずれかから選択された少なくとも１種類のＡＤ指標遺伝子を測定するためのプローブを固定したアトピー性皮膚炎の診断用ＤＮＡチップを提供する。あるいは本発明は、ｉ）群〜ｉｖ）群のいずれかから選択された少なくとも１種類の乾癬指標遺伝子を測定するためのプローブを固定した乾癬の診断用ＤＮＡチップを提供する。
測定すべき指標遺伝子の種類は任意である。指標遺伝子の数が多いほど、多くの指標に基づく判断が可能となる。一般に、より多くの指標を測定する方が、診断の確度は高まる。また、複数の指標遺伝子を測定する場合には、性質の異なった遺伝子を選択するのが有利である。発現レベルの変動のメカニズム、あるいは遺伝子によってコードされる蛋白質の機能などが異なると考えられる遺伝子は、相互に性質の異なる遺伝子と言うことができる。更に、ａ）−ｄ）に記載されたＡＤ指標遺伝子とｉ）−ｉｖ）に記載された乾癬指標遺伝子とを測定対象とすることによって、アトピー性皮膚炎と乾癬の両方を同一のＤＮＡチップによって検査することもできる。
指標遺伝子の組み合せの例として、次のような例を示すことができる。次に示すような指標遺伝子の組み合せは、アレルギーの検査の精度の向上に貢献する。
［プロテアーゼとプロテアーゼインヒビターで構成される群に含まれる指標遺伝子から選択された２以上の遺伝子］
プロテアーゼとプロテアーゼインヒビターとは、組織の崩壊と構築のバランスの指標となる。すなわち、本発明における指標遺伝子のうち、プロテアーゼ群に含まれる遺伝子と、プロテアーゼインヒビターに含まれる遺伝子から選択された遣伝子について、その遺伝子検出用のプローブを集積して、アトピー性皮膚炎検査用チップとすることができる。各群に含まれる指標遺伝子は、明細書の最後に示した指標遺伝子のリストから見出すことができる。例えば、ＭＭＰ−３（Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３）とＴＩＭＰ−１（Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＭＭＰ−１）の不均衡により皮疹が慢性化するような報告もあることから、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビターの組み合せはアレルギー性疾患の指標遺伝子の組み合せとして意義がある。
［サイトカイン、サイトカインレセプター、ケモカイン、ケモカインレセプター、ＣＤ抗原、抗体、および抗体レセプターで構成される群に含まれる指標遺伝子から選択された２以上の遺伝子］
これらの組み合せは、いずれも相互にリガンドとレセプターの関係にある物質の組み合せである。免疫応答は、これらの物質間の相互作用の結果と見ることもできる。したがって、これらの指標遺伝子を組み合せることによって、皮膚組織が免疫学的にどのような状態にあるかを判断できる可能性がある。指標遺伝子としては、リガンドとレセプターの関係にある分子の両方を選択しても良いし、本発明における指標遺伝子としていずれか一方しか示されていない場合には、いずれか一方のみを指標遺伝子として選択することもできる。
［サイトカイン、細胞外マトリックス蛋白質、細胞骨格系の蛋白、細胞間接着分子、および転写因子で構成される群に含まれる指標遺伝子から選択された２以上の遺伝子］
細胞外マトリックス蛋白質としてはコラーゲンなどを示すことができる。細胞骨格系の蛋白は、ケラチン、ｓｍａｌｌ ｐｒｏｌｉｎ ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎなどを含む。また、細胞間接着分子には、カドヘリン、デスモコリンなどが含まれる。そして、転写因子としては、ｊｕｎ、ｆｏｓ、あるいはｍｙｃを示すことができる。これらの指標遺伝子の発現レベルを観察することによって、皮膚組織の分化、炎症部位の再構築（修復）の度合を評価できる可能性がある。
［酵素に含まれる指標遺伝子から選択された２以上の遺伝子］
酵素に含まれる指標遺伝子を選択することによって、皮膚細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅやｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）でどのような代謝が行われているかを知ることができる。例えば、脂質メディエーターやバリア機能を支える脂質分子の代謝については脂質代謝酵素の発現レベルから判断することができる。脂質代謝酵素には、たとえばｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２、ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ Ｄ２ ｓｙｎｔｈａｓｅ、あるいはＦａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ１，２などが含まれる。
あるいは、より精度の高い検査を実現するために、ａ）群およびｂ）群を構成する遺伝子から選択された任意の複数の遺伝子の組み合せについて、選択された遺伝子を検出することができるプローブを集積したアトピー性皮膚炎検査用チップは有効である。具体的には、ａ）群から通常１０以上、たとえば３０以上、好ましくは５０以上、より好ましくは６０以上、更に好ましくは８０以上、あるいは１００以上の遺伝子を選択することができる。一方ｂ）群からは、通常１０以上、たとえば３０以上、好ましくは５０以上、より好ましくは６０以上、更に好ましくは８０以上の遺伝子を選択することができる。
同様に、より精度の高い検査を実現するために、ｃ）群またはｄ）群を構成する遺伝子から選択された任意の複数の遺伝子の組み合せについて、選択された遺伝子を検出することができるプローブを集積したアトピー性皮膚炎検査用チップは有効である。具体的には、ｃ）群から通常１０以上、たとえば３０以上、好ましくは５０以上、より好ましくは６０以上、更に好ましくは８０以上の遺伝子を選択することができる。一方ｄ）群からは、通常１０以上、たとえば３０以上、好ましくは５０以上、より好ましくは６０以上、更に好ましくは７０以上の遺伝子を選択することができる。
また、ａ）群から選択された遺伝子とｃ）群から選択された遺伝子の組み合せからなるアトピー性皮膚炎検査用チップも、検査精度を高めるために有効である。同様に、ｂ）群から選択された遺伝子とｄ）群から選択された遺伝子の組み合せからなるアトピー性皮膚炎検査用チップも、検査精度を高めるために有効である。乾癬診断用ＤＮＡチップにおいてもＡＤ診断用ＤＮＡチップと同様にして複数の指標遺伝子を組み合わせることができる。
更に前記ｉ）〜ｉｖ）に記載された乾癬指標遺伝子を組み合わせることによって、本発明による乾癬検査用チップを得ることができる。乾癬指標遺伝子は、前記のアトピー性皮膚炎検査用チップと同様にして組み合わせることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。This invention is made | formed in view of such a condition, The objective is to provide the new parameter | index which enables the test | inspection of atopic dermatitis. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for examining atopic dermatitis based on the index and a screening method for candidate compounds for treating atopic dermatitis.
The present inventors have intensively studied to solve the above problems. That is, the genes that have a difference in expression level between the non-eruption part in the same patient as the eruption part of the patient with atopic dermatitis, and the non-eruption part of the patient with atopic dermatitis and the skin of a healthy person, By clarifying the relationship with the atopic dermatitis reaction, we thought that we could find a new target for the treatment of atopic dermatitis.
Based on this idea, the present inventors expressed the rash area in the same patient as the rash area of the patient with atopic dermatitis, and the rash area of the patient with atopic dermatitis and the skin of the healthy person. We searched for genes with different states. The skin tissue of the subject was selected as the biological sample for comparing the gene expression state. The skin tissue specimen that is actually inflamed is infiltrated with many lymphocytes that are important for pathogenesis, and gene expression analysis in the skin local area may lead to the elucidation of the pathology of atopic dermatitis.
The present inventors compared the expression profiles of genes that are expressed in the non-eruption part of the same patient as the eruption part of the patient with atopic dermatitis and in the skin of a healthy person, using a gene chip. Genes with expression fluctuations of 2 times or more were selected, and the gene expression level was measured. And it confirmed that the expression of the indicator gene selected from the group as described in any of the following a)-d) was fluctuating. Furthermore, the present inventors analyzed the expression level in the mouse dermatitis model of the mouse counterparts of these indicator genes, and described them as any one of the groups A) to D) as indicator genes related to mouse dermatitis. The indicator genes were selected.
A part of the base sequence of each indicator gene described in any one of a) to d) is known as EST. A part of the base sequence of each indicator gene described in any of A) to D) is known as EST. The function of the protein encoded by each indicator gene of a) to d) is described in the papers shown in the Reference section of Data 1, Data 2, Data 5, and Data 6 described later. The function of the protein encoded by each index gene of A) to D) is described in the papers shown in the Reference section of Data 3, Data 4, Data 11, and Data 12. Some of the fragment sequences shown in these papers have been reported for direct association with atopic dermatitis, but many fragment sequences have not been reported to be associated with allergic diseases. In addition, there is no report on the fragment sequences that have been reported to be associated with atopic dermatitis in terms of combinations with other genes that co-variate at the same timing. Similarly, it has not been reported that the index gene for psoriasis is useful as an index for testing or screening for therapeutic agents.
The fact that fluctuations in the expression level of the indicator gene were observed between the rash area in the same patient as the rash area of the patient with atopic dermatitis, and between the rash area of the patient with atopic dermatitis and the healthy person, It represents a deep association between the indicator gene of the present invention and atopic skin inflammation. In addition, there is a difference in the expression level of the counterpart of the above-mentioned indicator gene in the auricle skin of the mite allergen-sensitized mouse and the ear skin of the mite-allergen non-sensitized mouse. Corroborates the connection with skin irritation symptoms.
Furthermore, the present inventors tried to compare each gene thus selected with the expression level in patients with psoriasis. As a result, a group of genes whose expression levels were specifically changed in atopic dermatitis patients and psoriasis patients, and a group of genes whose expression levels were commonly changed in both patients were clarified. A gene group in which a change unique to each disease can be expected to be useful as a diagnostic index specific to each disease and a target gene of a treatment method. On the other hand, a group of genes whose expression levels commonly change in both diseases can be expected to be useful as a diagnostic index common to skin inflammatory diseases and a target gene of a treatment method.
Based on the above findings, the present inventors use the expression level of each indicator gene or the activity of the protein encoded by each indicator gene as an indicator to diagnose atopic dermatitis or psoriasis, and the disease The present inventors have found that it is possible to screen for therapeutic agents for the present invention.
That is, the present invention relates to the following methods for examining atopic dermatitis and methods for screening candidate compounds for therapeutic agents for atopic dermatitis.
[1] A test method for atopic dermatitis comprising the following steps (1) to (3), wherein the indicator gene is selected from the group of any one of the following a) to d) The method of being a gene.
(1) A step of measuring the expression level of the indicator gene in a biological sample collected from the rash and / or rash area of the subject
(2) When the expression level measured in step (1) is the gene described in a) or b), the biological sample collected from the non-eruption part of the same subject as the control The expression level of the indicator gene in, and when the indicator gene is the gene described in c) or d), the step of comparing with the expression level of the indicator gene in a biological sample of a healthy person as a control, and
(3) As a result of the comparison in step (2), when the indicator gene is the gene described in a) or c), the expression level is higher than that of the control, and the indicator gene is b) or d). In the case of the gene described in the above, the step of determining that the subject has atopic dermatitis when the expression level is low compared to the control

[10] The testing method according to [1], wherein the gene expression level is measured by PCR of cDNA.
[11] The test method according to [1], wherein the expression level of the gene is measured by detecting a protein encoded by the indicator gene.
[12] A reagent for testing atopic dermatitis comprising a polynucleotide comprising a base sequence of an indicator gene, or an oligonucleotide having a length of at least 15 bases having a base sequence complementary to its complementary strand, A reagent for testing atopic dermatitis, wherein the gene is any gene selected from the group according to any one of a) to d) in [1].
[13] An atopic dermatitis test reagent comprising an antibody that recognizes a protein encoded by an indicator gene, wherein the indicator gene is selected from the group according to any one of a) to d) in [1] A reagent for testing atopic dermatitis, which is one of the genes mentioned above.
[14] A screening method for a therapeutic drug for atopic dermatitis, comprising the following steps, wherein any gene selected from the group according to any one of a) to d) in [1] A screening method.
(1) contacting the candidate compound with a cell expressing the indicator gene;
(2) measuring the expression level of the gene;
(3) Compared with a control not contacted with a candidate compound, the indicator gene of group a) or c) is a compound that decreases the expression level of the gene, and the indicator gene of group b) or d) is Selecting a compound that increases the expression level of the gene
[15] The method according to [14], wherein the cell is a established skin cell.
[16] Atopic dermatitis comprising a polynucleotide comprising a base sequence of an indicator gene, or an oligonucleotide having a base sequence complementary to its complementary strand and a length of at least 15 bases, and a cell expressing the indicator gene A kit for screening a therapeutic agent complement compound of any one of the above, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of a) to d) in [1].
[17] A kit for screening a candidate drug for the treatment of atopic dermatitis, comprising an antibody that recognizes a protein encoded by the indicator gene and a cell that expresses the indicator gene, wherein the indicator gene is [1] The kit which is any gene selected from the group in any one of a) -d).
[18] An atopic dermatitis model animal comprising a transgenic non-human vertebrate having an increased expression intensity in the skin of an indicator gene or a gene functionally equivalent to the indicator gene, wherein the indicator gene is a in [1] ) Or c), and a model animal that is any gene selected from the group described in A) or C) below.

[19] The model animal according to [18], wherein the non-human vertebrate is a mouse.
[20] An atopic dermatitis model animal comprising a transgenic non-human vertebrate having a reduced expression intensity in the skin of an indicator gene or a gene functionally equivalent to the indicator gene, wherein the indicator gene is b in [1] ) Or d), and a model animal that is any gene selected from the group described in B) or D) below.

D) An indicator gene group consisting of the following genes, whose expression level in the auricular skin of DNFB repeated application contact dermatitis model mice is lower than that of the mouse auricular skin before DNFB repeated application: period homolog 3 (AI019779), And glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondral (U11680)
[21] The model animal according to [20], wherein the non-human vertebrate is a mouse.
[22] A method for producing an atopic dermatitis model animal, comprising a step of administering the following component 1) -4) to a mouse.
1) A polynucleotide comprising a base sequence constituting any gene selected from the gene group described in A) and C) in [18],
2) A protein encoded by a polynucleotide comprising a base sequence constituting any gene selected from the gene group described in A) and C) in [18]
3) Antisense or RNAi of a polynucleotide comprising a base sequence constituting any gene selected from the gene group described in B) and D) in [20]
4) An antibody that binds to a protein encoded by a polynucleotide comprising a base sequence constituting any gene selected from the gene group described in B) and D) in [20], or an antigen-binding region thereof fragment
[23] An inducer for inducing atopic dermatitis in a mouse, comprising as an active ingredient the component according to any one of 1) to 4) in [22].
[24] A screening method for a therapeutic drug for atopic dermatitis comprising the following steps, wherein the indicator gene is any one of a) to d) in [1], and A) and C) in [18], And a screening method which is a gene functionally equivalent to any gene selected from the group described in B) and D) in [20] or an indicator gene.
(1) a step of administering a candidate compound to a test animal;
(2) measuring the expression intensity of the indicator gene in the biological sample of the test animal,
(3) Compared with a control not contacted with a candidate compound, the index gene of the a) group, c) group, A) group, and C) group is a compound that decreases the expression level of the gene, and b) group , D) group, B) group, and D) group, the step of selecting a compound that increases the expression level of the gene.
[25] A screening method for a therapeutic drug for atopic dermatitis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of a) to d) in [1] Or a screening method that is a functionally equivalent gene to an indicator gene.
(1) contacting a candidate compound with a cell into which a vector containing a transcriptional regulatory region of a marker gene and a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region is introduced;
(2) measuring the activity of the reporter gene, and
(3) Compared with a control not contacted with a candidate compound, a compound that decreases the expression level of the reporter gene for the indicator gene of group a) or c), and a marker gene of group b) or d) Selecting a compound that increases the expression level of the reporter gene,
[26] A screening method for a therapeutic drug for atopic dermatitis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of a) to d) in [1] Or a screening method that is a functionally equivalent gene to an indicator gene.
(1) contacting a protein encoded by an indicator gene with a candidate compound;
(2) measuring the activity of the protein; and
(3) Compared with a control in which no candidate compound is contacted, the compound that decreases the activity for the indicator gene of group a) or c), and the activity for the indicator gene of group b) or d) The step of selecting the compound to be raised
[27] A therapeutic agent for atopic dermatitis comprising a compound obtainable by the screening method according to any one of [14], [24], [25] and [26] as an active ingredient.
[28] A therapeutic agent for atopic dermatitis comprising an indicator gene, or a part of its antisense DNA as an active ingredient, wherein the indicator gene is from the group according to any one of a) or c) in [1] A therapeutic agent that is one of the selected genes.
[29] A therapeutic agent for atopic dermatitis comprising an antibody that recognizes a protein encoded by an indicator gene as an active ingredient, wherein the indicator gene is the group according to any one of a) or c) in [1] A therapeutic agent that is any gene selected from.
[30] A therapeutic agent for atopic dermatitis comprising, as an active ingredient, an indicator gene or a protein encoded by the indicator gene, wherein the indicator gene is selected from the group described in b) or d) in [1] A therapeutic drug that is one of the genes.
[31] A DNA chip for diagnosis of atopic dermatitis in which a probe for measuring an indicator gene is immobilized, wherein the indicator gene is selected from any one of groups a) to d) described in [1] A DNA chip that is at least one gene.
Or this invention relates to the treatment method of atopic dermatitis including the process of administering the compound which can be obtained by the screening method in any one of [14], [24], [25] and [26]. The present invention also relates to the use of the compound obtainable by the screening method according to any one of [14], [24], [25] and [26] in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating atopic dermatitis. About.
In addition, the present invention relates to a method for treating atopic dermatitis comprising the step of administering the following component (i) or (ii): Alternatively, the present invention relates to the use of the following component (i) or (ii) in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of atopic dermatitis.
(I) the gene described in a) or c) above, or an antisense DNA of a part thereof,
(Ii) an antibody that recognizes a protein encoded by the gene described in a) or c) above
The present invention further relates to a method for treating atopic dermatitis comprising the step of administering the following component (iii) or (iv): Alternatively, the present invention relates to the use of the following component (iii) or (iv) in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of atopic dermatitis.
(Iii) the gene according to b) or d) above,
(Iv) a protein encoded by the gene described in b) or d) above
The present invention also relates to the following methods for examining psoriasis and methods for screening candidate compounds for treating psoriasis.
[32] A method for examining psoriasis, comprising the following steps (1) to (3), wherein the indicator gene is any gene selected from the group described in any of the following i) to iv): There is a way.
(1) A step of measuring the expression level of the indicator gene in a biological sample collected from the rash and / or rash area of the subject
(2) When the expression level measured in step (1) is the gene described in i) or ii), the biological sample collected from the non-rash area of the same subject as a control The expression level of the indicator gene in, and when the indicator gene is the gene described in iii) or iv), the step of comparing with the expression level of the indicator gene in a biological sample of a healthy person as a control, and
(3) As a result of the comparison in (2), when the indicator gene is the gene described in i) or iii), the expression level is higher than that of the control, and the indicator gene is in ii) or iv) Determining that the subject has psoriasis when the expression level is lower in the case of the described gene compared to the control

