JPWO2003100086A1 - Viable cell counting method and apparatus - Google Patents

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正夫 那須
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Abstract

試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法および装置において、前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第一画像中と第二画像中の輝点数の差（Ｂ−Ａ）を求めることとする。さらに前記とは異なる方法として、前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めるか、もしくは、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることことにより、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、測定精度の向上を図る。In the live cell counting method and apparatus for measuring the number of living cells by labeling living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent, the fluorescence of the sample is measured before fluorescent labeling of the living cells. After obtaining an image (first image) and fluorescently labeling the living cells, a fluorescence image (second image) of the sample is obtained, and the difference in the number of bright spots in the first image and the second image (B− A) is to be obtained. Further, as a method different from the above, a difference image between the first image and the second image is obtained, and the number of bright spots in the difference image is obtained, or the position of the bright spots in the second image is By obtaining the number of bright spots that are not included in the dead area associated with each bright spot in the first image, the influence of fluorescent contaminants is eliminated regardless of the properties of the sample, and the measurement accuracy is improved.

Description

技術分野
この発明は、微生物や組織細胞等の生細胞を、蛍光標識（蛍光試薬で染色）し、試薬を励起することで蛍光を発生させ、あるいは、微生物や組織細胞等の生細胞が元々有する蛍光性分子を励起することで蛍光を発生させ、その蛍光画像を利用して生細胞を計数する生細胞の計数方法および装置に関する。
背景技術
試料中の微生物や動植物等の組織細胞などの生細胞の検出は、例えば、滅菌状態の確認や、細胞の生存状態の異常等を検出する上で、産業上極めて重要な技術である。以下の説明においては、説明の便宜上、主に細菌を対象として述べる。
自然環境中には、生きているが通常の方法では培養が困難な状態にある細菌が高い割合で存在する。これらの細菌は、一般的な寒天平板培地上にコロニーを形成せず、また液体培地中でも増殖しないことが多い。このため、従来の培養を基本とする方法では検出できない恐れがある。
こうした問題を解決する方法として、前記生細胞を蛍光試薬により標識する方法以外に、例えばＤＮＡに結合するジアミジノ・フェニル・インドール（ＤＡＰＩ）やアクリジン・オレンジ（ＡＯ）を用いて遺伝子を標識することで細菌を検出する方法や、細菌内で代謝されて蛍光性となるフルオレセイン・ジアセテート（ＦＤＡ）、カルボキシ・フルオレセイン・ジアセテート（ＣＦＤＡ）、５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロライド（ＣＴＣ）などを用いて生理活性を維持している細菌を検出する計測方法が提案されている。
前記ＦＤＡやＣＦＤＡは、細菌などの生細胞内にある酵素（エステラーゼ）の働きで加水分解されて蛍光性となる。また、ＣＴＣは、生細胞の呼吸に伴って還元されると蛍光性となる。前記いずれの試薬も、溶液として測定対象となる試料中の生細胞に接触させ、生細胞内に取り込まれて反応することにより、蛍光を発する状態となり、この蛍光によって細菌等の生細胞を検出する。
しかしながら、蛍光によって細菌を検出する方法では、試料中に蛍光性の夾雑物が共存した場合、それを検出すべき細菌と誤認し、計数結果の誤差になるという問題があった。
後述する特許文献１は、この問題を解消すべく発明された細菌の検出方法として、以下の方法を開示している。即ち、「（ａ）蛍光性酵素基質で媒体を染色し、その蛍光画像を記録し、（ｂ）染色された媒体に光照射して光退色させた後、その蛍光画像を記録し、（ｃ）上記（ａ）で得られた蛍光画像と、上記（ｂ）で得られた蛍光画像との差画像を取ることを特徴とする生細胞の検出方法。」を開示している。
前記特許文献１に記載の発明においては、要するに、蛍光試薬によって標識した細菌が元々試料に含まれる蛍光性夾雑物よりも光退色しやすいという点に着目し、前記のような手順により蛍光性夾雑物の影響を除去するようにしている。
しかしながら、上記特許文献１に記載の発明においても、下記のような問題がある。
蛍光試薬によって標識した生細胞は、試料に含まれる蛍光性夾雑物よりも光退色しやすいものの、夾雑物の蛍光特性は制御し得ないため、必ずしも、染色された細菌だけが退色して、夾雑物の蛍光が全て退色しない状態を維持するとは限らない。
夾雑物の蛍光が蛍光標識した細菌と同様に退色した場合には、その分測定誤差となる。従って、常に、精度の高い生細胞の計数が可能というわけにはいかず、試料の性状が変わった場合には、計測値の精度確保が難しい問題がある。
〔特許文献１〕
特開平１０−２１５８９４号公報
本発明は上記のような点に鑑みなされたもので、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、測定精度の向上を図った生細胞の計数方法および装置を提供することを目的とする。
発明の開示
上記のような課題を解決するため、請求の範囲第１項の発明では、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記第一画像中の輝点を計数し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第二画像中の輝点を計数し、前記第一画像中の輝点数と第二画像中の輝点数との差を求めることにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする。上記計数方法によれば、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除でき、精度よく生細胞を計数することができる。
同様の目的を達成するために、下記請求の範囲第２項ないし第３項の発明の方法とすることもできる。即ち、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定する（請求の範囲第２項の発明）。
また、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、かつ前記第一画像中の輝点の位置情報を取得し、さらに、前記輝点に対して半径や縦横幅などの不感領域を予め設定して、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域をそれぞれ認識し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、かつ前記第二画像中の輝点の位置情報を取得し、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定する（請求の範囲第３項の発明）。
上記不感領域設定は、計測状況や試料の状態によって異なるが、例えば「第一画像で得られた輝点の存在位置に対して半径１０μｍの領域」あるいは「画像として縦横とも±５ピクセルの領域」といった設定ができる。この不感領域を適切に設定することによって、細菌数を適正に計測することが可能となる。
さらに、蛍光性夾雑物の影響の排除をより確実にして、生細胞の計数精度をより向上する観点から、下記請求の範囲第４項ないし第５項の発明が好ましい。即ち、前記請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記第一画像取得の際の励起光量を、前記第二画像取得の際の励起光量より大とする（請求の範囲第４項の発明）。
また、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、前記生細胞を蛍光標識する前に、前記請求の範囲第３項に記載の第一画像に代えて、試料の実体画像を取得してこれを第一画像とし、かつ前記実体画像中の全ての粒子の輝点の位置情報を取得し、さらに、前記輝点に対して半径や縦横幅などの不感領域を予め設定して、前記実体画像中の各輝点に付随する不感領域をそれぞれ認識し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、かつ前記第二画像中の輝点の位置情報を取得し、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記実体画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定する（請求の範囲第５項の発明）。
