JPS6350356B2 - - Google Patents
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Description
本発明は一般式（）
（式中、R1は水素もしくは低級アルキル基を表
わし、R2は水素もしくはエステル残基を表わし、
６、７位の水素はシスの関係にある）で表わされ
るセフアロスポリン類縁体の光学活性体およびそ
の塩類並びにその製法に関する。
一般式（）においてR1で表わされる低級ア
ルキル基は、炭素数１−５の直鎖もしくは分岐し
たアルキル基であり、例えばメチル、エチル、ｎ
−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブ
チル、sec−ブチル、ｔ−ブチル基などが例示さ
れる。
COOR2で表わされるエステル基は、ペニシリ
ン、セフアロスポリン類の化学において用いられ
る容易にCOOHに誘導される基である。
R2としては炭素数１−５の直鎖もしくは分
岐したアルキル等（例えばメチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチ
ル、sec−ブチル、ｔ−ブチル基など）、炭素数
１−５の直鎖もしくは分岐した低級アルコキシメ
チル基（例えばメトキシメチル、エトキシメチル
基など）、炭素数１−５の直鎖もしくは分岐し
たハロゲン化アルキル基（例えばクロロメチル、
２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−ト
リフロロエチル基など）、低級アルキルスルホ
ニルエチル基（例えばメチルスルホニルエチル、
エチルスルホニルエチル基など）、炭素数７−
12のアリールメチル基（例えばベンジル、ジフエ
ニルメチル、トリチル、トリフエニルメチル基な
ど）、炭素数７−20の置換アリールメチル基
（置換基としてはメトキシ基、ニトロ基等が例示
され、フエニル基上の置換基数は、１〜５であ
る）または一般式（）
（式中、R3は炭素数１−５の直鎖もしくは分岐
した低級アルキル基、炭素数１−５の直鎖もしく
は分岐した低級アルコキシ基、フエニル基を表わ
し、R4は水素もしくは炭素数１−５の直鎖もし
くは分岐した低級アルキル基を表わす）で表わさ
れるエステル残基などが例示される。
セフアロスポリンの硫黄原子が炭素原子に置き
換えられたカルバセフエム類化合物〔カルバセエ
フエムの命名は、J.Am.Chem.Soc.、96、7584
（1974）の記述に従つた〕については３位に置換
メチル基をもつ化合物が知られているが（前記の
文献並びにJ.Med.Chem.、20、551（1977）、な
ど）、特に強い抗菌活性を示す化合物は知られて
いない。
本発明者らは、先にカルバセフエム核の、４
位、５位または３位に種々の置換基を有する化合
物の合成に成功し、これらの化合物は特願昭53−
34696号、53−122403号、53−133072号、53−
162005号、昭和54年１月27日付出願(1)、発明の名
称：セフアロスポリン類縁体（特開昭55−100384
号公報；特公昭59−36916号公報）等の各明細書
中に開示されている。更に、本発明者らは新規な
カルバセフエム核をもつアシル体の合成にも成功
した。これらのアシル体は、強い抗菌作用を有す
る新規な抗生物質であり、それらはまた、特願昭
53−34696号、53−122402号、53−127027号、53
−133071号、53−162006号、53−162007号、昭和
54年１月27日付出願(2)“発明の名称：セフアロス
ポリン類縁体”（特開昭55−100391号公報；特公
昭59−36917号公報）等の各明細書中に開示され
ている。
しかしながら、上記に記載されているカルバセ
フエム核は光学不活性な原料を用いて、合成的手
法によつて製造される為全て光学的に不活性なdl
体〔又は（±）体と表示される〕である。即ち、
６位、７位の水素がシスの関係にある一般式
（）に相当する化合物はお互いに鏡像体の関係
にある式（−１）、および式（−２）
The present invention is based on the general formula () (In the formula, R 1 represents hydrogen or a lower alkyl group, R 2 represents hydrogen or an ester residue,
The present invention relates to optically active derivatives of cephalosporin analogs (hydrogens at positions 6 and 7 are in a cis relationship), salts thereof, and methods for producing the same. The lower alkyl group represented by R 1 in the general formula () is a straight chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n
-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl groups and the like. The ester group represented by COOR 2 is a group easily derived into COOH, which is used in the chemistry of penicillins and cephalosporins. R 2 is a linear or branched alkyl having 1 to 5 carbon atoms (e.g. methyl, ethyl, n-
propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl group, etc.), straight chain or branched lower alkoxymethyl group having 1 to 5 carbon atoms (e.g. methoxymethyl, ethoxymethyl group, etc.), carbon number 1 -5 linear or branched halogenated alkyl group (e.g. chloromethyl,
2,2,2-trichloroethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, etc.), lower alkylsulfonylethyl groups (for example, methylsulfonylethyl,
(ethylsulfonylethyl group, etc.), carbon number 7-
12 arylmethyl groups (e.g., benzyl, diphenylmethyl, trityl, triphenylmethyl groups, etc.), substituted arylmethyl groups having 7 to 20 carbon atoms (examples include methoxy groups, nitro groups, etc.), and substitution on phenyl groups. base number is 1 to 5) or general formula () (In the formula, R 3 represents a straight chain or branched lower alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a straight chain or branched lower alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, or a phenyl group, and R 4 represents hydrogen or a straight chain or branched lower alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.) Examples include ester residues represented by -5 (representing a straight chain or branched lower alkyl group). Carbacefem compounds in which the sulfur atom of cephalosporin is replaced with a carbon atom [Carbacefm is named after J.Am.Chem.Soc., 96 , 7584
(1974)], compounds with a substituted methyl group at the 3-position are known (see the above-mentioned literature and J.Med.Chem., 20 , 551 (1977), etc.); No compounds are known to exhibit antibacterial activity. The present inventors previously demonstrated that 4
We succeeded in synthesizing compounds having various substituents at the 5-position, 5-position, or 3-position, and these compounds were granted a patent application in 1973-
No. 34696, No. 53-122403, No. 53-133072, No. 53-
No. 162005, filed on January 27, 1972 (1), title of invention: Cephalosporin analogs (Japanese Patent Application Laid-open No. 100384-1984)
It is disclosed in various specifications such as Japanese Patent Publication No. 59-36916). Furthermore, the present inventors also succeeded in synthesizing an acyl compound having a novel carbacephem nucleus. These acyl forms are novel antibiotics with strong antibacterial activity, and they are also
No. 53-34696, No. 53-122402, No. 53-127027, 53
-133071, 53-162006, 53-162007, Showa
It is disclosed in various specifications such as the application filed on January 27, 1954 (2) "Title of the Invention: Cephalosporin Analogues" (Japanese Patent Application Laid-Open No. 100391/1980; Japanese Patent Publication No. 36917/1989). However, since the carbacefem nuclei described above are produced by synthetic methods using optically inactive raw materials, all of them are optically inactive DL.