[41] The testing method according to [32], wherein the gene expression level is measured by PCR of cDNA.
[42] The test method according to [32], wherein the expression level of the gene is measured by detecting a protein encoded by the indicator gene.
[43] A psoriasis test reagent comprising a polynucleotide comprising a base sequence of an indicator gene or an oligonucleotide having a base sequence complementary to its complementary strand and having a length of at least 15 bases, wherein the indicator gene is [ 32], a reagent for examining psoriasis, which is any gene selected from the group according to any one of i) to iv).
[44] A reagent for psoriasis testing comprising an antibody that recognizes a protein encoded by an indicator gene, wherein the indicator gene is selected from the group according to any one of i) to iv) in [32] Reagent for testing psoriasis, which is a gene for
[45] A screening method for a therapeutic agent for psoriasis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of i) to iv) in [32]: Method.
(1) contacting the candidate compound with a cell expressing the indicator gene;
(2) measuring the expression level of the gene;
(3) Compared with a control not contacted with a candidate compound, a compound that decreases the expression level of the gene for an indicator gene of the group i) or iii), and an indicator gene of the group ii) or iv) Selecting a compound that increases the expression level of the gene
[46] The method according to [45], wherein the cells are established skin cells.
[47] A therapeutic agent for psoriasis, comprising a polynucleotide comprising a base sequence of an indicator gene, or an oligonucleotide having a base sequence complementary to its complementary strand and a length of at least 15 bases, and a cell expressing the indicator gene A kit for screening a candidate compound, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of i) to iv) in [32].
[48] A kit for screening a candidate drug for treating psoriasis, comprising an antibody that recognizes a protein encoded by an indicator gene and a cell that expresses the indicator gene, wherein the indicator gene is i) in [32] -Iv) A kit which is any gene selected from the group described in any one of the above.
[49] A psoriasis model animal comprising a transgenic non-human vertebrate having an increased expression intensity in the skin of an indicator gene or a gene functionally equivalent to the indicator gene, wherein the indicator gene is the group i) in [32] and iii) A model animal that is any gene selected from the group described in the group.
[50] The model animal according to [49], wherein the non-human vertebrate is a mouse.
[51] A psoriasis model animal comprising a transgenic non-human vertebrate having reduced expression intensity in the skin of an indicator gene or a gene functionally equivalent to the indicator gene, wherein the indicator gene is ii) group and iv) A model animal that is any gene selected from the group.
[52] The model animal according to [51], wherein the non-human vertebrate is a mouse.
[53] A method for screening a therapeutic agent for psoriasis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of i) to iv) in [32], or the indicator A screening method that is a gene functionally equivalent to a gene.
(1) contacting a candidate compound with a cell into which a vector containing a transcriptional regulatory region of a marker gene and a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region is introduced;
(2) measuring the activity of the reporter gene, and
(3) Compared with a control not contacted with a candidate compound, the compound that decreases the expression level of the reporter gene for the indicator gene of group i) or iii), and the indicator gene of group ii) or iv) Selecting a compound that increases the expression level of the reporter gene,
[54] A screening method for a therapeutic agent for psoriasis, comprising the following step, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of i) to iv) in [32], or the indicator A screening method that is a gene functionally equivalent to a gene.
(1) contacting a protein encoded by an indicator gene with a candidate compound;
(2) measuring the activity of the protein; and
(3) Compared with the control not contacted with the candidate compound, the compound that decreases the activity for the indicator gene of the group i) or iii), and the activity for the indicator gene of the group ii) or iv) The step of selecting the compound to be raised
[55] A therapeutic agent for psoriasis comprising a compound obtainable by the screening method according to any one of [45], [53], and [54] as an active ingredient.
[56] A therapeutic agent for psoriasis comprising, as an active ingredient, an indicator gene, or a part of its antisense DNA, wherein the indicator gene is selected from the group described in either i) or iii) in [32] A therapeutic that is either gene.
[57] A therapeutic agent for psoriasis comprising, as an active ingredient, an antibody that recognizes a protein encoded by the indicator gene, wherein the indicator gene is selected from the group described in either i) or iii) in [32] A therapeutic drug that is one of the genes.
[58] A therapeutic agent for psoriasis comprising, as an active ingredient, an indicator gene or a protein encoded by the indicator gene, wherein the indicator gene is selected from the group described in ii) or iv) in [32] Therapeutic drugs that are genes.
[59] A DNA chip for diagnosing psoriasis to which a probe for measuring an indicator gene is fixed, wherein the indicator gene is selected from any of the groups i) to iv) described in [32] DNA chip that is the gene of
Or this invention relates to the treatment method of psoriasis including the process of administering the compound which can be obtained by the screening method in any one of [45], [53], and [54]. The present invention also relates to the use of the compound obtainable by the screening method according to any of [45], [53] and [54] in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating psoriasis.
In addition, the present invention relates to a method for treating psoriasis, comprising the step of administering the following component (1) or (2). Alternatively, the present invention relates to the use of the following component (1) or (2) in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of psoriasis.
(1) the gene described in i) or iii) above, or an antisense DNA of a part thereof,
(2) An antibody that recognizes a protein encoded by the gene described in i) or iii) above
Furthermore, this invention relates to the treatment method of psoriasis including the process of administering the following component (3) or (4). Alternatively, the present invention relates to the use of the following components (3) or (4) in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of psoriasis.
(3) the gene according to ii) or iv) above,
(4) Protein encoded by the gene described in ii) or iv) above
In the present invention, allergic disease is a general term for diseases involving an allergic reaction. More specifically, it can be defined as an allergen is identified, a profound link is established between exposure to the allergen and the development of the lesion, and an immunological mechanism is demonstrated for the lesion. Here, the immunological mechanism means that white blood cells exhibit an immune response by stimulation of allergen. Examples of allergens include mite antigens and pollen antigens.
Representative allergic diseases can include atopic dermatitis, bronchial asthma, allergic rhinitis, hay fever, insect allergy, and the like. Allergic disease is a genetic factor transmitted from parents with allergic diseases to their children. An allergic disease that develops familially is also called an atopic disease, and a genetically transmitted factor that causes it is atopic predisposition. Atopic dermatitis is a generic name given to diseases associated with skin irritation, among atopic diseases.
In the present invention, a gene that can be used as an index of atopic dermatitis is referred to as an AD index gene. A protein having an amino acid sequence encoded by an AD index gene is referred to as an AD index protein. Unless otherwise specified, the AD index gene is used as a term indicating any one or a plurality of arbitrary genes selected from the genes described in a) to d) and A) to D).
In the AD index gene of the present invention, a gene selected from the following gene group is preferable as the gene of group a) or b). These genes are included in the -a) group- or low-b) group-AD indicator gene group whose expression level in the eruption part of atopic dermatitis patients is higher than that in the non-eruption part of atopic dermatitis patients. In addition, it is a gene for which no significant difference was found in the expression level in the comparison of the rash and non-rash areas of psoriasis patients. These AD index genes are genes whose expression levels are specifically changed in patients with atopic dermatitis.

On the other hand, in the AD index gene of the present invention, a gene selected from the following gene group is preferable as the gene of the group c) or d). These genes are included in -c) group- or low -d) group-AD index gene group, and the expression level in the rash area of atopic dermatitis patients is higher than that in healthy subjects, and there is no psoriasis patient. It is a gene for which no significant difference was found in the expression level in the comparison between the rash and healthy subjects. These AD index genes are also genes whose expression levels are specifically changed in patients with atopic dermatitis.

In the present invention, a gene that can be used as an index of psoriasis is referred to as a psoriasis index gene. A protein consisting of an amino acid sequence encoded by a psoriasis index gene is referred to as a psoriasis index protein. Unless otherwise specified, the psoriasis indicator gene is used as a term indicating any one or a plurality of arbitrary genes selected from the genes described in i) to iv). Further, hereinafter, when a disease is not particularly specified and is simply described as an indicator gene or an indicator protein, it is used as a term including both the AD indicator gene (and AD indicator protein) and the psoriasis indicator gene (psoriasis indicator protein). .
In the psoriasis index gene of the present invention, a gene selected from the following gene group is preferred as the gene of group i) or group ii). These genes are included in the -i) group- or low -ii) group-psoriasis indicator gene group, and the expression level in the rash area of psoriasis patients is higher than that of the non-rash area of psoriasis patients, and atopic dermatitis It is a gene for which no significant difference was observed in the expression level in comparison between the rash and non-rash areas of patients. These psoriasis index genes are genes whose expression levels are specifically changed in psoriasis patients.

On the other hand, in the psoriasis index gene of the present invention, a gene selected from the following gene group is preferable as the gene of group iii) or iv). These genes have higher expression levels in the psoriatic area of psoriasis patients than in healthy individuals-iii) group-or low-iv) group-included in the psoriasis indicator gene group, and those of atopic dermatitis It is a gene for which no significant difference was found in the expression level in the comparison between the rash and healthy subjects. These psoriasis index genes are also genes whose expression levels are specifically changed in psoriasis patients.

