JPWO2004013342A1

JPWO2004013342A1 - New antifungal active substances PF1237A, B and M substances

Info

Publication number: JPWO2004013342A1
Application number: JP2004525822A
Authority: JP
Inventors: 貴志矢口; 勝植田; 伏見　英樹; 英樹伏見; 昭一天野; 真依子飯田
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2003-08-01
Publication date: 2006-09-21
Also published as: WO2004013342A1; AU2003254794A1

Abstract

本発明は、抗真菌活性を有する新規化合物ＰＦ１２３７Ａ、ＰＦ１２３７ＢおよびＰＦ１２３７Ｍ物質、およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属するＰＦ１２３７生産菌株を培養することによる当該新規化合物の製造方法ならびに当該新規化合物を含有する抗真菌剤を提供する。本発明の新規化合物群は、抗真菌活性を有するため、医薬、農薬、衛生用品の分野で、抗真菌剤として使用することができる。特に真菌感染症の治療薬としての活用が期待される。The present invention relates to a novel compound PF1237A, PF1237B and PF1237M substances having antifungal activity, and a method for producing the novel compound by culturing a PF1237-producing strain belonging to the genus Fusarium, and an antifungal agent containing the novel compound I will provide a. Since the novel compound group of the present invention has antifungal activity, it can be used as an antifungal agent in the fields of pharmaceuticals, agricultural chemicals and hygiene products. In particular, it is expected to be used as a therapeutic agent for fungal infections.

Description

本発明は新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質またはそれらの塩、それらの製造法ならびにそれらを有効成分とする抗真菌剤に関するものである。 The present invention relates to a novel antifungal active substance PF1237A substance, PF1237B substance and PF1237M substance or a salt thereof, a production method thereof, and an antifungal agent containing them as an active ingredient.

１９５０年代以降の抗生物質に関する研究開発の急速な進歩およびその広範な普及により、細菌性の感染症に対する多くの治療薬が開発されてきた。その一方で、平素は無害な弱病原性微生物による感染症、いわゆる日和見感染症が近年大きな問題になりつつある。この日和見感染症は免疫不全症や悪性腫瘍等の疾病、または免疫抑制剤や抗炎症剤等の投与によって免疫機能が低下した場合、また抗生物質の投与による共生菌の抑制から生じる菌交代などが原因とされている。このような日和見感染症の中で真菌が原因である症例が数多く報告されている。また、本発明によるＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質と物理化学的性状が類似する化合物として、パプラカンジンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ（Ｐａｐｕｌａｃａｎｄｉｎｓ）［トラキセラー（Ｔｒａｘｌｅｒ）ら、ジャーナルオブアンティバイオティックス（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）３０：２８９−２９６，１９７７］、カエティアカンジン（Ｃｈａｅｔｉａｃａｎｄｉｎ）［コモリ（Ｋｏｍｏｒｉ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ３８：４５５−４５９，１９８５］、Ｌ−６８７，７８１［ヴァンミドルスワース（Ｖａｎｍｉｄｄｌｅｓｗｏｒｔｈ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４４：４５−５１，１９９１］、Ｂｕ−４７９４Ｆ［アオキ（Ａｏｋｉ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４６：９５２−９６０，１９９３］、サリカンジン（Ｓａｒｉｃａｎｄｉｎ）［ランダール（Ｒａｎｄａｌ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４９：５９６−５９８，１９９６］等が知られているが、抗真菌物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質はこれらの物質とは物理化学的性状が異なり明確に区別される。
現在使用されている主な抗真菌剤としては、ポリエンマクロライド系、アゾール系およびフルシトシン等がある。表在性真菌症の治療には、主に外用剤が使用され、それらには多種のイミダゾールやトリアゾール系の抗真菌剤を始め、アリルアミン系の抗真菌剤が用いられている。一方、深在性真菌症の治療においては、トリアゾール系薬剤であるフルコナゾールが、その高い安全性から多用されているが、これは抗菌スペクトルが狭いことが難点とされている。また、ポリエンマクロライド系薬剤であるアムホテリシンＢは抗菌スペクトルが広く、抗真菌活性は強いが同時に毒性も高く、安全性の面での問題が残されている。
このような背景からより有効かつ安全な抗真菌剤の提供とその有利な製造法は常に求められる課題である。本発明者らは、以上のような点に着目し、抗真菌活性を有する新規な化合物を提供するとともに、微生物の培養法を用いたそれらの製造法を提供することを目的とした。また、本発明の別の目的は、当該新規化合物を含有する医薬組成物および抗真菌剤の提供である。Due to the rapid progress in research and development of antibiotics since the 1950s and their widespread use, many therapeutic agents for bacterial infections have been developed. On the other hand, infectious diseases caused by weakly pathogenic microorganisms, so-called opportunistic infections, are becoming a major problem in recent years. This opportunistic infection is caused by diseases such as immunodeficiency and malignant tumors, or when the immune function is reduced by the administration of immunosuppressants or anti-inflammatory agents, or the bacterial turnover resulting from suppression of commensal bacteria by administration of antibiotics. It is the cause. There have been many reports of such opportunistic infections caused by fungi. Further, as compounds having physicochemical properties similar to those of the PF1237A substance, PF1237B substance and PF1237M substance according to the present invention, papracandins A, B, C, D and E (Papulcandins) [Traxler et al., Journal of Antibiotics ( J. Antibiotics 30: 289-296, 1977], Chaetiacandin [Komori et al., J. Biol. Antibiotics 38: 455-459, 1985], L-687,781 [Vanmidlesworth et al., J. Biol. Antibiotics 44: 45-51, 1991], Bu-4794F [Aoki et al., J. Biol. Antibiotics 46: 952-960, 1993], Saricandin [Randal et al., J. Biol. Antibiotics 49: 596-598, 1996] is known, but the antifungal substance PF1237A substance, PF1237B substance and PF1237M substance are distinct from these substances in their physicochemical properties and are clearly distinguished.
The main antifungal agents currently used include polyene macrolides, azoles and flucytosine. For the treatment of superficial mycosis, external preparations are mainly used, and various imidazole and triazole antifungal agents and allylamine antifungal agents are used. On the other hand, in the treatment of deep mycosis, fluconazole, which is a triazole drug, is frequently used due to its high safety, but this has a difficulty in having a narrow antibacterial spectrum. In addition, amphotericin B, which is a polyene macrolide, has a broad antibacterial spectrum and strong antifungal activity, but at the same time has high toxicity, and there remains a problem in terms of safety.
From such a background, the provision of a more effective and safe antifungal agent and its advantageous production method are always required issues. The present inventors paid attention to the above points and aimed to provide novel compounds having antifungal activity and to provide a method for producing them using a microorganism culture method. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition and an antifungal agent containing the novel compound.

