JP4171974B2 - Antigen separation apparatus and antigen measurement method and apparatus using the same - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
この発明は、試料中の細菌や生体内蛋白質等の抗原の分離装置並びにこれを利用した抗原の計測方法及び装置に関する。分離・計測対象としては、抗原抗体反応を利用して計測可能なすべての物が含まれ、細菌や放線菌などの原核生物、酵母やカビなどの真核生物、下等藻類、ウイルスなどの微生物や、動植物由来の培養細胞及びスギやヒノキなどの花粉などの細胞が含まれる。また、免疫分析,内分泌撹乱性物質(環境ホルモン)の検出,アトピー性皮膚炎の原因物質特性なども対象となる。対象試料としては、気体試料に比べて液体試料の場合の方が多いが、例えば気中に浮遊する細菌やカビなどの気体試料の抗原の計測も含まれる。本発明の利用分野としては、医療,食品製造,上下水道,環境分析などがある。
【0002】
【従来の技術】
例えば、試料中の微生物や動植物等の組織細胞などの検出は、滅菌状態の確認や、細胞の生存状態の異常等を検出する上で、産業上極めて重要な技術である。
【0003】
従来、被験面上に存在する肉眼では観察することのできない細菌等の微生物を観察および計数するには、培養法、すなわち寒天などで賦形した固形の平板培地を被験面に押し当てることにより、被験面上の微生物を寒天平板培地上に転写し、該微生物をそのまま平板培地上で適当な環境のもとで培養することにより出現するコロニーを肉眼または実体顕微鏡等で見定めながら計測する方法が一般的に利用されている。
【0004】
前記培養法は、計測所要時間が諸準備を含めて48〜72時間もかかる欠点があるので、近年では、抗原抗体反応を利用し、抗原を蛍光試薬により標識して画像計測する方法が開発されている。例えば、フィルタ上に捕集した微生物を適当な染色液と接触させて、発色した菌体数を顕微鏡等で計数することにより、培養を行わずに微生物を検出する。
【0005】
前記画像計測方法によれば、2〜3時間で計測が可能となる。計測所要時間の内訳は、例えば、抗原抗体反応および抗体磁気ビーズと試料液中のゴミとの磁気的分離に約70分,蛍光染色に約30分,顕微鏡観察に約30分で、合計2〜3となる。
【0006】
ところで、前記計測方法における画像解析方法としては、一般に、手動合焦の顕微鏡や撮像装置等を用いた画像解析が行なわれており、高倍率の使用条件下では被写界深度が狭いので合焦に手間取ることも多く、自動合焦や自動解析が望まれている。この観点から、自動合焦を行なって蛍光画像計測を行なう方法に関して、本件出願人によって発明された蛍光画像計測方法が、特願2002−30648号により出願されている。
【0007】
図5は、前記特願2002−30648号に記載された方法を実施する装置の一例を示す。図5に示す装置によれば、標本81に対して励起光を励起用光源80から照射する前に、蛍光画像計測波長帯域で発光するオートフォーカス(AF)用光を、図示のように励起光照射側と同じ側から光源82により照射し、これにより得た画像情報から合焦度を判断し、その度合いに応じて標本81と受光系の少なくとも一方を駆動して合焦点位置を探索し、合焦点位置に達したらAF用光の照射を停止し、その後に光源80から標本81に励起光を照射して蛍光画像計測を行なうことができる。本装置によれば、透過光を利用しないので、メンブレンフィルタ表面に補足した標本の計測も可能となる。
【0008】
AF用光源82としては、発光ダイオードや半導体レーザが好適である。AF用光照射時の標本の画像は、対物レンズ85,ダイクロイックミラー83,蛍光受光側フィルタ84および結像レンズ86を介して、撮像素子87で捉える。撮像素子としてはCCDカメラ用素子やCMOSカメラ用素子が好適である。撮像素子87で得た画像は演算部88に送り、ここでコントラストの評価を行なう。コントラストの評価は、例えば隣り合う画素間の輝度差として算出し、コントラストが最大になる位置を合焦点位置とする、一般的なAF手法により行なう。
【0009】
なお、図5において、89はステージ移動機構、91は励起光の集光レンズ、92はフィルタ、93は蛍光フィルタブロックを示す。また、前記コントラストの評価を行なうための合焦用マーカーとしては、図5には図示しないが、標本を保持するスライドガラスの表面に模様(マーク)をつけるか、もしくは標本のろ過捕捉用のメンブレンフィルタの表面に模様(マーク)をつける方法を採用している(詳細は、前記特願2002−30648号参照)。上記方法によれば、要素数の少ないシンプルな構成で、励起光の照射によって標本が消光し検知不能とすることなく、かつ、メンブレンフィルタ表面に補足した標本やコントラストが不鮮明な標本についてもオートフォーカス(AF)が可能となる。
【0010】
また、前記蛍光画像計測方法においては、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、測定精度の向上を図ることが望ましく、この観点から、本件出願人によって発明された生細胞の計数方法および装置が、特願2002−148884号により出願されている。
【0011】
前記特願2002−148884号に記載された画像計測装置は、生細胞の蛍光標識後の画像情報と蛍光標識前の画像情報との差に基づき画像計測を行ない、夾雑物の蛍光誤差を除去する機能を備えるものであって、前記出願においては三種類の方法を開示している。
【0012】
即ち、第一の方法は、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法および装置において、生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像(第一画像)を取得し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像(第二画像)を取得し、前記第一画像中と第二画像中の輝点数の差(B−A)を求めることとする。さらに前記とは異なる方法としては、前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求める第二の方法か、もしくは、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求める第三の方法である(詳細は、前記特願2002−148884号参照)。
【0013】
図6は、一例として、第一画像と第二画像との間で差分画像を求めることを利用する前記第二の方法に係る細菌数の計測方法を示す図である。
【0014】