A part of the base sequence of the indicator gene in the present invention is known as EST. In some cases, the amino acid sequence encoded by the base sequence of the indicator gene in the present invention has been clarified. GenBank accession numbers for obtaining partial base sequence data of the indicator gene are summarized later together with the name of the indicator gene.
Those skilled in the art can clarify the full-length base sequence of the indicator gene based on the partial base sequence information. The full-length base sequence can be obtained by, for example, in silico cloning. That is, the EST base sequence (query sequence) that constitutes a part of the indicator gene is collated for a huge amount of EST information accumulated in a public database. Based on the result of the collation, other EST information whose base sequence matches the query sequence over a certain length is acquired. The acquisition of other EST information is repeated using the obtained other EST information as a new query sequence. By repeating this operation, a plurality of sets of ESTs sharing a partial base sequence can be obtained. A set of ESTs is called a cluster. The base sequence of the target gene can be clarified by superimposing the base sequences of ESTs constituting the cluster and integrating them into one base sequence.
Furthermore, those skilled in the art can design a primer for PCR based on the base sequence determined by in silico cloning. By confirming that the gene fragment having the designed length is amplified by RT-PCR using this primer, it can be confirmed that the gene having the determined base sequence actually exists.
Alternatively, the results of in silico cloning can be evaluated by Northern blotting. Northern blotting is performed using a probe designed based on the determined nucleotide sequence information. As a result, if a band that matches the base sequence information can be detected, the presence of the gene having the determined base sequence can be confirmed.
In addition to in silico cloning, experimentally targeted genes can also be isolated. First, a cDNA clone provided with base sequence information registered as an EST is obtained, and all the base sequences of the cDNA possessed by the clone are determined. As a result, there is a possibility that the full-length sequence of cDNA can be revealed. At least a longer base sequence can be revealed. The length of the cDNA possessed by the clone can be experimentally confirmed in advance if the vector structure is clear.
Further, a method for obtaining a part having an unknown base sequence of the gene based on the partial base sequence is known even if there is no clone having the base sequence information of EST at hand. For example, screening a cDNA library using EST as a probe may reveal a longer base sequence. If a library containing many full-length cDNAs is used as the cDNA library, a full-length cDNA clone can be easily isolated. For example, it is said that a cDNA library synthesized based on the principle of the oligo cap method contains a large amount of full-length cDNA.
Furthermore, a technique for synthesizing a region whose gene base sequence is unknown based on partial base sequence information is known. For example, the RACE method is a typical method for isolating a gene containing an unknown base sequence. In the RACE method, an oligonucleotide linker is artificially linked to the end of cDNA. The base sequence of this oligonucleotide linker is known in advance. Therefore, a primer for PCR can be designed based on a region whose base sequence is already known as EST and the base sequence information of the oligonucleotide linker. A region whose base sequence is unknown is specifically synthesized by PCR using the primer thus designed.
The test method for allergic diseases of the present invention measures the expression level of each indicator gene in a biological sample of a subject, and when the indicator gene is a gene described in a) or b) above, When the expression level of the indicator gene in a biological sample collected from the rashless part of the same subject and the indicator gene is the gene described in c) or d) above, a biological sample of a healthy person as a control Comparing the expression level of the indicator gene in If the indicator gene is the gene described in a) or c) above, the subject is determined to have atopic dermatitis when the expression level is higher than that of the control. If the indicator gene is the gene described in b) or d) above, the subject is determined to be atopic dermatitis when the expression level is lower than that of the control.
The method for examining psoriasis according to the present invention measures the expression level of each indicator gene in a biological sample of a subject, and when the indicator gene is a gene described in i) or ii) above, The expression level of the indicator gene in the biological sample collected from the non-eruption part of the examiner, and the indicator in the biological sample of a healthy person as a control when the indicator gene is the gene described in iii) or iv) above Comparing to the expression level of the gene. If the indicator gene is the gene described in i) or iii) above, the subject is determined to have psoriasis when the expression level is higher than that of the control. If the indicator gene is the gene described in ii) or iv) above, the subject is determined to have psoriasis when the expression level is lower than that of the control.
For comparison of expression levels, a standard value is usually set based on, for example, the expression level of the indicator gene in healthy individuals. Based on this standard value, for example, ± 2S. D. The range is considered as an allowable range. A technique for setting a standard value or an allowable range based on the measured value of the indicator gene is known. Alternatively, in the comparison of the expression level with the rash area of the same patient, the expression level of the indicator gene in the rash area can be measured in advance to determine the standard value of the rash area in the patient. After setting the standard value, only the expression level of the eruption part is measured, and the test method of the present invention can be carried out based on a comparison with the standard value of the patient's non-eruption part determined in advance.
When the indicator gene in the subject is the gene described in the above a) or c), if the expression level is higher than the allowable range compared to the control, the subject is said to have atopic dermatitis Determined. Similarly, when the indicator gene in the subject is the gene described in b) or d) above, if the expression level is lower than the allowable range compared to the control, the subject is atopic dermatitis. It is determined that If the expression level of the indicator gene is within an acceptable range, the possibility of atopic dermatitis is expected to be low.
When the index gene in the subject is the gene described in i) or iii) above, the subject is determined to have psoriasis if the expression level is higher than an acceptable range compared to the control. . Similarly, when the indicator gene in the subject is the gene described in ii) or iv) above, if the expression level is lower than the allowable range compared to the control, the subject is said to have psoriasis. Determined. If the expression level of the indicator gene is within an acceptable range, the possibility of psoriasis is expected to be low.
In the present invention, the expression level of an indicator gene includes transcription of the indicator gene into mRNA and translation into a protein. Therefore, the test method for atopic dermatitis according to the present invention is performed based on the comparison of the expression intensity of mRNA corresponding to the indicator gene or the expression level of the protein encoded by the indicator gene.
The measurement of the expression level of the indicator gene in the test for atopic dermatitis or psoriasis in the present invention can be performed according to a known gene analysis method. Specifically, for example, a hybridization technique using a nucleic acid hybridizing to this gene as a probe or a gene amplification technique using a DNA hybridizing to the indicator gene of the present invention as a primer can be used.
The probe or primer used in the test of the present invention can be designed based on the base sequence of the indicator gene. The base sequence of the indicator gene and a part of the amino acid sequence encoded by the indicator gene are known. The GenBank accession numbers of the known nucleotide sequences of the respective index genes of the present invention are the following data 1, data 2, data 5, and data 6 (human), and data 3, data 4, data 11, and data 12 (mouse). ). Alternatively, the base sequence of the psoriasis indicator gene and the part of the amino acid sequence encoded by the indicator gene in the method for examining psoriasis according to the present invention are known. GenBank accession numbers of known base sequences of the respective index genes of the present invention are as described in the following data 7 to data 10 (human). For some of the indicator genes of the present invention, the base sequence and the amino acid sequence encoded by the base sequence are shown in the following SEQ ID NOs. In addition, it has already been described that it is possible to obtain a full-length base sequence of a gene based on the revealed partial base sequence information.
In general, genes of higher animals are frequently accompanied by polymorphisms. There are also many molecules that produce isoforms consisting of different amino acid sequences during the splicing process. Even genes having different nucleotide sequences depending on polymorphisms or isoforms have the same activity as the indicator gene and are involved in atopic dermatitis, and are all included in the indicator gene of the present invention.
In the present invention, the indicator gene includes not only human but also homologs in other species. Therefore, an indicator gene in a species other than human refers to a homologue of an indicator gene unique to that species or an exogenous indicator gene introduced into the individual unless otherwise specified.
In the present invention, the homologue of a human indicator gene refers to a gene derived from a species other than human that can hybridize under stringent conditions using the human indicator gene as a probe. The stringent conditions can generally indicate the following conditions. That is, hybridization is performed at 4 × SSC at 65 ° C., and washing is performed at 65 ° C. for 1 hour using 0.1 × SSC. Hybridization and washing temperature conditions that greatly affect stringency can be adjusted according to the melting temperature (Tm). Tm varies depending on the proportion of the constituent base in the base pairs to be hybridized and the hybridization solution composition (salt concentration, formamide or sodium dodecyl sulfate concentration). Therefore, those skilled in the art can set conditions that give equivalent stringency in consideration of these conditions, either experimentally or empirically.
As the primer or probe, a polynucleotide comprising a base sequence of an indicator gene or a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to its complementary strand can be used. Here, the “complementary strand” refers to the other strand with respect to one strand of double-stranded DNA comprising A: T (U in the case of RNA) and G: C base pairs. In addition, “complementary” is not limited to the case where the sequence is completely complementary in at least 15 consecutive nucleotide regions, and is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and even more preferably 95%. What is necessary is just to have the homology on the above base sequences. The homology of the base sequence can be determined by an algorithm such as BLAST.
Such a polynucleotide can be used as a probe for detecting an indicator gene and as a primer for amplifying the indicator gene. When used as a primer, it usually has a chain length of 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 35 bp. When used as a probe, DNA having at least part or all of the sequence of the indicator gene (or its complementary strand) and having a chain length of at least 15 bp is used. When used as a primer, the region on the 3 ′ side needs to be complementary, but a restriction enzyme recognition sequence or a tag can be added on the 5 ′ side.
The “polynucleotide” in the present invention can be DNA or RNA. These polynucleotides may be synthesized or natural. In addition, as the probe DNA used for hybridization, a labeled DNA is usually used. As a labeling method, for example, the following method can be shown. The term oligonucleotide means a polynucleotide having a relatively low degree of polymerization. Oligonucleotides are included in polynucleotides.
-Labeling by nick translation using DNA polymerase I
・ End labeling using polynucleotide kinase
Fillin end labeling with Klenow fragment (Berger SL, Kimmel AR. (1987) Guide to Molecular Cloning Technologies, Method in Enzymology, Academic Press; Hames BD, HigginsAp. J, Fritsch EF, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Labeling by transcription using RNA polymerase (Melton DA, Krieg, PA, Rebagia MR, Maniatis T, Zinn K, Green MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12, 7035-7056)
-Method of incorporating modified nucleotides without using radioisotopes into DNA (Kricka LJ. (1992) Nonisotopic DNA Probing Techniques. Academic Press)
Examination of atopic dermatitis using a hybridization technique can be performed using, for example, a Northern hybridization method, a dot blot method, a method using a DNA microarray, or the like. Furthermore, gene amplification techniques such as RT-PCR can be used. In the RT-PCR method, the expression of the indicator gene of the present invention can be analyzed more quantitatively by using the PCR amplification monitoring method in the gene amplification process.
In the PCR gene amplification monitoring method, probes labeled with different fluorescent dyes that cancel each other's fluorescence are used at both ends, and hybridized to a detection target (DNA or RNA reverse transcription product). When the PCR reaction proceeds and the probe is degraded by the 5′-3 ′ exonuclease activity of Taq polymerase, the two fluorescent dyes are separated and fluorescence is detected. This fluorescence is detected in real time. By simultaneously measuring a standard sample with a clear copy number for the detection target, the copy number of the detection target in the target sample is determined by the number of cycles with linearity of PCR amplification (Holland, PM et al.,). 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280; Livak, KJ et al., 1995, PCR Methods and Applications 4 (6): 357-362; Heid, CA et al. , Genome Research 6: 986-994; Gibson, EMU et al., 1996, Genome Research 6: 995-1001). In the PCR amplification monitoring method, for example, ABI PRISM7700 (Applied Biosystems) can be used.
Moreover, the test method for atopic dermatitis or psoriasis of the present invention can also be performed by detecting a protein encoded by an indicator gene. As such a test method, for example, a Western blotting method using an antibody that binds to each indicator protein, an immunoprecipitation method, an ELISA method, or the like can be used.
Antibodies that bind to the indicator protein used for this detection can be obtained using techniques well known to those skilled in the art. The antibody used in the present invention can be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody (Milstein C, et al., 1983, Nature 305 (5934): 537-40). For example, in the case of a polyclonal antibody against an indicator protein, blood of a mammal sensitized with an antigen is taken out, and serum is separated from this blood by a known method. As the polyclonal antibody, serum containing the polyclonal antibody can be used. Alternatively, a fraction containing a polyclonal antibody can be further isolated from this serum as necessary. In order to obtain a monoclonal antibody, immune cells are removed from a mammal sensitized with the antigen and fused with myeloma cells or the like. The thus obtained hybridoma can be cloned, and the antibody can be recovered from the culture to obtain a monoclonal antibody.
For the detection of the indicator protein, these antibodies may be appropriately labeled and used. Further, a substance that specifically binds to the antibody, for example, protein A or protein G, can be labeled and detected indirectly without labeling the antibody. Specific examples of the detection method include an ELISA method.
A protein used for an antigen or a partial peptide thereof is, for example, a marker gene or a part thereof is incorporated into an expression vector, introduced into an appropriate host cell, a transformant is prepared, and the transformant is cultured and recombined. It can be obtained by expressing a protein and purifying the expressed recombinant protein from a culture or culture supernatant. Alternatively, an oligopeptide consisting of an amino acid sequence encoded by the gene or a partial amino acid sequence of the amino acid sequence encoded by the full-length cDNA can be chemically synthesized and used as an immunogen.
Furthermore, in the present invention, allergic diseases or psoriasis can be examined using not only the expression level of the indicator gene but also the activity of the indicator protein in the biological sample as an indicator. The activity of the indicator protein refers to the biological activity of the protein. A general method for measuring the activity of each protein is described below.
[Protease]
The protease sample is electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel copolymerized with a substrate such as gelatin under non-reducing conditions, and after electrophoresis, it is allowed to stand in an optimum buffer solution at 37 ° C. for 16 hours. After 16 hours, the gel is stained with Coomassie Brilliant Blue R250, and the protease activity can be evaluated by the fact that the migration position of the protease is not stained, that is, the gelatin is degraded.
Chen, J. et al. M.M. Et al. Biol. Chem. 266, 5113-5121 (1991)
[Protease inhibitor]
The protease inhibitor is subjected to electrophoresis on SDS polyacrylamide gel copolymerized with a protease substrate such as gelatin under non-reducing conditions, and after electrophoresis, allowed to stand at 37 ° C. for 16 hours in an optimal buffer solution to which protease is added. After 16 hours, the gel is stained with Coomassie Brilliant Blue R250, and the protease inhibitor activity can be evaluated by staining the migration position of the protease inhibitor, that is, the gelatin is not degraded.
Greene J et al. Biol. Chem. 271, 30375-30380 (1996)
[Transcription factor]
Transcription factor ³² Incubate at room temperature with a double-stranded oligo DNA containing a target sequence of a transcription factor labeled with P or the like to bind. The sample after incubation is electrophoresed on a native polyacrylamide gel without SDS, and the mobility of the labeled oligo DNA is determined. ³² Evaluation is performed using the radioactivity of P as an index. If the transcription factor has binding activity to the oligo DNA, the mobility of the labeled oligo DNA becomes slow and shifts to the high molecular weight side. The binding specificity for the target sequence can be confirmed by inhibiting the binding between the transcription factor and the labeled oligo DNA by the double-stranded oligo DNA not labeled with an excessive amount.
Moreover, the transcription activation ability by a transcription factor can evaluate the activity of the transcription factor by cotransformation of a reporter gene expression vector and a transcription factor expression vector. The reporter gene expression vector is an expression vector in which a reporter gene such as chloramphenicol acetyltransferase (CAT) is linked downstream of the target sequence. On the other hand, a transcription factor whose activity is to be evaluated can be expressed by a transcription factor expression vector in which a transcription factor gene is linked downstream such as a response gene promoter of human cytomegalovirus (CMV). Transcriptional activity can be evaluated by co-introducing these vectors into cell lines such as Hela and HEK293, preparing a cell disruption solution 48 hours later, and examining the expression level of CAT.
Zhao F et al. Biol. Chem. 276, 40755-40760 (2001)
[Kinase]
Buffer containing myelin basic protein as a substrate (20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MgCl ₂ , 2 mM MnCl ₂ , 2 mM dithiothreitol, and 25 μM ATP), and [γ- ³² Add P] ATP and incubate at 37 ° C. for 10 minutes. After 10 minutes, the reaction is stopped with Laemmli buffer, and the reaction solution is subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis. After electrophoresis, the gel is dried, and the radioactivity of phosphorylated myelin basic protein is detected with an X-ray film.
Park SY et al. Biol. Chem. 275, 19768-19777 (2000)
[Phosphatase]
Phosphatase is added to a buffer solution (25 mM MES, pH 5.5, 1.6 mM dithiothreitol, 10 mM pNPP) containing p-nitrophenyl phosphate (pNPP) as a substrate, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After 30 minutes, 1N NaOH is added to stop the reaction, and the absorbance at 405 nm resulting from the hydrolysis of pNPP is measured.
Aoyama K et al. Biol. Chem. 276, 27575-27583 (2001)
[Chemokines and chemokine receptors]
Cells in which the chemokine receptor is forcibly expressed are suspended in Hank's balanced salt solution containing the calcium-sensitive fluorescent dye fura-2, and stimulated with the chemokine. The increase in intracellular calcium concentration caused by chemokine stimulation is measured with a fluorescence detector such as LS50B (PerkinElmer).
Zhou N et al. Biol. Chem. 276, 42826-42833 (2001)
[Cytokine, cytokine receptor]
Cells that express cytokine receptors are stimulated with cytokines, and the cell proliferation caused thereby is evaluated by thymidine incorporation.
Alternatively, activation of a transcription factor located downstream of a cytokine receptor by cytokine stimulation can be evaluated by expression of a reporter gene such as luciferase.
Piek E et al. Biol. Chem, 276, 19945-19933 (2001)
[Ion channel]
The opening diameter of the tip is several μm ² It can be evaluated by a patch clamp method in which a plasma membrane containing an ion channel is attached to the tip of a glass pipette, and a potential difference is applied to the inside and outside of the pipette to measure the current passing through the channel.
Hamill, O .; P. Et al. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981)
[Cell adhesion factor]
Cells in which adhesion molecules are expressed on the cell surface are incubated on a plate coated with the ligand, and the number of adhered cells is evaluated.
Fujiwara H et al. Biol. Chem. 276, 17550-17558 (2001)
[Extracellular matrix protein]
A suspension of cells having a receptor for an extracellular matrix protein such as integrin is added to the plate coated with the extracellular matrix protein and cultured at 37 ° C. for 1 hour. After culturing, the cells are fixed and reacted by adding a DNA-binding fluorescent dye such as Hoechst 33342. After the reaction, the fluorescence intensity is measured using a fluorometer, and the number of adherent cells quantified as the fluorescence intensity is evaluated as the activity of the extracellular matrix protein.
Miyazaki K et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 11767 (1993)
In the inspection method of the present invention, the skin tissue of the subject is used as a sample. The collection of a skin tissue sample is somewhat painful to the subject. On the other hand, since skin tissue can be easily collected, it is useful as a diagnostic material.
Methods for collecting skin tissue are known. The skin tissue can be collected as follows, for example. That is, first, the collection site is anesthetized with a local anesthetic. After pulling the skin around the biopsy site to make it slack, the punch is embedded in the skin and rotated to put the tissue of the specimen into the punch. Pull out the punch and collect the skin in the cut punch. The punch is an instrument for collecting hollow skin tissue. For example, an instrument capable of collecting skin tissue having a diameter of 3 mm is generally used.
In the present invention, the skin tissue anatomically includes the epidermis and dermis. The skin tissue may include not only skin-specific cells but also cells other than the skin found in the skin tissue, such as lymphocytes, Langerhans cells, or mast cells. Cells collected together with these skin cells are also included in the skin tissue sample.
In the present invention, in order to determine the expression level of the indicator gene in the eruption, a skin tissue sample of the eruption is used. The skin eruption refers to the skin forming an acute lesion. For example, an acute lesion can be determined according to the diagnostic criteria reported in Japanese Journal of Dermatology 104: 1210 (1994). Specifically, for example, the following clinical findings are used as indicators of acute lesions.
Acute lesions: erythema, moist erythema, papules, serous papules, scales, crusts
In order to determine the expression level of the indicator gene in the rash area of the patient, the skin tissue sample of the rash area is used. The rashless part in the patient is the skin at a site not accompanied by the above lesion. Furthermore, in order to determine the expression level of the indicator gene in the skin of a healthy person, the skin tissue of the healthy person is used. A healthy person in the present invention refers to a human who is clearly free from a disease to be diagnosed. That is, in the test for allergic disease, a human who does not have an allergic disease is a healthy person. Similarly, in the examination method for psoriasis, a human who does not have psoriasis is a healthy person. A healthy person is allowed to have a disease other than the disease to be diagnosed. However, preferred healthy individuals are humans who have neither allergic disease nor psoriasis. The skin tissue can be collected by a method similar to that for collecting the patient's skin tissue. In comparing the expression level of the indicator gene, it is desirable to compare the skin at the same site as much as possible. However, in the comparison of the rash / non-rash area of the same patient, it may be difficult to find the skin of the rash area at the same site. In such cases, different skin sites can be used for comparison.
Since it is easy to collect a skin tissue sample, a simple examination at a medical site is possible. For example, it can be prepared by the method shown in the Examples. If the prepared skin tissue is destroyed and used as a lysate, it can be used as a sample for immunological measurement of the indicator protein.
If a lysate is prepared from the above biological sample, it can be used as a sample for immunological measurement of the indicator protein. Or if mRNA is extracted from this lysate, it can be set as the sample for the measurement of mRNA corresponding to an indicator gene. It is convenient to use a commercially available kit for extracting lysate or mRNA from a biological sample. If the indicator protein is secreted into the blood, the expression level of the gene encoding it can be compared by measuring the amount of the target protein contained in a body fluid sample such as blood or serum of the subject. Is possible. The above sample can be used in the method of the present invention after being diluted with a buffer or the like as necessary.
When measuring mRNA, the measured value of the expression level of the indicator gene in the present invention can be corrected by a known method. By correction, it is possible to compare changes in gene expression levels in cells. The measurement value is corrected based on the measurement value of the expression level of a gene (for example, a housekeeping gene) whose expression level does not vary greatly in each cell in the biological sample. This is done by correcting. Examples of genes whose expression levels do not vary greatly include β-actin, GAPDH and the like.
Furthermore, this invention provides the reagent for the test | inspection method of this invention. That is, the present invention relates to a reagent for testing atopic dermatitis comprising a polynucleotide comprising a base sequence of an indicator gene or an oligonucleotide having a base sequence complementary to its complementary strand and having a length of at least 15 bases. Alternatively, the present invention relates to a reagent for testing atopic dermatitis, comprising an antibody that recognizes an indicator protein. An oligonucleotide or antibody constituting the reagent of the present invention can be bound with an appropriate label depending on the assay format. Alternatively, the oligonucleotide or antibody constituting the reagent of the present invention can be immobilized on an appropriate support depending on the assay format. Further, the reagent of the present invention can be combined with an additional element necessary for inspection and storage in addition to the oligonucleotide or the antibody to form a test kit. Additional elements that can make up the kit are listed below. These elements can be mixed in advance if necessary. Moreover, a preservative and preservative can be added to each element as needed.
Buffer for diluting reagents and biological samples
Positive control
Negative control
Substrate for measuring label
Reaction vessel
Instructions describing assay protocol
The AD index gene in the present invention has an expression level in each skin tissue in comparison with the rash area in the same patient as the rash area of the patient with atopic dermatitis or the rash area in the patient with atopic dermatitis and a healthy person. Variation was confirmed. Therefore, atopic dermatitis can be examined using the expression level of the AD index gene as an index.
The test for atopic dermatitis in the present invention includes, for example, the following tests. Whether or not a patient with atopic dermatitis shows symptoms that are suspected, but cannot be determined to be atopic dermatitis by a general test, whether or not the patient is atopic dermatitis if the test based on the present invention is performed. It can be easily determined. More specifically, in a patient who exhibits symptoms suspected of having atopic dermatitis, when the AD index gene is the gene described in a) or c), an increase in the expression of the AD index gene is a cause of the symptoms. Indicates a high possibility of atopic dermatitis. In addition, in a patient who exhibits symptoms suspected of having atopic dermatitis, when the AD index gene is the gene described in b) or d), the decrease in the expression of the AD index gene is caused by the same atopic characteristics. This indicates a high possibility of dermatitis.
Or the test for judging whether atopic dermatitis is improving is possible. That is, it is useful for determining the therapeutic effect on atopic dermatitis. In addition, in patients diagnosed with atopic dermatitis, when the AD index gene is the gene described in a) or c), the increase in the expression of the AD index gene is further progressed by atopic dermatitis. This indicates a high possibility. Further, in a patient diagnosed with atopic dermatitis, when the AD index gene is the gene described in b) or d), the decrease in the expression of the AD index gene is also caused by the further progression of atopic dermatitis. This indicates that there is a high possibility.
Furthermore, the severity of atopic dermatitis can also be determined based on the difference in expression level. That is, when the AD index gene is the gene described in a) or c), the degree of increase in the expression of the AD index gene correlates with the severity of atopic dermatitis. Alternatively, when the AD index gene is the gene described in b) or d), the degree of decrease in the expression of the AD index gene correlates with the severity of atopic dermatitis.
The expression level of the psoriasis index gene in the present invention was confirmed in each skin tissue in comparison with the rash area in the same patient as the rash area of a psoriasis patient, or in the rash area of a psoriasis patient and a healthy person. Therefore, psoriasis can be examined using the expression level of the psoriasis index gene as an index.
The test for psoriasis in the present invention includes the following tests, for example. Even if a patient cannot be determined to have psoriasis by a general test while showing symptoms suspected of having psoriasis, it can be easily determined whether or not the patient is psoriasis by performing a test based on the present invention. More specifically, in a patient who exhibits symptoms suspected of having psoriasis, when the psoriasis index gene is the gene described in i) or iii), an increase in the expression of the psoriasis index gene is caused by psoriasis. This indicates that there is a high possibility. Further, in a patient exhibiting symptoms suspected of having psoriasis, when the psoriasis index gene is the gene described in ii) or iv), the decrease in the expression of the psoriasis index gene may indicate that the cause of the symptoms is also psoriasis. Is high.
Alternatively, a test can be made to determine whether psoriasis is improving. That is, it is useful for determining the therapeutic effect on psoriasis. Further, in a patient diagnosed with psoriasis, when the psoriasis index gene is the gene described in i) or iii), an increase in the expression of the psoriasis index gene indicates that there is a high possibility that psoriasis is further progressed. Show. In patients diagnosed with psoriasis, when the psoriasis index gene is the gene described in ii) or iv), the decrease in the expression of the psoriasis index gene is also likely to be caused by further progress of psoriasis. Is shown.
Furthermore, the severity of psoriasis can be determined based on the difference in expression level. That is, when the psoriasis index gene is the gene described in i) or iii), the degree of increase in the expression of the psoriasis index gene correlates with the severity of psoriasis. Alternatively, when the psoriasis indicator gene is a gene described in ii) or iv), the degree of decrease in the expression of the psoriasis indicator gene correlates with the severity of psoriasis.
The present invention also provides an atopic dermatitis model animal comprising a transgenic non-human animal having an increased expression intensity in the skin of the AD index gene described in a) or c) or a gene functionally equivalent to the AD index gene. About.
According to the present invention, it has been clarified that the expression intensity of the AD index gene described in a) is increased in the eruption of a patient with atopic dermatitis. Similarly, it was revealed that the expression intensity of the AD index gene described in c) increases in the rashless part of atopic dermatitis patients. Therefore, an animal in which the expression level of the AD index gene described in a) or c) or a gene functionally equivalent to the AD index gene is artificially enhanced in the skin should be used as a model animal for atopic dermatitis. Can do.
The present invention also provides an atopic dermatitis model animal comprising a transgenic non-human animal in which the expression intensity in skin of the AD index gene or the gene functionally equivalent to the AD index gene described in b) or d) is reduced. About.
According to the present invention, it has been clarified that the expression intensity of the AD index gene described in b) is decreased in the rash portion of atopic dermatitis patients. Similarly, it has been clarified that the expression intensity of the AD index gene described in d) decreases in the rashless part of patients with atopic dermatitis. Therefore, an animal in which the expression level of the AD indicator gene described in b) or d) or a gene functionally equivalent to the indicator gene in the skin is artificially reduced should be used as a model animal for atopic dermatitis. Can do.
The present invention also relates to a psoriasis model animal comprising a transgenic non-human animal having an increased expression intensity in the skin of the psoriasis indicator gene described in i) or iii) or a gene functionally equivalent to the psoriasis indicator gene.
According to the present invention, it was revealed that the expression intensity of the psoriasis index gene described in i) is increased in the skin area of psoriasis patients. Similarly, it was revealed that the expression intensity of the psoriasis index gene described in iii) is increased in the non-rash area of psoriasis patients. Therefore, an animal in which the expression level of the psoriasis index gene described in i) or iii) or a gene functionally equivalent to the psoriasis index gene is artificially enhanced in the skin can be used as a model animal for psoriasis.
The present invention also relates to a psoriasis model animal comprising a transgenic non-human animal having reduced expression intensity in the skin of the psoriasis index gene or the gene functionally equivalent to the psoriasis index gene described in ii) or iv).
According to the present invention, it has been clarified that the expression intensity of the psoriasis index gene described in ii) is reduced in the eruption of a psoriasis patient. Similarly, it was revealed that the expression intensity of the psoriasis index gene described in iv) is decreased in the non-rash area of psoriasis patients. Therefore, an animal in which the expression level of the psoriasis indicator gene described in ii) or iv) or a gene functionally equivalent to the psoriasis indicator gene is artificially reduced in the skin can be used as a model animal for psoriasis. .
In the present invention, a functionally equivalent gene is a gene encoding a protein having the same activity as that revealed in the protein encoded by the indicator gene. Representative examples of functionally equivalent genes include counterparts of indicator genes in the animal species that are inherently provided in the test animal. For example, the genes described in the groups A) to D) are functionally equivalent genes in mice. The genes described in the A) group-D) group are desirable indicator genes when the screening based on the present invention is performed using mice.
Furthermore, the present invention revealed the counterparts of the AD indicator genes described in a) to d) in mice. The mouse counterparts for the AD indicator genes described in a) to d) are indicated as A) to D), respectively. These counterparts are genes for which a difference of 2 times or more was observed when gene expression levels in the sensitized mouse auricle skin and the non-sensitized mouse auricle skin were compared.
Therefore, an atopic dermatitis model animal can be created by adjusting the expression level of these counterparts or administering them. That is, the present invention relates to a method for producing an atopic dermatitis model animal by adjusting the expression level of the gene group described in A) to D). Or this invention relates to the manufacturing method of the atopic dermatitis model animal including the process which administers the protein itself encoded by the gene group as described in A) -D), or the antibody of this protein to a non-human animal.
First, the gene group described in A) or C) can induce atopic dermatitis by increasing the expression level, similar to the gene group described in a) or c). Alternatively, an atopic dermatitis model animal can be created by administration of a gene selected from these genes and a protein encoded by the gene. Since all these counterparts are mouse genes, it is desirable to administer genes and proteins to mice.
In addition, the gene group described in B) or D) can induce atopic dermatitis by suppressing the expression level in the same manner as the gene group described in b) or d). Alternatively, atopic dermatitis can be produced by suppressing the expression of a gene selected from these gene groups and the activity of the protein encoded by the gene. For suppression of expression, antisense nucleic acid or RNAi can be used. For the regulation of protein activity, administration of an activity inhibitor such as an antibody is effective. That is, atopic dermatitis is induced by administering these components to an animal having a genetic group described in B) or D), that is, a mouse.
The atopic dermatitis model animal is useful for clarifying in vivo changes in atopic dermatitis. Furthermore, it is of great significance to elucidate the further function of the indicator gene by using the atopic dermatitis model animal and to evaluate a drug targeting the gene.
The animal model for atopic dermatitis according to the present invention is useful for elucidating the mechanism of atopic dermatitis and for testing the safety of the screened compound. For example, if the atopic dermatitis model animal according to the present invention develops dermatitis or shows a change in measured values related to any allergic disease, a screening system for searching for a compound having an action to recover it can be constructed. .
In the present invention, an increase in the expression level is a state in which an indicator gene is introduced and forcedly expressed as a foreign gene, or a state in which transcription of an indicator gene originally provided in a test animal and translation into a protein are enhanced, In addition, it means any state in which the degradation of the protein as a translation product is suppressed.
In the present invention, a decrease in expression level means either a state in which transcription of an indicator gene provided in a test animal and translation into a protein are inhibited, or a state in which degradation of a protein that is a translation product is promoted. . The gene expression level can be confirmed, for example, by the difference in signal intensity in the DNA chip as shown in the Examples. Moreover, the activity of the protein which is a translation product can be confirmed by comparing with the normal state.
A representative transgenic animal can be an animal in which an indicator gene has been introduced and forcibly expressed, an animal in which the indicator gene has been knocked out, an animal in which another gene has been replaced (knocked in), or the like. In addition, transgenic animals into which antisense DNA for the indicator gene, DNA encoding a ribozyme, DNA functioning as a decoy nucleic acid, or the like can be used as the transgenic animal in the present invention. In addition, for example, an animal in which a mutation has been introduced into the coding region of an indicator gene to enhance or suppress its activity, or an amino acid sequence that has been modified to an amino acid sequence that is not easily degraded or easily degraded can be shown. As the amino acid sequence mutation, substitution, deletion, insertion, or addition can be shown. In addition, the expression itself of the indicator gene of the present invention can be regulated by mutating the transcriptional regulatory region of the gene.
A method for obtaining a transgenic animal for a specific gene is known. That is, a method in which a gene and an egg are mixed and treated with calcium phosphate, a method in which a gene is directly introduced into a nucleus of a pronuclear phase egg using a micropipette under a phase contrast microscope (microinjection method, US Pat. No. 4,873,191), A transgenic animal can be obtained by a method using embryonic stem cells (ES cells). In addition, a method of inserting a gene into a retrovirus vector and infecting an egg, a sperm vector method for introducing a gene into an egg via sperm, and the like have been developed. The sperm vector method is a genetic recombination method in which a foreign gene is introduced into a sperm by attaching the foreign gene to the sperm or incorporating it into a sperm cell by a method such as electroporation and then fertilizing the egg (M. Lavitranoe et al. Cell, 57, 717, 1989).
If a promoter whose transcription is regulated by a substance such as an appropriate drug is used as the promoter used in the expression vector, the expression level of the exogenous indicator gene in the transgenic animal can be adjusted by administration of the substance.
The transgenic animal used as a model animal for atopic dermatitis or psoriasis of the present invention can be prepared using any vertebrate other than humans. Specifically, transgenic animals in which various gene introductions and expression levels are modified in vertebrates such as mice, rats, rabbits, minipigs, goats, sheep, and cows have been created.
Furthermore, the present invention relates to a method for screening a candidate compound for treating atopic dermatitis. In the present invention, the AD index gene is a gene selected from the group described in any one of a) to d). The expression level of the gene selected from the group described in a) is significantly increased in the rash portion of the same patient as compared to the non-rash portion of the patient with atopic dermatitis. The expression level of the gene selected from the group described in b) is significantly reduced in the rash area of the same patient as compared to the non-rash area of the patient with atopic dermatitis. The expression level of the gene selected from the group described in c) is significantly increased in the rash area of patients with atopic dermatitis compared to healthy subjects. And the expression level of the gene selected from the group described in d) is significantly reduced in the rash area of atopic dermatitis patients as compared with healthy individuals.
Therefore, for the AD index gene of group a) or c), a therapeutic drug for atopic dermatitis can be obtained by selecting a compound that can reduce the expression level of the AD index gene. On the other hand, with respect to the AD index gene of group b) or d), a therapeutic drug for atopic dermatitis can be obtained by selecting a compound capable of increasing the expression level of the AD index gene.
In the screening method for candidate compounds for the treatment of atopic dermatitis according to the present invention, the following genes can be shown as preferable genes as AD index genes.

