JPWO2003102182A1 - 炎症性皮膚疾患に関連するｓｌｕｒｐ−２遺伝子およびその利用 - Google Patents

Abstract

マイクロアレイで正常組織と乾癬病変組織との間に遺伝子発現の点で有意差が認められたｃＤＮＡクローンの中から新規遺伝子を同定した。この遺伝子をＳＬＵＲＰ−２（分泌型Ｌｙ−６／ｕＰＡＲ関連タンパク質−２）遺伝子と命名した。全ＲＮＡ抽出物を用いた定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により、この遺伝子の発現を乾癬病変皮膚、非病変皮膚および正常皮膚で比較したところ、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子は乾癬病変皮膚で有意にアップレギュレートされていることが示された。従って、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子は、乾癬などの炎症性皮膚疾患の診断マーカーとなりうる。

Description

技術分野
本発明は、炎症性皮膚疾患関連遺伝子およびその利用に関する。
背景技術
尋常性乾癬（ＭＩＭ １７７９００）は慢性炎症性皮膚疾患であり、有病率は白人では２〜３％（Ｎｅｖｉｔｔ，Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．（１９９６）．Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３５：５３３−５３８．）、英国および欧州では１〜２％（Ｈｅｌｌｇｒｅｎ，Ｌ．（１９６７）．Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ：Ｔｈｅ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｉｎ Ｓｅｘ，Ａｇｅ ａｎｄ Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｔｏｔａｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｗｅｄｅｎ．Ａｌｍｑｕｉｓｔ ＆ Ｗｉｋｓｅｌｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ．、Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｇ．Ｇ．，Ｂｅｒｇｓｔｒｅｓｓｅｒ，Ｐ．Ｒ．，Ｎｉｃｈｏｌａｓ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ Ｖｏｏｒｈｅｅｓ，Ｊ．Ｊ．（１９８４）．Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ａｍ Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１：９３７−９４７．）、極東（Ｓｉｍｏｎｓ，Ｒ．Ｄ．（１９４９）．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２：２８６−２９４．）および中国（Ｙｕｉ Ｙｉｐ，Ｓ．（１９８４）．Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０：９６５−９６８．）では０．１〜０．３％である。日本人で観測されている発生率はこれよりも低く、０．１％である。
尋常性乾癬症例の大半は散発性である。本症は、表皮過剰増殖を示す皮膚病変の発生、ケラチノサイト分化異常（例えば、ケラチノサイトの過剰増殖）、活性化ヘルパーＴ細胞および単核細胞の浸潤ならびに炎症誘発性サイトカインの放出に起因する炎症を特徴とする（Ｍｅｎｔｅｒ，Ａ．，ａｎｄ Ｂａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｎ．Ｗ．Ｎ．（１９９１）．Ｌａｎｃｅｔ ３３８：２３１．、Ｓｔｅｍ，Ｒ．Ｓ．（１９９７）．Ｌａｎｃｅｔ，３５０：３４９−３５３．）。
乾癬病変は非皮膚性の誘発因子によって供給される抗原／スーパー抗原または自己抗原によって惹起されることが示唆されている（Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ，ＩＭ，Ｅｉｓｅｎ，ＡＺ，Ｗｏｌｆｆ，Ｋ，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，ＬＡ，Ｋａｔｚ，ＳＩ，Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，ＴＢ．（１９９８）．ＦＩＴＺＰＡＴＲＩＣ’Ｓ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ｉｎ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１，５１０．）。さらに、多くの報告により、Ｔ細胞が本症の免疫病理に極めて重要な役割を果たすことが明らかになっている（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｓ．Ｌ．，Ｇｉｌｌｅａｕｄｅａｕ，Ｐ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．，Ｅｓｔｅｓ，Ｌ．，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｔｏ ａ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｎ（ＤＡＢ３９８ＩＬ−２）ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｍｍｕｎｅ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：４４２−４４７．；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｋ．Ｄ．，Ｖｏｏｒｈｅｅｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｇ．Ｊ．，Ｃｈａｎ，Ａ．Ｋ．ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９０）．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ ｏｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２３：１３１８−１３２６．；Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｃａｈｍｃｈｉｃｋ，Ｎ．，Ｔｈｉｖｏｌｅｔ，Ｊ．，Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，Ｊ．，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）．ＣＤ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３３８：３２１．；Ｕｙｅｍｕｒａ，Ｋ．，Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｆｉｖｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．，Ｍｏｄｌｉｎｅ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．（１９９３）．Ｔｈｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎ ｌｅｓｉｏｎａｌ ａｎｄ ｌｅｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ｓｋｉｎ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ａ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ １ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１：７０１−７０５．；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ Ｗｒｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．（１９９９）．Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅ−ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ｓｋｉｎ ｗｉｔｈ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：１４５−１５８．）。
乾癬の家族集積性は十分に確認されており（Ｈｅｌｌｇｒｅｎ，Ｉ．（１９６７）．Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ：Ｔｈｅ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｉｎ Ｓｅｘ，Ａｇｅ，ａｎｄ Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ ｉｎ Ｔｏｔａｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｗｅｄｅｎ：Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｏｔｈｅｒ Ｓｋｉｎ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｓｔｏｃｋｏｌｍ：Ａｌｍｑｖｉｓｔ ａｎｄ Ｗｉｋｓｅｌｌ．）、遺伝率が７０〜９０％の範囲にあることが双生児研究で示されている（Ｆａｂｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ａｎｄ Ｎａｌｌ，Ｍ．Ｌ．（１９７４）．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ（Ｂａｓｅｌ）１４８：１−１８，１９７４．、Ｂｒａｎｄｒｕｐ，Ｆ．，Ｈａｕｇｅ，Ｍ．，Ｈｅｎｎｉｎｇｓｅｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｅｒｉｃｋｓｅｎ，Ｂ．（１９７８）．Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４：８７４−８７８．、Ｂｒａｎｄｒｕｐ，Ｆ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ａ．（１９８１）．Ａｃｔａ．Ｄｅｒｍ．−Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．６１：３４４−３４６．、Ｂｒａｎｄｒｕｐ，Ｆ．，Ｈｏｌｍ，Ｎ．，Ｇｒｕｎｎｅｔ，Ｋ．，Ｈｅｎｎｉｎｇｓｅｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．（１９８２）．Ａｃｔａ．Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．６２：２２９−２３６．、Ｂｒａｎｄｒｕｐ，Ｆ．（１９８７）．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｗｉｎｓ ｉｎ ｅｔｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ｉｎ Ｆｒａｂｅｒ，Ｅ．，Ｎａｌｌ，Ｌ．，Ｍｏｒｈｅｎｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）．Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｕｒｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．４０１−４０２．、Ｄｕｆｆｙ，Ｄ．Ｌ．，Ｓｐｅｌｍａｎ，Ｌ．Ｓ．，ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｎ．Ｇ．，（１９９３）．Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２９：４２８−４３４．）。このような家族研究から乾癬には強い遺伝的要素があることが明確に示されている（Ａｂｅｌｅ，Ｄ．Ｃ．，Ｄｏｂｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｂ．（１９６３）．Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８８：３８−４７．、Ｆａｒｂｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ｎａｌｌ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ，Ｗ．（１９７４）．Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０９：２０７−２１１．、Ｂｒａｎｄｒｕｐ，Ｆ．，Ｈａｕｇｅ，Ｍ．，Ｈｅｎｎｉｎｇｓｅｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｅｒｉｋｓｅｎ，Ｂ．（１９７８）．Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４：８７４−８７８．）。
乾癬の感受性遺伝子座は染色体６ｐ（ＰＳＯＲＳ１ ［ＭＩＭ １７７９００］）（Ｔｒｅｍｂａｔｈ，Ｒ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｈｕｍ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：８１３−８２０．、Ｎａｉｒ，Ｒ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：１３４９−１３５６．、Ｏｋａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．８：２１６５−２１７０．）、１７ｑ（ＰＳＯＲＳ２［ＭＩＭ ６０２７２３］）（Ｔｏｍｆｏｈｒｄｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：１１４１−１１４５．）および４ｑ（ＰＳＯＲＳ３［ＭＩＭ ６０１４５４］）（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：２３１−２３３．）にいくつか記載されており、ほかにも乾癬遺伝子座と推定される候補が染色体１６ｑ、２０ｐ（Ｎａｉｒ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：１３４９−１３５６．）、８ｑ（Ｂｒａｎｄｒｕｐ，Ｆ．，Ｈａｕｇｅ，Ｍ．，Ｈｅｎｎｉｎｇｓｅｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｅｒｉｋｓｅｎ，Ｂ．（１９７８）．Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４：８７４−８７８．）、１ｑ（ＰＳＯＲＳ４［ＭＩＭ ６０３９３５］）（Ｃａｐｏｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ，（１９９９）．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：３２−３５．）および３ｑ（ＰＳＯＲＳ５［ＭＩＭ ６０４３１６］）（Ｅｎｌｕｎｄ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７：７８３−７９０．）に報告されている。