body [or expressed as (±) body]. That is,
Compounds corresponding to the general formula () in which the hydrogens at the 6th and 7th positions are in a cis relationship are the formula (-1) and the formula (-2), which are in an enantiomeric relationship with each other.
【式】
〔式（−１）、（−２）中、R1およびR2は前
記と同義を表わす。〕で表わされる化合物の等量
混合物として存在する。しかし光学活性体である
一方の鏡像体のみを分離する方法は今迄知られて
いない。
本発明者らは、この光学活性な一方の鏡像体の
分離、調製に成功し、本発明を完成した。即ち、
本発明者らは、光学不活性なdl体に特定のアシル
基を導入した化合物を原料（基質）として用い、
酵素を用いる光学選択的脱アシル化反応により、
一般式（）で表わされるセフアロスポリン類縁
体の光学活性体の製造に初めて成功した。加えて
極めて収率の良い方法で製造することに成功し、
本発明を完成した。尚一般式（）で表わされる
化合物（以下化合物〔〕と略称する）の対応す
る鏡像体混合物（dl体）に光学活性なアシル基、
例えばＤ−フエニルグリシル基を導入した式[Formula] [In formulas (-1) and (-2), R 1 and R 2 have the same meanings as above. ) is present as a mixture of equal amounts of compounds. However, until now, there is no known method for separating only one optically active enantiomer. The present inventors succeeded in separating and preparing one of the optically active enantiomers and completed the present invention. That is,
The present inventors used a compound in which a specific acyl group was introduced into an optically inactive dl form as a raw material (substrate),
Through an optically selective deacylation reaction using an enzyme,
We succeeded for the first time in producing an optically active form of a cephalosporin analog represented by the general formula (). In addition, we succeeded in producing it with an extremely high yield method,
The invention has been completed. In addition, an optically active acyl group, the corresponding enantiomeric mixture (dl form) of the compound represented by the general formula (
For example, a formula in which a D-phenylglycyl group is introduced
【式】又はCH3
で表わされる化合物は後記参考例に示す如く、
夫々のジアステレオアイソマーに分離されている
（特願昭53−127027号）。
本発明によつて得られる光学活性体は後記の各
種物性値、又そのアシル体が対応する光学不活性
体（dl体）に比べ強い抗菌活性を示すこと（参考
例参照）更にセフアロスポリン類の絶対構造と活
性相関との知見とから上記一般式（−１）の絶
対構造を有すると考えられる。従つて以下の記述
には一般式（−１）の構造式を用いて説明す
る。実施例、参考例の化合物名もこの推定絶対構
造式をもつものとして命名する。
以下本発明について詳述する。
一般式〔〕で表わされるセフアロスポリン類
縁体の光学活性体、又は推定絶対構造式（−
１）で表わされる化合物は一般式（）
（式中Ｒは置換又は非置換の不飽和炭素６員環、
複素５員環を、Ｘは水素、アミノ基、水酸基、低
級アルキル基を示す）で表わされる化合物〔以下
化合物〔〕と略称する〕を光学選択的脱アシル
化することによつて製造される。
不飽和炭素６員環、複素５員環としてはフエニ
ル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、
チエニル、フリルが例示され、これらの置換基と
しては水酸基、ハロゲン基、ニトロ基、メタンス
ルホンアミド基等が挙げられる。
低級アルキル基とは、炭素数１−５の直鎖もし
くは分岐したアルキル基（例えば、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、
イソブチル、sec−ブチル、ｔ−ブチル基など）
である。
化合物〔〕の光学活性な化合物〔〕への光
学選択的な脱アシル化反応は、化合物〔〕を光
学選択的に脱アシル化して光学活性な化合物
〔〕を生成する能力を有する微生物、該微生物
の培養処理物、および／または該微生物の産生す
る酵素を用いて行なうことが出来る。
上記光学選択的脱アシル化反応を行なうことが
出来る微生物としては、アエロモナス属、アクロ
モバクター属、アースロバクター属、アセトバク
ター属、アルカリゲネス属、エシエリシア属、キ
サントモナス属、クルイベラ属、グルコノバクタ
ー属、クロストリジウム属、コマモナス属、コネ
リバクテリウム属、ザルシナ属、スタフイロコツ
カス属、スピリルム属、パチルス属、プシユード
モナス属、フラボバクテリウム属、ブレビバクテ
リウム属、プロタミノバクター属、プロテウス
属、ベネケア属、ミコプラーナ属、ロドプシユー
ドモナス属に属する微生物があげられる。具体的
な菌株としては以下のものが例示される。
アエロモナス ヒドロフイラ IFO12634
アクロモバクター アセリス IFO3320
アースロバクター シンプレツクス
ATCC15799
アセトバクター アウランチウス IFO3245
IAM1812
アセトバクター sp.ATCC21760
アルカリゲネス フエカリス ATCC8750
エシエリシア コリ ATCC11105
エシエリシア コリ ATCC13281
キサントモナス シトリ IFO3835
キサントモナス・フイザリデイコーラ
IFO13555
クルイベラ シトロフイラ ATCC21285
グルコノバクター リケフアシエンス
ATCC14835
グルコノバクター デオキシアセトニカス
IFO3271
クロストリジウム アセトプチリカム
IFO3346
コマモナス テリゲナ IFO12685
コリネバクテリウム トリチシ IFO1216
ザルシナ ルテア ATCC9341
スタフイロコツカス アウレウス IFO3060
スピリルム メタモルフアム IFO12012
パチルス メガテリウム ATCC14945
プシユードモナス アエルギノーサ IFO3451
プシユードモナス メラノゲナム
ATCC17808
IAM1577
フラボバクテリウム sp.ATCC21429
微工研菌寄第343号
プレビバクテリウム セリナム ATCC15112
プロタミノバクター アルボフラバス
IFO13221
プロテウス レトゲリ ATCC9250
ベネケア ヒペロプテイカ ATCC15803
ミコプラーナ ブラタ IFO13267
ミコプラーナ デモルフア IFO13213
ロドプシユードモナス スフエロイダス
ATCC21286
光学選択的脱アシル化には上記微生物の産出す
る酵素を用いる他に
上記微生物の培養液もしくは培養処理物
分離菌体〔培養液より遠心分離等により分離
する。更には、この菌体を食塩水（通常約１
％）、緩衝液等で洗つてから使用してもよい〕、
もしくは分離菌体懸濁液
菌体破砕液〔上記で得られた菌体を機械的も
しくは化学的に破砕した液〕
菌体破砕液〔上記で得られた菌体破砕液から
菌体残渣を除いた液
精製酵素液〔上記で得られた酵素液、好まし
くは上澄液に、硫安等を加えて酵素蛋白を沈澱
させた後、これをゲル過法や、イオン交換セ
ルロースカラムクロマト、イオン交換セフアデ
ツクスカラムクロマト等の手段により精製した
酵素液〕
なども同様に使用できる。さらに、菌体あるいは
抽出精製された酵素を常法により固定化した固定
化酵素も使用することが出来る。