本発明者らは、より有効かつ安全な新規抗真菌活性物質を見い出すため、幅広く微生物の探索を行った結果、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する菌を培養することによって、抗真菌活性を示す物質が培養物中に生産、蓄積されることを見い出した。
次いで、本発明者らは培養物中から式（１）で表される有効物質ＰＦ１２３７Ａ物質、式（２）で表されるＰＦ１２３７Ｂ物質、および式（３）で表されるＰＦ１２３７Ｍ物質をそれぞれ単離、精製し、これらの物理化学的性状からこれらの物質が新規物質であることを明らかにし、抗真菌活性を有することを確認した。これらの知見に基づいて、本発明を完成した。
すなわち、本発明は下記の新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質またはそれらの薬理学的に許容される塩を提供するものである。
式（１）

で表されるＰＦ１２３７Ａ物質または薬理学的に許容されるその塩。
式（２）

で表されるＰＦ１２３７Ｂ物質または薬理学的に許容されるその塩。
式（３）

で表されるＰＦ１２３７Ｍ物質または薬理学的に許容されるその塩。
また、本発明は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属し、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を蓄積させ、当該培養物からＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を採取することを特徴とするＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩の製造法を提供するもので。
さらに、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を含有する医薬組成物および抗真菌剤に関する。
＜発明の実施の態様＞
本発明の第１の要旨とするところは、前述式（１）で表され、下記の物理化学的性状を有する新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質にある。
１．ＰＦ１２３７Ａ物質の物理化学的性状
（１）色および形状：無色粉末
（２）分子式：Ｃ_４１Ｈ_６０Ｏ_１６

（４）比旋光度：［α］_Ｄ ^２５＝＋１５．２°（ｃ１．０，ＣＨ_３ＯＨ）
（５）紫外線吸収スペクトルメタノール中で測定した結果を以下に示す。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０７（１４２０），２２５（６４０），２６７（１４１０）
（６）赤外線吸収スペクトルＫＢｒ錠での測定結果を以下に示す。
ν_ｍａｘｃｍ^−１：３４４０，２９３０，２８６０，１７１７，１６３６，１６１０，１４５８，１２４４，１１５４，１０７０，１０３６，１０１０，９７８，８４３，７４５
（７）^１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ、測定溶媒中に含まれるＣＨＤ_２ＯＤのＨのシグナルを３．３８ｐｐｍとした時の化学シフト値、積分強度、多重度、結合定数を示す。）
δ（ｐｐｍ）：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．１３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．１６−１．５５（７Ｈ，ｍ），１．９７（３Ｈ，ｓ），１．９０−２．０３（３Ｈ，ｍ），２．２７−２．４１（４Ｈ，ｍ），３．４０−３．６３（４Ｈ，ｍ），３．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），３．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），３．９４−４．１５（５Ｈ，ｍ），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），５．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．９，１５．１Ｈｚ），５．４７（２Ｈ，ｍ），６．１１−６．２４（３Ｈ，ｍ），６．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．２，１４．８Ｈｚ），７．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）
（８）^１３ＣＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ、重メタノールの^１３Ｃのシグナルを４９．０ｐｐｍとした時の化学シフト値を示す。）
δ（ｐｐｍ）：１７５．７，１７０．２，１６１．６，１５４．５，１４５．５，１４１．２，１３９．９，１３７．５，１２９．８，１２９．０，１２７．０，１１６．５，１１２．０，１０５．０，１０３．０，１００．０，７７．０，７６．４，７５．４，７４．９，７４．７，７３．９，７３．７，７２．６，７２．０，６９．９，６４．１，６１．５，３９．９，３９．６，３９．３，３４．０，３３．９，３１．０，２８．５，２８．３，２１．０，１４．３，１３．１，１２．２，９．５
（９）溶解性：メタノールに溶け、アセトン、酢酸エチルに溶けにくく、水にほとんど溶けない。
（１０）塩基性、酸性、中性の区別：弱酸性物質
本発明の第２の要旨とするところは、前述式（２）で表され、下記の物理化学的性状を有する新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ｂ物質にある。
２．ＰＦ１２３７Ｂ物質の物理化学的性状
（１）色および性状：無色粉末
（２）分子式：Ｃ_４２Ｈ_６２Ｏ_１６

（４）比旋光度：［α］_Ｄ ^２５＝＋１９．８°（ｃ１．０，ＣＨ_３ＯＨ）
（５）紫外線吸収スペクトルメタノール中で測定した結果を以下に示す。
λ_ｍａｘｎｍ（ε）：２０８（１６００），２２５（７６０），２６７（１８５０）
（６）赤外線吸収スペクトルＫＢｒ錠での測定結果を以下に示す。
ν_ｍａｘｃｍ^−１：３４３２，２９３２，２８７６，１７１７，１７０２，１６３６，１６１１，１２４６，１１５４，１０７１，９７８，８４３
（７）^１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ、測定溶媒中に含まれるＣＨＤ_２ＯＤのＨのシグナルを３．３８ｐｐｍとした時の化学シフト値、積分強度、多重度、結合定数を示す。）
δ（ｐｐｍ）：０．９３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．１０−１．５２（７Ｈ，ｍ），１．５８−１．７０（２Ｈ，ｍ），１．９７−２．１２（３Ｈ，ｍ），２．０６（３Ｈ，ｓ），２．３０−２．５０（４Ｈ，ｍ），３．４８−３．７３（４Ｈ，ｍ），３．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），４．０２−４．１４（４Ｈ，ｍ），４．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５，１０．５Ｈｚ），４．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２６．１Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２５．７Ｈｚ），５．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，３０．０Ｈｚ），５．４０−５．５６（２Ｈ，ｍ），６．１８−６．３３（３Ｈ，ｍ），６．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．２，１５．７Ｈｚ），７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）
（８）^１３ＣＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ、重メタノールの^１３Ｃのシグナルを４９．０ｐｐｍとした時の化学シフト値を示す。）
δ（ｐｐｍ）：１７４．９，１７０．２，１６１．６，１５４．５，１４５．５，１４１．２，１３９．９，１３７．５，１２９．８，１２９．０，１２７．０，１１６．５，１１２．０，１０５．０，１０３．０，１００．０，７７．０，７６．４，７５．４，７４．９，７４．７，７３．９，７３．８，７２．６，７２．０，７０．０，６４．１，６１．５，３９．８，３９．６，３９．３，３７．０，３４．０，３３．９，３１．０，２８．５，２１．０，１９．５，１４．３，１４．１，１３．１，１２．２
（９）溶解性：メタノールに溶け、アセトン、酢酸エチルに溶けにくく、水にほとんど溶けない
（１０）塩基性、酸性、中性の区別：弱酸性物質
本発明の第３の要旨とするところは、前述式（３）で表され、下記の物理化学的性状を有する新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ｍ物質にある。
３．ＰＦ１２３７Ｍ物質の物理化学的性状
（１）色および形状：無色粉末
（２）分子式：Ｃ_３８Ｈ_５６Ｏ_１５