さらに、請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記「生細胞を蛍光試薬により標識すること」に代えて、「生細胞内の代謝により蛍光すること」とすることもできる（請求の範囲第６項の発明）。生細胞内の代謝により蛍光性となる試薬としては、前述のＦＤＡ，ＣＦＤＡ，ＣＴＣ等が使用できる。
また、適用メリットの観点から、前記請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記生細胞は、細菌とすること（請求の範囲第７項の発明）が好適である。
さらにまた、請求の範囲第１項ないし第５項の発明の実施態様としては、測定精度向上の観点から、下記請求の範囲第８項ないし第１０項の発明が好ましい。即ち、試料をろ過してフィルタ上に生細胞を捕捉し、前記フィルタ上に捕捉した生細胞を含む試料の第一画像を取得し、蛍光試薬をフィルタ上の試料に添加して生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、フィルタ上に捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得する（請求の範囲第８項の発明）。
また、請求の範囲第８項に記載の生細胞の計数方法において、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、ろ過後も残留する蛍光試薬を洗い流すべく、洗浄液を前記フィルタ上の試料に添加して、この洗浄液をろ過する（請求の範囲第９項の発明）。
さらに、請求の範囲第９項に記載の生細胞の計数方法において、前記洗浄液は、前記蛍光試薬の蛍光発現に適したｐＨを有する緩衝液とする（請求の範囲第１０項の発明）。
また、前記第一画像および第二画像を取得する際の、前記請求の範囲第８項の発明とは異なる方法に関する発明としては、下記請求の範囲第１１項ないし第１４項の発明が、それぞれニーズに応じて好適に採用できる。
まず、請求の範囲第１１項の発明は、生細胞の捕捉に静電力を利用する方法であって、即ち、前記請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記試料を、生細胞計数用の撮像手段を備えたセル流路内に導入し、前記セル流路の一部を正に帯電させることにより、自然状態で負に帯電した試料中の生細胞を前記正帯電部に捕捉し、前記捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬を前記セル流路に導入して前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする。
次に、請求の範囲第１２項の発明は、生細胞の捕捉に抗原抗体反応を利用する方法であって、即ち、前記請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記試料を、生細胞計数用の撮像手段を備えたセル流路内に導入し、前記セル流路の一部に、予め、捕捉すべき生細胞と特異的に結合する抗体を固定しておくことにより、試料中の生細胞を前記抗体との結合によって捕捉し、前記抗体に捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬を前記セル流路に導入して前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする。
次に、請求の範囲第１３項の発明は、生細胞の捕捉にフィルタを利用し、塵埃付着防止やハンドリングの容易化のために生細胞捕捉面を透明板で保持する方法であって、即ち、前記請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法において、前記試料を、ろ過してフィルタ上に生細胞を捕捉し、前記フィルタ上の生細胞捕捉面を、ガラスまたはプラスチック等の透明板で被覆し、この透明板側から前記捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬をフィルタの生細胞捕捉面と反対側から添加することにより、前記前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、前記透明板側から前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする。なお、前記透明板としては、厚さの薄いフィルム状のものが好ましい。
次に、請求の範囲第１４項の発明は、生細胞の捕捉に、静電力または抗原抗体反応を利用し、かつ蛍光試薬の反応時間を第一画像および第二画像の取得タイミングに利用する方法であって、即ち、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、生細胞計数用の撮像手段を備え、かつ試料中の生細胞を捕捉するための正帯電部もしくは抗体固定部を備えたセル流路内に、前記試料を蛍光試薬と共に導入し、前記蛍光試薬に反応して生細胞が蛍光標識される前に、前記捕捉した生細胞を含む試料の第一画像を取得し、その後、前記蛍光試薬に反応して生細胞が蛍光標識した後に、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする。
前記請求の範囲第１４項の発明の場合には、計数手順が簡略化するメリットがあるが、必要に応じて、蛍光試薬の濃度を下げて反応時間を遅くする、もしくは、反応時の温度を下げて反応時間を遅くすることにより、第一画像および第二画像の取得タイミングの間隔を大とすることができる。
また、前記計数方法を実施するための装置としては、下記請求の範囲第１５項ないし第１７項の発明が好適である。即ち、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、撮像素子で得た画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求める画像処理手段と、予め設定した範囲の面積を有する輝点を計数し、かつ前記第一画像と第二画像との間の輝点数の差を求める演算手段とを備える（請求の範囲第１５項の発明）。
また、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、前記第一画像と第二画像との間の差分画像を求め、この差分画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求める画像処理手段と、予め設定した範囲の面積を有する輝点を計数する演算手段とを備える（請求の範囲第１６項の発明）。
さらに、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、撮像素子で得た画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求め、予め設定した範囲の面積を有する輝点の位置を記録する画像処理手段と、記録した個々の輝点の位置に対して、予め設定した領域を各々の輝点に付随する不感領域として認識し、かつ、前記第二画像中の輝点のうち、その位置が第一画像で認識された不感領域に含まれないものを判別し計数する演算手段とを備える（請求の範囲第１７項の発明）。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施例について、図１ないし図６に基づき詳細に説明する。
（実施例１：輝点数の差による方法）
図１に基づき、第一画像と第二画像との間の輝点数の差を求めることを利用する細菌数の計測方法の実施例について以下に述べる。以下の説明では液状試料に含まれる細菌の計数を想定している。ただし、固形試料に付着している細菌はふき取りやストマッキングによって滅菌水に展開し、それ以降、液状試料と同様に取り扱うことができる。
まず、試料１に含まれる細菌を、ろ過によってフィルタ２上に捕捉する。フィルタとしては、ポアサイズの均一性が高いメンブレンフィルタが好ましい。用いるメンブレンフィルタのポアサイズは、計測しようとする細菌のサイズによって選択が必要である。細菌を計数する場合は、通常０．２〜０．６μｍ程度が適当である。
次に、蛍光画像取得手段３を用いて、細菌を捕捉したメンブレンフィルタの蛍光画像（第一画像）を取得する。取得した画像を画像・演算処理部４で画像処理し、画像中に存在する蛍光輝点数Ａを求める。蛍光標識前に既に存在する輝点は夾雑物である。
画像処理としては、具体的に次のような処理を行う。
▲１▼同一視野で複数画面を取込み、それらを平均化してランダムノイズを低減
▲２▼シェーディング（濃淡）補正
▲３▼エッジ検出により輝点を抽出
▲４▼ラベリングにより、どこまでがひとつながりの個別の輝点かを認識
▲５▼面積が予め設定した範囲に該当する輝点を選別
▲６▼▲５▼で選別された輝点を計数
前記▲５▼で予め設定する面積は、計数すべき細菌のサイズと検出に用いる装置の特性とから決まる数値である。事前に実験検討を行うことにより、例えば「直径０．２〜１０μｍ相当の面積」といった設定が可能である。
続いて、メンブレンフィルタ上に蛍光標識試薬５を添加する。蛍光標識試薬５としては、遺伝子に親和性のあるＤＡＰＩやＡＯを用いれば全細菌を標識できる。死菌の標識にはＰＩが適している。酵素反応や呼吸など細菌の生理活性によって蛍光を発現するＣＦＤＡやＣＴＣを用いれば、生菌だけを選択的に標識できる。特定の細菌を標識する場合は、抗原抗体反応や特定の遺伝子配列を認識する手法を利用する。前者の場合、目的とする細菌の抗原に特異的に結合する抗体を予め蛍光標識しておき、この蛍光標識抗体を試料と反応させることで特定種の細菌だけを標識する。後者の場合、ＦＩＳＨ、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲといった手法を用いて特定の遺伝子をターゲットとして目的の細菌を標識できる。
細菌と反応しなかった蛍光標識試薬が計測上のノイズとなる場合がある。この場合には、細菌に取り込まれなかった試薬をろ過により除去することが有効である。さらに除去の効果を上げるためには、細菌に取り込まれなかった試薬をろ過により除去した後、さらに、洗浄液によって試薬を洗い流すことが効果的である。
洗浄液としては、蛍光標識試薬の蛍光発現に適したｐＨを有する緩衝液が適している。例えば、蛍光標識試薬としてＡＯやＣＦＤＡはアルカリ性で蛍光発現効率が良好なため、洗浄液としてアルカリ性のｐＨ緩衝液を用いることで、よりコントラストの高い蛍光画像を得ることができる。