反応は反応に影響しない不活性溶媒中０〜40
℃、好ましくは15〜35℃、PH５〜８で行なわれ
る。最も好ましい溶媒としては水があげられる
が、（基質であるセフアロスポリン類縁体を溶解
するために）有機溶媒（例えばアセトン、メタノ
ール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシドなど）を用いることも
できる。反応時のPHをコントロールするために、
リン酸塩緩衝剤、ベロナール緩衝剤、クエン酸緩
衝剤を添加することも効果的である。反応時間は
酵素の種類、濃度、基質の種類、濃度、反応温
度、反応PH等により影響されるが、通常30分〜24
時間である。反応収率が最大値に達した時に反応
を終了するのが最も好ましい。
用いられる菌体濃度は乾燥重量で、反応液１ml
当たり１mgから50mgが好ましい。精製された酵素
を用いる場合はその活性が前記乾燥菌体量に相当
するだけ用いられる。又用いられる基質濃度は、
化合物〔〕が反応液１ml当たり0.5mg〜50mgが
好ましい。
尚本反応に妨害となる酵素活性、例えばβ−ラ
クタマーゼ、エステラーゼなどが使用する菌体に
含有されている場合は、該菌体に変異処理を施し
て、これを消失せしめた菌体を取り、この菌体を
使用することもできる。又、これら妨害となる酵
素の阻害剤を反応系に添加することにより反応収
率を向上させることもできる。
反応終了後、目的物の単離は一般に培養液から
有機化合物の精製単離法として知られている各種
担体を用いる吸着、又はイオン交換クロマト、あ
るいはゲル過、液々抽出法などにより行なわれ
る。
尚、一般式(1)で表わされる化合物の中で一般式
（−３）
（式中、R1は前記と同義を表わし、R2′はエステ
ル残基を表わし、６、７位の水素はシスの関係に
ある）で表わされるセフアロスポリン類縁体の光
学活性体は、前記の如くにして得られる一般式
（−４）
（式中、R1は前記と同義を表わし、６、７位の
水素はシスの関係にある。）で表わされるセフア
ロスポリン類縁体の光学活性体を常法によりエス
テル化することによつても得られる。
光学活性な本発明化合物、化合物〔〕は、そ
れ自身抗菌活性を期待できる有用な化合物である
が、光学活性な化合物〔〕をアシル化した化合
物は、対応する不活性な化合物〔〕をアシル化
した化合物に比し、極めて強い抗菌活性を示す有
用な化合物である。それらの化合物の一例および
その抗菌活性を参考例に示す。
次に本発明を実施例により説明する。
実施例 １
（＋）−7β−アミノ−１−アザビシクロ〔４，
２，０〕オクト−２−エン−８−オン−２−カ
ルボン酸〔（＋）−7β−アミノ−２−カルボキ
シ−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−
２−エン−８−オン〕の製造法。
１−１ 菌体破砕液の調製
(イ) 光学選択的脱アシル化能を有する微生物の
培養
種菌としてKluyvera citrophila
ATCC21285〔菌学的記載はJ.General
Applied Microbiology３、28−31（1957）参
照〕を用いる。
種培地として、ポリペプトン１％、酵母エ
キス１％、肉エキス0.5％、グルタミン酸ナ
トリウム0.5％、食塩0.25％を含む水溶液を
5N−NaOHでPH7.0に調整した溶液を用い
た。種菌１白金耳を50mlの太型試験管中の10
mlの種培地に植菌し、30℃で24時間振とう培
養した。この種培地の全量を、２のひだ付
エルレンマイヤーフラスコ中に入れた本培地
300mlに植菌し、30℃で振とう培養する。
本醗酵培地は種培地と同一組成のものを用
いた。
(ロ) 菌体破砕液の調製
上記本培養24時間後に、醗酵液から遠心分
離により菌体をとりだし、0.9％食塩水50ml
で２回洗浄する。この菌体を1/30Ｍ燐酸バツ
フアー中に懸濁する。菌体濃度は40mg／ml
で、菌体重量は乾燥菌体換算である。上記懸
濁液10mlを50mlの太型試験管に入れ、200ワ
ツトで２分間超音波処理によつて、菌体を破
砕し菌体破砕液を調製した。本処理にはトミ
ー精工社製の超音波発生装置モデルUR200P
を用いた。
１−２ 基質溶液の調製
後記参考例６と同様に作成した（±）−シス
−７−フエニルアセトアミド−１−アザビシク
ロ〔４，２，０〕−オクト−２−エン−８−オ
ン−２−カルボン酸200mgを1/30Ｍリン酸緩衝
液（PH6.5）９mlに加える。この時該化合物は
溶解しないが2N−NaOHを微量ずつ添加し、
次いでPHを再び6.5に調整すると溶解した。最
後に脱イオン水を添加して全量を10mlに調節し
た。
１−３ 酵素反応
前記菌体破砕液10mlを基質溶液10mlに加え、
30℃で80分酵素反応を行なう。反応の経時変化
を第１表に示す。The compound represented by [Formula] or CH 3 is as shown in the reference examples below,
It has been separated into each diastereoisomer (Japanese Patent Application No. 127027-1983). The optically active substance obtained by the present invention has various physical properties as described below, and its acyl form exhibits stronger antibacterial activity than the corresponding optically inactive form (dl form) (see reference examples). Based on the knowledge of structure and activity relationship, it is considered to have the absolute structure of the above general formula (-1). Therefore, the following description will be made using the structural formula of general formula (-1). The compounds of Examples and Reference Examples are also named as having this presumed absolute structural formula. The present invention will be explained in detail below. An optically active form of a cephalosporin analog represented by the general formula [] or a presumed absolute structural formula (-
The compound represented by 1) has the general formula () (In the formula, R is a substituted or unsubstituted unsaturated carbon 6-membered ring,
It is produced by optically selective deacylation of a compound [hereinafter abbreviated as compound []] represented by a five-membered heterocyclic ring, where X represents hydrogen, an amino group, a hydroxyl group, or a lower alkyl group. Unsaturated carbon 6-membered rings, hetero 5-membered rings include phenyl, cyclohexenyl, cyclohexadienyl,
Examples include thienyl and furyl, and examples of substituents thereof include hydroxyl group, halogen group, nitro group, methanesulfonamide group, and the like. A lower alkyl group refers to a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms (for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl,
isobutyl, sec-butyl, t-butyl group, etc.)
