JPS6381260A

JPS6381260A - 定量方法および定量装置

Info

Publication number: JPS6381260A
Application number: JP61225594A
Authority: JP
Inventors: Michio Kawada; 川田　倫夫; Takashi Kawasaki; 隆志川崎
Original assignee: Nitto Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1986-09-24
Filing date: 1986-09-24
Publication date: 1988-04-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は２例えば、血液・尿等の体液に含まれる生体成
分の定量方法あるいは酵素の活性測定方法、およびその
定量に使用される定量装置に関し。

特に測定精度の高い定量方法および定量装置に関する。

（従来の技術）血液・尿等の体液に含まれる生体成分の定量には、従来
、ディスクリート方式等の自動定量分析装置が用いられ
ている。このディスクリート方式の自動定量分析装置は
、化学試薬や酵素等を用いて１検体ごとに１本の試験管
内で反応から検出まで行い、最終的に分光光度計にて比
色して定量するものであり、多くの検体の多項目の分析
を同時に処理することができるという長所を有する。し
かし、この装置は、使用前のウオーミングアツプに長時
間を要し、使用後には洗浄が必要であるという短所を有
する。サンプル数が少ないときにも使用が不便である。

また、検査後の溶液の処理には環境汚染上の問題もある
。

また、尿成分等の検査用として、スティックタイプの試
薬も開発されている。この試薬は操作が容易ではあるが
、定量性にかけるという欠点がある。

近時２例えば電極の先端部に半透膜を設置し。

その半透膜に酵素を固定化し、試料溶液にこの固定化さ
れた酵素を浸漬させて酵素反応させ、その溶液内に存在
する試料物質量に応じて生じる。あるいは減少する過酸
化水素や酸素を測定し、あるいはｐＨ濃度の変化を捉え
て定量分析する方法も開発されている。この方法では、
半透膜等に酵素を固定化せねばならず、固定化された酵
素の安定性は、その種類と処理方法により異なるが９通
常。

１週間〜１ケ月程度であり、酵素の活性の低下が測定精
度の低下に繋がる。また、半透膜の近傍では酵素反応に
より試料物質および酵素などの濃度の低下を招くため、
試料溶液を常に攪拌することが必要になる。このような
方法により、定量分析し得る生体成分としては、グルコ
ース、尿素、コレステロース等が挙げられる。電極は溶
液内に挿入しなければならず、そのため、１つの試料の
測定後に電極を洗浄する必要がある。測定終了後の溶液
の処理にも環境汚染上問題がある。

さらに、測定後の廃液処理の問題を解決することができ
る定量分析方法として、多層分析素子を用いた方法があ
る。多層分析素子とは、生体内の特定成分を、乾式で迅
速かつ簡便に定量する材料であり、支持体、試薬層９反
射層、展開層を順に積層したものである。そして、この
多層分析素子に試料を点着し、その色変化または濃度変
化を肉眼判定あるいは反射測光することにより、試料中
の被検査成分が定量分析できる。この方法は、操作が簡
単であって短時間で測定でき、しかも試料を点着させる
だけでよいために、試料溶液が微量ですみ、溶液の処理
が不要になる等の利点がある。

しかし、多層分析素子として各層を積層するときに高精
度を要するために生産性が悪く、さらには反射光にて測
定する場合はダイナミックレンジが十分ではないという
欠点もある。

（発明が解決しようとする問題点）本発明は、上記従来技術の問題点を解決するものであり
、その目的は、迅速かつ簡便に定量が行なえる定量方法
および定量装置を提供することにある。本発明の他の目
的は、測定精度の高い定量方法および定量装置を提供す
ることにある。本発明のさらに他の目的は、測定後の溶
液の処理が不要であり、環境汚染を起こすおそれのない
定量方法および定量装置を提供することにある。

（問題点を解決するための手段）本発明の定量方法は、塩橋を介して参照電極に接続され
た陽極と、陰極との間に、試料物質を酵素反応させるこ
とにより生成される過酸化水素を含浸した吸水性部材を
介装して、該吸水性部材に電圧を印加し、過酸化水素の
電気分解により生ずる電流値に基づいて過酸化水素を定
量することにより試料物質を定量してなり、そのことに
より上記目的が達成される。

