JPWO2003083111A1 - Nucleic acid library and protein library - Google Patents
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Abstract
複数種類のタンパク質を、それをコードする核酸と対応付けて一度に供給し、供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質の解析を並列して行なうことができる核酸ライブラリー及びタンパク質ライブラリーを提供することを目的とし、互いに離反した状態で存在する２種類以上のライブラリーユニットを有し、各ライブラリーユニットが、ｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸と該核酸に近接して設けられたタンパク質捕獲体とを含んで構成されており、各ライブラリーユニットが、固体支持体の表面に設けられ、各ライブラリーユニットに含まれる核酸が、各ライブラリーユニットが設けられた固体支持体の表面に固定されている核酸ライブラリーを提供するとともに、当該核酸ライブラリーが有する２種類以上のライブラリーユニットをｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系に一度に供することにより得られるタンパク質ライブラリーを提供する。To provide a nucleic acid library and a protein library that can supply a plurality of types of proteins at once in association with the nucleic acids that encode them, and that can immediately analyze the plurality of types of proteins in parallel immediately after the supply. A nucleic acid capable of expressing one or more types of proteins in an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system, and having two or more types of library units that exist in a state of being separated from each other. Each of the library units is provided on the surface of the solid support, and each library unit contains the nucleic acid contained in each library unit. Providing a nucleic acid library immobilized on the surface of the solid support provided, Providing a protein library obtained by subjecting two or more libraries units having the nucleic acid library once invitro transcription-translation system or invitro translation system.
Description
技術分野
本発明は、固体支持体上に固定された複数の核酸を含む核酸ライブラリー（核酸の集合物）、及び固体支持体上にディスプレイされた複数のタンパク質を含むタンパク質ライブラリー（タンパク質の集合物）に関する。
背景技術
プロテオミックスにおいては、複数種類のタンパク質に関して、その構造、機能等に関する多種多様な解析を並列して行なうこと（すなわちハイスループット解析）が必要となる。複数種類のタンパク質の解析を並列して行なう上で、固体支持体表面に複数種類のタンパク質が固定されたプロテインアレイ（プロテインチップ）の有用性が注目されている。プロテインアレイは、複数種類のタンパク質が固体支持体表面の所定領域に固定されており、各種類のタンパク質を固体支持体上の位置によって識別できるようになっている。プロテインアレイは、例えば、複数種類のタンパク質の中から、標的物質（例えばタンパク質、ＤＮＡ等）と結合できるタンパク質をスクリーニングするのに有用である。
発明の開示
しかしながら、従来のプロテインアレイでは、固体支持体表面へのタンパク質の非効率的なスポッティングが必要となることはもとより、固体支持体表面に固定されたタンパク質が乾燥すると簡単に変性や失活を起こしてしまう。固体支持体表面に固定されたタンパク質が一旦変性や失活を起こすと、そのタンパク質を再生させるのは困難であるため、従来のプロテインアレイは、長期間にわたる保存や使用が困難であった。
また、従来のプロテインアレイを用いたアッセイ系では、供給されたタンパク質を固体支持体表面に固定して初めて解析を行なうことができるので、タンパク質の供給後直ちに解析を開始することはできず、タンパク質の供給から解析開始に至るまでに多大な時間と労力を必要としていた。すなわち、タンパク質の供給とタンパク質のアッセイ系とが別個独立した技術となっていたため、タンパク質の解析を効率的に進めることが困難であった。
その一方、ファージプロモーターを利用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系等の開発が進み、効率よく短時間に目的のタンパク質を供給することが可能となっている。また、ファージ・ディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，１３１５−１３１７）、リボゾーム・ディスプレイ法（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，４９３７−４９４２）等が開発され、目的のタンパク質を、それをコードする核酸と対応付けた状態で供給することが可能となっている。解析対象となる標的タンパク質（表現型）を、それをコードする核酸（遺伝子型）と対応付けた状態で供給できれば、標的タンパク質のアミノ酸配列を容易に同定できるので標的タンパク質の解析において有利である。
さらに、少なくとも転写翻訳開始領域、標的タンパク質をコードする領域及びアダプタータンパク質（本発明では「タグタンパク質」とも呼ぶ）をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡを利用して、標的タンパク質を、それをコードする核酸と対応付けて供給する技術も開発されている（特開２００１−１２８６９０号公報）。この技術においては、上記ＤＮＡを無細胞転写翻訳系で発現させ、標的タンパク質をアダプタータンパク質との融合タンパク質として合成し、上記ＤＮＡに結合したリガンドとアダプタータンパク質との特異的な結合を介して上記融合タンパク質を上記ＤＮＡに結合させることにより、標的タンパク質を、それをコードするＤＮＡと対応付けて供給することが可能となっている。また、この技術によって作製されるタンパク質−ＤＮＡ連結分子のライブラリーを用いれば、複数種類のタンパク質の解析を並列して行なうことができる。しかしながら、この技術においては、異なる種類のＤＮＡにより発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを防止するために、ＤＮＡを１種類又は１分子ずつ隔離した状態で発現させる必要がある。
そこで、本発明は、複数種類のタンパク質を、それをコードする核酸と対応付けて一度に供給できるとともに、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質の解析を並列して行なうことができ、しかも変性や失活を起こしたタンパク質を容易に再生できる核酸ライブラリー、タンパク質ライブラリー及びタンパク質ライブラリーの作製方法を提供することを目的とする。また、本発明は、核酸ライブラリー及びタンパク質ライブラリーを構成するライブラリーユニットとして有用な粒子を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、下記の核酸ライブラリー、タンパク質ライブラリー、タンパク質ライブラリーの作製方法、タンパク質ライブラリー作製用キット及び粒子を提供する。
（１）本発明の核酸ライブラリーは、互いに離反した状態で存在する２種類以上のライブラリーユニットを有する核酸ライブラリーであって、各ライブラリーユニットが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸と、前記核酸に近接して設けられた第一のタンパク質捕獲体とを含んで構成されており、各ライブラリーユニットが、固体支持体の表面に設けられ、各ライブラリーユニットに含まれる核酸が、各ライブラリーユニットが設けられた固体支持体の表面に固定されていることを特徴とする。
本発明の核酸ライブラリーにおいては、異なる種類のライブラリーユニットが互いに離反した状態で存在するとともに、各ライブラリーユニットにおいてタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）が核酸に近接して設けられているので、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離は、同一のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離よりも圧倒的に大きくなっている。したがって、各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質は、異なる種類のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）よりも、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に優先的に捕獲されるので、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。よって、本発明の核酸ライブラリーが有する２種類以上のライブラリーユニットをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に供すると、各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されたタンパク質は、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に捕獲された状態で固体支持体上にディスプレイ（提示）される。すなわち、本発明の核酸ライブラリーによれば、複数種類のタンパク質を、それをコードする核酸と対応付けた状態で、かつ固体支持体上にディスプレイされた状態で一度に供給でき、これにより複数種類のタンパク質の解析を並列して効率よく行なうことができる。
また、本発明の核酸ライブラリーは、各ライブラリーユニットをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に供することにより直ちにタンパク質ライブラリーに変換される。すなわち、本発明の核酸ライブラリーにおいては、タンパク質の供給とタンパク質のアッセイ系とが一体となっているので、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質の解析を行なうことができる。
さらに、本発明の核酸ライブラリーにおいては、固体支持体上にディスプレイされたタンパク質が変性や失活を起こしたとしても、そのタンパク質に対応する核酸を再度発現させることにより、タンパク質を容易に再生できる。
さらに、本発明の核酸ライブラリーの各ライブラリーユニットに含まれる核酸はタンパク質と比較して長期保存が可能である。したがって、核酸ライブラリーの状態で保存しておき、必要なときにタンパク質ライブラリーを再生させることにより、本発明の核酸ライブラリーから作製されるタンパク質ライブラリーを長期間にわたり繰り返し使用できる。
（２）前記（１）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、全てのライブラリーユニットが、単一の固体支持体の表面に設けられている。
本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、単一の固体支持体を取り扱うことにより全てのライブラリーユニットを一度に取り扱うことができるので、核酸ライブラリーの取扱が容易である。
（３）前記（２）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記固体支持体上における各ライブラリーユニットの位置と、各ライブラリーユニットの種類とが対応付けられている。
本態様に係る核酸ライブラリーおいては、各ライブラリーユニットの種類、各ライブラリーユニットに含まれる核酸の種類及び各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質の種類を、各ライブラリーユニットの固体支持体上の位置に基づき識別できる。
（４）前記（２）又は（３）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記固体支持体が、軸部材に巻装可能な形状を有する。
平面上において複数種類のＤＮＡを高密度に配列させる場合、異なる種類のＤＮＡのクロスコンタミネーションが生じやすくなる、多大な手間と時間を要するため、ＤＮＡアレイの製造に多大なコストがかかる等の問題点がある。そこで、所定の化学構造をもつ各種検出用物質が、長手方向に沿って並ぶように固定され、各化学構造とその固定位置とが対応付けられた糸状、紐状又はテープ状等の細長形状の基礎部材と、前記基礎部材が巻装される支持体とを有する集積支持体が開発されており、この集積技術を利用すれば、糸状、紐状又はテープ状等の細長形状の固体担体を展開した状態においてＤＮＡを固定化した後（第１次集積化）、それを軸部材に巻装することにより（第２次集積化）、クロスコンタミネーションを防止しつつ、容易かつ低コストで、ＤＮＡが高密度に配列したＤＮＡアレイを作製することが可能となる（ＷＯ ０１／６９２４９Ａ１，ＷＯ ０１／５３８３１Ａ１，ＷＯ ０２／６３３００Ａ１）。
本態様に係る核酸ライブラリーはこの集積技術を利用したものである。すなわち、本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、軸部材に巻装可能な形状（例えば、紐状、テープ状、糸状等の細長形状）を有する固体支持体を展開した状態で、当該固体支持体に各ライブラリーユニットを設けた後（第１次集積化）、それを軸部材に巻装することにより（第２次集積化）、各ライブラリーユニットを高密度に配列させることができる。そして、各ライブラリーユニットが高密度に配列した核酸ライブラリーをタンパク質ライブラリーに変換することにより、タンパク質が高密度に配列したプロテインアレイを作製することができる。したがって、固体支持体が軸部材に巻装された核酸ライブラリーを利用することにより、タンパク質ライブラリーの作製からタンパク質ライブラリーを利用したタンパク質の解析に至る一連の操作の自動化を容易に実現できる。
また、軸部材に巻装可能な形状を有する固体支持体を展開した状態で、核酸ライブラリーをタンパク質ライブラリーに変換した後、当該固体支持体を軸部材に巻装することにより、タンパク質が高密度に配列したプロテインアレイを作製することができる。
（５）前記（１）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、異なる種類のライブラリーユニットが、それぞれ別個の固体支持体の表面に設けられている。
本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸が、それぞれ別個の固体支持体の表面に固定されている。固体支持体は核酸やタンパク質捕獲体と比較してマクロな存在であるから、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離は、同一のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離よりも圧倒的に大きくなっているとともに、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との遭遇確率は極めて低い状態に保たれている。したがって、各固体支持体の表面に設けられたライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質は、同一の固体支持体の表面に設けられたライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に優先的に捕獲され、別個の固体支持体の表面に設けられたライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。
また、本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、ライブラリーユニットの組み合わせの自由度が増加するので、異なる種類のタンパク質を自由に組み合わせて解析を行なうことができる。
（６）前記（５）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、異なる種類のライブラリーユニットが設けられた固体支持体が、相互に区別して識別可能である。
本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、各ライブラリーユニットが設けられた固体支持体を識別することにより、各ライブラリーユニットの種類、各ライブラリーユニットに含まれる核酸の種類及び各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質の種類を識別できる。
（７）前記（５）又は（６）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記固体支持体が粒子である。
本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、各ライブラリーユニットが設けられた粒子を液体中に分散させることができる（下記（９）参照）。
（８）前記（７）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記粒子が磁性を有する。
本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、各ライブラリーユニットが設けられた固体支持体の操作性が向上し、本発明の核酸ライブラリーを利用したタンパク質ライブラリーの作製の自動化及び本発明のタンパク質ライブラリーを利用したタンパク質の解析の自動化を容易に実現できる。
（９）前記（７）又は（８）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記粒子が液体中に分散している。
本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、各ライブラリーユニットが設けられた粒子を液体中に分散させることにより、各ライブラリーユニットにおける反応性が向上し、本態様に係る核酸ライブラリーをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に供したときに、各ライブラリーユニットにおける転写反応及び翻訳反応を迅速に進行させることができる。粒子が磁性を有する場合には、磁石を用いて液体中に分散している粒子を捕集し、粒子を液体から容易に分離できるので、液体中に分散させる粒子は磁性を有することが好ましい。
なお、各ライブラリーユニットが設けられた固体支持体が液体中に分散した状態にあるものも、本発明の核酸ライブラリーに含まれる。また、各ライブラリーユニットが設けられた粒子が液体中に分散した状態にあっても、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離は、同一のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離よりも圧倒的に大きくなっているとともに、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との遭遇確率は極めて低い状態に保たれている。したがって、各粒子の表面に設けられたライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質は、同一の粒子の表面に設けられたライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に優先的に捕獲され、別個の粒子の表面に設けられたライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。
（１０）前記（９）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記液体中に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系においてタンパク質を発現し得る核酸が固定されていない粒子が混在している。
本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、各ライブラリーユニットが設けられた粒子間に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系においてタンパク質を発現し得る核酸が固定されていない粒子が介在することにより、各ライブラリーユニットが設けられた粒子間の距離が広がる。これによって、各粒子の表面に設けられたライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）は、同一の粒子の表面に設けられたライブラリーユニットから発現されたタンパク質を、他の粒子の表面に設けられたライブラリーユニットから発現されたタンパク質よりも優先して捕獲できるので、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。また、本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、各ライブラリーユニットが設けられた粒子の濃度が低濃度となったとき（例えば、粒子間の距離を広げるために粒子の濃度を低濃度としたとき）に生じる粒子の操作性低下という問題を解消できる。なお、混在させる粒子には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系においてタンパク質を発現し得る核酸が固定されていないので、当該粒子からタンパク質が発現することはなく、当該粒子が各ライブラリーユニットに対してタンパク質のクロスコンタミネーションを生じさせることはない。
（１１）前記（９）又は（１０）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記液体中に、第二のタンパク質捕獲体又はＲＮＡポリメラーゼ結合体が混在している。
本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、各粒子の表面に設けられたライブラリーユニットから発現したタンパク質が、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に捕獲されず液体中に分散したとしても、液体中に存在するタンパク質捕獲体（第二のタンパク質捕獲体）が当該タンパク質を捕獲することによって、当該タンパク質が他の粒子の表面に設けられたライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体に捕獲されることを防止できる。
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に含まれるＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼ結合体に結合することにより、核酸としてＤＮＡを含むライブラリーユニットにおける転写反応が阻害されるので、当該ライブラリーユニットから過剰なｍＲＮＡが発現し、液体中に分散されることを効果的に防止できる。
したがって、本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。
（１２）前記（１）〜（１１）のいずれかに記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記固体支持体が多孔質である。
本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、ライブラリーユニットを固体支持体の細孔の内部表面に設けることができる。固体支持体の細孔内は液体（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液）の流動性が低いので、固体支持体の細孔の内部表面に設けられたライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質は細孔内から放出され難い。したがって、当該核酸から発現されるタンパク質を、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に確実に捕獲でき、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。
（１３）前記（１２）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記固体支持体が繊維又はその集合体である。
本態様に係る核酸ライブラリーにおいては、固体支持体が繊維又はその集合体であるので、固体支持体が多孔質となる。固体支持体が繊維の集合体（例えば繊維を撚ったもの）である場合には、固体支持体に多くの細孔が存在する。
（１４）前記（１）〜（１３）のいずれかに記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、いずれか１個以上のライブラリーユニットにおいて、前記核酸の一端が前記固体支持体に固定されており、前記核酸の他端に前記第一のタンパク質捕獲体が設けられている。
本態様に係る核酸ライブラリーでは、核酸の末端にタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）が設けられることによって、タンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）が核酸に近接して設けられている。
（１５）前記（１）〜（１４）のいずれかに記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、いずれか１個以上のライブラリーユニットにおいて、前記第一のタンパク質捕獲体が、前記核酸を包囲するように設けられている。
本態様に係る核酸ライブラリーでは、タンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）が核酸を包囲するように設けられることによって、当該核酸から発現されるタンパク質が、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に確実に捕獲されるので、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。第一のタンパク質捕獲体が核酸を包囲するように設けられるライブラリーユニットの個数が増加するほど、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できるので、第一のタンパク質捕獲体が核酸を包囲するように設けられるライブラリーユニットの個数はできるだけ多いことが好ましく、全てのライブラリーユニットにおいて第一のタンパク質捕獲体が核酸を包囲するように設けられることが最も好ましい。
（１６）前記（１）〜（１５）のいずれかに記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、いずれか１個以上のライブラリーユニットにおいて、前記核酸が発現し得るタンパク質が、標的タンパク質と前記第一のタンパク質捕獲体に結合し得るタグタンパク質との融合タンパク質である。
本態様に係る核酸ライブラリーでは、核酸から発現されたタンパク質と当該核酸と同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）との結合が確実なものとなる。なお、「標的タンパク質」とは解析対象となるタンパク質を意味する。
複数のライブラリーユニットから融合タンパク質が発現される場合、それらの融合タンパク質は、向きが同一となるように第一のタンパク質捕獲体と結合することが好ましい。いずれの融合タンパク質の向きも同一となることにより当該融合タンパク質の反応性を均一化及び最適化できる。
（１７）前記（１６）記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記タグタンパク質が前記第二のタンパク質捕獲体に結合し得る。
本態様に係る核酸ライブラリーでは、核酸から発現されたタンパク質が当該核酸と同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に捕獲されず液体中に分散したとしても、液体中に存在するタンパク質捕獲体（第二のタンパク質捕獲体）によって当該タンパク質を確実に捕獲できる。
（１８）前記（１）〜（１７）のいずれかに記載の核酸ライブラリーの好ましい態様では、前記核酸としてＤＮＡを含むライブラリーユニットにおいて、ｍＲＮＡ捕獲体が前記ＤＮＡに近接して設けられている。