Ｌｙ−６スーパーファミリーは、特徴的な配置パターンを示す８〜１０個の保存的システイン残基を有し、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカーを介して細胞表面に付着するという、特有の構造を有する一群のリンパ球抗原である（Ｐａｌｆｒｅｅ，Ｒ．Ｇ．（１９９６）．Ｌｙ−６ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒｓ：ａ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｌｙ−６ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｓｐｅｒｍ ａｃｒｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰ−１０．Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ４８：７１−７９．；Ｌｏｗ，Ｍ．Ｇ．（１９８９）．Ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ａｎｃｈｏｒ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ ９８８：４２７−４５４．）。これには２つのサブファミリーがあり（Ａｄｅｒｍａｎｎ，Ｋ．，Ｗａｔｔｌｅｒ，Ｆ．，Ｗａｔｔｌｅｒ，Ｓ．，Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．，Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｗ．Ｇ．ａｎｄ Ｎｅｈｌｓ，Ｍ．（１９９９）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＳＬＵＲＰ−１，ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｙ６／ｕＰＡＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．８：８１０−８１９．）、その１つは上記の膜貫通型タンパク質であるが、もう１つはＧＰＩ−アンカーのない分泌タンパク質である。
Ｌｙ−６スーパーファミリーのメンバーは、マウスで最初に同定されて以来（ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉ．Ｆ．，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｊ．，Ｃｈｅｒｒｙ，Ｍ．，ａｎｄ Ｓｎｅｌｌ，Ｇ．Ｄ．（１９７７）．Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ：Ｌｙ−４，Ｌｙ−６，ａｎｄ Ｌｙ−７．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．９：６６７−６６９．）、マウスだけでなくヒトでも多くのファミリータンパク質が単離されている。ヒトのＬｙ−６スーパーファミリーには、ＣＤ５９（Ｂｉｃｋｍｏｒｅ，Ｗ．Ａ．，Ｌｏｎｇｂｏｔｔｏｍ，Ｄ．，Ｏｇｈｅｎｅ，ｋ．，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ ｖａｎ Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ，Ｖ．（１９９３）．Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＤ５９ ｇｅｎｅ ｔｏ １１ｐ１３ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＭＩＣ１１ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１７：１２９−１３５．）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）（Ｓｕｈ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｅｒｌｏｖ，Ｃ．，Ｄａｎｏ，Ｋ．，ａｎｄ Ｄｅｇｅｎ，Ｊ．Ｌ．（１９９４）．Ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５９９２−２５９９８．）、前立腺幹細胞抗原（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｇｕ，Ｚ．，Ｗａｔａｂｅ，Ｔ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．，Ｓｚｉｇｅｔｉ，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ：ａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｉ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１７３５−１７４０．）、ＳＰ−１０（Ｐａｌｆｒｅｅ，Ｒ．Ｇ．（１９９６）．Ｌｙ−６ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒｓ：ａ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｌｙ−６ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｓｐｅｒｍ ａｃｒｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰ−１０．Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ４８：７１−７９．）、およびリンパ球抗原前駆体を除く蛇毒（Ｍｉｗａ，Ｊ．Ｍ．，Ｉｂａｎｅｚ−Ｔａｌｌｏｎ，Ｉ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｇ．Ｗ．，Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｒ．，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｎｅｕｒｏｎ ２３：１０５−１１４．）が含まれる。そのメンバーの大部分は第８番染色体、特に８ｑ２４．３に認められ、これはマウス第１５番染色体、ＤバンドのマウスＬｙ−６遺伝子座と相同である（Ｋａｍｉｕｒａ，Ｓ．，Ｎｏｌａｎ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｍｅｒｕｅｌｏ，Ｄ．（１９９２）．Ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｙ−６ ｃｏｍｐｌｅｘ：ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｌｙ−６ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｂｙ ｆｉｅｌｄ−ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １２：８９−１０５．）。ヒトＬｙ−６スーパーファミリーの大部分のメンバーの機能はまだ解明されていない。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規な炎症性皮膚疾患関連遺伝子を単離・同定し、該遺伝子の利用方法を提供することにある。より詳細には、新規乾癬関連遺伝子およびその利用方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、新規乾癬関連遺伝子を同定するために、マイクロアレイを用いて、乾癬患者の罹患部および非罹患部の皮膚に生じる転写変化を正常対照と比較する包括的解析を行った。その結果、乾癬病変において正常組織と比べて約１０倍以上アップレギュレートまたはダウンレギュレートされるＥＳＴを８６個見出した。本発明者らは、そのうちの１つについて、ＲＡＣＥおよびオリゴキャッピング法を用いて完全長ｃＤＮＡを単離した。ホモロジー検索の結果、該ｃＤＮＡからコードされるタンパク質は、Ｌｙ−６／ｕＰＡＲスーパーファミリーの新規メンバーであることが判明した。本発明者らは、該ｃＤＮＡからコードされるタンパク質をＳＬＵＲＰ−２（分泌型Ｌｙ−６／ｕＰＡＲ関連タンパク質−２）と命名した。ＲＴ−ＰＣＲ発現解析により、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子が多くの組織で発現し、主として上皮組織で発現することが明らかになった。また、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子は骨髄と脾臓では検出されなかったが、胸腺では検出された。全ＲＮＡ抽出物を用いた定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により、この遺伝子の発現を乾癬病変皮膚、非病変皮膚および正常皮膚で比較したところ、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子は乾癬病変皮膚で有意にアップレギュレートされていることが示された。従って、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子は、乾癬などの炎症性皮膚疾患の診断マーカーとなりうる。
即ち、本発明は、炎症性皮膚疾患関連遺伝子およびその利用に関し、より具体的には、
〔１〕下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
〔２〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
〔３〕〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡによりコードされるポリペプチド、
〔４〕〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
〔５〕〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡまたは〔４〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
〔６〕〔５〕に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたポリペプチドを回収する工程を含む、〔３〕に記載のポリペプチドの製造方法、
〔７〕〔３〕に記載のポリペプチドに結合する抗体、
〔８〕モノクローナル抗体である、〔７〕に記載の抗体、
〔９〕〔１〕に記載のＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔３〕に記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法、
（ａ）該ポリペプチドに被検試料を接触させる工程
（ｂ）該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程
（ｃ）該ポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程
〔１１〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、炎症性皮膚疾患の検査方法、
（ａ）被検者からＲＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ＲＮＡ試料に含まれる〔３〕に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたＲＮＡの量を対照と比較する工程
〔１２〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、炎症性皮膚疾患の検査方法、
（ａ）被検者からｃＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ｃＤＮＡ試料に含まれる〔３〕に記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する工程
〔１３〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、炎症性皮膚疾患の検査方法、
（ａ）被検者からポリペプチド試料を調製する工程
（ｂ）該ポリペプチド試料に含まれる〔３〕に記載のポリペプチドの量を測定する工程
（ｃ）測定されたポリペプチドの量を対照と比較する工程
〔１４〕炎症性皮膚疾患が乾癬である、〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の検査方法、
〔１５〕〔９〕に記載のオリゴヌクレオチドを含む、炎症性皮膚疾患の検査薬、
〔１６〕〔７〕または〔８〕に記載の抗体を含む、炎症性皮膚疾患の検査薬、
〔１７〕炎症性皮膚疾患が乾癬である、〔１５〕または〔１６〕に記載の検査薬、
を提供するものである。
本発明は、新規な遺伝子「ＳＬＵＲＰ−２（分泌型Ｌｙ−６／ｕＰＡＲ関連タンパク質−２）遺伝子」を提供する。ヒトＳＬＵＲＰ−２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
ＳＬＵＲＰ−２遺伝子は、炎症性皮膚疾患の罹患部において発現している遺伝子として単離された。よって、該遺伝子は、炎症性皮膚疾患の診断マーカーとして利用することができる。また、該遺伝子は、炎症性皮膚疾患の治療や予防への応用が期待される。
本発明において、炎症性皮膚疾患とは、活性化ヘルパーＴ細胞および単核細胞などの炎症性細胞の浸潤、および、表皮肥厚やケラチノサイト分化異常に起因する皮膚病変の発生を特徴とする疾患を意味する。本発明における炎症性皮膚疾患としては、例えば、乾癬、扁平苔癬、毛孔性紅色粃糠疹、掌蹠膿疱症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、乾癬をは、通常、尋常性乾癬を意味するが、本発明における乾癬は、尋常性乾癬だけでなく、膿疱性乾癬、関節症性乾癬などのその他の乾癬が含まれる。
本発明は、また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。このようなＤＮＡには、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドの変異体、アレル、バリアント、ホモログ等をコードするＤＮＡが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるポリペプチドが、ＳＬＵＲＰ−２と同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。また、本発明におけるＳＬＵＲＰ−２は、炎症性皮膚疾患の罹患部において、その発現が非罹患部と比較して上昇する性質を有することが好ましい。対象となるＤＮＡからコードされるポリペプチドが、同様の性質を有するか否かは、当業者らに周知の方法によって測定することが可能である。
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者においては、ＳＬＵＲＰ−２をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１）もしくはその一部を利用して、これと相同性の高いＤＮＡを単離すること、さらに、該ＤＮＡからＳＬＵＲＰ−２と機能的に同等なポリペプチドを単離することは、周知の技術である。
