【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は脂質代謝阻害活性を有し、ヒトのコレステロール蓄積に起因する疾病の予防剤または治療剤、あるいは抗真菌剤として有用な新規ＦＫＩ−０９２９物質、該物質の組成物およびそれらの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ステロールとしてヒトの場合はコレステロールが、また真菌の場合はエルゴステロールが生合成されるが、これらステロール生合成に関与する酵素群は、ヒトの高脂血症や動脈硬化症の予防、治療剤の開発や抗真菌剤の開発のターゲットとして認識されている（Ｔｏｍｏｄａ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｍｕｒａ，Ｓ．：Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（編集、Ｋｉｒｓｔ，Ａ．ら）、第１５章 ｐｐ．３４３〜３７８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００１年）。
【０００３】
実際、プラバスタチンを代表とするスタチン系化合物は、コレステロール生合成の律速酵素の一つであるヒドロキシメチルグルタリル−コエンザイム・エー（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素を特異的に阻害し、血中コレステロールを低下させ動脈硬化症の予防、治療薬として臨床的に用いられている。しかしながら、現在使用されているスタチン系化合物の場合は、生体にとって必須の成分である非ステロール化合物群の生合成も阻害されることが懸念されることから、生合成中間体であるスクアレン以降の酵素がより優れた薬剤標的と期待されている。
【０００４】
また、真菌感染症の治療に用いられている２，４−ジフルオロ−α，α−ビス−（１Ｈ，１，２，４−トリアゾル−１−イルメチル）ベンジルアルコール（一般名：フルコナゾール；アイシーエヌファーマスーティカルズ社製、米国）、或いは１−［２−（２，４−ジクロロベンジルオキシ）−２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル］イミダゾール（一般名：ミコナゾール；シグマ社製、米国）などのアゾール系化合物はエルゴステロールのＣ−１４脱メチル化反応を阻害する抗真菌剤として実用化されている。しかしながら、アゾール系抗真菌剤の長期間または反復投与による耐性菌の出現が問題となっており、安全性が高く、耐性菌の出現頻度の低い薬剤の開発が社会的急務とされていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
かかる実情において、ラノステロール合成酵素は２，３−オキシドスクアレンを基質として閉環反応によりラノステロールを生成する酵素であり、本酵素を阻害する医薬品は未だ実用化に至っていない。従って、本酵素を阻害する薬剤の発見は、上記の課題を解決し得ると考えられ、高脂血症や動脈硬化症によって惹起される心筋梗塞や脳卒中などの新しい予防剤または治療剤、あるいは新しい抗真菌剤として臨床できることが期待される。
本発明の目的は、ラノステロール合成酵素に対して阻害作用を有することにより、ヒトのコレステロール蓄積に起因する疾病の予防剤または治療剤や抗真菌剤として臨床できる新規ＦＫＩ−０９２９物質、該物質の組成物およびそれらの製造法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、植物の表面より新たに分離されたＦＫＩ−０９２９菌株の培養物中に、ラノステロール合成酵素阻害活性を有する物質が産生されることを見いだした。次いで、該培養物中からラノステロール合成酵素を阻害する活性物質を分離、精製したところ、後記［Ｉ］および［ＩＩ］で表される化学構造を有する物質を見いだした。これらの物質は従来まったく知られていないことから、各々本物質をＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質およびＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質（ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質の立体異性体）と称することにし、その総称をＦＫＩ−０９２９物質と称することにした。
本発明はかかる知見に基づいて完成されたものであって、下記式［Ｉ］
【０００７】
【化５】
で表されるＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質を提供するものである。
本発明は更に、下記式［ＩＩ］
【０００８】
【化６】
で表される新規ＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を提供するものである。
本発明は更に、特に下記式［Ｉ］
【０００９】
【化７】
で表される新規ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質及び特に下記式［ＩＩ］
【００１０】
【化８】
で表されるＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質とからなる新規ＦＫＩ−０９２９物質の組成物を提供するものである。
【００１１】
本発明は更に、糸状菌に属し、ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質を採取するＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質の製造法を提供するものである。
【００１２】
本発明は更に、糸状菌に属し、ＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を採取するＦＫＩ−０９２９Ｃ物質の製造法を提供するものである。
【００１３】
本発明は更に、糸状菌に属し、ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質及び／又はＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質及び／又はＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質及び／又はＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を採取するＦＫＩ−０９２９物質の組成物の製造法を提供するものである。
【００１４】
本発明は更に、糸状菌に属し、ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質及び／又はＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物が、Ｆｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎ ＦＫＩ−０９２９（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１４７）である化合物又は組成物を提供するものである。。
【００１５】
本発明は更に、糸状菌に属し、ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質及び／又はＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物が、Ｆｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎ ＦＫＩ−０９２９（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１４７）である化合物又は組成物の製造法を提供するものである。
【００１６】
本発明は更に、糸状菌に属し、ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質及び／又はＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質又はこれらの組成物を生産する能力を有する微生物が、糸状菌ＦＫＩ−０９２９株である微生物を提供するものであり、該微生物がＦｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎ ＦＫＩ−０９２９（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１４７）である微生物を提供するものである。
【００１７】
本発明は更に、ラノステロール合成酵素阻害活性を有する化合物または組成物を提供するものであり、該化合物または組成物はヒトのコレステロール蓄積に起因する高脂血症および動脈硬化に基づく心筋梗塞または脳卒中の予防剤または治療剤、あるいは抗真菌剤として使用し得る薬剤を提供するものである。
【００１８】
前記の式［Ｉ］で表されるＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質および式［ＩＩ］で表されるＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物（以下、「ＦＫＩ−０９２９物質生産菌」と称する）は、糸状菌に属するが、例えば本発明者らが沖縄県の植物の表面より分離した糸状菌ＦＫＩ−０９２９株であるＦｕｎｇａｌｓｔｒａｉｎ（ファンガル ストレイン）ＦＫＩ−０９２９が最も有効に使用される菌株の一例である。本菌株の菌学的性状を示すと次のとおりである。
【００１９】
１．形態的性質
