JP4106626B2 - Fluorescence image measuring method and apparatus - Google Patents
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Description
技術分野
この発明は、微生物や組織細胞等の細胞や鉱物粒子などの微粒子を蛍光標識(蛍光試薬で染色)し、試薬を励起することで蛍光を発生させ、あるいは、微生物や組織細胞等の細胞や鉱物粒子などの微粒子が元々有する蛍光性分子を励起することで蛍光を発生させ、その蛍光画像を計測する蛍光画像計測方法および装置に関する。
背景技術
微生物や組織細胞などの蛍光画像計測は、生物を扱う多くの分野で用いられている。このような画像計測においても、近年の撮像素子や画像処理技術の進展に伴い、オートフォーカス(AF)の技術が汎用されるようになってきた。一般的なオートフォーカスは、画像信号に含まれる高周波成分量(コントラスト)を求め、コントラストが最大になる位置を合焦点位置とするものである。
本発明において、前記微生物には、細菌や放線菌などの原核生物、酵母やカビなどの真核生物、下等藻類、ウイルスなどが含まれ、前記組織細胞には、動植物由来の培養細胞及びスギやヒノキなどの花粉などが含まれる。なお、死菌を計測するなど、生きている物のみに限定されない。
また、本発明の計測方法においては、検出対象(例えば、微生物)を染色し得る1種以上の発色性物質にて染色を施すことができる。発色性物質としては、微生物に含まれる細胞成分と作用して発色するものであれば特に限定されないが、その代表的なものとして、核酸やタンパク質を染色する蛍光染色液が挙げられる。さらに具体的な発色性染料としては、微生物一般を対象とする場合は、蛍光性核酸塩基類似体、核酸を染色する蛍光染色剤、タンパク質を染色する染色液、タンパク質などの構造解析に用いられる環境性蛍光プローブ、細胞膜や膜電位の解析に用いられる染色液、蛍光抗体の標識に用いられる染色液などが、好気性細菌を対象とする場合は細胞の呼吸によって発色する染色液などが、真核微生物を対象とする場合はミトコンドリアを染色する染色液、ゴルジ体を染色する染色液、小胞体を染色する染色液、細胞内エステラーゼと反応する染色液及びその修飾化合物などが、高等動物細胞を対象とする場合は骨組織の観察に用いられる染色液、神経細胞トレーサである染色液などが挙げられる。
前記染色試薬で微生物等を染色後、試薬を励起することで蛍光を発生させ、その蛍光画像を撮像素子(例えば、CCDカメラ素子)で計測することにより、微生物等を計数することができる。なお、発生する蛍光の色(緑色、赤色等)あるいは蛍光の波長帯域は、微生物と染色試薬の種類によって異なる。
前記発色性物質の種類を選択することによって、すべての微生物を検出する全菌数測定、呼吸活性を持つ微生物のみを染色し計数する検定、エステラーゼ活性を持つ微生物のみを染色し計数する検定、あるいは複数の発色性物質を組み合わせた多重染色法を用いることによる特定の属や種の微生物を染色し計数する検定など、幅広い分野への適用が可能となる。
ところで、微生物や組織細胞の計測においては、蛍光試薬によって標本を標識する手法が広く用いられているが、この場合、下記のような問題がある。まず、計測対象の蛍光量が小さい場合が多いので、蛍光画像でAFを行おうとすると、AF用の撮像素子で検知可能な入射光量を得るのに長い蓄積時間が必要となり、その結果、AFに要する時間が長くなる。また、AFの間に励起光の照射によって標本が消光し輝度が低下、極端な場合には計測不能となる。
上記のような問題を解決し、オートフォーカスの効率向上を目的とした顕微鏡用焦点検出装置が提案されている(例えば、後記の特許文献1参照)。
特許文献1に開示された顕微鏡用焦点検出装置は、同公報の記載によれば、「特定波長の励起光を標本に照射し、該励起光より波長の長い光を対物レンズで集める落射蛍光観察手段と、透過照明手段の中にあって、蛍光より長い波長の光を透過するフィルタと、フィルタを透過した光のうち一方を透過し、他方を反射するダイクロイックミラーと、ダイクロイックミラーにより分離された短波長側及び長波長側に夫々配され、標本の観察光像を撮像するカメラ及び標本の観察光像の蓄積を行うイメージセンサと、イメージセンサの出力に基づいて標本の観察光像の焦点状態を検出する焦点検出手段と、焦点検出手段の合焦度に応じて対物レンズ、標本側の少なくとも一方を駆動して合焦点サーチを行うサーボ手段及びイメージセンサ、焦点検出手段を制御するCPUを備えたもの」である。
即ち、上記特許文献1に開示されたものは、対物レンズと対向する側に透過照明手段を設け、この透過照明によって蛍光観察波長よりも長波長の光を標本に照射し、それによって得られる観察像に基づいてAFを行なうものであり、蛍光画像とAF用画像とを分離するために波長分離手段を有し、各画像を得るために2系統の撮像手段を備えている。また、蛍光画像計測波長を切り替えて複数の波長帯域で蛍光画像計測を行なう場合は、光路長補正ユニットを組み合せて合焦位置を調節するようにしている。
しかしながら、上記特許文献1に開示されたものは、下記のような種々の問題がある。即ち、
1)光学フィルタやミラーが多いだけでなく、複数の撮像素子や光路長補正ユニットを必要とするため、構成が複雑でコスト高になる。
2)光学素子が多く受光効率が低下するため、輝度の低い標本の計測が困難である。
3)透過照明による計測画像をAFに用いているため、光を透過しないメンブレンフィルタ(標本のろ過,補足用フィルタ)などの表面に補足された標本にはフォーカスが行なえない。
4)コントラストが不鮮明でフォーカスのターゲットが明瞭でない標本に対してはAFが難しい。
また、上記特許文献1のように、標本の観察光像の焦点状態を検出するものではないが、光学系の焦点合わせを正確に行なう光計測方法に関して、後記の特許文献2には、下記の方法が記載されている。