All of these genes were genes whose expression levels were not changed in patients with psoriasis. In other words, it can be said to be a gene whose expression level specifically changes in patients with atopic dermatitis. By using these AD index genes, a therapeutic effect specific to atopic skin inflammation can be evaluated.
The present invention further relates to a method for screening a candidate compound for treating psoriasis. In the present invention, the psoriasis indicator gene is a gene selected from the group described in any one of i) to iv). The expression level of the gene selected from the group described in i) is significantly increased in the skin area of the same patient as compared with the non-rash area of the psoriasis patient. The expression level of the gene selected from the group described in ii) is significantly decreased in the rash area of the same patient as compared to the non-rash area of the psoriasis patient. The expression level of the gene selected from the group described in iii) is significantly increased in the rash area of psoriasis patients compared to healthy individuals. And the expression level of the gene selected from the group described in iv) is significantly reduced in the rash area of psoriasis patients compared to healthy individuals.
Therefore, for the psoriasis index gene of group i) or iii), a therapeutic agent for psoriasis can be obtained by selecting a compound that can reduce the expression level of the psoriasis index gene. On the other hand, for the psoriasis index gene of group ii) or iv), a therapeutic agent for psoriasis can be obtained by selecting a compound that can increase the expression level of the psoriasis index gene.
In the screening method for candidate compounds for treating psoriasis according to the present invention, the following genes can be shown as preferred genes for psoriasis index genes.