手順としては、例えば、試料液に含まれる細菌を、ろ過によってメンブレンフィルタ上に捕捉する。次に、細菌を捕捉したメンブレンフィルタの蛍光標識前の蛍光画像(図6の中央部に示す第一画像96)を取得する。続いて、メンブレンフィルタ上に蛍光標識試薬を添加し、細菌を蛍光標識する。その後、再びメンブレンフィルタの蛍光画像(図6の左側に示す第二画像97)を取得する。そして、前記第二画像97と第一画像96とにより、図6の右側に示す差分画像98を求める。
【0015】
差分画像98中に存在する輝点が蛍光標識によって現れた輝点であり、これを細菌数として計数することにより、夾雑物の蛍光誤差を除去することができる。
【0016】
ところで、上記のように改良された蛍光画像計測方法に対しても、さらに簡便に短時間で、高精度の計測ができるような改良が求められている。また、計測対象によっては、微量の試料で計測を可能とすることが望まれる。このような観点から、微量試料をマイクロチップ内で抗原抗体反応をさせて計測する免疫分析装置と方法が、特許文献1により知られている。
【0017】
図7は、特許文献1に記載された免疫分析装置の斜視図を示す。図7に示す免疫分析装置は、特許文献1の記載によれば、反応固相としての直径1mm以下の固体微粒子102とともに、この固体微粒子102の径よりも大きい断面積を有するマイクロチャンネル反応槽部103と、前記固体微粒子102の径よりも小さい断面積を有するマイクロチャンネル分離部104とを備え、抗原および標識抗体を別々に前記反応槽部103へと導く導入部もしくはマイクロチャンネル流入部105,106を有している免疫分析マイクロチップを構成し、これを用いて分析する。
【0018】
図7において、第二抗体としての標識抗体の反応槽部103への導入のためのマイクロチャンネル流入部106とともに、第一抗体の導入のためのマイクロチャンネル流入部107、並びにバッファー液や洗浄液の導入のためのマイクロチャンネル流入部108を備えており、各々のマイクロチャンネル流入部105,106,107,108の端部には、抗原、標識抗体(第二抗体)、第一抗体、そして洗浄液の注入穴部105A,106A,107A,108Aが設けられてもいる。また、図7の例では、マイクロチャンネル分離部104の端部には、廃液部104Aが設けられている。
【0019】
固体微粒子102は、免疫抗原−抗体反応のための反応固相としての役割を果たすものであって、たとえばガラスビーズ、あるいはポリスチレン等の高分子ビーズ等が用いられる。この固体微粒子102は、直径が1mm以下、たとえば15〜85μmのもの用いられる。
【0020】
上記免疫分析マイクロチップによって、微量の試料等の使用によって、簡便に短い反応時間で免疫分析が可能となる。免疫分析の方法としては、反応固相としての固体微粒子102をマイクロチャンネル反応槽部103に導入し、導入部もしくはマイクロチャンネル流入部105,106より導入した抗原および標識抗体、さらに必要によりマイクロチャンネル流入部107より導入した抗体の固体微粒子102上での反応を行い、未反応物をマイクロチャンネル分離部104で分離し、光熱変換分析や蛍光分析等により分析することを可能としている。
【0021】
【特許文献1】
特開2001−4628号公報(第3−4頁、図1)
【0022】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上記特許文献1に記載された発明においても、主に測定対象物の分離装置に関わり、下記のような問題点がある。
【0023】
特許文献1の装置の場合、具体的には、上記特許文献1に記載されたように、「マイクロチャンネル反応槽部103の大きさは、半球状の穴部とした場合には、たとえばその半径が100μm以上、より好ましくは150μm以上とし、また、マイクロチャンネル分離部104は、たとえば、深さが10μm以下、幅10μm以下とされる。このようにすることによって、反応固相としての固体微粒子102は、マイクロチャンネル分離部104に流入することはなく、せき止められることになる。そして未反応物だけが、マイクロチャンネル分離部104に流入して分離される。また、必要に応じて、固体微粒子102から脱着された反応生成物のみが分離される。」
上記特許文献1に記載のように、特許文献1の分離装置は、「せき止め方式」であるため、試料液中に「ゴミ」がある場合、前記10μm以下に絞られた部分に、ゴミが詰まりやすく、測定不能となる問題がある。
【0024】
また、測定対象試料が比較的均質な場合には、極微量の試料により、高精度の検出が可能であるが、測定対象試料として、例えば、単位体積当りに含まれる細菌の数が少ない試料液であって、その液中の分布が均等でないような場合には、測定する液体の処理量は、ある程度の量必要であり、処理量が少なすぎると、測定精度の低下をもたらすか、もしくは測定が実質的に不可能となる。
【0025】
この発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、この発明の課題は、試料流体中の抗原の分離の際に、マイクロチャンネル内に液中のゴミが詰まることがなく、かつ、分離が簡便にして短時間ででき、流体の処理量も必要に応じて確保可能な抗原の分離装置を提供し、さらにこの分離装置を用いて、簡便にして短時間かつ高精度な計測が可能な抗原の計測方法及び装置を提供することにある。
【0026】
【課題を解決するための手段】
前述の課題を解決するために、この発明は、細菌や生体内蛋白質等の抗原を含む試料流体の導入口と、前記試料流体が流れる矩形状断面を有するマイクロチャンネル内の底面に複数個の抗体担持体を配設し、抗原・抗体反応により前記抗原を分離する反応部と、前記試料流体の導入口と反応部とを連通する前記マイクロチャンネル状の試料流体の導入路と、前記反応部から試料流体を排出する排出路とを備える抗原の分離装置において、前記導入路は、前記底面に垂直な方向の流体の流れのベクトルを生じて、前記試料流体中の抗原の分散濃度を前記底面近傍で局所的に高くする(抗原濃縮機能を備える)ように、前記反応部と流路段差を実質的に備えるものとする(請求項1の発明)。
【0027】
本発明における「矩形状断面」とは、底辺と対向する一辺が平行をなす多角形状断面のことであり、台形あるいは6角形などの断面形状を含むものとする。
【0028】
抗原・抗体反応により抗原を分離するためには、抗体担持体(例えば、抗体ビーズ)付近に抗原を濃縮する必要がある。抗体ビーズから例えば、20〜30μm程度、好ましくは、従来装置のように10μm程度に濃縮する必要がある。上記分離装置によれば、従来のように試料液の流路をせき止めもしくは絞ることなく、液中の固形物を濃縮し、反応部において特定の抗原のみを抗体ビーズにより捕獲分離して、残りのゴミを反応部から排出できるので、ゴミ詰まりの問題が解消でき、かつ簡便にして短時間に抗原が分離できる。また、例えば10分で10mL程度の処理量も確保できるので、種々のニーズに対応できる。詳細は後述する。