本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、麦芽汁寒天培地、ジャガイモ・ニンジン寒天培地、オートミール寒天培地、三浦寒天培地などで良好に生育したが、最大４週間の培養で有性胞子、無性胞子、小菌核および菌核の形成は観察されなかった。また、自然光下における培養においても同様に有性胞子や無性胞子の形成は観察されなかった。
菌糸は無色から薄い茶色で、隔壁を有していた。
【００２０】
２．各種培地上での培養性状
各種寒天培地上で、２７℃、７日間培養した場合の各培地における肉眼的観察結果を下記に示す。
【００２１】
【００２２】
３．生理学的諸性質
１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件はｐＨ４〜７、温度１６〜３０℃である。
２）生育の範囲
本菌株の生育範囲はｐＨ３〜１０、温度１０〜３４℃である。
３）好気性、嫌気性の区別
好気性
【００２３】
４．結論
以上、本菌株の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みたが、菌学的性質を詳細に明らかにするまでに至っていない。したがって、本菌株をＦｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎ（ファンガル ストレイン）ＦＫＩ−０９２９と称することにした。本菌株はＦｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎ ＦＫＩ−０９２９（ファンガル ストレイン ＦＫＩ−０９２９）として、茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１４年１２月９日に寄託され、受託番号としてＦＥＲＭ Ｐ−１９１４７が付与された。
【００２４】
本発明の好ましい菌株として、ＦＫＩ−０９２９物質生産菌について説明したが、菌の一般的性状として菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行なわれる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導体剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異株も含め、糸状菌に属し、ＦＫＩ−０９２９物質を生産する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することができる。また、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株もＦＫＩ−０９２９物質生産菌として包含される。
【００２５】
本発明のＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質およびＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質又はこれらの組成物を製造するに当っては、先ず糸状菌に属するＦＫＩ−０９２９物質生産菌が適当な培地に培養される。本菌株の培養においては、通常の真菌の培養方法が一般に適用される。培地としては微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩などを含有させた栄養培地が適宜用いられる。
【００２６】
上記の同化し得る炭素源としては、ブドウ糖、ショ糖、糖密、澱粉、デキストリン、セルロース、グリセリン、有機酸などが単独または組み合わせて用いられる。消化し得る窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、カゼイン、大豆蛋白加水分解物、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化合物が単独あるいは組み合わせて用いられる。
【００２７】
その他必要に応じてナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩、重金属塩類が添加される。さらに培地には、必要に応じて本菌の生育やＦＫＩ−０９２９物質の生産を促進する微量栄養素、発育促進物質、前駆物質を適当に添加してもよい。
【００２８】
培養は通常静置、振とうまたは通気攪拌培養などの条件下で行うのがよい。工業的には深部通気攪拌培養が好ましい。培地のｐＨは中性付近で培養を行うのが好ましい。培養温度は２０〜３７℃の範囲でも行い得るが、通常は２４〜３０℃、好ましくは２７℃付近に保つのがよい。培養時間は、静置培養の場合、通常１０〜１６日間培養を行うと、本発明のＦＫＩ−０９２９物質が生成蓄積されるので、好ましくは培養中の蓄積量が最大に達したときに培養を終了すればよい。
これらの培養組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択されることはいうまでもない。
【００２９】
このようにして得られた培養物中に蓄積されたＦＫＩ−０９２９物質は、培養ろ液または培養菌体中に含まれているので、培養液を必要に応じてろ過補助剤、例えばセライト、ハイフロースパーセル等を加えてろ過するか、または遠心分離して培養ろ液と菌体とに分離し、培養ろ液と菌体との有機溶媒抽出物を濃縮したものの中からＦＫＩ−０９２９物質を採取するのが有利である。
【００３０】
また、培養ろ液からＦＫＩ−０９２９物質を採取するには、先ず培養ろ液を酢酸エチル、酢酸ブチル、ベンゼンなどの非親水性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧濃縮して粗製の物質、ＦＫＩ−０９２９物質が得られる。該粗製物質はさらに脂溶性物質の精製に通常用いられる公知の方法、例えばシリカゲル、アルミナなどの担体を用いるカラムクロマトグラフィーによりＦＫＩ−０９２９物質を分離、精製することができる。
【００３１】
菌体からＦＫＩ−０９２９物質を採取するには、菌体を含水アセトン、含水メタノールなどの含水親水性有機溶媒で抽出し、得られた抽出液を減圧濃縮し、その濃縮物を酢酸エチル、酢酸ブチル、ベンゼンなどの非親水性有機溶媒で抽出し、得られた抽出液は、前記の培養液から得た抽出液と合わせて分離、精製するか、あるいは前記と同じ方法によってＦＫＩ−０９２９物質を分離、精製することができる。
【００３２】
次に、本発明のＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質およびＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質の理化学的性状について述べる。
［Ｉ］ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質
（１）分子式：Ｃ18Ｈ31Ｏ2 Ｎ（高分解能ＦＡＢマススペクトルでｍ／ｚ２９４．２４６０（Ｍ＋Ｈ）が観察された）（計算値２９４．２４３３）。
（２）分子量：２９３（ＥＩマススペクトルよりｍ／ｚ２９３（Ｍ）+ が観察された）。
（３）比旋光度：［α］D 22＋２２°（ｃ＝０．１４、メタノール）。
【００３３】
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示すとおりであり、２２４ｎｍ（ε＝９，３００）に特徴的な吸収極大を示す。
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは図２に示すとおりであり、λｍａｘKBr ｃｍ-1：３４３７、２９５６、２９３１、２８７２、１６６２、１６３３、１５６６、１４５８、１４０８、１２６７、１１０７、１０２４に特徴的な吸収帯を有する。
（６）溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、ジメチルスルホキシドに可溶、水に不溶。
【００３４】
（７）塩基性、酸性、中性の区別：弱塩基性。
（８）物質の色、形状：無色油状物質。
（９）核磁気共鳴スペクトル：ＪＥＯＬ社製（日本国）、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中で測定、５００ＭＨｚ）は図３に、及びカーボン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中で測定、１２５．６５ＭＨｚ）は図４に示すとおりであり、水素および炭素の化学シフト（ｐｐｍ）、多重度及び結合定数（Ｈｚ）は下記に示すとおりである
【００３５】
【００３６】
位置* ：式［Ｉ］中の各位置に付設した番号に対応し、略号：ｓはシングレット、ｄはダブレット、ｔはトリプレット、ｑはカルテット、ｍはマルチプレットを意味する。
以上、ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、本ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質は下記式［Ｉ］で表される化学構造であることが決定された。
【００３７】
【化９】
【００３８】
［ＩＩ］ＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質。
（１）分子式：Ｃ18Ｈ31Ｏ2 Ｎ（高分解能ＦＡＢマススペクトルでｍ／ｚ２９４．２４５２（Ｍ＋Ｈ）が観察された）（計算値２９４．２４３３）。
（２）分子量：２９３（ＥＩマススペクトルよりｍ／ｚ２９３（Ｍ）+ が観察された）。
（３）比旋光度：［α］D 22＋２５°（ｃ＝０．２８、メタノール）。
【００３９】
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図５に示すとおりであり、２２４ｎｍ（ε＝１１，８００）に特徴的な吸収極大を示す。
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは図６に示すとおりであり、λｍａｘKBr ｃｍ-1：３４３１、２９５８、２８７３、２８１９、１６６６、１６２８、１５７４、１４０４、１３３５、１２１３、１０２８に特徴的な吸収帯を有する。