All of these genes were genes whose expression level was not changed in patients with atopic dermatitis. In other words, it can be said to be a gene whose expression level specifically changes in psoriasis patients. By using these psoriasis indicator genes, a therapeutic effect specific to the symptoms of psoriasis can be evaluated.
In the present invention, a compound that increases the expression level of a gene is a compound that has an action of promoting the transcription, translation, and protein expression of the gene. In the present invention, a compound that decreases the expression level of a gene is a compound having an action that acts to inhibit any of these steps.
The screening method for a candidate compound for treatment of allergic disease (or psoriasis) of the present invention can be performed in vivo or in vitro. This screening can be performed, for example, according to the following steps.
(1) administering a candidate compound to a test animal;
(2) measuring the expression intensity of the indicator gene in the biological sample of the subject animal,
(3) Compared with a control not contacted with a candidate compound, a compound that decreases the expression level of the gene for an indicator gene of a) group or c) group (i) group or iii) group) in the case of psoriasis, In addition, for the index gene of b) group or d) group (ii group or iv) group in the case of psoriasis, a step of selecting a compound that increases the expression level of the gene
In the screening method of the present invention, the indicator gene is functionally any one of the genes selected from the group described in any one of the above-mentioned a) to d) (for psoriasis, i) to iv)) Equivalent genes can be used. In the present invention, a functionally equivalent gene is a gene encoding a protein having the same activity as that revealed in the protein encoded by the indicator gene. Representative examples of functionally equivalent genes include counterparts of indicator genes in the animal species that are inherently provided in the test animal.
As a test animal in the screening method of the present invention, for example, an atopic dermatitis model animal can be used. Atopic dermatitis model animals are known. For example, as a model close to human atopic dermatitis, a spontaneous dermatitis onset model using NC / Nga mice has been reported. When a mite antigen (5 μg / ear) is administered to the auricle of this mouse a total of 8 times at intervals of 2-3 days, symptoms very similar to human atopic dermatitis can be induced after 2 weeks. The screening according to the present invention can be carried out by administering a candidate compound to this system and following the change in the expression level of the indicator gene of the present invention.
In this way, by contacting the test animal with the drug candidate compound and monitoring the effect of the compound on the expression of the indicator gene in the biological sample derived from the test animal, the influence of the drug candidate compound on the expression level of the indicator gene is evaluated. be able to. The variation in the expression level of the indicator gene in the biological sample derived from the test animal can be monitored by the same method as the test method of the present invention. Further, based on the result of this evaluation, when the indicator gene is a gene described in a) group or c) group (i) group or iii) group) for psoriasis, a drug candidate compound that decreases the expression level is added. If the drug candidate compound that increases the expression level is selected when the indicator gene is the gene described in b) group or d) group (ii) group or iv) group) in the case of psoriasis, Can be screened.
More specifically, the screening according to the present invention can be carried out by collecting a skin tissue sample from a test animal and comparing the expression level of the indicator gene with a control not contacted with a candidate compound. A method for collecting and preparing a skin tissue sample is known.
By such screening, it is possible to select drugs that are involved in the expression of the indicator gene in various forms. Specifically, for example, drug candidate compounds having the following actions can be found.
When the indicator gene is a gene described in a) group or c) group (in the case of psoriasis, i) group or iii) group):
・ Suppression of signal transduction pathways that lead to the expression of indicator genes
・ Repression of transcriptional activity of indicator genes
・ Inhibition of stabilization or degradation of indicator gene transcripts
When the indicator gene is the gene described in b) group or d) group (in the case of psoriasis, group ii) or group iv)):
Activation of signal transduction pathways leading to the expression of indicator genes,
・ Promoting transcriptional activity of indicator genes,
・ Stabilization of indicator gene transcripts and inhibition of degradation
In addition, in in vitro screening, for example, a candidate compound is brought into contact with a cell expressing an indicator gene, and the indicator gene is described in group a) or c) (in the case of psoriasis, group i) or group iii)) A compound that decreases the expression level in the case of the gene of (2), an expression level if the indicator gene is the gene described in group b) or d) group (ii or group iv) in the case of psoriasis) The method of selecting the compound to raise is mentioned. This screening can be performed, for example, according to the following steps.
(1) A step of bringing a candidate compound into contact with a cell expressing an indicator gene
(2) measuring the expression level of the indicator gene,
(3) A compound that decreases the expression level of the gene for the indicator gene described in a) group or c) group (i) group or iii) group) in comparison with a control not contacted with a candidate compound And b) or d) (in the case of psoriasis, the compound that increases the expression level of the gene for the indicator gene described in ii) or iv)
In the present invention, a cell that expresses an indicator gene can be obtained by inserting the indicator gene into an appropriate expression vector and introducing the vector into an appropriate host cell. Any vector and host cell that can be used may be used as long as they can express the indicator gene of the present invention. Examples of host cells in the host-vector system include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like, and usable vectors can be appropriately selected.
Examples of methods for introducing a vector into a host include biological methods, physical methods, and chemical methods. Biological methods include, for example, a method using a viral vector, a method using a specific receptor, a cell fusion method (HVJ (Sendai virus), polyethylene glycol (PEG), an electric cell fusion method, micronucleus fusion, and the like. Law (chromosome transfer)). Examples of physical methods include a microinjection method, an electroporation method, and a method using a gene particle gun. Examples of the chemical method include calcium phosphate precipitation method, liposome method, DEAE dextran method, protoplast method, erythrocyte ghost method, erythrocyte membrane ghost method, and microcapsule method.
In the screening method of the present invention, in addition to skin cells, skin tissues such as Langerhans cells, mast cells, T cells, eosinophils, B cells, neutrophils, or basophils are used as cells expressing the indicator gene. The cells found in can be used.
There has been a report that differentiation can be induced by applying stimulation with TGF-β or sodium butyrate to primary cultured cells of human epidermal keratinocytes (keratinocytes) NHEK (Normal Human Epidermal Keratinocyte) (for example, Geng Wang et al. , EXPERIMENTAL CELL RESEARCH 198, 27-30 (1992)). Along with the differentiation, an intracellular structure called a cornified envelope (CE) is formed. Differentiation can be confirmed using CE formation or gene expression of CE constituent molecules (involucrin, loricrin, etc.) as an index. The differentiated cells are useful for screening in the present invention.
Skin cells, T cells, eosinophils, mast cells, basophils, B cells, Langerhans cells, and neutrophils can also be used as cells found in the skin tissue. The established skin cells are suitable for the screening method of the present invention in that a large number of homogeneous cells can be obtained and culture is easy. Examples of skin cell lines that can be used in the present invention are shown below.
-Established skin cells: HaCaT, A431 (ATCC CRL-1555)
-Cell lines established: Jurkat (ATCC TIB-152), Molt-4 (ATCC CRL-1582), H9 (ATCC HTB-176)
-Eosinophil strains: AML14.3D10
-Mast cell line: HMC-1
-Stock basophils: KU-812
-Cell line B: DND39, Raji (ATCC CCL-86)
-(Corporation) Langerhans cells: MUTZ-3
-(Corporation) Neutrophils: HL-60 (ATCC CCL-240)
Those with parentheses in the cell line are differentiated from the cell line prior to use. Differentiation of Langerhans cells (Allan J. Masterson et al. Blood 2002 Jul 15; 100 (2): 701-3) or neutrophils (Santos-Beneit AM et al. J Leukoc Biol 2000 May; 67 (5): 712-24) Is known.
In the screening method, first, a candidate compound is brought into contact with the established skin cells. Thereafter, the expression level of the indicator gene in the established skin cells is measured, and compared with the control not contacted with the candidate compound, it is described in a) group or c) group (in the case of psoriasis, i) group or iii) group) A compound that decreases the expression level of the gene for the indicator gene of ii), and the expression level of the gene for the indicator gene described in b) group or d) group (ii group or iv) in the case of psoriasis) Select the compound to be raised.
In the screening method of the present invention, the expression level of the indicator gene can be compared by detecting not only the expression level of the protein encoded by the gene but also the corresponding mRNA. In order to compare the expression level by mRNA, the preparation step of mRNA sample as described above is performed instead of the preparation step of protein sample. Detection of mRNA and protein can be carried out by a known method as described above.
Furthermore, based on the disclosure of the present invention, a transcriptional regulatory region of the indicator gene of the present invention can be obtained to construct a reporter assay system. The reporter assay system refers to an assay system for screening a transcriptional regulatory factor that acts on a transcriptional regulatory region using the expression level of a reporter gene arranged downstream of the transcriptional regulatory region as an index.
That is, the present invention is a method for screening a therapeutic agent for atopic dermatitis or psoriasis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any one of a) to d) (i) in the case of psoriasis: iv) The method is a gene functionally equivalent to any gene selected from the group described in any one) or an indicator gene.
(1) contacting a candidate compound with a cell into which a vector containing a transcriptional regulatory region of a marker gene and a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region is introduced;
(2) measuring the activity of the reporter gene, and
(3) The expression level of the reporter gene is decreased for the indicator gene described in a) group or c) group (i) group or iii) group) in comparison with a control not contacted with a candidate compound A step of selecting a compound, or a compound that increases the expression level of the reporter gene for the indicator gene described in b) group or d) group (ii group or iv group in the case of psoriasis)
Examples of transcription regulatory regions include promoters, enhancers, and CAAT boxes, TATA boxes, etc. that are usually found in promoter regions.
In addition, as a reporter gene, a CAT (chlorphenicol acyltransferase) gene, a luciferase gene, a growth hormone gene, or the like can be used.
Alternatively, the transcriptional regulatory region of each indicator gene in the present invention can be obtained as follows. That is, based on the nucleotide sequence of the cDNA disclosed in the present invention, screening is performed from a human genomic DNA library such as a BAC library or a YAC library by a method using PCR or hybridization, and a genome containing the cDNA sequence is contained. A DNA clone is obtained. Based on the obtained genomic DNA sequence, the transcriptional regulatory region of the cDNA disclosed in the present invention is estimated, and the transcriptional regulatory region is obtained. The resulting transcriptional regulatory region is cloned so as to be located upstream of the reporter gene to construct a reporter construct. The obtained reporter construct is introduced into a cultured cell line to obtain a transformant for screening. The indicator gene described in a) group or c) group (i) group or iii) group in the case of psoriasis is compared with the control in which the candidate compound is contacted with this transformant and the candidate compound is not contacted. A compound that decreases the expression level of the reporter gene, and a compound that increases the expression level of the reporter gene for the indicator gene described in group b) or d) (in the case of psoriasis, group ii) or group iv)) By selecting, the screening of the present invention can be performed.
As a screening method according to the present invention in vitro, a screening method based on the activity of the indicator protein can also be used. That is, the present invention is a screening method for a therapeutic drug for atopic dermatitis or psoriasis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any of a) to d) (in the case of psoriasis, i) to iv) Or a gene that is functionally equivalent to an indicator gene.
(1) contacting a protein encoded by an indicator gene with a candidate compound;
(2) measuring the activity of the protein; and
(3) Compared with a control not contacted with a candidate compound, a compound that decreases the activity for the indicator gene described in a) group or c) group (i) group or iii) group in the case of psoriasis, a step of selecting a compound that increases the activity of the indicator gene described in group b) or group d) (in the case of psoriasis, group ii) or group iv))
Using the activity of the index protein in the present invention as an index, for the index gene described in a) group or c) group (i) group or iii) group) in the case of psoriasis, a compound having an activity to inhibit the activity Can be screened. The compound thus obtained suppresses the action of each indicator gene described in a) group or c) group (i) group or iii) group in the case of psoriasis). As a result, atopic dermatitis (or psoriasis) can be controlled through inhibition of an indicator protein whose expression is induced in the skin.
In addition, for the indicator genes described in b) group or d) group (in the case of psoriasis, group ii) or group iv)), a compound having an activity for promoting the activity can be screened. The compounds obtainable in this way promote the action of the indicator genes described in group b) or d) (in the case of psoriasis group ii) or group iv)). As a result, atopic dermatitis (or psoriasis) can be controlled through promotion of an indicator protein whose expression is inhibited in the skin.
Candidate substances used for screening include compound preparations synthesized by existing chemical methods such as steroid derivatives, compound preparations synthesized by combinatorial chemistry, animal / plant tissue extracts or microbial cultures, etc. And a mixture containing a plurality of these compounds, and a standard purified from them.
Polynucleotides, antibodies, cell lines, or model animals necessary for various screening methods according to the present invention can be combined in advance to form a kit. These kits should be packaged with substrate compounds used for label detection, media and containers for cell culture, positive and negative standard samples, and instructions describing how to use the kit. You can also.
The compound selected by the screening method of the present invention is useful as a therapeutic agent for atopic dermatitis. Alternatively, an antisense DNA that can suppress the expression of any of the AD index genes described in a) and c) is also useful as a therapeutic agent for atopic dermatitis.
Furthermore, an antibody that recognizes a protein encoded by any of the AD index genes described in a) or c) is also useful as a therapeutic agent for atopic dermatitis. The AD index gene described in a) or c) is a gene whose expression is increased in the skin eruption of an atopic dermatitis patient. Therefore, the therapeutic effect of atopic dermatitis can be expected by suppressing the expression of these genes or the function of the protein encoded by these genes.
In addition, any of the AD index genes described in b) or d) and the protein itself encoded by the gene are also useful as therapeutic agents for atopic dermatitis.
The compound selected by the screening method of the present invention is useful as a therapeutic agent for psoriasis. Alternatively, an antisense DNA capable of suppressing the expression of any of the psoriasis indicator genes described in i) and iii) is also useful as a therapeutic agent for psoriasis.
Furthermore, an antibody that recognizes a protein encoded by any of the psoriasis indicator genes described in i) or iii) is also useful as a therapeutic agent for psoriasis. The indicator gene described in i) or iii) is a gene whose expression is increased in the skin eruption part of a psoriasis patient. Therefore, the therapeutic effect of psoriasis can be expected by suppressing the expression of these genes or the function of the protein encoded by these genes.
In addition, any of the psoriasis indicator genes described in ii) or iv) and the protein itself encoded by the gene are also useful as therapeutic agents for psoriasis.
The therapeutic agent for allergic disease or psoriasis according to the present invention is produced by mixing a compound selected by the screening method as an active ingredient with a physiologically acceptable carrier, excipient, diluent or the like. Can do. The therapeutic agent for allergic disease or psoriasis of the present invention can be administered orally or parenterally for the purpose of improving allergic symptoms or psoriasis.
As the oral preparation, dosage forms such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions can be selected. Examples of injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, and the like.
Moreover, when the compound to be administered consists of protein, the therapeutic effect can be achieved by introducing a gene encoding it into a living body using a gene therapy technique. A technique for treating a disease by introducing a gene encoding a protein having a therapeutic effect into a living body and expressing the gene is known.
Alternatively, antisense DNA can be incorporated downstream of an appropriate promoter sequence and administered as an antisense RNA expression vector. When this expression vector is introduced into mononuclear cells of patients with allergic diseases, the antisense of these genes is expressed, and the therapeutic effect of allergy can be achieved by lowering the expression level of the genes. As an introduction of an expression vector into a mononuclear cell, a method performed in vivo or ex vivo is known.
The dose varies depending on the patient's age, sex, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, type of active ingredient contained in the pharmaceutical composition, etc., but it is usually 0 per adult per dose. It can be administered in the range of 1 mg to 500 mg, preferably in the range of 0.5 mg to 20 mg. However, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be required.
The present invention also provides a DNA chip for diagnosing atopic dermatitis to which a probe for measuring at least one AD index gene selected from any one of groups a) to d) is immobilized. Alternatively, the present invention provides a DNA chip for diagnosing psoriasis to which a probe for measuring at least one psoriasis indicator gene selected from any one of groups i) to iv) is fixed.
The type of indicator gene to be measured is arbitrary. The greater the number of index genes, the more judgments can be made based on the indices. In general, the accuracy of diagnosis increases when more indicators are measured. Further, when measuring a plurality of indicator genes, it is advantageous to select genes having different properties. Genes that are considered to differ in the mechanism of expression level variation or the function of the protein encoded by the gene can be said to be genes having different properties. Furthermore, by using the AD index gene described in a) -d) and the psoriasis index gene described in i) -iv) as measurement targets, both atopic dermatitis and psoriasis can be detected using the same DNA chip. It can also be inspected.
The following examples can be shown as examples of combinations of indicator genes. Combinations of indicator genes as shown below contribute to improving the accuracy of allergy tests.
[Two or more genes selected from indicator genes included in the group consisting of protease and protease inhibitor]
Proteases and protease inhibitors serve as indicators of the balance between tissue breakdown and architecture. That is, among the indicator genes in the present invention, for genes selected from the genes included in the protease group and the genes included in the protease inhibitor, probes for detecting the genes are accumulated and used for testing atopic dermatitis. It can be a chip. The indicator genes included in each group can be found from the list of indicator genes shown at the end of the specification. For example, since there is a report that the skin rash becomes chronic due to an imbalance between MMP-3 (Matrix Metalloproteinase-3) and TIMP-1 (Tissue Inhibitor of MMP-1), the combination of protease and protease inhibitor is an allergic disease. It is significant as a combination of indicator genes.
[Two or more genes selected from the group consisting of cytokines, cytokine receptors, chemokines, chemokine receptors, CD antigens, antibodies and antibody receptors]
These combinations are combinations of substances having a relationship between a ligand and a receptor. The immune response can also be viewed as a result of the interaction between these substances. Therefore, by combining these indicator genes, it may be possible to determine what state the skin tissue is immunologically. As the indicator gene, both molecules having a relationship between the ligand and the receptor may be selected. When only one of the molecules is shown as the indicator gene in the present invention, only one of them is selected as the indicator gene. You can also
[Two or more genes selected from index genes included in the group consisting of cytokines, extracellular matrix proteins, cytoskeletal proteins, intercellular adhesion molecules, and transcription factors]
Examples of extracellular matrix protein include collagen. Cytoskeletal proteins include keratin, small proline rich protein, involucrin, and the like. In addition, intercellular adhesion molecules include cadherin, desmocholine, and the like. And as a transcription factor, jun, fos, or myc can be shown. By observing the expression levels of these indicator genes, there is a possibility that the degree of skin tissue differentiation and the reconstruction (repair) of the inflammatory site can be evaluated.
[Two or more genes selected from the indicator genes contained in the enzyme]
By selecting an indicator gene contained in the enzyme, it is possible to know what kind of metabolism is being performed in skin cells (epidermal keratinocyte or derma fibroblast). For example, the metabolism of lipid molecules that support lipid mediators and barrier functions can be determined from the expression level of lipid metabolizing enzymes. Examples of lipid metabolizing enzymes include phospholipase A2, cyclogenase-2, prostaglandin D2 synthase, Fatty acid desaturase 1, and the like.
Alternatively, in order to realize a test with higher accuracy, a probe capable of detecting the selected gene is accumulated for any combination of a plurality of genes selected from the genes constituting the groups a) and b). The tip for testing atopic dermatitis is effective. Specifically, 10 or more genes, typically 30 or more, preferably 50 or more, more preferably 60 or more, still more preferably 80 or more, or 100 or more genes can be selected from group a). On the other hand, genes of 10 or more, for example, 30 or more, preferably 50 or more, more preferably 60 or more, still more preferably 80 or more can be selected from group b).
Similarly, in order to realize a test with higher accuracy, a probe capable of detecting a selected gene for any combination of a plurality of genes selected from the genes constituting c) group or d) group is provided. The accumulated atopic dermatitis testing chip is effective. Specifically, genes of 10 or more, usually 30 or more, preferably 50 or more, more preferably 60 or more, still more preferably 80 or more can be selected from group c). On the other hand, genes of 10 or more, for example, 30 or more, preferably 50 or more, more preferably 60 or more, still more preferably 70 or more can be selected from the group d).
In addition, an atopic dermatitis test chip comprising a combination of a gene selected from group a) and a gene selected from group c) is also effective for improving the test accuracy. Similarly, an atopic dermatitis test chip comprising a combination of a gene selected from group b) and a gene selected from group d) is also effective for increasing the test accuracy. In the DNA chip for psoriasis diagnosis, a plurality of indicator genes can be combined in the same manner as the DNA chip for AD diagnosis.
Furthermore, the psoriasis test chip according to the present invention can be obtained by combining the psoriasis index genes described in i) to iv) above. The psoriasis index gene can be combined in the same manner as the above-described chip for atopic dermatitis test.
It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference. Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples.

（２） ヒト皮膚からのジーンチップ解析用のＲＮＡ調製
採取した３個の皮膚ｂｉｏｐｓｙ（直径３ｍｍ）をＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に浸漬し、ウルトラタックスＴ８ホモジナイザー（ＩＫＡ社）を使用してホモジナイズした。ホモジナイズ以降の操作はＩｓｏｇｅｎのマニュアルに従い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿を回収した。沈殿は７５％エタノールでリンス、遠心を行い、沈殿をｔｏｔａｌ ＲＮＡとして回収した。回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、そのマニュアルに従って更に精製した。
（３） ジーンチップ用のｃＤＮＡ合成
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２−５μｇから、Ｔ７−（ｄＴ）_２４（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をプライマーとして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌの方法に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて逆転写し、１本鎖ｃＤＮＡを作製した。
Ｔ７−（ｄＴ）_２４プライマーは、以下のようにＴ７プロモーターの塩基配列に（ｄＴ）_２４を付加した塩基配列からなる。

次に、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌに従い、ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ，ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩおよびＲＮａｓｅ Ｈを加え、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出後、Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌｓに供し、エタノール沈殿により精製した。
さらに、ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを用い、ビオチンラベルしたｃＲＮＡを合成した。ＲＮｅａｓｙ Ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＲＮＡを精製し、熱処理により断片化した。
そのうち１０μｇのｃＲＮＡをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌに従いＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌに加えた。これをＤＮＡチップに入れ、４５℃で１６時間ハイブリダイゼーションした。ＤＮＡチップとしてはＧｅｎｅＣｈｉｐ^（Ｒ） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５Ａｖ２，Ｂ，Ｃ，Ｄ，およびＥ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いた。
ＤＮＡチップを洗浄した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、ｎｏｒｍａｌヤギＩｇＧとビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジンＩｇＧ抗体の混合液をアレイに加えた。さらに、蛍光強度を増強する目的で、再度Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、スキャナーにセットし、ＤＮＡチップ解析ソフトにて解析した。
（４） ＤＮＡチップ解析
ＤＮＡチップ解析ソフトであるＳｕｉｔｅを用いて発現蛍光強度を測定し、データ解析を行った。まず全てのチップについてＡｂｓｏｌｕｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓを行い、用いたサンプル各々の遺伝子発現量を測定した。
１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔに対応するチップデータの解析は、プローブセットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比較して、ｐｏｓｉｔｉｖｅとｎｅｇａｔｉｖｅを決定した。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ，Ｌｏｇ Ａｖｇ，Ｐｏｓ／Ｎｅｇの値から判定されるＡｂｓｏｌｕｔｅ ＣａｌｌであるＰ（ｐｒｅｓｅｎｔ）、Ａ（ａｂｓｅｎｔ）、およびＭ（ｍａｒｇｉｎａｌ）の３区分の判定を行った。用語定義は以下に示した。
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅなペアの割合
Ｌｏｇ Ａｖｇ；パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度比の対数の平均
Ｐｏｓ／Ｎｅｇ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅペア数とＮｅｇａｔｉｖｅペア数の比
また、パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度の差の平均値であるＡｖｅｒａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ａｖｇ Ｄｉｆｆ）も計算した。
サンプル間の遺伝子発現を比較する場合には、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅに従いＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓを行った。各チップの全プローブセットの蛍光強度の平均値が一定になるように蛍光強度を補正した。
アトピー性皮膚炎患者の無疹部と急性病変部間で発現変動する遺伝子の解析
１０例の各患者の無疹部における遺伝子発現と急性病変部における遺伝子発現をＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓによって比較解析し、急性病変部で無疹部と比べて２倍以上発現が増加している遺伝子、１／２以下に発現が減少している遺伝子を選択した。患者ごとに選んできた遺伝子について、今度は１０例の患者のうち６例以上で共通変動している遺伝子を選択した。選択した遺伝子の遺伝子名と各症例における発現プロファイルを表２〜表６に示した。複数のアトピー性皮膚炎患者で共通変動しているこれらの遺伝子はアトピー性皮膚炎の病態形成に重要な役割を果たしていると考えられ、診断マーカーや治療のターゲットとしての重要性が示唆される。

〔実施例２〕 ヒトのアトピー性皮膚炎とマウス皮膚炎モデルの比較
ヒトアトピー性皮膚炎の無疹部と皮疹部間で発現変動している遺伝子とマウス皮膚炎モデルの非感作皮膚と感作皮膚間で発現変動している遺伝子を比較解析した。両者の間で共通して変動している遺伝子群を選ぶことができれば、その遺伝子についてノックアウトマウスあるいはトランスジェニックマウスを作製することにより、皮膚炎病態におけるその遺伝子の重要性を評価することができる。
また、その遺伝子が液性因子あるいは膜蛋白質をコードしている場合には、中和抗体、液性因子そのもの、あるいは可溶性レセプターなどを実験動物に投与することができる。その結果、遺伝子改変マウスを利用した場合に比べて短期間で、その遺伝子のヒト皮膚炎病態における重要性を評価できる。ヒトのアトピー性皮膚炎の皮膚検体を用いた遺伝子発現解析によって見出された病態関連遺伝子の重要性を評価する目的で、マウス皮膚炎モデルの遺伝子発現プロファイルを解析し、ヒトのアトピー性皮膚炎と比較した。
（１） ＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚炎モデルの作製
ＳＰＦ ＮＣ／Ｎｇａマウス（♂・６週齢）の耳介部と背部皮膚にダニ抗原（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ ５μｇ／部位）を３日間隔で計９回皮内投与した。耳浮腫の測定と背部皮膚の症状を週１回の割合で観察した。血中のｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度については、ダニ抗原投与前、投与開始１４日後、２８日後に採血を行い、マウスＩｇＥ測定キット（ヤマサ醤油）にて測定した。コントロールとして非感作群を取り、各群２０匹（１０匹：ダニ抗原投与開始１４日後解剖、１０匹：ダニ抗原投与開始２８日後解剖）で試験を行った。
ダニ抗原投与１４日後解剖および２８日解剖のいずれの試験においても非感作群では耳浮腫は認められなかった。一方、感作群ではダニ抗原投与１週間後より明らかな耳の肥厚を示し、２週間後以降高値を維持した（表７）。また、血中のｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度は、感作群においてダニ抗原投与２週間後より濃度の上昇が認められた（表８）。これらの結果に加え、病理学的検査の結果、感作群の耳介皮膚では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球ならびにリンパ球）、浮腫、結合組織の増生およびマスト細胞の脱顆粒等が軽度から中等度の変化で観察され、皮膚炎病態を形成していることが確認できた。

（２） マウス皮膚からのジーンチップ解析用のＲＮＡ調製
非感作マウスおよび感作マウス（感作後１４日と２８日）より耳介皮膚および背部皮膚を回収し、Ｉｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に浸漬し、ホモジナイザー（ＮＳ−３１０Ｅ；（株）日音医理科器械製作所）を使用して氷冷下にホモジナイズした。ホモジナイズ以降の操作はＩｓｏｇｅｎのマニュアルに従い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿を回収した。沈殿は７５％エタノールでリンス、遠心を行い、沈殿をｔｏｔａｌ ＲＮＡとして回収した。回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、そのマニュアルに従って更に精製した。
（３） ジーンチップ用のｃＤＮＡ合成
１群１０匹の各個体の耳介から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡをまとめ、そのｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２−５μｇから、Ｔ７−（ｄＴ）_２４（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をプライマーとして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌの方法に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて逆転写し、１本鎖ｃＤＮＡを作製した。
Ｔ７−（ｄＴ）_２４プライマーは、以下のようにＴ７プロモーターの塩基配列に（ｄＴ）_２４を付加した塩基配列からなる。