本態様に係る核酸ライブラリーでは、核酸としてＤＮＡを含むライブラリーユニットにおいて、当該ＤＮＡの転写により生じるｍＲＮＡが、同一のライブラリーユニットに含まれるｍＲＮＡ捕獲体に捕獲される。したがって、本態様に係る核酸ライブラリーをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に供したときに、核酸としてＤＮＡを含むライブラリーユニットから生じたｍＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の溶液中に分散することを防止できる。これにより、当該ｍＲＮＡの翻訳により生じるタンパク質が他のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体に捕獲されることが防止され、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。
（１９）本発明のタンパク質ライブラリーは、前記（１）〜（１８）のいずれかに記載の核酸ライブラリーが有する２種類以上のライブラリーユニットをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に一度に供して、前記ライブラリーユニットに含まれる核酸を一度に発現させることにより得られることを特徴とする。
本発明の核酸ライブラリーが有する２種類以上のライブラリーユニットをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に一度に供しても、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションが防止されるから、複数種類のタンパク質は、それをコードする核酸と対応付けた状態で固体支持体上に一度にディスプレイされる。したがって、本発明のタンパク質ライブラリーによれば、複数種類のタンパク質の解析を並列して効率的に行なうことができる。
また、本発明のタンパク質ライブラリーは、本発明の核酸ライブラリーの各ライブラリーユニットに含まれる核酸を発現させることによって直ちに作製されるので、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質の解析を行なうことができる。
さらに、本発明のタンパク質ライブラリーにおいては、固体支持体上にディスプレイされたタンパク質が変性や失活を起こしたとしても、そのタンパク質に対応する核酸を再度発現させることにより、そのタンパク質を容易に再生できる。
さらに、核酸ライブラリーの状態で保存しておき、必要なときにタンパク質ライブラリーを再生させることにより、本発明のタンパク質ライブラリーを長期間にわたり繰り返し使用できる。
（２０）本発明のタンパク質ライブラリーの作製方法は、前記（１）〜（１８）のいずれかに記載の核酸ライブラリーが有する２種類以上のライブラリーユニットをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に一度に供して、前記ライブラリーユニットに含まれる核酸を一度に発現させることを特徴とする。
本発明のタンパク質ライブラリーの作製方法では、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを防止した状態で、本発明のタンパク質ライブラリーを作製できる。
（２１）前記（２０）記載のタンパク質ライブラリーの作製方法の好ましい態様では、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に、第二のタンパク質捕獲体を混在させておく。
本態様に係るタンパク質ライブラリーの作製方法においては、各ライブラリーユニットから発現したタンパク質が、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に捕獲されずｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液中に分散したとしても、当該溶液中に存在するタンパク質捕獲体（第二のタンパク質捕獲体）が当該タンパク質を捕獲することによって、当該タンパク質が他のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に捕獲されることを防止できる。したがって、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止した状態で、本発明のタンパク質ライブラリーを作製できる。
（２２）前記（２０）又は（２１）記載のタンパク質ライブラリーの作製方法の好ましい態様では、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系における転写反応を阻害しながら、前記核酸を一度に発現させる。
本態様に係るタンパク質ライブラリーの作製方法においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系における転写反応が阻害されるので、核酸としてＤＮＡを含むライブラリーユニットから過剰なｍＲＮＡが発現され、当該ｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の溶液中に分散することを防止できる。したがって、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止した状態で、本発明のタンパク質ライブラリーを作製できる。
（２３）前記（２２）記載のタンパク質ライブラリーの作製方法の好ましい態様では、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系にＲＮＡポリメラーゼ結合体を混在させて、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系における転写反応を阻害する。
本態様に係るタンパク質ライブラリーの作製方法においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に含まれるＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼ結合体に結合することにより、核酸としてＤＮＡを含むライブラリーユニットにおける転写反応が阻害されるので、当該ライブラリーユニットからの過剰なｍＲＮＡの発現を効果的に防止できる。
（２４）前記（２２）又は（２３）記載のタンパク質ライブラリーの作製方法の好ましい態様では、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の温度を調節して、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系における転写反応を阻害する。
本態様に係るタンパク質ライブラリーの作製方法においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の温度を調節して、当該ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に含まれるＲＮＡポリメラーゼの反応性を低下させることにより、核酸としてＤＮＡを含むライブラリーユニットにおける転写反応が阻害されるので、当該ライブラリーユニットからの過剰なｍＲＮＡの発現を効果的に防止できる。
なお、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の温度を調節することにより、転写反応だけでなく翻訳反応も阻害される可能性があるが、その場合には、翻訳反応に関与する因子を予め多めにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に含有させておくことにより、翻訳反応の阻害を防止できる。
（２５）本発明のタンパク質ライブラリー作製用キットは、前記（１）〜（１８）のいずれかに記載の核酸ライブラリーと、第二のタンパク質捕獲体又はＲＮＡポリメラーゼ結合体とを含むことを特徴とする。
本発明のタンパク質ライブラリーの作製用キットによれば、第二のタンパク質捕獲体又はＲＮＡポリメラーゼ結合体の上述の作用効果により、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止した状態で、本発明のタンパク質ライブラリーを作製できる。本発明のタンパク質ライブラリー作製用キットは、核酸ライブラリー、第二のタンパク質捕獲体、ＲＮＡポリメラーゼ結合体以外に、タンパク質ライブラリーの作製に必要な任意の要素を含むことができる。
（２６）本発明の粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸が表面に高密度で固定された粒子であって、前記核酸の一端が前記粒子の表面に固定されており、前記核酸の他端にタンパク質捕獲体が設けられていることを特徴とする。
本発明の粒子の外側には、タンパク質捕獲体のバリア（障壁）が粒子上の核酸に近接して形成され、粒子上の核酸はタンパク質捕獲体で包囲された状態にあるので、複数の粒子を一度にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に供しても、各粒子で発現されるタンパク質は同一の粒子上のタンパク質捕獲体に捕獲され、各粒子で発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。したがって、本発明の粒子は、本発明の核酸ライブラリー及びタンパク質ライブラリーを構成するライブラリーユニットとして有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の核酸ライブラリーは、２種類以上のライブラリーユニットを有する。ここで、ライブラリーユニットの種類の異同は、ライブラリーユニットから発現されるタンパク質の種類の異同によって決定される。すなわち、１種類以上の異なるタンパク質を発現する関係にあるライブラリーユニット同士は異なる種類のライブラリーユニットであり、それ以外の関係にあるライブラリーユニット同士は同一種類のライブラリーユニットである。したがって、「２種類以上のライブラリーユニットを有する」とは、それぞれ少なくとも１種類の異なるタンパク質を発現し得る複数個のライブラリーユニットを有することを意味する。本発明の核酸ライブラリーは、２種類以上のライブラリーユニットを有する限り、同一種類のライブラリーユニットを複数個有していてもよい。なお、同一種類のライブラリーユニットには、同一種類のタンパク質のみを発現する関係にあるライブラリーユニット同士はもちろん、一方は異なる種類のタンパク質を発現するが、他方は異なる種類のタンパク質を発現しない関係にあるライブラリーユニット同士（例えば、一方のライブラリーユニットはタンパク質Ａとタンパク質Ｂという２種類のタンパク質を発現し、他方のライブラリーユニットはタンパク質Ａという１種類のタンパク質を発現する場合）も含まれる。
本発明の核酸ライブラリーにおいて、異なる種類のライブラリーユニットは互いに離反した状態で存在する。ここで、異なる種類のライブラリーユニット間の距離は、各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質が、異なる種類のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体よりも同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体に優先的に捕獲され得る限り特に限定されるものではなく、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離が、同一のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離よりも圧倒的に大きくなるように設定される。
本発明の核酸ライブラリーが同一種類のライブラリーユニットを複数個有する場合、同一種類のライブラリーユニットは互いに離反した状態で存在していてもよいし、互いに近接した状態で存在していてもよい。同一種類のライブラリーユニットが近接した状態で存在している場合、各ライブラリーユニットで発現されたタンパク質が異なるライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体に捕獲される場合があるが、同一種類のライブラリーユニットであればクロスコンタミネーションの問題は生じない。
本発明の核酸ライブラリーにおいて、各ライブラリーユニットは、固体支持体の表面に設けられている。本発明の核酸ライブラリーは、水性媒体中で使用される場合（例えば、本発明の核酸ライブラリーを細胞抽出液から調製された無細胞転写・翻訳系に供する場合）があるので、各ライブラリーユニットが設けられる固体支持体は、水に対して不溶性であることが好ましい。このような固体支持体の材質としては、ガラス、シリコン、セラミックス、水不溶性ポリマー（例えば、ポリスチレン等のポリスチレン系樹脂、ポリメチルメタクリレート等のアクリル樹脂（メタクリル樹脂）、ポリアミド樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリカーボネート等の合成樹脂；アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類；ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質等）等が挙げられる。固体支持体の表面は、平面であっても曲面であってもよく、または凹凸を有していてもよい。
固体支持体は多孔質であっても無孔質であってもよいが、多孔質であることが好ましい。多孔質の固体支持体としては、例えば、繊維又はその集合体（例えば繊維を撚ったもの）が挙げられる。固体支持体が多孔質である場合、ライブラリーユニットを細孔の内部表面に設けることができる。固体支持体の細孔内は液体（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液）の流動性が低いので、固体支持体の細孔の内部表面に設けられたライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質は細孔内から放出され難い。したがって、当該タンパク質を同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に確実に捕獲でき、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。
固体支持体の形状は特に限定されるものではなく、例えば、平板状、粒子（ビーズ）状、棒状、紐状、テープ状、糸状等の任意の形状をとることができるが、固体支持体は、軸部材に巻装可能な形状を有するか、又は粒子（ビーズ）状であることが好ましい。軸部材に巻装可能な形状としては、紐状、テープ状、糸状等の細長形状が挙げられる。軸部材は、巻く物の中心となり得る限り、その形状や構造は特に限定されるものではなく、例えば、棒状、円柱状、円筒状、角柱状、角筒状等の部材が挙げられる。軸部材に巻装可能な形状を有する固体支持体を用いることにより、各ライブラリーユニットが高密度に配列した核酸ライブラリー及びタンパク質が高密度に配列したプロテインアレイを作製することができる。また、固体支持体が軸部材に巻装された核酸ライブラリーを利用することにより、タンパク質ライブラリーの作製からタンパク質ライブラリーを利用したタンパク質の解析に至る一連の操作の自動化を容易に実現できる。
固体支持体が軸部材に巻装可能な形状を有する核酸ライブラリーの一実施形態として、紐状の固体支持体３２が円柱状の軸部材３１に巻装された核酸ライブラリー３を図７に示す。紐状の固体支持体３２の表面には複数の異なるライブラリーユニットが設けられている。
固体支持体は磁性を有していてもよく、特に固体支持体が粒子状であるときには磁性を有することが好ましい。固体支持体として磁性粒子を用いると操作性が向上し、本発明の核酸ライブラリーを利用したタンパク質ライブラリーの作製の自動化及びタンパク質ライブラリーを利用したタンパク質の解析の自動化を容易に実現できる。なお、「粒子」の形状は特に限定されるものではないが、例えば、球形である。また、粒子の大きさも特に限定されるものではないが、粒径が０．２〜３０μｍであることが好ましい。
本発明の核酸ライブラリーにおいて、各ライブラリーユニットが設けられる固体支持体の「表面」とは、液体（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液）と接触し得る面を意味し、固体支持体の外面（外部表面）はもちろんのこと、液体が浸潤し得る固体支持体の内面（内部表面）（例えば、固体支持体が有する細孔の内部表面）も含まれる。
本発明の核酸ライブラリーは、複数個のライブラリーユニットの集合体である。ライブラリーユニットの集合形態は特に限定されるものではなく、全てのライブラリーユニットが単一の固体支持体（例えば、軸部材に巻装可能な形状を有する固体支持体）の表面に一緒に設けられた状態で集合していてもよいし、各ライブラリーユニットが複数個の固体支持体の表面に別れて設けられた状態で集合していてもよい。また、各ライブラリーユニットは、複数個の固体支持体（例えば粒子）の表面に別れて設けられ、液体中に分散した状態（例えば、容器に収容された一定容積の液体中に分散した状態）で集合していてもよい。
各ライブラリーユニットが複数個の固体支持体の表面に別れて設けられる場合、各固体支持体に設けられるライブラリーユニットの個数は１個であっても複数個であってもよく、各固体支持体に設けられるライブラリーユニットの種類は同一であっても異なっていてもよい。
異なる種類のライブラリーユニットが同一の固体支持体の表面に設けられる場合、異なる種類のライブラリーユニット同士は互いに離反するように設けられる。また、異なる種類のライブラリーユニットがそれぞれ別個の固体支持体に設けられる場合、固体支持体は核酸やタンパク質捕獲体と比較してマクロな存在であるので、異なる種類のライブラリーユニット同士は互いに離反して存在することとなる。
本発明の核酸ライブラリーにおいては、全てのライブラリーユニットが単一の固体支持体の表面に設けられるか、あるいは、異なる種類のライブラリーユニットがそれぞれ別個の固体支持体の表面に設けられることが好ましい。
異なる種類のライブラリーユニットがそれぞれ別個の固体支持体の表面に設けられる場合であって、同一種類のライブラリーユニットが複数個ある場合、同一種類のライブラリーユニット同士は一緒の固体支持体の表面に設けられていてもよいし、別個の固体支持体の表面に設けられていてもよい。
本発明の核酸ライブラリーにおいて、各ライブラリーユニットは、その種類が識別できる状態で集合していることが好ましい。各ライブラリーユニットの種類の識別により、各ライブラリーユニットに含まれる核酸の種類及び各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質の種類の識別も可能となるので、タンパク質解析を効率的に行なうことができる。
全てのライブラリーユニットが単一の固体支持体の表面に設けられる場合には、例えば、固体支持体上における各ライブラリーユニットの位置と、各ライブラリーユニットの種類とを対応付けておくことにより、各ライブラリーユニットの種類を各ライブラリーユニットの固体支持体上の位置に基づき識別できる。
また、異なる種類のライブラリーユニットがそれぞれ別個の固体支持体の表面に設けられる場合には、例えば、相互に区別して識別可能な固体支持体を用いることにより、各ライブラリーユニットの種類を各ライブラリーユニットが設けられた固体支持体の種類に基づき識別できる。
さらに、異なる種類のライブラリーユニットの構成要素を異なる標識物質で標識しておくことにより、ライブラリーユニットの種類をライブラリーユニット自体の標識に基づき識別することも可能である。標識物質で標識できるライブラリーユニットの構成要素としては、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸、第一のタンパク質捕獲体、ｍＲＮＡ捕獲体、第一のタンパク質捕獲体を固体支持体に固定するための要素（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系においてタンパク質を発現し得ない核酸）等が挙げられる。
固体支持体の識別は、例えば、異なる種類のライブラリーユニットが設けられる固体支持体を異なる標識物質で標識しておくことによって可能となる。標識物質の具体例としては、蛍光色素（例えば、Ｍａｒｉｎｅ Ｂｌｕｅ，Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ，Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ，Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＣｙＣｈｒｏｍｅ，ＰｅｒＣＰ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＰｈａｒＲｅｄ等の他、Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ７等のＣｙ系色素、Ａｌｅｘａ−４８８，Ａｌｅｘａ−５３２，Ａｌｅｘａ−５４６，Ａｌｅｘａ−６３３，Ａｌｅｘａ−６８０等のＡｌｅｘａ系色素、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ等のＢＯＤＩＰＹ系色素）等の蛍光性物質、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）等の放射性物質等が挙げられる。標識物質として蛍光色素を用いる場合、蛍光色素の種類と含有量とを組み合わせることにより多種多様な標識が可能となる。蛍光色素による固体支持体の標識化は、例えば、予め表面にアミノ基を導入しておいた固体支持体に活性エステルを有する蛍光色素を反応させることにより、あるいは、予め表面にカルボキシル基又はアミノ基を導入しておいた固体支持体に、カルボキシル基との結合反応が可能な官能基（例えばアミノ基）を有する蛍光色素又はアミノ基との結合反応が可能な官能基（例えばカルボキシル基）を有する蛍光色素を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミド類の存在下で反応させることにより行なうことができる。また、固体支持体が粒子である場合には、例えば、重合反応によって粒子を合成する際に反応液中に蛍光色素を添加しておくことにより、あるいは、ラジカル重合の重合反応の終了直後でラジカルが残存している間に当該ラジカルと反応性を有する蛍光色素を添加することにより、蛍光色素による粒子の標識化を行なうことができる。
また、固体支持体の識別は、異なる種類のライブラリーユニットが設けられる固体支持体の形状や大きさを相違させることによっても可能となる。例えば、固体支持体が粒子（ビーズ）状である場合には、その粒径を相違させることにより固体支持体の識別が可能となる。粒径の異なる粒子の識別は、例えばフローサイトメトリー等を用いて行なうことができる。
また、固体支持体の識別は、異なる種類のライブラリーユニットが設けられる固体支持体の物性を相違させることによっても可能となる。例えば、磁石を接近させたときの着磁性の相違に基づいて固体支持体の識別が可能となる。
各ライブラリーユニットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸と、該核酸に近接して設けられた第一のタンパク質捕獲体とを含んで構成され、各ライブラリーユニットに含まれる核酸は、各ライブラリーユニットが設けられた固体支持体の表面に固定されている。
各ライブラリーユニットに含まれる核酸を構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであってもよいしリボヌクレオチドであってもよい。すなわち、各ライブラリーユニットに含まれる核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであってもよく、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸」にはＤＮＡ及びＲＮＡが含まれ、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸」にはＲＮＡが含まれる。また、核酸の塩基長及び塩基配列は特に限定されるものではなく、目的のタンパク質が発現し得るように適宜選択される。核酸がＤＮＡである場合、二本鎖の状態で固定化されていてもよいし、一本鎖の状態で固定化されていてもよいが、二本鎖の状態で固定されていることが好ましい。ポリメラーゼによるＤＮＡの転写は二本鎖ＤＮＡを基質として効率的に行なわれるからである。
各ライブラリーユニットに含まれる核酸の数は特に限定されるものではなく、複数の核酸（核酸群）が含まれていてもよい。各ライブラリーユニットに複数の核酸が含まれる場合、各核酸が発現し得るタンパク質の種類は同一であっても異なっていてもよい。各ライブラリーユニットから解析対象となる１種類のタンパク質が発現されるとタンパク質解析を効率よく行なうことができるので、同一のライブラリーユニットに含まれる各核酸から発現されるタンパク質は同一種類であることが好ましいが、例えば、解析対象となるタンパク質が複数種類の異なるサブユニットからなる場合には、それぞれのサブユニットを発現する核酸を同一のライブラリーユニットに含めておくことが好ましい。
また、各ライブラリーユニットに同一種類のタンパク質を発現し得る複数の核酸が含まれる場合、各核酸の構造は同一であっても異なっていてもよい。例えば、オープンリーディングフレームは同一であるが転写調節領域や翻訳調節領域が異なる核酸が含まれていてもよい。
各ライブラリーユニットに含まれる核酸は、本発明の核酸ライブラリーを水性媒体中で使用したときに核酸が固体支持体から離脱しないように固定されることが好ましい。このような核酸の固定方法としては、例えば、固体支持体の表面の官能基へ共有結合させる方法（Ｖｅｒａ Ｌａｎｄ，Ｒｕｔｈ Ｓｃｈｍｉｄ，Ｄａｖｉｄ Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｅｒｉｋ Ｈｏｒｎｅｓ（１９８８）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（２２），１０８６１）、ビオチン−アビジン系を用いた方法（Ｓｈａｏ−ＯｃｈｉｅＨｕａｎｇ，Ｈａｒｏｌｄ Ｓｗｅｒｃｌｏｗ，ａｎｄ Ｋａｒｉｎ Ｄ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ（１９９４）．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２２，４４１−１１９）等が挙げられる。前者の方法において、固体支持体の表面の官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、水酸基等が挙げられる。例えば、固体支持体の表面にカルボキシル基が形成されている場合には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミド類でカルボキシル基を活性化させた後、核酸に予め導入しておいてアミノアルキル基と結合させることができる。また、固体支持体の表面にアミノ基が形成されている場合には、無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、核酸に予め導入しておいたアミノアルキル基と結合させるか、あるいは核酸の末端のリン酸と結合させることができる。後者の方法では、例えば、５’末端を予めビオチン化しておいたプライマーを用いてＰＣＲを行なうことによりビオチン化された核酸を得、この核酸を、表面がアビジン（又はストレプトアビジン）コーティングされた固体支持体に固定できる。
各ライブラリーユニットにおいて、核酸のどの部分が固体支持体に固定されていてもよいが、核酸の３’末端又は５’末端が固体支持体に固定されているのが好ましい。これにより、各ライブラリーユニットに含まれる核酸からタンパク質を効率よく発現させることができる。
各ライブラリーユニットにおいて、核酸が固定される固体支持体の「表面」とは、液体（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液）と接触し得る面を意味し、固体支持体の外面（外部表面）はもちろんのこと、液体が浸潤し得る固体支持体の内面（内部表面）（例えば、固体支持体が有する細孔の内部表面）も含まれる。
各ライブラリーユニットに含まれる核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る構造を有している。ここで、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核酸からｍＲＮＡへの転写を行なうことができるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系と、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を行なうことができるｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系とからなり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系には、転写及び翻訳に必要な全ての要素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡ等）が含まれる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の具体例としては、真核細胞及び原核細胞の抽出液から調製された無細胞転写・翻訳系が挙げられ、無細胞転写・翻訳系の具体例としては、大腸菌（例えば大腸菌Ｓ３０）、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等の細胞抽出液から調製された無細胞転写・翻訳系が挙げられる。