（６）溶媒に対する溶解性：メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、ジメチルスルホキシドに可溶、水に不溶。
【００４０】
（７）塩基性、酸性、中性の区別：弱塩基性。
（８）物質の色、形状：無色油状物質。
（９）核磁気共鳴スペクトル：ＪＥＯＬ社製（日本国）、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中で測定、５００ＭＨｚ）は図７に、及びカーボン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中で測定、１２５．６５ＭＨｚ）は図８に示すとおりであり、水素および炭素の化学シフト（ｐｐｍ）、多重度及び結合定数（Ｈｚ）は下記に示すとおりである。
【００４１】
【００４２】
位置* ：式［ＩＩ］中の各位置に付設した番号に対応し、略号：ｓはシングレット、ｄはダブレット、ｔはトリプレット、ｑはカルテット、ｍはマルチプレットを意味する。
以上、ＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、本ＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質は下記式［ＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
【００４３】
【化１０】
【００４４】
上記したように、ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質およびＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質の各種理化学的性状について詳述したが、このような性質に一致する化合物はこれまでに全く報告されておらず、ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質およびＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質は新規物質であると決定した。
【００４５】
次に、本発明のＦＫＩ−０９２９物質の生物学的性状について以下に述べる。
（１）ヒト由来ラノステロール合成酵素に対する阻害作用
ラノステロール合成酵素活性はＫｕｓａｎｏらの方法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３９巻、２３９〜２４１頁、１９９１年）を一部改変して行った。
【００４６】
酵素源としては、ヒト由来ラノステロール合成酵素ｃＤＮＡ（Ｓｕｎｇら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１８巻、１４５９〜１４６１頁、１９９５年）を酵母由来グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターによりラノステロール合成酵素欠損酵母ＧＩＬ７７（Ｋｕｓｈｉｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６巻、２３８〜２４１頁、１９９８年）において発現させることにより得られた形質転換酵母由来の無細胞抽出液を用いた。
【００４７】
上記の形質転換酵母は、氷冷した緩衝液Ａ（０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．４５Ｍスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭジチオトレイトール）中で酸処理ガラスビーズの存在下、Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒ［（型式５００ＡＣＤ）、佐久間製作所製、日本国］でホモジナイズする。これを８６００×ｇで遠心した上清を１０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度となるように前記の緩衝液Ａで調製し、無細胞抽出液とした。
【００４８】
基質の［14Ｃ］（３Ｓ）−２，３−オキシドスクアレンは、ラノステロール合成酵素欠損酵母ＧＬ７（Ｇｏｌｌｕｂら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２巻、２８４６〜２８５４頁、１９７７年）に［１−14Ｃ］酢酸ナトリウムを投与して放射活性を取り込ませることにより生合成的に調製した。
【００４９】
ラノステロール合成酵素活性の測定は、緩衝液Ｂ（０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１％トリトン Ｘ−１００）中で［14Ｃ］（３Ｓ）−２，３−オキシドスクアレン（最終濃度０．１７〜０．４２μＭ、４．５ｎＣｉ）とＦＫＩ−０９２９物質を加え全量９００μｌとして、３７℃で１０分間プレインキュベート後、酵素源１ｍｇ蛋白量を加え全量１ｍｌとして、３７℃で６０分間反応させた。
【００５０】
次いでそこに、６％水酸化カリウム／エタノールを加えて反応を停止させ、３７℃で１０分間インキュベートすることによりけん化させ、２ｍｌシクロヘキサンを加えてよく攪拌した。シクロヘキサン層１．６ｍｌを乾固後、ＴＬＣ［シリカゲルプレート（濃縮ゾーン付き）、メルク社製（米国）、厚さ０．２５ｍｍ：Ａｒｔ．Ｎｏ．１１７９８］にスポットし、ベンゼン／アセトン（１９：１、ｖ／ｖ）の溶媒で展開した。次に未反応の［14Ｃ］（３Ｓ）−２，３−オキシドスクアレン及び生成した［14Ｃ］ラノステロールの量をフォトイメージアナライザーＢＡＳ−１５００（富士写真フィルム社製、日本国）で定量することにより、ラノステロールへの合成阻害率を以下の式により算出した。
【００５１】
上記の算出結果より、ＦＫＩ−０９２９物質のラノステロール合成酵素活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ50）は、ＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質で１０μＭと測定され、ＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質で６．０μＭと測定された。
【００５２】
以上詳しく述べたように、本発明のＦＫＩ−０９２９物質はラノステロール合成酵素に対して阻害を示すことから、ヒトのコレステロール蓄積に起因する高脂血症や動脈硬化症によって惹起される心筋梗塞や脳卒中などの新しい予防剤、治療剤として、また新しい抗真菌剤として臨床できることが期待される。
【００５３】
【発明の実施の態様】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
５００ｍｌ容三角フラスコに、グルコース２．０％、酵母エキス０．２％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ポリペプトン０．５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％およびアガー０．１％を含む培地（ｐＨ６．０に調整）１００ｍｌを仕込み、綿栓後、蒸気滅菌し、寒天培地上に生育させたＦｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎ（ファンガル ストレイン）ＦＫＩ−０９２９（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１４７）の菌糸体を無菌的に植菌し、２７℃で３日間振とう培養して種培養液を得た。
【００５４】
１リットル容ルー瓶３６本にルー瓶１本当たりイタリア米１５０ｇ、微量金属（ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．９ｍｇ、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ０．９ｍｇ、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．９ｍｇ、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．９ｍｇ、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ０．９ｍｇ）と水９０ｍｌを仕込み、蒸気滅菌し、ルー瓶１本当たり上記の種培養液２ｍｌを無菌的に移植した。これを２７℃で１４日間静置培養後、培養物をルー瓶１本当たり３００ｍｌの５０％エタノール水で処理して３６本合わせて減圧ろ過し、５リットルまで減圧濃縮した。これを５リットルのクロロホルムで処理して分液ロートで有機層と無機層に分離した。この無機層を再び５リットルのクロロホルムで処理して分液ロートで有機層と無機層に分離した。これら有機層を減圧濃縮して粗物質８．９ｇを得た。
【００５５】
このようにして得られた粗物質の一部（４．０ｇ）をシリカゲル［４００ｇ、ワコーゲル（登録商標）Ｃ−２００、和光純薬工業社製、日本国］のカラムにチャージし、クロロホルム０．４リットル、クロロホルム−メタノール（２０：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール（１８：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール（１６：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール（１４：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール（１２：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール（１０：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール（８：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール（６：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール（４：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール（２：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール−水（２０：１０：１）の溶液１．０リットル、クロロホルム−メタノール−水（１０：１０：１）の溶液１．０リットルの順に段階的に溶出させた。