次に、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌに従い、ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ，ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩおよびＲＮａｓｅ Ｈを加え、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出後、Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌｓに供し、エタノール沈殿により精製した。
さらに、ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを用い、ビオチンラベルしたｃＲＮＡを合成した。ＲＮｅａｓｙ Ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＲＮＡを精製し、熱処理により断片化した。
そのうち１０μｇのｃＲＮＡをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌに従いＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌに加えた。これをＤＮＡチップに入れ、４５℃で１６時間ハイブリダイゼーションした。ＤＮＡチップとしてはＧｅｎｅＣｈｉｐ^（Ｒ） Ｍｕｒｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ７４Ａｖ２，Ｂｖ２，Ｃｖ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いた。
ＤＮＡチップを洗浄した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、ｎｏｒｍａｌヤギＩｇＧとビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジンＩｇＧ抗体の混合液をアレイに加えた。さらに、蛍光強度を増強する目的で、再度Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、スキャナーにセットし、ＤＮＡチップ解析ソフトにて解析した。
（４） ＤＮＡチップ解析
ＤＮＡチップ解析ソフトであるＳｕｉｔｅを用いて発現蛍光強度を測定し、データ解析を行った。まず全てのチップについてＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅに従いＡｂｓｏｌｕｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓを行い、用いたサンプル各々の遺伝子発現量を測定した。
１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔに対応するチップデータの解析は、プローブセットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比較して、ｐｏｓｉｔｉｖｅとｎｅｇａｔｉｖｅを決定した。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ，Ｌｏｇ Ａｖｇ，Ｐｏｓ／Ｎｅｇの値から判定されるＡｂｓｏｌｕｔｅ ＣａｌｌであるＰ（ｐｒｅｓｅｎｔ）、Ａ（ａｂｓｅｎｔ）、およびＭ（ｍａｒｇｉｎａｌ）の３区分の判定を行った。
用語定義は以下に示した。
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅなペアの割合
Ｌｏｇ Ａｖｇ；パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度比の対数の平均
Ｐｏｓ／Ｎｅｇ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅペア数とＮｅｇａｔｉｖｅペア数の比
また、パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度の差の平均値であるＡｖｅｒａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ａｖｇ Ｄｉｆｆ）も計算した。
サンプル間の遺伝子発現を比較する場合には、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅに従いＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓを行った。各チップの全プローブセットの蛍光強度の平均値が一定になるように蛍光強度を補正した。
ダニ抗原感作皮膚と非感作皮膚間で発現変動する遺伝子
感作マウス耳介皮膚における遺伝子発現と非感作マウス耳介皮膚における遺伝子発現をＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓによって比較解析し、感作１４日後あるいは２８日後のマウス耳介皮膚において非感作耳介皮膚と比べて２倍以上発現が増加している遺伝子（データ３）および１／２以下に発現が減少している遺伝子（データ４）を選択した。これら遺伝子群とヒトのアトピー性皮膚炎の無疹部と急性病変部間で発現変動した遺伝子群を比較した結果を表９および表１０に示した。共通変動を示した遺伝子については、このマウス皮膚炎モデルにおいてノックアウトマウスあるいはトランスジェニックマウスを作製することにより、皮膚炎病態における重要性を評価することができる。また、液性因子や膜蛋白質については皮膚炎モデルマウスに中和抗体を投与、あるいは液性因子そのものや可溶性膜蛋白質を投与することにより、その遺伝子の重要性を評価できる。

以上の解析の結果に基づいて、アトピー性皮膚炎の指標とすることができる遺伝子として次に示す遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、いずれも本発明における指標遺伝子として用いることができる。以下に示す各遺伝子のデータは、いずれも、左から順に次の情報を記載している。各情報はスラッシュ（／）で区切って示している。また指標遺伝子は、各遺伝子の機能にしたがって、分類した。分類された機能を＝で示した。
「遺伝子名」
「プローブ」（ＧｅｎｅＣｈｉｐにおけるプローブＩＤ）
「プローブの塩基配列のデザインのために用いられた塩基配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「各指標遺伝子の塩基配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「各指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」（当該遺伝子を報告した論文、および塩基配列を配列表に記載したものについてはその配列番号）

また以上の解析の結果に基づいて、アトピー性皮膚炎の指標とすることができるマウス由来の遺伝子として次に示す遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、いずれも本発明における指標遺伝子として用いることができる。以下に示す各遺伝子のデータは、いずれも、左から順に次の情報を記載している。各情報はスラッシュ（／）で区切って示している。各遺伝子の機能は、対応するヒト遺伝子の記載に基づいて明らかにすることができる。
「マウス遺伝子名およびシンボル」
「プローブ」（ＧｅｎｅＣｈｉｐにおけるプローブＩＤ）
「プローブの塩基配列のデザインのために用いられた塩基配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「各指標遺伝子の塩基配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「当該遺伝子の塩基配列を示す配列番号」
「各指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「当該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を示す配列番号」
「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」（当該遺伝子を報告した論文）
「対応するヒト遺伝子のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「対応するヒト遺伝子の遺伝子名」

〔実施例３〕 アトピー性皮膚炎患者皮膚組織における、アフィメトリックス社ジーンチップによるディファレンシャル発現解析２
アトピー性皮膚炎患者の皮膚組織で発現変動している新しい治療標的遺伝子あるいは診断に有用な遺伝子を見出すことを目的として、アトピー性皮膚炎患者の無疹部、急性病変部と健常人の正常皮膚で発現している遺伝子について、ジーンチップを用いたディファレンシャルな発現比較解析を行った。
アトピー性皮膚炎患者１２例、健常人７例から同意を得て、患者からは無疹部と急性病変部を、健常人からは正常皮膚を、各部位からそれぞれ３個の皮膚検体（直径３ｍｍ）を採取した。急性病変部位は日本皮膚科学会の診断基準に基づき判定した。皮膚を採取したアトピー性皮膚炎患者の診療情報は上記表１に示した通りである。
ヒト皮膚からのジーンチップ解析用のＲＮＡ調製、ジーンチップ用のｃＤＮＡ合成、ＤＮＡチップ解析は実施例１に従って行った。
アトピー性皮膚炎患者の無疹部と健常人の正常組織間で発現変動する遺伝子の解 折
１０例の各患者の無疹部における遺伝子発現と健常人６例の正常組織における遺伝子発現の比較にＤＮＡチップ解析ソフトであるＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ４．２（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を用いた。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌに従い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社解析ソフトＳｕｉｔｅ４．２によるＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓの結果をＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇに取り込み、同一チップ上の全ての遺伝子について各遺伝子のＡｖｅｒａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値をそのｍｅｄｉａｎ値で割り、チップ内補正値（補正値Ａ）を得た。さらに各遺伝子について、使用した全てのチップにおける補正値Ａをそのｍｅｄｉａｎ値で割ることにより補正値Ｂを得た。補正値Ｂを用いてマン・ホイットニ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔ）を行い、患者無疹部と健常皮膚間で発現量に有意差のある遺伝子を選択した。選択した遺伝子群について、更に、患者無疹部と健常皮膚における各遺伝子の発現量の平均値を比較して２倍以上差のある遺伝子を選択した。患者無疹部に比較して健常皮膚で発現の高い遺伝子については健常人６例のうち４例以上でＰ（ｐｒｅｓｅｎｔ）となる遺伝子のみを選択し、患者無疹部で発現の高い遺伝子については患者１０例のうち６例以上でＰとなる遺伝子のみを選択した。結果を表１１〜表１６に示した。

以上の解析の結果に基づいて、アトピー性皮膚炎の指標とすることができる遺伝子として次に示す遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、いずれも本発明における指標遺伝子として用いることができる。以下に示す各遺伝子のデータは、いずれも、左から順に次の情報を記載している。各情報はスラッシュ（／）で区切って示している。また指標遺伝子は、各遺伝子の機能にしたがって、分類した。分類された機能を＝で示した。
「遺伝子名」
「プローブ」（ＧｅｎｅＣｈｉｐにおけるプローブＩＤ）
「プローブの塩基配列のデザインのために用いられた塩基配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「各指標遺伝子の塩基配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「各指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」（当該遺伝子を報告した論文）

〔実施例４〕 アトピー性皮膚炎患者の皮膚組織と乾癬患者の皮膚組織間での遺伝子発現の比較
代表的な２つの炎症性皮膚疾患の炎症局所における遺伝子発現を比較することにより、アトピー性皮膚炎特異的な変動を示す遺伝子、乾癬特異的な変動を示す遺伝子、両疾患で共通変動する遺伝子を同定することができる。実施例１で選択された遺伝子群の中からアトピー性皮膚炎病態において特異的な発現変動を示す遺伝子を選択することを目的に、乾癬患者の皮膚組織における遺伝子発現解析を行い、アトピー性皮膚炎患者の皮膚組織における遺伝子発現解析結果と比較した。
乾癬患者６例から同意を得て、無疹部と病変部を各部位からそれぞれ３個の皮膚検体（直径３ｍｍ）を採取した。ヒト皮膚からのジーンチップ解析用のＲＮＡ調製、ジーンチップ用のｃＤＮＡ合成、ＤＮＡチップ解析は実施例１に従って行った。
アトピー性皮膚炎患者と乾癬患者の無疹部と皮疹部間で発現変動する遺伝子群の 比較
６例の乾癬患者の無疹部における遺伝子発現と皮疹部における遺伝子発現をＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓによって比較解析を行い、無疹部と比べて皮疹部で２倍以上発現が増加している遺伝子、１／２以下に発現が減少している遺伝子を選択した。患者ごとに選んできた遺伝子について、今度は６例の患者のうち４例以上で共通変動している遺伝子を選択した。これらの遺伝子群について、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ後のＡｖｅｒａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値を用いてウィルコクソン符号付順位和検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋｓ ｔｅｓｔ）を行い、ｐ値を算出した。選択した遺伝子群と実施例１で行ったアトピー性皮膚炎患者の無疹部と皮疹部間の比較で発現変動が認められた遺伝子群を比較することにより、アトピー性皮膚炎と乾癬で共通変動する遺伝子、アトピー性皮膚炎でのみ発現変動を示す遺伝子、乾癬でのみ発現変動を示す遺伝子を同定した。
アトピー性皮膚炎と乾癬で共通変動した遺伝子群を表１７〜表２５に、アトピー性皮膚炎でのみ発現変動を示した遺伝子群を表２６〜表３３に、乾癬でのみ発現変動を示した遺伝子を表３４〜表４９に示した。

健常人の正常組織とアトピー性皮膚炎患者および乾癬患者の無疹部間で発現変動する遺伝子群の比較
６例の乾癬患者の無疹部における遺伝子発現と健常人６例の正常組織における遺伝子発現の比較にＤＮＡチップ解析ソフトであるＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ４．２（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を用いた。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌに従い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社解析ソフトＳｕｉｔｅ４．０によるＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓの結果をＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ４．２に取り込んだ。同一チップ上の全ての遺伝子について各遺伝子のＡｖｅｒａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値をそのｍｅｄｉａｎ値で割り、チップ内補正値（補正値Ａ）を得た。
さらに各遺伝子について、使用した全てのチップにおける補正値Ａをそのｍｅｄｉａｎ値で割ることにより補正値Ｂを得た。補正値Ｂを用いてマン・ホイットニ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ ｔｅｓｔ）を行い、患者無疹部と健常皮膚間で発現量に有意差のある遺伝子を選択した。選択した遺伝子群について、更に、患者無疹部と健常皮膚における各遺伝子の発現量の平均値を比較して２倍以上差のある遺伝子を選択した。
患者無疹部に比較して健常皮膚で発現の高い遺伝子については健常人６例のうち４例以上でＰ（ｐｒｅｓｅｎｔ）となる遺伝子のみを選択し、患者無疹部で発現の高い遺伝子については患者６例のうち４例以上でＰとなる遺伝子のみを選択した。選択した遺伝子群と実施例３で行った健常人正常組織とアトピー性皮膚炎患者無疹部間の比較で発現変動が認められた遺伝子群を比較することにより、アトピー性皮膚炎と乾癬で共通変動する遺伝子、アトピー性皮膚炎でのみ発現変動を示す遺伝子、乾癬でのみ発現変動を示す遺伝子を同定した。
アトピー性皮膚炎と乾癬で共通変動した遺伝子群を表５０〜表５１に、アトピー性皮膚炎でのみ発現変動を示した遺伝子群を表５２〜表５５に、乾癬でのみ発現変動を示した遺伝子を表５６〜表６５に示した。各疾患特異的に発現変動するとして同定した遺伝子については、他方の疾患における発現プロファイルも表中に併記した。各疾患特異的変動遺伝子として同定した遺伝子の中には、他方の疾患においても統計的に有意な変動を示しているように見える遺伝子が認められるが、これらの遺伝子は全て我々の選択基準を満たさないものであった（２倍以下の変動倍率で有意差が認められたか、あるいはＧｅｎｅＣｈｉｐの検出限界以下の定量値を用いた統計解析で有意差が認められた遺伝子）。

以上の解析の結果に基づいて、乾癬の指標とすることができる遺伝子として次に示す遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、いずれも本発明における指標遺伝子として用いることができる。以下に示す各遺伝子のデータは、いずれも、左から順に次の情報を記載している。各情報はスラッシュ（／）で区切って示している。また指標遺伝子は、各遺伝子の機能にしたがって、分類した。分類された機能を＝＝で示した。
「遺伝子名」
「プローブ」（ＧｅｎｅＣｈｉｐにおけるプローブＩＤ）
「プローブの塩基配列のデザインのために用いられた塩基配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「各指標遺伝子の塩基配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「各指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」（当該遺伝子を報告した論文）

〔実施例５〕 ヒトのアトピー性皮膚炎とマウス皮膚炎モデルの比較２
ヒトのアトピー性皮膚炎の皮膚検体を用いた遺伝子発現解析によって見出された病態関連遺伝子の重要性を評価する目的で、マウス皮膚炎モデルの遺伝子発現プロファイルを解析し、ヒトのアトピー性皮膚炎と比較した。
ＤＮＦＢ反復塗布接触性皮膚炎モデルマウスは、永井らの方法（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７ Ｄｅｃ；１００（６ Ｐｔ ２）：Ｓ３９−４４）に従って作製した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（♂・７〜１０週齢）の耳介部に週１回の割合で合計５回、ｖｅｈｉｃｌｅ（アセトンとオリーブオイルを３：１の割合で混合した溶媒）に溶解した０．１５％のＤｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（ＤＮＦＢ）溶液２５μｌを塗布した。
２回目のＤＮＦＢ塗布２４時間後から耳介の浮腫が観察され、３、４、５回と塗布回数を重ねるに従って塗布２４時間後の浮腫率も増加した。一方、ｖｅｈｉｃｌｅ塗布群では耳浮腫は観察されなかった。また、血中の特異的ＩｇＥおよびｔｏｔａｌ ＩｇＥ濃度は、ＤＮＦＢ塗布群で５回目のＤＮＦＢ塗布４時間後の測定でＤＮＦＢ塗布前（試験開始時）に比べて著しい上昇が認められたのに対し、ｖｅｈｉｃｌｅ塗布群では上昇が認められなかった。更に、病理組織学的解析の結果、５回目のＤＮＦＢ塗布２４時間後の耳介皮膚組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球など）、表皮の肥厚が認められ、皮膚炎病態の形成が観察できた。
ＤＮＦＢ塗布またはＶｅｈｉｃｌｅ塗布群からそれぞれ２匹の個体を選択し、１、３、５回目の塗布前と塗布４時間後の耳介皮膚を採取した。マウス皮膚からのジーンチップ解析用のＲＮＡ調製、ジーンチップ用のｃＤＮＡ合成、ＤＮＡチップ解析は実施例２に従って行った。
ＤＮＦＢ反復塗布耳介皮膚（接触性皮膚炎病変部）で発現変動する遺伝子とヒトアト ピー性皮膚炎皮膚組織で発現変動する遺伝子の比較
ＤＮＦＢ塗布耳介皮膚における遺伝子発現とＶｅｈｉｃｌｅ塗布耳介皮膚における遺伝子発現をＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓによって比較解析し、ＤＮＦＢ塗布１、３、５回目のそれぞれで塗布前と塗布４時間後の比較で２倍以上発現が増加している遺伝子および１／２以下に発現が減少している遺伝子を急性病変部で変動する遺伝子として選択した。また、３回目および５回目のＤＮＦＢ塗布前と１回目の塗布前の比較で２倍以上発現が増加している遺伝子および１／２以下に発現が減少している遺伝子を慢性病変部で変動する遺伝子として選択した。
これら遺伝子群とヒトのアトピー性皮膚炎の無疹部と急性病変部間で発現変動した遺伝子群を比較した結果を表６６〜表６７に示した。共通変動を示した遺伝子については、このマウス皮膚炎モデルにおいてノックアウトマウスあるいはトランスジェニックマウスを作製することにより、皮膚炎病態における重要性を評価することができる。また、液性因子や膜蛋白質については皮膚炎モデルマウスに中和抗体を投与、あるいは液性因子そのものや可溶性膜蛋白質を投与することにより、その遺伝子の重要性を評価できる。

また以上の解析の結果に基づいて、皮膚炎に関連するマウス由来の遺伝子として次に示す遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、いずれも本発明における指標遺伝子として用いることができる。以下に示す各遺伝子のデータは、いずれも、左から順に次の情報を記載している。各情報はスラッシュ（／）で区切って示している。各遺伝子の機能は、対応するヒト遺伝子の記載に基づいて明らかにすることができる。
「マウス遺伝子名およびシンボル」
「プローブ」（ＧｅｎｅＣｈｉｐにおけるプローブＩＤ）
「プローブの塩基配列のデザインのために用いられた塩基配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「各指標遺伝子の塩基配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「当該遺伝子の塩基配列を示す配列番号」
「各指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「当該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を示す配列番号」
「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」（当該遺伝子を報告した論文）
「対応するヒト遺伝子のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッションナンバー」
「対応するヒト遺伝子の遺伝子名」

[Example 1] Differential expression analysis by Affymetrix GeneChip in the skin tissue of atopic dermatitis patients
  In order to find new therapeutic target genes or genes useful for diagnosis that change in expression in the skin tissue of patients with atopic dermatitis, the rash area, acute lesions of normal patients and normal skin of healthy persons A differential expression analysis using a gene chip was performed on the genes expressed in (2).
(1) Obtaining skin samples
  The consent was obtained from 12 patients with atopic dermatitis and 4 healthy subjects, the rash and acute lesions from patients, normal skin from healthy subjects, and 3 skin specimens (diameter 3 mm each) from each site. ) Was collected. The acute lesion site was determined based on the diagnostic criteria of the Japanese Dermatological Association (Journal of Japanese Dermatology 104: 1210 (1994)). Table 1 shows clinical information of patients with atopic dermatitis from which the skin was collected.