各ライブラリーユニットに含まれる核酸の構造は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る限り特に限定されるものではない。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸としては、例えば、転写調節領域と、翻訳調節領域と、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とを含んで構成され、オープンリーディングフレームの３’側には終止コドンが設けられたＤＮＡが挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸としては、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得るＤＮＡと、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）である点を除き同様の構造を有するＲＮＡが挙げられる。但し、ＲＮＡの場合には転写調節領域は不要である。
転写調節領域の具体例としては、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等が挙げられ、翻訳調節領域の具体例としては、コザック（ｋｏｚａｋ）配列、シャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列等が挙げられる。転写調節領域及び翻訳調節領域は、それぞれＤＮＡからｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を可能とする限りいかなる種類のものであってもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系の種類等に応じて適宜選択できる。また、転写調節領域及び翻訳調節領域は、別個の領域として存在していてもよいし重なり合って存在していてもよい。
オープンリーディングフレームの数は特に限定されるものではなく、１種類のタンパク質が発現されるように１つのオープンリーディングフレームが単独で存在していてもよいし、同一種類の複数のオープンリーディングフレームが離れた状態で存在していてもよい。また、２種類以上のタンパク質が発現されるように、２種類以上のオープンリーディングフレームが離れた状態で存在していてもよい。また、融合タンパク質が発現されるように、２種類以上のオープンリーディングフレームが連結された状態で存在していてもよい。なお、融合タンパク質は「１種類のタンパク質」に含まれる。
各ライブラリーユニットに含まれる核酸の具体的な構造としては、例えば、オープンリーディングフレームの５’側にプロモーター及びＳＤ配列を有し、オープンリーディングフレームの３’側に終止コドン及びターミネーターを有する構造が挙げられる。
各ライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）は、タンパク質を捕獲できる限りいかなるものであってもよい。各ライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）は、各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質を特異的に捕獲できることが好ましいが、その場合、ライブラリーユニットの種類ごとに異なるタンパク質捕獲体が必要となるので本発明の核酸ライブラリーの構築が困難となる。したがって、第一のタンパク質捕獲体としては、一般的に、任意のタンパク質を非特異的に捕獲できるタンパク質捕獲体が用いられる。第一のタンパク質捕獲体としては、例えば、化学的結合、電気的結合又は物理的結合を介して任意のタンパク質を非特異的に捕獲できるタンパク質捕獲体を用いることができる。また、タンパク質のライブラリーユニットから離反する方向への移動を制限するような（すなわち、タンパク質をライブラリーユニット近傍に保持できるような）物理的障害物を第一のタンパク質捕獲体として用いることもできる。なお、第一のタンパク質捕獲体の種類、及び第一のタンパク質捕獲体によるタンパク質の捕獲様式は、それぞれのライブラリーユニットにおいて共通していてもよいし異なっていてもよい。
例えば、あるライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質が、解析対象となる標的タンパク質と、第一のタンパク質捕獲体に化学的に結合し得るタグタンパク質との融合タンパク質である場合第一のタンパク質捕獲体は化学的結合を介して発現されたタンパク質（融合タンパク質）を捕獲できる。タグタンパク質／タンパク質捕獲体の組み合わせとしては、例えば、アビジンやストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルやコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、受容体タンパク質／リガンド等が挙げられる。
また、タンパク質は等電点より高いｐＨでは負に荷電し、等電点より低いｐＨでは正に荷電するから、正電荷体又は負電荷体を第一のタンパク質捕獲体として用いることにより、タンパク質と第一のタンパク質捕獲体との電気的結合（静電的相互作用）を利用してタンパク質を捕獲できる。正電荷体及び負電荷体としては、例えば、正荷電基（例えば、アミノ基、グアニジル基、イミダゾール基）を有する物質や負荷電基（例えば、カルボキシル基、スルホニル基、リン酸基）を有する物質を用いることができる。また、電気回路に接続した導電体を正電荷体及び負電荷体として用いることもできる。
また、アルキル基又はその誘導基、フェニル基又はその誘導基等の疎水性基を有する物質を第一のタンパク質捕獲体として用いることにより、タンパク質と第一のタンパク質捕獲体との疎水性相互作用を利用してタンパク質を捕獲できる。
各ライブラリーユニットにおいて、第一のタンパク質捕獲体は、核酸に近接して設けられる。第一のタンパク質捕獲体は、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸よりも同一のライブラリーユニットに含まれる核酸に十分に近接するように設けられる。これにより、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離は、同一のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離よりも圧倒的に大きくなり、各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質は、同一のライブラリーユニットに含まれる第一のタンパク質捕獲体に優先的に捕獲され、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションが防止される。第一のタンパク質捕獲体は出来るだけ同一のライブラリーユニットに含まれる核酸に近接させて設けることが好ましく、第一のタンパク質捕獲体は、例えば、一端が固体支持体に固定されている核酸の他端に設けられる。これにより、第一のタンパク質捕獲体を同一のライブラリーユニットに含まれる核酸に確実に近接させて設けることができる。
第一のタンパク質捕獲体は、固体支持体の表面に直接固定されていてもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸（例えば、核酸の末端のうち、固体支持体に固定されている末端と反対側の末端）に固定されていてもよい。また、固体支持体の表面に固定された他の要素（例えば、糖鎖、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系においてタンパク質を発現し得ない核酸（第一のタンパク質捕獲体を固体支持体に固定するための核酸））に固定されていてもよい。第一のタンパク質捕獲体を、固体支持体の表面に固定された他の要素に固定することによって、タンパク質の発現量とタンパク質捕獲体の量とを簡便に調節することができる。
第一のタンパク質捕獲体の固定は、種々の結合様式によって行なうことができる。結合様式の具体例としては、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとの特異的相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、極性相互作用、共有結合（例えば、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合等）の形成、架橋剤による架橋等が挙げられる。これらの結合様式による固定が可能となるように、公知の技術を用いて、固体支持体表面、第一のタンパク質捕獲体等に適当な化学修飾を施すことができる。ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとの特異的相互作用以外にも、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルやコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原、ＩｇＧ／プロテインＡ等の特異的相互作用を利用することができる。
いずれか１個以上のライブラリーユニットにおいて、第一のタンパク質捕獲体が核酸を包囲するように設けられていることが好ましい。第一のタンパク質捕獲体がこのように設けられたライブラリーユニットにおいては、当該ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質が、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に確実に捕獲されるので、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。第一のタンパク質捕獲体がこのように設けられたライブラリーユニットの個数は出来るだけ多いことが好ましく、全てのライブラリーユニットにおいて第一のタンパク質捕獲体がこのように設けられることが最も好ましい。
固体支持体が粒子であって、核酸の一端が粒子の表面に固定されており、核酸の他端にタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）が設けられている場合、当該核酸が高密度で粒子の表面に固定されていると、粒子の外側にタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）のバリア（障壁）が核酸に近接して形成され、粒子上の核酸はタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）で包囲された状態となる。したがって、かかる粒子をライブラリーユニットとして用いれば、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止できる。ここで、「高密度」とは、粒子上に固定された核酸から発現されたタンパク質が、粒子の外側に形成されたタンパク質捕獲体のバリアを通過しない（ほとんど通過しない）程度の密度であり（すなわち、粒子上に固定された核酸から発現されたタンパク質の全て又はほとんど全てがタンパク質捕獲体に捕獲される程度の密度であり）、粒子上に固定された核酸から発現されるタンパク質の大きさ等に応じて適宜調節できるが、例えば、粒子の表面１μｍ２あたり１０３〜１０６分子程度、好ましくは粒子の表面１μｍ２あたり１０５分子程度の核酸を固定することにより良好な効果を得ることができる。
本発明の核酸ライブラリーが有する２種類以上のライブラリーユニットをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に一度に供して、各ライブラリーユニットに含まれる核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において一度に発現させることにより、複数種類のタンパク質を含んで構成されるタンパク質ライブラリーが得られる。このとき、一度に発現させるライブラリーユニットは２種類以上である限り、本発明の核酸ライブラリーが有する全てのライブラリーユニットであってもよいし、本発明の核酸ライブラリーが有する一部のライブラリーユニットであってもよい。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に供するライブラリーユニットに含まれる核酸は通常ＤＮＡ又はＲＮＡであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に供するライブラリーユニットに含まれる核酸は通常ＲＮＡである。
２種類以上のライブラリーユニットに含まれる核酸を一度に発現させると、各ライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体は、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されたタンパク質よりも、同一のライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されたタンパク質を優先して捕獲するので、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションは防止される。
２種類以上のライブラリーユニットに含まれる核酸を一度に発現させる際、当該ライブラリーユニットに含まれるＤＮＡの転写により生じたｍＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の溶液に移行すると、当該ｍＲＮＡの翻訳により生じたタンパク質が異なる種類のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体に捕獲され、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションが生じるおそれがある。そこで、核酸としてＤＮＡを含むライブラリーユニットにおいて、ＤＮＡの転写により生じるｍＲＮＡを捕獲し得るｍＲＮＡ捕獲体がＤＮＡに近接して設けられていることが好ましい。なお、ライブラリーユニットに含まれる核酸がＲＮＡである場合には、ＤＮＡの転写により生じたｍＲＮＡに起因するタンパク質のクロスコンタミネーションが生じるおそれがない。
ｍＲＮＡ捕獲体はｍＲＮＡを捕獲できる限りいかなるものであってもよい。ｍＲＮＡ捕獲体としては、例えば、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を用いることができる。このとき、ｍＲＮＡ捕獲体は、各ライブラリーユニットに含まれる核酸の転写により生じるｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るものであってもよいが、その場合、ライブラリーユニットの種類ごとに異なるｍＲＮＡ捕獲体が必要となるので本発明の核酸ライブラリーの構築が困難となる。したがって、一般的には、任意のｍＲＮＡを非特異的に捕獲できるｍＲＮＡ捕獲体が用いられる。例えば、ライブラリーユニットに含まれるＤＮＡの転写により生じるｍＲＮＡがポリＡ配列を有する場合には、ポリＴ配列を有するオリゴヌクレオチドをｍＲＮＡ捕獲体として用いることができる。ライブラリーユニットに含まれるＤＮＡにポリＴ配列を導入しておくことにより、当該ＤＮＡの転写により生じるｍＲＮＡにポリＡ配列を導入することが可能である。ｍＲＮＡ捕獲体は、固体支持体の表面に直接固定されていてもよいし、ライブラリーユニットに含まれるＤＮＡ（例えば、ＤＮＡの末端のうち、固体支持体に固定されている末端と反対側の末端）に固定されていてもよい。また、固体支持体の表面に固定された他の部材に固定されていてもよい。
また、２種類以上のライブラリーユニットに含まれる核酸を一度に発現させる際、当該ライブラリーユニットから発現したタンパク質が、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に捕獲されずｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液中に分散すると、当該タンパク質が異なる種類のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に捕獲され、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションが生じるおそれがある。そこで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液には、第一のタンパク質捕獲体とは別個の第二のタンパク質捕獲体を混在させることが好ましい。第二のタンパク質捕獲体の種類は第一のタンパク質の種類と同一であってもよいし異なっていてもよい。本発明の核酸ライブラリーにおいて、各ライブラリーユニットが設けられた固体支持体（例えば粒子）が液体中に分散している状態にある場合には、当該液体中に、第二のタンパク質捕獲体を混在させておくことができる。第二のタンパク質捕獲体は単独で存在していてもよいが、後処理により分離しやすいように固体支持体（例えば粒子）に固定されていることが好ましい。
第二のタンパク質捕獲体は、各ライブラリーユニットから発現されたタンパク質を捕獲できる限りいかなるものであってもよい。第二のタンパク質捕獲体としては、一般的に、任意のタンパク質を非特異的に捕獲できるタンパク質捕獲体が用いられる。第二のタンパク質捕獲体としては、第一のタンパク質捕獲体と同様に、化学的結合、電気的結合又は物理的結合を介して任意のタンパク質を非特異的に捕獲できるタンパク質捕獲体を用いることができる。あるライブラリーユニットから発現されるタンパク質が、標的タンパク質と第一のタンパク質捕獲体に結合し得るタグタンパク質との融合タンパク質である場合には、タグタンパク質が第二のタンパク質捕獲体にも結合し得ることが好ましい。これにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液中に分散した融合タンパク質を第二のタンパク質捕獲体によって確実に捕獲できる。
また、２種類以上のライブラリーユニットに含まれる核酸を一度に発現させる際、当該ライブラリーユニットに含まれるＤＮＡから過剰なｍＲＮＡが発現され、それがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の溶液に移行すると、当該ｍＲＮＡの翻訳により生じたタンパク質が異なる種類のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体に捕獲され、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションが生じるおそれがある。そこで、過剰なｍＲＮＡの発現を防止するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系における転写反応を阻害しながら、前記核酸を一度に発現させることが好ましい。但し、転写反応を完全に阻害すると各ライブラリーユニットからタンパク質を発現させることができなくなるので、転写反応を完全に阻害してはならない。なお、ライブラリーユニットに含まれる核酸がＲＮＡである場合には、過剰なｍＲＮＡの発現に起因するタンパク質のクロスコンタミネーションが生じるおそれがない。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系における転写反応の阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に含まれるＲＮＡポリメラーゼの量的阻害又は質的阻害により行なうことができる。
「ＲＮＡポリメラーゼの量的阻害」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に含まれるＲＮＡポリメラーゼのうち、転写反応に関与できるＲＮＡポリメラーゼ量を低減させることを意味し、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系にＲＮＡポリメラーゼ結合体を混在させておくことより、ＲＮＡポリメラーゼの量的阻害を行なうことができる。ＲＮＡポリメラーゼ結合体は、ＲＮＡポリメラーゼと結合（可逆的結合又は不可逆的結合）し得る限りいかなるものであってもよく、ＲＮＡポリメラーゼ結合体としては、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（例えばプロモーター領域）を有する核酸、又は当該核酸が表面に固定された固体支持体（例えば粒子）を用いることができる。
また、「ＲＮＡポリメラーゼの質的阻害」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に含まれる個々のＲＮＡポリメラーゼの反応性を低下させることを意味し、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の温度を調節することにより、ＲＮＡポリメラーゼの質的阻害を行なうことができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の温度は、転写反応が阻害され得る限り上昇させてもよいし下降させてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の温度を転写反応の至適温度よりも高温して転写反応を阻害する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の温度は、通常３４〜４２℃、好ましくは３６〜３８℃に調節される。なお、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の温度を調節することにより、転写反応だけでなく翻訳反応も阻害される可能性があるが、その場合には、翻訳反応に関与する因子を予め多めにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に含有させておくことにより、翻訳反応の阻害を防止できる。
本発明の核酸ライブラリーにおいて、各ライブラリーユニットが設けられた粒子が液体中に分散している状態にある場合には、当該粒子間の距離を広げることによって、各ライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体は、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されたタンパク質よりも、同一のライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されたタンパク質をより優先して捕獲できるようになる。したがって、各ライブラリーユニットが設けられた粒子間の距離を広げるために、液体中に分散している当該粒子の濃度を低濃度に調節することが好ましい。粒子濃度を５０μＬあたり１０４〜１０５個とすることにより良好な効果を得ることができる。
また、各ライブラリーユニットが設けられた粒子間の距離を広げるために、当該粒子が分散している液体中に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系においてタンパク質を発現し得る核酸が固定されていない粒子を混在させることが好ましい。このような粒子を混在させることによって、各ライブラリーユニットが設けられた粒子間の距離を広げることができるとともに、液体中の粒子濃度が低濃度となったときに生じる粒子のハンドリング性低下という問題も解消できる。なお、混在させる粒子の表面には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系においてタンパク質を発現し得ない核酸を固定しておいてもよい。混在させる粒子の表面にこのような核酸を固定しておくことにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に含まれる転写・翻訳に必要なタンパク質や各ライブラリーユニットから発現されたタンパク質が当該粒子に非特異的に吸着される等、当該粒子を混在させることによる反応系への予期しない影響を防止できる。
各ライブラリーユニットが設けられている粒子とは別の粒子を液体中に混在させた場合には、粒子の粒径を異なるものとしておくことにより、両粒子を例えばフローサイトメトリーによって分別できる。また、各ライブラリーユニットが設けられている粒子として着磁性を有する粒子を用い、混在させる別の粒子として着磁性を有しない粒子を用いることにより、磁石を接近させたときの着磁性の相違に基づいて両粒子を分別できる。
本発明の核酸ライブラリーにおいて、２種類以上のライブラリーユニットに含まれる核酸を一度に発現させても、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションは防止されるので、各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されたタンパク質は、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体（第一のタンパク質捕獲体）に捕獲された状態でディスプレイ（提示）される。すなわち、本発明のタンパク質ライブラリーにおいて、各種類のタンパク質は、それをコードする核酸と対応付けられた状態で固体支持体上にディスプレイされる。
本発明の核酸ライブラリーにおいて、全てのライブラリーユニットが単一の固体支持体の表面に設けられている場合には、当該固体支持体をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液中に浸漬すると、各種類のタンパク質が単一の固体支持体上にディスプレイされる。また、本発明の核酸ライブラリーにおいて、異なる種類のライブラリーユニットがそれぞれ別個の固体支持体の表面に設けられ、液体中に分散している場合には、当該液体中にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の要素を添加すると、異なる種類のタンパク質がそれそれ別個の固体支持体上にディスプレイされる。こうして作製された本発明のタンパク質ライブラリーを用いることにより、複数種類のタンパク質の解析を並列して効率的に行なうことができる。また、本発明の核酸ライブラリーはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に供すると直ちにタンパク質ライブラリーに変換されるので、タンパク質の供給とタンパク質のアッセイ系とが一体となっており、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質解析を開始できる。
本発明のタンパク質ライブラリーを用いたタンパク質解析は、例えば次のようにして行なうことができる。
本発明のタンパク質ライブラリーにおいて、各種類のタンパク質が単一の固体支持体上にディスプレイされている場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液から固体支持体を分離した後、洗浄し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系由来のタンパク質その他の夾雑物を除去する。その後、固体支持体上にディスプレイされた各種類のタンパク質と、標識化した標的物質（例えば、タンパク質、核酸、糖質、脂質等）とを反応させる。反応後、洗浄して未反応の標的物質を除去し、標的物質の標識を検出することによって、固体支持体上にディスプレイされた各種類のタンパク質と標的物質とが反応したか否かを検出できる。標的物質が反応したタンパク質の種類は、そのタンパク質がディスプレイされている位置等によって識別できる。また、そのタンパク質と対応付けられている核酸の塩基配列を解析することによりタンパク質のアミノ酸配列を同定できる。
本発明のタンパク質ライブラリーにおいて、異なる種類のタンパク質がそれぞれ別個の磁性粒子上にディスプレイされ、各磁性粒子がｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液中に分散している場合には、磁力を作用させて各磁性粒子をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液から分離した後、各磁性粒子を洗浄液に移して洗浄し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系由来のタンパク質その他の夾雑物を除去する。その後、各磁性粒子を、標識化した標的物質（例えば、タンパク質、核酸、糖質、脂質等）を含有する溶液中に加えてよく攪拌し、各磁性粒子上にディスプレイされた各種類のタンパク質と、標識化した標的物質とを反応させる。反応後、磁力を作用させて各磁性粒子を溶液から分離し、各磁性粒子を洗浄液に移して洗浄し、未反応の標的物質を除去する。その後、標的物質の標識を検出することによって、磁性粒子上にディスプレイされた各種類のタンパク質と標的物質とが反応したか否かを検出できる。標的物質が反応したタンパク質の種類は、そのタンパク質が設けられた磁性粒子の標識等によって識別できる。また、そのタンパク質と対応付けられている核酸の塩基配列を解析することによりタンパク質のアミノ酸配列を同定できる。
本発明のタンパク質ライブラリーにおいて、異なる種類のタンパク質がそれぞれ別個の粒子上にディスプレイされ、各粒子がｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の溶液中に分散している場合には、タンパク質の種類に対応する特定の蛍光色素で標識された抗体と各粒子とを反応させた後、フローサイトメトリーによって蛍光色素で標識された粒子を分取し、分取された粒子上に固定されている核酸の塩基配列を解析することにより、抗体が結合した抗原を迅速に特定できる。