蛍光標識の後、再びメンブレンフィルタの蛍光画像（第二画像）を取得する。取得した第二画像に第一画像と同様の画像処理を行い、画像中に存在する蛍光輝点数Ｂを求める。そして、第一画像と第二画像との間で輝点数の差（Ｂ−Ａ）すなわち、蛍光標識によって現れた輝点数を求め、これを細菌数とする。
（実施例２：差分画像の利用による方法）
図２に基づき、第一画像と第二画像との間で差分画像を求めることを利用する細菌数の計測方法の実施例について、以下に述べる。
手順としては、まず、実施例１と同じく、試料液に含まれる細菌を、ろ過によってメンブレンフィルタ上に捕捉する。次に、細菌を捕捉したメンブレンフィルタの蛍光画像（図２の中央部に示す第一画像６）を取得する。続いて、メンブレンフィルタ上に蛍光標識試薬を添加し、細菌を蛍光標識する。その後、再びメンブレンフィルタの蛍光画像（図２の左側に示す第二画像７）を取得する。そして、前記第二画像７と第一画像６とにより、図２の右側に示す差分画像８を求める。
差分画像８中に存在する輝点が蛍光標識によって現れた輝点であり、これを細菌数として計数する。
実際に画像間で差分を行う際は、上述の処理で理想的な結果が得られないケースがある。具体的には、次のような場合、単純な差分画像では適正な輝点数を得るのが難しい。
▲１▼第一画像と第二画像とで画像取得位置がずれた場合
▲２▼蛍光標識操作の影響や、画像取得時の光学的な条件の違いから、第一画像と第二画像とで画像全体（背景）の輝度が異なった場合
▲３▼画像取得時のピントの合い方や、画像処理時の条件設定の違いによって、第一画像と第二画像とで、各々対応する輝点に由来する画像の形状やサイズが異なった場合
▲４▼第一画像と第二画像とで輝点自体が移動してしまった場合
前記▲１▼の場合は、パターンマッチングという画像処理で二つの画像の位置関係を認識し、対応する位置の差分画像を求めれば正しい結果を得ることができる。
前記▲２▼の場合は、二値化やエッジ検出という画像処理で輝点に由来する信号と背景に由来する信号との区別を明らかにする手法によって対応できる。▲３▼の場合は、本実施例での対応が難しいが、後述の実施例３によれば有効に対応が可能である。▲４▼の場合は、前述の実施例１で対応できる。
この他、本実施例および後述の実施例３では、蛍光標識や洗浄の際に細菌の位置が移動すると、第一画像と第二画像との間の輝点の解析に誤差が生じる。これを防ぐためには、吸引ろ過を行ったままで蛍光標識や洗浄を行うことが有効である。
（実施例３：位置情報の利用による方法）
図３に基づき、蛍光輝点の位置情報を利用する細菌数の計測方法の実施例について、以下に述べる。
手順としては、実施例１および実施例２と同様に、まず、試料液に含まれる細菌を、ろ過によってメンブレンフィルタ上に捕捉する。次に、細菌を捕捉したメンブレンフィルタの蛍光画像（第一画像６）を取得する。画像取得の際、基準点９（図中、白抜きの矢印で示す）を利用し、これを基準にメンブレンフィルタの位置を把握して、第一画像中の輝点の位置情報１０を認識する。続いて、メンブレンフィルタ上に蛍光標識試薬を添加し、細菌を蛍光標識する。その後、メンブレンフィルタの蛍光画像（第二画像７）を取得する。第一画像と同様に、画像取得の際、基準点９（図中矢印）を利用し、これを基準にメンブレンフィルタの位置を把握して、第二画像中の輝点の位置情報１１を認識する。
図３に示す第一画像６および第二画像７は、微小ではあるが、平行移動と回転が起きている例を示す。このように、画像取得位置がずれた場合でも、基準点からの相対位置として輝点の位置を正しく認識できる。そして、第二画像７と第一画像６とで輝点の位置情報を比較し、第二画像７になってから初めて現れた輝点情報１２を求める。輝点情報１２で求められた輝点数が、細菌数である。
実際には、面積を持たない点どうしの一致不一致を求めることは難しい。そこで、第一画像６で得られた輝点の存在位置に対して、予め設定した所定の領域を各々の輝点に付随する不感領域として認識させる。不感領域設定は、前述のように、例えば、「第一画像で得られた輝点の存在位置に対して半径１０μｍの領域」あるいは「画像として縦横とも±５ピクセルの領域」と設定する。この不感領域を適切に設定することによって、前述の実施例２で課題となっていた▲３▼の場合にも、細菌数を適正に計測することが可能となる。
なお、図３に示す実施例において、前記請求の範囲第４項の発明のように、第一画像取得の際の励起光量を、前記第二画像取得の際の励起光量より大とすることにより、蛍光性夾雑物の影響の排除をより確実にして、生細胞の計数精度をより向上することができる。
さらに、前記請求の範囲第５項の発明のように、第一画像を蛍光画像に代えて試料の実体画像とすることにより、計数精度の向上を図ることができる。この場合には、第一画像を取得する際、励起光を白色光に代えて試料に照射する。
（実施例４：装置の実施例）
図４に基づき、本発明に係る生細胞の計数装置の実施例について説明する。
光源１３から発した励起光は、ダイクロイックミラー１４で反射、対物レンズ１５で集光し、メンブレンフィルタ２上の試料１６に照射する。光源としては、発光ダイオード、半導体レーザ、水銀ランプなどが好適である。試料が発する蛍光は対物レンズで集光し、ダイクロイックミラーを透過して、撮像素子１７に結像する。撮像素子には、ＣＣＤ素子やＣＭＯＳ素子を用いることができる。撮像素子は蛍光を画像として捉え電気信号に変換する。撮像素子で得た画像は画像・演算処理部４に伝送し、既に述べたような各種の画像処理や演算処理を行う。
また、試料を載せたメンブレンフィルタ２は、図示しない駆動手段によって水平方向１８に順次走査し、複数画面を取得、解析することで視野面積を拡大することが好ましい。これは、例えば、細菌の分布に粗密がある場合に、計数結果の統計的なばらつきを低減するのに有効である。さらに、垂直方向１９の駆動は画像観察のためにオートフォーカスを行う場合に必要な機能である。駆動手段としては、例えば、精密な位置制御ができるステッピングモータが望ましい。
なお、第一画像を蛍光画像に代えて試料の実体画像とする場合には、第一画像を取得する際、励起光を白色光に代えて試料に照射するが、前記光源１３は、励起光と白色光との図示しない切り替え手段を備える。
（実施例５：静電力を利用する方法）
図５に基づき、生細胞の捕捉に静電力を利用する方法の実施例について、以下に述べる。
図５において、試料を、生細胞計数用の撮像手段２１と静電力発生用の電極２２とを備えたセル流路２０内に導入し、前記セル流路２０の一部を正に帯電させることにより、自然状態で負に帯電した試料中の生細胞３０を前記正帯電部に捕捉し、捕捉した生細胞を含む試料の第一画像を撮像手段２１で取得し、その後、蛍光試薬をセル流路２０に導入して前記捕捉した生細胞３０を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を撮像手段２１により取得する。
なお、図５において、セル流路２０の少なくとも撮像手段２１が臨む面は、透明なガラスまたはプラスチックにより構成される。
（実施例６：抗原抗体反応を利用する方法）
図６に基づき、生細胞の捕捉に抗原抗体反応を利用する方法の実施例について、以下に述べる。
図６において、試料を、生細胞計数用の撮像手段２１を備えたセル流路２０内に導入し、前記セル流路２０の一部に、予め、捕捉すべき生細胞と特異的に結合する抗体２３を固定しておくことにより、試料中の生細胞３０を抗体２３との結合によって捕捉し、抗体２３に捕捉した生細胞３０を含む試料の第一画像を撮像手段２１により取得し、その後、蛍光試薬を前記セル流路２０に導入して前記捕捉した生細胞３０を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を撮像手段２１により取得する。
産業上の利用の可能性
この発明は、前述のように、微生物や組織細胞等の生細胞を、蛍光試薬で染色し、試薬を励起することで蛍光を発生させ、あるいは、微生物や組織細胞等の生細胞が元々有する蛍光性分子を励起することで蛍光を発生させ、その蛍光画像を利用して生細胞を計数する生細胞の計数方法および装置に利用できる。前記微生物としては、細菌，真菌，ウィルス，酵母，カビ類などがあり、本計数方法および装置の利用分野としては、医療，食品製造，上下水道などがある。
この発明によれば、前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像もしくは実体画像（第一画像）を取得し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第一画像中と第二画像中の輝点数の差を求めるか、又は、前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めるか、もしくは、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることとしたので、
試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、測定精度の向上を図った生細胞の計数方法および装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の実施例に関わる生細胞の計数方法の手順を示す図。
図２は、この発明の実施例に関わる差分画像を利用する方法の模式的説明図。
図３は、この発明の実施例に関わる輝点の位置情報を利用する方法の模式的説明図。
図４は、この発明の実施例に関わる生細胞の計数装置の模式的構成図。
図５は、この発明の静電力を利用する実施例の説明図。
図６は、この発明の抗原抗体反応を利用する実施例の説明図。Technical field
In the present invention, living cells such as microorganisms and tissue cells are fluorescently labeled (stained with a fluorescent reagent), and fluorescence is generated by exciting the reagent, or the fluorescence inherent in living cells such as microorganisms and tissue cells. The present invention relates to a live cell counting method and apparatus for generating fluorescence by exciting molecules and counting live cells using the fluorescence image.