本発明には、ＳＬＵＲＰ−２をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＳＬＵＲＰ−２と機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ由来のホモログが挙げられるが、これらに制限されない。
ＳＬＵＲＰ−２と機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られると期待される。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、ＳＬＵＲＰ−２をコードするＤＮＡ（配列番号：１）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して、ＳＬＵＲＰ−２と機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、ＳＬＵＲＰ−２と機能的に同等なポリペプチドは、通常、ＳＬＵＲＰ−２とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明のポリペプチドには、ＳＬＵＲＰ−２と機能的に同等であり、かつ該ポリペプチドのアミノ酸配列と高い相同性を有するポリペプチドも含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、ＳＬＵＲＰ−２のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明に含まれる。このようなアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。変異するアミノ酸数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、より好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であり、さらに好ましくは２アミノ酸以内である。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
また、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ，ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、ＳＬＵＲＰ−２のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。
ＳＬＵＲＰ−２のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドには、これらポリペプチドを含む融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、これらポリペプチドと他のポリペプチドとが融合したものであり、本発明に含まれる。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、ＳＬＵＲＰ−２をコードするＤＮＡと他のポリペプチドをコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のポリペプチドとの融合に付される他のポリペプチドとしては、特に限定されない。
本発明のポリペプチドとの融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のポリペプチドとの融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらポリペプチドをコードするＤＮＡを本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
本発明のＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明のポリペプチドをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドを発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより天然由来のＤＮＡが調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のポリペプチドを発現する細胞、組織（例えば、脳、肺、食道、胃、小腸、結腸、直腸、精巣、子宮、子宮頚部、胸腺、皮膚、胎児皮膚、表皮ケラチノサイトなど）または炎症性皮膚疾患の罹患部などから、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業社）等を用いて行うこともできる。また、５’−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）に従い、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｒ４３−７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
また、本発明は、ＳＬＵＲＰ−２をコードするＤＮＡ（配列番号：１）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含む。ＳＬＵＲＰ−２遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子の発現量を測定するのに用いることが可能である。従って、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、必ずしもポリペプチドをコードしている必要はない。このようなＤＮＡは、配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域にハイブリダイズすることが好ましい。又、１００塩基以上の長さを有していることが好ましく、さらに好ましくは２００塩基以上、もつとも好ましくは２５０塩基以上である。
ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件については、前述の条件を用いることができる。このようにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、通常、高い同一性（例えば、７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性）を有する。
本発明は、上記本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたポリペプチドが、ＳＬＵＲＰ−２と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明のポリペプチドを原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明のポリペプチドはこのようなポリペプチドも包含する。
本発明のポリペプチドは、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして、また天然のポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドであれば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明のポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然のポリペプチドであれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のポリペプチドを発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明のポリペプチドに結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明のポリペプチドの部分ペプチドを包含する。本発明の部分ペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体の作製、本発明のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニングや、本発明のポリペプチドの促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。また、本発明のポリペプチドのアンタゴニストや競合阻害剤になり得る。
本発明の部分ペプチドは、免疫原とする場合には、少なくとも７アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。本発明のポリペプチドの競合阻害剤として用いる場合には、少なくとも１００アミノ酸以上、好ましくは２００アミノ酸以上、さらに好ましくは３００アミノ酸以上（例えば、４００アミノ酸以上）のアミノ酸配列からなる。
本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のポリペプチドを適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持させたり、本発明のポリペプチドを発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。
ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。
本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明のＳＬＵＲＰ−２遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であってもｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のポリペプチドの製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することによりポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｍａ Ｊ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明のポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたポリペプチドも包含する。
なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明のポリペプチドと結合する抗体としては、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体変異体等が例示できる。
本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、天然において起こり得る少量で存在する変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作用するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含む慣用な（ポリクローナル）抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えば後述するハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５））、または、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物学的活性を有する限り、このような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
本発明において、「抗体変異体」とは、１またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアントであれ、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本発明における「抗体変異体」に含まれる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と１００％よりも少ない配列相同性、または類似性を有する。
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹膜内（ｉｐ）注射により非ヒト哺乳動物で作られる。免疫化される種に対して免疫原性のタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、仔ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに、例えば、マレイミドベンゾイルスルフォスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、塩化チオニル、若しくはＲ^１Ｎ＝Ｃ＝ＣＲ（式中、Ｒ及びＲ^１は異なるアルキル基である）等の二機能性の薬剤若しくは誘導剤を用いて関連抗原を結合させることもできる。
例えば、１００μｇ若しくは５μｇのタンパク質若しくはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスについての量）を３倍量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバントと合わせ、溶液を複数回、皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫化する。一ヶ月後、動物をもとのＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの１／５〜１／１０量を複数の部位に皮下注射することにより追加免疫する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価について分析する。好ましくは、動物の追加免疫の際には、同じ抗原ではあるが異なるタンパク質に、及び／または、異なる交差結合試薬を介して結合されたコンジュゲートを用いる。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養タンパク質融合で作成することもできる。また、免疫応答を増幅するため、ミョウバン等の凝集剤が好ましくは用いられる。選択された哺乳動物抗体は通常、抗原に対して十分に強い結合親和性を有する。抗体の親和性は、飽和結合、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、及び競合分析（例えば、放射性免疫分析）により決定することができる。
所望のポリクローナル抗体のスクリーニング法としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｙ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ ｅｄｉｔ．（１９８８））に記載されるような慣用の交差結合分析を行うことができる。また、代わりに、例えば、エピトープマッピング（Ｃｈａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５））を行ってもよい。ポリペプチドまたは抗体の効力の測定方法として好ましいのは、抗体結合親和性の定量化を用いた方法であるが、その他の態様では、それに加えて、または結合親和性測定に代えて抗体の１若しくはそれ以上の生物学的特性を評価する方法を含む。このような分析法は特に、抗体の治療的な有効性を示すので有用である。通常、必ずしもではないが、このような分析において改善された特性を示す抗体はまた、結合親和性も増幅されている。
モノクローナル抗体は単一の抗原部位を認識する抗体であり、均一な特異性により、一般的に多数の異なる抗原部位を認識する抗体を含むポリクローナル抗体よりも有用である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５））または、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）等により製造することができる。