It is. An optically selective deacylation reaction of a compound [] to an optically active compound [] is carried out using a microorganism that has the ability to optically deacylate a compound [] to produce an optically active compound []; This can be carried out using a cultured product of the microorganism and/or an enzyme produced by the microorganism. Microorganisms capable of carrying out the above-mentioned optical selective deacylation reaction include the genus Aeromonas, the genus Achromobacter, the genus Arthrobacter, the genus Acetobacter, the genus Alcaligenes, the genus Esierisia, the genus Xanthomonas, the genus Kluybella, and the genus Gluconobacter. , Clostridium, Comamonas, Coneribacterium, Sarcina, Staphylocotcus, Spirillum, Pacillus, Pseudomonas, Flavobacterium, Brevibacterium, Protaminobacter, Proteus, Benecare Examples include microorganisms belonging to the genus Mycoplana and Rhodopseudomonas. Specific examples of bacterial strains include the following. Aeromonas hydrophila IFO12634 Achromobacter aceris IFO3320 Arthrobacter simplex
ATCC15799 Acetobacter aurantius IFO3245
IAM1812 Acetobacter sp.ATCC21760 Alcaligenes fuecalis ATCC8750 E. coli ATCC11105 E. coli ATCC13281 Xanthomonas citri IFO3835 X. fuisaridaycola
IFO13555 Kluyvera Citrophylla ATCC21285 Gluconobacter Lychefaciens
ATCC14835 Gluconobacter deoxyacetonicus
IFO3271 Clostridium acetoptylicum
IFO3346 Comamonas terrigena IFO12685 Corynebacterium tritici IFO1216 Zarcina lutea ATCC9341 Staphylococcus aureus IFO3060 Spirillum metamorphum IFO12012 Pachylus megaterium ATCC14945 Pseudomonas aeruginosa IFO3451 Pseudomonas melanogae Namu
ATCC17808 IAM1577 Flavobacterium sp.ATCC21429 Microtechnical Research Institute Bacteria No. 343 Previbacterium Serinum ATCC15112 Protaminobacter Alboflabus
IFO13221 Proteus letgeri ATCC9250 Benecare hyperopteica ATCC15803 Mycoplana bulata IFO13267 Mycoplana demorphea IFO13213 Rhodopsieudomonas sphaeroidus
ATCC21286 For optical selective deacylation, in addition to using enzymes produced by the above-mentioned microorganisms, culture fluid or cultured product of the above-mentioned microorganisms, isolated bacterial bodies [separated from the culture fluid by centrifugation, etc. Furthermore, the bacterial cells are soaked in saline solution (usually about 1
%), may be used after washing with buffer, etc.],
or isolated bacterial cell suspension; bacterial cell disruption liquid [a liquid obtained by mechanically or chemically disrupting the bacterial cells obtained above] bacterial cell disruption liquid [the bacterial cell residues are removed from the bacterial cell disruption liquid obtained above] Purified enzyme solution [After adding ammonium sulfate etc. to the enzyme solution obtained above, preferably the supernatant solution to precipitate the enzyme protein, this is subjected to gel filtration method, ion exchange cellulose column chromatography, ion exchange cellulose column chromatography, etc. An enzyme solution purified by means such as Adex column chromatography] can also be used in the same manner. Furthermore, an immobilized enzyme obtained by immobilizing bacterial cells or an extracted and purified enzyme by a conventional method can also be used. The reaction is carried out in an inert solvent that does not affect the reaction.
C., preferably 15-35.degree. C., and pH 5-8. The most preferred solvent is water, but organic solvents (e.g., acetone, methanol, ethanol, N,N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, etc.) can also be used (to dissolve the substrate cephalosporin analog). . In order to control the PH during the reaction,
It is also effective to add phosphate buffers, veronal buffers, and citrate buffers. The reaction time is affected by the type and concentration of the enzyme, the type and concentration of the substrate, the reaction temperature, the reaction pH, etc., but is usually 30 minutes to 24 minutes.