（４）比旋光度：［α］_Ｄ ^２５＝＋１０．０°（ｃ１．０，ＣＨ_３ＯＨ）
（５）紫外線吸収スペクトル：メタノール中で測定した結果を以下に示す。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０６（１１５０），２２５（４７０），２６７（９４０）
（６）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ錠での測定結果を以下に示す。
ν_ｍａｘｃｍ^−１：３４１０，２９３０，１７００，１６４０，１６１０，１４６０，１２４０，１１５０，１０７０，９８０，７４０
（７）^１ＨＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ、測定溶媒中に含まれるＣＨＤ_２ＯＤのＨのシグナルを３．３８ｐｐｍとした時の化学シフト値、積分強度、多重度、結合定数を示す。）
δ（ｐｐｍ）：０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．１５−１．６５（７Ｈ，ｍ），１．９７−２．１５（３Ｈ，ｍ），２．０７（３Ｈ，ｓ），２．４４（２Ｈ，ｍ），３．４４−３．７２（６Ｈ，ｍ），３．８４−３．９２（２Ｈ，ｍ），４．０２−４．１６（３Ｈ，ｍ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ），５．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），５．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．１，１４．９Ｈｚ），５．２７−５．４０（２Ｈ，ｍ），６．２３−６．３３（３Ｈ，ｍ），６．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２，１５．８Ｈｚ），７．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ）
（８）^１３ＣＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ、重メタノールの^１３Ｃのシグナルを４９．０ｐｐｍとした時の化学シフト値を示す。）
δ（ｐｐｍ）：１７０．２，１６１．６，１５４．６，１４５．５，１４１．３，１４０．０，１３７．５，１２９．８，１２９．０，１２６．９，１１６．５，１１２．０，１０５．２，１０３．０，１００．０，７７．１，７６．７，７６．３，７５．５，７５．０，７４．９，７３．９，７２．９，７２．０，６９．７，６１．７，６１．７，３９．８，３９．５，３９．４，３３．９，３３．９，３１．０，２８．５，２１．０，１４．４，１３．１，１２．２
（９）溶解性：メタノールに溶け、アセトン、酢酸エチルに溶けにくく、水にほとんど溶けない
（１０）塩基性、酸性、中性の区別：弱酸性物質
本発明の第４の要旨とするところは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属するＰＦ１２３７物質群を生産する菌を培養し、その培養物からＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を採取することを特徴とする、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の製造法である。
上記のＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質生産菌としては、例えば本発明者らが新たに分離したＰＦ１２３７株が挙げられる。なお、本発明で用いられるＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質生産菌は、本明細書に記載の微生物に限定されるものではない。ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を生産する能力を有している菌であればＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質生産菌としていずれを用いてもよい。使用できる微生物の好適な例としては、ＰＦ１２３７株、あるいはこの菌株の継代培養物、人工変異株ならびに自然変異株、遺伝子組換え株などが挙げられる。ＰＦ１２３７株の菌学的性状は以下の通りである。
ＰＦ１２３７株の菌学的性状
（１）コロニーの性状
ツァペック酵母エキス寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は５０〜５３ｍｍに達する。濃黄色、放射状のしわを生じ、密な菌糸層からなり、束状の気生菌糸を中央に、なわ状の気生菌糸を周辺に生じる。分生子は形成しない。裏面は濃黄色となる。ツァペック寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は５０〜５２ｍｍに達する。白色、平坦、薄い菌糸層からなる。分生子を疎らに形成する。裏面は白色となる。３７℃の培養では、どの培地上でも生育しない。
（２）形態的性状
菌糸は太く２．５μｍ以上である。フィアライドは無色、円筒形、菌糸側面より直立に生じ、先端は細まり、基部はややくびれ、４．０〜８．０ｘ１．５〜２．５μｍである。分生子は無色、楕円形〜円筒形、滑面、３．５〜７．５ｘ１．５〜２．５μｍ、フィアライドの先端に粘塊状に生じる。
以上の菌学的性状より、大分生子を形成しないが、ＰＦ１２３７株を不完全菌類のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する糸状菌と同定した。なお、本菌株は以下のように独立行政法人産業技術総合研究所特許生産寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−８４１６として国際寄託されている。
▲１▼寄託機関：国際寄託機関、独立行政法人産業技術総合研究所特許生産寄託セ
ンター
住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便
番号３０５−８５６６）
▲２▼寄託日：原寄託日：平成１４年３月２９日
移管請求日：平成１５年６月２４日（平成１４年３月２９日に寄託さ
れたＦＥＲＭＰ−１８７９８号より移管）
▲３▼寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−８４１６
生産菌の培養法
本発明の菌株を用いてＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を生産する培養方法としては、通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地を用い、一般に実施されている方法に従って培養することが可能である。
栄養源としては、従来カビの培養に利用されている公知のものが使用できる。例えば、炭素源としては、グルコース、スクロース、水飴、デキストリン、でんぷん、グリセロール、糖蜜、動植物油等を使用し得る。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用し得る。その他必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。また、菌の発育を助け、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の生産を促進するような有機及び無機物を適当に添加することができる。
培養法としては、好気的条件での培養法、特に液体培養法が最も適している。培養に適当な温度は２５〜３０℃であるが、多くの場合２６℃付近で培養する。ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の生産は、培地や培養条件によって異なるが、静置培養、振盪培養、タンク培養のいずれにおいても、通常２〜１４日間でその蓄積が最高に達する。培養液中のＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の蓄積が最高になった時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離、精製する。
ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の精製法
本発明によって得られる新規抗真菌物質は主に菌体中に存在するので、菌体より通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂への吸脱着法、若しくは分配あるいはゲルろ過等のカラムクロマトグラフィーを単独又は組み合わせて行うことにより精製できる。また高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーなども精製に利用可能である。好ましい分離、精製の方法としては以下の方法が挙げられる。培養液から遠心分離により菌体を得る。得られた菌体からメタノールやアセトン等により活性成分を抽出する。この菌体抽出液を減圧下で溶媒を留去後酢酸エチル、クロロホルム等の水と混和し難い有機溶媒を用いて抽出する。抽出液を濃縮乾固後クロロホルム−メタノールの混液を溶出液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー、次いで水−アセトニトリルの混液を溶出液とするＯＤＳカラムクロマトグラフィー、次にメタノールを溶出液としたセファデックスＬＨ２０を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー、さらに水−アセトニトリルの混液を溶出液とする高速液体クロマトグラフィー、を行うことにより目的とするＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を得ることが出来る。
本発明の要旨とするところは、本発明で得られる新規な抗真菌活性物質または薬理学的に許容されるその塩を含有する医薬組成物を提供することにある。薬理学的に許容しうる塩の典型例としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属、アンモニウム塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン等の有機アミン塩等を挙げることができる。
本発明に用いられるＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を医薬組成物として使用するには種々の投与形態あるいは使用形態に合わせて、公知の担体を組み合わせて製剤化すればよい。公知の担体としては、賦形剤（例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、ラクトース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例えば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロースおよびそのカルシウム塩、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等）潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリン酸ナトリウム等）、芳香剤（例えば、クエン酸、メントール、グリシン、オレンジ紛等）、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等）、安定化剤（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸など）懸濁化剤（例えば、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウムなど）、分散剤（例えば界面活性化剤）などの医薬用として常用される種々の有機および無機の担体物質が上げられる。
本発明の化合物は、抗真菌剤として皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、坐薬等による非経口投与あるいは錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等による経口投与などの全身投与のほか、軟膏剤、ローション剤、膣坐薬等の局所投与の形態を例示することができる。農薬用または衛生用品として本発明の化合物を活用する場合には、各分野で常用される調製方法を用いることができる。In order to find a more effective and safe novel antifungal active substance, the present inventors have extensively searched for microorganisms. As a result, by culturing a bacterium belonging to the genus Fusarium, a substance exhibiting antifungal activity can be obtained. It was found to be produced and accumulated in the culture.
Next, the present inventors isolated the active substance PF1237A substance represented by the formula (1), the PF1237B substance represented by the formula (2), and the PF1237M substance represented by the formula (3) from the culture, respectively. These substances were purified and revealed from these physicochemical properties to be novel substances, and confirmed to have antifungal activity. Based on these findings, the present invention has been completed.
That is, the present invention provides the following novel antifungal active substances PF1237A substance, PF1237B substance and PF1237M substance or pharmacologically acceptable salts thereof.
Formula (1)