【0029】
また、前記請求項1の発明の抗原濃縮機能は、下記請求項2の発明のようにすると、濃縮機能はさらに向上する。即ち、請求項1に記載の分離装置において、前記反応部は、抗原を、前記抗体担持体が配設された底面側に、電気的吸引力により吸引するための電場発生手段を備えるものとする。
【0030】
抗原は、自然状態において、負に帯電しているので、前記抗体担持体が配設された底面側を正極とし、対向面を負極とした電場を発生することにより、抗原は抗体担持体の側に吸引されて濃縮される。なお、前記電場は、交番電界によって形成することもできる。
【0031】
また、前記請求項1または2に記載の分離装置において、前記導入路は、前記導入口と反応部との間に、前記試料流体に蛍光染色試薬を注入するための注入口を備えるものとする(請求項3の発明)。これにより、後述するように、蛍光画像観察により、抗原を計測することができるようになる。
【0032】
さらにまた、前記請求項1ないし3のいずれか1項に記載の分離装置において、分離装置本体は、前記試料流体の導入口,導入路,反応部および排出路等の流路を含む部材と、光透過性の蓋部材とを貼り合せた構成とする(請求項4の発明)。分離装置は、試料液や蛍光染色試薬等を導入するための配管,シール装置,制御弁などの種々の周辺機器を含むが、分離装置本体を、上記請求項4の発明のように構成することにより、分離装置本体をチップ化でき、量産性の向上とコストの低減化が図れる。上記チップは、使い捨てとすることができるので、装置の機動性およびメンテナンス性も向上する。
【0033】
また、試料液が多種類の抗原を含み、これらを同時に分離するためには、下記請求項5の発明が好ましい。即ち、前記請求項1ないし4のいずれか1項に記載の分離装置において、前記反応部を複数備え、各反応部はそれぞれ多種類の抗体を固定した抗体担持体もしくは各反応部毎に異なる抗体を固定した抗体担持体を有し、前記導入路は、前記各反応部を直列もしくは並列に試料流体が流れるように構成して、多種類の抗原を含む試料流体内の各抗原を個別に分離する構成とする。上記のように、反応部を複数設けたマルチチップとすることにより、多様性が高くかつ低コストの計測が可能となる。詳細は後述する。
【0034】
次に、前記分離装置を利用した抗原の計測装置としては、下記請求項6ないし9の発明が好ましい。即ち、請求項3に記載の抗原の分離装置を用いる抗原の計測装置であって、前記分離装置は、分離された抗原の蛍光画像情報に基づき画像計測を行なう画像計測装置を備えるものとする(請求項6の発明)。これにより、従来2〜3時間かかった計測時間は、磁気的分離操作がないこともあり、大幅に短縮され、25〜30分となる。
【0035】
また、請求項6の発明の実施態様としては、下記請求項7〜9の発明が好ましい。即ち、請求項6に記載の抗原の計測装置において、前記画像計測装置は、合焦用マーカーを有し、計測対象の抗原に対してオートフォーカスする合焦手段を備えるものとする(請求項7の発明)。この作用効果は、前述のとおりである。
【0036】
さらに、請求項7に記載の抗原の計測装置において、前記合焦用マーカーは、前記反応部の底面に配設した複数個の抗体担持体とする(請求項8の発明)。抗体担持体として、例えば、ポリスチレンビーズを用いた場合、前記底面に配列したビーズは、合焦用マーカーとして機能させることができるので、あらためて、マーカーを設ける必要がない。
【0037】
さらにまた、前記請求項6ないし8のいずれか1項に記載の抗原の計測装置において、前記画像計測装置は、前記抗原の蛍光標識後の画像情報と蛍光標識前の画像情報との差に基づき画像計測を行ない、夾雑物の蛍光誤差を除去する演算機能を備えるものとする(請求項9の発明)。この作用効果は、前述のとおりである。
【0038】
次に、抗原の計測方法としては、下記請求項10または11の発明が好ましい。即ち、請求項6ないし8のいずれか1項に記載の抗原の計測装置を用いた抗原の計測方法であって、下記の工程を含むこととする(請求項10の発明)。
1)前記抗原の分離装置の前記反応部へ、抗原を含む試料流体を、所定流量速度で通流する工程。
2)前記反応部において、電場を印加もしくは印加せずに抗原を濃縮し、抗原・抗体反応により抗原を抗体担持体に吸着する工程。
3)前記試料流体に蛍光試薬を注入して抗原を蛍光標識する工程。
4)洗浄液を通流して、前記蛍光試薬を洗浄する工程。
5)蛍光画像装置により抗原の画像計測を行なう工程。
【0039】
なお、上記3)の工程において、試料流体が気体の場合には、前記蛍光染色試薬は、ミスト状にして注入することが望ましい。
【0040】
また、前記請求項9に記載の抗原の計測装置を用いた抗原の計測方法であって、前記請求項10に記載の工程に加えて、請求項10に記載の3)の工程に係る蛍光標識する工程の前段においても画像計測を行い、請求項10に記載の5)の工程に係る画像計測による画像情報と、前記蛍光標識前段の画像情報との差に基づき、抗原の画像計測を行なう(請求項12の発明)。
【0041】
【発明の実施の形態】
本発明の実施例に関し、液体試料中の菌の計測例について、図1〜5に基づいて以下に述べる。まず、抗原の分離装置について述べる。
【0042】
図1は、請求項1および2の発明に関わる抗原の分離装置本体の概念的模式図である。また、図2は抗原の計測装置の模式的構成図であり、分離装置本体の具体的構成の斜視断面図を合わせて示す。図2(a)には本体下部の部材と蓋部材とを分解した斜視断面図を示し、図2(b)には組み立てた状態の斜視断面図を示す。
【0043】
図1および図2において、1は試料液の導入口、2は例えばポリスチレン製の抗体ビーズ、3は反応部、4は試料液の導入路、5は試料液の排出路、6は蛍光染色試薬の注入口、7は前記導入口,導入路,反応部および排出路等を含む試料液の流路を示す。また、図1において30は電場発生手段であり、図2において8は成型部材、9は蓋部材、10は蛍光染色試薬、20は画像計測装置を示す。
【0044】
図1に基づき、抗原の分離動作について説明する。導入口1から導入路4に導入された試料液は、抗原としての例えば菌1aとゴミ1bとを含むものとする。この試料液が反応部3に導入される過程で、導入路4の流路段差4aの部分で、矢印Vで示すような垂直方向の流れのベクトルを受けて、試料液中の菌1aは、ゴミ1bと共に反応部3の下方に濃縮される。反応部3のチャンネルの深さは、例えば、100μmとし、長さは3000μmである。また、濃縮される部分の深さ(図示h)は、例えば20μmである。
【0045】
上記濃縮により、抗体ビーズ2に菌1aに、抗原抗体反応によって容易に捕獲され、ゴミ1bのみが排出路5から排出されて、抗原としての菌1aが、試料液およびゴミから容易に分離される。また、濃縮される部分以外の流路は、試料液が円滑に流れることができるので、前記処理量を必要に応じて確保できる。