特許文献2に開示された光計測方法は、同公報の記載によれば、「異なる波長領域を備えた複数の励起光源を備え、該複数の励起光源の中の第1の励起光源から発生した第1の励起光を試料に照射し、該照射により前記試料から発生した蛍光をレンズを通して検出する光計測方法において、前記複数の励起光源の中から前記蛍光の波長とほぼ等しい波長領域を備えた第2の励起光源を選択し、該第2の励起光源から発生した第2の励起光を前記試料に照射し、該試料で反射した第2の励起光を前記レンズを通して検出し、該検出される値が最大となるように前記レンズの位置を調節してフォーカシングを行うことを特徴とする光計測方法」である。
上記特許文献2に開示された光計測方法は、主として、DNAアレイ試験片の読み取りを対象とし、反射光量最大の位置をフォーカス位置と判断しており、前述のように、標本の観察光像の焦点状態を検出することにより、もしくは画像情報に基づいてオートフォーカスするものではない。また、反射光量を検量するために、オートフォーカス用の光を励起光と同じ光路で照射する必要があり、そのために同軸落射光学系で入射させなくてはならない。さらに、同公報の図4および当該部の説明から明らかなように、複数種類のダイクロイックミラーをモータにより回転させる必要がある等、装置構成が複雑で高コストとなる問題がある。
〔特許文献1〕
特開2001−91822号公報(第1−4頁、図1)
〔特許文献2]
特開2001−74658号公報(第2−4頁、図1、図4)
本発明は上記のような点に鑑みなされたもので、構成要素の少ないシンプルな構成で、蛍光強度の低い標本についても消光を起こさせることなく、さらに、メンブレンフィルタ表面に補足した標本やコントラストが不鮮明な標本についても、画像情報に基づいてAFを可能とする蛍光画像計測方法および蛍光画像計測装置を提供することを目的とする。
発明の開示
上記のような課題を解決するため、請求の範囲第1項の発明では、撮像手段を介して得た画像情報に基づきオートフォーカスを行なう蛍光画像計測方法において、計測試料としての標本に対して、まず蛍光画像計測波長帯域で発光するオートフォーカス用光を照射し、その結果得た画像情報に基づいて合焦度を判定し、その合焦度に応じて受光光学系または標本の少なくとも一方を駆動して合焦点位置をサーチし、合焦点位置に到達した後オートフォーカス用光の照射を止め、その後に、前記標本に対して励起光を照射し、試料が発する蛍光画像を計測することを特徴とする。これにより、標本に励起光を照射せずにオートフォーカスが可能であり、また、構成要素の少ないシンプルな構成によりオートフォーカスが可能となるので、受光効率低下が最小限に抑えられ、特に、蛍光強度の低い標本の計測が可能となる。
前記請求の範囲第1項の発明の実施態様としては、下記請求の範囲第2項ないし第8項の発明が好ましい。即ち、前記計測試料は、微生物や組織細胞等の細胞とする(請求の範囲第2項の発明)。
また、請求の範囲第1項または第2項記載の蛍光画像計測方法において、前記オートフォーカス用光は、前記標本に対して励起光照射側と同じ側であって、かつ励起光照射軸と所定の傾斜角を有する照射軸方向から照射する(請求の範囲第3項の発明)。これにより、装置構成がシンプルとなり、また、メンブレンフィルタ表面に補足した標本についても、オートフォーカスが可能である。
さらにまた、請求の範囲第2項記載の蛍光画像計測方法において、前記計測試料は複数種の細胞を含み、この複数種の細胞を計測する場合に、計測する細胞に応じて予め設定された複数の蛍光画像計測波長帯域のオートフォーカス用光を、順次切り替えて照射して前記合焦度を判定し、各細胞の蛍光画像を計測する(請求の範囲第4項の発明)。これによれば、オートフォーカス用の光を切り替えることにより、複数の励起−蛍光特性で画像計測を行なうシステムに対しても、この発明を適用することができる。
また、請求の範囲第1項ないし第4項のいずれかの発明においては、前記標本に近接する模様を設け、この模様の画像情報に基づいてオートフォーカスを行なうようにすることができる(請求の範囲第5項の発明)。AFのためには、コントラストの評価を行なうが、標本保持位置以外にフォーカスしてしまうといった誤動作を防ぎ、コントラスト評価を簡便かつ正確に行なうには、模様を用いる方法が有効である。
この請求の範囲第5項の発明において、前記模様は、標本を保持するスライドガラス表面に設けることができる(請求の範囲第6項の発明)。また、請求の範囲第5項の発明において、前記模様は、前記標本をろ過,補足するフィルタの表面に設けることができる(請求の範囲第7項の発明)。さらに、前記請求の範囲第5項ないし第7項の発明において、前記模様は、数字や図形を含み、これらを識別することで標本の位置情報を得ることを可能とすることができる(請求の範囲第8項の発明)。
また、前記蛍光画像計測方法を実施するための装置としては、下記請求の範囲第9項ないし第11項の発明が好ましい。即ち、撮像手段を介して得た画像情報に基づきオートフォーカスを行なう蛍光画像計測装置において、標本に対して蛍光画像計測波長帯域の光を照射するオートフォーカス用光照射手段と、標本に対する励起光照射手段と、オートフォーカス用および蛍光画像計測用の撮像手段と、蛍光および励起用のフィルタおよびダイクロイックミラーを有する蛍光フィルタブロックと、合焦度に応じて受光光学系または標本の少なくとも一方を駆動する合焦用駆動手段と、演算制御手段とを備え、前記演算制御手段は、オートフォーカス用光を照射して得た画像情報に基づいて合焦度を判定し、その合焦度に応じて受光光学系または標本の少なくとも一方を駆動して合焦点位置をサーチし、合焦点位置に到達した後オートフォーカス用光の照射を止め、その後に、前記標本に対して励起光を照射し、試料が発する蛍光画像を計測する制御機能を備えることを特徴とする(請求の範囲第9項の発明)。
また、前記請求の範囲第9項の発明において、前記オートフォーカス用光照射手段および/または励起光照射手段における光源は、発光ダイオードもしくは半導体レーザとする(請求の範囲第10項の発明)。
さらに、前記請求の範囲第9項の発明において、複数の蛍光画像計測波長帯域の光を切り替えてオートフォーカスを行なうために、前記オートフォーカス用光照射手段は複数のオートフォーカス用光源を有し、かつ前記蛍光フィルタブロックを複数個設けてなり、さらに、前記演算制御手段は、複数種の細胞にそれぞれ対応する予め設定された複数の蛍光画像計測波長帯域の光源を、順次切り替えてオートフォーカスを行なう機能を備えることを特徴とする(請求の範囲第11項の発明)。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について、図面に基づき詳細に説明する。図1は本発明の第1の実施の形態を示す蛍光画像計測装置の概略構成図である。