【００５６】
次に、クロロホルム−メタノール−水（２０：１０：１）画分及びクロロホルム−メタノール−水（１０：１０：１）画分を集め、減圧乾固して粗物質４８２ｍｇを得た。これをシリカゲル［５０ｇ、ワコーゲル（登録商標）Ｃ−２００、和光純薬工業社製、日本国］のカラムにチャージし、クロロホルム−メタノール−酢酸（１００：１０：１）の溶液１５０ｍｌ、クロロホルム−メタノール−酢酸（８０：１０：１）の溶液１５０ｍｌ、クロロホルム−メタノール−酢酸（６０：１０：１）の溶液１５０ｍｌ、クロロホルム−メタノール−酢酸（４０：１０：１）の溶液１５０ｍｌ、クロロホルム：メタノール：酢酸（２０：１０：１）の溶液１５０ｍｌ、クロロホルム：メタノール：酢酸（１０：１０：１）の溶液１５０ｍｌの順に段階的に溶出させた。
【００５７】
ＦＫＩ−０９２９−Ｂ成分、及びＦＫＩ−０９２９−Ｃ成分を含むクロロホルム−メタノール−酢酸（６０：１０：１）画分及びクロロホルム−メタノール−酢酸（４０：１０：１）画分を集め、減圧乾固して赤褐色の粗物質１０４ｍｇを得た。そのうちの７０ｍｇを液体クロマトグラフィー［装置は東ソー社製（日本国）のＣＣＰＭ、カラムはメルク社製（米国）のＬｏｂａｒ ｃｏｌｕｍｎ ｓｉｚｅ Ｂ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８（サイズ２５×３１０ｍｍ、粒子径４０〜６３μｍ、Ａｒｔ．Ｎｏ．１０６２５）、検出はＵＶ２５４ｎｍ、流速は４ｍｌ／分、溶出条件は１００分までメタノール−水−酢酸（３０：７０：０．５）、１００分から２００分までメタノール−水−酢酸（４０：６０：０．５）、２００分から３００分までメタノール−水−酢酸（５０：５０：０．５）、その後４００分まで１００％メタノールで溶出）にチャージして、溶出時間１２５分から２００分まで１画分（以下、画分Ｘと称する）、２００分から２７５分まで１画分（以下、画分Ｙと称する）の計２画分を集め、それぞれ減圧濃縮して画分Ｘは約０．５ｍｌのメタノール−水−酢酸（３５：６５：０．５）溶液、画分Ｙは約０．５ｍｌのメタノール−水−酢酸（４０：６０：０．５）溶液とした。
【００５８】
画分Ｘを、液体クロマトグラフィー［装置は東ソー社製（日本国）のＣＣＰＭ、カラムはメルク社製（米国）のＬｏｂａｒ ｃｏｌｕｍｎ ｓｉｚｅ Ｂ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８（サイズ２５×３１０ｍｍ、粒子径４０〜６３μｍ、Ａｒｔ．Ｎｏ．１０６２５）、検出はＵＶ２５４ｎｍ、流速は４ｍｌ／分、溶出条件は１００分までメタノール−水−酢酸（３５：６５：０．５）、１００分から２００分までメタノール−水−酢酸（４０：６０：０．５）、２００分から３００分までメタノール−水−酢酸（４５：５５：０．５）、３００分から４００分までメタノール−水−酢酸（５０：５０：０．５）、その後５００分まで１００％メタノールで溶出）にチャージして、溶出時間２５０分から２７５分まで１画分、２７５分から３００分まで１画分、３００分から３５０分まで１画分、３５０分か５００分まで１画分の計４画分を集め、それぞれ減圧濃縮して約０．５ｍｌのメタノール−水−酢酸（４５：５５：０．５）溶液とした。
【００５９】
画分Ｙを、液体クロマトグラフィー［装置は東ソー社製（日本国）のＣＣＰＭ、カラムはメルク社製（米国）のＬｏｂａｒ ｃｏｌｕｍｎ ｓｉｚｅ Ｂ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８（サイズ２５×３１０ｍｍ、粒子径４０〜６３μｍ、Ａｒｔ．Ｎｏ．１０６２５）、検出はＵＶ２５４ｎｍ、流速は４ｍｌ／分、溶出条件は１００分までメタノール−水−酢酸（４０：６０：０．５）、１００分から２００分までメタノール−水−酢酸（４５：５５：０．５）、２００分から３００分までメタノール−水−酢酸（５０：５０：０．５）、その後４００分まで１００％メタノールで溶出）にチャージして、溶出時間１５０分から１７５分まで１画分、１７５分から２００分まで１画分、２００分から２２５分まで１画分、２２５分から２７５分まで１画分、２７５分から４００分まで１画分の計５画分を集め、それぞれ減圧濃縮して約０．５ｍｌのメタノール−水−酢酸（４５：５５：０．５）溶液とした。
【００６０】
画分Ｘおよび画分Ｙより得られたそれら９画分を、さらに個々に高速液体クロマトグラフィー［装置は東ソー社製（日本国）のＣＣＰＥ−ＩＩ、カラムは東ソー社製（日本国）のＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴM （サイズ７．８×３００ｍｍ、粒子径５μｍ）、検出はＵＶ２５４ｎｍ、流速は１．５ｍｌ／分、溶出条件はメタノール−水−酢酸（４５：５５：０．５）、チャージ量は１インジェクション当たり５０〜２００μｌ）で繰り返し精製することにより、溶出時間１５分のピークからＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質を１．５ｍｇ、溶出時間１７分のピークからＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質を２．９ｍｇ得た。
【００６１】
【発明の効果】
以上のとおり、糸状菌に属するＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質およびＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質又はこれらの物質からなる組成物を生産する能力を有する微生物を培地に培養して、その培養物中からＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質およびＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質又は該物質の組成物を採取することにより、ラノステロール合成酵素に対する阻害活性物質が得られ、該物質は高脂血症や動脈硬化症に基づく心筋梗塞や脳卒中などの成人病の予防、治療効果が期待され、また真菌感染症に対する抗真菌剤としての効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質の紫外部吸収スペクトル（ＣＨ3 ＯＨ中）を示したものである。
【図２】本発明によるＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示したものである。
【図３】本発明によるＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ3 ）を示したものである。
【図４】本発明によるＦＫＩ−０９２９−Ｂ物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ3 ）を示したものである。
【図５】本発明によるＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質の紫外部吸収スペクトル（ＣＨ3 ＯＨ中）を示したものである。
【図６】本発明によるＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示したものである。
【図７】本発明によるＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ3 ）を示したものである。
【図８】本発明によるＦＫＩ−０９２９−Ｃ物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ3 ）を示したものである。[0001]
The present invention relates to a novel FKI-0929 substance having lipid metabolism inhibitory activity and useful as an agent for preventing or treating diseases caused by cholesterol accumulation in humans, or as an antifungal agent, and the composition of the substance. To products and their production methods.
[0002]
[Prior art]
Cholesterol is biosynthesized in humans and ergosterol in fungi as sterols, and these enzymes involved in sterol biosynthesis are used in the prevention and treatment of hyperlipidemia and arteriosclerosis in humans. (Tomoda, H. and Omura, S .: Enzyme Technology for Pharmaceutical and Biological Applications (Edition, Kirst, A., et al.), Chapters 15-78). Marcel Dekker, Inc., NY, 2001).