また、この定量方法に使用される装置は、塩橋を介して
参照電極に接続された陽極と、陰極との間に、試料物質
を酵素反応させることにより生成される過酸化水素を含
浸した吸水性部材を介装し　′てなり、該吸水性部材に
所定の電圧を印加して過酸化水素の電気分解により生ず
る電流値に基づいて過酸化水素を定量するためのもので
あり、そのことにより上記目的が達成される。

（原理）本発明の定量方法の原理について説明する。

生体成分内に電解質または過酸化水素が存在すれば、電
圧を印加すると、電流が流れる。電解質は２分極作用に
より電流が流れることに貢献するが、その分極作用は極
めてすみやかに終了し１通常約１■の電圧をかけたとき
は数秒で終了する。

過酸化水素は、以下に示す原理により電極反応が生じ電
流が流れる。

陽極：ｆｌｚＯｚ　　→　２８”　＋　０２　＋　２ｅ
−陰極：　２８”　＋　１／２０ｇ　＋　２ｅ−−８２
０全体の反応：Ｈ２０□　→　ＩｂＯ＋　１／２０□こ
の反応は数十秒〜数分間継続し、その間、電流が流れる
。

第１図に０．５ｍＭの過酸化水素め電気分解による電流
値の経時変化を示す。第１図に示すように時間の経過に
伴って１通流する電流値は低下する。

しかし、所定時間後の過酸化水素量と電流値は略比例関
係にある。したがって、電気分解による所定時間後の電
流値から過酸化水素を定量することができる。この場合
、過酸化水素を定量する方法としては、単に所定時間後
の電流値を読み取ることから求めることも可能であり、
また所定時間の電流値の積分値を計算することによって
も可能である。従って、電流値の経時変化を記録して計
算することも可能であるが、コンピューターにプログラ
ム化しておいて自動的に計算することも可能である。

通常、生体成分内には過酸化水素はほとんど存在しない
が、生体成分の多くの化学物質は、酵素反応により定量
的に過酸化水素を生成せしめることができる。例えば。

このように、グルコース１モルに対して、過酸化水素１
モルが生成するため、過酸化水素を定量すればグルコー
スが定量できる。

また、酵素反応により生成した過酸化水素を定量するこ
とにより酵素の活性が測定できる。つまり、所定の化学
物質と活性測定すべき酵素とを反応させて過酸化水素を
生成せしめ、その過酸化水素に電圧を印加して２通流す
る電流値から過酸化水素を定量し、その定量値に基づい
て酵素の活性が測定されうる。

酵素反応により過酸化水素が生成される生体成分は次の
とおりである。ただし、（）内は過酸化水素を生成し得
る酵素名であり、２種以上の酵素名は複合酵素系である
ことを示す。グルコース（グルコースオキシダーゼ）、
シュクロース（インベルターゼ・ムタローゼ・グルコー
スオキシダーゼ）、マルトース（グルコアミラーゼ・グ
ルコースオキシダーゼ）、ガラクトース（ガラクトース
オキシダーゼ）、エタノール（アルコールオキシダーゼ
）、乳酸（乳酸オキシダーゼ）、ピルビン酸（ピルビン
酸オキシダーゼ）、尿酸（ウリカーゼ）、フェニルアラ
ニン（Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ）、グルタミン酸（Ｌ
−アミノ酸オキシダーゼ）、アミン（アミンオキシダー
ゼ）、クレアチニン（クレアチナーゼ・サルコシンオキ
シダーゼ）、ビリルビン（ビリルビンオキシダーゼ）。

コレステロール（コレステロールオキシダーゼ）。

リン脂質（ホスホリパーゼＤ・コリンオキシダーゼ）、
遊離脂肪酸（アシルＣｏＡシンターゼ・アシルＣｏＡオ
キシダーゼ）、トリグセリド（リボプロティンリパーゼ
・グリセロールオキシダーゼ）。

尿素（ウレアーゼ・グルタミン酸オキシダーゼ）。

リン酸イオン（アルカリホスファターゼ・グルコースオ
キシダーゼ）。

本発明は、このように、定置すべき試料物質を酵素反応
させることにより過酸化水素を生成せしめ、生成された
過酸化水素の電気分解により通流する電流値が、過酸化
水素量に略比例するということに基づいてこの試料物質
中の被定量成分（例えば、生体成分）を定量するもので
ある。特に。

吸水性部材に酵素反応により生成された過酸化水素を含
ませた状態で、該吸水性部材に電圧を印加して電気分解
を起こし、その電流値に基づいて試料物質中の被定量成
分を定量することに特徴を有している。特に、吸水性部
材と参照電極とを塩橋を介して接続することにより、参
照電極が酵素反応の影響を受けず、測定精度が向上する
。