ハイブリドーマ法では、マウス、または、ハムスター若しくはアカゲザル等の他の適当な宿主動物を免疫化に使用したタンパク質に対して特異的に結合する抗体を産生するか、または、産生できるリンパ球を誘導するために上述と同様に免疫化する。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてリンパ球を免疫化することもできる。その後、リンパ球をポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９０−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））。製造されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の生育または成長を阻害する１またはそれより多くの物質を含む適当な培養培地に植え、生育する。例えば、もし親ミエローマ細胞がヒポキサンチン グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、そのハイブリドーマのための培養培地には、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の生育を阻止する物質ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンが含まれる（ＨＡＴ培地）。好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞において、安定で高いレベルで抗体を産生し、そして、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性の細胞である。これらの中で好ましいミエローマセルラインは、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）から入手できるＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞、並びに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡ）から入手できるＳＰ−２、またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞等のマウスミエローマラインである。ヒトミエローマ、及び、マウス−ヒトｈｅｔｅｒｏｍｙｃｌｏｍａセルラインも、ヒトモノクローナル抗体の産生に用いられてきた（Ｋｏｚｂａｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
次に、ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降、または、放射免疫分析（ＲＩＡ）若しくは酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）等のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合分析により測定する。所望の特異性、親和性及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限定的希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により生育する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。この目的に適した培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＩＭ−１６４０培地である。さらに、ハイブリドーマ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで動物中の腹水腫瘍として生育させることもできる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、好ましくは培養培地、腹水液、または血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー等の慣用な免疫グロブリン精製方法により分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させる。また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０））により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片を単離することができる。
Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１））、及びＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））は、各々、ファージライブラリーを用いたマウス及びヒト抗体の単離について記載する。次の文献は、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体のチェーンシャッフリングによる製造（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２））について、そして、巨大なファージライブラリーを構築するための方法としてのコンビナトリアル感染、及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））について記載する。これらの技術も、モノクローナル抗体の単離のために従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代えて利用し得る。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖、及び軽鎖の定常ドメインのコード配列をそれに対するマウス配列に代えて置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンポリペプチドを共有結合により結合させることにより改変することができる。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、１つの抗原に対して特異性を有する抗原結合部位、及び、異なる抗原に対して特異性を有する抗原結合部位を有するキメラ二特異性抗体を構築するため、抗体の定常ドメインで置換するか、または、抗体の抗原結合部位の可変ドメインを置換する。
また、本発明のポリペプチドと結合する抗体としては、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ）等もまた挙げられる。
上記「ヒト化抗体」とは再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
「キメラ抗体」とは、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である抗体を意味する。
本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と呼ばれる、それぞれ１つの抗原結合部位を有する２つの同じ抗原結合断片、及び、残りの容易に結晶化するために「Ｆｃ」と呼ばれる断片が生じる。また、ペプシン消化により２つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得るＦ（ａｂ’）_２断片、及び、残りの別な断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。その他の断片としては、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片より形成された多特異性抗体が含まれる。
ここで、「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。この領域は１つの重鎖及び軽鎖の可変ドメインが非共有結合により強く連結されたダイマーである（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌダイマー）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合部位を付与するものである。しかしながら、１つの可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常ドメイン、及び、重鎖の細胞の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点で異なる。
本発明において、「ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、該断片は、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖中で２つのドメインの間を結合できない位に短いリンカーを用いると、２つのドメインはもう一方の鎖の定常ドメインとペアを形成し、２つの抗原結合部位が創り出される。Ｄｉａｂｏｄｙはより詳細に、例えば、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、及びＨｏｌｌｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３））に記載される。
一本鎖抗体（以下、一本鎖Ｆｖ若しくはｓＦｖとも呼ぶ）、またはｓＦｖ抗体断片には、抗体のＶＨ及びＶＬドメインが含まれ、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、それによりｓＦｖは、抗原結合のために必要な構造が形成できる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏｌ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４））参照。
多特異性抗体は、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。通常このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体）、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上の（例えば、３種類の）抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二特異性抗体）であり得る。
従来、抗体断片は天然の抗体のプロテアーゼによる消化により製造されてきた（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５））が、現在は組換技術により製造することも可能である。例えば、上述の抗体ファージライブラリーから抗体断片を単離することもできる。また、大腸菌等の宿主より直接Ｆ（ａｂ’）_２−ＳＨ断片を回収し、Ｆ（ａｂ’）_２断片の形態に化学的に結合させることもできる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。さらにまた別の方法としては、Ｆ（ａｂ’）_２断片を直接、組換宿主培養物から単離することもできる。その他、一本鎖抗体等の断片の作製方法も公知である。一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。
当分野において多特異性抗体の製造法は公知である。全長の二特異性抗体の産生は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の共発現を含むものである（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖はランダムに取り合わされるので、共発現を行う得られた複数のハイブリドーマ（クワドローマ）は、各々異なる抗体分子を発現するハイブリドーマの混合物であり、このうち正しい二特異性抗体を産生するものを選択する必要がある。選択はアフィニティークロマトグラフィー等の方法により行うことができる。また、別な方法では所望の結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。該定常ドメイン配列は、好ましくは免疫グロブリンの重鎖の定常領域の内、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖のＣＨ１領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。別々の発現ベクターに各遺伝子を挿入することにより、それぞれの鎖の存在割合が同じでない方が、得られる抗体の収量が上がる場合に、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。
好ましい態様においては、第一の結合特性を有する重鎖がハイブリッド免疫グロブリンの一方の腕として存在し、別の結合特性の重鎖−軽鎖複合体がもう一方の腕として存在する二重特異性抗体が望ましい。このように一方の腕のみに軽鎖を存在させることにより、二重特異性抗体の他の免疫グロブリンからの分離を容易に行うことができる。該分離方法については、ＷＯ９４／０４６９０参照。二特異性抗体の作成方法については、さらに、Ｓｕｒｅｓｈら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６））の方法を参照することができる。組換細胞培養物から得られる最終産物中のホモダイマーを減らしヘテロダイマーの割合を増加させる方法として、抗体の定常ドメインのＣＨ３を含み、一方の抗体分子において、他方の分子と結合する表面の１若しくは複数の小さな側鎖のアミノ酸を大きな側鎖のアミノ酸（例えば、チロシンやトリプトファン）に変え、他方の抗体分子の対応する部分の大きな側鎖のアミノ酸を小さなもの（例えば、アラニンやスレオニン）に変えて第一の抗体分子の大きな側鎖に対応する空洞を設ける方法も知られている（ＷＯ９６／２７０１１）。
二重特異性抗体には、例えば、一方の抗体がアビジンに結合され、他方がビオチン等に結合されたようなヘテロ共役抗体が含まれる（米国特許第４，６７６，９８０号；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／００３７３；ＥＰ０３０８９）。このようなヘテロ共役抗体の作成に利用される架橋剤は周知であり、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号にもそのような例が記載されている。
また、抗体断片より二特異性抗体を製造する方法も報告されている。例えば、化学結合を利用して製造することができる。例えば、まずＦ（ａｂ’）_２断片を作成し、同一分子内でのジフルフィド形成を防ぐため断片をジチオール錯化剤アルサニルナトリウムの存在化で還元する。次にＦ（ａｂ’）_２断片をチオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。メルカプトエチルアミンを用いて一方のＦ（ａｂ’）_２−ＴＮＢ誘導体をＦａｂ’−チオールに再還元した後、Ｆ（ａｂ’）_２−ＴＮＢ誘導体及びＦａｂ’−チオールを等量混合し二特異性抗体を製造する。
組換細胞培養物から直接、二重特異性抗体を製造し、単離する方法も種々、報告されている。例えば、ロイシンジッパーを利用した二重特異性抗体の製造方法が報告されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２））。まず、Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させ、ホモダイマーの抗体をヒンジ領域においてモノマーを形成するように還元し、抗体ヘテロダイマーとなるように再酸化する。また、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、これら２つのドメイン間での対形成できない位に短いリンカーを介して連結し、相補的な別のＶＬ及びＶＨドメンと対を形成させ、それにより２つの抗原結合部位を形成させる方法もある（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３））。また、一本鎖Ｆｖ（ｓＦＶ）を用いたダイマーについても報告されている（Ｇｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４））。さらに、二重特異性ではなく三重特異性の抗体についても報告されている（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。