【0046】
なお、前記流路段差4aは、導入路4が直角に曲がる段差を図示しているが、デッドスペースをなくして滑らかな曲線で導入路4と反応部3とを接続してもよく、垂直方向の流れのベクトルを受けるような実質的な段差を備える流路構成であれば、種々の形状をとり得る。また、図1においては、排出路5にも段差を設けた例を示すが、この段差は省略することができる。
【0047】
また、前述のように、上記流路段差4aの他に、前記抗体ビーズが配設された底面側を正極とし、対向面を負極とした電場を、電場発生手段30により発生することにより、自然状態で負に帯電した抗原としての菌1aを、抗体ビーズ2の側に吸引し濃縮できる。なお、電場発生用の電源電圧は、例えば10数Vである。
【0048】
次に、図2に基づき、抗原の分離装置本体の構成および蛍光画像計測との関連について述べる。先に、分離装置本体の構成について、図3をも参照して述べる。図3は分離装置本体のみに着目した断面斜視分解図(a図),断面斜視図(b図)および断面図(c図)である。
【0049】
分離装置本体は、前述のように、前記試料液の導入口1,導入路4,反応部3および排出路5等の流路7を含む樹脂一体成型部材8と、ガラスもしくは光透過性樹脂製の蓋部材9とを接着した構成とする。なお、図2においては、導入路4に、蛍光染色試薬10の注入口6を設けた例を示す。また、蓋部材9には、排出路5の段差部の一部を塞ぐ突出部9aを設けた例を示すが、排出路5の段差を省略した場合には、前記突出部9aは不要である。
【0050】
次に、図2に基づき、抗原の計測手順について説明する。図2において、画像計測装置20は、前記図5に示したものと同様の装置であって、抗体ビーズ2に捕獲された抗原としての菌1aが、例えばガラス製の蓋部材9を介して観察できるように配設される。計測手順の具体例に関しては後述するとして、電場を印加する例に関して、まず基本的な手順について述べる。
【0051】
まず、反応部3へ、抗原としての菌1aを含む試料液を所定流量速度で導入した後、電場を印加して抗原を濃縮し、抗原・抗体反応により菌1aを抗体ビーズ2に吸着する。続いて、蛍光染色試薬10を注入して抗原を蛍光標識する。その後、洗浄液を通流して、前記蛍光染色試薬を洗浄した後、画像計測装置20により、画像計測を行ない、菌の計数が可能となる。画像計測の際、反応部に空気を導入して試料液を排出してもよいが、液を満たした状態で計測することができる。また蛍光出力は、菌の体積濃度の増大とともに比例的に増大するので、予め標準濃度で検量したデータに基づき、菌の体積濃度の計数も可能である。
【0052】
なお、ゴミなどの夾雑物の蛍光出力誤差を防止するためには、前述のように、蛍光標識する工程の前段においても画像計測を行い、蛍光標識前後の画像情報の差に基づき、抗原の画像計測を行なうことが望ましい。また、測定に当っては抗原へオートフォーカスすることが望ましいが、この具体的な方法に関しては後述する。
【0053】
次に、蛍光標識を行なって画像計測を行なう方法の具体例について述べる。具体的な蛍光試薬としては、例えば、微生物一般を対象とする場合は、蛍光性核酸塩基類似体、核酸を染色する蛍光染色剤、タンパク質を染色する染色液、タンパク質などの構造解析に用いられる環境性蛍光プローブ、細胞膜や膜電位の解析に用いられる染色液、蛍光抗体の標識に用いられる染色液などが、また好気性細菌を対象とする場合は細胞の呼吸によって発色する染色液などが、さらに真核微生物を対象とする場合はミトコンドリアを染色する染色液、ゴルジ体を染色する染色液、小胞体を染色する染色液、細胞内エステラーゼと反応する染色液及びその修飾化合物などが、また高等動物細胞を対象とする場合は骨組織の観察に用いられる染色液、神経細胞トレーサである染色液などが適用できる。これらにより染色することにより、蛍光顕微鏡で蛍光画像が観察できる。
【0054】
次に、前述のような方法で蛍光染色した微生物および細胞等の抗原の蛍光観察像を得る実施例について以下に述べる。即ち、分離した微生物および細胞等の抗原にエステラーゼ活性によって蛍光化する試薬、例えばカルボキシフルオレセインジアセテート(以下CFDAと略す)を反応させる。CFDAで蛍光染色された抗原の蛍光画像を取得する際は、まずマーカーとしての抗体ビーズ上にCFDAの蛍光波長光(例えば500〜550nm)を発するオートフォーカス用光を照射する。
【0055】
顕微鏡の焦点深度は、例えば約10μm程度であり、抗体ビーズおよびビーズに捕獲された抗原は、それぞれ、例えば約1μm程度であるので、マーカーとしての抗体ビーズに合焦させれば、実質的に抗原にも合焦させたこととなる。従って、抗体ビーズに合焦させ後、フォーカスされた抗原計測面にCFDAを励起できる波長(例えば450〜500nm)の光を照射して抗原の蛍光画像を取得する。得られた蛍光画像から、微生物および細胞等の抗原を認識、検出することができる。
【0056】
次に、図4について述べる。図4は、請求項5の発明に関わり、多種類の抗原を含む試料流体内の各抗原を個別に分離する場合の構成の概念的説明図である。(a)図は4個の反応部を直列に構成する場合の模式図、(b)図は並列に構成する場合の模式図である。図4において、1は試料流体の導入口、4は試料流体の導入路、5は試料流体の排出口、6は蛍光染色試薬の注入口を示す。4個の反応部は、それぞれ、3a〜3dで示す。
【0057】
前記各反応部3a〜3dは、それぞれ多種類の抗体を固定したビーズもしくは各反応部毎に異なる抗体を固定したビーズを備える。上記構成により、直列構成および並列構成のいずれの場合においても、多種類の抗原を含む試料流体内の各抗原を個別に分離することができる。但し、試料流体の各反応部への分配の均等性を考慮すると、直列構成の方が計測精度上好ましく、また構造もシンプルである。
【0058】
【発明の効果】
上記のとおり、この発明によれば、細菌や生体内蛋白質等の抗原を含む試料流体の導入口と、前記試料流体が流れる矩形状断面を有するマイクロチャンネル内の底面に複数個の抗体担持体を配設し、抗原・抗体反応により前記抗原を分離する反応部と、前記試料流体の導入口と反応部とを連通する前記マイクロチャンネル状の試料流体の導入路と、前記反応部から試料流体を排出する排出路とを備える抗原の分離装置において、前記導入路は、前記底面に垂直な方向の流体の流れのベクトルを生じて、前記試料流体中の抗原の分散濃度を前記底面近傍で局所的に高くする(抗原濃縮機能を備える)ように、前記反応部と流路段差を実質的に備えるものとしたので、
抗原の分離の際のゴミ詰まりの問題を解消し、分離が簡便にして短時間ででき、さらに流体の処理量も必要に応じて確保可能な抗原の分離装置が提供できる。
【0059】