[0003]
In fact, statin compounds represented by pravastatin specifically inhibit hydroxymethylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase, one of the rate-limiting enzymes in cholesterol biosynthesis, to lower blood cholesterol. It is used clinically as a preventive and therapeutic agent for arteriosclerosis. However, in the case of a statin compound currently used, there is a concern that the biosynthesis of a group of non-sterol compounds, which are essential components for the living body, may be inhibited. Are expected to be better drug targets.
[0004]
Also, 2,4-difluoro-α, α-bis- (1H, 1,2,4-triazol-1-ylmethyl) benzyl alcohol (generic name: fluconazole; ICN Pharmaceutical Co., Ltd.) used for the treatment of fungal infections Such as 1- [2- (2,4-dichlorobenzyloxy) -2- (2,4-dichlorophenyl) ethyl] imidazole (generic name: miconazole; Sigma, USA) Azole compounds have been put to practical use as antifungal agents that inhibit the C-14 demethylation reaction of ergosterol. However, the emergence of resistant bacteria due to long-term or repeated administration of azole antifungal agents has become a problem, and development of a drug with high safety and low frequency of resistant bacteria has been urgently needed.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Under these circumstances, lanosterol synthase is an enzyme that generates lanosterol by a ring-closure reaction using 2,3-oxidesqualene as a substrate, and a drug that inhibits this enzyme has not yet been put to practical use. Therefore, the discovery of a drug that inhibits the present enzyme is considered to be able to solve the above-mentioned problems, and a new preventive or therapeutic agent for myocardial infarction or stroke caused by hyperlipidemia or arteriosclerosis, or a new therapeutic agent. It is expected that it can be clinically used as an antifungal agent.
An object of the present invention is to provide a novel FKI-0929 substance which has an inhibitory effect on lanosterol synthase and can be clinically used as a prophylactic or therapeutic agent or an antifungal agent for diseases caused by cholesterol accumulation in humans, and a composition of the substance. Products and methods for their production.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted various studies on metabolites produced by microorganisms. As a result, a substance having lanosterol synthase inhibitory activity was produced in a culture of FKI-0929 strain newly isolated from the surface of a plant. I found something. Next, an active substance that inhibits lanosterol synthase was separated and purified from the culture, and a substance having a chemical structure represented by the following [I] and [II] was found. Since these substances have not been known at all, these substances are respectively referred to as FKI-0929-B substance and FKI-0929-C substance (stereoisomer of FKI-0929-B substance), and the generic term thereof is used. FKI-0929 material.
The present invention has been completed based on such findings, and has the following formula [I]
[0007]
Embedded image
The present invention further provides the following formula [II]
[0008]
Embedded image
The present invention furthermore particularly relates to the following formula [I]
[0009]
Embedded image
[0010]
Embedded image
[0011]
The present invention further provides a method for culturing a microorganism belonging to a filamentous fungus and having an ability to produce a FKI-0929-B substance in a medium, accumulating the FKI-0929-B substance in a culture solution, and removing the FKI-0929-B substance from the culture. The present invention provides a method for producing FKI-0929-B substance from which -B substance is collected.
[0012]
The present invention further provides a method of culturing a microorganism belonging to a filamentous fungus and having an ability to produce an FKI-0929-C substance in a medium, accumulating the FKI-0929-C substance in a culture solution, and removing the FKI-0929-C from the culture. The present invention provides a method for producing FKI-0929C substance from which -C substance is collected.
[0013]
The present invention further provides a method for culturing a microorganism belonging to a filamentous fungus and capable of producing a FKI-0929-B substance and / or a FKI-0929-C substance in a medium, and adding the FKI-0929-B substance and / or Another object of the present invention is to provide a method for producing a composition of FKI-0929 substance by accumulating FKI-0929-C substance and collecting FKI-0929-B substance and / or FKI-0929-C substance from the culture.
[0014]
The present invention further provides a compound or composition wherein the microorganism belonging to the filamentous fungus and having the ability to produce the FKI-0929-B substance and / or the FKI-0929-C substance is Fungal strain FKI-0929 (FERM P-19147). It provides things. .
[0015]
The present invention further provides a compound or composition wherein the microorganism belonging to the filamentous fungus and having the ability to produce the FKI-0929-B substance and / or the FKI-0929-C substance is Fungal strain FKI-0929 (FERM P-19147). It is intended to provide a method of manufacturing a product.
[0016]
The present invention further provides a microorganism belonging to the filamentous fungus, wherein the microorganism having the ability to produce the FKI-0929-B substance and / or the FKI-0929-C substance or a composition thereof is the filamentous fungus strain FKI-0929. The microorganism is Fungal strain FKI-0929 (FERM P-19147).
[0017]
The present invention further provides a compound or composition having lanosterol synthase inhibitory activity, wherein the compound or composition is used for myocardial infarction or stroke based on hyperlipidemia and arteriosclerosis caused by cholesterol accumulation in humans. It is intended to provide a drug which can be used as a prophylactic or therapeutic agent or an antifungal agent.
[0018]
A microorganism capable of producing the FKI-0929-B substance represented by the above formula [I] and the FKI-0929-C substance represented by the formula [II] (hereinafter referred to as "FKI-0929 substance-producing bacteria" ) Belongs to a filamentous fungus. For example, Fungalstrain FKI-0929, which is a filamentous fungus FKI-0929 strain isolated from the surface of a plant in Okinawa Prefecture, is one of the strains most effectively used. This is an example. The bacteriological properties of this strain are as follows.
[0019]
1. Morphological properties
This strain grew well on potato / glucose agar medium, wort agar medium, potato / carrot agar medium, oatmeal agar medium, Miura agar medium, etc., but sexual spores, asexual spores, Small sclerotium and sclerotium formation were not observed. Similarly, formation of sexual spores and asexual spores was not observed in culture under natural light.
The mycelium was colorless to light brown with septum.
[0020]
2. Culture properties on various media
The results of macroscopic observation of each medium when cultured on various agar media at 27 ° C. for 7 days are shown below.
[0021]
3. Physiological properties
1) Optimal growth conditions
The optimum growth conditions for this strain are pH 4-7 and temperature 16-30 ° C.
2) Range of growth
The growth range of this strain is pH 3-10 and temperature 10-34 ° C.
3) distinction between aerobic and anaerobic
Aerobic
[0023]
4. Conclusion
As described above, the comparison with known bacterial species was attempted based on the morphological characteristics, culture characteristics, and physiological characteristics of the present strain, but the mycological characteristics have not been clarified in detail. Therefore, this strain was named Fungal strain FKI-0929. This strain is designated as Fungal strain FKI-0929 (Fungal Strain FKI-0929) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, located at 1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japan. Deposited with the Center on December 9, 2002, and assigned FERM P-19147 as a deposit number.