It's time. Most preferably, the reaction is terminated when the reaction yield reaches a maximum value. The bacterial cell concentration used is dry weight, 1 ml of reaction solution
1 mg to 50 mg per serving is preferred. When a purified enzyme is used, its activity is used in an amount corresponding to the amount of dry bacterial cells. Also, the substrate concentration used is
The compound [] is preferably 0.5 mg to 50 mg per ml of the reaction solution. In addition, if the bacterial cells used contain enzyme activities that interfere with this reaction, such as β-lactamase or esterase, the bacterial cells are subjected to mutation treatment to eliminate this enzyme activity, and then the bacterial cells are removed. This bacterial cell can also be used. The reaction yield can also be improved by adding an inhibitor of these interfering enzymes to the reaction system. After completion of the reaction, isolation of the target product is generally carried out by adsorption using various carriers, ion exchange chromatography, gel filtration, liquid-liquid extraction, etc., which are known methods for purifying and isolating organic compounds from culture fluids. Furthermore, among the compounds represented by general formula (1), general formula (-3) (In the formula, R 1 represents the same meaning as above, R 2 ' represents an ester residue, and the hydrogens at the 6th and 7th positions are in a cis relationship). General formula (-4) obtained as follows (In the formula, R 1 represents the same meaning as above, and the hydrogens at the 6th and 7th positions are in a cis relationship.) It can also be obtained by esterifying an optically active form of a cephalosporin analog represented by It will be done. The optically active compound of the present invention, compound [], is itself a useful compound that can be expected to have antibacterial activity, but the compound obtained by acylating the optically active compound [] can acylate the corresponding inactive compound []. It is a useful compound that exhibits extremely strong antibacterial activity compared to other compounds. Examples of these compounds and their antibacterial activity are shown in Reference Examples. Next, the present invention will be explained by examples. Example 1 (+)-7β-amino-1-azabicyclo[4,
2,0] oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid [(+)-7β-amino-2-carboxy-1-azabicyclo[4,2,0]octo-
2-en-8-one] production method. 1-1 Preparation of disrupted bacterial cell solution (a) Cultivation of microorganisms having optical selective deacylation ability Kluyvera citrophila as the inoculum
ATCC21285 [Mycological description is by J.General
Applied Microbiology 3 , 28-31 (1957)] is used. As a seed medium, an aqueous solution containing 1% polypeptone, 1% yeast extract, 0.5% meat extract, 0.5% monosodium glutamate, and 0.25% salt was used.
A solution adjusted to pH 7.0 with 5N-NaOH was used. Place 1 platinum loopful of the inoculum into a 50ml thick test tube.
ml of seed medium was inoculated and cultured with shaking at 30°C for 24 hours. The entire volume of this seed medium was placed in a pleated Erlenmeyer flask as shown in No. 2.
Inoculate into 300ml and culture with shaking at 30℃. The fermentation medium used had the same composition as the seed medium. (b) Preparation of disrupted bacterial cell solution After 24 hours of the above main culture, the bacterial cells were removed from the fermentation solution by centrifugation, and 50 ml of 0.9% saline was added.
Wash twice with The cells are suspended in 1/30M phosphate buffer. Bacterial cell concentration is 40mg/ml
The bacterial weight is calculated in terms of dry bacterial cells. 10 ml of the above suspension was placed in a 50 ml large test tube and subjected to ultrasonication at 200 watts for 2 minutes to disrupt the bacterial cells to prepare a disrupted bacterial cell solution. For this process, an ultrasonic generator model UR200P manufactured by Tomy Seiko Co., Ltd. is used.