また、上記分離装置により分離された抗原の蛍光画像情報に基づき画像計測を行なうことにより、従来2〜3時間かかった抗原の計測時間は、25〜30分に短縮され、簡便にして短時間かつ高精度な計測が可能となる。
【0060】
さらに、前述のように、分離装置を成型樹脂で1チップ化し、また反応部を複数設けてマルチチップ化することにより、多様性が高くかつ低コストの計測が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の抗原の分離装置本体の実施例の概念的模式図
【図2】 本発明の抗原の計測装置の実施例の模式的構成図
【図3】 本発明の抗原の分離装置本体の断面斜視分解図,断面斜視図および断面図
【図4】 本発明に関わり、多種類の抗原を含む試料流体内の各抗原を個別に分離する場合の構成の概念的説明図
【図5】 特願2002−30648号に記載されたオートフォーカスを行なう蛍光画像計測装置の構成の一例を示す図
【図6】 差分画像による細菌数の計測方法を示す図
【図7】 特許文献1に記載された免疫分析装置の斜視図
【符号の説明】
1:導入口、1a:菌、1b:ゴミ、2:抗体ビーズ、3,3a〜3d:反応部、4:導入路、4a:段差部、5:排出路、6:蛍光染色試薬の注入口、7:流路、8:成型部材、9:蓋部材、10:蛍光染色試薬、20:画像計測装置、30:電場発生手段。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an apparatus for separating antigens such as bacteria and biological proteins in a sample, and an antigen measuring method and apparatus using the same. Separation / measurement targets include everything that can be measured using antigen-antibody reactions. Prokaryotes such as bacteria and actinomycetes, eukaryotes such as yeast and mold, lower algae, microorganisms such as viruses And cultured cells derived from animals and plants and cells such as pollen such as cedar and cypress. In addition, immunological analysis, detection of endocrine disrupting substances (environmental hormones), and characteristics of causative substances of atopic dermatitis are also targeted. The target sample is more often a liquid sample than a gas sample, but includes, for example, measurement of an antigen of a gas sample such as bacteria or mold floating in the air. Fields of application of the present invention include medical care, food production, water and sewage, environmental analysis, and the like.
[0002]
[Prior art]
For example, detection of tissue cells such as microorganisms and animals and plants in a sample is an extremely important technology in the industry for confirming the sterilization state and detecting abnormalities in the survival state of cells.
[0003]
Conventionally, in order to observe and count microorganisms such as bacteria that cannot be observed with the naked eye on the test surface, the culture method, that is, by pressing a solid plate medium shaped by agar or the like against the test surface, A method is generally used in which a microorganism on the test surface is transferred onto an agar plate medium, and the colony that appears by culturing the microorganism as it is on a plate medium in an appropriate environment is measured with the naked eye or a stereomicroscope. Is used.
[0004]
Since the culture method has a drawback that it takes 48 to 72 hours, including various preparations, in recent years, a method for measuring an image by labeling an antigen with a fluorescent reagent using an antigen-antibody reaction has been developed. ing. For example, the microorganisms collected on the filter are brought into contact with an appropriate staining solution, and the number of colored cells is counted with a microscope or the like, thereby detecting the microorganisms without culturing.