[0024]
As a preferred strain of the present invention, an FKI-0929 substance-producing bacterium has been described. However, as a general property of the bacterium, mycological properties are extremely liable to vary, and are not constant. It is a well-known fact that mutation is carried out by artificial mutation using X-ray irradiation or a mutant derivative agent such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonate and the like. All strains belonging to filamentous fungi and having the ability to produce FKI-0929 substances, including mutant strains and natural mutant strains, can be used in the present invention. In addition, strains mutated by cell engineering such as cell fusion and genetic manipulation are also encompassed as FKI-0929 substance producing bacteria.
[0025]
In producing the FKI-0929-B substance and the FKI-0929-C substance or their compositions of the present invention, first, an FKI-0929 substance-producing bacterium belonging to a filamentous fungus is cultured in an appropriate medium. In culturing this strain, a general fungal culture method is generally applied. As the medium, a nutrient medium containing a carbon source that can be assimilated by microorganisms, a nitrogen source that can be digested, and, if necessary, an inorganic salt or the like is appropriately used.
[0026]
As the assimilable carbon source, glucose, sucrose, molasses, starch, dextrin, cellulose, glycerin, organic acids and the like are used alone or in combination. Digestible nitrogen sources include peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, soy flour, corn steep liquor, cottonseed meal, casein, soy protein hydrolyzate, amino acids, organic nitrogen sources such as urea, nitrates And inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts are used alone or in combination.
[0027]
In addition, if necessary, inorganic salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt and phosphate, and heavy metal salts are added. Further, micronutrients, growth promoting substances and precursors which promote the growth of the present bacterium and the production of FKI-0929 substance may be appropriately added to the medium as needed.
[0028]
Culture is usually preferably performed under conditions such as standing, shaking, or aeration and stirring culture. Industrially, deep aeration stirring culture is preferred. The culture is preferably carried out at a pH around neutrality. The cultivation temperature can be in the range of 20 to 37 ° C, but it is usually maintained at 24 to 30 ° C, preferably around 27 ° C. In the case of stationary culture, the culturing time is usually 10 to 16 days. If the cultivation is performed, the FKI-0929 substance of the present invention is produced and accumulated. You only have to end.
These culture compositions, liquid properties of the medium, culture temperature, agitation speed, culture conditions such as aeration are appropriately adjusted and selected so as to obtain preferable results depending on the strain used and external conditions. Not even.
[0029]
Since the FKI-0929 substance accumulated in the culture thus obtained is contained in the culture filtrate or the cultured cells, the culture solution may be filtered, if necessary, with a filter aid such as Celite, High Flow. Add a supercell or the like and filter or centrifuge to separate the culture filtrate and cells, and extract FKI-0929 substance from the concentrated organic solvent extract of the culture filtrate and cells Advantageously.
[0030]
To collect FKI-0929 substance from the culture filtrate, first, the culture filtrate is extracted with a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, and benzene, and the extract is concentrated under reduced pressure to obtain a crude substance. FKI-0929 material is obtained. The crude substance can be further separated and purified of FKI-0929 substance by a known method usually used for purification of a fat-soluble substance, for example, column chromatography using a carrier such as silica gel or alumina.
[0031]
In order to collect the FKI-0929 substance from the cells, the cells are extracted with a water-containing hydrophilic organic solvent such as water-containing acetone or water-containing methanol, and the obtained extract is concentrated under reduced pressure. The extract is extracted with a non-hydrophilic organic solvent such as butyl or benzene, and the obtained extract is separated and purified in combination with the extract obtained from the above-mentioned culture solution, or FKI-0929 substance is obtained by the same method as described above. It can be separated and purified.
[0032]
Next, the physicochemical properties of the FKI-0929-B substance and the FKI-0929-C substance of the present invention will be described.
[I] FKI-0929-B substance
(1) Molecular formula: C18H31OTwoN (m / z 294.2460 (M + H) observed in high resolution FAB mass spectrum) (calculated 294.2433).
(2) Molecular weight: 293 (m / z 293 (M) based on EI mass spectrum)+Was observed).
(3) Specific rotation: [α]D twenty two+22 [deg.] (C = 0.14, methanol).
[0033]
(4) Ultraviolet absorption spectrum: An ultraviolet absorption spectrum measured in methanol is as shown in FIG. 1 and shows a characteristic absorption maximum at 224 nm (ε = 9,300).
(5) Infrared absorption spectrum: The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide tablet method is as shown in FIG.KBrcm-1: 3437, 2956, 2931, 2872, 1662, 1633, 1566, 1458, 1408, 1267, 1107, 1024.
(6) Solubility in solvent: soluble in methanol, ethanol, acetonitrile, ethyl acetate, chloroform, dimethyl sulfoxide, and insoluble in water.
[0034]
(7) Basic, acidic or neutral: weakly basic.
(8) Color and shape of substance: colorless oily substance.
(9) Nuclear magnetic resonance spectrum: Proton nuclear magnetic resonance spectrum (measured in deuterated chloroform, 500 MHz) measured using a nuclear magnetic resonance spectrometer manufactured by JEOL (Japan), and FIG. The spectrum (measured in deuterated chloroform, 125.65 MHz) is as shown in FIG. 4, and the chemical shift (ppm), multiplicity and coupling constant (Hz) of hydrogen and carbon are as shown below.
[0035]
[0036]
position*: Corresponding to the number attached to each position in the formula [I], abbreviations: s means singlet, d means doublet, t means triplet, q means quartet, and m means multiplet.
As described above, as a result of detailed examination of various physicochemical properties and spectrum data of the FKI-0929-B substance, it was determined that the present FKI-0929-B substance had a chemical structure represented by the following formula [I].
[0037]
Embedded image
[0038]
[II] FKI-0929-C substance.
(1) Molecular formula: C18H31OTwoN (m / z 294.2452 (M + H) observed in high resolution FAB mass spectrum) (calculated 294.2433).
(2) Molecular weight: 293 (m / z 293 (M) based on EI mass spectrum)+Was observed).
(3) Specific rotation: [α]D twenty two+25 [deg.] (C = 0.28, methanol).
[0039]
(4) Ultraviolet absorption spectrum: An ultraviolet absorption spectrum measured in methanol is as shown in FIG. 5 and shows a characteristic absorption maximum at 224 nm (ε = 11,800).
(5) Infrared absorption spectrum: The infrared absorption spectrum measured by the potassium bromide tablet method is as shown in FIG.KBrcm-1: 3431, 2958, 2873, 2819, 1666, 1628, 1574, 1404, 1335, 1213, and 1028.
(6) Solubility in solvent: soluble in methanol, ethanol, acetonitrile, ethyl acetate, chloroform, dimethyl sulfoxide, and insoluble in water.
[0040]
(7) Basic, acidic or neutral: weakly basic.