本発明のタンパク質ライブラリーにおいて、異なる種類のタンパク質がそれぞれ別個の粒子上にディスプレイされている場合には、各粒子上に提示されたタンパク質の性質を利用して、そのタンパク質をコードする遺伝子を濃縮できる。
本発明のタンパク質ライブラリーに含まれるタンパク質が、タンパク質解析途中に変性や失活を起こしたとしても、そのタンパク質がディスプレイされたライブラリーユニットに含まれる核酸を再度発現させることにより、そのタンパク質の再生が可能である。また、タンパク質解析の終了後は、次回使用するときまで核酸ライブラリーの状態で保存しておき、必要なときに各ライブラリーユニットに含まれる核酸を発現させてタンパク質ライブラリーを再生して使用できる。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。
〔実施例１〕
（１）タンパク質合成用ＤＮＡ固定化ビーズの作製
アビジン遺伝子（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＆ Ｗｅｂｅｒ，Ｇｅｎｅ，１３６，２４３−２４６，１９９３．配列番号１参照）の５’側にそれぞれ異なった２種類のタグで標識した。２種類のタグとしては、ヒスチジン（以下「Ｈｉｓ」という。）及びインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来ＨＡペプチド（以下「ＨＡ」という。）を用いた。
Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＲＴＳ １００，Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）のプロトコールに従い、Ｈｉｓ標識アビジン遺伝子及びＨＡ標識アビジン遺伝子の５’側にＴ７プロモーターとリボゾーム結合領域（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ（ＲＢＳ））を、３’側にＴ７ターミネーターをＰＣＲにより導入した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にクローニングして塩基配列を確認後、Ｔ７プロモーターの上流に特異的にハイブリダイズするビオチン標識プライマーと、Ｔ７ターミネーターの下流に特異的にハイブリダイズするＳｆｉＩサイト導入用プライマーを設計した。これらのプライマーは、図１（Ａ）の１７ｂｉｏ−ｆ，ｓｆｉ−ｔｒｍ、あるいは図１（Ｂ）の１１ｂｉｏ−ｒ，ｓｆｉ−ｐｒｍに示した。なお、図１（Ｃ）に、Ｈｉｓ標識アビジン遺伝子におけるアビジン遺伝子部分の開始コドン上流の構造を、図１（Ｄ）にＨＡ標識アビジン遺伝子におけるアビジン遺伝子部分の開始コドン上流の構造を、図１（Ｅ）にＨｉｓ標識アビジン遺伝子及びＨＡ標識アビジン遺伝子におけるアビジン遺伝子部分の終止コドン下流の構造を示した。図１（Ｃ）中の下線部は５’末端側から順に、Ｔ７プロモーター、ｇ１０（ＲＢＳエンハンサー）、ＲＢＳ、ＡＴＧ、Ｈｉｓを示す。図１（Ｄ）中の下線部は５’末端側から順に、Ｔ７プロモーター、ｇ１０（ＲＢＳエンハンサー）、ＲＢＳ、ＡＴＧ、ＨＡを示す。図１（Ｅ）中の下線部はＴ７ターミネーターを示す。図１（Ａ）〜（Ｅ）中の太字部分は、各プライマーが特異的に結合する配列を示す。なお、Ｔ７プロモーター等の配列はＲＴＳ１００で推奨している発現ベクターｐＩＶＥＸ２．４ａを参照した。
Ｈｉｓ標識アビジン遺伝子及びＨＡ標識アビジン遺伝子を鋳型として、上記プライマーを用いてＰＣＲを行ない、５’側にビオチン（１７ｂｉｏ−ｆ）を３’側にＳｆｉＩサイト（ｓｆｉ−ｔｒｍ）を持ったＤＮＡ断片を作製した。なお、３’側にビオチン（１１ｂｉｏ−ｒ）を５’側にＳｆｉＩサイト（ｓｆｉ−ｐｒｍ）を持ったＤＮＡ断片も作製し、タンパク質の発現に成功している。
各ＤＮＡ断片５０μＬ（約１μＭ）をＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で精製後、制限酵素ＳｆｉＩで切断した後（５０℃、１時間３０分）、プロトコールに従い１×ＢＷ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄された０．２ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｄｙｎａｌｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、ビオチン−アビジン反応により各ＤＮＡ断片（約５０ｐｍｏｌ）を回収した（１×ＢＷ ｂｕｆｆｅｒ溶液中、室温で１５分）。これにより、ビオチン−アビジン反応を介して表面に各ＤＮＡ断片が固定されたビーズが得られた。
各種ビーズは、１×ＢＷ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、アダプターとライゲーションするために、１×Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ社製）に懸濁した。
一方、５’側をリン酸化した合成オリゴＤＮＡと５’側をビオチン標識した適当な配列を有する合成オリゴＤＮＡを等量混ぜ、両者をアニーリングし（１時間３０分かけて８５℃から４℃まで冷却）、ＳｆｉＩサイトとライゲーションするビオチン化アダプターを作製した。図２（Ａ）に、アダプターの塩基配列を示す。また、図２（Ｂ）に、ＳｆｉＩサイトへのビオチン化アダプターのライゲーションの様子を模式的に示す。
ＳｆｉＩで切断されたＤＮＡ断片（約５０ｐｍｏｌ）が結合したビーズ０．２ｍｇと、合成オリゴＤＮＡのアニーリングで作製したビオチン化アダプター（２４０ｐｍｏｌ）とを、ＴａＫａＲａ Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（５２５ｕｎｉｔｓ）を用い、室温で軽く混合しながら１時間の反応によってライゲーションした。
以上の操作によって、５’末端側がビーズ（０．２ｍｇ）に固定され、３’末端側にビオチンを持った鋳型ＤＮＡが作製された。すなわち、Ｈｉｓ−アビジンをコードするＤＮＡ断片が表面に固定化されたビーズ（以下「Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズ」という。）、及びＨＡ−アビジンをコードするＤＮＡ断片が表面に固定化されたビーズ（以下「ＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズ」という。）の、２種類のビーズが作製された。この２種類のビーズが保持するＤＮＡ断片の配列を、Ｈｉｓ−アビジンについては配列番号２に、ＨＡ−アビジンについては配列番号３に示す。この２種類のビーズをそれぞれ、１×ＢＷ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）４０μＬに懸濁した。
Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズ又はＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズからのタンパク質合成の際に共存させるビーズとして、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（粒径：２．８μｍ）とは大きさの異なるストレプトアビジン固相化磁性ビーズ（粒径：０．７μｍ）（ＴＯＹＯＢＯ：ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｌｅａｎ ｕｐに含まれる）に、二本鎖ＤＮＡを固定化したビーズを調製した（以下「ｓａｖビーズ」という）。二本鎖ＤＮＡは、図１（Ｆ）で示されたｓａｖ−ｃｏｍｐと３’側がビオチン化されたｓａｖ−Ｂｉｏｔｉｎを混合後、８５℃から４℃まで１時間３０分かけて冷却してアニーリングさせることにより作製した。調製した二本鎖ＤＮＡ（１０ｎｍｏｌ）は、１×ＢＷ Ｂｕｆｆｅｒ中でビオチン−アビジン反応を介してビーズ（２ｍｇ）表面に固定化し、１×ＢＷ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、ＴＥ４００μＬに懸濁した。なお、ｓａｖビーズに固定化された二本鎖ＤＮＡは、転写及び翻訳に必要な一切の配列を含まない。ｓａｖビーズを共存させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に含まれる転写・翻訳に必要なタンパク質、あるいはＨｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズ又はＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズから合成されたタンパク質がｓａｖビーズに非特異的に吸着される等、反応系に予期しない影響が及ぶ可能性があるが、ｓａｖビーズにもＨｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズ又はＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズと同様に二本鎖ＤＮＡを固定化しておくことにより、このような可能性を低減させることができる。
（２）タンパク質合成（ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳）
上記で作製されたタンパク質合成用ＤＮＡ固定化ビーズを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によるタンパク質合成を行なった。Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズのみを含有する溶液、ＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズのみを含有する溶液、及びＨｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズとＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズの混合ビーズを含有する溶液、それぞれ全量１０μＬについてビーズ上のＤＮＡを鋳型として、ＲＴＳ１００のプロトコールに従い、３０℃、２時間又は４時間の反応によって、タンパク質（Ｈｉｓとアビジンとの融合タンパク質、又はＨＡとアビジンとの融合タンパク質）を合成した。なお、いずれの反応液にも４５μｇのｓａｖビーズを添加した。
（３）蛍光標識抗体による検出と識別
各種ビーズを１×ＢＷ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）＋５％スキムミルク溶液で、室温で軽く混合しながら１時間ブロッキングした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、室温で軽く混合しながら１次及び２次抗体反応を各１時間行なった。１次抗体は、マウス由来抗Ｈｉｓ抗体（アマシャムファルマシアバイオテク社製）及びウサギ由来抗ＨＡ抗体（コスモバイオ社製）各０．５μｇをＰＢＳ−Ｔ １００μＬに希釈して使用した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、抗Ｈｉｓ抗体を蛍光標識するための２次抗体として、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８標識されたヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（フナコシ社製）０．５μｇをＰＢＳ−Ｔ １００μＬに希釈して使用した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製））、励起波長：４８８ｎｍ、測定波長：５３０／３０ｎｍにより測定した。
測定結果を図３に示す。図３中、Ａは、タンパク質合成用ＤＮＡ固定化ビーズとしてＨｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズのみを含有する溶液及びＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズのみを含有する溶液を用いて、それぞれタンパク質を発現させた後、混合して上記測定を行なったときの結果を示す図であり、Ｂは、タンパク質合成用ＤＮＡ固定化ビーズとしてＨｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズとＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズの混合ビーズを含有する溶液を用いてタンパク質を発現させ、上記測定を行なったときの結果を示す図であり、Ｃは、タンパク質合成用ＤＮＡ固定化ビーズとしてＨｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズとＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズの混合ビーズを含有する溶液を用いてタンパク質を発現させる際に、ビオチン化アガロースゲルを溶液中に混在させて溶液中のタンパク質を捕獲したときの結果を示す図である。
図３Ａ及びＢに示すように、転写・翻訳時間を２時間としたときには、蛍光強度が異なる２種類のビーズが得られた。この２種類のビーズの一方は、Ｈｉｓとアビジンとの融合タンパク質が捕獲されたビーズであり、他方は、ＨＡとアビジンとの融合タンパク質が捕獲されたビーズであると考えられる。後述する実施例３の結果を考慮すると、この２種類のビーズは、Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズとＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズであると考えられるので、Ｈｉｓとアビジンとの融合タンパク質はＨｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズに捕獲され、ＨＡとアビジンとの融合タンパク質はＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズに捕獲されたと考えられる。
このことから、ビーズが液体中に分散した状態にあるとき（すなわち、各ビーズが離隔した状態にあるとき）、ビーズ上に固定されたタンパク質捕獲体（本実施例ではビオチン）は、他のビーズ上に固定されたＤＮＡ断片から発現されるタンパク質（本実施例では、Ｈｉｓとアビジンの融合タンパク質又はＨＡとアビジンとの融合タンパク質）よりも、同一のビーズ上に固定されたＤＮＡ断片から発現されるタンパク質（本実施例では、Ｈｉｓとアビジンの融合タンパク質又はＨＡとアビジンとの融合タンパク質）を優先して捕獲することができ、これにより異なる種類のＤＮＡ断片が固定されたビーズ間でのタンパク質のクロスコンタミネーションが防止されると考えられる。
但し、転写・翻訳時間を４時間としたときには、明確なビーズの分離が観察されなかった。これは、転写・翻訳時間の延長により、転写によって生じた過剰のｍＲＮＡが溶液中に放出され、翻訳されたことが原因であると考えられる。したがって、転写・翻訳を行なう溶液中にタンパク質捕獲体を混在させることにより、異なる種類のＤＮＡ断片が固定されたビーズ間でタンパク質のクロスコンタミネーションを防止できると考えられる。実際に、溶液中にビオチン化アガロースゲルを混在させた場合（図３Ｃ）には、混在させない場合（図３Ｂ）よりも明確なビーズの分離が観察されている。
このことから、転写・翻訳が行なわれる溶液中に、各種ビーズから発現されるタンパク質（本実施例では、Ｈｉｓとアビジンの融合タンパク質又はＨＡとアビジンとの融合タンパク質）を捕獲できるタンパク質捕獲体（本実施例ではビオチン化アガロースゲル）を混在させておくことにより、異なる種類のＤＮＡ断片が固定されたビーズ間でタンパク質のクロスコンタミネーションを防止できると考えられる。
〔実施例２〕
（１）タンパク質合成用ＤＮＡ固定化ビーズの作製
実施例１と同様にしてタンパク質合成用ＤＮＡ固定化ビーズを作製した。
（２）タンパク質合成（ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳）
上記で作製されたタンパク質合成用ＤＮＡ固定化ビーズを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によるタンパク質合成を行なった。Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズのみを含有する溶液、ＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズのみを含有する溶液、及びＨｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズとＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズの混合ビーズを含有する溶液、それぞれ全量１０μＬについてビーズ上のＤＮＡを鋳型として、ＲＴＳ１００のプロトコールに従い、３０℃で１時間又は１時間１５分、あるいは３７℃で１時間４５分の反応によって、タンパク質（Ｈｉｓとアビジンとの融合タンパク質、又はＨＡとアビジンとの融合タンパク質）を合成した。なお、いずれの反応液にも４５μｇのｓａｖビーズを添加した。
また、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を阻害するために、Ｔ７プロモーター配列を有するＤＮＡ断片（１７ｍｅｒ，６０ｍｅｒ）（以下「阻害ＤＮＡ」という。）を５０ｐｍｏｌ添加した。１７ｍｅｒ及び６０ｍｅｒの阻害ＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号４及び５に示す。
（３）蛍光標識抗体による検出と識別
各種ビーズを１×ＢＷ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）＋５％スキムミルク溶液で、室温で軽く混合しながら１時間ブロッキングした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、室温で軽く混合しながら１次及び２次抗体反応を各１時間行なった。１次抗体としては、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８で標識されたマウス由来モノクロナル抗ＨＡ抗体（モレキュラプローブ社製）およびウサギ由来抗Ｈｉｓ抗体（コスモバイオ社製）を用い、２次抗体としては、フィコエリスリン（ＰＥ）で標識されたヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体（フナコシ社製）を用いた。それぞれの抗体は、１次抗体の場合には各０．５μｇをＰＢＳ−Ｔ １００μＬに希釈して、２次抗体の場合には２μｇをＰＢＳ−Ｔ １００μＬに希釈して使用した。それぞれの抗体の結合後にはＰＢＳ−Ｔで洗浄した。フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製））、励起波長：４８８ｎｍ、測定波長：５３０／３０ｎｍおよび５８５／４５ｎｍにより測定した。
測定結果を図４及び５に示す。
図４中、「コントロール」（Ａ及びＣ）は、Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズのみを含有する溶液及びＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズのみを含有する溶液を用いて、それぞれタンパク質を発現させた後、混合して上記測定を行なったときの結果を示し、「ミックス」（Ｂ及びＤ）は、Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズとＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズの混合ビーズを含有する溶液を用いてタンパク質を発現させ、上記測定を行なったときの結果を示す。なお、Ａ及びＢの転写・翻訳条件は３０℃で１時間であり、Ｃ及びＤの転写・翻訳条件は３７℃で１時間４５分である。
図５中、「コントロール」（Ａ及びＥ）は、Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズのみを含有する溶液及びＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズのみを含有する溶液を用いて、それぞれタンパク質を発現させた後、混合して上記測定を行なったときの結果を示し、「阻害ＤＮＡ不存在下」（Ｂ及びＦ）、「１７ｍｅｒ阻害ＤＮＡ存在下」（Ｃ及びＧ）、「６０ｍｅｒ阻害ＤＮＡ存在下」（Ｄ及びＨ）は、Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズとＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズの混合ビーズを含有する溶液（阻害ＤＮＡ無添加、１７ｍｅｒ阻害ＤＮＡ添加、６０ｍｅｒ阻害ＤＮＡ添加）を用いてタンパク質を発現させ、上記測定を行なったときの結果を示す。なお、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの転写・翻訳条件は３０℃で１時間１５分であり、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨの転写・翻訳時間は３７℃で１時間４５分である。
図４Ｂ及びＤに示すように、３７℃では３０℃よりも翻訳産物の量が若干減少しているように見えるが、３７℃では３０℃よりも明確なビーズの分離が観察された。また、図５Ｂに示すように、阻害ＤＮＡ不存在下では、明確なビーズの分離は観察されなかったが、図５Ｃ及びＧに示すように１７ｍｅｒ阻害ＤＮＡ存在下では３７℃で、また図５Ｄ及びＨに示すように６０ｍｅｒ阻害ＤＮＡ存在下では３０℃で、明確なビーズの分離が観察された。
明確なビーズの分離は、Ｈｉｓとアビジンとの融合タンパク質が捕獲されたビーズ及びＨＡとアビジンとの融合タンパク質が捕獲されたビーズの２種類のビーズが得られたことを示すこと、並びに、阻害ＤＮＡの存在及び反応温度の上昇はいずれも転写反応を阻害する要因であることから、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系における転写反応を阻害することにより、ビーズ間におけるタンパク質のクロスコンタミネーションを防止できるものと考えられる。
なお、図５Ｈに示すように、６０ｍｅｒ阻害ＤＮＡ存在下、３７℃では明確なビーズの分離が観察されていないが、阻害ＤＮＡの添加と３７℃という反応温度はいずれもタンパク質の翻訳量の低下を引き起こすことから、この条件ではタンパク質がほとんど生成されず、ビーズが原点から動いていないことが原因であると推察される。
〔実施例３〕
実施例２においてフローサイトメトリーで分離された２種類のビーズ（Ｈｉｓとアビジンとの融合タンパク質が捕獲されたビーズ及びＨＡとアビジンとの融合タンパク質が捕獲されたビーズ）が、Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズとＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズであることを確認するために、図４Ｂ及びＤ並びに図５Ｄの点線で囲まれた領域のビーズを分取した。図４Ｂ及びＤ並びに図５Ｄ中、Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズが含まれると予想される領域を「Ｈｉｓ」と表示し、ＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズが含まれると予想される領域を「ＨＡ」と表示する。
上記で分取したビーズについて、ＰＣＲを用いて表面に固定化されているＤＮＡの種類の特定を行った。プライマーを設計した位置を図６に示す。
まず、上記で分取したビーズを鋳型として、１ｓｔ ＰＣＲ用のプライマーを用いて増幅を行った。１ｓｔ ＰＣＲで用いた上流及び下流プライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号６及び７に示す。次に、１ｓｔ ＰＣＲの産物を鋳型として、２ｎｄ ＰＣＲ用のプライマーを用いて増幅を行った。２ｎｄ ＰＣＲでは、上流側のプライマーとして、Ｃｙ５又はＦＩＴＣで標識された２種類のプライマー（Ｃｙ５−Ｈｉｓ及びＦＩＴＣ−ＨＡ）の混合物を用い、下流側のプライマーとして、ビオチン標識したプライマーを共通して用いた。プライマーＣｙ５−Ｈｉｓ及びＦＩＴＣ−ＨＡの塩基配列をそれぞれ配列番号８及び９に示し、ビオチン標識したプライマーの塩基配列を配列番号１０に示す。
上記ＰＣＲにより、ビーズ上のＤＮＡ断片がＨＡタグをコードする塩基配列を有している場合には、末端がＦＩＴＣとビオチンで標識されたＤＮＡ断片が増幅され、ビーズ上のＤＮＡ断片がＨｉｓタグをコードする塩基配列を有している場合には、末端がＣｙ５とビオチンで標識されたＤＮＡ断片が増幅される。従って、２ｎｄ ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片をアビジン磁気ビーズで捕獲し、磁気ビーズ上に捕獲された蛍光色素（ＦＩＴＣ又はＣｙ５）の蛍光強度を測定することにより、１ｓｔ ＰＣＲで鋳型として用いたＤＮＡ断片の種類を特定することができる。
蛍光強度の測定結果を表１及び２に示す。
表２に示すように、Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズと予想されるビーズはＦＩＴＣ／Ｃｙ５の比が小さく、ＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズと予想されるビーズはＦＩＴＣ／Ｃｙ５の比が大きかった。したがって、実施例２においてフローサイトメトリーで分離された２種類のビーズが、Ｈｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズとＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズであることが確認された。
以上の結果から、Ｈｉｓとアビジンとの融合タンパク質はＨｉｓ−ａｖｉｄｉｎビーズに捕獲され、ＨＡとアビジンとの融合タンパク質はＨＡ−ａｖｉｄｉｎビーズに捕獲されていることが確認された。
産業上の利用の可能性
本発明により、複数種類のタンパク質を、それをコードする核酸と対応付けて一度に供給できるとともに、タンパク質の供給後、直ちに複数種類のタンパク質の解析を並列して行なうことができ、しかも変性や失活を起こしたタンパク質を容易に再生できる核酸ライブラリー及びタンパク質ライブラリー並びにタンパク質ライブラリーの作製方法が提供される。また、本発明により、そのような核酸ライブラリー及びタンパク質ライブラリーを構成するライブラリーユニットとして有用な粒子が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１（Ａ）は、Ｈｉｓ標識及びＨＡ標識アビジン遺伝子について、５’側にビオチンを、３’側にＳｆｉＩサイトを導入するためのＰＣＲ用プライマーの塩基配列を、図１（Ｂ）は、Ｈｉｓ標識及びＨＡ標識アビジン遺伝子について、５’側にＳｉｆＩサイトを、３’側にビオチンを導入するためのＰＣＲ用プライマーの塩基配列を、図１（Ｃ）は、Ｈｉｓ標識アビジン遺伝子におけるアビジン遺伝子部分の開始コドン上流の構造を、図１（Ｄ）は、ＨＡ標識アビジン遺伝子におけるアビジン遺伝子部分の開始コドン上流の構造を、図１（Ｅ）は、Ｈｉｓ標識アビジン遺伝子及びＨＡ標識アビジン遺伝子におけるアビジン遺伝子部分の終止コドン下流の構造を、図１（Ｆ）は、０．７μｍの粒径を有するｓａｖビーズに固定化した二本鎖ＤＮＡの調製に用いたオリゴＤＮＡの構造を示す図である。
図２（Ａ）は、アダプターの塩基配列を、図２（Ｂ）は、ＳｆｉＩサイトへのビオチン化アダプターのライゲーションの様子を模式的に示す図である。
図３は、異なる種類のＤＮＡ断片が固定されたビーズを混合して又は混合せずにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に供した後（２時間又は４時間）、フローサイトメトリーによりビーズを分離した結果である。
図４は、異なる種類のＤＮＡ断片が固定されたビーズを混合して又は混合せずにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に供した後（３０℃で１時間又は３７℃１時間４５分）、フローサイトメトリーによりビーズを分離した結果である。
図５は、Ｔ７プロモーター配列を有するＤＮＡ断片（１７ｍｅｒ，６０ｍｅｒ）の存在下又は不存在下、異なる種類のＤＮＡ断片が固定されたビーズを混合して又は混合せずにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に供した後（３０℃で１時間１５分又は３７℃１時間４５分）、フローサイトメトリーによりビーズを分離した結果である。
図６は、ビーズ表面に固定化されているＤＮＡ断片の種類を特定する際にＰＣＲ（１回目及び２回目）で使用したプライマーのハイブリダイズ位置を示す図である。
図７は、紐状の固体支持体が円柱状の軸部材に巻装された核酸ライブラリーの一実施形態を示す斜視図である。 Technical field
The present invention relates to a nucleic acid library (aggregate of nucleic acids) comprising a plurality of nucleic acids immobilized on a solid support, and a protein library (protein aggregate) comprising a plurality of proteins displayed on a solid support. About.