[0005]
According to the image measurement method, measurement is possible in 2 to 3 hours. The breakdown of the time required for measurement is, for example, about 70 minutes for antigen-antibody reaction and magnetic separation of antibody magnetic beads and dust in the sample solution, about 30 minutes for fluorescent staining, and about 30 minutes for microscopic observation. 3
[0006]
By the way, as an image analysis method in the measurement method, image analysis using a manually focused microscope, an imaging device, or the like is generally performed, and focusing is performed because a depth of field is narrow under a high-magnification use condition. Therefore, automatic focusing and automatic analysis are desired. From this point of view, a fluorescence image measurement method invented by the present applicant has been filed in Japanese Patent Application No. 2002-30648 regarding a method of performing fluorescence image measurement by performing automatic focusing.
[0007]
Figure5These show an example of the apparatus which implements the method described in the said Japanese Patent Application No. 2002-30648. Figure5According to the apparatus shown in FIG. 1, before the sample 81 is irradiated with the excitation light from the
[0008]
As the
[0009]
Figure5, 89 is a stage moving mechanism, 91 is a condensing lens for excitation light, 92 is a filter, and 93 is a fluorescent filter block. Further, as a focusing marker for performing the contrast evaluation, FIG.5Although not shown in the figure, a pattern (mark) is applied to the surface of the slide glass holding the specimen, or a method of applying a pattern (mark) to the surface of the membrane filter for collecting and filtering the specimen is adopted. And Japanese Patent Application No. 2002-30648). According to the above method, with a simple configuration with a small number of elements, the sample is not extinguished due to excitation light irradiation and cannot be detected, and auto-focusing is performed even for samples captured on the membrane filter surface or samples with poor contrast (AF) is possible.
[0010]
Further, in the fluorescence image measurement method, it is desirable to eliminate the influence of fluorescent contaminants regardless of the properties of the sample, and to improve the measurement accuracy. From this viewpoint, the living cell invented by the applicant of the present application is desirable. A counting method and apparatus have been filed by Japanese Patent Application No. 2002-148884.
[0011]
The image measuring apparatus described in Japanese Patent Application No. 2002-14884 performs image measurement based on a difference between image information after fluorescent labeling of live cells and image information before fluorescent labeling, and removes fluorescence errors of impurities. The above application discloses three types of methods.
[0012]
That is, the first method is to label live cells with a fluorescent labeling method and apparatus for measuring the number of live cells by labeling live cells such as microorganisms and cell tissues in a sample with a fluorescent reagent. A fluorescent image of the sample (first image) is acquired, and after the live cells are fluorescently labeled, a fluorescent image of the sample (second image) is acquired, and the first image and the second image The difference (B−A) in the number of bright spots is determined. Further, as a method different from the above, the second image is obtained by obtaining a difference image between the first image and the second image, and the number of bright spots in the difference image is obtained. Among these, the position is a third method for obtaining the number of bright spots that are not included in the dead area associated with each bright spot in the first image (for details, refer to Japanese Patent Application No. 2002-148884).
[0013]
Figure6These are figures which show the measuring method of the bacteria count which concerns on said 2nd method using calculating | requiring a difference image between a 1st image and a 2nd image as an example.
[0014]
As a procedure, for example, bacteria contained in the sample solution are captured on a membrane filter by filtration. Next, the fluorescence image before the fluorescent labeling of the membrane filter that captured the bacteria (Fig.6A first image 96) shown in the central part of FIG. Subsequently, a fluorescent labeling reagent is added onto the membrane filter to fluorescently label the bacteria. Then, again, the fluorescence image of the membrane filter (Fig.6A second image 97) shown on the left side of FIG. The
[0015]
The bright spot present in the difference image 98 is a bright spot that appears due to the fluorescent label, and by counting this as the number of bacteria, the fluorescence error of impurities can be removed.
[0016]
Incidentally, there is a demand for an improved fluorescent image measurement method as described above that can perform measurement with high accuracy in a simpler and shorter time. Further, depending on the measurement target, it is desired to enable measurement with a very small amount of sample. From this point of view,
[0017]
Figure7These show the perspective view of the immunoassay apparatus described in
[0018]
Figure7In order to introduce a
[0019]
The
[0020]
By the use of a small amount of sample or the like, the immunoassay microchip can easily perform an immunoassay with a short reaction time. As an immunoassay method,
[0021]
[Patent Document 1]
Japanese Unexamined Patent Publication No. 2001-4628 (page 3-4, FIG. 1)
[0022]
[Problems to be solved by the invention]
By the way, the invention described in the above-mentioned
[0023]
In the case of the apparatus of
As described in
[0024]
In addition, when the sample to be measured is relatively homogeneous, high-precision detection is possible with a very small amount of sample, but as the sample to be measured, for example, a sample solution containing a small number of bacteria per unit volume However, when the distribution in the liquid is not uniform, a certain amount of processing amount of the liquid to be measured is necessary, and if the processing amount is too small, the measurement accuracy is lowered or the measurement is performed. Is virtually impossible.
[0025]
The present invention has been made in view of the above points, and an object of the present invention is to prevent the clogging of dust in the liquid in the microchannel during the separation of the antigen in the sample fluid, and the separation. Providing an antigen separation device that can be performed simply and in a short time, and can secure a fluid throughput as required, and further, using this separation device, an antigen that can be measured easily and in a short time with high accuracy It is in providing the measuring method and apparatus of this.
[0026]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the aforementioned problems, the present invention provides a plurality of antibodies on the inlet of a sample fluid containing an antigen such as a bacterium or an in vivo protein, and on the bottom surface of a microchannel having a rectangular cross section through which the sample fluid flows. A reaction part that disposes the antigen by antigen-antibody reaction, a microfluid-shaped sample fluid introduction path that communicates with the sample fluid introduction port and the reaction part, and a reaction part. In the antigen separation apparatus comprising a discharge path for discharging a sample fluid, the introduction path generates a fluid flow vector in a direction perpendicular to the bottom surface, and the dispersion concentration of the antigen in the sample fluid is determined in the vicinity of the bottom surface. The reaction part and the flow path step are substantially provided so as to be locally high (provided with an antigen concentration function) (invention of claim 1).