(2) Preparation of RNA for gene chip analysis from human skin
  Three collected skin biopsies (diameter 3 mm) were immersed in Isogen (Nippon Gene; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and homogenized using an Ultratax T8 homogenizer (IKA). Following the homogenization, total RNA was extracted according to the manual of Isogen. Chloroform was added and stirred and centrifuged to recover the aqueous layer. Next, isopropanol was added, and the precipitate was collected by stirring and centrifugation. The precipitate was rinsed with 75% ethanol and centrifuged, and the precipitate was recovered as total RNA. The recovered total RNA was further purified using RNeasy Mini kit (QIAGEN) according to the manual.
(3) cDNA synthesis for gene chips
  From Total RNA 2-5 μg, T7- (dT)₂₄(Amersham Pharmacia Biotech) was used as a primer in accordance with Affymetrix's Expression Analysis Technical Manual method.
  T7- (dT)₂₄The primer is added to the base sequence of the T7 promoter as follows (dT)₂₄It consists of a base sequence to which

  Next, according to Expression Analysis Technical Manual, DNA ligase, DNA polymerase I and RNase H were added to synthesize a double-stranded cDNA. The cDNA was extracted with phenol / chloroform, subjected to Phase Lock Gels, and purified by ethanol precipitation.
  In addition, bioarray-labeled cRNA was synthesized using BioArray High Yield RNA Transcription Labeling Kit. CRNA was purified using RNeasy Spin column (QIAGEN) and fragmented by heat treatment.
  Of these, 10 μg of cRNA was added to the Hybridization Cocktail according to the Expression Analysis Technical Manual. This was placed in a DNA chip and hybridized at 45 ° C. for 16 hours. GeneChip as a DNA chip^(R)  Human Genome U95Av2, B, C, D, and E (Affymetrix) were used.
  After washing the DNA chip, Streptavidin-Phycoerythrin was added and stained. After washing, a mixture of normal goat IgG and biotinylated goat anti-streptavidin IgG antibody was added to the array. Furthermore, for the purpose of enhancing the fluorescence intensity, Streptavidin-Phycoerythrin was added again and stained. After washing, it was set on a scanner and analyzed with DNA chip analysis software.
(4) DNA chip analysis
  The intensity of expression fluorescence was measured using Suite, which is DNA chip analysis software, and data analysis was performed. First, absolute analysis was performed on all the chips, and the gene expression level of each sample used was measured.
  In the analysis of chip data corresponding to 1 transscript, the positive and negative fluorescence intensities of the probe set were compared to determine positive and negative. Three classifications were performed: P (present), A (absent), and M (marginal), which are absolute calls determined from the values of Positive Fraction, Log Avg, and Pos / Neg. Term definitions are shown below.
Positive Fraction: Ratio of positive pairs
Log Avg; logarithmic average of the fluorescence intensity ratio of the perfect match and mismatch probe cells
Pos / Neg: Ratio of the number of positive pairs and the number of negative pairs
  Also, Average Difference (Avg Diff), which is an average value of the difference in fluorescence intensity between the perfect match and mismatch probe cells, was calculated.
  When comparing the gene expression between samples, Comparison analysis was performed according to GeneChip Analysis Suite User Guide. The fluorescence intensity was corrected so that the average value of the fluorescence intensity of all probe sets on each chip was constant.
Analysis of genes whose expression changes between non-eruption and acute lesions in patients with atopic dermatitis
  The gene expression in the rash area and the gene expression in the acute lesion area of each of the 10 patients were compared and analyzed by Comparison analysis, and the gene whose expression increased more than twice in the acute lesion area compared to the rash area, A gene whose expression decreased to 2 or less was selected. About the gene selected for every patient, the gene which changes in common in 6 or more out of 10 patients this time was selected. The gene names of the selected genes and the expression profiles in each case are shown in Tables 2 to 6. These genes, which are commonly fluctuated among multiple patients with atopic dermatitis, are thought to play an important role in the pathogenesis of atopic dermatitis, suggesting their importance as diagnostic markers and therapeutic targets.

[Example 2] Comparison of human atopic dermatitis and mouse dermatitis model
  We analyzed the genes whose expression changes between the non-eruption and rash areas of human atopic dermatitis and the genes whose expression changes between non-sensitized and sensitized skin in the mouse dermatitis model. If a gene group fluctuating in common between the two can be selected, the importance of the gene in the pathology of dermatitis can be evaluated by preparing a knockout mouse or a transgenic mouse for the gene.
  When the gene encodes a humoral factor or a membrane protein, a neutralizing antibody, the humoral factor itself, a soluble receptor, or the like can be administered to an experimental animal. As a result, it is possible to evaluate the importance of the gene in the pathology of human dermatitis in a shorter period of time than when genetically modified mice are used. In order to evaluate the importance of pathologically related genes found by gene expression analysis using human atopic dermatitis skin specimens, we analyzed gene expression profiles of mouse dermatitis models, and human atopic dermatitis Compared with.
(1) Preparation of NC / Nga mouse dermatitis model
  Mite antigen (Dermatophagoides pteronyssinus 5 μg / site) was intradermally administered 9 times at intervals of 3 days to the auricle and back skin of SPF NC / Nga mice (♂, 6 weeks old). Ear edema measurements and back skin symptoms were observed once a week. The total IgE concentration in blood was measured with a mouse IgE measurement kit (Yamasa Soy Sauce) before tick antigen administration, 14 days after administration start, and 28 days after administration. A non-sensitized group was taken as a control, and the test was performed with 20 animals in each group (10 animals: dissected 14 days after starting mite antigen administration, 10 animals: dissected 28 days after starting mite antigen administration).
  Ear edema was not observed in the non-sensitized group in both the 14 day autopsy and 28 day autopsy studies. On the other hand, in the sensitized group, the ear thickening was apparent from 1 week after mite antigen administration, and remained high after 2 weeks (Table 7). Further, the total IgE concentration in blood increased in the sensitized group after 2 weeks from the tick antigen administration (Table 8). In addition to these results, as a result of pathological examination, in the auricular skin of the sensitized group, thickening of the epidermis, inflammatory cell infiltration (neutrophils, eosinophils and lymphocytes), edema in the dermis and subcutaneous tissue The growth of connective tissue and degranulation of mast cells were observed with mild to moderate changes, confirming the formation of a dermatitis condition.

(2) Preparation of RNA for gene chip analysis from mouse skin
  Auricular skin and back skin were collected from non-sensitized mice and sensitized mice (14 and 28 days after sensitization), immersed in Isogen (Nippon Gene; Wako Pure Chemical Industries), and homogenizer (NS-310E; ) And homogenized under ice cooling. Following the homogenization, total RNA was extracted according to the manual of Isogen. Chloroform was added and stirred and centrifuged to recover the aqueous layer. Next, isopropanol was added, and the precipitate was collected by stirring and centrifugation. The precipitate was rinsed with 75% ethanol and centrifuged, and the precipitate was recovered as total RNA. The recovered total RNA was further purified using RNeasy Mini kit (QIAGEN) according to the manual.
(3) cDNA synthesis for gene chips
  Total RNA extracted from the pinna of each group of 10 individuals was collected, and from 2-5 μg of the total RNA, T7- (dT)₂₄(Amersham Pharmacia Biotech) was used as a primer in accordance with Affymetrix's Expression Analysis Technical Manual method.
  T7- (dT)₂₄The primer is added to the base sequence of the T7 promoter as follows (dT)₂₄It consists of a base sequence to which

  Next, according to Expression Analysis Technical Manual, DNA ligase, DNA polymerase I and RNase H were added to synthesize a double-stranded cDNA. The cDNA was extracted with phenol / chloroform, subjected to Phase Lock Gels, and purified by ethanol precipitation.
  In addition, bioarray-labeled cRNA was synthesized using BioArray High Yield RNA Transcription Labeling Kit. CRNA was purified using RNeasy Spin column (QIAGEN) and fragmented by heat treatment.
  Of these, 10 μg of cRNA was added to the Hybridization Cocktail according to the Expression Analysis Technical Manual. This was placed in a DNA chip and hybridized at 45 ° C. for 16 hours. GeneChip as a DNA chip^(R)  Murine Genome U74Av2, Bv2, Cv2 (made by Affymetrix) was used.
  After washing the DNA chip, Streptavidin-Phycoerythrin was added and stained. After washing, a mixture of normal goat IgG and biotinylated goat anti-streptavidin IgG antibody was added to the array. Furthermore, for the purpose of enhancing the fluorescence intensity, Streptavidin-Phycoerythrin was added again and stained. After washing, it was set on a scanner and analyzed with DNA chip analysis software.
(4) DNA chip analysis
  The intensity of expression fluorescence was measured using Suite, which is DNA chip analysis software, and data analysis was performed. First, absolute analysis was performed on all the chips in accordance with GeneChip Analysis Suite User Guide, and the gene expression level of each of the samples used was measured.
  In the analysis of chip data corresponding to 1 transscript, the positive and negative fluorescence intensities of the probe set were compared to determine positive and negative. Three classifications were performed: P (present), A (absent), and M (marginal), which are absolute calls determined from the values of Positive Fraction, Log Avg, and Pos / Neg.
Term definitions are shown below.
Positive Fraction: Ratio of positive pairs
Log Avg; logarithmic average of the fluorescence intensity ratio of the perfect match and mismatch probe cells
Pos / Neg: Ratio of the number of positive pairs and the number of negative pairs
  Also, Average Difference (Avg Diff), which is an average value of the difference in fluorescence intensity between the perfect match and mismatch probe cells, was calculated.
  When comparing the gene expression between samples, Comparison analysis was performed according to GeneChip Analysis Suite User Guide. The fluorescence intensity was corrected so that the average value of the fluorescence intensity of all probe sets on each chip was constant.
Genes whose expression varies between tick antigen-sensitized skin and non-sensitized skin
  Gene expression in sensitized mouse auricular skin and gene expression in non-sensitized mouse auricular skin were compared and analyzed by comparison analysis, compared to non-sensitized auricular skin in mouse auricular skin 14 or 28 days after sensitization. A gene whose expression was increased by 2 times or more (data 3) and a gene whose expression was decreased to 1/2 or less (data 4) were selected. Tables 9 and 10 show the results of comparing these gene groups with the gene groups whose expression changes between the non-eruption part and the acute lesion part of human atopic dermatitis. About the gene which showed the common fluctuation | variation, the importance in a dermatitis pathological condition can be evaluated by producing a knockout mouse or a transgenic mouse in this mouse dermatitis model. Regarding humoral factors and membrane proteins, the importance of the gene can be evaluated by administering neutralizing antibodies to dermatitis model mice, or administering humoral factors themselves or soluble membrane proteins.

  Based on the results of the above analysis, the following genes were identified as genes that can be used as indicators of atopic dermatitis. Any of these genes can be used as an indicator gene in the present invention. Each gene data shown below describes the following information in order from the left. Each information is shown separated by a slash (/). The indicator genes were classified according to the function of each gene. The classified functions are indicated by =.
"Gene name"
“Probe” (probe ID in GeneChip)
"Base sequence database (GenBank) accession number used for probe sequence design"
"Base sequence database of each index gene (GenBank) accession number"
"Database of amino acid sequences encoded by each indicator gene (GenBank) accession number"
“Reference” (the article that reported the gene and the sequence number of the nucleotide sequence described in the sequence listing)

  Based on the results of the above analysis, the following genes were identified as mouse-derived genes that can be used as indicators of atopic dermatitis. Any of these genes can be used as an indicator gene in the present invention. Each gene data shown below describes the following information in order from the left. Each information is shown separated by a slash (/). The function of each gene can be clarified based on the description of the corresponding human gene.
"Mouse gene names and symbols"
“Probe” (probe ID in GeneChip)
"Base sequence database (GenBank) accession number used for probe sequence design"
"Base sequence database of each index gene (GenBank) accession number"
"Sequence number indicating the base sequence of the gene"
"Database of amino acid sequences encoded by each indicator gene (GenBank) accession number"
“SEQ ID NO: showing the amino acid sequence encoded by the gene”
"Reference" (the paper reporting the gene)
Corresponding human gene database (GenBank) accession number
"Gene name of the corresponding human gene"

[Example 3] Differential expression analysis 2 by Affymetrix GeneChip in the skin tissue of patients with atopic dermatitis 2
  In order to find new therapeutic target genes or genes useful for diagnosis that change in expression in the skin tissue of patients with atopic dermatitis, the rash area, acute lesions of normal patients and normal skin of healthy persons A differential expression analysis using a gene chip was performed on the genes expressed in (2).
  The consent was obtained from 12 patients with atopic dermatitis and 7 healthy subjects. The rash and acute lesions were obtained from the patients, the normal skin was obtained from the healthy subjects, and 3 skin samples (diameter 3 mm each) from each site. ) Was collected. The acute lesion site was determined based on the diagnostic criteria of the Japanese Dermatological Association. The medical information of patients with atopic dermatitis from which the skin has been collected is as shown in Table 1 above.
  RNA preparation for gene chip analysis from human skin, cDNA synthesis for gene chip, and DNA chip analysis were performed according to Example 1.
Analysis of genes whose expression fluctuates between the non-rash area of patients with atopic dermatitis and normal tissues of healthy individuals Occasionally
  GeneSpring 4.2 (Silicon Genetics), which is DNA chip analysis software, was used to compare the gene expression in the rash area of each of the 10 patients and the gene expression in the normal tissues of 6 healthy subjects. In accordance with GeneSpring User Manual, the results of Absolute Analysis by Affymetrix analysis software Suite 4.2 are imported into GeneSpring, and the average difference value of each gene is corrected by the median correction value for all genes on the same chip. A) was obtained. Further, for each gene, a correction value B was obtained by dividing the correction value A for all the chips used by its median value. Using the correction value B, a Mann-Whitney's U test was performed, and a gene having a significant difference in expression level between the patient's non-rash area and healthy skin was selected. About the selected gene group, the average value of the expression level of each gene in the patient non-eruption part and the healthy skin was compared, and a gene having a difference of 2 times or more was selected. For genes that are highly expressed in healthy skin compared to patients with no rash, select only genes that are P (present) in 4 or more of 6 healthy subjects, and genes that are highly expressed in patients without rash Only genes that were P in 6 or more of 10 patients were selected. The results are shown in Tables 11-16.

  Based on the results of the above analysis, the following genes were identified as genes that can be used as indicators of atopic dermatitis. Any of these genes can be used as an indicator gene in the present invention. Each gene data shown below describes the following information in order from the left. Each information is shown separated by a slash (/). The indicator genes were classified according to the function of each gene. The classified functions are indicated by =.
"Gene name"
“Probe” (probe ID in GeneChip)
"Base sequence database (GenBank) accession number used for probe sequence design"
"Base sequence database of each index gene (GenBank) accession number"
"Database of amino acid sequences encoded by each indicator gene (GenBank) accession number"
"Reference" (the paper reporting the gene)

[Example 4] Comparison of gene expression between the skin tissue of an atopic dermatitis patient and the skin tissue of a psoriasis patient
  By comparing the gene expression in the inflammatory area of two typical inflammatory skin diseases, genes that show atopic dermatitis-specific changes, genes that show psoriasis-specific changes, and genes that change in common in both diseases Can be identified. For the purpose of selecting genes showing specific expression fluctuations in the pathology of atopic dermatitis from the gene group selected in Example 1, gene expression analysis in the skin tissue of psoriasis patients was performed, and atopic dermatitis The results were compared with gene expression analysis results in the patient's skin tissue.
  The consent was obtained from 6 patients with psoriasis, and three skin specimens (diameter 3 mm) were collected from each site for the rash and lesions. RNA preparation for gene chip analysis from human skin, cDNA synthesis for gene chip, and DNA chip analysis were performed according to Example 1.
Gene groups that vary in expression between the rash and rash in patients with atopic dermatitis and psoriasis Comparison
  Comparative analysis of gene expression in the non-rash area and rash area of 6 patients with psoriasis by Comparison analysis, a gene whose expression is more than doubled in the rash area compared to the non-rash area, 1/2 The genes with reduced expression were selected below. Regarding the genes selected for each patient, genes that were commonly fluctuated in 4 or more out of 6 patients were selected. For these gene groups, Wilcoxon signed-ranks test was performed using the Average Difference value after Comparison analysis, and the p-value was calculated. By comparing the selected gene group and the gene group in which expression change was observed in the comparison between the non-eruption part and the eruption part of the patient with atopic dermatitis performed in Example 1, it was common in atopic dermatitis and psoriasis , Genes that show expression changes only in atopic dermatitis, and genes that show expression changes only in psoriasis were identified.
  Tables 17 to 25 show gene groups commonly changed in atopic dermatitis and psoriasis, Tables 26 to 33 show gene groups that showed expression changes only in atopic dermatitis, and genes showed expression changes only in psoriasis Are shown in Table 34 to Table 49.

  Comparison of gene groups whose expression varies between normal tissues of normal subjects and non-eruptions of patients with atopic dermatitis and psoriasis
  GeneSpring 4.2 (Silicon Genetics), which is DNA chip analysis software, was used to compare gene expression in the non-rash area of 6 psoriasis patients and gene expression in normal tissues of 6 healthy individuals. In accordance with GeneSpring User Manual, the results of Absolute Analysis by Affymetrix analysis software Suite 4.0 were imported into GeneSpring 4.2. For all genes on the same chip, the average difference value of each gene was divided by its median value to obtain an in-chip correction value (correction value A).
  Further, for each gene, a correction value B was obtained by dividing the correction value A for all the chips used by its median value. Using the correction value B, a Mann-Whitney's U test was performed, and a gene having a significant difference in expression level between the patient's non-rash area and healthy skin was selected. About the selected gene group, the average value of the expression level of each gene in the patient non-eruption part and the healthy skin was compared, and a gene having a difference of 2 times or more was selected.
  For genes that are highly expressed in healthy skin compared to patients with no rash, select only genes that are P (present) in 4 or more of 6 healthy subjects, and genes that are highly expressed in patients without rash Only genes that were P in 4 or more of 6 patients were selected. By comparing the selected gene group and the gene group in which expression change was observed in the normal tissue of normal subjects and the non-eruption part of atopic dermatitis patients performed in Example 3, it was common in atopic dermatitis and psoriasis We identified genes that fluctuate, genes that showed expression changes only in atopic dermatitis, and genes that showed expression changes only in psoriasis.
  Tables 50 to 51 show gene groups that commonly changed in atopic dermatitis and psoriasis, Tables 52 to 55 show gene groups that showed expression changes only in atopic dermatitis, and genes that showed expression changes only in psoriasis Are shown in Table 56 to Table 65. For genes identified as expression-specific fluctuations in each disease, the expression profile in the other disease is also shown in the table. Among the genes identified as each disease-specific variable gene, there are genes that appear to show statistically significant variations in the other disease, but these genes all meet our selection criteria. (A gene in which a significant difference was observed at a variation rate of 2 times or less, or a statistical analysis using a quantitative value below the detection limit of GeneChip was found).