ヒト抗体は当業者に公知の方法で得ることができる。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、所望のヒト抗体を得ることができる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原を投与して抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／２５５８５号公報、ＷＯ ９３／１２２２７号公報、ＷＯ ９２／０３９１８号公報、ＷＯ ９４／０２６０２号公報参照）。
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡを、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより宿主を形質転換して得られる遺伝子組換え宿主であって、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する宿主を培養することにより培養上清中から得ることもできる。ここで、該宿主は受精卵以外の真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞である。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
抗体には治療目的として各種試薬を結合して使用することもできる。このような試薬としては、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソールなどの化学療法剤、重金属、放射核種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ解毒素などのトキシン類を挙げることができる。治療用試薬との結合体を生産する方法および治療用に使用する方法については、米国特許５０５７３１３号、米国特許５１５６８４０号に記載されている。
本発明はまた、本発明のＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。
ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる二本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。また、「オリゴヌクレオチド」にはポリヌクレオチドも含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該ＤＮＡの発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明のポリペプチドの発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするＤＮＡ等）として使用することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡアレイの基板の形態で使用することができる。
該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、本発明のＤＮＡまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。また、プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的とし、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のＤＮＡまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を^３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして^３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のポリペプチドの産生細胞に作用して、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明のポリペプチドの発現を抑制することにより、結果的に本発明のポリペプチドの作用を抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のポリペプチドの発現を阻害し、従って、本発明のポリペプチドの生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、本発明のポリペプチドの生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
本発明において「基板」とは、オリゴヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明の基板は、オリゴヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものオリゴヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
本発明において、オリゴヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ｂｐであり、好ましくは１０〜５０ｂｐであり、さらに好ましくは１５〜２５ｂｐである。
また、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法を提供する。この方法は、本発明のポリペプチドとこれに結合する化合物を含むと予想される被検試料とを接触せしめ、該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出し、そして本発明のポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択することを含む。
スクリーニングに用いられる本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドであっても、天然由来のポリペプチドであってもよい。また部分ペプチドであってもよい。また細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製ポリペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被検試料を接触させる本発明のポリペプチドは、例えば、精製したポリペプチドとして、可溶型ポリペプチドとして、担体に結合させた形態として、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分として被検試料に接触させることができる。
本発明のポリペプチドを用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ Ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ ＬＴＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７）），ＳＲ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明のポリペプチドのＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとして本発明のポリペプチドを発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。
融合ポリペプチドにすることにより本発明のポリペプチドの性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７ ｇｅｎｅ１０タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明のポリペプチドに結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープー抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明のポリペプチド、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明のポリペプチドに対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のポリペプチドに対する抗体は、例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明のポリペプチドの部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明のポリペプチドを、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明のポリペプチドの抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的には本発明のポリペプチドに結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である^３５Ｓ−メチオニンや^３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
また、本発明のポリペプチドを用いて、該ポリペプチドに結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識した本発明のポリペプチドと上記フィルターとを反応させ、本発明のポリペプチドと結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明のポリペプチドを標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドに融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
２−ハイブリッドシステムにおいては、本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドをＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内で本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これにより本発明のポリペプチドに結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２−ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
本発明のポリペプチドと結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティークロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドに結合したポリペプチドを調製することができる。
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
また、ポリペプチドに限らず、本発明のポリペプチドに結合する化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）を単離する方法としては、例えば、固定した本発明のポリペプチドに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のポリペプチドに結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐＴ７−９）が当業者に公知である。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明のポリペプチドと被検化合物との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明のポリペプチドと被検化合物との結合を評価することが可能である。
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物は、本発明のポリペプチドの活性を調節するための薬剤の候補となり、本発明のポリペプチドの発現異常や機能異常などに起因する疾患や本発明のポリペプチドの活性を制御することにより治療可能な疾患の治療への応用が考えられる。治療や予防の対象となる疾患としては、好ましくは炎症性皮膚疾患である。本発明は、このようなスクリーニングにより単離しうる化合物も包含する。
本発明は、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子の発現量を測定する工程を含む、炎症性皮膚疾患の検査方法を提供する。以下に検査方法の具体的な態様を記載するが、本発明の検査方法は、それらの方法に限定されるものではない。
本発明の検査方法の１つの態様としては、まず、被検者からＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料に含まれる本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡの量を測定する。次いで、測定されたＲＮＡの量を対照と比較する。別の態様としては、まず、被検者からｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、該ｃＤＮＡ試料に含まれる本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの量を測定する。次いで、測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する。これらのような方法としては、当業者らに周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法等を挙げることができる。
ＤＮＡアレイ法においては、被検者から調製したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ試料を調製し、本発明のオリゴヌクレオチドが固定された基板と接触させ、該ｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれるＳＬＵＲＰ−２遺伝子の発現量を測定する。次いで、測定されたＳＬＵＲＰ−２遺伝子の発現量を対照と比較する。
被検者からのｃＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。ｃＤＮＡ試料の調製の好ましい態様においては、まず被検者の細胞あるいは組織（例えば、皮膚ケラチノサイト）から全ＲＮＡの抽出を行う。全ＲＮＡの抽出は、当業者にとって周知の方法、例えば次のようにして行うことができる。全ＲＮＡ抽出には純度の高い全ＲＮＡが調製できる方法であれば、既存の方法およびキット等を用いることが可能である。例えばＡｍｂｉｏｎ社“ＲＮＡ ｌａｔｅｒ”を用い前処理を行った後、ニッポンジーン社”Ｉｓｏｇｅｎ”を用いて全ＲＮＡの抽出を行う。具体的方法にはそれらの添付プロトコールに従えばよい。