[0027]
The “rectangular cross section” in the present invention is a polygonal cross section in which one side facing the base is parallel, and includes a cross-sectional shape such as a trapezoid or a hexagon.
[0028]
In order to separate the antigen by the antigen-antibody reaction, it is necessary to concentrate the antigen in the vicinity of the antibody carrier (for example, antibody beads). It is necessary to concentrate the antibody beads to, for example, about 20 to 30 μm, preferably about 10 μm as in the conventional apparatus. According to the separation apparatus, the solid matter in the liquid is concentrated without clogging or squeezing the flow path of the sample liquid as in the prior art, and only the specific antigen is captured and separated by the antibody beads in the reaction section, and the rest Since dust can be discharged from the reaction part, the problem of dust clogging can be solved, and antigens can be separated easily and in a short time. Moreover, since a processing amount of about 10 mL can be ensured in 10 minutes, for example, various needs can be met. Details will be described later.
[0029]
AlsoThe antigen concentration function of the invention of
[0030]
Since the antigen is negatively charged in a natural state, the antigen is generated on the side of the antibody carrier by generating an electric field with the bottom surface on which the antibody carrier is disposed as the positive electrode and the opposite surface as the negative electrode. To be concentrated. The electric field can also be formed by an alternating electric field.
[0031]
In addition, the claim 1Or 2In the separation apparatus according to
[0032]
Furthermore, the
[0033]
In addition, the sample solution contains many types of antigens, and in order to separate them simultaneously, the following claims5The invention is preferred. That is, the
[0034]
Next, as an antigen measurement device using the separation device, the following claim6Or9The invention is preferred. That is, the claim3An antigen measurement apparatus using the antigen separation apparatus according to
[0035]
Claims6As an embodiment of the present invention, the following claims are provided.7~9The invention is preferred. That is, the claim6In the antigen measurement device according to
[0036]
And claims7In the antigen measurement apparatus according to
[0037]
Furthermore, the claim6Or8The antigen measurement apparatus according to any one of
[0038]
Next, the antigen measurement method includes the following claims:10Or11The invention is preferred. That is, the claim6Or8An antigen measurement method using the antigen measurement apparatus according to
1) A step of passing a sample fluid containing an antigen at a predetermined flow rate through the reaction part of the antigen separation device.
2) A step of concentrating the antigen in the reaction section with or without applying an electric field and adsorbing the antigen to the antibody carrier by an antigen / antibody reaction.
3) A step of fluorescently labeling the antigen by injecting a fluorescent reagent into the sample fluid.
4) A step of washing the fluorescent reagent by flowing a washing solution.
5) A step of measuring an antigen image using a fluorescence imaging apparatus.
[0039]
In the above step 3), when the sample fluid is a gas, the fluorescent staining reagent is preferably injected in the form of a mist.
[0040]
Also, the claim9An antigen measurement method using the antigen measurement apparatus according to
[0041]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Regarding examples of the present invention, examples of measuring bacteria in a liquid sample will be described below with reference to FIGS. First, an antigen separation apparatus will be described.
[0042]
FIG. 1 claims1 and 2It is a notional schematic diagram of the main body of an antigen separation apparatus according to the invention. FIG. 2 is a schematic configuration diagram of the antigen measuring apparatus, and also shows a perspective sectional view of a specific configuration of the separation apparatus main body. FIG. 2A shows an exploded perspective cross-sectional view of the lower body member and the lid member, and FIG. 2B shows an assembled perspective cross-sectional view.
[0043]
1 and 2, 1 is a sample solution introduction port, 2 is a polystyrene antibody bead, 3 is a reaction part, 4 is a sample solution introduction channel, 5 is a sample solution discharge channel, and 6 is a fluorescent staining reagent. , 7 denotes a flow path for the sample solution including the introduction port, the introduction channel, the reaction part, the discharge channel, and the like. In FIG. 1, 30 is an electric field generating means, and in FIG. 2, 8 is a molding member, 9 is a lid member, 10 is a fluorescent staining reagent, and 20 is an image measuring device.
[0044]
The antigen separation operation will be described with reference to FIG. The sample solution introduced from the
[0045]
By the above concentration, the bacteria 1a are easily captured by the
[0046]
Although the flow path step 4a is illustrated as a step where the
[0047]
Further, as described above, in addition to the flow path level difference 4a, the electric field generating means 30 generates an electric field having the bottom surface side where the antibody beads are disposed as a positive electrode and the opposite surface as a negative electrode. Bacteria 1a as a negatively charged antigen in a state can be sucked and concentrated on the side of the
[0048]
Next, based on FIG. 2, the structure of the antigen separation apparatus main body and the relationship with the fluorescence image measurement will be described. First, the configuration of the separation device main body will be described with reference to FIG. FIG. 3 is a cross-sectional perspective exploded view (a view), a cross-sectional perspective view (b view), and a cross-sectional view (c view) focusing only on the separation device main body.
[0049]
As described above, the main body of the separation device includes the resin integrated molding member 8 including the
[0050]
Next, an antigen measurement procedure will be described with reference to FIG. In FIG. 2, the image measuring device 20 is5The apparatus is the same as that shown in FIG. 1 and is arranged so that the bacteria 1a as the antigen captured by the
[0051]
First, after introducing a sample solution containing bacteria 1a as an antigen into the
[0052]
In addition, in order to prevent the fluorescence output error of contaminants such as dust, as described above, image measurement is also performed before the fluorescent labeling process, and the image of the antigen is based on the difference in image information before and after the fluorescent labeling. It is desirable to perform measurement. Further, in the measurement, it is desirable to autofocus on the antigen, but this specific method will be described later.
[0053]
Next, a specific example of a method for performing image measurement by performing fluorescent labeling will be described. As specific fluorescent reagents, for example, when targeting microorganisms in general, fluorescent nucleobase analogs, fluorescent stains for staining nucleic acids, staining solutions for staining proteins, environments used for structural analysis of proteins, etc. Fluorescent probes, stains used for analysis of cell membranes and membrane potentials, stains used for fluorescent antibody labeling, and stains that develop color by respiration of cells when targeting aerobic bacteria. For eukaryotic microorganisms, stains that stain mitochondria, stains that stain the Golgi apparatus, stains that stain the endoplasmic reticulum, stains that react with intracellular esterases and their modifying compounds, and higher animals In the case of targeting cells, a staining solution used for observation of bone tissue, a staining solution that is a nerve cell tracer, and the like can be applied. By staining with these, a fluorescence image can be observed with a fluorescence microscope.