(8) Color and shape of substance: colorless oily substance.
(9) Nuclear magnetic resonance spectrum: Proton nuclear magnetic resonance spectrum (measured in deuterated chloroform, 500 MHz) manufactured by JEOL (Japan) using a nuclear magnetic resonance spectrometer is shown in FIG. 7 and carbon nuclear magnetic resonance. The spectrum (measured in deuterated chloroform, 125.65 MHz) is as shown in FIG. 8, and the chemical shift (ppm), multiplicity and coupling constant (Hz) of hydrogen and carbon are as shown below.
[0041]
[0042]
position*: Corresponding to the number attached to each position in the formula [II], abbreviations: s means singlet, d means doublet, t means triplet, q means quartet, and m means multiplet.
As described above, as a result of detailed examination of various physicochemical properties and spectrum data of the FKI-0929-C substance, it was determined that the present FKI-0929-C substance had a chemical structure represented by the following formula [II].
[0043]
Embedded image
[0044]
As described above, various physicochemical properties of the FKI-0929-B substance and the FKI-0929-C substance have been described in detail, but no compound corresponding to such properties has been reported so far, and FKI- The 0929-B and FKI-0929-C substances were determined to be new substances.
[0045]
Next, the biological properties of the FKI-0929 substance of the present invention will be described below.
(1) Inhibitory effect on lanosterol synthase derived from human
The lanosterol synthase activity was obtained by partially modifying the method of Kusano et al. (Chem. Pharm. Bull. 39, 239-241, 1991).
[0046]
As the enzyme source, human lanosterol synthase cDNA (Sung et al., Biol. Pharm. Bull. 18, 1459-1461, 1995) was deficient in lanosterol synthase by the yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter. A cell-free extract derived from transformed yeast obtained by expression in yeast GIL77 (Kushiro et al., Eur. J. Biochem. 256, 238-241, 1998) was used.
[0047]
The above transformed yeast was obtained by the presence of acid-treated glass beads in ice-cold buffer A (0.1 M potassium-phosphate buffer (pH 7.4), 0.45 M sucrose, 1 mM EDTA and 1 mM dithiothreitol). Below, homogenize with Waring Blender [(model 500ACD), manufactured by Sakuma Seisakusho, Japan]. This was centrifuged at 8,600 × g, and the supernatant was prepared with the above-mentioned buffer solution A so as to have a protein concentration of 10 mg / ml, to obtain a cell-free extract.
[0048]
Substrate [14C] (3S) -2,3-oxidesqualene was obtained from lanosterol synthase-deficient yeast GL7 (Gollub et al., J. Biol. Chem. 252, 2846-2854, 1977).14C] was prepared biosynthetically by administering sodium acetate to incorporate radioactivity.
[0049]
The lanosterol synthase activity was measured in buffer B (0.1 M potassium-phosphate buffer (pH 7.4), 0.1% Triton X-100) [14C] (3S) -2,3-oxidesqualene (final concentration: 0.17 to 0.42 μM, 4.5 nCi) and FKI-0929 substance were added to make a total volume of 900 μl, and after preincubation at 37 ° C. for 10 minutes, 1 mg of enzyme source The amount of protein was added to make a total volume of 1 ml, and reacted at 37 ° C. for 60 minutes.
[0050]
Then, the reaction was stopped by adding 6% potassium hydroxide / ethanol, and the mixture was saponified by incubating at 37 ° C. for 10 minutes, 2 ml of cyclohexane was added, and the mixture was stirred well. After drying 1.6 ml of the cyclohexane layer, TLC [silica gel plate (with concentration zone), manufactured by Merck (USA), thickness 0.25 mm: Art. No. 11798] and developed with a solvent of benzene / acetone (19: 1, v / v). Next, unreacted [14C] (3S) -2,3-oxidesqualene and [14C] The amount of lanosterol was quantified with a photo image analyzer BAS-1500 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan), and the synthesis inhibition rate to lanosterol was calculated by the following equation.
[0051]
From the above calculation results, the concentration at which the FKI-0929 substance inhibits the lanosterol synthase activity by 50% (IC50) Was measured at 10 μM for the FKI-0929-B substance and 6.0 μM for the FKI-0929-C substance.
[0052]
As described in detail above, since the FKI-0929 substance of the present invention shows inhibition against lanosterol synthase, myocardial infarction or stroke caused by hyperlipidemia or arteriosclerosis caused by cholesterol accumulation in humans. It is expected that it can be clinically used as a new prophylactic or therapeutic agent, and as a new antifungal agent.
[0053]
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples of the present invention, but the present invention is not limited thereto.
In a 500 ml Erlenmeyer flask, glucose 2.0%, yeast extract 0.2%, MgSOFour・ 7HTwoO 0.05%, polypeptone 0.5%, KHTwoPOFour100 ml of a medium (adjusted to pH 6.0) containing 0.1% and agar 0.1% was charged, and after cotton plugs were steam-sterilized and grown on an agar medium, Fungal strain FKI-0929 (FERM) P-19147) was inoculated aseptically and cultured with shaking at 27 ° C. for 3 days to obtain a seed culture.
[0054]
36 bottles of 1 liter roux bottle, 150 g of Italian rice per roux bottle, trace metal (FeSOFour・ 7HTwoO 0.9mg, MnClTwo・ 4HTwoO 0.9mg, ZnSOFour・ 7HTwoO 0.9mg, CuSOFour・ 5HTwoO 0.9mg, CoClTwo・ 6HTwo(0.9 mg) and 90 ml of water, steam-sterilized, and aseptically transplanted 2 ml of the above seed culture solution per roux bottle. After standing culture at 27 ° C. for 14 days, the culture was treated with 300 ml of 50% ethanol water per one bottle, and 36 of them were combined, filtered under reduced pressure, and concentrated under reduced pressure to 5 liters. This was treated with 5 liters of chloroform and separated into an organic layer and an inorganic layer with a separating funnel. This inorganic layer was treated again with 5 liters of chloroform and separated into an organic layer and an inorganic layer by a separating funnel. These organic layers were concentrated under reduced pressure to obtain 8.9 g of a crude substance.
[0055]
A portion (4.0 g) of the crude substance thus obtained was charged into a column of silica gel [400 g, Wakogel (registered trademark) C-200, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Japan], and chloroform was added to the mixture. 4 liters, 1.0 liter of a solution of chloroform-methanol (20: 1), 1.0 liter of a solution of chloroform-methanol (18: 1), 1.0 liter of a solution of chloroform-methanol (16: 1), 1.0 liter of methanol (14: 1) solution, 1.0 liter of chloroform-methanol (12: 1) solution, 1.0 liter of chloroform-methanol (10: 1) solution, chloroform-methanol (8: 1) ), 1.0 liter of a chloroform-methanol (6: 1) solution, chloroform-methanol (6: 1) 1), 1.0 liter of a solution of chloroform-methanol (2: 1), 1.0 liter of a solution of chloroform-methanol-water (20: 10: 1), and chloroform-methanol-water (20: 1). The solution was eluted stepwise in the order of 1.0 liter of a 10: 10: 1) solution.