Or a pharmacologically acceptable salt thereof.
Formula (2)

Or a pharmacologically acceptable salt thereof.
Formula (3)

Or a pharmacologically acceptable salt thereof.
The present invention also relates to a microorganism belonging to the genus Fusarium, culturing a microorganism having the ability to produce a PF1237A substance, a PF1237B substance and a PF1237M substance in a medium, accumulating the PF1237A substance, the PF1237B substance and the PF1237M substance in the culture, A method for producing a PF1237A substance, a PF1237B substance and a PF1237M substance, or a pharmacologically acceptable salt thereof, characterized by collecting a PF1237A substance, a PF1237B substance and a PF1237M substance from the product.
Furthermore, it is related with the pharmaceutical composition and antifungal agent containing PF1237A substance, PF1237B substance, and PF1237M substance or those pharmacologically acceptable salts.
<Aspect of the Invention>
The first gist of the present invention resides in a novel antifungal active substance PF1237A represented by the above formula (1) and having the following physicochemical properties.
1. Physicochemical properties of PF1237A substance (1) Color and shape: colorless powder (2) Molecular formula: C ₄₁ H ₆₀ O ₁₆

(4) Specific rotation: [α] _D ²⁵ = + 15.2 ° (c1.0, CH ₃ OH)
(5) Ultraviolet absorption spectrum The results of measurement in methanol are shown below.
λmax nm (ε): 207 (1420), 225 (640), 267 (1410)
(6) Infrared absorption spectrum Measurement results with KBr tablet are shown below.
ν _max cm ⁻¹ : 3440, 2930, 2860, 1717, 1636, 1610, 1458, 1244, 1154, 1070, 1036, 1010, 978, 843, 745
(7) ¹ H NMR spectrum (400 MHz, CD ₃ OD, CHD ₂ OD contained in the measurement solvent indicates a chemical shift value, integral intensity, multiplicity, and binding constant when the H signal of CHD ₂ OD is 3.38 ppm. )
δ (ppm): 0.85 (3H, t, J = 7.5 Hz), 0.89 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.95 (3H, d, J = 6.8 Hz), 1.13 (3H, t, J = 7.5 Hz), 1.16-1.55 (7H, m), 1.97 (3H, s), 1.90-2.03 (3H, m), 2.27-2.41 (4H, m), 3.40-3.63 (4H, m), 3.72 (1H, d, J = 2.2 Hz), 3.78 (1H, d, J = 11.5 Hz), 3.94-4.15 (5 H, m), 4.34 (1 H, d, J = 7.1 Hz), 4.38 (1 H, d, J = 10.0 Hz), 5 .01 (1H, d, J = 13.1 Hz), 5.04 (1 H, d, J = 12.4 Hz), 5.32 (1H, dd, J = 7.9, 15.1 Hz), 5. 47 (2H, m), 6.11- .24 (3H, m), 6.49 (1H, dd, J = 11.2,14.8Hz), 7.25 (1H, d, J = 11.5Hz)
(8) ¹³ C NMR spectrum (shows the chemical shift value when the ¹³ C signal of 100 MHz, CD ₃ OD, and deuterated methanol is 49.0 ppm.)
δ (ppm): 175.7, 170.2, 161.6, 154.5, 145.5, 141.2, 139.9, 137.5, 129.8, 129.0, 127.0, 116 5, 112.0, 105.0, 103.0, 100.0, 77.0, 76.4, 75.4, 74.9, 74.7, 73.9, 73.7, 72.6 72.0, 69.9, 64.1, 61.5, 39.9, 39.6, 39.3, 34.0, 33.9, 31.0, 28.5, 28.3, 21 0.0, 14.3, 13.1, 12.2, 9.5
(9) Solubility: Soluble in methanol, hardly soluble in acetone and ethyl acetate, hardly soluble in water.
(10) Discrimination between basic, acidic and neutral: weakly acidic substance The second gist of the present invention is a novel antifungal active substance represented by the above formula (2) and having the following physicochemical properties In PF1237B material.
2. Physicochemical properties of PF1237B substance (1) Color and properties: colorless powder (2) Molecular formula: C ₄₂ H ₆₂ O ₁₆