図1において、1は標本、2はAF用光源、3はダイクロイックミラー、4はフィルタ、5は対物レンズ、6は結像レンズ、7は撮像素子、8は演算部、9はステージ移動機構、10は励起用光源、11は集光レンズ、13は蛍光フィルタブロックを示す。
図1の計測装置においては、標本1に対して斜め上の方向から照射される光でAFを行ない、落射光学系によって蛍光画像計測を行なう方法を示すが、これに限定されるものではなく、例えば励起光,AF用光ともに斜め方向から照射する変形例、場合によってはAF用光を透過光とする例も含むものとするが、構造的には、図1に示す形態が最もシンプルで、かつ低コスト化が図れる。また、AFは従来と同様、画素間のコントラストを利用する一般的な方法を用いることとする。
図1において、まず、標本1に対して、AF用光源2から蛍光画像計測波長帯域の波長を含む光を照射することで、標本の退色を抑えるようにする。蛍光画像計測波長帯域は、ダイクロイックミラー3の分光透過特性と蛍光受光側フィルタ4の分光透過特性とで決まる。
AF用光源2としては、発光ダイオード(LED)や半導体レーザが好適である。その理由は、素子の選択によって発光スペクトルを様々に選ぶことができ、また、ON/OFFを繰り返しても特性が悪化し難いからである。さらに、これらの素子は小形軽量であるため、AF用光源として組み付けることも容易であることにもよる。
蛍光画像計測波長帯域でAF用画像を得られるので、前記特許文献1に開示された装置のように波長分離手段や2系統の撮像素子が不要となり、前記特許文献1や2の装置に比べて、装置構成が簡素化できる。なお、AF用光源として白色ランプを用い、光学フィルタを組み合わせることで所望の波長を得、照射,非照射をシャッタの開閉によって行なうことも可能である。また、AF用光の照射の角度は、試料面に対する傾斜角が5〜45°程度が好ましい。
AF用光照射時の標本の画像は、対物レンズ5,ダイクロイックミラー3,蛍光受光側フィルタ4および結像レンズ6を介して、撮像素子7で捉える。撮像素子としては、CCDカメラ用素子やCMOSカメラ用素子が好適である。撮像素子7で得た画像は、前記演算制御手段としての演算部8に送り、ここでコントラストの評価を行なう。コントラストの評価は、例えば隣り合う画素間の輝度差として算出し、コントラストが最大になる位置を合焦点位置とする、一般的なAF手法により行なう。
合焦点位置に至るまでの処理は、概ね以下のようになる。
1)ステージ移動機構9によって標本を移動
2)画像取込み
3)コントラスト評価
4)前画面とコントラストを比較
5)コントラストが増大していれば同方向にさらに移動
6)コントラストが減少していれば逆方向に移動
実際にAFを行なう際は、上記に加えて、始めに全域を粗くスキャンして概略フォーカス位置を把握したり、フォーカス位置に近づくにつれて移動距離を徐々に小さくしたり、同じ位置を所定回数往復したら合焦点位置と判断するなどのアルゴリズムが必要である。なお、ステージ移動機構9は必須要件ではなく、標本1と受光系の少なくとも一方を駆動して合焦点をサーチできれば良い。
合焦点位置に到達した後にAF用光を消灯し、それに続いて励起用光源10を点灯する。励起用光源10からの光は集光レンズ11,励起側フィルタ12,ダイクロイックミラー3および対物レンズ5を介して標本1に照射されるので、これにより蛍光画像計測が可能となる。
上記励起用光源としては、従来は高圧水銀ランプを用いることが多かったが、高圧水銀ランプは短時間でON/OFFを繰り返すと特性が著しく悪化するため、照射,非照射の切り替えにはシャッタが必要となる。従って、波長特性および光量が満足できれば、励起用光源としてもAF用光源と同様に、発光ダイオード(LED)や半導体レーザを用いることが望ましい。
図1に示す装置における各種主要部材の、好適な具体的諸元の一例(励起青色光−蛍光観察緑色光−AF緑色光の例)について、以下に示す。
1)励起用光源:中心波長470nmの青色LED
2)励起光側光学フィルタの透過波長帯域:450〜470nm
3)ダイクロイックミラーの特性:反射率と透過率の分岐点波長が505nm(即ち、505nmで透過率が約50%であって、505nmより短波長側では透過率が低下(反射率が高上)し、505nmより長波長側では透過率が高上(反射率が低下)するミラー特性を備える)
4)蛍光観察側光学フィルタの透過波長帯域:510〜560nm
5)AF用光源:中心波長535nmの緑色LED
次に、図2に示す本発明の第2の実施の形態を示す蛍光画像計測装置について述べる。図2において、図1に示す部材と同一機能部材には同一番号を付して、その詳細説明を省略する。
図2は、複数の生細胞、例えば複数の細菌を同時に計測する場合や同一の細菌であっても生菌と死菌とを含む場合であって、前記請求の範囲第4項や第11項の発明に関わる装置を示す。例えば複数の細菌を同時に計測する場合には、細菌の種類に応じて、複数の染色試薬が使用され、蛍光色は、細菌の種類や染色剤によって異なる。
そこで、上記のような複数の生細胞を計測する蛍光画像計測システムの場合には通常、前述の励起側フィルタ12,ダイクロイックミラー3および画像計測側フィルタ4の3要素を1つのユニットとする蛍光フィルタブロック13が、図2に示すように、複数個設けられる。そして、これらを切り替えることで、高圧水銀ランプから発せられる白色光を利用した複数の励起−蛍光特性で画像計測を可能としている。このような画像計測条件切り替え機構を有する蛍光画像計測システムに、この発明を適用する例について、図2に基づき以下に説明する。
図2においては、例えば5個の蛍光フィルタブロック13に対し位置認識機構14を設け、ブロックを切り替えたときその出力を取り込むことで、ブロックの設定状況を演算部8により自動認識するようにする。さらに、演算部8は設定された蛍光フィルタブロック13の蛍光画像計測波長を判断し、それに適合するAF用光を標本1に照射する。AF用光源15としては、複数種類の発光ダイオードや半導体レーザを切り替えて使用しても良いし、白色光源に所定の分光透過性を持った光学フィルタの切り替え機構とシャッタ機構を組み合わせて用いても良い。