Background art
The detection of living cells such as tissue cells such as microorganisms and animals and plants in a sample is an extremely important technology in the industry, for example, for confirming the sterilization state or detecting abnormalities in the survival state of cells. In the following description, for the sake of convenience of description, the description will mainly focus on bacteria.
In the natural environment, there are a high percentage of bacteria that are alive but difficult to cultivate using conventional methods. These bacteria often do not form colonies on common agar plates and do not grow in liquid media. For this reason, there exists a possibility that it cannot detect with the method based on the conventional culture | cultivation.
As a method for solving such problems, in addition to the method of labeling the living cells with a fluorescent reagent, for example, by labeling a gene with diamidino-phenyl-indole (DAPI) or acridine orange (AO) that binds to DNA, Methods for detecting bacteria, and fluorescein diacetate (FDA), carboxyfluorescein diacetate (CFDA), and 5-cyano-2,3-ditolyltetrazolium chloride (CTC) that are metabolized and fluorescent in bacteria A measurement method has been proposed for detecting bacteria that maintain physiological activity using the above-described techniques.
The FDA and CFDA are hydrolyzed by the action of an enzyme (esterase) in living cells such as bacteria and become fluorescent. CTC becomes fluorescent when it is reduced with the respiration of living cells. Any of the reagents is brought into contact with living cells in the sample to be measured as a solution, and is taken into the living cells and reacts to become fluorescent. The living cells such as bacteria are detected by this fluorescence. .
However, in the method of detecting bacteria by fluorescence, there is a problem that when a fluorescent contaminant coexists in a sample, it is mistaken as a bacterium to be detected, resulting in an error in counting results.
Patent Document 1 described later discloses the following method as a method for detecting bacteria invented to solve this problem. That is, “(a) staining a medium with a fluorescent enzyme substrate and recording the fluorescence image; (b) irradiating the stained medium with light and causing photobleaching; then recording the fluorescence image; ) Disclosed is a method for detecting a living cell, characterized by taking a difference image between the fluorescence image obtained in (a) and the fluorescence image obtained in (b).
In the invention described in Patent Document 1, in short, paying attention to the fact that bacteria labeled with a fluorescent reagent are more easily photobleached than fluorescent contaminants originally contained in a sample, the procedure described above is effective for fluorescent contamination. The effect of things is removed.
However, the invention described in Patent Document 1 also has the following problems.
Although living cells labeled with a fluorescent reagent are more susceptible to photobleaching than the fluorescent contaminants contained in the sample, the fluorescence characteristics of the contaminants cannot be controlled. It does not always maintain the state in which the fluorescence of the object does not fade completely.
When the fluorescence of impurities is discolored in the same manner as the fluorescently labeled bacteria, a measurement error is caused accordingly. Therefore, it is not always possible to count live cells with high accuracy, and there is a problem that it is difficult to ensure the accuracy of measurement values when the properties of a sample change.
[Patent Document 1]
JP-A-10-215894
The present invention has been made in view of the above points, and provides a live cell counting method and apparatus that eliminates the influence of fluorescent contaminants regardless of the properties of a sample and improves measurement accuracy. Objective.
Disclosure of the invention
In order to solve the above-described problem, in the invention of claim 1, the living cells for measuring the number of the living cells by labeling the living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent In this counting method, before fluorescently labeling the living cells, a fluorescence image (first image) of the sample is obtained, the bright spots in the first image are counted, and the living cells are fluorescently labeled, And obtaining the difference between the number of bright spots in the first image and the number of bright spots in the second image, and counting the number of bright spots in the second image. It is characterized by measuring the number of cells. According to the above counting method, the influence of fluorescent contaminants can be eliminated regardless of the properties of the sample, and viable cells can be counted with high accuracy.
In order to achieve the same object, the invention according to the second to third claims can be used. That is, in the live cell counting method for measuring the number of living cells by labeling the living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent, before the fluorescent labeling of the living cells, the fluorescence of the sample is measured. After obtaining an image (first image) and fluorescently labeling the living cells, a fluorescence image (second image) of the sample is obtained, a difference image between the first image and the second image is obtained, and this difference image The number of living cells is measured by obtaining the number of bright spots in the inside (the invention of claim 2).
In addition, in the live cell counting method for measuring the number of living cells by labeling living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent, before the fluorescent labeling of the living cells, the fluorescence of the sample is measured. An image (first image) is acquired, and position information of a bright spot in the first image is acquired. Further, an insensitive area such as a radius and a vertical and horizontal width is set in advance with respect to the bright spot, and the first After recognizing insensitive areas associated with each bright spot in one image and fluorescently labeling the living cells, a fluorescent image (second image) of the sample is obtained, and the position of the bright spot in the second image The number of viable cells is obtained by obtaining information and obtaining the number of bright spots whose positions are not included in the insensitive area associated with each bright spot in the first image among the bright spots in the second image. Is measured (invention of claim 3).
The insensitive area setting varies depending on the measurement condition and the state of the sample. For example, “an area having a radius of 10 μm with respect to the position of the bright spot obtained in the first image” or “an area having ± 5 pixels in both vertical and horizontal directions” Can be set. By appropriately setting this insensitive area, it is possible to appropriately measure the number of bacteria.
Furthermore, from the viewpoint of more reliably eliminating the influence of fluorescent impurities and further improving the counting accuracy of living cells, the inventions of claims 4 to 5 below are preferred. That is, in the live cell counting method according to any one of claims 1 to 3, the excitation light amount at the time of acquiring the first image is changed to the excitation light amount at the time of acquiring the second image. (Invention of claim 4).
Further, in the live cell counting method for measuring the number of viable cells by labeling viable cells such as microorganisms and cell tissues in a sample with a fluorescent reagent, before the live cells are fluorescently labeled, the claim In place of the first image described in the range item 3, the sample is acquired as a first image, and the position information of the bright spots of all the particles in the entity image is acquired. Insensitive areas such as radii and vertical and horizontal widths are set in advance for the bright spots, the dead areas associated with the bright spots in the entity image are recognized, and the living cells are fluorescently labeled. An image (second image) is acquired, and position information of a bright spot in the second image is acquired, and among the bright spots in the second image, the position is set to each bright spot in the entity image. By obtaining the number of bright spots not included in the accompanying insensitive area, Measuring the (invention claims Section 5).