酵素反応により生成された過酸化水素を含浸する吸水性
部材に、電極を接触させて電圧を印加すれば、酵素等の
高分子成分、イオン等の影響により１通流する電流値が
一定しないおそれがある。

本発明は、このような影響を極力抑制すべく、吸水性部
材に電圧を印加する陽極と参照電極とを塩橋を介して接
続したものである。

（実施例）以下に本発明の実施例について説明する。

本発明に係る生体成分の定量方法は９例えば。

第２図に示す定量装置１により実施される。該定量装置
１は、定量用素子ＩＯと、該定量用素子１０に所定の電
圧を印加する電圧印加装置２０とを具備する。定量用素
子１０は、矩形状の電極１３と、該電極１３の上面に設
けられた円盤状の吸水性部材１２と。

該吸水性部材１２の上面に同心状に設けられ円盤状の電
極１１とを有する。電圧印加装置２０は、電極１１が陽
極、他方の電極１３が陰極となるように電圧を印加する
。

吸水性部材１２は両電極１１．１３に密着している。

吸水性部材１２は、吸水性材質にて構成される。吸水性
部材１２内には９例えば、所定の酵素が予め含浸されて
いる。酵素の含浸は、緩衝液に酵素を溶解させた酵素溶
液内に、吸水性部材１２を浸漬して乾燥させることによ
り達成される。含浸される酵素は、定置すべき生体成分
から酵素反応により過酸化水素を導き得るものである。

吸水性部材１２には、塩橋１４および電解質溶液１５を
介して、参照（比較）電極２７が接続されている。

このように、参照電極２７と吸水性部材１２との間に。

塩橋１４および電解質溶液１５を設けることにより。

参照電極２７が吸水性部材１２で起こる酵素反応の影響
を受けない、従って、電流値の測定精度が向上する。参
照電極２７は電解質溶液１５を介さず、直接塩橋１４と
接続されてもよい。しかし、電解質溶液１５を設けた方
が、より測定精度が高くなる。

塩橋としては１例えば、寒天、アクリルアミドなどの親
水性高分子を用いた含水ゲルが使用される。このゲルは
９強度を増すべく、不織布などに塗布されてもよい。ゲ
ルは、チューブなどに入れて使用されてもかまわない。

電解質溶液には２例えば、飽和塩化カリウム溶液がある
。

各電極１１および１３としては９例えば金属電極が使用
される。陽極となる電極１１は１例えば、１ｍｍの厚さ
の白金（Ｐｔ）が用いられ、陰極となる電極１３は２例
えば、プラスチックフィルム等のフィルム状部材に銀（
Ａｇ）を０．０３＃ｍ　〜０．１０μｍの厚さに蒸着し
て被覆したものが用いられる。

各電極１１．１３の材料としては、金（Ａｕ）　、ニッ
ケル（Ｎｉ）　、白金（Ｐｔ）　、鉛（Ｐｂ）　、酸化
鉛（ＰｂＯ□）。

！Ｉ（Ａｇ）　、チタン（Ｔｉ）等１通常、金属電極と
して使用し得るものすべてが使用可能である。好ましく
は、　Ａｕ、　Ｐｔ＋　Ａｇ等のように電気化学的に安
定なものがよい。また、同一の材料を陽極、陰極として
用いることも可能である。電極の厚さは９通電可能であ
れば、どのような値でもよい。

吸水性部材１２としては、検査されるべき生体の試料溶
液を一定量吸収し得る必要があり２例えばメンブランフ
ィルタ−９不織布、濾紙等が用いられる。吸水性部材１
２の材質としては、再生セルロース、ニトロセルロース
、酢酸セルロース等のセルロース系材料；ポリアミド、
フッ素樹脂、ポリエステル系、ポリビニルアルコール系
などの合成繊維が使用され得る。吸水性部材１２の厚さ
は、好ましくは０．１〜３鶴程度であるが、この厚さに
は限定されず、過酸化水素量と電流値との関係が略比例
状態になる厚さであればよい。

電圧印加装置２０は、各電極１１．１３に一定の電圧を
印加するポテンシオスタット２６を有する。電極１１は
陽極に接続され、電極１３は陰極に接続されている。ま
た、ポテンシオスタット２６には参照電極２７が接続さ
れており、該参照電極２７は、電解質溶液１５（例えば
、飽和塩化カリウム溶液）に浸漬されている。