was used. 1-2 Preparation of substrate solution (±)-cis-7-phenylacetamido-1-azabicyclo[4,2,0]-oct-2-en-8-one-2 prepared in the same manner as Reference Example 6 described later. - Add 200 mg of carboxylic acid to 9 ml of 1/30M phosphate buffer (PH6.5). At this time, the compound did not dissolve, but 2N-NaOH was added little by little.
Then the pH was adjusted to 6.5 again and it dissolved. Finally, deionized water was added to adjust the total volume to 10 ml. 1-3 Enzyme reaction Add 10ml of the above bacterial cell disruption solution to 10ml of substrate solution,
Perform the enzymatic reaction at 30°C for 80 minutes. Table 1 shows the time course of the reaction.
【表】
反応、収率は第１表から明らかな如く、仕込
んだ光学異性体混合物の50％（モル換算）が変
換された時から一定となつている。
１−４ 目的物の単離・精製
反応終了後、反応液から遠心分離によつて菌
体を除き、上澄液を2N−塩酸でPH3.0に調整す
る。次いで該反応液を270mlのダイヤイオン
HP−10〔三菱化成(株)製〕を充填したカラム
（カラム径2.6cm、高さ51cm）にチヤージする。
溶出は脱イオン水で行ない、５mlずつ分取す
る。目的物は280mlから315mlのフラクシヨンに
溶出する。このフラクシヨンを減圧濃縮後凍結
乾燥し、少量の水−メタノール（50：50、容量
比、以下同じ）混合液に溶解し、130mlのセフ
アデツクスLH・20（フアーマシア・フアイ
ン・ケミカル社製）を充填したカラム（カラム
径1.6cm、高さ64.5cm）にチヤージし溶出は水
−メタノール（50：50）混合液で行なう。溶出
液は５mlずつ分取し、65mlから85mlのフラクシ
ヨンを集め、減圧濃縮してメタノールを除き、
次いで残液を凍結乾燥して白色粉末48mgを得
る。
このものの物性値は以下の通りである。
IR（KBr）νcm-1max 1800、1790、1775、1640、
1620
NMR（100M D2O−DSS）δ：6.46（1H、dd、
Ｊ＝3.5、4.7Hz）、4.88（1H、ｄ、Ｊ＝5.2）、
4.06（1H、ｍ）、2.5〜1.5（4H、ｍ）
この化合物は元素分析により塩酸と水それぞ
れ１分子持つことが判明し、上記の物性値に対
応するdl体のそれらとよく一致する。旋光度は
〔α〕15°
Ｄ＝＋48゜（ｃ＝0.5、1M燐酸緩衝液中、
PH7.0）。この値は後記実施例２により求められ
た光学活性体の旋光度〔α〕15°
Ｄ＝48.5゜（ｃ＝
0.5、1M燐酸緩衝液中、PH7.0）とよい一致を
示す。
シリカゲル薄層クロマトグラフイー〔薄層プ
レートメルクArt5721（E.メルク製）、展開溶媒
イソプロパノール：酢酸：水＝４：１：１〕に
よれば、Rf値＝0.22に、ニンヒドリンポジテイ
ブな単一のスポツトが認められる。このRf値
は光学不活性なdl体のスポツトのRf値と一致
する。
実施例 ２
（＋）−7β−アミノ−１−アザビシクロ〔４，
２，０〕−オクト−２−エン−８−オン−２−
カルボン酸の製造法（別法）
２−１ 菌体破砕液の調製
実施例１の１−１と同様に行なう。
２−２ 基質溶液の調製
後記参考例４と同様に作成した（＋）−シス
−7β−〔（Ｒ）−２−フエニル−２−アミノアセ
トアミド〕−１−アザビシクロ−〔４，２，０〕
オクト−２−エン−８−オン−２−カルボン酸
100mgを1/30Ｍ燐酸緩衝液（PH6.5）５mlに溶解
する。
２−３ 酵素反応
前記菌体破砕液５mlを、前記基質溶液５mlに
加え、30℃で24時間酵素反応を行なう。
２−４ 単離・精製
実施例１の１−４と同様の操作を行なつて白
色粉末46mgを得る。
このものの物性値は実施例１で得られる化合
物のそれとよく一致する。
〔α〕15°
Ｄ＝48.5゜、〔ｃ＝0.5、1M燐酸緩衝液
（PH7.0）〕
実施例 ３
（−）−7β−アミノ−4α−メチル−１−アザビ
シクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−
オン−２−カルボン酸の製造法。
３−１ 菌体破砕液の調製
実施例１の１−１と同様に行なう。
３−２ 基質溶液の調製
参考例７と同様に作成した（±）−シス−7β
−フエニルアセトアミド−4α−メチル−１−
アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン
−８−オン−２−カルボン酸を用いて実施例１
の１−２と同様に行なう。
３−３ 酵素反応
３−１、３−２で調製した菌体破砕液、基質
溶液を用いて、実施例１−３と同様に行なう。
１時間後に反応収率はほぼ一定となるが120分
行なう。反応収率は基質である光学異性体混合
物の50％（モル換算）である。
３−４ 目的物の単離・精製
実施例１の１−４とほぼ同様の操作を行な
う。反応終了後、反応液から遠心分離により菌
体を除き、上澄液をそのまま220mlのダイヤイ
オンHP−10を充填したカラム（カラム径2.5
cm、樹脂高46cm）にチヤージする。溶出は脱イ
オン水で行ない、５mlずつ分取する。目的物は
200ml〜270mlのフラクシヨンに溶出される。こ
のフラクシヨンを減圧濃縮後、凍結乾燥し、少
量の水−メタノール（50：50）に溶かし、130
mlのセフアデツクスLH−20（カラム径1.6cm、
高さ64.5cm）にチヤージし、溶出は水−メタノ
ール（50：50）混合液で行なう。溶出液は５ml
ずつ分取し、65mlから80mlのフラクシヨンを集
め、減圧濃縮してメタノールを除き、次いで残
液を凍結乾燥して白色粉末30.5mgを得る。
このものの物性値は以下の通り。
IR（KBr）νcm-1max 1800、1770（sh）、1760
（sh）、1740、1680、1630
NMR（100M D2O−DSS）δ：6.16（1H、ｄ、
Ｊ＝5.1）、4.52（1H、ｄ、Ｊ＝4.9）、3.86
（1H、ｍ）、2.64（1H、ｍ）、1.9〜1.4（2H、
ｍ）、1.10（3h、ｄ、Ｊ＝7.3）
この化合物は元素分析により水を２分子もつ
カリウム塩であることが判明し、上記の物性値
は対応するdl体のそれらとよく一致する。この
もののシリカゲル薄層クロマトグラフイー（実
施例１の１−４に同じ）によれば、Rf値＝0.33
にニンヒドリンポジテイブな単一のスポツトが
認められる。このRf値は、光学不活性なdl体
のスポツトのRf値と一致する。
旋光度：〔α〕15°
Ｄ＝−30゜（ｃ＝0.5、1M燐酸緩
衝液中）。
この値は、後記実施例４により求められた光
学活性体の旋光度：〔α〕15°
Ｄ＝−30.8゜（ｃ＝
0.5、1M燐酸緩衝液中、PH＝7.0）とよい一致
を示す。
実施例 ４
（−）−7β−アミノ−4α−メチル−１−アザビ
シクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−
オン−２−カルボン酸の製造法（別法）。
４−１ 菌体破砕液の調製
実施例３の３−１と同様に行なう。
４−２ 基質溶液の調製
後記参考例５と同様に作成した（＋）−シス
−7β−〔（Ｒ）−２−フエニル−２−アミノアセ
トアミド〕−4α−メチル−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オン−
２−カルボン酸100mgを1/30Ｍ燐酸緩衝液（PH
6.5）５mlに溶解する。
４−３ 酵素反応
実施例１の１−３と同様に、前記菌体破砕液
５mlを前記基質液５mlに加え、30℃で24時間酵
素反応を行なう。
４−４ 目的物の単離・精製
実施例３の３−４と同様の操作を行なつて、
白色粉末55mgを得る。
このものの物性値は実施例３で得られる化合
物のそれらとよく一致する。
旋光度：〔α〕15°
Ｄ＝−30.8゜〔ｃ＝0.5、1M燐酸
緩衝液（PH7.0）〕
実施例 ５
（＋）−7β−アミノ−１−アザビシクロ〔４，
２，０〕オクト−２−エン−８−オン−２−カ
ルボン酸の製造法。
５−１ 菌体の培養
種菌としてアエロモナス・ヒドロフイラ
IFO12634、アクロモバクター・アセリス
IFO3320、アースロバクター・シンプレツクス
ATCC15799、アセトバクター・アウランチウ
ス IFO3245、アセトバクター・sp.