[0054]
Next, examples for obtaining fluorescence observation images of antigens such as microorganisms and cells fluorescently stained by the method as described above will be described below. That is, a reagent that fluoresces by esterase activity, for example, carboxyfluorescein diacetate (hereinafter abbreviated as CFDA) is reacted with antigens such as separated microorganisms and cells. When acquiring a fluorescent image of an antigen fluorescently stained with CFDA, first, autofocus light that emits CFDA fluorescence wavelength light (for example, 500 to 550 nm) is irradiated onto an antibody bead as a marker.
[0055]
The depth of focus of the microscope is about 10 μm, for example, and the antibody beads and the antigen captured on the beads are about 1 μm, for example. It is also in focus. Therefore, after focusing on the antibody beads, the focused antigen measurement surface is irradiated with light having a wavelength capable of exciting CFDA (for example, 450 to 500 nm) to obtain a fluorescence image of the antigen. From the obtained fluorescence image, antigens such as microorganisms and cells can be recognized and detected.
[0056]
Next, figure4Is described. Figure4Claims5It is a conceptual explanatory drawing of the structure in the case of isolate | separating each antigen in the sample fluid containing many types of antigens separately in connection with this invention. (A) is a schematic diagram in the case where four reaction parts are configured in series, and (b) is a schematic diagram in the case where they are configured in parallel. Figure4In the figure, 1 is a sample fluid inlet, 4 is a sample fluid inlet, 5 is a sample fluid outlet, and 6 is a fluorescent staining reagent inlet. The four reaction parts are indicated by 3a to 3d, respectively.
[0057]
Each of the reaction units 3a to 3d includes beads to which various types of antibodies are immobilized, or beads to which different antibodies are immobilized for each reaction unit. With the above configuration, each antigen in the sample fluid containing many types of antigens can be separated separately in both cases of the serial configuration and the parallel configuration. However, considering the uniformity of the distribution of the sample fluid to each reaction part, the series configuration is preferable in terms of measurement accuracy, and the structure is simple.
[0058]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a plurality of antibody carriers are provided on the inlet of a sample fluid containing antigens such as bacteria and in vivo proteins and on the bottom surface of a microchannel having a rectangular cross section through which the sample fluid flows. A reaction portion that separates the antigen by antigen-antibody reaction, a microfluid-shaped sample fluid introduction path that communicates the inlet of the sample fluid and the reaction portion, and a sample fluid from the reaction portion. In the antigen separation apparatus comprising the discharge passage, the introduction passage generates a fluid flow vector in a direction perpendicular to the bottom surface, and the dispersion concentration of the antigen in the sample fluid is locally determined in the vicinity of the bottom surface. The reaction part and the flow path step are substantially provided so as to be higher (having an antigen concentration function).RumoBecause it was
It is possible to provide an antigen separation apparatus that eliminates the problem of dust clogging during antigen separation, can be easily separated in a short time, and can secure a fluid throughput as required.
[0059]
In addition, by performing image measurement based on the fluorescence image information of the antigen separated by the separation device, the antigen measurement time, which has conventionally taken 2-3 hours, is reduced to 25-30 minutes. High-precision measurement is possible.
[0060]
Furthermore, as described above, the separation device is made into one chip with a molded resin, and a plurality of reaction parts are provided to make a multi-chip, so that measurement with high diversity and low cost can be realized.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual schematic diagram of an embodiment of an antigen separating apparatus main body of the present invention.
FIG. 2 is a schematic configuration diagram of an embodiment of an antigen measurement apparatus of the present invention.
FIG. 3 is a cross-sectional perspective exploded view, a cross-sectional perspective view, and a cross-sectional view of the antigen separation device body of the present invention.
FIG. 4 relates to the present invention,Conceptual explanatory diagram of the configuration when each antigen in a sample fluid containing multiple types of antigens is individually separated
[Figure 5]The figure which shows an example of a structure of the fluorescence image measuring device which performs autofocus described in Japanese Patent Application No. 2002-30648
[Fig. 6]The figure which shows the measurement method of the number of bacteria with the difference image
[Fig. 7]Perspective view of immunoassay device described in
[Explanation of symbols]
1: introduction port, 1a: bacteria, 1b: dust, 2: antibody beads, 3, 3a to 3d: reaction part, 4: introduction path, 4a: step part, 5: discharge path, 6: injection port for fluorescent staining reagent , 7: flow path, 8: molded member, 9: lid member, 10: fluorescent staining reagent20: Image measuring device, 30: Electric field generating means.
Claims (11)
1)前記抗原の分離装置の前記反応部へ、抗原を含む試料流体を、所定流量速度で通流する工程。
2)前記反応部において、電場を印加もしくは印加せずに抗原濃縮し、抗原・抗体反応により抗原を抗体担持体に吸着する工程。
3)前記試料流体に蛍光試薬を注入して抗原を蛍光標識する工程。
4)洗浄液を通流して、前記蛍光試薬を洗浄する工程。
5)蛍光画像装置により抗原の画像計測を行なう工程。An antigen measurement method using the antigen measurement apparatus according to any one of claims 6 to 8 , comprising the following steps.
1) A step of passing a sample fluid containing an antigen at a predetermined flow rate through the reaction part of the antigen separation device.
2) A step of concentrating the antigen in the reaction part with or without applying an electric field and adsorbing the antigen to the antibody carrier by an antigen / antibody reaction.
3) A step of fluorescently labeling the antigen by injecting a fluorescent reagent into the sample fluid.
4) A step of washing the fluorescent reagent by flowing a washing solution.
5) A step of measuring an antigen image using a fluorescence imaging apparatus.
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