ポテンシオスタット２６には、吸水性部材１２を通流す
る電流値を測定するための電流計２８が接続されており
、電流計２８にはその電流値を時間とともに記録する記
録計２９が接続されている。

参照電極２７としては９通常用いられる銀−塩化銀電極
あるいは飽和甘こう電極が使用できる。実用的には、参
照電極の先はできるだけ細くすることが好ましい。

両電極１１・１３間に印加される電圧は、電流値を計測
する必要があることから、一定である必要があり１本実
施例では、ポテンシオスタット２６を用いて１両電極１
１−１３間に一定の電圧を印加するようにしている。電
圧値は、過酸化水素の電気分解が可能であり水の電気分
解が酵素の測定に影響を与えない範囲である必要がある
。この電圧値は。

電極に用いる金属の種類により異なるが１通常０．５〜
１．５ｖ程度である。

第３図は定量用素子１０の他の実施例を示し、電極１１
°、１３“を円盤状とし１両者の間に、同様の円盤状を
した吸水性部材１２′を密着介装させたものである。吸
水性部材１２°には塩１１４′が接続されている。

斯かる構成の定量装置の作用は次のとおりである。まず
、定量用素子１０の両電極１１・１３間に介装された吸
水性部材１２に、試料溶液を含浸さそる。

含浸された試料溶液は、′＠、、水性部材１２に予め含
浸された酵素と反応して過酸化水素を発生する０次いで
５両電極１１・１３間に、ポテンシオスタット２６によ
り所定の電圧を印加すると過酸化水素は電気分解により
電流が通流し、その電流値は電流計２８にて測定され、
記録計２９にて記録される。そして。

電圧印加から所定時間後の電流値に基づいて試料溶液中
の生体成分が定量される。

なお９本発明方法は、吸水性部材１２に生体成分から酵
素反応により過酸化水素を生成せしめる酵素を予め含浸
させ、該吸水性部材１２にて酵素反応を起こさせて過酸
化水素を発生せしめるという工程にのみ限定されること
はなく、試料溶液と酵素とを予め反応させて過酸化水素
を生成せしめ、生成された過酸化水素を定量時に吸水性
部材１２に含浸させて所定の電圧を印加し、その電流値
に基づいて過酸化水素を定量することにより生体成分を
定量することも可能である。

第２図に示す定量装置１を用いて過酸化水素を定量した
結果を第４図に示す。参照電極２７を電解質溶液１５を
介さず直接塩橋１４に接続して同様に過酸化水素を定量
した結果を第５図に、そして塩橋１４や電解質溶液１５
を用いず、参照電極２７を直接吸水性部材に接続した結
果を第６図に示す。図においてＣＶは変動係数（測定値
のバラツキ度合を示す）であり９次式で表される：又ここで、δｎは標準偏差、５！は平均値そしてｎは検体
数である。

第４図〜第６図には、各過酸化水素濃度に対し。

１０回（ｎ＝１０）測定した時のＣＶ値を示す。

定量用素子１０における吸水性部材１２として、濾紙（
！に５ｃ、　　φ１４鶴、厚さ２５０μｍ）を用いた。

過酸化水素の標準液は０．８％ＮａＣ１で希釈して用い
た。ポテンシオスタット２６にて印加される電圧は。

水の電気分解を最小限に抑えるために、　０．６４Ｖを
用いた（この場合、０．７Ｖ以上では水の電解が起こる
）。濾紙に過酸化水素の標準液５０μｌを含浸させ、　
０．６４Ｖの電圧を印加し、２０秒後の電流値を読み取
った。

第４図〜第６図から明らかなように、電極１１（陽極）
と参照電極２７とを、塩橋１４および電解質溶液１５を
介して接続した本発明の定量装置を用いれば、ＣＶ＝１
〜２％と測定値のバラツキが少ない。

参照電極２７を塩橋１４に直接接続すれば、ＣＶ＝７〜
８％となり、バラツキが生じる。塩橋を用いず。

参照電極２７を吸水性部材１２に接続すれば、　ＣＶ＝
１０〜１５％とバラツキが大きい。しかも、塩橋を用い
ないと、検量線が原点を通過しない（第６図）。

塩橋を用いた方法では、検量線が原点を通過するため、
電流値の計算が容易に行われる（第４図および第５図）
、第６図には、生体成分として、乳酸、グルコースおよ
びコレステロールの生体内における濃度を示す。