Background art
In proteomics, it is necessary to perform a wide variety of analyzes on the structure, function, etc. of multiple types of proteins in parallel (ie, high-throughput analysis). In conducting analysis of multiple types of proteins in parallel, the usefulness of protein arrays (protein chips) in which multiple types of proteins are immobilized on the surface of a solid support has attracted attention. In the protein array, a plurality of types of proteins are fixed to a predetermined region on the surface of the solid support, and each type of protein can be identified by the position on the solid support. The protein array is useful, for example, for screening proteins that can bind to a target substance (eg, protein, DNA, etc.) from a plurality of types of proteins.
Disclosure of the invention
However, conventional protein arrays require inefficient spotting of the protein on the surface of the solid support, and can easily denature or deactivate when the protein immobilized on the surface of the solid support is dried. End up. Once a protein fixed on the surface of a solid support is denatured or inactivated, it is difficult to regenerate the protein. Therefore, conventional protein arrays have been difficult to store and use for a long period of time.
In addition, in a conventional assay system using a protein array, analysis cannot be started immediately after protein supply because the analysis can be performed only after the supplied protein is immobilized on the surface of the solid support. It took a lot of time and labor from the supply to the start of analysis. That is, since the protein supply and the protein assay system are separate and independent technologies, it is difficult to efficiently proceed with protein analysis.
On the other hand, development of an in vitro transcription / translation system using a phage promoter has progressed, and the target protein can be efficiently supplied in a short time. In addition, the phage display method (Smith, GP, 1985, Science, 228, 1315-1317), the ribosome display method (Hanes, J. and Puckthun, A. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA). , 94, 4937-4942) have been developed, and it is possible to supply a target protein in a state in which it is associated with a nucleic acid encoding it. If the target protein (phenotype) to be analyzed can be supplied in a state associated with the nucleic acid (genotype) encoding it, it is advantageous in analyzing the target protein because the amino acid sequence of the target protein can be easily identified.
Furthermore, the target protein can be obtained by using a DNA having at least a transcription translation initiation region, a region encoding a target protein, and a region encoding an adapter protein (also referred to as “tag protein” in the present invention) and a ligand bound thereto. In addition, a technique for supplying the nucleic acid in association with the nucleic acid encoding it has also been developed (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-128690). In this technology, the DNA is expressed in a cell-free transcription / translation system, the target protein is synthesized as a fusion protein with an adapter protein, and the fusion is performed through specific binding between the ligand bound to the DNA and the adapter protein. By binding the protein to the DNA, it is possible to supply the target protein in association with the DNA encoding it. In addition, if a library of protein-DNA linked molecules prepared by this technique is used, a plurality of types of proteins can be analyzed in parallel. However, in this technique, in order to prevent cross-contamination of proteins expressed by different types of DNA, it is necessary to express DNA in a state where one type or one molecule is isolated.
Therefore, the present invention can supply a plurality of types of proteins at once in association with the nucleic acid encoding them, and immediately after the supply of the plurality of types of proteins, the analysis of the plurality of types of proteins can be performed in parallel. Another object of the present invention is to provide a nucleic acid library, a protein library, and a method for producing the protein library that can easily regenerate a denatured or inactivated protein. Another object of the present invention is to provide particles useful as library units constituting nucleic acid libraries and protein libraries.
In order to achieve the above object, the present invention provides the following nucleic acid library, protein library, protein library preparation method, protein library preparation kit and particles.
(1) The nucleic acid library of the present invention is a nucleic acid library having two or more types of library units that exist in a state of being separated from each other, and each library unit is an in vitro transcription / translation system or in vitro translation. A nucleic acid capable of expressing one or more proteins in the system, and a first protein capturing body provided in the vicinity of the nucleic acid, and each library unit is placed on the surface of the solid support. The nucleic acid contained in each library unit is fixed to the surface of a solid support on which each library unit is provided.
In the nucleic acid library of the present invention, different types of library units exist in a state of being separated from each other, and a protein capture body (first protein capture body) is provided close to the nucleic acid in each library unit. Therefore, the distance between the nucleic acid contained in different types of library units and the protein capture body is much larger than the distance between the nucleic acid contained in the same library unit and the protein capture body. Therefore, the protein expressed from the nucleic acid contained in each library unit has a protein capture contained in the same library unit, rather than the protein capture contained in a different type of library unit (first protein capture). Since it is preferentially captured by the body (first protein capture body), cross-contamination of proteins expressed in different types of library units can be effectively prevented. Therefore, when two or more kinds of library units possessed by the nucleic acid library of the present invention are subjected to an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system, the proteins expressed from the nucleic acids contained in each library unit are identical. It is displayed (presented) on a solid support in a state of being captured by a protein capturing body (first protein capturing body) contained in the library unit. That is, according to the nucleic acid library of the present invention, a plurality of types of proteins can be supplied at a time in a state in which they are associated with nucleic acids encoding them and displayed on a solid support. Can be efficiently analyzed in parallel.
Moreover, the nucleic acid library of the present invention is immediately converted into a protein library by subjecting each library unit to an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system. That is, in the nucleic acid library of the present invention, since the protein supply and the protein assay system are integrated, the plurality of types of proteins can be analyzed immediately after the supply of the plurality of types of proteins.
Furthermore, in the nucleic acid library of the present invention, even if the protein displayed on the solid support is denatured or inactivated, the protein can be easily regenerated by re-expressing the nucleic acid corresponding to the protein. .
Furthermore, nucleic acids contained in each library unit of the nucleic acid library of the present invention can be stored for a long period of time compared to proteins. Therefore, the protein library prepared from the nucleic acid library of the present invention can be used repeatedly over a long period of time by storing it in the nucleic acid library state and regenerating the protein library when necessary.
(2) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (1), all library units are provided on the surface of a single solid support.
In the nucleic acid library according to this embodiment, since all library units can be handled at once by handling a single solid support, the handling of the nucleic acid library is easy.
(3) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (2), the position of each library unit on the solid support is associated with the type of each library unit.
In the nucleic acid library according to the present embodiment, the type of each library unit, the type of nucleic acid contained in each library unit, and the type of protein expressed from the nucleic acid contained in each library unit are classified into each library unit. Can be identified based on their position on the solid support.
(4) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (2) or (3), the solid support has a shape that can be wound around a shaft member.
When arranging multiple types of DNA on a flat surface at a high density, cross contamination of different types of DNA is likely to occur, and it takes a lot of time and effort. There is a point. Therefore, various detection substances having a predetermined chemical structure are fixed so as to be arranged in the longitudinal direction, and each of the chemical structures and their fixed positions are associated with each other in a slender shape such as a thread shape, a string shape, or a tape shape. An integrated support having a base member and a support on which the base member is wound has been developed. By using this integration technology, an elongated solid carrier such as a thread, string, or tape can be developed. In this state, DNA is immobilized (primary integration), and then wound around a shaft member (secondary integration), thereby preventing DNA from cross contamination and easily and at low cost. Can be produced at high density (WO 01 / 69249A1, WO 01 / 53831A1, WO 02 / 63300A1).
The nucleic acid library according to this embodiment uses this integration technique. That is, in the nucleic acid library according to the present embodiment, in a state where a solid support having a shape that can be wound around a shaft member (for example, an elongated shape such as a string shape, a tape shape, or a thread shape) is developed, the solid support After each library unit is provided (primary integration), each library unit can be arranged at high density by winding it around a shaft member (secondary integration). Then, by converting a nucleic acid library in which each library unit is arranged at high density into a protein library, a protein array in which proteins are arranged at high density can be produced. Therefore, by using a nucleic acid library in which a solid support is wound around a shaft member, it is possible to easily realize automation of a series of operations from preparation of a protein library to analysis of a protein using the protein library.
Further, in a state where a solid support having a shape that can be wound around a shaft member is developed, the nucleic acid library is converted into a protein library, and then the solid support is wound around the shaft member, thereby increasing the protein. Protein arrays arranged in density can be made.
(5) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (1), different types of library units are provided on the surfaces of separate solid supports.
In the nucleic acid library according to this embodiment, nucleic acids contained in different types of library units are respectively immobilized on the surfaces of separate solid supports. Since solid supports are macroscopic compared to nucleic acid and protein capture bodies, the distance between nucleic acid and protein capture bodies contained in different types of library units is the same as the nucleic acid and protein contained in the same library unit. While it is overwhelmingly larger than the distance to the capture body, the encounter probability between the nucleic acid contained in different types of library units and the protein capture body is kept extremely low. Therefore, the protein expressed from the nucleic acid contained in the library unit provided on the surface of each solid support is converted into the protein trap (first protein) contained in the library unit provided on the surface of the same solid support. It is possible to effectively prevent cross-contamination of proteins that are preferentially captured by a protein capture body) and expressed in a library unit provided on the surface of a separate solid support.
Further, in the nucleic acid library according to this embodiment, the degree of freedom of the combination of library units increases, so that analysis can be performed by freely combining different types of proteins.
(6) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to the above (5), the solid supports provided with different types of library units can be distinguished from each other.
In the nucleic acid library according to the present embodiment, by identifying the solid support provided with each library unit, the type of each library unit, the type of nucleic acid contained in each library unit, and each library unit The type of protein expressed from the contained nucleic acid can be identified.
(7) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (5) or (6), the solid support is a particle.
In the nucleic acid library according to this embodiment, particles provided with each library unit can be dispersed in a liquid (see (9) below).
(8) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (7), the particles have magnetism.
In the nucleic acid library according to this embodiment, the operability of the solid support provided with each library unit is improved, the automation of the production of the protein library using the nucleic acid library of the present invention, and the protein live of the present invention is performed. Automation of protein analysis using a rally can be easily realized.
(9) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (7) or (8), the particles are dispersed in a liquid.
In the nucleic acid library according to this embodiment, the reactivity of each library unit is improved by dispersing the particles provided with each library unit in a liquid, and the nucleic acid library according to this embodiment is transferred in vitro. -When subjected to a translation system, the transcription reaction and translation reaction in each library unit can be rapidly advanced. When the particles have magnetism, it is preferable that the particles dispersed in the liquid have magnetism because the particles dispersed in the liquid can be collected using a magnet and the particles can be easily separated from the liquid.
In addition, the nucleic acid library of the present invention includes those in which the solid support provided with each library unit is dispersed in a liquid. In addition, even if the particles provided with each library unit are dispersed in a liquid, the distance between the nucleic acid and the protein trap contained in different types of library units is included in the same library unit. While the distance is far greater than the distance between the nucleic acid and the protein capturer, the encounter probability between the nucleic acid and the protein capturer contained in different types of library units is kept extremely low. Therefore, the protein expressed from the nucleic acid contained in the library unit provided on the surface of each particle is a protein trap (first protein trap) contained in the library unit provided on the surface of the same particle. It is possible to effectively prevent cross-contamination of proteins that are preferentially captured and expressed in library units provided on the surface of separate particles.
(10) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (9), particles in which a nucleic acid capable of expressing a protein in an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system is not fixed are mixed in the liquid. Yes.
In the nucleic acid library according to this embodiment, particles in which a nucleic acid capable of expressing a protein in an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system is not fixed are interposed between particles provided with each library unit. Thus, the distance between the particles provided with each library unit is increased. As a result, the protein capture body (first protein capture body) contained in the library unit provided on the surface of each particle can be used as a substitute for the protein expressed from the library unit provided on the same particle surface. Since the protein expressed from the library unit provided on the surface of the particle can be preferentially captured, cross-contamination of proteins expressed in different types of library units can be effectively prevented. In addition, in the nucleic acid library according to this embodiment, when the concentration of the particles provided with each library unit is low (for example, when the concentration of particles is low to increase the distance between particles) ) Can be solved. In addition, since the nucleic acid capable of expressing the protein in the in vitro transcription / translation system or the in vitro translation system is not fixed to the particles to be mixed, the protein is not expressed from the particles, and the particles are not included in each library. It does not cause protein cross-contamination to the unit.
(11) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (9) or (10), a second protein capture body or RNA polymerase conjugate is mixed in the liquid.
In the nucleic acid library according to this embodiment, the protein expressed from the library unit provided on the surface of each particle is not captured by the protein capturing body (first protein capturing body) included in the same library unit. Even if dispersed in a liquid, the protein capture body (second protein capture body) present in the liquid captures the protein, so that the protein is included in the library unit provided on the surface of another particle. Can be prevented from being captured by a protein trap.
In addition, since the RNA polymerase contained in the in vitro transcription / translation system binds to the RNA polymerase conjugate, the transcription reaction in the library unit containing DNA as a nucleic acid is inhibited, so that excess mRNA is released from the library unit. It can be effectively prevented from being expressed and dispersed in the liquid.
Therefore, in the nucleic acid library according to the present embodiment, cross-contamination of proteins expressed in different types of library units can be effectively prevented.
(12) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to any one of (1) to (11), the solid support is porous.
In the nucleic acid library according to this embodiment, the library unit can be provided on the inner surface of the pores of the solid support. Since the fluidity of the liquid (for example, in vitro transcription / translation system or in vitro translation system) is low in the pores of the solid support, it is included in the library unit provided on the internal surface of the pores of the solid support. The protein expressed from the nucleic acid is hardly released from the pores. Therefore, the protein expressed from the nucleic acid can be reliably captured in the protein capture body (first protein capture body) included in the same library unit, and the cross-contamination of the proteins expressed in different types of library units. Nation can be effectively prevented.
(13) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (12), the solid support is a fiber or an assembly thereof.
In the nucleic acid library according to this embodiment, since the solid support is a fiber or an aggregate thereof, the solid support is porous. When the solid support is an aggregate of fibers (for example, a twisted fiber), there are many pores in the solid support.
(14) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to any one of (1) to (13), one end of the nucleic acid is fixed to the solid support in any one or more library units. The first protein capturing body is provided at the other end of the nucleic acid.
In the nucleic acid library according to this embodiment, the protein capture body (first protein capture body) is provided close to the nucleic acid by providing the protein capture body (first protein capture body) at the end of the nucleic acid. Yes.
(15) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to any one of (1) to (14), in any one or more library units, the first protein capture body surrounds the nucleic acid. It is provided as follows.
In the nucleic acid library according to this embodiment, a protein capture body (first protein capture body) is provided so as to surround the nucleic acid, so that proteins expressed from the nucleic acid are contained in the same library unit. Since it is surely captured by the capture body (first protein capture body), cross-contamination of proteins expressed in different types of library units can be effectively prevented. As the number of library units provided so that the first protein capture body surrounds the nucleic acid increases, cross-contamination of proteins expressed in different types of library units can be effectively prevented. It is preferable that the number of library units provided so as to surround the nucleic acid is as large as possible, and it is most preferable that the first protein trap is provided so as to surround the nucleic acid in all the library units. .
(16) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to any one of (1) to (15), in any one or more library units, the protein that can be expressed by the nucleic acid is a target protein and the first protein. It is a fusion protein with a tag protein that can bind to one protein trap.
In the nucleic acid library according to this embodiment, the binding between the protein expressed from the nucleic acid and the protein capture body (first protein capture body) contained in the same library unit as the nucleic acid is ensured. “Target protein” means a protein to be analyzed.
When fusion proteins are expressed from a plurality of library units, the fusion proteins are preferably bound to the first protein capture body so that their orientations are the same. By making the direction of any fusion protein the same, the reactivity of the fusion protein can be made uniform and optimized.
(17) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to (16), the tag protein can bind to the second protein trap.
In the nucleic acid library according to this embodiment, even if the protein expressed from the nucleic acid is not captured by the protein capturing body (first protein capturing body) contained in the same library unit as the nucleic acid and dispersed in the liquid, The protein can be reliably captured by the protein capturing body (second protein capturing body) present in the liquid.