  Based on the results of the above analysis, the following genes were identified as genes that can be used as indicators of psoriasis. Any of these genes can be used as an indicator gene in the present invention. Each gene data shown below describes the following information in order from the left. Each information is shown separated by a slash (/). The indicator genes were classified according to the function of each gene. The classified functions are indicated by ==.
"Gene name"
“Probe” (probe ID in GeneChip)
"Base sequence database (GenBank) accession number used for probe sequence design"
"Base sequence database of each index gene (GenBank) accession number"
"Database of amino acid sequences encoded by each indicator gene (GenBank) accession number"
"Reference" (the paper reporting the gene)

[Example 5] Comparison of human atopic dermatitis and mouse dermatitis model 2
  In order to evaluate the importance of pathologically related genes found by gene expression analysis using human atopic dermatitis skin specimens, we analyzed gene expression profiles of mouse dermatitis models, and human atopic dermatitis Compared with.
  DNFB repeated application contact dermatitis model mice were prepared according to the method of Nagai et al. (J Allergy Clin Immunol 1997 Dec; 100 (6 Pt 2): S39-44).
Dissolved in vehicle (a solvent in which acetone and olive oil were mixed at a ratio of 3: 1) in the auricular part of BALB / c mice (♂, 7 to 10 weeks old) once a week for a total of 5 times. 25 μl of a 15% Dintrofluorbenzene (DNFB) solution was applied.
  Edema of the auricle was observed 24 hours after the second DNFB application, and the edema rate 24 hours after application increased as the number of applications was repeated 3, 4, and 5 times. On the other hand, no ear edema was observed in the vehicle application group. In addition, the specific IgE and total IgE concentrations in the blood were significantly increased compared to before DNFB application (at the start of the test) in the DNFB application group, measured 4 hours after the fifth DNFB application, In the vehicle application group, no increase was observed. Furthermore, as a result of histopathological analysis, inflammatory cell infiltration (neutrophils, eosinophils, etc.) and thickening of the epidermis were observed in the auricular skin tissue 24 hours after the fifth DNFB application, and dermatitis pathology Formation could be observed.
  Two individuals were selected from the DNFB-applied or Vehicle-applied groups, respectively, and the auricular skin was collected before the first, third, and fifth application, and 4 hours after application. RNA preparation for gene chip analysis from mouse skin, cDNA synthesis for gene chip, and DNA chip analysis were performed according to Example 2.
Genes that change expression in the auricular skin (contact dermatitis lesions) and DN Comparison of genes whose expression changes in skin tissue of pea dermatitis
Gene analysis in DNFB-applied auricle skin and gene expression in Vehicle-applied auricular skin were compared and analyzed by Comparison analysis, and the expression was more than doubled in comparison with DNFB application 1, 3 and 5 times before application and 4 hours after application. Genes with increased and genes with decreased expression below 1/2 were selected as genes that fluctuate in acute lesions. In addition, genes whose expression is increased more than 2-fold and genes whose expression is decreased to 1/2 or less compared with before and after the third and fifth DNFB application vary in chronic lesions. Selected as a gene.
  Tables 66 to 67 show the results of comparison between these gene groups and the gene groups whose expression changes between the non-eruption part and acute lesion part of human atopic dermatitis. About the gene which showed the common fluctuation | variation, the importance in a dermatitis pathological condition can be evaluated by producing a knockout mouse or a transgenic mouse in this mouse dermatitis model. Regarding humoral factors and membrane proteins, the importance of the gene can be evaluated by administering neutralizing antibodies to dermatitis model mice, or administering humoral factors themselves or soluble membrane proteins.

  Based on the results of the above analysis, the following genes were identified as genes derived from mice related to dermatitis. Any of these genes can be used as an indicator gene in the present invention. Each gene data shown below describes the following information in order from the left. Each information is shown separated by a slash (/). The function of each gene can be clarified based on the description of the corresponding human gene.
"Mouse gene names and symbols"
“Probe” (probe ID in GeneChip)
"Base sequence database (GenBank) accession number used for probe sequence design"
"Base sequence database of each index gene (GenBank) accession number"
"Sequence number indicating the base sequence of the gene"
"Database of amino acid sequences encoded by each indicator gene (GenBank) accession number"
“SEQ ID NO: showing the amino acid sequence encoded by the gene”
"Reference" (the paper reporting the gene)
Corresponding human gene database (GenBank) accession number
"Gene name of the corresponding human gene"

Industrial applicability

The present invention provides index genes for atopic dermatitis shown in the following groups a) to d) or A) to D).
a) Indicator gene group whose expression level in the eruption is higher than that in the non-eruption of an atopic dermatitis patient:
b) Indicator gene group whose expression level in the eruption is lower than that in the non-eruption of an atopic dermatitis patient:
c) Indicator gene group whose expression level in the non-rash area of patients with atopic dermatitis is higher than that of healthy subjects:
d) Indicator gene group whose expression level in the non-rash area of patients with atopic dermatitis is lower than that of healthy subjects:
A) Indicator gene group whose expression level in the auricular skin of mite allergen-sensitized mice is higher than that of mite allergen-sensitized mice:
B) Indicator gene group whose expression level in the auricular skin of mite allergen-sensitized mice is lower than that of mite allergen-sensitized mice:
C) Indicator gene group whose expression level in the auricular skin of DNFB repeated application contact dermatitis model mice is higher than that in the mouse auricular skin before DNFB repeated application:
D) Indicator gene group whose expression level in the auricular skin of DNFB repeated application contact dermatitis model mice is lower than that in the mouse auricular skin before DNFB repeated application:
By using the expression level of each gene as an indicator, it became possible to screen a compound for testing atopic dermatitis, creating an allergic disease model animal, and treating the disease.
In addition, the present invention provides an indicator gene for psoriasis shown in the following groups i) to iv).
i) Indicative gene group whose expression level in the eruption is higher than that in the non-eruption in patients with psoriasis:
ii) Indicative gene group whose expression level in the eruption is lower than that in the non-eruption in patients with psoriasis:
iii) Indicator gene group whose expression level in the non-rash area of patients with psoriasis is higher than that of healthy subjects:
iv) Indicator gene group whose expression level in the non-rash area of psoriasis patients is lower than the expression level of healthy subjects:
Each indicator gene of the present invention is associated with a pathological change in expression. Therefore, it is possible to treat atopic dermatitis or psoriasis by regulating the expression of the indicator gene and the activity of the protein encoded by the indicator gene. For example, in the case of a gene whose expression is increased in the affected area or the patient's skin, inhibition of expression or its activity is a target for the treatment strategy for atopic dermatitis or psoriasis. Conversely, in the case of genes whose expression is reduced, promoting expression and activity is the target of treatment strategies for atopic dermatitis or psoriasis. These index genes can be expected to be useful as new clinical diagnostic indices for monitoring in the treatment of atopic dermatitis or psoriasis.
Each indicator gene provided by the present invention can easily know its expression level regardless of the type of allergen. Therefore, it is possible to comprehensively grasp the pathology of allergic reaction.
Moreover, since the expression level of the test method for atopic dermatitis according to the present invention can be analyzed using a biological sample as a sample, the invasiveness to a patient is low. Moreover, with respect to gene expression analysis, highly sensitive measurement using a small amount of sample is possible. Gene analysis technology is progressing in high throughput and low price year by year. Therefore, the test method for atopic dermatitis according to the present invention is expected to become an important diagnostic method in the medical field in the near future. In this sense, the diagnostic value of the indicator gene of the present invention is high.

[Sequence Listing]

Claims (59)

A method for examining atopic dermatitis comprising the following steps (1) to (3), wherein the indicator gene is any gene selected from the group described in any of the following a) to d): There is a way.
(1) A step of measuring the expression level of the indicator gene in a biological sample collected from the rash and / or non-rash portion of the subject (2) The expression level measured in step (1) In the case of the gene described in b) or b), the expression level of the indicator gene in a biological sample collected from the non-rash area of the same subject as the control, and the indicator gene is described in c) or d) In the case where the gene is an indicator gene, the step of comparing with the expression level of the indicator gene in the biological sample of a healthy person as a control, and (3) the indicator gene is described in a) or c) as a result of the comparison in step (2). In the case of the expressed gene, the expression level is higher than that of the control, and in the case of the gene described in b) or d), the expression level is lower than that of the control. Subject is a Step of determining to have peak dermatitis

The test method according to claim 1, wherein the gene expression level is measured by PCR of cDNA. The test method according to claim 1, wherein the expression level of the gene is measured by detecting a protein encoded by the indicator gene. A reagent for testing atopic dermatitis comprising a polynucleotide comprising a base sequence of an indicator gene, or an oligonucleotide having a length of at least 15 bases having a base sequence complementary to its complementary strand, wherein the indicator gene is claimed A reagent for testing atopic dermatitis, which is any gene selected from the group according to any one of items a) to d) in Item 1. A reagent for testing atopic dermatitis comprising an antibody that recognizes a protein encoded by an indicator gene, wherein the indicator gene is selected from the group according to any one of claims 1) to 3) A reagent for testing atopic dermatitis, which is a gene of A screening method for a therapeutic drug for atopic dermatitis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of a) to d) in claim 1 Method.
(1) contacting the candidate compound with a cell expressing the indicator gene;
(2) measuring the expression level of the gene;
(3) Compared with a control not contacted with a candidate compound, the indicator gene of group a) or c) is a compound that decreases the expression level of the gene, and the indicator gene of group b) or d) is Selecting a compound that increases the expression level of the gene The method according to claim 14, wherein the cells are established skin cells. A therapeutic agent for atopic dermatitis, comprising a polynucleotide comprising a base sequence of an indicator gene, or an oligonucleotide having a base sequence complementary to its complementary strand and a length of at least 15 bases, and a cell expressing the indicator gene A kit for screening a candidate compound, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of a) to d) in claim 1. A kit for screening a candidate compound for the treatment of atopic dermatitis comprising an antibody that recognizes a protein encoded by an indicator gene and a cell that expresses the indicator gene, wherein the indicator gene is a) in claim 1 A kit that is any gene selected from the group according to any one of -d). An atopic dermatitis model animal comprising a transgenic non-human vertebrate having an increased expression intensity in the skin of an indicator gene or a gene functionally equivalent to the indicator gene, wherein the indicator gene is a) or c in claim 1 ), And a model animal that is any gene selected from the group described in A) or C) below.

The model animal according to claim 18, wherein the non-human vertebrate is a mouse. An atopic dermatitis model animal comprising a transgenic non-human vertebrate having a reduced expression intensity in the skin of an indicator gene or a gene functionally equivalent to the indicator gene, wherein the indicator gene is b) or d in claim 1 ), And a model animal that is any gene selected from the group described in B) or D) below.

The model animal according to claim 20, wherein the non-human vertebrate is a mouse. The manufacturing method of atopic dermatitis model animal including the process of administering the component in any one of following 1) -4) to a mouse | mouth.
1) a polynucleotide comprising a base sequence constituting any gene selected from the gene group described in A) and C) in claim 18;
2) A protein encoded by a polynucleotide comprising a base sequence constituting any gene selected from the gene group described in A) and C) in claim 18 3) in B) and D) in claim 20 Antisense or RNAi of a polynucleotide containing a base sequence constituting any gene selected from the described gene group
4) An antibody that binds to a protein encoded by a polynucleotide comprising a base sequence that constitutes any gene selected from the gene group described in B) and D) in claim 20, or an antigen-binding region thereof fragment An inducer for inducing atopic dermatitis in a mouse, comprising as an active ingredient the component according to any one of 1) to 4) in claim 22. A method for screening a therapeutic drug for atopic dermatitis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any one of a) to d) in claim 1, and A) and C) in claim 18, and claim A screening method which is a gene functionally equivalent to any gene selected from the group described in B) and D) in 20 or an indicator gene.
(1) a step of administering a candidate compound to a test animal;
(2) measuring the expression intensity of the indicator gene in the biological sample of the test animal,
(3) Compared with a control not contacted with a candidate compound, the index gene of the a) group, c) group, A) group, and C) group is a compound that decreases the expression level of the gene, and b) group , D) group, B) group, and D) group, the step of selecting a compound that increases the expression level of the gene. A method for screening a therapeutic drug for atopic dermatitis comprising the following steps, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of claims 1) to d), or an indicator: A screening method that is a functionally equivalent gene to a gene.
(1) contacting a candidate compound with a cell into which a vector containing a transcriptional regulatory region of a marker gene and a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region is introduced;
(2) a step of measuring the activity of the reporter gene, and (3) a compound that reduces the expression level of the reporter gene for the indicator gene of group a) or c) compared to a control that does not contact the candidate compound And a compound that increases the expression level of the reporter gene for the indicator gene of b) group or d) group, A method for screening a therapeutic drug for atopic dermatitis comprising the following steps, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of claims 1) to d), or an indicator: A screening method that is a functionally equivalent gene to a gene.
(1) contacting a protein encoded by an indicator gene with a candidate compound;
(2) a step of measuring the activity of the protein, and (3) a compound that decreases the activity for the indicator gene of group a) or c) compared to a control not contacted with a candidate compound, and b) A step of selecting a compound that increases the activity of the indicator gene of group or d) group A therapeutic agent for atopic dermatitis comprising a compound obtainable by the screening method according to any one of claims 14, 24, 25, and 26 as an active ingredient. A therapeutic agent for atopic dermatitis comprising an indicator gene or a part of its antisense DNA as an active ingredient, wherein the indicator gene is selected from the group according to any one of a) and c) in claim 1 A therapeutic that is either gene. A therapeutic agent for atopic dermatitis comprising an antibody recognizing a protein encoded by an indicator gene as an active ingredient, wherein the indicator gene is selected from the group according to any one of a) and c) in claim 1 A therapeutic drug that is one of the genes. A therapeutic agent for atopic dermatitis comprising, as an active ingredient, an indicator gene or a protein encoded by the indicator gene, wherein the indicator gene is selected from the group described in b) or d) in claim 1 Therapeutic drugs that are genes. A DNA chip for diagnosing atopic dermatitis in which a probe for measuring an indicator gene is immobilized, wherein the indicator gene is selected from any one of groups a) to d) according to claim 1 DNA chip that is a kind of gene. A method for examining psoriasis, comprising the following steps (1) to (3), wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of the following i) to iv):
(1) A step of measuring the expression level of the indicator gene in a biological sample collected from the rash and / or non-rash portion of the subject (2) The expression level measured in step (1) is expressed as i ) Or ii), the expression level of the indicator gene in a biological sample collected from the non-rash area of the same subject as the control, and the indicator gene is described in iii) or iv) In the case where the gene is an indicator gene, the step of comparing with the expression level of the indicator gene in the biological sample of a healthy person as a control, and (3) as a result of the comparison in (2), the indicator gene is described in i) or iii). When the expression level is higher in the case of the gene expressed in comparison with the control, and in the case of the gene described in ii) or iv), the expression level is lower in comparison with the control. Step of determining a subject with psoriasis

The test method according to claim 32, wherein the expression level of the gene is measured by PCR of cDNA. The test method according to claim 32, wherein the expression level of the gene is measured by detecting a protein encoded by the indicator gene. A psoriasis test reagent comprising a polynucleotide comprising a base sequence of an indicator gene or an oligonucleotide having a base sequence complementary to its complementary strand and having a length of at least 15 bases, wherein the indicator gene is defined in claim 32. A reagent for examining psoriasis, which is any gene selected from the group according to any one of i) to iv). A reagent for psoriasis testing, comprising an antibody that recognizes a protein encoded by an indicator gene, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of i) to iv) in claim 32. A psoriasis test reagent. A screening method for a therapeutic agent for psoriasis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of i) to iv) in claim 32:
(1) contacting the candidate compound with a cell expressing the indicator gene;
(2) measuring the expression level of the gene;
(3) Compared with a control not contacted with a candidate compound, a compound that decreases the expression level of the gene for an indicator gene of the group i) or iii), and an indicator gene of the group ii) or iv) Selecting a compound that increases the expression level of the gene 46. The method of claim 45, wherein the cell is a established skin cell. A therapeutic drug candidate compound for psoriasis comprising a polynucleotide comprising a base sequence of an indicator gene, or an oligonucleotide having a base sequence complementary to its complementary strand and a length of at least 15 bases, and a cell expressing the indicator gene A kit for screening, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of i) to iv) in claim 32. A kit for screening a candidate drug for treating psoriasis, comprising an antibody that recognizes a protein encoded by an indicator gene and a cell that expresses the indicator gene, wherein the indicator gene is i) to iv) in claim 32. A kit which is any gene selected from the group described in any of the above. A psoriasis model animal comprising a transgenic non-human vertebrate having an increased expression intensity in the skin of an indicator gene or a gene functionally equivalent to the indicator gene, wherein the indicator gene is the group i) and the group iii) in claim 32 A model animal that is any gene selected from the group described in 1. The model animal according to claim 49, wherein the non-human vertebrate is a mouse. A psoriasis model animal comprising a transgenic non-human vertebrate with reduced expression intensity in the skin of an indicator gene or a gene functionally equivalent to the indicator gene, wherein the indicator gene is a group ii) and a group iv) in claim 32 A model animal that is any gene selected from. The model animal according to claim 51, wherein the non-human vertebrate is a mouse. A method for screening a therapeutic agent for psoriasis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of i) to iv) in claim 32, or the indicator gene and function: Screening method that is a genetically equivalent gene.
(1) contacting a candidate compound with a cell into which a vector containing a transcriptional regulatory region of a marker gene and a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region is introduced;
(2) a step of measuring the activity of the reporter gene, and (3) a compound that reduces the expression level of the reporter gene for the indicator gene of group i) or iii) compared to a control that does not contact the candidate compound And a compound that increases the expression level of the reporter gene for the indicator gene of group ii) or iv), A method for screening a therapeutic agent for psoriasis, comprising the following steps, wherein the indicator gene is any gene selected from the group according to any one of i) to iv) in claim 32, or the indicator gene and function: Screening method that is a genetically equivalent gene.
(1) contacting a protein encoded by an indicator gene with a candidate compound;
(2) a step of measuring the activity of the protein, and (3) a compound that decreases the activity for the indicator gene of group i) or iii) compared to a control not contacted with a candidate compound, and ii) Selecting a compound that increases the activity of the indicator gene of group or iv) group A therapeutic agent for psoriasis, comprising as an active ingredient a compound obtainable by the screening method according to any one of claims 45, 53, and 54. A therapeutic agent for psoriasis comprising, as an active ingredient, an indicator gene, or a part of the antisense DNA, wherein the indicator gene is any one selected from the group of i) or iii) in claim 32 A therapeutic agent that is a gene. A therapeutic agent for psoriasis comprising, as an active ingredient, an antibody that recognizes a protein encoded by an indicator gene, wherein the indicator gene is selected from the group of either i) or iii) in claim 32 Therapeutic drugs that are genes. A therapeutic agent for psoriasis comprising an indicator gene or a protein encoded by the indicator gene as an active ingredient, wherein the indicator gene is any gene selected from the group described in ii) or iv) in claim 32 A therapeutic drug. A DNA chip for diagnosis of psoriasis to which a probe for measuring an indicator gene is fixed, wherein the indicator gene is at least one gene selected from any one of the groups i) to iv) according to claim 32. A DNA chip.