(4) Specific rotation: [α] _D ²⁵ = + 19.8 ° (c1.0, CH ₃ OH)
(5) Ultraviolet absorption spectrum The results of measurement in methanol are shown below.
λ _max nm (ε): 208 (1600), 225 (760), 267 (1850)
(6) Infrared absorption spectrum Measurement results with KBr tablet are shown below.
ν _max cm ⁻¹ : 3432, 2932, 2876, 1717, 1702, 1636, 1611, 1246, 1154, 1071, 978, 843
(7) ¹ H NMR spectrum (400 MHz, CD ₃ OD, CHD ₂ OD contained in the measurement solvent indicates a chemical shift value, integral intensity, multiplicity, and binding constant when the H signal of CHD ₂ OD is 3.38 ppm. )
δ (ppm): 0.93 (3H, t, J = 7.3 Hz), 0.98 (3H, d, J = 6.9 Hz), 1.03 (3H, d, J = 6.9 Hz), 1.06 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.10-1.52 (7H, m), 1.58-1.70 (2H, m), 1.97-2.12 (3H , M), 2.06 (3H, s), 2.30-2.50 (4H, m), 3.48-3.73 (4H, m), 3.80 (1H, d, J = 1) .6 Hz), 3.87 (1 H, d, J = 11.3 Hz), 4.02-4.14 (4 H, m), 4.21 (1 H, dd, J = 6.5, 10.5 Hz) 4.42 (1H, d, J = 7.8 Hz), 4.47 (1H, d, J = 9.7 Hz), 5.08 (1H, d, J = 26.1 Hz), 5.12 ( 1H, d, J = 25.7 Hz), 5 33 (1H, dd, J = 15.2, 30.0 Hz), 5.40-5.56 (2H, m), 6.18-6.33 (3H, m), 6.56 (1H, dd , J = 11.2, 15.7 Hz), 7.33 (1H, d, J = 11.2 Hz)
(8) ¹³ C NMR spectrum (shows the chemical shift value when the ¹³ C signal of 100 MHz, CD ₃ OD, and deuterated methanol is 49.0 ppm.)
δ (ppm): 174.9, 170.2, 161.6, 154.5, 145.5, 141.2, 139.9, 137.5, 129.8, 129.0, 127.0, 116 5, 112.0, 105.0, 103.0, 100.0, 77.0, 76.4, 75.4, 74.9, 74.7, 73.9, 73.8, 72.6 72.0, 70.0, 64.1, 61.5, 39.8, 39.6, 39.3, 37.0, 34.0, 33.9, 31.0, 28.5, 21 0.0, 19.5, 14.3, 14.1, 13.1, 12.2.
(9) Solubility: soluble in methanol, hardly soluble in acetone and ethyl acetate, hardly soluble in water (10) distinction between basic, acidic and neutral: weakly acidic substance The third gist of the present invention is In the novel antifungal active substance PF1237M substance represented by the above formula (3) and having the following physicochemical properties:
3. Physicochemical properties of PF1237M substance (1) Color and shape: colorless powder (2) Molecular formula: C ₃₈ H ₅₆ O ₁₅