(18) In a preferred embodiment of the nucleic acid library according to any one of (1) to (17), in the library unit containing DNA as the nucleic acid, an mRNA trap is provided in the vicinity of the DNA. .
In the nucleic acid library according to this embodiment, in a library unit containing DNA as a nucleic acid, mRNA generated by transcription of the DNA is captured by an mRNA trap contained in the same library unit. Therefore, when the nucleic acid library according to this embodiment is subjected to an in vitro transcription / translation system, mRNA generated from the library unit containing DNA as a nucleic acid is dispersed in the solution of the in vitro transcription / translation system. Can be prevented. This prevents the protein produced by translation of the mRNA from being captured by protein capture bodies contained in other library units, and effectively prevents cross-contamination of proteins expressed in different types of library units. Can be prevented.
(19) In the protein library of the present invention, two or more types of library units possessed by the nucleic acid library according to any one of (1) to (18) above are used as an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system. It is obtained by subjecting the nucleic acid contained in the library unit to a single expression at a time.
Even if two or more types of library units possessed by the nucleic acid library of the present invention are subjected to an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system at once, cross-contamination of proteins expressed in different types of library units can be achieved. Therefore, a plurality of types of proteins are displayed on the solid support at a time in association with the nucleic acid encoding them. Therefore, according to the protein library of the present invention, it is possible to efficiently analyze a plurality of types of proteins in parallel.
Moreover, since the protein library of the present invention is immediately prepared by expressing the nucleic acid contained in each library unit of the nucleic acid library of the present invention, the plurality of types of proteins are immediately prepared after the supply of the plurality of types of proteins. Can be analyzed.
Furthermore, in the protein library of the present invention, even if the protein displayed on the solid support is denatured or deactivated, the protein can be easily regenerated by re-expressing the nucleic acid corresponding to the protein. it can.
Furthermore, the protein library of the present invention can be used repeatedly over a long period of time by storing it in the state of a nucleic acid library and regenerating the protein library when necessary.
(20) The method for producing a protein library of the present invention comprises two or more types of library units possessed by the nucleic acid library according to any one of (1) to (18) described above in an in vitro transcription / translation system or in vitro. The nucleic acid contained in the library unit is expressed at a time by being subjected to a translation system at a time.
In the method for producing a protein library of the present invention, the protein library of the present invention can be produced in a state in which cross-contamination of proteins expressed in different types of library units is prevented.
(21) In a preferred embodiment of the method for producing a protein library according to (20), a second protein capture body is mixed in the in vitro transcription / translation system or the in vitro translation system.
In the method for producing a protein library according to the present embodiment, proteins expressed from each library unit are not captured by the protein capture body (first protein capture body) included in the same library unit, and in vitro transcription / Even when dispersed in a solution of a translation system or an in vitro translation system, the protein capturer (second protein capturer) present in the solution captures the protein, so that the protein becomes another library unit. Can be prevented from being captured by the protein capture body (first protein capture body) contained in. Therefore, the protein library of the present invention can be prepared in a state in which cross-contamination of proteins expressed in different types of library units is effectively prevented.
(22) In a preferred embodiment of the method for producing a protein library according to (20) or (21), the nucleic acid is expressed at a time while inhibiting a transcription reaction in the in vitro transcription / translation system.
In the method for producing a protein library according to this embodiment, since a transcription reaction in an in vitro transcription / translation system is inhibited, excess mRNA is expressed from a library unit containing DNA as a nucleic acid, and the mRNA is in vitro transcribed. -Prevents dispersion in a translation system solution. Therefore, the protein library of the present invention can be prepared in a state in which cross-contamination of proteins expressed in different types of library units is effectively prevented.
(23) In a preferred embodiment of the method for producing a protein library according to (22), an RNA polymerase conjugate is mixed in the in vitro transcription / translation system to inhibit a transcription reaction in the in vitro transcription / translation system. .
In the method for producing a protein library according to this embodiment, the RNA polymerase contained in the in vitro transcription / translation system binds to the RNA polymerase conjugate, thereby inhibiting the transcription reaction in the library unit containing DNA as a nucleic acid. Therefore, excessive mRNA expression from the library unit can be effectively prevented.
(24) In a preferred embodiment of the method for producing a protein library according to (22) or (23), the temperature of the in vitro transcription / translation system is adjusted to inhibit the transcription reaction in the in vitro transcription / translation system. To do.
In the method for producing a protein library according to this embodiment, the temperature of an in vitro transcription / translation system is adjusted to reduce the reactivity of RNA polymerase contained in the in vitro transcription / translation system, whereby DNA is used as nucleic acid. Since the transcription reaction in the library unit containing is inhibited, the excessive mRNA expression from the library unit can be effectively prevented.
In addition, by adjusting the temperature of the in vitro transcription / translation system, there is a possibility that not only the transcription reaction but also the translation reaction may be inhibited. In that case, a large number of factors involved in the translation reaction are previously added in vitro. By containing it in the transcription / translation system, inhibition of the translation reaction can be prevented.
(25) A kit for preparing a protein library of the present invention comprises the nucleic acid library according to any one of (1) to (18) above and a second protein capturer or RNA polymerase conjugate. And
According to the kit for producing a protein library of the present invention, cross-contamination of proteins expressed in different types of library units can be effectively performed by the above-described effects of the second protein capture body or RNA polymerase conjugate. Thus, the protein library of the present invention can be prepared. The kit for preparing a protein library of the present invention can contain any element necessary for preparing a protein library, in addition to the nucleic acid library, the second protein capture body, and the RNA polymerase conjugate.
(26) The particle of the present invention is a particle in which a nucleic acid capable of expressing one or more proteins in an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system is immobilized on a surface at a high density, and one end of the nucleic acid is It is fixed on the surface of the particle, and a protein capturing body is provided at the other end of the nucleic acid.
On the outside of the particle of the present invention, a barrier of the protein trap is formed in close proximity to the nucleic acid on the particle, and the nucleic acid on the particle is surrounded by the protein trap. Even if the in vitro transcription / translation system or in vitro translation system is used at once, the protein expressed in each particle is captured by the protein trap on the same particle, and the cross-contamination of the protein expressed in each particle is performed. It can be effectively prevented. Therefore, the particle of the present invention is useful as a library unit constituting the nucleic acid library and protein library of the present invention.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The nucleic acid library of the present invention has two or more types of library units. Here, the difference in the type of library unit is determined by the difference in the type of protein expressed from the library unit. That is, library units that have a relationship of expressing one or more different proteins are different types of library units, and library units that have other relationships are the same type of library units. Therefore, “having two or more library units” means having a plurality of library units each capable of expressing at least one different protein. The nucleic acid library of the present invention may have a plurality of library units of the same type as long as it has two or more types of library units. The same type of library unit has the relationship that expresses only the same type of protein, as well as one that expresses a different type of protein, but the other does not express a different type of protein. (For example, one library unit expresses two types of proteins, protein A and protein B, and the other library unit expresses one type of protein, protein A). .
In the nucleic acid library of the present invention, different types of library units exist in a state of being separated from each other. Here, the distance between different types of library units is such that the protein expressed from the nucleic acid contained in each library unit is contained in the same library unit than the protein trap contained in the different type library unit. It is not particularly limited as long as it can be preferentially captured by the protein capture body, and the distance between the nucleic acid and the protein capture body contained in different types of library units is the same as that contained in the same library unit. It is set to be overwhelmingly larger than the distance to the catcher.
When the nucleic acid library of the present invention has a plurality of library units of the same type, the same type of library units may exist in a state of being separated from each other or may be present in a state of being close to each other. . When library units of the same type exist in close proximity, the protein expressed in each library unit may be captured by protein traps contained in different library units. If it is a rally unit, there is no problem of cross contamination.
In the nucleic acid library of the present invention, each library unit is provided on the surface of a solid support. Since the nucleic acid library of the present invention may be used in an aqueous medium (for example, when the nucleic acid library of the present invention is used in a cell-free transcription / translation system prepared from a cell extract) The solid support on which the unit is provided is preferably insoluble in water. Examples of the material for such a solid support include glass, silicon, ceramics, water-insoluble polymers (for example, polystyrene resins such as polystyrene, acrylic resins such as polymethyl methacrylate (methacrylic resins), polyamide resins, and polyesters such as polyethylene terephthalate. Synthetic resins such as polycarbonate; polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; proteins such as gelatin, collagen, and casein). The surface of the solid support may be a flat surface, a curved surface, or may have irregularities.
The solid support may be porous or nonporous, but is preferably porous. Examples of the porous solid support include fibers or aggregates thereof (for example, twisted fibers). If the solid support is porous, the library unit can be provided on the internal surface of the pores. Since the fluidity of the liquid (for example, in vitro transcription / translation system or in vitro translation system) is low in the pores of the solid support, it is included in the library unit provided on the internal surface of the pores of the solid support. The protein expressed from the nucleic acid is hardly released from the pores. Therefore, the protein can be reliably captured in the protein trap (first protein trap) contained in the same library unit, effectively preventing cross-contamination of proteins expressed in different types of library units. it can.
The shape of the solid support is not particularly limited. For example, the solid support can take any shape such as a flat plate shape, a particle (bead) shape, a rod shape, a string shape, a tape shape, and a thread shape. It is preferable that the shaft member has a shape that can be wound, or is in the form of particles (beads). Examples of shapes that can be wound around the shaft member include elongated shapes such as string, tape, and thread. The shape and structure of the shaft member are not particularly limited as long as the shaft member can be the center of the wound object, and examples thereof include rod-shaped, columnar, cylindrical, prismatic, and rectangular tube-shaped members. By using a solid support having a shape that can be wound around a shaft member, a nucleic acid library in which each library unit is arranged at a high density and a protein array in which proteins are arranged at a high density can be produced. In addition, by using a nucleic acid library in which a solid support is wound around a shaft member, it is possible to easily realize automation of a series of operations from preparation of a protein library to analysis of a protein using the protein library.
As an embodiment of a nucleic acid library having a shape in which a solid support can be wound around a shaft member, a
The solid support may have magnetism, and particularly preferably has magnetism when the solid support is in the form of particles. When magnetic particles are used as the solid support, the operability is improved, and automation of protein library production using the nucleic acid library of the present invention and protein analysis using the protein library can be easily realized. The shape of the “particle” is not particularly limited, but is, for example, a spherical shape. Further, the size of the particles is not particularly limited, but the particle size is preferably 0.2 to 30 μm.
In the nucleic acid library of the present invention, the “surface” of the solid support on which each library unit is provided means a surface that can come into contact with a liquid (for example, an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system solution). In addition to the outer surface (outer surface) of the solid support, the inner surface (inner surface) of the solid support that can be infiltrated with liquid (for example, the inner surface of the pores of the solid support) is also included.
The nucleic acid library of the present invention is an assembly of a plurality of library units. The collective form of the library units is not particularly limited, and all the library units are provided together on the surface of a single solid support (for example, a solid support having a shape that can be wound around a shaft member). Alternatively, the library units may be assembled in a state of being provided separately on the surfaces of a plurality of solid supports. Each library unit is provided separately on the surface of a plurality of solid supports (for example, particles) and dispersed in a liquid (for example, dispersed in a fixed volume of liquid contained in a container). You may gather at.
When each library unit is provided separately on the surface of a plurality of solid supports, the number of library units provided on each solid support may be one or plural. The types of library units provided in the body may be the same or different.
When different types of library units are provided on the surface of the same solid support, the different types of library units are provided so as to be separated from each other. In addition, when different types of library units are provided on separate solid supports, the solid supports are macroscopic compared to nucleic acid and protein capture bodies, so that different types of library units are separated from each other. Will exist.
In the nucleic acid library of the present invention, all library units may be provided on the surface of a single solid support, or different types of library units may be provided on the surfaces of separate solid supports. preferable.
When different types of library units are provided on the surface of a separate solid support, and there are multiple library units of the same type, the same type of library units are on the surface of the solid support together. It may be provided on the surface of a separate solid support.
In the nucleic acid library of the present invention, each library unit is preferably assembled in such a state that its type can be identified. By identifying the type of each library unit, it is also possible to identify the type of nucleic acid contained in each library unit and the type of protein expressed from the nucleic acid contained in each library unit. Can be done.
When all library units are provided on the surface of a single solid support, for example, by associating the position of each library unit on the solid support with the type of each library unit The type of each library unit can be identified based on the position of each library unit on the solid support.
In addition, when different types of library units are provided on the surfaces of separate solid supports, for example, by using solid supports that can be distinguished from each other, the type of each library unit is assigned to each live support. Identification can be made based on the type of solid support provided with the rally unit.
Furthermore, by labeling the components of different types of library units with different labeling substances, it is possible to identify the type of library unit based on the label of the library unit itself. As a component of the library unit that can be labeled with a labeling substance, for example, an in vitro transcription / translation system or a nucleic acid capable of expressing one or more proteins in an in vitro translation system, a first protein capture body, an mRNA capture body, Examples include an element for immobilizing the first protein capture body on a solid support (for example, an in vitro transcription / translation system or a nucleic acid that cannot express a protein in an in vitro translation system).
The solid support can be identified, for example, by labeling solid supports provided with different types of library units with different labeling substances. Specific examples of the labeling substance include fluorescent dyes (for example, Marine Blue, Cascade Blue, Cascade Yellow, Fluorescein, Rhodamine, Phycoerythrin, CyChrom, PerCP, Texas Red, AllyCycynein, PhyCyCyanin, PhyCyCyanin, PhyCyCyanin, PhyCyCyanin, PhyCyCyanin, PhyCyCyanin, PhyCyCyanin, PcC Fluorescent substances such as Cy dyes such as Cy5 and Cy7, Alexa dyes such as Alexa-488, Alexa-532, Alexa-546, Alexa-633 and Alexa-680, and BODIPY dyes such as BODIPY FL and BODIPY TR) , Radioisotopes (eg,3H,14C,32P,33P,35S,125And radioactive substances such as I). When a fluorescent dye is used as a labeling substance, a wide variety of labels can be achieved by combining the type and content of the fluorescent dye. The labeling of the solid support with a fluorescent dye is performed, for example, by reacting a solid support that has been previously introduced with an amino group with a fluorescent dye having an active ester, or with a carboxyl group or amino group on the surface in advance. A solid support into which a fluorescent group having a functional group (for example, an amino group) capable of binding to a carboxyl group or a functional group (for example, a carboxyl group) capable of binding to an amino group is present. It can be performed by reacting the fluorescent dye in the presence of carbodiimides such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC). When the solid support is a particle, for example, when a particle is synthesized by a polymerization reaction, a radical dye is added to the reaction solution or immediately after the completion of the polymerization reaction of radical polymerization. By adding a fluorescent dye that is reactive with the radicals while the residue remains, the particles can be labeled with the fluorescent dye.
In addition, the solid support can be identified by changing the shape and size of the solid support on which different types of library units are provided. For example, when the solid support is in the form of particles (beads), the solid support can be identified by making the particle diameters different. Identification of particles having different particle diameters can be performed using, for example, flow cytometry.
In addition, the solid support can be identified by changing the physical properties of the solid support provided with different types of library units. For example, the solid support can be identified based on the difference in magnetization when the magnets are brought close to each other.
Each library unit includes a nucleic acid capable of expressing one or more types of proteins in an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system, and a first protein trap provided in the vicinity of the nucleic acid. The nucleic acid contained in each library unit is fixed to the surface of the solid support provided with each library unit.
The nucleotides constituting the nucleic acid contained in each library unit may be deoxyribonucleotides or ribonucleotides. That is, the nucleic acid contained in each library unit may be either DNA or RNA, and “nucleic acid capable of expressing one or more proteins in an in vitro transcription / translation system” includes DNA and RNA. , “Nucleic acid capable of expressing one or more proteins in an in vitro translation system” includes RNA. In addition, the base length and base sequence of the nucleic acid are not particularly limited, and are appropriately selected so that the target protein can be expressed. When the nucleic acid is DNA, it may be immobilized in a double-stranded state or may be immobilized in a single-stranded state, but is preferably immobilized in a double-stranded state. . This is because transcription of DNA by polymerase is efficiently performed using double-stranded DNA as a substrate.
The number of nucleic acids contained in each library unit is not particularly limited, and a plurality of nucleic acids (nucleic acid group) may be contained. When each library unit includes a plurality of nucleic acids, the types of proteins that each nucleic acid can express may be the same or different. Since protein analysis can be performed efficiently when one type of protein to be analyzed is expressed from each library unit, the protein expressed from each nucleic acid contained in the same library unit must be the same type. However, for example, when the protein to be analyzed is composed of a plurality of different subunits, it is preferable to include nucleic acids that express each subunit in the same library unit.
In addition, when each library unit includes a plurality of nucleic acids capable of expressing the same type of protein, the structure of each nucleic acid may be the same or different. For example, nucleic acids having the same open reading frame but different transcription regulatory regions and translation regulatory regions may be included.
The nucleic acid contained in each library unit is preferably immobilized so that the nucleic acid is not detached from the solid support when the nucleic acid library of the present invention is used in an aqueous medium. As a method for immobilizing such a nucleic acid, for example, a method of covalently binding to a functional group on the surface of a solid support (Vera Land, Ruth Schmid, David Rickwood, Erik Hornes (1988). Nucleic Acids Res. 16 (22), 10861), a method using a biotin-avidin system (Shao-OchieHuang, Harold Swerlow, and Karin D. Caldwell (1994). Analytical Biochemistry 222, 441-119). In the former method, examples of the functional group on the surface of the solid support include a carboxyl group, an amino group, and a hydroxyl group. For example, when a carboxyl group is formed on the surface of the solid support, the carboxyl group is formed with a carbodiimide such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC). After activation, it can be preliminarily introduced into a nucleic acid and bound to an aminoalkyl group. Further, when an amino group is formed on the surface of the solid support, the amino group is converted into a carboxyl group using a cyclic acid anhydride such as succinic anhydride, and then the amino group previously introduced into the nucleic acid is used. It can be linked to an alkyl group or to the phosphate at the end of the nucleic acid. In the latter method, for example, a biotinylated nucleic acid is obtained by performing PCR using a primer that has been pre-biotinylated at the 5 ′ end, and this nucleic acid is coated with a solid having a surface coated with avidin (or streptavidin). Can be fixed to a support.
In each library unit, any part of the nucleic acid may be immobilized on the solid support, but it is preferred that the 3 'end or 5' end of the nucleic acid is immobilized on the solid support. Thereby, protein can be efficiently expressed from the nucleic acid contained in each library unit.
In each library unit, the “surface” of the solid support on which the nucleic acid is immobilized means a surface that can come into contact with a liquid (for example, an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system solution). As well as the outer surface (outer surface) of the solid support, the inner surface (inner surface) of the solid support into which liquid can infiltrate (for example, the inner surface of the pores of the solid support) is also included.
The nucleic acid contained in each library unit has a structure capable of expressing one or more kinds of proteins in an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system. Here, the “in vitro transcription / translation system” is an in vitro transcription system that can perform transcription from nucleic acid to mRNA in vitro, and an in vitro translation that can perform translation from mRNA to protein in vitro. The in vitro transcription / translation system includes all elements necessary for transcription and translation (for example, RNA polymerase, ribosome, tRNA, etc.). Specific examples of in vitro transcription / translation systems include cell-free transcription / translation systems prepared from eukaryotic and prokaryotic cell extracts. Examples of cell-free transcription / translation systems include E. coli (for example, Examples include cell-free transcription / translation systems prepared from cell extracts such as E. coli S30), wheat germ, rabbit reticulocyte, mouse L-cell, Ehrlich ascites tumor cell, HeLa cell, CHO cell, and budding yeast.