（発明の効果）本発明によれば、このように、電極により過酸化水素の
定量測定を行う際に、陽極と参照電極とを塩橋を介して
配置するために、測定精度が著しく向上する。塩橋と参
照電極とを電解質溶液で接続すれば、測定精度がさらに
高くなる。検量線は原点を通過することから、電流値の
計算も容易となる。また、電極を試料溶液内に浸すこと
なく電気分解を生じせしめることができるので、電極の
洗浄が不要になる。試料溶液の量は、少な（とも電極間
に挟まれた吸水性部材の部分に溶液が存在して電気分解
が生ずればよいので、非常に微量でよく、測定後の溶液
の処理という問題は起こらず。

したがってその溶液による環境汚染のおそれもない。溶
液量が多すぎても吸水性部材に吸水されて拡散するだけ
なので、測定誤差はほとんど生じない。溶液の電気分解
は２両電極間の吸水性部材内にて起こるので、従来の溶
液内に電極を挿入して測定する場合のように溶液を、測
定中、常に攪拌する必要がない。吸水性部材を取り換え
ることにより、多数の試料の定量分析が可能である。電
圧を印加するだけでよいので、短時間で測定することが
できる。吸水性部材に酵素を含浸させる場合には、酵素
を固定化する必要がない。このとき。

吸水性部材を乾燥状態で保存することができるため、酵
素の失活がなく、長期にわたっての酵素の保存が可能で
ある。

４、　文　　の　　゛　なＵ第１図は過酸化水素の電気分解による電流値の経時変化
を示すグラフ、第２図は本発明方法の実施に用いる定量
装置の模式図、第３図は本発明の定量装置の他の実施例
を示す斜視図、第４図〜第６図は、過酸化水素量と電流
値との関係を示すグラフである。

ｌ・・・定量装置、１０・・・定量用素子、　１１．１
３・・・電極。

１２・・・吸水性部材、１４・・・塩橋、１５・・・電
解質溶液、　２０・・・電圧印加装置、２７・・・参照
電極。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、塩橋を介して参照電極に接続された陽極と、陰極と
の間に、試料物質を酵素反応させることにより生成され
る過酸化水素を含浸した吸水性部材を介装して、該吸水
性部材に電圧を印加し、過酸化水素の電気分解により生
ずる電流値に基づいて過酸化水素を定量することにより
試料物質を定量する定量方法。２、前記試料物質は生体成分である特許請求の範囲第１
項に記載の定量方法。３、前記吸水性部材には、前記生体成分から過酸化水素
を生成せしめる酵素が予め含浸されており、定量時に生
体成分の試料溶液が該吸水性部材に含浸される特許請求
の範囲第２項に記載の定量方法。４、前記吸水性部材には、生体成分の酵素反応により予
め生成された過酸化水素が定量時に含浸される特許請求
の範囲第２項に記載の定量方法。５、前記試料物質は酵素である特許請求の範囲第１項に
記載の定量方法。６、前記吸水性部材には前記酵素と反応して過酸化水素
を生成せしめる物質が予め含浸されており、定量時に該
酵素が該吸水性部材に含浸される特許請求の範囲第５項
に記載の定量方法。７、前記吸水性部材には、前記酵素との反応により生成
した過酸化水素が定量時に含浸される特許請求の範囲第
５項に記載の定量方法。８、前記塩橋と前記参照電極とが電解質溶液にて接続さ
れた特許請求の範囲第１項に記載の定量方法。９、塩橋を介して参照電極に接続された陽極と、陰極と
の間に、試料物質を酵素反応させることにより生成され
る過酸化水素を含浸した吸水性部材を介装してなり、該
吸水性部材に所定の電圧を印加して過酸化水素の電気分
解により生ずる電流値に基づいて過酸化水素を定量する
ための定量装置。１０、前記陽極および陰極は金属電極である特許請求の
範囲第９項に記載の定量装置。１１、前記陰極はフィルム状部材上に被覆されている特
許請求の範囲第１０項に記載の定量装置。１２、前記フィルム状部材はプラスチックフィルムであ
る特許請求の範囲第１１項に記載の定量装置。１３、前記陽極が白金であり、陰極が銀である特許請求
の範囲第１０項に記載の定量装置。１４、前記塩橋と前記参照電極とが電解質溶液にて接続
された特許請求の範囲第９項に記載の定量装置。