(4) Specific rotation: [α] _D ²⁵ = + 10.0 ° (c1.0, CH ₃ OH)
(5) Ultraviolet absorption spectrum: The results measured in methanol are shown below.
λmax nm (ε): 206 (1150), 225 (470), 267 (940)
(6) Infrared absorption spectrum: The measurement results with KBr tablets are shown below.
ν _max cm ⁻¹ : 3410, 2930, 1700, 1640, 1610, 1460, 1240, 1150, 1070, 980, 740
(7) ¹ H NMR spectrum (400 MHz, CD ₃ OD, CHD ₂ OD contained in the measurement solvent indicates a chemical shift value, integral intensity, multiplicity, and binding constant when the H signal of CHD ₂ OD is 3.38 ppm. )
δ (ppm): 0.94 (3H, t, J = 7.3 Hz), 0.99 (3H, d, J = 6.9 Hz), 1.04 (3H, d, J = 6.3 Hz), 1.15-1.65 (7H, m), 1.97-2.15 (3H, m), 2.07 (3H, s), 2.44 (2H, m), 3.44-3. 72 (6H, m), 3.84-3.92 (2H, m), 4.02-4.16 (3H, m), 4.43 (1H, d, J = 6.7 Hz), 4. 47 (1H, d, J = 10.0 Hz), 5.07 (1 H, d, J = 12.9 Hz), 5.13 (1 H, d, J = 12.7 Hz), 5.34 (1 H, dd) , J = 7.1, 14.9 Hz), 5.27-5.40 (2H, m), 6.23-6.33 (3H, m), 6.58 (1H, dd, J = 1.12. 2, 15.8 Hz), 7.34 ( H, d, J = 11.6Hz)
(8) ¹³ C NMR spectrum (shows the chemical shift value when the ¹³ C signal of 100 MHz, CD ₃ OD, and deuterated methanol is 49.0 ppm.)
δ (ppm): 170.2, 161.6, 154.6, 145.5, 141.3, 140.0, 137.5, 129.8, 129.0, 126.9, 116.5, 112 0.0, 105.2, 103.0, 100.0, 77.1, 76.7, 76.3, 75.5, 75.0, 74.9, 73.9, 72.9, 72.0 69.7, 61.7, 61.7, 39.8, 39.5, 39.4, 33.9, 33.9, 31.0, 28.5, 21.0, 14.4, 13 .1,12.2
(9) Solubility: soluble in methanol, hardly soluble in acetone and ethyl acetate, hardly soluble in water (10) distinction between basic, acidic and neutral: weakly acidic substance The fourth gist of the present invention is , A PF1237A substance, a PF1237B substance and a PF1237M substance, characterized by culturing a bacterium that produces a PF1237 substance group belonging to the genus Fusarium and collecting PF1237A substance, PF1237B substance and PF1237M substance from the culture Is the law.
Examples of the PF1237A substance, PF1237B substance, and PF1237M substance-producing bacterium include the PF1237 strain newly isolated by the present inventors. Note that the PF1237A substance, PF1237B substance, and PF1237M substance-producing bacteria used in the present invention are not limited to the microorganisms described herein. Any bacteria can be used as the PF1237A substance, the PF1237B substance, and the PF1237M substance-producing bacteria as long as they have the ability to produce the PF1237A substance, the PF1237B substance, and the PF1237M substance. Preferable examples of microorganisms that can be used include the PF1237 strain, or subcultures of this strain, artificial mutants, natural mutants, and gene recombinants. The mycological properties of the PF1237 strain are as follows.
Mycological properties of PF1237 strain (1) Colony properties It grows well on the Czapek yeast extract agar medium, and the colony diameter reaches 50 to 53 mm after culturing at 25 ° C. for 7 days. Dark yellow, radial wrinkles are formed, consisting of a dense mycelium layer, with a bundle of aerial hyphae in the center and a wrinkled aerial hyphae around. Conidia do not form. The back is dark yellow. It grows well on the Czapek agar medium, and the colony diameter reaches 50 to 52 mm after culturing at 25 ° C. for 7 days. It consists of white, flat and thin mycelium layers. Conidia are sparsely formed. The back side is white. In the culture at 37 ° C., it does not grow on any medium.
(2) Morphological properties Mycelium is thick and 2.5 μm or more. The phialide is colorless, cylindrical, and stands upright from the side of the mycelium. The tip is narrowed and the base is slightly constricted, and the size is 4.0 to 8.0 × 1.5 to 2.5 μm. Conidia are colorless, oval-cylindrical, smooth, 3.5-7.5 × 1.5-2.5 μm, and are formed in a viscous mass at the tip of the phialide.
Based on the above bacteriological properties, the PF1237 strain was identified as a filamentous fungus belonging to the genus Fusarium, an incomplete fungus, although it did not form conidia. In addition, this strain is internationally deposited as FERM BP-8416 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Production Depositary as follows.
(1) Depositary organization: International depositary organization, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)
Address: 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan
Number 305-8666)
(2) Deposit date: Original deposit date: March 29, 2002
Transfer request date: June 24, 2003 (Deposited on March 29, 2002)
Transferred from FERM P-18798)
(3) Deposit number: FERM BP-8416
Culture method of producing bacteria As a culture method for producing the PF1237A substance, the PF1237B substance and the PF1237M substance using the strain of the present invention, a method generally used using a medium containing nutrients that can be used by ordinary microorganisms It is possible to culture according to
As the nutrient source, known ones conventionally used for mold cultivation can be used. For example, as the carbon source, glucose, sucrose, starch syrup, dextrin, starch, glycerol, molasses, animal and vegetable oils and the like can be used. As the nitrogen source, soybean flour, wheat germ, corn steep liquor, cottonseed meal, meat extract, peptone, yeast extract, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea, and the like can be used. In addition, it is effective to add inorganic salts capable of generating sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, sulfuric acid and other ions as required. Moreover, organic and inorganic substances that assist the growth of bacteria and promote the production of PF1237A substance, PF1237B substance, and PF1237M substance can be appropriately added.
As the culture method, a culture method under aerobic conditions, particularly a liquid culture method is most suitable. A suitable temperature for culturing is 25 to 30 ° C., but in many cases, culturing is performed at around 26 ° C. Production of the PF1237A substance, the PF1237B substance, and the PF1237M substance varies depending on the medium and the culture conditions, but the accumulation reaches the maximum in 2 to 14 days in any of stationary culture, shaking culture, and tank culture. When the accumulation of the PF1237A substance, the PF1237B substance, and the PF1237M substance in the culture solution reaches the maximum, the culture is stopped, and the target substance is isolated and purified from the culture solution.
2. Purification method of PF1237A substance, PF1237B substance and PF1237M substance Since the novel antifungal substance obtained by the present invention is mainly present in the microbial cells, it can be separated from the microbial cells by a normal separation means such as a solvent extraction method, an ion exchange resin It can be purified by performing a desorption method or column chromatography such as partitioning or gel filtration alone or in combination. High-performance liquid chromatography and thin layer chromatography can also be used for purification. Preferred methods for separation and purification include the following methods. Bacteria are obtained from the culture by centrifugation. The active ingredient is extracted from the obtained cells with methanol, acetone or the like. The cell extract is distilled off under reduced pressure and then extracted with an organic solvent that is difficult to mix with water, such as ethyl acetate or chloroform. After concentrating the extract to dryness, silica gel column chromatography using chloroform-methanol mixture as eluent, then ODS column chromatography using water-acetonitrile mixture as eluent, then Sephadex LH20 using methanol as eluent The target PF1237A substance, PF1237B substance, and PF1237M substance can be obtained by performing the gel filtration column chromatography used and, further, high performance liquid chromatography using a mixture of water and acetonitrile as an eluent.
The gist of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing the novel antifungal active substance obtained by the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof. Typical examples of pharmacologically acceptable salts include alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, calcium and barium, organic amine salts such as ammonium salts, trimethylamine and triethylamine. it can.
In order to use the PF1237A substance, the PF1237B substance, and the PF1237M substance used in the present invention as a pharmaceutical composition, it may be formulated by combining known carriers in accordance with various administration forms or use forms. Known carriers include excipients (eg, sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, calcium phosphate, calcium carbonate, etc.), binders (eg, cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, polypropylpyrrolidone, gelatin, Gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch, etc.), disintegrant (eg, starch, carboxymethylcellulose and its calcium salt, sodium bicarbonate, calcium phosphate, calcium citrate, etc.) lubricant (eg, magnesium stearate, aerosil, talc, Sodium laurate), fragrances (eg, citric acid, menthol, glycine, orange powder, etc.), preservatives (eg, sodium benzoate, sodium bisulfite, etc.), stabilizers (eg, Various organic and inorganic substances commonly used for pharmaceuticals such as suspending agents (eg, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, aluminum stearate), dispersants (eg, surfactants) The carrier material is raised.
The compound of the present invention can be used as an antifungal agent for systemic administration such as subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, parenteral administration by suppository, or oral administration by tablet, capsule, powder, granule, etc., and ointment And local administration forms such as lotions and vaginal suppositories. When utilizing the compound of the present invention for agricultural chemicals or hygiene products, preparation methods commonly used in various fields can be used.