The structure of the nucleic acid contained in each library unit is not particularly limited as long as one or more proteins can be expressed in an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system. The nucleic acid capable of expressing one or more types of proteins in an in vitro transcription / translation system includes, for example, a transcriptional regulatory region, a translational regulatory region, and an open reading frame (ORF) encoding the target protein. In the open reading frame, DNA having a stop codon is provided on the 3 ′ side. Examples of nucleic acids capable of expressing one or more types of proteins in an in vitro translation system include, for example, DNA capable of expressing one or more types of proteins in an in vitro transcription / translation system, and thymine (T) is uracil (U). Except for the above, RNA having the same structure can be mentioned. However, in the case of RNA, a transcriptional regulatory region is not necessary.
Specific examples of transcriptional regulatory regions include promoters, terminators, enhancers and the like, and specific examples of translational regulatory regions include Kozak sequences and Shine-Dalgarno (SD) sequences. The transcriptional regulatory region and the translational regulatory region may be of any type as long as transcription from DNA to mRNA and translation from mRNA to protein are possible, and are appropriately selected according to the type of in vitro transcription system, etc. it can. Moreover, the transcriptional regulatory region and the translational regulatory region may exist as separate regions or may overlap and exist.
The number of open reading frames is not particularly limited, and one open reading frame may exist alone so that one type of protein is expressed, or multiple open reading frames of the same type are separated. It may exist in the state. Further, two or more types of open reading frames may be present in a separated state so that two or more types of proteins are expressed. Further, two or more types of open reading frames may be present in a linked state so that the fusion protein is expressed. The fusion protein is included in “one kind of protein”.
The specific structure of the nucleic acid contained in each library unit includes, for example, a structure having a promoter and an SD sequence on the 5 ′ side of the open reading frame and a stop codon and terminator on the 3 ′ side of the open reading frame. Can be mentioned.
The protein capturing body (first protein capturing body) contained in each library unit may be any as long as it can capture the protein. It is preferable that the protein capture body (first protein capture body) contained in each library unit can specifically capture the protein expressed from the nucleic acid contained in each library unit. Since different types of protein capture bodies are required for each type, it is difficult to construct the nucleic acid library of the present invention. Therefore, as the first protein capturing body, a protein capturing body capable of capturing any protein non-specifically is generally used. As the first protein capturing body, for example, a protein capturing body capable of capturing any protein non-specifically through a chemical bond, an electrical bond or a physical bond can be used. In addition, a physical obstacle that restricts the movement of the protein away from the library unit (that is, the protein can be held in the vicinity of the library unit) can also be used as the first protein trap. . In addition, the kind of 1st protein capture body and the capture mode of protein by the 1st protein capture body may be common in each library unit, and may differ.
For example, if the protein expressed from the nucleic acid contained in a library unit is a fusion protein of a target protein to be analyzed and a tag protein that can be chemically bound to the first protein trap, the first A protein trap can capture a protein (fusion protein) expressed through chemical binding. Examples of tag protein / protein capture body combinations include biotin-binding proteins / biotin such as avidin and streptavidin, maltose-binding protein / maltose, polyhistidine peptides / metal ions such as nickel and cobalt, glutathione-S-transferase / glutathione , Calmodulin / calmodulin binding peptide, ATP binding protein / ATP, receptor protein / ligand and the like.
In addition, since proteins are negatively charged at a pH higher than the isoelectric point and positively charged at a pH lower than the isoelectric point, by using a positively charged body or a negatively charged body as a first protein capturing body, Proteins can be captured using electrical coupling (electrostatic interaction) with the first protein capturer. As the positively charged body and the negatively charged body, for example, a substance having a positively charged group (for example, amino group, guanidyl group, imidazole group) or a substance having a negatively charged group (for example, carboxyl group, sulfonyl group, phosphate group) Can be used. In addition, a conductor connected to an electric circuit can be used as a positive charge body and a negative charge body.
In addition, by using a substance having a hydrophobic group such as an alkyl group or a derivative group thereof, a phenyl group or a derivative group thereof as the first protein capture body, hydrophobic interaction between the protein and the first protein capture body is achieved. It can be used to capture proteins.
In each library unit, the first protein capture body is provided close to the nucleic acid. The first protein capture body is provided so as to be sufficiently closer to the nucleic acids contained in the same library unit than the nucleic acids contained in different types of library units. As a result, the distance between the nucleic acid contained in different types of library units and the protein capture body is overwhelmingly larger than the distance between the nucleic acid contained in the same library unit and the protein capture body. Proteins expressed from the nucleic acids contained in are preferentially captured by the first protein trap contained in the same library unit, preventing cross-contamination of proteins expressed in different types of library units. The The first protein capture body is preferably provided as close as possible to the nucleic acids contained in the same library unit. For example, the first protein capture body may be a nucleic acid other than a nucleic acid whose one end is fixed to a solid support. Provided at the end. Thereby, the first protein capture body can be provided in close proximity to the nucleic acids contained in the same library unit.
The first protein trap may be directly immobilized on the surface of the solid support, or may be a nucleic acid capable of expressing one or more proteins in an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system (eg, nucleic acid The terminal may be fixed to the terminal opposite to the terminal fixed to the solid support). Also, other elements immobilized on the surface of the solid support (for example, sugar chains, nucleic acids that cannot express proteins in in vitro transcription / translation systems (for fixing the first protein capture body to the solid support) Nucleic acid)). By immobilizing the first protein capture body to other elements immobilized on the surface of the solid support, the expression level of the protein and the amount of the protein capture body can be easily adjusted.
The first protein capturer can be immobilized by various binding modes. Specific examples of binding modes include streptavidin or avidin-specific interaction of biotin, hydrophobic interaction, magnetic interaction, polar interaction, covalent bond (eg, amide bond, disulfide bond, thioether bond, etc.) Examples thereof include formation and crosslinking with a crosslinking agent. Appropriate chemical modification can be applied to the surface of the solid support, the first protein capturing body, and the like using a known technique so that fixation by these binding modes becomes possible. In addition to the specific interaction between streptavidin or avidin and biotin, maltose binding protein / maltose, polyhistidine peptide / metal ions such as nickel and cobalt, glutathione-S-transferase / glutathione, calmodulin / calmodulin binding peptide, ATP binding Specific interactions such as protein / ATP, nucleic acid / complementary nucleic acid, receptor protein / ligand, enzyme / substrate, antibody / antigen, IgG / protein A, etc. can be utilized.
In any one or more library units, the first protein capture body is preferably provided so as to surround the nucleic acid. In the library unit in which the first protein capture body is provided in this way, the protein expressed from the nucleic acid contained in the library unit is the protein capture body (first protein contained in the same library unit). (Capture body) is surely captured, so that cross-contamination of proteins expressed in different types of library units can be effectively prevented. It is preferable that the number of library units provided with the first protein capture body is as large as possible, and it is most preferable that the first protein capture body is provided in this way in all the library units.
When the solid support is a particle, one end of the nucleic acid is fixed on the surface of the particle, and the other end of the nucleic acid is provided with a protein capture body (first protein capture body), the nucleic acid has a high density. In this case, a barrier of the protein capturing body (first protein capturing body) is formed in the vicinity of the nucleic acid on the outside of the particle, and the nucleic acid on the particle is One protein trap). Therefore, if such particles are used as library units, cross-contamination of proteins expressed in different types of library units can be effectively prevented. Here, “high density” means a density at which a protein expressed from a nucleic acid immobilized on a particle does not pass (almost) does not pass through a barrier of a protein trap formed on the outside of the particle ( That is, the density is such that all or almost all of the protein expressed from the nucleic acid immobilized on the particle is captured by the protein capture body), the size of the protein expressed from the nucleic acid immobilized on the particle, etc. Can be adjusted appropriately according to, for example, the surface of the particle 1 μm2Per 103-106Molecular size, preferably 1 μm surface of particle2Per 105A good effect can be obtained by immobilizing a nucleic acid having a molecular weight.
Two or more types of library units possessed by the nucleic acid library of the present invention are subjected to an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system at a time, and nucleic acids contained in each library unit are in vitro transcription / translation system or in A protein library comprising a plurality of types of proteins can be obtained by expressing at once in a vitro translation system. At this time, as long as there are two or more types of library units to be expressed at a time, all the library units possessed by the nucleic acid library of the present invention may be used, or some live units possessed by the nucleic acid library of the present invention It may be a rally unit. Moreover, the nucleic acid contained in the library unit used for the in vitro transcription / translation system is usually DNA or RNA, and the nucleic acid contained in the library unit used for the in vitro translation system is usually RNA.
When nucleic acids contained in two or more types of library units are expressed at once, the protein traps contained in each library unit are more identical than the proteins expressed from the nucleic acids contained in different types of library units. Since the protein expressed from the nucleic acid contained in the library unit is preferentially captured, cross-contamination of proteins expressed in different types of library units is prevented.
When nucleic acids contained in two or more types of library units are expressed at a time, if mRNA generated by transcription of DNA contained in the library units is transferred to a solution in an in vitro transcription / translation system, The resulting protein may be captured by protein capture bodies contained in different types of library units, and cross-contamination of proteins expressed in different types of library units may occur. Therefore, in a library unit containing DNA as a nucleic acid, it is preferable that an mRNA capturing body capable of capturing mRNA generated by DNA transcription is provided close to the DNA. When the nucleic acid contained in the library unit is RNA, there is no possibility of protein cross-contamination due to mRNA generated by transcription of DNA.
The mRNA capturing body may be anything as long as it can capture mRNA. As the mRNA trap, for example, a nucleic acid (DNA or RNA) that can hybridize with mRNA can be used. At this time, the mRNA capture body may be capable of specifically hybridizing with mRNA generated by transcription of the nucleic acid contained in each library unit, but in that case, different mRNA captures for each type of library unit. It is difficult to construct the nucleic acid library of the present invention. Therefore, generally, an mRNA capturer that can capture any mRNA nonspecifically is used. For example, when mRNA generated by transcription of DNA contained in the library unit has a poly A sequence, an oligonucleotide having a poly T sequence can be used as an mRNA trap. By introducing a poly-T sequence into DNA contained in the library unit, it is possible to introduce a poly-A sequence into mRNA generated by transcription of the DNA. The mRNA capturing body may be directly fixed on the surface of the solid support, or DNA contained in the library unit (for example, the end of the DNA opposite to the end fixed to the solid support. ) May be fixed. Moreover, you may fix to the other member fixed to the surface of the solid support body.
In addition, when nucleic acids contained in two or more types of library units are expressed at once, the proteins expressed from the library units are converted into protein capture bodies (first protein capture bodies) contained in the same library unit. If the protein is not captured and dispersed in an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system solution, the protein is captured by a protein capturer (first protein capturer) contained in a different type of library unit. There is a possibility that cross-contamination of the protein expressed in the library unit may occur. Therefore, it is preferable to mix a second protein capture body separate from the first protein capture body in the solution of the in vitro transcription / translation system or the in vitro translation system. The type of the second protein trap may be the same as or different from the type of the first protein. In the nucleic acid library of the present invention, when the solid support (for example, particles) provided with each library unit is dispersed in a liquid, the second protein capture body is added to the liquid. Can be mixed. The second protein capture body may exist alone, but is preferably fixed to a solid support (for example, particles) so that it can be easily separated by post-treatment.
The second protein capturing body may be anything as long as the protein expressed from each library unit can be captured. As the second protein capturing body, generally, a protein capturing body capable of capturing any protein non-specifically is used. As the second protein capture body, a protein capture body that can capture any protein non-specifically through chemical bonds, electrical bonds, or physical bonds is used as in the case of the first protein capture body. it can. If the protein expressed from a library unit is a fusion protein of a target protein and a tag protein that can bind to the first protein capturer, the tag protein can also bind to the second protein capturer. It is preferable. Thereby, the fusion protein dispersed in the solution of the in vitro transcription / translation system or the in vitro translation system can be reliably captured by the second protein capturing body.
Further, when nucleic acids contained in two or more kinds of library units are expressed at a time, excessive mRNA is expressed from the DNA contained in the library units, and when it is transferred to a solution in an in vitro transcription / translation system, There is a possibility that the protein produced by the translation of the mRNA is captured by protein capture bodies contained in different types of library units, and cross-contamination of proteins expressed in different types of library units may occur. Therefore, in order to prevent the expression of excessive mRNA, it is preferable to express the nucleic acid at a time while inhibiting the transcription reaction in the in vitro transcription / translation system. However, since the protein cannot be expressed from each library unit when the transcription reaction is completely inhibited, the transcription reaction must not be completely inhibited. When the nucleic acid contained in the library unit is RNA, there is no risk of protein cross-contamination due to excessive mRNA expression.
Inhibition of the transcription reaction in the in vitro transcription / translation system can be carried out by quantitative inhibition or qualitative inhibition of RNA polymerase contained in the in vitro transcription / translation system.
“Quantitative inhibition of RNA polymerase” means to reduce the amount of RNA polymerase that can participate in a transcription reaction among RNA polymerases contained in an in vitro transcription / translation system. For example, in the in vitro transcription / translation system, By mixing an RNA polymerase conjugate, RNA polymerase can be quantitatively inhibited. The RNA polymerase conjugate may be anything as long as it can bind to RNA polymerase (reversible binding or irreversible binding). Examples of the RNA polymerase conjugate include an RNA polymerase binding site (for example, a promoter region). A nucleic acid or a solid support (for example, a particle) on which the nucleic acid is immobilized can be used.
In addition, “qualitative inhibition of RNA polymerase” means to reduce the reactivity of individual RNA polymerases contained in the in vitro transcription / translation system, for example, to regulate the temperature of the in vitro transcription / translation system. Thus, qualitative inhibition of RNA polymerase can be performed. The temperature of the in vitro transcription / translation system may be increased or decreased as long as the transcription reaction can be inhibited. When the temperature of the in vitro transcription / translation system is higher than the optimum temperature for the transcription reaction to inhibit the transcription reaction, the temperature of the in vitro transcription / translation system is usually 34-42 ° C., preferably 36-38 ° C. Adjusted. In addition, by adjusting the temperature of the in vitro transcription / translation system, there is a possibility that not only the transcription reaction but also the translation reaction may be inhibited. In that case, a large number of factors involved in the translation reaction are previously added in vitro. By containing it in the transcription / translation system, inhibition of the translation reaction can be prevented.
In the nucleic acid library of the present invention, when the particles provided with each library unit are dispersed in a liquid, the protein contained in each library unit is increased by increasing the distance between the particles. The capturing body can capture proteins expressed from nucleic acids contained in the same library unit with higher priority than proteins expressed from nucleic acids contained in different types of library units. Therefore, in order to increase the distance between the particles provided with each library unit, it is preferable to adjust the concentration of the particles dispersed in the liquid to a low concentration.
In addition, in order to increase the distance between the particles provided with each library unit, a nucleic acid capable of expressing a protein in an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system is fixed in a liquid in which the particles are dispersed. It is preferable to mix particles that are not used. By mixing such particles, the distance between the particles provided with each library unit can be increased, and the handling property of the particles is reduced when the particle concentration in the liquid becomes low. Can also be eliminated. A nucleic acid that cannot express a protein in an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system may be immobilized on the surface of the particles to be mixed. By immobilizing such nucleic acids on the surface of the particles to be mixed, proteins necessary for transcription / translation included in in vitro transcription / translation system or in vitro translation system and proteins expressed from each library unit can be obtained. Unexpected influence on the reaction system due to mixing of the particles such as nonspecific adsorption to the particles can be prevented.
When particles other than the particles provided with each library unit are mixed in the liquid, the particles can be separated by, for example, flow cytometry by setting the particle diameters different. In addition, by using particles having magnetism as the particles provided with each library unit and using particles having no magnetism as other particles to be mixed, the difference in magnetization when the magnets are brought close to each other Based on this, both particles can be separated.
In the nucleic acid library of the present invention, cross-contamination of proteins expressed in different types of library units is prevented even if nucleic acids contained in two or more types of library units are expressed at one time. The protein expressed from the nucleic acid contained in the rally unit is displayed (presented) in a state of being captured by the protein capture body (first protein capture body) contained in the same library unit. That is, in the protein library of the present invention, each type of protein is displayed on a solid support in a state where it is associated with a nucleic acid encoding it.
In the nucleic acid library of the present invention, when all library units are provided on the surface of a single solid support, the solid support is placed in a solution of an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system. Each type of protein is displayed on a single solid support. In the nucleic acid library of the present invention, when different types of library units are provided on the surfaces of separate solid supports and dispersed in a liquid, an in vitro transcription / translation system is provided in the liquid. Or, by adding elements of an in vitro translation system, different types of proteins are each displayed on a separate solid support. By using the protein library of the present invention thus prepared, a plurality of types of proteins can be analyzed efficiently in parallel. In addition, since the nucleic acid library of the present invention is immediately converted into a protein library when subjected to an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system, the protein supply and the protein assay system are integrated. The analysis of the plurality of types of proteins can be started immediately after the supply of the types of proteins.
Protein analysis using the protein library of the present invention can be performed, for example, as follows.
In the protein library of the present invention, when each type of protein is displayed on a single solid support, the solid support is separated from the solution of the in vitro transcription / translation system or the in vitro translation system. And washing to remove proteins and other contaminants derived from the in vitro transcription / translation system or the in vitro translation system. Thereafter, each type of protein displayed on the solid support is reacted with a labeled target substance (eg, protein, nucleic acid, carbohydrate, lipid, etc.). After the reaction, washing is performed to remove the unreacted target substance, and the label of the target substance is detected to detect whether or not each type of protein displayed on the solid support has reacted with the target substance. . The type of protein reacted with the target substance can be identified by the position where the protein is displayed. Moreover, the amino acid sequence of a protein can be identified by analyzing the base sequence of a nucleic acid associated with the protein.
In the protein library of the present invention, when different types of proteins are displayed on separate magnetic particles, and each magnetic particle is dispersed in an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system solution, After separating each magnetic particle from the solution of in vitro transcription / translation system or in vitro translation system by applying magnetic force, each magnetic particle is transferred to a washing solution and washed, and derived from the in vitro transcription / translation system or in vitro translation system Remove proteins and other contaminants. Thereafter, each magnetic particle is added to a solution containing a labeled target substance (eg, protein, nucleic acid, carbohydrate, lipid, etc.) and stirred well, and each type of protein displayed on each magnetic particle And reacting with a labeled target substance. After the reaction, a magnetic force is applied to separate each magnetic particle from the solution, and each magnetic particle is transferred to a washing solution and washed to remove the unreacted target substance. Thereafter, by detecting the label of the target substance, it is possible to detect whether or not each type of protein displayed on the magnetic particles has reacted with the target substance. The type of protein reacted with the target substance can be identified by the label of the magnetic particles provided with the protein. Moreover, the amino acid sequence of a protein can be identified by analyzing the base sequence of a nucleic acid associated with the protein.
In the protein library of the present invention, when different types of proteins are displayed on separate particles and each particle is dispersed in an in vitro transcription / translation system or an in vitro translation system solution, After each antibody reacts with an antibody labeled with a specific fluorescent dye corresponding to the type, the particles labeled with the fluorescent dye are separated by flow cytometry and immobilized on the separated particles. By analyzing the base sequence of the nucleic acid, the antigen bound to the antibody can be quickly identified.
When different types of proteins are displayed on separate particles in the protein library of the present invention, the properties of the proteins displayed on each particle are used to enrich the genes encoding the proteins. it can.
Even if the protein contained in the protein library of the present invention is denatured or deactivated during protein analysis, the protein is regenerated by re-expressing the nucleic acid contained in the library unit on which the protein is displayed. Is possible. In addition, after completion of protein analysis, it can be stored in the state of a nucleic acid library until the next use, and when necessary, the nucleic acid contained in each library unit can be expressed and the protein library can be regenerated and used. .
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples.
[Example 1]
(1) Preparation of DNA-immobilized beads for protein synthesis
The avidin gene (Thompson & Weber, Gene, 136, 243-246, 1993, see SEQ ID NO: 1) was labeled with two different types of tags, respectively. As the two types of tags, histidine (hereinafter referred to as “His”) and influenza hemagglutinin protein-derived HA peptide (hereinafter referred to as “HA”) were used.