Furthermore, in the live cell counting method according to any one of claims 1 to 5, in place of the "labeling the live cells with a fluorescent reagent", "by metabolism in the live cells" It can also be “fluorescent” (the invention of claim 6). As the reagent that becomes fluorescent due to metabolism in living cells, the aforementioned FDA, CFDA, CTC and the like can be used.
From the viewpoint of application merit, in the live cell counting method according to any one of claims 1 to 6, the live cells are bacteria (claim 7). Of the present invention is preferred.
Furthermore, as the embodiments of the inventions of claims 1 to 5, the inventions of claims 8 to 10 below are preferable from the viewpoint of improving measurement accuracy. That is, the sample is filtered to capture live cells on the filter, a first image of the sample containing the live cells captured on the filter is acquired, and a fluorescent reagent is added to the sample on the filter to fluoresce the live cells. After the fluorescent reagent that has been labeled and not taken up by the living cells is removed by filtration, a fluorescent image (second image) of the sample containing the living cells captured on the filter is obtained (the invention of claim 8). .
Further, in the method for counting living cells according to claim 8, after removing the fluorescent reagent that has not been taken up by the living cells by filtration, a washing solution is applied to the filter to wash away the fluorescent reagent remaining after filtration. The cleaning solution is filtered by adding to the sample (invention of claim 9).
Furthermore, in the live cell counting method according to claim 9, the washing solution is a buffer solution having a pH suitable for the fluorescence expression of the fluorescent reagent (invention of claim 10).
Further, as the invention relating to the method different from the invention of claim 8 when acquiring the first image and the second image, the inventions of claims 11 to 14 below are respectively It can be suitably used according to needs.
First, the invention of claim 11 is a method of using electrostatic force for capturing live cells, that is, the live cells according to any one of claims 1 to 5. In this counting method, the sample is introduced into a cell flow path provided with an imaging means for counting live cells, and a part of the cell flow path is positively charged, so that the sample is negatively charged in a natural state. The live cells inside are captured by the positively charged portion, the first image of the sample containing the captured live cells is acquired, and then a fluorescent reagent is introduced into the cell channel to fluoresce the captured live cells. The fluorescent reagent that is labeled and not taken up by the living cells is removed by a washing solution, and then a fluorescence image (second image) of the sample containing the captured living cells is obtained.
Next, the invention of claim 12 is a method of using an antigen-antibody reaction for capturing live cells, that is, according to any one of claims 1 to 5. In the live cell counting method, the sample is introduced into a cell flow path equipped with an imaging means for counting live cells, and specifically binds to a part of the cell flow path in advance with a live cell to be captured. By immobilizing the antibody to be captured, live cells in the sample are captured by binding to the antibody, and the first image of the sample containing the live cells captured by the antibody is obtained. A fluorescent image (second image) of the sample containing the captured live cells is introduced after introducing into the cell channel and fluorescently labeling the captured live cells and removing the fluorescent reagent that has not been taken up by the live cells with a washing solution. It is characterized by acquiring.
Next, the invention of claim 13 is a method of using a filter for capturing living cells and holding the living cell capturing surface with a transparent plate for preventing dust adhesion and facilitating handling. The live cell counting method according to any one of claims 1 to 5, wherein the sample is filtered to capture live cells on a filter, and the live cells are captured on the filter. The surface is covered with a transparent plate such as glass or plastic, and the first image of the sample containing the captured live cells is obtained from the transparent plate side, and then the fluorescent reagent is placed on the side opposite to the live cell capture surface of the filter. The fluorescence image of the sample containing the captured live cells from the transparent plate side (after the fluorescent reagent that has not been taken up by the live cells by filtration is removed by filtration. Second image) Characterized in that the Tokusuru. The transparent plate is preferably a thin film.
Next, the invention of claim 14 uses a method of using an electrostatic force or an antigen-antibody reaction for capturing a living cell, and using a reaction time of a fluorescent reagent for acquisition timing of the first image and the second image. That is, in the live cell counting method for measuring the number of live cells by labeling live cells such as microorganisms and cell tissues in a sample with a fluorescent reagent, an imaging means for live cell counting is provided. In addition, the sample is introduced together with a fluorescent reagent into a cell flow path having a positively charged part or an antibody fixing part for capturing live cells in the sample, and the living cells are fluorescently labeled in response to the fluorescent reagent. A first image of the sample containing the captured live cells is obtained, and after the live cells are fluorescently labeled in response to the fluorescent reagent, a fluorescence image of the sample containing the captured live cells (first image) is obtained. By acquiring two images) And measuring the number of cells.
In the case of the invention of claim 14, there is a merit that the counting procedure is simplified, but if necessary, the concentration of the fluorescent reagent is lowered to slow the reaction time, or the temperature during the reaction is set. By reducing the reaction time by lowering, the interval between the acquisition timings of the first image and the second image can be increased.
In addition, as an apparatus for carrying out the counting method, inventions according to claims 15 to 17 are preferable. That is, in the living cell counting apparatus for measuring the number of living cells by labeling living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent, optical means for irradiating the sample with excitation light; Optical means for collecting the fluorescence emitted by the sample, an image sensor that captures the captured fluorescence as an image and converts it into an electrical signal, and recognizes each bright spot in the image obtained by the image sensor. Image processing means for determining the area of the image, and arithmetic means for counting the number of bright spots having an area in a preset range and calculating the difference in the number of bright spots between the first image and the second image. (Invention of range 15)
Further, in the living cell counting apparatus for measuring the number of living cells by labeling living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent, optical means for irradiating the sample with excitation light; An optical means for collecting the fluorescence emitted from the sample, an image pickup device that captures the collected fluorescence as an image and converts it into an electrical signal, and obtains a difference image between the first image and the second image. An image processing means for recognizing a bright spot in the interior and calculating the area of each recognized bright spot, and an arithmetic means for counting bright spots having an area in a preset range (invention of claim 16) ).
Furthermore, in the living cell counting device for measuring the number of living cells by labeling living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent, optical means for irradiating the sample with excitation light; Optical means for collecting the fluorescence emitted by the sample, an image sensor that captures the captured fluorescence as an image and converts it into an electrical signal, and recognizes each bright spot in the image obtained by the image sensor. Image processing means for determining the area of the image and recording the position of the bright spot having an area within a preset range, and the insensitivity associated with each of the recorded bright spots for each recorded bright spot position. And calculating means for discriminating and counting those bright spots in the second image that are not included in the insensitive area recognized in the first image. Item 17).
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to FIGS.
(Example 1: Method by difference in number of bright spots)
Based on FIG. 1, an embodiment of a method for measuring the number of bacteria utilizing the difference in the number of bright spots between the first image and the second image will be described below. In the following description, the count of bacteria contained in the liquid sample is assumed. However, the bacteria adhering to the solid sample can be developed into sterilized water by wiping or stomaching and thereafter handled in the same manner as the liquid sample.
First, bacteria contained in the sample 1 are captured on the filter 2 by filtration. As the filter, a membrane filter having high uniformity of pore size is preferable. The pore size of the membrane filter to be used must be selected depending on the size of the bacteria to be measured. When counting bacteria, about 0.2-0.6 micrometer is suitable normally.
Next, the fluorescent image acquisition means 3 is used to acquire a fluorescent image (first image) of the membrane filter that has captured the bacteria. The acquired image is subjected to image processing by the image / arithmetic processing unit 4 to obtain the number A of fluorescent luminescent spots present in the image. Bright spots already present before fluorescent labeling are impurities.
Specifically, the following processing is performed as image processing.
(1) Capture multiple screens with the same field of view and average them to reduce random noise
(2) Shading (shading) correction
(3) Bright spots are extracted by edge detection
(4) Recognize how far individual bright spots are connected by labeling
(5) Select bright spots whose area falls within the preset range
Count the bright spots selected in (6) (5)
The area preset in (5) is a numerical value determined from the size of the bacteria to be counted and the characteristics of the device used for detection. By conducting an experimental study in advance, a setting such as “an area corresponding to a diameter of 0.2 to 10 μm” can be made.