以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではなく、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段のすべてを包括するものである。 Examples of the present invention will be described below, but this is merely an example and is not intended to limit the present invention, and encompasses all of the many variations or modification means not exemplified here.

種培地として、でんぷん２．０％、グルコース１．０％、ポリペプトン０．５％、小麦胚芽０．６％、酵母エキス０．３％、大豆粕０．２％および炭酸カルシウム０．２％の組成からなる培地（殺菌前ｐＨ７．０）を用いた。また、生産培地としては、グルコース５．０％（別に殺菌）、肉エキス０．４％、大豆粕１．０％、ポリペプトン０．４％、酵母エキス０．１％、塩化ナトリウム０．２５％および炭酸カルシウム０．５％の組成からなる培地（殺菌前ｐＨ７．０）を用いた。
前記の種培地８０ｍＬを分注した５００ｍＬ容三角フラスコを１２０℃で２０分間殺菌し、これにＰＦ１２３７株（ＦＥＲＭＢＰ−８４１６）の斜面寒天培養の３〜４白金耳を植菌後、２６℃で３日間振とう培養した。次いで、種培地５００ｍＬを分注した２０００ｍＬ容三角フラスコを１２０℃で２０分間殺菌し、これに上記種培養液を１０ｍＬずつ植菌し２６℃で２日間振とう培養した。さらに、生産培地６０Ｌを仕込んだ１００Ｌ容ジャーファメンター（福嶋鉄工（株）製）を１２１℃で３０分間殺菌し、これに上記種培養液を１．５Ｌ植菌し、撹拌数は最初１５０ｒｐｍ、２４時間後に１８０ｒｐｍ、通気量６０Ｌ／分、２６℃で５日間培養した。
こうして得られた培養液９０Ｌを遠心分離し菌体の沈殿物２０Ｌを得た。この菌体にメタノール４０Ｌを加え室温で１２０分攪拌した後、遠心分離により菌体を除去しメタノール抽出液を得た。メタノール抽出液を減圧下に約５Ｌに濃縮し７Ｌの酢酸エチルを加え室温で６０分攪拌し沈殿物を除去することにより得られた酢酸エチル抽出液６Ｌを減圧下に濃縮し２８．８ｇの粗抽出物を得た。
得られた粗抽出物に４００ｍＬのヘキサンと２００ｍＬのメタノールを加え攪拌した後メタノール層を分離し減圧下に濃縮し２５．８ｇの粗抽出物を得た。これを７０ｍＬのメタノールに溶解し、１００ｇのシリカゲル（ワコーゲルＣ−３００、和光純薬社製）を加えた後、減圧下でメタノールを留去した。得られた粗抽出物をシリカゲルに均一に吸着させた。これをグラスフィルター上のシリカゲル１００ｇに重層し、クロロホルム／メタノール溶液（メタノール濃度が０％を２．４Ｌ次いで１，１０，５０，１００％をそれぞれ２Ｌ）で溶出し活性画分を集めて減圧濃縮により残渣１８．８ｇを得た。
得られた残渣を１００ｍＬのアセトニトリルに溶解し２００ｍＬの蒸留水を加え懸濁させた。これをアセトニトリル／蒸留水＝３／７の混合溶媒にて平衡化したグラスフィルター上のコスモシール７５Ｃ_１８−ＯＰＮ（ナカライテスク社製）２００ｇに吸着した。本カラムを、アセトニトリル／蒸留水＝３／７１．６Ｌ、アセトニトリル／蒸留水＝３／２１．６Ｌ、およびメタノール５００ｍＬにて順じ溶離した。ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を含む分画から有機溶媒を留去し、得られた水層を酢酸エチルで抽出し減圧濃縮により残渣１．６５ｇを得た。
得られた残渣をメタノールを溶離液とするセファデックスＬＨ２０カラムクロマトグラフィー（ファルマシア社製、内径５ｃｍ、長さ８０ｃｍ）にかけ活性画分を濃縮乾固することにより粗物質７２１ｍｇを得た。
得られた粗物質を７．２ｍＬのメタノールに溶解し、その一部を用いアセトニトリル／蒸留水＝５５／４５の混合溶液で充填した高速液体クロマトグラフィー（カラム：イナートシルＯＤＳ−２、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、ジーエルサイエンス社製）に注入しアセトニトリル／蒸留水＝５５／４５の混合溶液で溶出することを繰り返すことによりＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を含む画分をそれぞれ得た。得られた画分はそれぞれアセトニトリルを留去し、得られた水層を酢酸エチルで抽出し濃縮乾固することによりＰＦ１２３７Ａ物質３４．６ｍｇ、ＰＦ１２３７Ｂ物質１３３ｍｇおよびＰＦ１２３７Ｍ物質６３．９ｍｇをそれぞれ無色粉末として得た。
試験例１
ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の抗真菌活性を液体培養試験法により、各種菌株に対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）として測定した。
培地としてＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社製）に１６５ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ナカライテスク社製）を加えｐＨ７．０に調製したものを用い、３５℃で２４時間（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓについては７２時間、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓについては３０℃、４８時間）培養した。その測定結果を表１に示す。