Rapid Translation System RTS 100, E.I. In accordance with the protocol of E. coli HY Kit (manufactured by Roche), a T7 promoter and a ribosome binding site (RBS) are placed on the 5 ′ side of the His-tagged avidin gene and the HA-tagged avidin gene, and a T7 terminator is placed on the 3 ′ side. Introduced by. After cloning the PCR product into pGEM T easy vector (Promega) and confirming the base sequence, a biotin-labeled primer that specifically hybridizes upstream of the T7 promoter and SfiI that specifically hybridizes downstream of the T7 terminator A primer for site introduction was designed. These primers are shown in 17 bio-f, sfi-trm in FIG. 1 (A), or 11 bio-r, sfi-prm in FIG. 1 (B). 1C shows the structure upstream of the start codon of the avidin gene portion in the His-tagged avidin gene, and FIG. 1D shows the structure upstream of the start codon of the avidin gene portion in the HA-tagged avidin gene. E) shows the structure downstream of the stop codon of the avidin gene part in the His-tagged avidin gene and the HA-tagged avidin gene. The underlined portion in FIG. 1C indicates T7 promoter, g10 (RBS enhancer), RBS, ATG, and His in this order from the 5 ′ end side. The underlined portion in FIG. 1 (D) indicates T7 promoter, g10 (RBS enhancer), RBS, ATG, and HA in order from the 5 'end side. The underlined portion in FIG. 1 (E) indicates a T7 terminator. The bold portions in FIGS. 1A to 1E indicate sequences to which each primer specifically binds. For the sequence of the T7 promoter and the like, the expression vector pIVEX2.4a recommended by RTS100 was referred to.
Using the His-labeled avidin gene and the HA-labeled avidin gene as a template, PCR was performed using the above primers, and a DNA fragment having biotin (17 bio-f) on the 5 ′ side and SfiI site (sfi-trm) on the 3 ′ side was obtained. Produced. In addition, a DNA fragment having biotin (11 bio-r) on the 3 'side and an SfiI site (sfi-prm) on the 5' side was also prepared, and the protein was successfully expressed.
50 μL (about 1 μM) of each DNA fragment was purified with MicroSpin S-400 HR Columns (Amersham Pharmacia Biotech), cleaved with restriction enzyme SfiI (50 ° C., 1 hour 30 minutes), and 1 × BW buffer (1 hour 30 minutes) according to the protocol. Each DNA fragment (about 50 pmol) was obtained by biotin-avidin reaction using 0.2 mg Dynabeads M-280 Streptavidin (manufactured by Dynabiotech) washed with 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl). Was recovered (in 1 × BW buffer solution, 15 minutes at room temperature). As a result, beads having DNA fragments immobilized on the surface via biotin-avidin reaction were obtained.
Various beads were washed with 1 × BW buffer and then suspended in 1 × T4 DNA ligation buffer (manufactured by TAKARA) for ligation with an adapter.
On the other hand, synthetic oligo DNA phosphorylated on the 5 ′ side and synthetic oligo DNA having an appropriate sequence labeled with biotin on the 5 ′ side are mixed in equal amounts and annealed (from 85 ° C. to 4 ° C. over 1 hour 30 minutes) Cooling), a biotinylated adapter ligated with the SfiI site was prepared. FIG. 2 (A) shows the base sequence of the adapter. FIG. 2B schematically shows the state of ligation of the biotinylated adapter to the SfiI site.
A 0.2 mg bead to which a DNA fragment (about 50 pmol) cleaved with SfiI was bound and a biotinylated adapter (240 pmol) prepared by annealing a synthetic oligo DNA were lightly used at room temperature using TaKaRa T4 DNA ligase (525 units). Ligation was performed by mixing for 1 hour with mixing.
By the above operation, a template DNA having the 5 'end side immobilized on beads (0.2 mg) and the 3' end side having biotin was prepared. That is, beads with a DNA fragment encoding His-avidin immobilized on the surface (hereinafter referred to as “His-avidin beads”) and beads with a DNA fragment encoding HA-avidin immobilized on the surface (hereinafter “ Two types of beads, “HA-avidin beads”), were produced. The sequences of the DNA fragments held by these two kinds of beads are shown in SEQ ID NO: 2 for His-avidin and SEQ ID NO: 3 for HA-avidin. Each of these two types of beads was washed with 1 × BW buffer and then suspended in 40 μL of TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0).
Streptavidin-immobilized magnetic beads (particle size) having a size different from Dynabeads M-280 Streptavidin (particle size: 2.8 μm) as beads coexisting in protein synthesis from His-avidin beads or HA-avidin beads : 0.7 μm) (included in TOYOBO: MagExtractor-Sequencing Cleanup) was prepared beads in which double-stranded DNA was immobilized (hereinafter referred to as “sav beads”). Double-stranded DNA is annealed by mixing sav-comp shown in FIG. 1 (F) and sav-Biotin biotinylated on the 3 ′ side from 85 ° C. to 4 ° C. over 1 hour 30 minutes. It was prepared. The prepared double-stranded DNA (10 nmol) was immobilized on the surface of beads (2 mg) via biotin-avidin reaction in 1 × BW Buffer, washed with 1 × BW Buffer, and suspended in 400 μL of TE. The double-stranded DNA immobilized on the sav beads does not contain any sequences necessary for transcription and translation. By coexistence of sav beads, proteins required for transcription / translation included in in vitro transcription / translation system, or proteins synthesized from His-avidin beads or HA-avidin beads are non-specifically adsorbed to sav beads. There is a possibility that the reaction system may be affected unexpectedly, but this possibility can be obtained by immobilizing double-stranded DNA on the sav beads in the same manner as the His-avidin beads or HA-avidin beads. Can be reduced.
(2) Protein synthesis (in vitro transcription / translation)
Protein synthesis was performed by an in vitro transcription / translation system using the above-described DNA-immobilized beads for protein synthesis. A solution containing only His-avidin beads, a solution containing only HA-avidin beads, and a solution containing mixed beads of His-avidin beads and HA-avidin beads, each with a total amount of 10 μL of DNA on the beads as a template, A protein (a fusion protein of His and avidin or a fusion protein of HA and avidin) was synthesized by a reaction at 30 ° C. for 2 hours or 4 hours according to the protocol of RTS100. In addition, 45 μg of sav beads were added to any reaction solution.
(3) Detection and identification with fluorescently labeled antibodies
After washing various beads with 1 × BW buffer, PBS-T (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4・ 7H2O, 1.4 mM KH2PO4,0.05% Tween 20) + 5% skim milk solution was blocked for 1 hour with gentle mixing at room temperature. Next, after washing with PBS-T, primary and secondary antibody reactions were performed for 1 hour each while mixing gently at room temperature. As the primary antibody, 0.5 μg each of mouse-derived anti-His antibody (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and rabbit-derived anti-HA antibody (manufactured by Cosmo Bio) was diluted with 100 μL of PBS-T and used. After washing with PBS-T, 0.5 μg of Alexafluor488-labeled goat-derived anti-mouse IgG antibody (manufactured by Funakoshi) as a secondary antibody for fluorescently labeling the anti-His antibody was diluted to 100 μL of PBS-T and used. . After washing with PBS-T, measurement was performed with a flow cytometer (FACS Calibur (manufactured by Becton Dickinson)), excitation wavelength: 488 nm, and measurement wavelength: 530/30 nm.
The measurement results are shown in FIG. In FIG. 3, A represents a protein using a solution containing only His-avidin beads and a solution containing only HA-avidin beads as DNA-synthesizing beads for protein synthesis. It is a figure which shows the result at the time of measuring, B is expressing the protein using the solution containing the mixed bead of His-avidin beads and HA-avidin beads as DNA immobilization beads for protein synthesis, and measuring the above C is a diagram showing the results when the protein is expressed using a solution containing mixed beads of His-avidin beads and HA-avidin beads as DNA-immobilized beads for protein synthesis. Capture protein in solution by mixing agarose gel in solution It is a diagram showing the results of the.
As shown in FIGS. 3A and 3B, when the transcription / translation time was 2 hours, two types of beads having different fluorescence intensities were obtained. One of the two types of beads is considered to be a bead in which a fusion protein of His and avidin is captured, and the other is a bead in which a fusion protein of HA and avidin is captured. Considering the results of Example 3 described later, these two kinds of beads are considered to be His-avidin beads and HA-avidin beads, so that the fusion protein of His and avidin is captured by the His-avidin beads, It is thought that the fusion protein of HA and avidin was captured by HA-avidin beads.
Therefore, when the beads are dispersed in the liquid (that is, when the beads are separated from each other), the protein trap (biotin in this embodiment) immobilized on the beads is not separated from other beads. It is expressed from a DNA fragment fixed on the same bead rather than a protein expressed from the DNA fragment fixed above (in this example, a fusion protein of His and avidin or a fusion protein of HA and avidin). Proteins (in this example, His-avidin fusion protein or HA-avidin fusion protein) can be preferentially captured, thereby cross-linking proteins between beads to which different types of DNA fragments are immobilized. Contamination is considered to be prevented.
However, when the transcription / translation time was 4 hours, no clear bead separation was observed. This is considered to be because excess mRNA generated by transcription was released into the solution and translated due to the extension of the transcription / translation time. Therefore, it is considered that the protein cross-contamination can be prevented between beads to which different types of DNA fragments are immobilized by mixing a protein capturing body in a solution for transcription / translation. Actually, when the biotinylated agarose gel is mixed in the solution (FIG. 3C), clearer bead separation is observed than when the biotinylated agarose gel is not mixed (FIG. 3B).
Therefore, a protein capturer (this book) that can capture a protein expressed in various beads (in this example, a fusion protein of His and avidin or a fusion protein of HA and avidin) in a solution in which transcription / translation is performed. In the examples, biotinylated agarose gel) can be mixed to prevent protein cross-contamination between beads to which different types of DNA fragments are immobilized.
[Example 2]
(1) Preparation of DNA-immobilized beads for protein synthesis
In the same manner as in Example 1, DNA-immobilized beads for protein synthesis were produced.
(2) Protein synthesis (in vitro transcription / translation)
Protein synthesis was performed by an in vitro transcription / translation system using the above-described DNA-immobilized beads for protein synthesis. A solution containing only His-avidin beads, a solution containing only HA-avidin beads, and a solution containing mixed beads of His-avidin beads and HA-avidin beads, each with a total amount of 10 μL of DNA on the beads as a template, According to the protocol of RTS100, protein (His-avidin fusion protein or HA-avidin fusion protein) was synthesized by reaction at 30 ° C for 1 hour or 1 hour 15 minutes, or at 37 ° C for 1 hour 45 minutes. . In addition, 45 μg of sav beads were added to any reaction solution.
Further, in order to inhibit the transcription reaction by T7 RNA polymerase, 50 pmol of a DNA fragment (17mer, 60mer) (hereinafter referred to as “inhibiting DNA”) having a T7 promoter sequence was added. The nucleotide sequences of 17-mer and 60-mer inhibitory DNAs are shown in SEQ ID NOs: 4 and 5, respectively.
(3) Detection and identification with fluorescently labeled antibodies
After washing various beads with 1 × BW buffer, PBS-T (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4・ 7H2O, 1.4 mM KH2PO4,0.05% Tween 20) + 5% skim milk solution was blocked for 1 hour with gentle mixing at room temperature. Next, after washing with PBS-T, primary and secondary antibody reactions were performed for 1 hour each while mixing gently at room temperature. As a primary antibody, a mouse-derived monoclonal anti-HA antibody (manufactured by Molecular Probes) labeled with Alexafluor 488 and a rabbit-derived anti-His antibody (manufactured by Cosmo Bio) were used, and phycoerythrin ( A goat-derived anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Funakoshi) labeled with PE) was used. In the case of the primary antibody, 0.5 μg of each antibody was diluted to 100 μL of PBS-T, and in the case of the secondary antibody, 2 μg was diluted to 100 μL of PBS-T. After binding of each antibody, it was washed with PBS-T. Measurement was performed with a flow cytometer (FACS Calibur (Becton Dickinson)), excitation wavelength: 488 nm, measurement wavelengths: 530/30 nm and 585/45 nm.
The measurement results are shown in FIGS.
In FIG. 4, “controls” (A and C) are expressed by using a solution containing only His-avidin beads and a solution containing only HA-avidin beads, and then mixing and measuring the above. The “mix” (B and D) shows the results when the protein was expressed using a solution containing mixed beads of His-avidin beads and HA-avidin beads and the above measurement was performed. Results are shown. The transcription and translation conditions for A and B are 1 hour at 30 ° C., and the transcription and translation conditions for C and D are 1 hour 45 minutes at 37 ° C.
In FIG. 5, “controls” (A and E) are expressed by using a solution containing only His-avidin beads and a solution containing only HA-avidin beads, and then mixing and measuring the above. In the presence of inhibitory DNA (B and F), “in the presence of 17mer inhibitory DNA” (C and G), and “in the presence of 60mer inhibitory DNA” (D and H) are His -A protein is expressed using a solution containing mixed beads of avidin beads and HA-avidin beads (no inhibitory DNA added, 17-mer inhibitory DNA added, 60-mer inhibitory DNA added), and the results when the above measurement is performed are shown. The transcription / translation conditions for A, B, C and D are 1 hour 15 minutes at 30 ° C., and the transcription / translation time for E, F, G and H is 1 hour 45 minutes at 37 ° C.
As shown in FIGS. 4B and 4D, the amount of translation product seems to be slightly decreased at 30 ° C. than at 30 ° C., but clearer bead separation was observed at 37 ° C. than at 30 ° C. Also, as shown in FIG. 5B, no clear bead separation was observed in the absence of inhibitory DNA, but at 37 ° C. in the presence of 17mer inhibitory DNA, as shown in FIGS. As shown in H, clear bead separation was observed at 30 ° C. in the presence of 60-mer inhibitory DNA.
Clear bead separation indicates that two types of beads were obtained, a bead in which the fusion protein of His and avidin was captured and a bead in which the fusion protein of HA and avidin was captured, and inhibiting DNA Since both the presence of protein and the increase in reaction temperature are factors that inhibit the transcription reaction, it is considered that the cross-contamination of proteins between beads can be prevented by inhibiting the transcription reaction in the in vitro transcription / translation system. It is done.
As shown in FIG. 5H, no clear bead separation was observed at 37 ° C. in the presence of 60-mer inhibitory DNA, but the addition of inhibitory DNA and the reaction temperature of 37 ° C. both reduced the amount of protein translation. From this, it is assumed that almost no protein is produced under this condition, and that the bead does not move from the origin.
Example 3
Two kinds of beads separated by flow cytometry in Example 2 (beads in which a fusion protein of His and avidin was captured and beads in which a fusion protein of HA and avidin was captured) were His-avidin beads and HA. -In order to confirm that it was an avidin bead, the bead of the area | region enclosed with the dotted line of FIG. 4B and D and FIG. 5D was fractionated. In FIG. 4B and FIG. 4D and FIG. 5D, the region expected to contain the His-avidin beads is indicated as “His”, and the region expected to contain the HA-avidin beads is indicated as “HA”.
About the bead fractionated above, the kind of DNA immobilized on the surface was identified using PCR. The positions where the primers were designed are shown in FIG.
First, amplification was performed using the beads collected above as a template and using primers for 1st PCR. The base sequences of the upstream and downstream primers used in the 1st PCR are shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively. Next, amplification was performed using the 1st PCR product as a template and primers for 2nd PCR. In 2nd PCR, a mixture of two types of primers (Cy5-His and FITC-HA) labeled with Cy5 or FITC is used as an upstream primer, and a biotin-labeled primer is commonly used as a downstream primer. It was. The base sequences of primers Cy5-His and FITC-HA are shown in SEQ ID NOs: 8 and 9, respectively, and the base sequences of biotin-labeled primers are shown in SEQ ID NO: 10.
When the DNA fragment on the bead has a base sequence encoding the HA tag by the PCR, the DNA fragment labeled with FITC and biotin is amplified, and the DNA fragment on the bead has the His tag. In the case of having a base sequence encoding, a DNA fragment labeled with Cy5 and biotin is amplified. Therefore, by capturing the DNA fragment amplified by 2nd PCR with avidin magnetic beads and measuring the fluorescence intensity of the fluorescent dye (FITC or Cy5) captured on the magnetic beads, the DNA fragment used as the template in 1st PCR Can be specified.
The measurement results of the fluorescence intensity are shown in Tables 1 and 2.
As shown in Table 2, beads expected to be His-avidin beads had a small ratio of FITC / Cy5, and beads expected to be HA-avidin beads had a large ratio of FITC / Cy5. Therefore, it was confirmed that the two types of beads separated by flow cytometry in Example 2 were His-avidin beads and HA-avidin beads.
From the above results, it was confirmed that the fusion protein of His and avidin was captured by His-avidin beads, and the fusion protein of HA and avidin was captured by HA-avidin beads.
Industrial applicability
According to the present invention, it is possible to supply a plurality of types of proteins at once in association with the nucleic acid that encodes them. Nucleic acid libraries and protein libraries that can easily regenerate activated proteins and methods for producing protein libraries are provided. The present invention also provides particles useful as library units that constitute such nucleic acid libraries and protein libraries.
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 (A) shows the base sequences of PCR primers for introducing the biotin on the 5 ′ side and the SfiI site on the 3 ′ side for the His-tagged and HA-tagged avidin genes, and FIG. Regarding the labeled and HA-labeled avidin genes, the base sequences of PCR primers for introducing the SifI site on the 5 ′ side and biotin on the 3 ′ side are shown in FIG. 1 (C). FIG. 1D shows the structure upstream of the start codon, FIG. 1D shows the structure upstream of the start codon of the avidin gene portion in the HA-tagged avidin gene, and FIG. 1E shows the avidin gene portion in the His-tagged avidin gene and the HA-tagged avidin gene. FIG. 1 (F) shows a double-stranded DN immobilized on a sav bead having a particle size of 0.7 μm. It is a diagram showing a structure of oligo DNA used in the preparation.
FIG. 2 (A) is a diagram schematically showing the base sequence of the adapter, and FIG. 2 (B) is a diagram schematically showing the state of ligation of the biotinylated adapter to the SfiI site.
Fig. 3 shows the results of separation of beads by flow cytometry after using beads immobilized with different types of DNA fragments in an in vitro transcription / translation system with or without mixing (2 or 4 hours). It is.
Figure 4 shows the flow site after mixing beads with different types of DNA fragments immobilized or subjected to an in vitro transcription / translation system (1 hour at 30 ° C or 1 hour 45 minutes at 37 ° C). It is the result of separating the beads by measurement.
FIG. 5 shows an in vitro transcription / translation system in the presence or absence of a DNA fragment having a T7 promoter sequence (17mer, 60mer) with or without mixing beads having different types of DNA fragments immobilized thereon. It is the result of separating the beads by flow cytometry after being applied (30 ° C. for 1 hour 15 minutes or 37 ° C. for 1 hour 45 minutes).
FIG. 6 is a diagram showing the hybridization positions of primers used in PCR (first and second rounds) when specifying the type of DNA fragment immobilized on the bead surface.
FIG. 7 is a perspective view showing an embodiment of a nucleic acid library in which a string-like solid support is wound around a cylindrical shaft member.
Claims (26)
各ライブラリーユニットが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸と、前記核酸に近接して設けられた第一のタンパク質捕獲体とを含んで構成されており、
各ライブラリーユニットが、固体支持体の表面に設けられ、各ライブラリーユニットに含まれる核酸が、各ライブラリーユニットが設けられた固体支持体の表面に固定されていることを特徴とする前記核酸ライブラリー。A nucleic acid library having two or more types of library units that exist in a state of being separated from each other,
Each library unit includes a nucleic acid capable of expressing one or more types of proteins in an in vitro transcription / translation system or in vitro translation system, and a first protein trap provided in the vicinity of the nucleic acid. Has been
Each library unit is provided on the surface of a solid support, and the nucleic acid contained in each library unit is fixed on the surface of the solid support provided with each library unit. Library.
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