ATCC21760、アルカリゲネス・フエカリス
ATCC8750、エシエリシア・コリ
ATCC11105、エシエリシア・コリ
ATCC13281、キサントモナス・シトリ
IFO3835、キサントモナス・フイザリデイコー
ラ IFO13555、グルコノバクター・リケフア
シエンス ATCC14835、グルコノバクター・
デオキシアセトニカス IFO3271、コマモナ
ス・テリゲナ IFO12685、コリネバクテリウ
ム・トリチシ IFO1216、ザルシナ・ルテア
ATCC9341、スタフイロコツカス・アウレウス
IFO3060、スピリルム・メタモルフアム
IFO12012、バチルス・メガテリウム
ATCC14945、プシユードモナス・メラノゲナ
ム ATCC17808、プシユードモナス・アエル
ギノーサ IFO3451、フラボバクテリウム
sp.ATCC21429、ブレビバクテリウム・セリナ
ム ATCC15112、プロタミノバクター・アル
ボフラバス IFO13221、プロテウス・レトゲ
リ ATCC9250、ベネケア・ヒペロプテイカ
ATCC15803、ミコプラーナ・ブラタ
IFO13267、ミコプラーナ・デモルフア
IFO13213、ロドプシユードモナス・スフエロ
イダス ATCC21286を用いる。培地として肉
エキス１％、ペプトン１％、食塩0.3％、酵母
エキス0.5％を含む水溶液を5N−NaOHでPH7.2
に調整した溶液を用いた。種菌１白金耳を300
mlのエルレンマイヤーフラスコ中の30mlの培地
に植菌し、30℃で24時間振とう培養した。この
培養液から遠心分離により、菌体をとり出し、
0.9％食塩水５mlで洗浄後再び遠心分離により
集菌した。この菌体を1/30Ｍ燐酸緩衝液（PH
7.0）中に菌体濃度20mg／ml（乾燥重量換算）
になるように懸濁した。
５−２ 基質溶液の調製
後記参考例４と同様に作成した（±）−シス
−７−〔（Ｒ）−２−フエニル−２−アミノアセ
トアミド〕−１−アザビシクロ〔４，２，０〕
オクト−２−エン−８−オン−２−カルボン酸
150mgを1/30Ｍ燐酸緩衝液（PH7.0）15mlに溶解
した。
５−３ 酵素反応
５−１によつて調製した各種菌体懸濁液0.5
mlと基質溶液0.5mlとを混合し、30℃で20時間
反応を行なつた。
５−４ 生成物の確認
高速液体クロマトグラフイーを用いることに
よつて基質である（±）−シス−７〔（Ｒ）−２−
フエニル−２−アミノアセトアミド〕−１−ア
ザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−
８−オン−２−カルボン酸がジアステレオアイ
ソマーに分離されることは後記参考例４に示し
たが、これと同様にして、これらジアステレオ
アイソマーを定量することが可能であつた。ま
た、この時同時に7β−アミノ−１−アザビシ
クロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オ
ン−２−カルボン酸のピークが観察されること
から、上記反応５−３によつて生じた本物質を
定量することが可能であつた。
第２表に示した如く、反応液中には、高極性な
ジアステレオアイソマー、即ち（−）−シス−７
−〔（Ｒ）−２−フエニル−２−アミノアセトアミ
ド〕−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−
２−エン−８−オン−カルボン酸は、全く減少せ
ずに残存しており、低極性な化合物即ち、（＋）−
シス−７−〔（Ｒ）−２−フエニル−２−アミノア
セトアミド〕−１−アザビシクロ〔４，２，０〕
オクト−２−エン−８−オン−２−カルボン酸の
みが減少している。またこれに対応して、（＋）−
7β−アミノ−１−アザビシクロ〔４，２，０〕
オクト−２−エン−８−オン−２−カルボン酸の
ピークが生じた。なお、（＋）−シス−７−〔（Ｒ）
−２−フエニル−２−アミノアセトアミド〕−１
−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン
−８−オン−２−カルボン酸の減少量と（＋）−
7β−アミノ−１−アザビシクロ〔４，２，０〕
オクト−２−エン−８−オン−２−カルボン酸の
生成量のバランスが必ずしも合わないのは反応系
に共存するβ−ラクタマーゼによる。
この様に第２表に示したすべての菌体の生産す
る酵素はセフアロスポリン類縁体を光学選択的に
脱アシル化し、6R.7Sの絶対配位を有する光学活
性な化合物を生成せしめる能力を有していた。[Table] As is clear from Table 1, the reaction and yield remained constant from the time when 50% (in terms of mole) of the charged optical isomer mixture was converted. 1-4 Isolation and Purification of Target Product After the reaction is complete, remove the bacterial cells from the reaction solution by centrifugation, and adjust the supernatant to pH 3.0 with 2N hydrochloric acid. Next, the reaction solution was poured into 270ml of Diaion.
Charge a column (column diameter 2.6 cm, height 51 cm) packed with HP-10 (manufactured by Mitsubishi Kasei Corporation).
Elution is performed with deionized water and aliquots of 5 ml are taken. The target product is eluted in a fraction of 280ml to 315ml. This fraction was concentrated under reduced pressure, freeze-dried, dissolved in a small amount of water-methanol (50:50, volume ratio, same hereinafter) mixture, and filled with 130 ml of Cephadex LH 20 (manufactured by Pharmacia Huain Chemical Co., Ltd.). Charge the column (column diameter 1.6 cm, height 64.5 cm) and elute with a water-methanol (50:50) mixture. Aliquot the eluate in 5 ml portions, collect fractions of 65 ml to 85 ml, and concentrate under reduced pressure to remove methanol.