合焦点位置に到達した後、AF用光を消灯する。それに続いて、励起光源10を点灯するか、あらかじめ励起光源は点灯しておき、励起光を遮っていたシャッタを開けることで、励起光を標本1に照射し、蛍光画像計測を行なう。なお、励起光源としては、前記白色光以外に、測定試料に応じた励起光を発する複数のLEDとすることもできる。
次に、図3ないし図5に基づき、AF用の模様を設けた例について説明する。前記図1および図2に示す蛍光画像計測装置においては、AFのためにコントラストの評価を行なっている。このとき、標本保持位置以外にフォーカスしてしまうといった誤動作を防ぎ、コントラスト評価を簡便かつ正確に行なうには、前述のように、模様を用いる方法が有効である。まず、標本を保持するスライドガラスの表面に模様をつける例について、図3を参照して説明する。
図示のように、スライドガラスGの表面に予め模様を描いておく。模様は、無蛍光性塗料や蛍光を発しない金属の蒸着などにより描く。模様の太さおよび密度は、画像を取り込んだとき視野中に少なくとも一部の境界が映るように設定することとする。
蛍光標識した微生物や組織細胞などの標本をスライドガラス上に滴下し、カバーガラスをかけて計測可能なサンプルとする。このとき、標本はカバーガラスで押えつけられ、スライドガラス表面の模様と近接あるいは密着した状態になる。サンプルを蛍光画像計測システムにセットし、AF用光を照射する。AF用画像の中には少なくとも模様の一部が映っているので、その部分をターゲットとしてオートフォーカスを行なう。それに続いて、励起光源を点灯し、蛍光画像計測を行なうのは、図1および図2に示した実施の形態と同様である。
なお、以上のような計測を行なうには、オートフォーカスの基準である模様と標本とが近接あるいは密着していることが前提である。実際には、対物レンズ,鏡筒,結像レンズおよび撮像素子で構成される受光系の焦点深度に比べ、模様と標本との距離が短ければ良い。
次に、図4について説明する。微生物や組織細胞を計測する際、メンブレンフィルタのろ過によって標本を補足し、それを計測する操作は極めて一般的な操作である。以下では、そのメンブレンフィルタ表面に模様を設ける蛍光画像計測方法について、図4を参照して説明する。
模様は図3の場合と同様、メンブレンフィルタFの表面に、無蛍光性塗料や蛍光を発しない金属の蒸着などにより描く。模様の太さおよび密度は、画像を取り込んだとき視野中に少なくとも一部の境界が映るように設定する。
蛍光標識した微生物や組織細胞などのサンプルを、メンブレンフィルタでろ過する。このメンブレンフィルタ上に補足された標本を、計測に用いるサンプルとする。このとき、標本はメンブレンフィルタ表面の模様と近接した状態になる。
サンプルを蛍光画像計測システムにセットし、AF用光を照射する。AF用画像の中には少なくとも模様の一部が映っているので、その部分をターゲットとしてオートフォーカスを行なう。合焦点位置到達後、AF用光を消灯する。それに続いて、励起光源を点灯し蛍光画像計測を行なう。
前記特許文献1の公報に開示された装置のように、透過光像に基づいてオートフォーカスを行なうものでは、特に、呈色がなく屈折率が水に近い標本に対しては、微分干渉法を用いる画像計測が事実上必須の要件となっている。上述したように、微生物を計測する際フィルタろ過によって標本を補足し、それを計測する操作は極めて良く行なわれる操作であるが、この状態では微分干渉像を得るのは困難である。つまり、特許文献1の公報に開示されたものは、フィルタ上に補足した標本については適用できないことになる。
次に、図5について説明する。微生物や組織細胞といった標本を計測する場合、統計的なバラツキを低減するためにサンプルを蛍光画像計測方向と直交する平面でスキャンし、複数の画面について画像計測を行なうことは少なくない。こうした場合、模様を単純な線などではなく、位置情報を得られる形態、例えば図5に示すように、例えばメンブレンフィルタFの表面に、区画と通し番号の組み合わせで描いておけば、微生物や組織細胞など標本の存在位置を把握することができる。
微生物や組織細胞が経時的に変化するような場合は、この方法を用いることで、個々の標本を個別に認識しつつ、その変化を追跡することができる。その典型例としては、微生物の増殖を捉える用途や、組織細胞に対する薬剤の影響を評価するようなケースが挙げられる。このような位置情報は、スライドガラスの表面に形成するようにしても良い。
産業上の利用の可能性
この発明は、前述のように、微生物や組織細胞等の細胞や鉱物粒子などの微粒子を含む試料を、染色試薬により標識し、試料が発する蛍光画像を計測する計測方法および装置に利用できる。本計測方法および装置の利用分野としては、医療,食品製造,上下水道などがある。
この発明によれば、標本に励起光を照射せずにオートフォーカスが可能であり、また、構成要素の少ないシンプルな機構を実現したことで受光効率低下が最小限に抑えられることから、特に、蛍光強度の低い標本の計測が可能である。
また、励起光照射方向と同じ側であって励起光照射軸と所定の傾斜角を有する照射軸方向からAF用光を照射するため、メンブレンフィルタ表面に補足した標本についても、オートフォーカスが可能である。
さらに、複数のAF用光源を備える方法によれば、蛍光フィルタブロックを切り替えながら複数の励起−蛍光特性で画像計測を行なうシステムに対しても、この発明を適用することができる。さらにまた、コントラストが不鮮明な標本についても、標本に近接して設ける模様を利用してオートフォーカスを行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明の第1の実施の形態を示す蛍光画像計測装置の概略構成図である。
図2は、本発明の第2の実施の形態を示す蛍光画像計測装置の概略構成図である。
図3は、AF用の模様を設けた例を説明する説明図である。
図4は、AF用の模様を設けた異なる例を説明する説明図である。
図5は、AF用の模様に位置情報を設けたさらに異なる例を説明する説明図である。Technical field