次いで、抽出した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡの合成を行い、ｃＤＮＡ試料を調製する。全ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、当業者に周知の方法で実施することができる。調製したｃＤＮＡ試料には、必要に応じて、検出のための標識を施す。標識物質としては、検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、蛍光物質、放射性元素等を挙げることができる。標識は、当業者によって一般的に行われる方法（Ｌ Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅｄａｄｊａｃｅｎｔ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９９，１１７−１２２）で実施することができる。
ヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとのハイブリダイズの強度の検出は、ｃＤＮＡ試料を標識した物質の種類に応じて当業者においては適宜行うことができる。例えば、ｃＤＮＡが蛍光物質によって標識された場合、スキャナーによって蛍光シグナルを読み取ることによって検出することができる。
本発明の検査方法の別の態様としては、まず、被検者の細胞あるいは組織（例えば、皮膚ケラチノサイト）からポリペプチド試料を調製する。次いで、該ポリペプチド試料に含まれる本発明のポリペプチドの量を測定する。次いで、測定されたポリペプチドの量を対照と比較する。
このような方法としては、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びに本発明の抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法を例示することができる。
上記の方法において、対照と比較して、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子の発現量が有意に上昇していた場合、被検者は、炎症性皮膚疾患を今後発症する疑いがある（危険性が高い）、もしくは既に炎症性皮膚疾患を罹患していると判定される。
本発明はまた、炎症性皮膚疾患の検査方法に用いるための検査薬を提供する。このような検査薬としては、本発明のオリゴヌクレオチドを含む検査薬（オリゴヌクレオチドプローブが固定された基板を含む）、本発明の抗体を含む検査薬が挙げられる。上記抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はない。抗体は必要に応じて標識される。
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）試料の情報
患者の罹患部および非罹患部の皮膚ならびに対照例から皮膚生検標本を採取した。全例で患者の病歴と臨床評価によって乾癬の有無を判定した。皮膚生検を行った個人からはすべてインフォームド・コンセントを得た。患者生検標本の採取に関するプロトコールは東海大学医学部による承認を受けている。患者は全例日本人であった。
（２）マイクロアレイ実験（ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現解析）
合計約６０，０００種の遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブのセットを含むＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５Ａ、Ｕ９５Ｂ、Ｕ９５Ｃ、Ｕ９５ＤおよびＵ９５Ｅプローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を製造者のプロトコール（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ）に従って用いて、遺伝子発現のスクリーニングを行った。ＲＮａｑｕｅｏｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を製造者のプロトコールに従って用いて、各サンプルの皮膚生検標本から全ＲＮＡを精製した。続いて混入ゲノムＤＮＡを除去するためにＲＮＡをＤＮａｓｅＩで処理し、エタノールで沈殿させた。全ＲＮＡの質をアガロースゲル電気泳動（明らかな２８Ｓおよび１８Ｓバンドの分解が肉眼で認められないこと）および分光光度法によって評価した。二本鎖ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）およびＴ７（ｄＴ）２４プライマー（ＧＥＮＳＥＴ）を用いて合成した。ＢｉｏＡｒｒａｙ ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｉｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）を用いて、ビオチン化ヌクレオシド三リン酸の存在下でｃＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行わせた。このビオチン化ｃＲＮＡをＵ９５Ａ〜Ｕ９５Ｅアレイと４５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。洗浄後にハイブリダイズしたビオチン化ｃＲＮＡをストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色し、続いてＨＰ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒでスキャニングを行った。各プローブの蛍光強度を、コンピュータプログラムＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ ３．３（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて定量化した。
（３）相同性の検討
尋常性乾癬患者と健常者の皮膚から採取したｃＤＮＡによるマイクロアレイ分析を用いたデータに従って選択したＥＳＴが、既知であるか未知であるかを、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）を用いたホモロジー検索によって確認した。未知のものの１つ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ８２９６４１）のクローニングを行った。
（４）完全長ｃＤＮＡのクローニング
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて培養ケラチノサイトから全ＲＮＡを抽出し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＶＥＲＩＴＡＳ）を用いてｍＲＮＡを精製した。ＭａｒａｔｈｏｎおよびＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）のプロトコールを用いて、それからＲＡＣＥ（ｃＤＮＡの５’末端と３’末端の迅速増幅）ライブラリーを作製した。この遺伝子の３’末端と５’末端を得るために、各ｃＤＮＡライブラリーに対して、遺伝子特異的プライマー（３’ＲＡＣＥには５’−ＣＴＡＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＧ−３’（配列番号：３）、５’ＲＡＣＥには５’−ＣＴＡＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＧ−３’（配列番号：４））および各汎用アダプタープライマー（ＡＰ−１）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いるＰＣＲを行い、精製後にｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２０種のクローンのシークエンシングを両ストランドに対して行った。この遺伝子の５’末端の確認にはオリゴキャッピング法を用いた。ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ ＲＬＭ−ＲＡＣＥ（Ａｍｂｉｏｎ）の５’ＲＬＭ−ＲＡＣＥプロトコールを用いて、オリゴキャッピングを行ったｃＤＮＡライブラリーを培養ケラチノサイトから作製した。３μｌのｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマー（５’−ＴＡＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧ−３’（配列番号：５）、５’−ＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＧＴＡＧ−３’（配列番号：６））および５’ＲＡＣＥ Ｏｕｔｅｒプライマーを用いる以下の条件のタッチダウンＰＣＲ反応によって増幅した：９６℃５秒間と６９℃４分間を５サイクル、続いて９５℃１０分間、さらに９６℃５秒間、６７℃１０秒間および７２℃４分間を５サイクル、９６℃５秒間、６５℃１０秒間および７２℃４分間を３０サイクル、その後に７２℃７分間。Ｏｕｔｅｒ ＰＣＲ産物の増幅には、遺伝子特異的プライマー（５’−ＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＧＴＡＧ−３’（配列番号：７）、５’−ＣＡＧＴＧＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＴＣ−３’（配列番号：８））および５’ＲＡＣＥ Ｉｎｎｅｒプライマーを用い、アニーリング温度をそれぞれ２℃高くした点を除き、以上とほぼ同じサイクリング条件で行った。アガロースゲル電気泳動およびＥｔ−Ｂｒ染色を行った後に、ＰＣＲ断片中のｃＤＮＡをアガロースゲルから抽出して精製した。それらをｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター中に連結した後、ＪＭ１０９という名称のコンピテント細胞（ＴＯＹＯＢＯ）への形質転換導入を行った。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコールを用いてプラスミドＤＮＡを単離した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、各ｃＤＮＡクローンに対して一方向シークエンシングを行った。
（５）ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ
ＳＬＵＲＰ−２遺伝子の発現をノーザンハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲによって評価した。前者に関しては、Ｈｕｍａｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍ １２−Ｌａｎｅ ＭＴＮ Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を購入した。ＤＩＧ ＲＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識したエクソン１〜エクソン３由来の２００ｂｐ ＲＮＡをプローブとしてそれらを処理した。室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳと６８℃の０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでそれぞれ２回ずつ洗浄した後、ＤＩＧシステムのプロトコールに従って検出を行った。
ＲＴ−ＰＣＲに関しては、脳、心臓、肺、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、子宮、子宮頚部、精巣、胎盤、胸腺、骨髄、骨格筋、成人皮膚、胎児皮膚、培養ケラチノサイト、繊維芽細胞のポリＡ（＋）ＲＮＡを用いた。ケラチノサイトは培養物から抽出し、ほかのものはすべて購入した。エクソン１およびエクソン３に対するプライマーを設計した；５’−ＧＡＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号：９）および５’−ＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧ−３’（配列番号：１０）。ｃＤＮＡはＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて合成し、続いてプライマーを用いて増幅した。
（６）ゲノムのサザン分析
分子クローニングのプロトコールに従い、ヒトリンパ球からゲノムＤＮＡを単離した。これを以下の制限酵素を用いて１回または２回消化処理した；ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩ＋ＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）。このようにして消化したゲノムＤＮＡを０．６％アガロースゲルで分離し、正荷電ナイロン膜（ＲＯＣＨＥ）に移した。これをＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂｒｉ（ＲＯＣＨＥ）にて、４２℃で１６時間、ＰＣＲ ＤＩＧ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ（ＲＯＣＨＥ）を用いてＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰで標識したＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。このプローブはエクソン３からなる。膜を室温の２×ＳＳＣ／１０％ＳＤＳで５分間、６８℃の０．５×ＳＳＣ／１０％ＳＤＳおよび０．１×ＳＳＣ／１０％ＳＤＳでそれぞれ１５分間、２回ずつ洗浄した。検出はＤＩＧ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＲＯＣＨＥ）を用いて行った。
（７）定量的ＲＴ−ＰＣＲ
尋常性乾癬患者５例の病変部および非病変部、ならびに健常者４例から採取した皮膚生検標本から全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡの最終濃度が２．５ｎｇ／μｌとなるように希釈した。５ｎｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡへと転写した後に、ウラシルＮ−グリコシラーゼを含まない２ｘＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、４０ｘＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅおよびＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ、各３００ｎＭの遺伝子特異的前方プライマーと逆プライマー（５’−ＧＡＧＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＴＧＴ−３’（配列番号：１１）、５’−ＧＣＡＧＣＣＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＴ−３’（配列番号：１２））および１００ｎＭの遺伝子特異的ＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎプローブ（５’−ＣＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＴ−３’（配列番号：１３））を含む、２３μｌの試薬混合液（ＴａｑＭａｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）中で増幅させた。内部陽性対照として、５０ｎＭの１８Ｓ ＲＮＡ特異的前方プライマーと逆プライマー、さらに５０ｎＭのＶＩＣ標識１８Ｓ ＲＮＡ特異的Ｔａｑｍａｎプローブを加えた。反応物の逆転写を４８℃で３０分間行い、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを活性化するために９５℃で１０分間インキュベートした上で、アニーリング／伸長を６２℃で１分間行った後に９５℃１５秒間の変性を行う二段階増幅サイクルを５０サイクル行った。ｃＤＮＡの総量を１８Ｓ ＲＮＡの総量に対して標準化した。