Subsequently, the fluorescent labeling reagent 5 is added on the membrane filter. As the fluorescent labeling reagent 5, if DAPI or AO having an affinity for a gene is used, all bacteria can be labeled. PI is suitable for labeling dead bacteria. By using CFDA or CTC that expresses fluorescence due to physiological activity of bacteria such as enzymatic reaction and respiration, only viable bacteria can be selectively labeled. When labeling a specific bacterium, an antigen-antibody reaction or a technique for recognizing a specific gene sequence is used. In the former case, an antibody that specifically binds to an antigen of a target bacterium is fluorescently labeled in advance, and only this specific type of bacterium is labeled by reacting this fluorescently labeled antibody with a sample. In the latter case, a target bacterium can be labeled with a specific gene as a target using a technique such as FISH or in situ PCR.
A fluorescent labeling reagent that has not reacted with bacteria may cause measurement noise. In this case, it is effective to remove the reagent that has not been taken up by the bacteria by filtration. In order to further improve the removal effect, it is effective to remove the reagent that has not been taken up by the bacteria by filtration and then wash away the reagent with a washing solution.
As the washing solution, a buffer solution having a pH suitable for the fluorescence expression of the fluorescent labeling reagent is suitable. For example, since AO and CFDA are alkaline and have good fluorescence expression efficiency as a fluorescent labeling reagent, a fluorescent image with higher contrast can be obtained by using an alkaline pH buffer solution as a washing solution.
After the fluorescent labeling, a fluorescent image (second image) of the membrane filter is acquired again. The acquired second image is subjected to the same image processing as that of the first image, and the number of fluorescent bright spots B existing in the image is obtained. Then, the difference (B−A) in the number of bright spots between the first image and the second image, that is, the number of bright spots appearing by the fluorescent label is obtained, and this is used as the number of bacteria.
(Example 2: Method using difference image)
Based on FIG. 2, an embodiment of a method for measuring the number of bacteria using the determination of a difference image between a first image and a second image will be described below.
As a procedure, first, as in Example 1, bacteria contained in the sample solution are captured on a membrane filter by filtration. Next, a fluorescence image (first image 6 shown in the center of FIG. 2) of the membrane filter that captures the bacteria is acquired. Subsequently, a fluorescent labeling reagent is added onto the membrane filter to fluorescently label the bacteria. Thereafter, a fluorescence image of the membrane filter (second image 7 shown on the left side of FIG. 2) is acquired again. Then, a difference image 8 shown on the right side of FIG. 2 is obtained from the second image 7 and the first image 6.
The bright spot present in the difference image 8 is a bright spot that appears by the fluorescent label, and this is counted as the number of bacteria.
When actually performing the difference between images, there are cases where an ideal result cannot be obtained by the above-described processing. Specifically, in the following cases, it is difficult to obtain an appropriate number of bright spots with a simple difference image.
(1) When the image acquisition position is shifted between the first image and the second image
(2) When the brightness of the entire image (background) differs between the first image and the second image due to the influence of fluorescent labeling operations and the difference in optical conditions during image acquisition
(3) When the shape and size of the images derived from the corresponding bright spots differ between the first image and the second image due to differences in focus at the time of image acquisition and conditions setting at the time of image processing
(4) When the bright spot itself has moved between the first and second images
In the case of {circle around (1)}, a correct result can be obtained by recognizing the positional relationship between the two images by image processing called pattern matching and obtaining a difference image at the corresponding position.
The case (2) can be dealt with by a method of clarifying the distinction between the signal derived from the bright spot and the signal derived from the background by image processing such as binarization and edge detection. In the case of (3), it is difficult to cope with this embodiment, but according to embodiment 3 described later, it can be effectively handled. Case (4) can be dealt with in the first embodiment.
In addition, in this example and Example 3 described later, if the position of the bacteria moves during fluorescent labeling or washing, an error occurs in the analysis of the bright spot between the first image and the second image. In order to prevent this, it is effective to perform fluorescence labeling or washing while performing suction filtration.
(Example 3: Method using location information)
Based on FIG. 3, an embodiment of a method for measuring the number of bacteria using the position information of the fluorescent bright spot will be described below.
As a procedure, as in Example 1 and Example 2, first, bacteria contained in the sample solution are captured on the membrane filter by filtration. Next, a fluorescent image (first image 6) of the membrane filter that captures the bacteria is acquired. At the time of image acquisition, the reference point 9 (indicated by a white arrow in the figure) is used, the position of the membrane filter is grasped based on this, and the position information 10 of the bright spot in the first image is recognized. . Subsequently, a fluorescent labeling reagent is added onto the membrane filter to fluorescently label the bacteria. Thereafter, a fluorescence image (second image 7) of the membrane filter is acquired. As with the first image, when acquiring the image, the reference point 9 (arrow in the figure) is used, the position of the membrane filter is grasped on the basis of this, and the position information 11 of the bright spot in the second image is recognized. To do.
Although the 1st image 6 and the 2nd image 7 which are shown in FIG. 3 are very small, the example in which the parallel movement and rotation have occurred is shown. In this way, even when the image acquisition position is shifted, the position of the bright spot can be correctly recognized as a relative position from the reference point. Then, the bright spot position information is compared between the second image 7 and the first image 6 to obtain bright spot information 12 that appears for the first time after becoming the second image 7. The number of bright spots obtained from the bright spot information 12 is the number of bacteria.
Actually, it is difficult to obtain coincidence / non-coincidence between points having no area. Therefore, a predetermined area set in advance is recognized as an insensitive area associated with each bright spot with respect to the position of the bright spot obtained in the first image 6. As described above, the insensitive area is set, for example, as “an area having a radius of 10 μm with respect to the position of the bright spot obtained in the first image” or “an area having ± 5 pixels in both vertical and horizontal directions as an image”. By appropriately setting this insensitive area, it is possible to appropriately measure the number of bacteria even in the case of (3), which has been a problem in the above-described second embodiment.
In the embodiment shown in FIG. 3, the amount of excitation light at the time of first image acquisition is made larger than the amount of excitation light at the time of second image acquisition as in the invention of claim 4 above. Further, it is possible to more reliably eliminate the influence of the fluorescent contaminants, and to further improve the counting accuracy of the living cells.
Further, as in the invention of claim 5 above, the counting accuracy can be improved by replacing the first image with a fluorescent image and using a sample solid image. In this case, when acquiring the first image, the sample is irradiated with excitation light instead of white light.
(Example 4: Example of apparatus)
Based on FIG. 4, the Example of the counting apparatus of the living cell based on this invention is described.
Excitation light emitted from the light source 13 is reflected by the dichroic mirror 14, collected by the objective lens 15, and irradiated on the sample 16 on the membrane filter 2. As the light source, a light emitting diode, a semiconductor laser, a mercury lamp, or the like is suitable. The fluorescence emitted from the sample is collected by the objective lens, passes through the dichroic mirror, and forms an image on the image sensor 17. A CCD element or a CMOS element can be used as the imaging element. The image sensor captures the fluorescence as an image and converts it into an electrical signal. An image obtained by the image sensor is transmitted to the image / arithmetic processing unit 4 and various image processing and arithmetic processing as described above are performed.
Moreover, it is preferable that the membrane filter 2 on which the sample is placed is sequentially scanned in the horizontal direction 18 by a driving unit (not shown), and a visual field area is enlarged by acquiring and analyzing a plurality of screens. This is effective, for example, in reducing statistical variations in the counting results when the bacterial distribution is dense. Further, the driving in the vertical direction 19 is a function necessary when performing autofocus for image observation. As the driving means, for example, a stepping motor capable of precise position control is desirable.