In the present invention, cells such as microorganisms and tissue cells, and fine particles such as mineral particles are fluorescently labeled (stained with a fluorescent reagent), and fluorescence is generated by exciting the reagent, or cells and minerals such as microorganisms and tissue cells. The present invention relates to a fluorescence image measuring method and apparatus for generating fluorescence by exciting fluorescent molecules originally possessed by fine particles such as particles and measuring the fluorescence image.
Background art
Fluorescence image measurement of microorganisms and tissue cells is used in many fields dealing with living organisms. Also in such image measurement, the autofocus (AF) technique has come to be widely used with the recent development of image sensors and image processing techniques. In general autofocus, a high-frequency component amount (contrast) included in an image signal is obtained, and a position where the contrast is maximized is set as a focus position.
In the present invention, the microorganism includes prokaryotes such as bacteria and actinomycetes, eukaryotes such as yeast and mold, lower algae, viruses, and the like, and the tissue cells include cultured cells derived from animals and plants and cedar. And pollen such as Japanese cypress. In addition, it is not limited only to living things, such as measuring dead bacteria.
In the measurement method of the present invention, staining can be performed with one or more chromogenic substances that can stain a detection target (for example, a microorganism). The color-developing substance is not particularly limited as long as it develops color by acting with cell components contained in microorganisms, and typical examples thereof include a fluorescent staining solution for staining nucleic acids and proteins. For specific chromogenic dyes, when targeting microorganisms in general, fluorescent nucleobase analogs, fluorescent stains for staining nucleic acids, staining solutions for staining proteins, environments used for structural analysis of proteins, etc. When a fluorescent probe, a staining solution used for analysis of cell membrane or membrane potential, a staining solution used for labeling a fluorescent antibody, etc. are used for aerobic bacteria, a staining solution that develops color by respiration of cells is a true nucleus. When targeting microorganisms, stains for mitochondria, stains for staining the Golgi apparatus, stains for staining the endoplasmic reticulum, stains that react with intracellular esterases, and modified compounds thereof target higher animal cells. In this case, a staining solution used for observing bone tissue, a staining solution that is a nerve cell tracer, and the like can be mentioned.