本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００２年８月０２日出願の日本特許出願（特願２００２−２２５５４０）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。As a seed medium, starch 2.0%, glucose 1.0%, polypeptone 0.5%, wheat germ 0.6%, yeast extract 0.3%, soybean meal 0.2% and calcium carbonate 0.2% A medium having a composition (pH 7.0 before sterilization) was used. In addition, as production medium, glucose 5.0% (separately sterilized), meat extract 0.4%, soybean meal 1.0%, polypeptone 0.4%, yeast extract 0.1%, sodium chloride 0.25% And a medium having a composition of 0.5% calcium carbonate (pH 7.0 before sterilization) was used.
The 500 mL Erlenmeyer flask into which 80 mL of the seed medium was dispensed was sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, and after inoculating 3-4 platinum ears of PF1237 strain (FERM BP-8416) slope agar culture at 26 ° C. Cultured with shaking for 3 days. Next, a 2000 mL Erlenmeyer flask into which 500 mL of the seed medium was dispensed was sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, and 10 mL of the above seed culture solution was inoculated therein and cultured with shaking at 26 ° C. for 2 days. Further, a 100 L jar fermenter (manufactured by Fukushima Tekko Co., Ltd.) charged with 60 L of production medium was sterilized at 121 ° C. for 30 minutes. After 24 hours, the cells were cultured at 180 rpm, aeration rate 60 L / min, and 26 ° C. for 5 days.
90 L of the culture solution thus obtained was centrifuged to obtain 20 L of bacterial cell precipitate. After adding 40 L of methanol to the cells and stirring at room temperature for 120 minutes, the cells were removed by centrifugation to obtain a methanol extract. The methanol extract was concentrated to about 5 L under reduced pressure, 7 L of ethyl acetate was added, and the mixture was stirred at room temperature for 60 minutes to remove the precipitate. The ethyl acetate extract 6 L obtained by concentrating under reduced pressure was concentrated to 28.8 g of crude crude. An extract was obtained.
To the obtained crude extract, 400 mL of hexane and 200 mL of methanol were added and stirred, and then the methanol layer was separated and concentrated under reduced pressure to obtain 25.8 g of crude extract. This was dissolved in 70 mL of methanol, 100 g of silica gel (Wakogel C-300, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and then methanol was distilled off under reduced pressure. The obtained crude extract was uniformly adsorbed on silica gel. This was layered on 100 g of silica gel on a glass filter, eluted with a chloroform / methanol solution (2.4 L of methanol concentration was 2.4 L, then 2 L of 1,10, 50, 100% each), and the active fractions were collected and concentrated under reduced pressure. Gave 18.8 g of residue.
The obtained residue was dissolved in 100 mL of acetonitrile and suspended by adding 200 mL of distilled water. This was adsorbed on 200 g of Cosmo Seal 75C ₁₈ -OPN (manufactured by Nacalai Tesque) on a glass filter equilibrated with a mixed solvent of acetonitrile / distilled water = 3/7. The column was sequentially eluted with acetonitrile / distilled water = 3/7 1.6 L, acetonitrile / distilled water = 3/2 1.6 L, and methanol 500 mL. The organic solvent was distilled off from the fraction containing the PF1237A substance, the PF1237B substance, and the PF1237M substance, and the resulting aqueous layer was extracted with ethyl acetate to obtain 1.65 g of a residue by concentration under reduced pressure.
The obtained residue was subjected to Sephadex LH20 column chromatography (Pharmacia, inner diameter 5 cm, length 80 cm) using methanol as an eluent, and the active fraction was concentrated and dried to obtain 721 mg of a crude substance.
The obtained crude substance was dissolved in 7.2 mL of methanol, and a portion thereof was filled with a mixed solution of acetonitrile / distilled water = 55/45 (column: inert sill ODS-2, inner diameter 20 mm, long The fractions containing the PF1237A substance, the PF1237B substance, and the PF1237M substance were obtained by repeating injection and elution with a mixed solution of acetonitrile / distilled water = 55/45. Acetonitrile was distilled off from each of the obtained fractions, and the resulting aqueous layer was extracted with ethyl acetate and concentrated to dryness to give PF1237A substance 34.6 mg, PF1237B substance 133 mg, and PF1237M substance 63.9 mg as colorless powders, respectively. Obtained.
Test example 1
The antifungal activity of the PF1237A substance, the PF1237B substance and the PF1237M substance was measured as the minimum inhibitory concentration (MIC) for various strains by the liquid culture test method.
A medium prepared by adding 165 mM MOPS buffer (manufactured by Nacalai Tesque) to RPMI1640 (manufactured by Nacalai Tesque) as a medium and using a pH of 7.0 was used for 24 hours (for Cryptococcus neoformans, 72 hours, for Aspergillus fumigatus, 30 ° C). 48 hours). The measurement results are shown in Table 1.

Although the present invention has been described in detail and with reference to specific embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention.
This application is based on a Japanese patent application filed on August 02, 2002 (Japanese Patent Application No. 2002-225540), the contents of which are incorporated herein by reference.

本発明の新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質は、表１に示したように、医療上問題になっているＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを含む各種真菌に対し抗真菌活性を有しており、これらを有効成分とする抗真菌剤は各種真菌を起因菌とする真菌症の治療に有用である。 The novel antifungal active substance PF1237A substance, PF1237B substance and PF1237M substance of the present invention, as shown in Table 1, have antifungal activity against various fungi including Candida albicans, which are medically problematic, Antifungal agents containing these as active ingredients are useful for the treatment of mycosis caused by various fungi.

Claims

Formula (1)

Or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Formula (2)

Or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Formula (3)

Or a pharmacologically acceptable salt thereof.

A novel antifungal active substance PF1237A substance according to any one of claims 1 to 3, wherein a fungus belonging to the genus Fusarium is cultured and a useful substance is collected from the culture. A method for producing a PF1237B substance and a PF1237M substance or a pharmacologically acceptable salt thereof.

A pharmaceutical comprising at least one of the novel antifungal active substance PF1237A substance, PF1237B substance and PF1237M substance or pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of claims 1 to 3 as an active ingredient Composition.

An antifungal agent comprising at least one of the novel antifungal active substance PF1237A substance, PF1237B substance and PF1237M substance or a pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of claims 1 to 3 as an active ingredient Fungicide.