［実施例１］ ＳＬＵＲＰ−２遺伝子のクローニング
遺伝子マイクロアレイ技術が最近利用可能になったため、罹患皮膚における全体的な遺伝子発現プロファイルを正常皮膚組織のものと比較して分析することが可能になった（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１６７５−１６８０．）。このアプローチによって得られるデータ量は、単一遺伝子の変化のみを同時に調べるという分析の限界を克服する。本発明者らは、罹病組織は疾患過程と関連のある情報を含むため、皮膚組織に関する遺伝子発現プロファイルの作成は有用と考えた。そこで、本発明者らは、大量の未知の発現配列タグ（ＥＳＴｓ）および既知の遺伝子の発現プロファイルを、ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイＵ９５Ａ、Ｕ９５Ｂ、Ｕ９５Ｃ、Ｕ９５ＤおよびＵ９５Ｅを用いて解析した。
具体的には、約１２，０００種の既知の遺伝子と４８，０００種の未知の発現配列タグ（ＥＳＴｓ）を含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のオリゴヌクレオチドアレイを用いて、乾癬患者の罹患部および非罹患部の皮膚に生じる転写変化を正常対照と比較する包括的解析を行った。その結果、乾癬病変において正常組織と比べて約１０倍以上アップレギュレートまたはダウンレギュレートされるＥＳＴを８６個見出した。本発明者らは、そのうち未知のものの１つ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ８２９６４１）のクローニングを行った。
［実施例２］ 完全長ｃＤＮＡの単離およびＳＬＵＲＰ−２遺伝子の構造解析
本発明者らは、ＲＡＣＥおよびオリゴキャッピング法を用いて完全長ｃＤＮＡを単離した（図１）。そのシークエンシングにより、この遺伝子の長さが約５．６ｋｂであり、３つのエクソンからなることが判明した。エクソン−イントロン境界はＧＴ−ＡＧ則に完全に従っていた（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ，Ｒ．，ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ Ｐ．Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｓｐｌｉｔ ｇｅｎｅｓ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．（１９８１）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９−３８３．）（表１）。

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、保存された特徴的な配置パターンを示す１０個のシステイン残基からなるＬｙ／ｕＰＡＲドメインを含む、９７アミノ酸からなるタンパク質をコードする（図２）。ＢＬＡＳＴホモロジー検索の結果、ヒトおよびマウスのＬｙ−６スーパーファミリーの他のメンバーとのアミノ酸レベルでの同一性は２９〜３１％であることが示された。さらに、シグナルＩＰ予測により、このタンパク質が２２アミノ酸からなるシグナルペプチドを含むことも示された。ＧＰＩ−アンカーは認められなかった。以上のデータは、このタンパク質が分泌タンパク質であることを示している。
［実施例３］ 転写開始部位の同定
ＲＴ−ＰＣＲおよびオリゴキャッピング法を用いて３つの転写開始部位を同定した。５’末端を確認するために、遺伝子特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った（前方プライマーはイニシエーターの内部または周辺に対して設計した）。−８０のヌクレオチドが転写開始部位であることが示された（図１）。さらに、本発明者らはオリゴキャッピング法を用いて５’末端を決定した。その結果、この遺伝子には２つの転写開始部位があることが明らかになった。２０種のクローンのうち１１種には図１に＋１と示したヌクレオチドが認められた。９種のクローンには＋５のヌクレオチドが認められ、これはＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥの５’末端に対応した。−８０のヌクレオチドが認められたクローンはなかった。
［実施例４］ ＳＬＵＲＰ−２遺伝子のプロモーター領域の分析
ＴＦＳＥＡＲＣＨを用いてプロモーター領域のコンピュータ解析を行った。その結果、特徴分析がなされた興味深いプロモーターを図１に示す。ＴＡＴＡボックスおよびＣＡＡＴコンセンサス配列は存在しないが、３つのＳＰ−１結合部位があり、これはＧＣリッチ領域に存在していた。主要な転写開始部位から−３７〜−４６の位置にＳＰ−１が１つ見いだされた。さらに、細胞増殖のマーカーであることが知られているＡＰ−１およびＥ２Ｆ結合部位が２つ見いだされた。Ｔ細胞の分化に働くＧＡＴＡ−３も１つ認められた。
［実施例５］ ＳＬＵＲＰ−２遺伝子の発現解析
さまざまな組織におけるＳＬＵＲＰ−２遺伝子の発現解析を行った。ＲＴ−ＰＣＲの結果、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子は子宮頸部と食道で高発現され、それに次いで成人および胎児の皮膚およびケラチノサイトで高発現されることが示された。脳、肺、胃、小腸、大腸、直腸、子宮および胸腺では弱い発現が検出された（図３）。脾臓と骨髄では発現が検出されなかった。
Ｈｕｍａｎ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ １２ Ｌａｎｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いたノーザンハイブリダイゼーションからは、食道、胃および十二指腸で発現されることが示された（図４）。陽性バンドが検出された位置は異なり、食道では約６６０ｂｐ、胃および十二指腸では約１，６００ｂｐであった。その発現レベルも組織毎に異なり、食道が最も高度であった。ノーザンハイブリダイゼーションによるケラチノサイトおよびヒト皮膚の発現解析も試みたが、バンドは全く検出されなかった。
［実施例６］ ゲノムのサザンハイブリダイゼーション
ヒトゲノムＤＮＡの二重または単一制限消化物を用い、ＤＩＧで標識したＳＬＵＲＰ−２遺伝子のエクソン３をプローブとして、サザンハイブリダイゼーション分析を行った。その結果、予想サイズに相当する単一のバンドのみが得られた（図５）。このことは、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子が単一の遺伝子として認められることを示唆する。ＡＬ０１１９７６内のゲノム配列に基づくと、ブロット上に存在する全バンドのサイズは正確に予測された。
［実施例７］ 定量的ＲＴ−ＰＣＲ
乾癬患者の病変皮膚（ｎ＝５）、乾癬患者の非病変皮膚（ｎ＝５）および健常者の皮膚（ｎ＝４）に由来する個々のｃＤＮＡの相対的かつ定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子が非病変皮膚または正常皮膚と比較して乾癬病変で有意にアップレギュレートされていることが示された（ｐ＜０．０００１；図６）。乾癬病変でのＳＬＵＲＰ−２遺伝子発現は、正常皮膚および乾癬非病変皮膚のそれぞれ３．８倍および２．８倍であった。乾癬非病変皮膚におけるＳＬＵＲＰ−２遺伝子の発現は正常皮膚とほぼ同程度であった。
本発明者らは、乾癬病変でアップレギュレートされる、ＳＬＵＲＰ−２と命名したタンパク質をコードする新規ヒト遺伝子の完全長ｃＤＮＡを培養ケラチノサイトから単離した。これは５８０塩基対で、３つのエクソンと２つのイントロンからなり、９７個のアミノ酸をコードするＯＲＦを含む。そのアミノ酸配列は特有であり、Ｌｙ−６／ｕＰＡＲモチーフと同じ特徴的な配置パターンを示す１０個のシステイン残基を有する（図２）。しかし、Ｌｙ−６スーパーファミリーの大部分のメンバーにみられるもう１つの特徴であるＧＰＩ−アンカーはこれにはない。最近、Ｌｙ−６／ｕＰＡＲスーパーファミリーには２つのサブファミリーがあることが示された。その１つ目は、Ｅ４８（Ｓｈａｎ，Ｘ．，Ｂｏｕｒｄｅａｒ，Ａ．，Ｒｈｏｔｏｎ，Ａ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ８ｑ２４．３ ｏｆ Ｌｙ−６−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ９８０４ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｐｐａｒｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＴＳＡ−１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１９７−２０８．）、ＲＩＧ−Ｅ（Ａｄｅｒｍａｎｎ Ｋ，Ｗａｔｔｌｅｒ Ｆ，Ｗａｔｔｌｅｒ Ｓ，Ｈｅｉｎｅ Ｇ，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＳＬＵＲＰ−１，ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｙ６／ｕＰＡＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．８：８１０−８１９．）およびＣＤ５９のように、１０個のシステイン残基があり、ＧＰＩ−アンカーもあるものである。第２のサブファミリーは、ＳＬＵＲＰ−１（分泌型Ｌｙ−６／ｕＰＡＲ関連タンパク質１）、分泌型の蛇毒およびカエル毒素のように８〜１０個のシステイン残基があるがＧＰＩ−アンカーはないものである。ＳＬＵＲＰ−１は哺乳動物Ｌｙ／ｕＰＡＲスーパーファミリーに属する分泌タンパク質として最初に発見された（Ｓｈａｎ，Ｘ．，Ｂｏｕｒｄｅａｒ，Ａ．，Ｒｈｏｔｏｎ，Ａ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ８ｑ２４．３ ｏｆ Ｌｙ−６−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ９８０４ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｐｐａｒｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＴＳＡ−１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１９７−２０８．）。ＢＬＡＳＴｐによるアミノ酸レベルでのホモロジー検索からも、それらのＬｙ−６スーパーファミリーの大部分のメンバーとの同一性は３４〜２８％であることが示された。以上のことは、ＳＬＵＲＰ−２がＬｙ−６／ｕＰＡＲタンパク質の新規メンバーであり、第２のサブファミリーに属することを示す。
ＢＬＡＳＴｎによるデータベース検索により、本発明者らが選択したＥＳＴであるＡＩ８２９６４１がクローンＡＩ０１１９７６の配列に含まれることが明らかになった。このクローンは８ｑ２４．３に位置しており、この位置はＬｙ−６スーパーファミリーのメンバーがクラスター化しているマウス第１５番染色体と相同である。ヒトＬｙ−６スーパーファミリーのメンバーの多くもこの位置にクラスター化している。興味深いことに、Ｇｏｌｄｅｎ Ｐａｔｈ、２００１ ＤＥＣからのマッピングデータにより、Ｌｙ−６スーパーファミリーの他の２つのメンバーであり、いずれも皮膚／ケラチノサイトで発現されるＡＲＳ成分ＢおよびＥ４８が、ＳＬＵＲＰ−２と約５０ｋｂの範囲内に並んで位置し、小さなクラスターを形成することが示された（図７）。Ｅ４８は頭部および頸部のＳＣＣの細胞系に認められ、細胞接着分子デスモグレインＩＩＩ／ｄｇ４と同一である可能性が示唆されている（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ，Ｒ．Ｈ．，Ｇｅｒｒｅｔｓｅｎ，Ｍ．，Ｋｎｉｐｐｌｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｃ．，ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｅ４８ ａｎｔｉｇｅｎ，ｈｉｇｈｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ Ｌｙ−６ ａｎｔｉｇｅｎ ＴｈＢ，ｉｓ ａ ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２９：１６７７−１６８９）。Ｅ４８のマウスホモログはＮｏｔｃｈファミリーのＥＧＦリピートと著しい相同性が認められる（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ．，ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉ．Ｆ．Ｃ．，ａｎｄ Ｓａｎｄｒｉｎ，Ｍ．Ｓ．（２０００）ＬＹ６ｄ−Ｌ，ａ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ Ｌｙ６ｄ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２２３−２３２．）ことから、細胞増殖に関係することが推定される。分泌型Ｌｙ／ｕＰＡＲ関連タンパク質１（ＳＬＵＲＰ−１）は、常染色体劣性型の掌蹠角化症であるＭａｌ ｄｅ Ｍｅｌｅｄａ病の原因であることが知られている（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．，Ｂｏｕａｄｊａｒ，Ｂ．，Ｈｅｉｌｉｇ，Ｒ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＳＬＵＲＰ−１ ｉｎ Ｍａｌ ｄｅ Ｍｅｌｅｄａ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１０：８７５−８８０．）。皮膚で発現されるこの２つのＬｙ−６メンバーはケラチノサイトの過剰増殖に関係している可能性が非常に高い。
ＲＴ−ＰＣＲを用いた本発明者らの発現解析により、この遺伝子が主として、皮膚をはじめとする上皮組織で発現されることが示された。しかし、ケラチノサイトまたはヒト皮膚におけるノーザンブロット分析ではバンドは全く検出されなかった。検出されなかった理由は、これらの組織におけるＳＬＵＲＰ−２遺伝子の発現がわずかであるためと思われる。ノーザンブロット分析からは、食道および十二指腸で示されたように、完全ｍＲＮＡおよび発現量が組織によって異なることが明らかになった。そのサイズは、オリゴキャッピング法によって得た主要な転写開始部位からのケラチノサイト由来のものよりも大きかった（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ−Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．，Ｓｕｙａｍａ，Ａ．，ａｎｄ Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．（１９９７）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ａｎｄ ａ ５’−ｅｎｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｇｅｎｅ ２００：１４９−１５６．）。しかし、食道のものの長さは、ＲＴ−ＰＣＲによって得た副次的な転写開始部位からのものと対応した。このことは、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子が異なる転写開始部位からの選択的スプライシングを受けた形態として存在する可能性を示唆する。