After staining the microorganism with the staining reagent, the reagent is excited to generate fluorescence, and the fluorescence image is measured with an imaging element (for example, a CCD camera element), whereby the microorganism can be counted. Note that the color of the generated fluorescence (green, red, etc.) or the wavelength band of the fluorescence varies depending on the type of microorganism and staining reagent.
By selecting the type of chromogenic substance, the total number of bacteria to detect all microorganisms, the assay for staining and counting only microorganisms having respiratory activity, the assay for staining and counting only microorganisms having esterase activity, or Application to a wide range of fields, such as an assay for staining and counting microorganisms of a specific genus or species by using a multiple staining method combining a plurality of chromogenic substances, becomes possible.
By the way, in the measurement of microorganisms and tissue cells, a technique of labeling a specimen with a fluorescent reagent is widely used, but in this case, there are the following problems. First, since the amount of fluorescent light to be measured is often small, when performing AF on a fluorescent image, a long accumulation time is required to obtain an incident light quantity that can be detected by an AF imaging device. It takes longer time. In addition, the specimen is extinguished by irradiation of excitation light during AF, and the luminance is lowered. In extreme cases, measurement is impossible.
There has been proposed a microscope focus detection apparatus that solves the above-described problems and aims to improve autofocus efficiency (see, for example,
According to the description of the publication, the focus detection apparatus for a microscope disclosed in
That is, the one disclosed in
However, the one disclosed in
1) Not only are there many optical filters and mirrors, but a plurality of image sensors and optical path length correction units are required, so the configuration is complicated and the cost is high.
2) Since there are many optical elements and the light receiving efficiency is lowered, it is difficult to measure a sample with low luminance.
3) Since a measurement image obtained by transmitted illumination is used for AF, it is not possible to focus on a sample captured on the surface such as a membrane filter (filter for sample, filter for supplement) that does not transmit light.
4) AF is difficult for specimens with unclear contrast and unclear focus targets.
Although the focus state of the observation light image of the specimen is not detected as in the above-mentioned
According to the description of the publication, the optical measurement method disclosed in
The optical measurement method disclosed in
[Patent Document 1]
JP 2001-91822 A (page 1-4, FIG. 1)
[Patent Document 2]
JP 2001-74658 A (page 2-4, FIG. 1, FIG. 4)
The present invention has been made in view of the above points, and has a simple configuration with few components, does not cause quenching even for a sample with low fluorescence intensity, and further has a sample and contrast supplemented on the membrane filter surface. It is an object of the present invention to provide a fluorescence image measurement method and a fluorescence image measurement apparatus that can perform AF even for unclear samples based on image information.
Disclosure of the invention
In order to solve the above-described problem, in the invention of
As an embodiment of the invention of the first aspect of the invention, the inventions of the second to eighth aspects of the invention are preferable. That is, the measurement sample is a cell such as a microorganism or tissue cell (the invention of claim 2).
Further, in the fluorescence image measuring method according to claim 1 or 2, the autofocus light is on the same side as the excitation light irradiation side with respect to the specimen and has a predetermined distance from the excitation light irradiation axis. Irradiation is performed from the direction of the irradiation axis having an inclination angle of (invention of claim 3). As a result, the apparatus configuration is simplified, and autofocusing is also possible for a sample captured on the membrane filter surface.
Furthermore, in the fluorescence image measuring method according to
In the invention of any one of
In the invention of claim 5, the pattern can be provided on the surface of the slide glass holding the specimen (invention of claim 6). In the invention of claim 5, the pattern can be provided on the surface of a filter that filters and supplements the specimen (invention of claim 7). Furthermore, in the inventions of claims 5 to 7, the pattern includes numerals and figures, and by identifying these, it is possible to obtain the position information of the specimen (claims). (Invention of item 8)
In addition, as an apparatus for carrying out the fluorescence image measuring method, the inventions of claims 9 to 11 described below are preferable. That is, in a fluorescence image measurement device that performs autofocus based on image information obtained through an imaging means, autofocus light irradiation means for irradiating the specimen with light in the fluorescence image measurement wavelength band, and excitation light irradiation for the specimen Means for driving autofocus and fluorescence image measurement, a fluorescence filter block having a filter for fluorescence and excitation, and a dichroic mirror; A driving unit for focusing, and a calculation control unit, wherein the calculation control unit determines a focusing degree based on image information obtained by irradiating the autofocusing light, and receives light according to the focusing degree. Drive at least one of the system or specimen to search for the in-focus position, and after reaching the in-focus position, stop the autofocus light irradiation, After the excitation light is irradiated to the specimen, characterized in that it comprises a control function of measuring a fluorescence image emitted by the sample (the invention of claims 9 wherein).
In the invention of claim 9, the light source in the autofocus light irradiation means and / or the excitation light irradiation means is a light emitting diode or a semiconductor laser (invention of claim 10).
Furthermore, in the invention of claim 9, in order to perform autofocus by switching light of a plurality of fluorescent image measurement wavelength bands, the autofocus light irradiation means has a plurality of autofocus light sources, In addition, a plurality of the fluorescent filter blocks are provided, and the arithmetic control means performs autofocus by sequentially switching light sources of a plurality of preset fluorescence image measurement wavelength bands respectively corresponding to a plurality of types of cells. It has a function (invention of claim 11).