[0056]
Next, a chloroform-methanol-water (20: 10: 1) fraction and a chloroform-methanol-water (10: 10: 1) fraction were collected and dried under reduced pressure to obtain 482 mg of a crude substance. This was charged into a column of silica gel [50 g, Wakogel (registered trademark) C-200, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Japan], 150 ml of a solution of chloroform-methanol-acetic acid (100: 10: 1), chloroform-methanol -150 ml of a solution of acetic acid (80: 10: 1), 150 ml of a solution of chloroform-methanol-acetic acid (60: 10: 1), 150 ml of a solution of chloroform-methanol-acetic acid (40: 10: 1), chloroform: methanol: acetic acid Elution was performed stepwise in the order of 150 ml of a (20: 10: 1) solution and 150 ml of a chloroform: methanol: acetic acid (10: 10: 1) solution.
[0057]
A chloroform-methanol-acetic acid (60: 10: 1) fraction and a chloroform-methanol-acetic acid (40: 10: 1) fraction containing the FKI-0929-B component and the FKI-0929-C component were collected and dried under reduced pressure. Solidification afforded 104 mg of a reddish brown crude material. 70 mg thereof was subjected to liquid chromatography [apparatus: CCPM manufactured by Tosoh Corporation (Japan), column: Lobar column size B LiChroprep RP-18 manufactured by Merck (USA) (size 25 × 310 mm, particle diameter 40 to 63 μm, Art No. 10625), detection was UV 254 nm, flow rate was 4 ml / min, elution conditions were methanol-water-acetic acid (30: 70: 0.5) up to 100 minutes, and methanol-water-acetic acid (40: 100: 200 minutes). 60: 0.5), methanol-water-acetic acid (50: 50: 0.5) from 200 minutes to 300 minutes, and then eluted with 100% methanol from 400 minutes). Fraction (hereinafter referred to as fraction X), one fraction from 200 minutes to 275 minutes (hereinafter referred to as fraction Y ) Were collected and concentrated under reduced pressure. Fraction X was a solution of about 0.5 ml of methanol-water-acetic acid (35: 65: 0.5), and fraction Y was about 0.5 ml of methanol. -A solution of water-acetic acid (40: 60: 0.5) was obtained.
[0058]
Fraction X was subjected to liquid chromatography [apparatus: CCPM manufactured by Tosoh Corporation (Japan), column: Lobar column size B LiChroprep RP-18 manufactured by Merck (USA) (size 25 × 310 mm, particle diameter 40 to 63 μm, Art.No.10625), detection was at UV 254 nm, flow rate was 4 ml / min, elution conditions were methanol-water-acetic acid (35: 65: 0.5) for up to 100 minutes, and methanol-water-acetic acid (40 for 100 to 200 minutes). : 60: 0.5), methanol-water-acetic acid (45: 55: 0.5) from 200 minutes to 300 minutes, methanol-water-acetic acid (50: 50: 0.5) from 300 minutes to 400 minutes, and then 500 Eluted with 100% methanol for 1 min) and elution time from 250 min to 275 min, 1 fraction, 275 min A total of four fractions were collected, one fraction up to 00 min, one fraction from 300 to 350 min, and one fraction from 350 to 500 min, and concentrated under reduced pressure to about 0.5 ml of methanol-water-acetic acid (45 ml). : 55: 0.5).
[0059]
Fraction Y was subjected to liquid chromatography [CCPM manufactured by Tosoh Corporation (Japan), Lobar column size B LiChroprep RP-18 manufactured by Merck (USA) (size 25 × 310 mm, particle diameter 40 to 63 μm, Art.No.10625), detection: UV 254 nm, flow rate: 4 ml / min, elution conditions: methanol-water-acetic acid (40: 60: 0.5) up to 100 minutes, methanol-water-acetic acid (45: 100 to 200 minutes). : 55: 0.5), charged with methanol-water-acetic acid (50: 50: 0.5) from 200 minutes to 300 minutes, then eluted with 100% methanol until 400 minutes), elution time from 150 minutes to 175 minutes 1 fraction, 1 fraction from 175 min to 200 min, 1 fraction from 200 min to 225 min, 225 min to 27 min 1 fraction to the minute, collected a total of 5 fractions of a fraction up to 400 minutes minutes 275, about 0.5ml of methanol and concentrated under reduced pressure respectively - water - acetic acid (45: 55: 0.5) to obtain a solution.
[0060]
The nine fractions obtained from the fractions X and Y were further individually subjected to high performance liquid chromatography [CCPE-II manufactured by Tosoh Corporation (Japan), TSKgel manufactured by Tosoh Corporation (Japan) as a column] ODS-80TM(Size 7.8 × 300 mm, particle diameter 5 μm), detection: UV 254 nm, flow rate: 1.5 ml / min, elution condition: methanol-water-acetic acid (45: 55: 0.5), charge amount: 50 per injection By repetitively purifying the solution with a concentration of -200 µl), 1.5 mg of the FKI-0929-B substance was obtained from the peak at the elution time of 15 minutes, and 2.9 mg of the FKI-0929-C substance was obtained from the peak at the elution time of 17 minutes.
[0061]
【The invention's effect】
As described above, the FKI-0929-B substance and the FKI-0929-C substance belonging to the filamentous fungi or a microorganism capable of producing a composition comprising these substances are cultured in a medium, and FKI- By collecting the 0929-B substance and the FKI-0929-C substance or the composition of the substance, an inhibitory active substance for lanosterol synthase can be obtained. It is expected to be effective in preventing and treating adult diseases such as stroke, and as an antifungal agent for fungal infections.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an ultraviolet absorption spectrum (CH) of FKI-0929-B substance according to the present invention.Three(In OH).
FIG. 2 shows an infrared absorption spectrum (KBr method) of FKI-0929-B substance according to the present invention.
FIG. 3 shows the proton nuclear magnetic resonance spectrum (CDCl) of the FKI-0929-B substance according to the present invention.Three).
FIG. 4 shows a carbon nuclear magnetic resonance spectrum (CDCl) of the FKI-0929-B substance according to the present invention.Three).
FIG. 5 shows an ultraviolet absorption spectrum (CH) of the FKI-0929-C substance according to the present invention.Three(In OH).
FIG. 6 shows an infrared absorption spectrum (KBr method) of FKI-0929-C substance according to the present invention.
FIG. 7 shows the proton nuclear magnetic resonance spectrum (CDCl) of the FKI-0929-C substance according to the present invention.Three).
FIG. 8 shows a carbon nuclear magnetic resonance spectrum (CDCl) of the FKI-0929-C substance according to the present invention.Three).