ＲＴ−ＰＣＲの結果からは、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子は骨髄と脾臓では発現されないが、胸腺では発現されるというもう１つの特徴も示された（図３）。マウスＬｙ−６スーパーファミリーのメンバーのいくつかは、造血細胞および胸腺細胞の分化に関する細胞表面マーカーであることが知られている。例えば、Ｓｃａ−１（Ｌｙ６Ａ／Ｅ）は造血幹細胞のマーカーとして用いられる（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ Ｇ．Ｊ．，Ｈｅｉｍｆｅｌｄ Ｓ．，ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．（１９８８）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４１：５８−６２．；Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ Ｇ．ａｎｄ Ｊｓｃｏｌｌａｙ，Ｒ．（１９９０）．Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．１８：９２０−９２６）。Ｓｃａ−２とＬｙ−６Ｇはそれぞれ未熟胸腺細胞および骨髄性細胞のマーカーであり（Ｇｏｄｆｒｅｙ Ｄ．Ｉ．，Ｍａｓｃｉａｎｔｏｎｉｏ，Ｍ．，Ｔｕｃｅｋ Ｃ．Ｌ．，Ｍａｌｉｎ，Ｍ．Ａ．，Ｂｏｙｄ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ Ｈｕｇｏ，Ｐ．（１９９２）Ｔｈｙｍｉｃ ｓｈａｒｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ−１：ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ ｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ｍａｔｕｒｅ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２００６−２０１１．；Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｔ．Ｊ．，Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．（１９９３）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｌｙ−６Ｇ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ：ＲＢ６−８Ｃ５ ｍＡｂ ｔｏ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ（Ｇｒ−１）ｄｅｔｅｃｔｓ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｙ−６ ｆａｍｉｌｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２３９９−２４０８．）、Ｌｙ６Ｃは末梢Ｔ細胞活性化抗原である（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｅｅｎｅｎ，Ｐ．Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｗ．Ｓ．（１９９３）．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｓｐｌｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｙ−６Ｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６３８９−６３９８．）。しかし、このような機能はヒトＬｙ−６スーパーファミリーでは見つかっていない。また、ＣＤ５９とｕＰＡＲを除いて、ヒトＬｙ−６スーパーファミリーの機能はまだ解明されていない。胸腺は、上皮細胞との相互作用を介してＴリンパ球が成熟するための臓器である。ＳＬＵＲＰ−２遺伝子が胸腺で発現され、他の血液系組織では発現されないという結果は、ＳＬＵＲＰ−２が上皮細胞成分と関係しているか、胸腺における特異的Ｔ細胞抗原である、あるいはその両方である可能性を示唆する。
Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔによる相同性検討により、ＳＬＵＲＰ−２のマウス４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）とのアミノ酸レベルでの同一性は３２％であることが示された。４−１ＢＢは誘導性Ｔ細胞抗原であり、活性化ＣＤ４およびＣＤ８上で発現される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に属する（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．，Ｄａｖｉｓ，Ｔ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｓｏｌａｍ，Ｌ．，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｆｉｎｅｓ ａｎ ｕｎｓｕａｌ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１９−１０２３．；Ｌｏｅｔｓｈｃｅｒ，Ｈ．，Ｐａｎ，Ｙ−Ｃ．Ｅ．，Ｌａｈｍ，Ｈ−Ｗ．，Ｇｅｎｔｚ，Ｒ．ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９０）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ５５ ｋｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ ６１：３５１−３５９．；Ｓｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．，Ｋｏｌｌｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ａ．，ａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９０）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ ６１：３６１−３７０．）、４−１ＢＢ／４−１ＢＢＬはＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の活性化と分化を誘導することが知られている（Ｖｉｎａｙ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓ．（１９９８）．Ｒｏｌｅ ｏｆ ４−１ＢＢ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４８１−４８９．）。ＴＮＦは胸腺細胞の増殖と分化、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２Ｒの誘導およびＩＦＮ−γの産生といったさまざまな機能を示す。ＳＬＵＲＰ−２は分泌タンパク質であるため、これはＴ細胞活性化に役割を果たす未知の受容体に対するリガンドとして作用する可能性があるように思われる。
本発明者らは、尋常性乾癬と関連のある遺伝子を単離するために、マイクロアレイ技術を用いた発現プロファイリングの結果を用いてこの遺伝子のクローニングを行った。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子は非病変皮膚および正常皮膚と比較して乾癬病変で有意にアップレギュレートされることが示された（図６）。プロモーター解析により、いくつかのＡＰ−１部位とＥ２Ｆ部位が、乾癬におけるケラチノサイト過剰増殖と関連する可能性が示された。プロモーター解析からは、プロモーター領域のはるかに上流にもう１つの部位であるＧＡＴＡ−３も示されたが、興味深いことに、ＧＡＴＡ−３はＴ細胞の分化を誘導するプロモーターである（Ｖｉｎａｙ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓ．（１９９８）．Ｒｏｌｅ ｏｆ ４−１ＢＢ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４８１−４８９．）。
産業上の利用の可能性
本発明者らによって、ＳＬＵＲＰ−２遺伝子が、炎症性皮膚疾患の罹患部において発現している遺伝子として単離された。よって、該遺伝子は、炎症性皮膚疾患の診断マーカーとして利用することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ＳＬＵＲＰ−２のｃＤＮＡヌクレオチド、推定アミノ酸配列およびプロモーター領域の配列を示す図である。矢印は転写開始部位を示す。図中の塩基配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：１および２に記載した配列と同じものである。
図２は、ヒトおよびマウスのＬｙ−６スーパーファミリーのアミノ酸配列を整列化した図である。保存的システイン残基は枠線で囲ってある。ＳＬＵＲＰ−１、Ｅ４８、Ｌｙ６Ｉ（マウス）、ＲＩＧ−Ｅのアミノ酸配列は、配列番号：１４〜１７に記載した配列と同じものである。
図３は、ＲＴ−ＰＣＲによる組織発現解析を示す写真である。ＳＬＵＲＰ−２遺伝子は主として上皮組織で発現され、食道と子宮頸部の発現が最も強く、皮膚およびケラチノサイトがそれに次ぐ。骨髄と脾臓では認められないが、胸腺では認められる。ローディングの対照としてＧＡＰＤＨもアッセイした。
図４は、ノーザンハイブリダイゼーションによるＳＬＵＲＰ−２ ｍＲＮＡの発現解析を示す写真である。ＳＬＵＲＰ−２ ｍＲＮＡは食道、胃および十二指腸で発現されるが、そのサイズは異なる。検討した組織は、レーン２、食道；レーン３、胃；レーン４、十二指腸；レーン５、回盲；レーン６、回腸；レーン７、空腸；レーン８、上行結腸；レーン９、下行結腸；レーン１０、横行結腸；レーン１１、直腸；レーン１２、盲腸、レーン１３、肝臓である。β−アクチンプローブを対照として用いた。
図５は、ゲノムのサザンブロット分析を示す写真である。１０μｇのヒトゲノムＤＮＡをＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ＋ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩ＋ＢａｍＨＩで消化処理し、０．６％アガロースゲルで分離した。エクソン３の領域に対応する断片を用いてブロットのプローブ検索を行った。
図６は、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる、乾癬病変皮膚、非病変皮膚および健常皮膚におけるＳＬＵＲＰ−２のｍＲＮＡ発現量を示す図である。示した結果は平均±ＳＤである（Ｌ、ＮＬ、ｎ＝５；Ｎ、ｎ＝４）。Ｐ＜０．０００１の統計学的有意性があるものを星印で示した。
図７は、ヒト染色体８ｑ２４．３の物理地図と転写物マップを示す図である。

Claims (17)

1. 下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
   （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ。
   （ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
   （ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡ。
   （ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡ。
   （ｅ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
2. 配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分ペプチドをコードするＤＮＡ。
3. 請求項１または２に記載のＤＮＡによりコードされるポリペプチド。
4. 請求項１または２に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
5. 請求項１または２に記載のＤＮＡまたは請求項４に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
6. 請求項５に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたポリペプチドを回収する工程を含む、請求項３に記載のポリペプチドの製造方法。
7. 請求項３に記載のポリペプチドに結合する抗体。
8. モノクローナル抗体である、請求項７に記載の抗体。
9. 請求項１に記載のＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
10. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項３に記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法。
    （ａ）該ポリペプチドに被検試料を接触させる工程
    （ｂ）該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程
    （ｃ）該ポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程
11. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、炎症性皮膚疾患の検査方法。
    （ａ）被検者からＲＮＡ試料を調製する工程
    （ｂ）該ＲＮＡ試料に含まれる請求項３に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡの量を測定する工程
    （ｃ）測定されたＲＮＡの量を対照と比較する工程
12. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、炎症性皮膚疾患の検査方法。
    （ａ）被検者からｃＤＮＡ試料を調製する工程
    （ｂ）該ｃＤＮＡ試料に含まれる請求項３に記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの量を測定する工程
    （ｃ）測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する工程
13. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、炎症性皮膚疾患の検査方法。
    （ａ）被検者からポリペプチド試料を調製する工程
    （ｂ）該ポリペプチド試料に含まれる請求項３に記載のポリペプチドの量を測定する工程
    （ｃ）測定されたポリペプチドの量を対照と比較する工程
14. 炎症性皮膚疾患が乾癬である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の検査方法。
15. 請求項９に記載のオリゴヌクレオチドを含む、炎症性皮膚疾患の検査薬。
16. 請求項７または８に記載の抗体を含む、炎症性皮膚疾患の検査薬。
17. 炎症性皮膚疾患が乾癬である、請求項１５または１６に記載の検査薬。

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