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a fluorescence image measuring apparatus showing a first embodiment of the present invention.
In FIG. 1, 1 is a specimen, 2 is a light source for AF, 3 is a dichroic mirror, 4 is a filter, 5 is an objective lens, 6 is an imaging lens, 7 is an image sensor, 8 is an arithmetic unit, 9 is a stage moving mechanism,
In the measurement apparatus of FIG. 1, a method of performing AF with light irradiated from a diagonally upper direction on the
In FIG. 1, first, the
As the AF
Since an image for AF can be obtained in the fluorescence image measurement wavelength band, wavelength separating means and two image sensors are not required as in the device disclosed in
An image of the sample at the time of AF light irradiation is captured by the image sensor 7 through the objective lens 5, the
Processing up to the in-focus position is generally as follows.
1) The specimen is moved by the stage moving mechanism 9
2) Image capture
3) Contrast evaluation
4) Compare contrast with previous screen
5) If contrast increases, move further in the same direction
6) Move in the opposite direction if the contrast is decreasing
When actually performing AF, in addition to the above, first, the entire area is scanned roughly to grasp the approximate focus position, the moving distance is gradually decreased as the focus position is approached, or the same position is reciprocated a predetermined number of times. An algorithm such as determining the in-focus position is necessary. The stage moving mechanism 9 is not an essential requirement, and it is sufficient that at least one of the
After reaching the in-focus position, the AF light is turned off, and then the
Conventionally, a high-pressure mercury lamp is often used as the excitation light source. However, since the characteristics of the high-pressure mercury lamp deteriorate significantly when it is turned on and off in a short time, a shutter is used for switching between irradiation and non-irradiation. Necessary. Therefore, if the wavelength characteristic and the light quantity are satisfactory, it is desirable to use a light emitting diode (LED) or a semiconductor laser as the excitation light source as in the AF light source.
An example of suitable specific specifications (excitation blue light—fluorescence observation green light—AF green light) of various main members in the apparatus shown in FIG. 1 is shown below.
1) Excitation light source: Blue LED with a center wavelength of 470 nm
2) Transmission wavelength band of excitation light side optical filter: 450 to 470 nm
3) Characteristics of dichroic mirror: the branching point wavelength of reflectance and transmittance is 505 nm (that is, the transmittance is about 50% at 505 nm, and the transmittance is lowered at a wavelength shorter than 505 nm (the reflectance is high). In addition, it has a mirror characteristic that the transmittance is increased (the reflectance is decreased) on the longer wavelength side than 505 nm)
4) Transmission wavelength band of fluorescence observation side optical filter: 510 to 560 nm
5) AF light source: green LED with a center wavelength of 535 nm
Next, a fluorescence image measuring apparatus showing a second embodiment of the present invention shown in FIG. 2 will be described. In FIG. 2, members having the same functions as those shown in FIG.
FIG. 2 shows a case where a plurality of living cells, for example, a plurality of bacteria are simultaneously measured, or a case where the same bacteria include live and dead bacteria, and the
Therefore, in the case of the fluorescence image measurement system for measuring a plurality of living cells as described above, the fluorescence filter having the three elements of the
In FIG. 2, for example, the position recognition mechanism 14 is provided for five fluorescent filter blocks 13, and when the blocks are switched, the output is taken in so that the setting state of the blocks is automatically recognized by the
After reaching the in-focus position, the AF light is turned off. Subsequently, the
Next, an example in which an AF pattern is provided will be described with reference to FIGS. In the fluorescence image measuring device shown in FIGS. 1 and 2, contrast is evaluated for AF. At this time, as described above, a method using a pattern is effective for preventing malfunction such as focusing other than the specimen holding position and performing contrast evaluation simply and accurately. First, an example in which a pattern is formed on the surface of a slide glass holding a specimen will be described with reference to FIG.
As shown in the figure, a pattern is drawn in advance on the surface of the slide glass G. The pattern is drawn by non-fluorescent paint or vapor deposition of non-fluorescent metal. The thickness and density of the pattern are set so that at least a part of the boundary appears in the field of view when the image is captured.
Specimens such as fluorescently labeled microorganisms and tissue cells are dropped on a slide glass and covered with a cover glass to obtain a measurable sample. At this time, the specimen is pressed by the cover glass, and is brought into close proximity or in close contact with the pattern on the surface of the slide glass. A sample is set in a fluorescence image measurement system and irradiated with AF light. Since at least a part of the pattern is reflected in the AF image, autofocus is performed with that part as a target. Subsequently, the excitation light source is turned on and the fluorescence image measurement is performed as in the embodiment shown in FIGS.
In order to perform the measurement as described above, it is premised that the pattern, which is a reference for autofocus, and the sample are close to or in close contact with each other. Actually, it is only necessary that the distance between the pattern and the specimen is shorter than the depth of focus of the light receiving system including the objective lens, the lens barrel, the imaging lens, and the imaging device.
Next, FIG. 4 will be described. When measuring microorganisms and tissue cells, the operation of capturing a sample by filtration through a membrane filter and measuring it is a very common operation. Below, the fluorescence image measuring method which provides a pattern in the membrane filter surface is demonstrated with reference to FIG.
As in the case of FIG. 3, the pattern is drawn on the surface of the membrane filter F by non-fluorescent paint or vapor deposition of metal that does not emit fluorescence. The thickness and density of the pattern are set so that at least a part of the boundary appears in the field of view when the image is captured.