In the case where the first image is used as a sample image instead of the fluorescence image, when the first image is acquired, the sample is irradiated with excitation light instead of white light. And white light switching means (not shown).
(Example 5: Method of using electrostatic force)
Based on FIG. 5, an embodiment of a method using electrostatic force for capturing live cells will be described below.
In FIG. 5, a sample is introduced into a cell channel 20 having an imaging means 21 for counting live cells and an electrode 22 for generating electrostatic force, and a part of the cell channel 20 is positively charged. Thus, the live cells 30 in the negatively charged sample in the natural state are captured by the positively charged portion, the first image of the sample containing the captured live cells is acquired by the imaging means 21, and then the fluorescent reagent is supplied to the cell flow. The captured live cells 30 introduced into the channel 20 are fluorescently labeled, and the fluorescent reagent that has not been taken up by the live cells is removed by a washing solution, and then a fluorescence image (second image) of the sample containing the captured live cells is taken. Obtained by means 21.
In FIG. 5, at least the surface of the cell channel 20 on which the imaging means 21 faces is made of transparent glass or plastic.
(Example 6: Method using antigen-antibody reaction)
Based on FIG. 6, an embodiment of a method using an antigen-antibody reaction for capturing live cells will be described below.
In FIG. 6, a sample is introduced into a cell flow path 20 provided with an imaging means 21 for counting live cells, and specifically binds to a part of the cell flow path 20 in advance with live cells to be captured. By immobilizing the antibody 23, the living cells 30 in the sample are captured by binding to the antibody 23, and a first image of the sample including the living cells 30 captured by the antibody 23 is acquired by the imaging means 21, and thereafter Then, a fluorescent reagent is introduced into the cell channel 20 to fluorescently label the captured live cells 30, and after the fluorescent reagent that has not been taken up by the live cells is removed by a washing solution, the fluorescence of the sample containing the captured live cells An image (second image) is acquired by the imaging means 21.
Industrial applicability
As described above, the present invention stains living cells such as microorganisms and tissue cells with a fluorescent reagent and generates fluorescence by exciting the reagent, or fluorescence originally possessed by living cells such as microorganisms and tissue cells. Fluorescence is generated by exciting a sex molecule, and the method can be used in a live cell counting method and apparatus that counts live cells using the fluorescence image. Examples of the microorganism include bacteria, fungi, viruses, yeasts, and molds, and fields of application of the counting method and apparatus include medical care, food production, and water and sewage.
According to this invention, before fluorescently labeling the living cells, a fluorescent image or a solid image (first image) of the sample is obtained, and after fluorescent labeling of the living cells, a fluorescent image of the sample (second image) Whether the difference between the number of bright spots in the first image and the second image is obtained, or the difference image between the first image and the second image is obtained, and the number of bright spots in the difference image is obtained. Or, since the position of the bright spots in the second image is determined to obtain the number of bright spots that are not included in the insensitive area associated with each bright spot in the first image,
It is possible to provide a live cell counting method and apparatus that eliminates the influence of fluorescent impurities regardless of the properties of the sample and improves the measurement accuracy.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the procedure of a live cell counting method according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a schematic explanatory view of a method of using a difference image according to the embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a schematic explanatory view of a method of using the bright spot position information according to the embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a schematic configuration diagram of a living cell counting apparatus according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is an explanatory diagram of an embodiment using the electrostatic force of the present invention.
FIG. 6 is an explanatory diagram of an example using the antigen-antibody reaction of the present invention.

Claims (17)

試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記第一画像中の輝点を計数し、
前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第二画像中の輝点を計数し、
前記第一画像中の輝点数と第二画像中の輝点数との差を求めることにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする生細胞の計数方法。In the live cell counting method for measuring the number of the living cells by labeling the living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent,
Before fluorescently labeling the living cells, obtain a fluorescent image of the sample (first image), count the bright spots in the first image,
After fluorescently labeling the living cells, obtain a fluorescent image (second image) of the sample, count the bright spots in the second image,
A method for counting living cells, wherein the number of viable cells is measured by obtaining a difference between the number of bright spots in the first image and the number of bright spots in the second image. 試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、
前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする生細胞の計数方法。In the live cell counting method for measuring the number of the living cells by labeling the living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent,
Before fluorescently labeling the living cells, obtain a fluorescent image (first image) of the sample, and after fluorescently labeling the living cells, obtain a fluorescent image (second image) of the sample,
A method for counting living cells, comprising: obtaining a difference image between the first image and the second image and measuring the number of the living cells by obtaining the number of bright spots in the difference image. 試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
前記生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、かつ前記第一画像中の輝点の位置情報を取得し、さらに、前記輝点に対して半径や縦横幅などの不感領域を予め設定して、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域をそれぞれ認識し、
前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、かつ前記第二画像中の輝点の位置情報を取得し、
前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする生細胞の計数方法。In the live cell counting method for measuring the number of the living cells by labeling the living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent,
Before fluorescently labeling the living cells, a fluorescent image (first image) of the sample is acquired, and position information of the bright spot in the first image is acquired. By setting insensitive areas such as width in advance, each of the insensitive areas associated with each bright spot in the first image is recognized,
After fluorescently labeling the living cells, obtain a fluorescence image (second image) of the sample, and obtain position information of bright spots in the second image,
Measuring the number of viable cells by determining the number of bright spots that are not included in the insensitive area associated with each bright spot in the first image among the bright spots in the second image. A method for counting live cells. 前記第一画像取得の際の励起光量は、前記第二画像取得の際の励起光量より大とすることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。4. The raw light according to claim 1, wherein an excitation light amount at the time of acquiring the first image is larger than an excitation light amount at the time of acquiring the second image. 5. Cell counting method. 試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
前記生細胞を蛍光標識する前に、前記請求の範囲第３項に記載の第一画像に代えて、試料の実体画像を取得してこれを第一画像とし、かつ前記実体画像中の全ての粒子の輝点の位置情報を取得し、さらに、前記輝点に対して半径や縦横幅などの不感領域を予め設定して、前記実体画像中の各輝点に付随する不感領域をそれぞれ認識し、
前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、かつ前記第二画像中の輝点の位置情報を取得し、
前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記実体画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求めることにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする生細胞の計数方法。In the live cell counting method for measuring the number of the living cells by labeling the living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent,
Before fluorescently labeling the living cells, instead of the first image according to claim 3, an entity image of the sample is obtained and used as the first image, and all of the entity images in the entity image The position information of the bright spot of the particle is acquired, and furthermore, a dead area such as a radius and a vertical and horizontal width is set in advance for the bright spot, and a dead area associated with each bright spot in the entity image is recognized. ,
After fluorescently labeling the living cells, obtain a fluorescence image (second image) of the sample, and obtain position information of bright spots in the second image,