Samples such as fluorescently labeled microorganisms and tissue cells are filtered through a membrane filter. A specimen captured on the membrane filter is used as a sample used for measurement. At this time, the specimen is in a state close to the pattern on the surface of the membrane filter.
A sample is set in a fluorescence image measurement system and irradiated with AF light. Since at least a part of the pattern is reflected in the AF image, autofocus is performed with that part as a target. After reaching the in-focus position, the AF light is turned off. Subsequently, the excitation light source is turned on and fluorescence image measurement is performed.
In the case of performing autofocus based on the transmitted light image, as in the apparatus disclosed in the publication of
Next, FIG. 5 will be described. When measuring specimens such as microorganisms and tissue cells, in order to reduce statistical variation, the sample is often scanned on a plane orthogonal to the fluorescence image measurement direction and image measurement is performed on a plurality of screens. In such a case, if the pattern is not a simple line or the like, the position information can be obtained. For example, as shown in FIG. It is possible to grasp the location of the specimen.
When microorganisms and tissue cells change over time, this method can be used to track changes while recognizing individual specimens individually. Typical examples include applications that capture the growth of microorganisms and cases that evaluate the effects of drugs on tissue cells. Such position information may be formed on the surface of the slide glass.
Industrial applicability
As described above, the present invention can be used in a measurement method and apparatus for measuring a fluorescent image emitted from a sample by labeling a sample containing fine particles such as cells such as microorganisms and tissue cells and fine particles such as mineral particles with a staining reagent. Fields of application of this measurement method and apparatus include medical care, food production, water and sewage.
According to the present invention, auto-focusing is possible without irradiating the sample with excitation light, and a simple mechanism with few components is realized, so that a decrease in light receiving efficiency can be minimized. Measurement of specimens with low fluorescence intensity is possible.
In addition, since the AF light is irradiated from the irradiation axis direction that has the predetermined inclination angle with the excitation light irradiation axis on the same side as the excitation light irradiation direction, auto-focusing is also possible for a sample supplemented to the membrane filter surface. is there.
Furthermore, according to the method including a plurality of AF light sources, the present invention can be applied to a system that performs image measurement with a plurality of excitation-fluorescence characteristics while switching the fluorescence filter block. Furthermore, autofocusing can be performed using a pattern provided in the vicinity of a sample even for a sample with poor contrast.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a fluorescence image measuring apparatus showing a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a schematic configuration diagram of a fluorescence image measuring apparatus showing a second embodiment of the present invention.
FIG. 3 is an explanatory diagram for explaining an example in which a pattern for AF is provided.
FIG. 4 is an explanatory diagram for explaining a different example in which a pattern for AF is provided.
FIG. 5 is an explanatory diagram for explaining still another example in which position information is provided in an AF pattern.
Claims (11)
計測試料としての標本に対して、まず蛍光画像計測波長帯域で発光するオートフォーカス用光を照射し、その結果得た画像情報に基づいて合焦度を判定し、その合焦度に応じて受光光学系または標本の少なくとも一方を駆動して合焦点位置をサーチし、合焦点位置に到達した後オートフォーカス用光の照射を止め、その後に、前記標本に対して励起光を照射し、試料が発する蛍光画像を計測することを特徴とする蛍光画像計測方法。In a fluorescence image measuring method for performing autofocus based on image information obtained through an imaging means,
First, irradiate a specimen as a measurement sample with autofocus light that emits light in the fluorescence image measurement wavelength band, determine the degree of focus based on the image information obtained as a result, and receive light according to the degree of focus. Drive at least one of the optical system or the specimen to search for the in-focus position, stop the autofocus light irradiation after reaching the in-focus position, and then irradiate the specimen with excitation light, A fluorescent image measuring method, comprising: measuring a emitted fluorescent image.
標本に対して蛍光画像計測波長帯域の光を照射するオートフォーカス用光照射手段と、標本に対する励起光照射手段と、オートフォーカス用および蛍光画像計測用の撮像手段と、蛍光および励起用のフィルタおよびダイクロイックミラーを有する蛍光フィルタブロックと、合焦度に応じて受光光学系または標本の少なくとも一方を駆動する合焦用駆動手段と、演算制御手段とを備え、
前記演算制御手段は、オートフォーカス用光を照射して得た画像情報に基づいて合焦度を判定し、その合焦度に応じて受光光学系または標本の少なくとも一方を駆動して合焦点位置をサーチし、合焦点位置に到達した後オートフォーカス用光の照射を止め、その後に、前記標本に対して励起光を照射し、試料が発する蛍光画像を計測する制御機能を備えることを特徴とする蛍光画像計測装置。In a fluorescence image measuring device that performs autofocus based on image information obtained through an imaging means,
Autofocus light irradiating means for irradiating the specimen with light in the fluorescence image measurement wavelength band, excitation light irradiating means for the specimen, imaging means for autofocus and fluorescence image measurement, filters for fluorescence and excitation, and A fluorescence filter block having a dichroic mirror, a focusing driving means for driving at least one of the light receiving optical system or the sample in accordance with the degree of focusing, and an arithmetic control means,
The arithmetic control unit determines a focus degree based on image information obtained by irradiating the autofocus light, and drives at least one of the light receiving optical system or the sample according to the focus degree to thereby adjust the focus position. And, after reaching the in-focus position, stop the irradiation of the autofocus light, and then irradiate the specimen with excitation light and measure the fluorescence image emitted from the sample. Fluorescent image measuring device.
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