Of the bright spots in the second image, the number of the live cells is measured by obtaining the number of bright spots whose positions are not included in the insensitive area associated with each bright spot in the entity image. A live cell counting method. 前記「生細胞を蛍光試薬により標識すること」に代えて、「生細胞内の代謝により蛍光すること」とすることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein, instead of “labeling a living cell with a fluorescent reagent”, “fluorescence is caused by metabolism in the living cell”. The live cell counting method described. 前記生細胞は、細菌とすることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。The live cell counting method according to any one of claims 1 to 6, wherein the live cell is a bacterium. 試料をろ過してフィルタ上に生細胞を捕捉し、前記フィルタ上に捕捉した生細胞を含む試料の第一画像を取得し、蛍光試薬をフィルタ上の試料に添加して生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、フィルタ上に捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。The sample is filtered to capture live cells on the filter, a first image of the sample containing the live cells captured on the filter is acquired, and a fluorescent reagent is added to the sample on the filter to fluorescently label the live cells. The fluorescent image (second image) of the sample containing the living cells captured on the filter is obtained after removing the fluorescent reagent that has not been taken up by the living cells by filtration. 6. The live cell counting method according to any one of items 5 to 6. 生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、ろ過後も残留する蛍光試薬を洗い流すべく、洗浄液を前記フィルタ上の試料に添加して、この洗浄液をろ過することを特徴とする請求の範囲第８項に記載の生細胞の計数方法。The fluorescent reagent that has not been taken up by the living cells is removed by filtration, and then the washing liquid is added to the sample on the filter and the washing liquid is filtered in order to wash away the fluorescent reagent remaining after the filtration. 9. The live cell counting method according to claim 8, 前記洗浄液は、前記蛍光試薬の蛍光発現に適したｐＨを有する緩衝液とすることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の生細胞の計数方法。10. The live cell counting method according to claim 9, wherein the washing solution is a buffer solution having a pH suitable for the fluorescence expression of the fluorescent reagent. 前記試料を、生細胞計数用の撮像手段を備えたセル流路内に導入し、前記セル流路の一部を正に帯電させることにより、自然状態で負に帯電した試料中の生細胞を前記正帯電部に捕捉し、前記捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬を前記セル流路に導入して前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。The sample is introduced into a cell flow path equipped with an imaging means for counting live cells, and a part of the cell flow path is positively charged, so that the living cells in the negatively charged sample in a natural state can be obtained. Captured by the positively charged portion, acquires the first image of the sample containing the captured live cells, and then introduces a fluorescent reagent into the cell channel to fluorescently label the captured live cells, 6. The fluorescent image (second image) of the sample containing the captured live cells is acquired after removing the fluorescent reagent that has not been taken in by the washing solution. The method for counting live cells according to claim 1. 前記試料を、生細胞計数用の撮像手段を備えたセル流路内に導入し、前記セル流路の一部に、予め、捕捉すべき生細胞と特異的に結合する抗体を固定しておくことにより、試料中の生細胞を前記抗体との結合によって捕捉し、前記抗体に捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬を前記セル流路に導入して前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬を洗浄液によって除去した後、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。The sample is introduced into a cell flow path provided with an imaging means for counting live cells, and an antibody that specifically binds to a live cell to be captured is fixed in advance in a part of the cell flow path. By capturing live cells in the sample by binding with the antibody, obtaining the first image of the sample containing live cells captured by the antibody, and then introducing a fluorescent reagent into the cell channel The captured live cells are fluorescently labeled, and after the fluorescent reagent that has not been taken up by the live cells is removed by a washing solution, a fluorescence image (second image) of the sample containing the captured live cells is acquired. The live cell counting method according to any one of claims 1 to 5. 前記試料を、ろ過してフィルタ上に生細胞を捕捉し、前記フィルタ上の生細胞捕捉面を、ガラスまたはプラスチック等の透明板で被覆し、この透明板側から前記捕捉した生細胞を含む試料の前記第一画像を取得し、その後、蛍光試薬をフィルタの生細胞捕捉面と反対側から添加することにより、前記前記捕捉した生細胞を蛍光標識し、生細胞に取り込まれなかった蛍光試薬をろ過によって除去した後、前記透明板側から前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の生細胞の計数方法。The sample is filtered to capture live cells on the filter, and the live cell capture surface on the filter is covered with a transparent plate such as glass or plastic, and the sample contains the captured live cells from the transparent plate side. The first image is acquired, and then a fluorescent reagent is added from the side opposite to the live cell capture surface of the filter, whereby the captured live cells are fluorescently labeled, and the fluorescent reagent that has not been incorporated into the live cells is removed. The fluorescent image (second image) of the sample containing the captured live cells is obtained from the transparent plate side after being removed by filtration, and any one of claims 1 to 5 characterized by the above-mentioned. The method for counting live cells according to 1. 試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法において、
生細胞計数用の撮像手段を備え、かつ試料中の生細胞を捕捉するための正帯電部もしくは抗体固定部を備えたセル流路内に、前記試料を蛍光試薬と共に導入し、前記蛍光試薬に反応して生細胞が蛍光標識される前に、前記捕捉した生細胞を含む試料の第一画像を取得し、その後、前記蛍光試薬に反応して生細胞が蛍光標識した後に、前記捕捉した生細胞を含む試料の蛍光画像（第二画像）を取得することにより、前記生細胞の数を測定することを特徴とする生細胞の計数方法。In the live cell counting method for measuring the number of the living cells by labeling the living cells such as microorganisms and cell tissues in the sample with a fluorescent reagent,
The sample is introduced together with the fluorescent reagent into a cell flow path provided with an imaging means for counting live cells and having a positively charged part or an antibody fixing part for capturing live cells in the sample. Before the live cells are fluorescently labeled by reaction, a first image of the sample containing the captured live cells is obtained. A method for counting living cells, comprising measuring a number of the living cells by acquiring a fluorescence image (second image) of a sample containing cells. 試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、
前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、撮像素子で得た画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求める画像処理手段と、予め設定した範囲の面積を有する輝点を計数し、かつ前記第一画像と第二画像との間の輝点数の差を求める演算手段とを備えることを特徴とする生細胞の計数装置。In a living cell counting apparatus for measuring the number of living cells by labeling living cells such as microorganisms and tissue in a sample with a fluorescent reagent,
Optical means for irradiating the sample with excitation light, optical means for collecting fluorescence emitted from the sample, an image pickup device that captures the collected fluorescence as an image and converts it into an electrical signal, and an image obtained by the image pickup device Image processing means for recognizing the bright spots of the image and calculating the areas of the recognized individual bright spots, counting bright spots having an area in a preset range, and bright spots between the first image and the second image. A living cell counting apparatus comprising: a calculating means for obtaining a difference in points. 試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、
前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、前記第一画像と第二画像との間の差分画像を求め、この差分画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求める画像処理手段と、予め設定した範囲の面積を有する輝点を計数する演算手段とを備えることを特徴とする生細胞の計数装置。In a living cell counting apparatus for measuring the number of living cells by labeling living cells such as microorganisms and tissue in a sample with a fluorescent reagent,
Optical means for irradiating the sample with excitation light, optical means for collecting fluorescence emitted from the sample, an image pickup device that captures the collected fluorescence as an image and converts it into an electrical signal, the first image, and the second image An image processing means for obtaining a difference image from the image, recognizing the bright spots in the difference image, obtaining the areas of the recognized individual bright spots, and calculating the bright spots having an area in a preset range And a means for counting living cells. 試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数装置において、
前記試料へ励起光を照射する光学的手段と、試料が発する蛍光を捕集する光学的手段と、捕集した蛍光を画像として捉え電気信号に変換する撮像素子と、撮像素子で得た画像中の輝点を認識し、認識した個々の輝点の面積を求め、予め設定した範囲の面積を有する輝点の位置を記録する画像処理手段と、記録した個々の輝点の位置に対して、予め設定した領域を各々の輝点に付随する不感領域として認識し、かつ、前記第二画像中の輝点のうち、その位置が第一画像で認識された不感領域に含まれないものを判別し計数する演算手段とを備えることを特徴とする生細胞の計数装置。In a living cell counting apparatus for measuring the number of living cells by labeling living cells such as microorganisms and tissue in a sample with a fluorescent reagent,
Optical means for irradiating the sample with excitation light, optical means for collecting fluorescence emitted from the sample, an image pickup device that captures the collected fluorescence as an image and converts it into an electrical signal, and an image obtained by the image pickup device The image processing means for recognizing the bright spot, obtaining the area of the recognized bright spot, recording the position of the bright spot having the area of the preset range, and the position of the recorded bright spot, Recognize a preset area as a dead area associated with each bright spot, and determine which bright spot in the second image is not included in the dead area recognized in the first image And a counting means for counting live cells.
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