The remaining liquid is then freeze-dried to obtain 48 mg of white powder. The physical properties of this product are as follows. IR (KBr) νcm -1 max 1800, 1790, 1775, 1640,
1620 NMR (100M D2O −DSS) δ: 6.46 (1H, dd,
J = 3.5, 4.7Hz), 4.88 (1H, d, J = 5.2),
4.06 (1H, m), 2.5-1.5 (4H, m) This compound was found to have one molecule each of hydrochloric acid and water by elemental analysis, and the physical properties agree well with those of the dl form corresponding to the above physical properties. The optical rotation is [α] 15° D = +48° (c = 0.5, in 1M phosphate buffer,
PH7.0). This value is the optical rotation angle [α] of the optically active substance determined in Example 2, which will be described later, 15° D = 48.5° (c =
0.5 in 1M phosphate buffer, pH7.0). According to silica gel thin layer chromatography [thin layer plate Merck Art5721 (manufactured by E. Merck), developing solvent isopropanol:acetic acid:water = 4:1:1], Rf value = 0.22, a single ninhydrin positive spot was detected. is recognized. This Rf value coincides with the Rf value of an optically inactive dl body spot. Example 2 (+)-7β-amino-1-azabicyclo[4,
2,0]-oct-2-ene-8-one-2-
Method for producing carboxylic acid (alternative method) 2-1 Preparation of disrupted bacterial cell solution The same procedure as 1-1 of Example 1 was carried out. 2-2 Preparation of substrate solution (+)-cis-7β-[(R)-2-phenyl-2-aminoacetamide]-1-azabicyclo-[4,2,0] prepared in the same manner as Reference Example 4 described later
Oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid
Dissolve 100 mg in 5 ml of 1/30M phosphate buffer (PH6.5). 2-3 Enzyme reaction Add 5 ml of the above bacterial cell disruption solution to 5 ml of the above substrate solution, and perform an enzymatic reaction at 30°C for 24 hours. 2-4 Isolation/purification The same operation as 1-4 of Example 1 was carried out to obtain 46 mg of white powder. The physical properties of this product agree well with those of the compound obtained in Example 1. [α]15° D=48.5°, [c=0.5, 1M phosphate buffer (PH7.0)] Example 3 (-)-7β-amino-4α-methyl-1-azabicyclo[4,2,0] oct-2-en-8-
Method for producing one-2-carboxylic acid. 3-1 Preparation of disrupted bacterial cell solution The same procedure as 1-1 of Example 1 was performed. 3-2 Preparation of substrate solution (±)-cis-7β prepared in the same manner as Reference Example 7
-phenylacetamide-4α-methyl-1-
Example 1 using azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid
Proceed in the same manner as 1-2. 3-3 Enzyme reaction The same procedure as in Example 1-3 was carried out using the disrupted bacterial cells and substrate solution prepared in 3-1 and 3-2.
The reaction yield becomes almost constant after 1 hour, but the reaction is carried out for 120 minutes. The reaction yield is 50% (in terms of mole) of the optical isomer mixture that is the substrate. 3-4 Isolation/purification of target product The operation is almost the same as in 1-4 of Example 1. After the reaction, the bacterial cells were removed from the reaction solution by centrifugation, and the supernatant was transferred to a column (column diameter 2.5) filled with 220 ml of Diaion HP-10.
cm, resin height 46cm). Elution is performed with deionized water and aliquots of 5 ml are taken. The object is
It is eluted in a fraction of 200ml to 270ml. This fraction was concentrated under reduced pressure, lyophilized, dissolved in a small amount of water-methanol (50:50),
ml of Sephadex LH-20 (column diameter 1.6 cm,
Charge to a height of 64.5 cm) and elute with a water-methanol (50:50) mixture. Eluate is 5ml
Fractions of 65 ml to 80 ml are collected, concentrated under reduced pressure to remove methanol, and the remaining liquid is lyophilized to obtain 30.5 mg of white powder. The physical properties of this product are as follows. IR (KBr) νcm -1 max 1800, 1770 (sh), 1760
(sh), 1740, 1680, 1630 NMR (100M D 2 O−DSS) δ: 6.16 (1H, d,
J=5.1), 4.52 (1H, d, J=4.9), 3.86
(1H, m), 2.64 (1H, m), 1.9~1.4 (2H,
m), 1.10 (3h, d, J = 7.3) Elemental analysis revealed that this compound is a potassium salt having two molecules of water, and the above physical properties agree well with those of the corresponding dl form. According to silica gel thin layer chromatography of this product (same as 1-4 in Example 1), Rf value = 0.33
A single ninhydrin-positive spot is observed in the specimen. This Rf value coincides with the Rf value of an optically inactive dl body spot. Optical rotation: [α] 15° D = -30° (c = 0.5, in 1M phosphate buffer). This value is the optical rotation of the optically active substance determined in Example 4 below: [α] 15° D=-30.8° (c=
0.5 in 1M phosphate buffer, pH=7.0). Example 4 (−)-7β-amino-4α-methyl-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-ene-8-
Method for producing one-2-carboxylic acid (alternative method). 4-1 Preparation of disrupted bacterial cell solution The same procedure as 3-1 of Example 3 was carried out. 4-2 Preparation of substrate solution (+)-cis-7β-[(R)-2-phenyl-2-aminoacetamide]-4α-methyl-1-azabicyclo[4,2] prepared in the same manner as Reference Example 5 described later. ,0]oct-2-ene-8-one-
100mg of 2-carboxylic acid was dissolved in 1/30M phosphate buffer (PH
6.5) Dissolve in 5ml. 4-3 Enzyme reaction As in 1-3 of Example 1, 5 ml of the above bacterial cell disruption solution was added to 5 ml of the above substrate solution, and an enzymatic reaction was carried out at 30°C for 24 hours. 4-4 Isolation/purification of target product Perform the same operation as 3-4 of Example 3,
Obtain 55 mg of white powder. The physical properties of this product agree well with those of the compound obtained in Example 3. Optical rotation: [α] 15° D = -30.8° [c = 0.5, 1M phosphate buffer (PH7.0)] Example 5 (+)-7β-amino-1-azabicyclo [4,
2,0] Method for producing oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid. 5-1 Cultivation of bacterial cells Aeromonas hydrophila as a seed culture
IFO12634, Achromobacter aceris
IFO3320, Arthrobacter simplex
ATCC15799, Acetobacter aurantius IFO3245, Acetobacter sp.
ATCC21760, Alcaligenes fuecalis
ATCC8750, Ethierisia coli
ATCC11105, Ethierisia coli
ATCC13281, Xanthomonas citri
IFO3835, Xanthomonas fuisaridaycola IFO13555, Gluconobacter liquefaciens ATCC14835, Gluconobacter
Deoxyacetonicus IFO3271, Comamonas terrigena IFO12685, Corynebacterium tritici IFO1216, Sarcina lutea
ATCC9341, Staphylococcus aureus
IFO3060, Spirillum metamorphum
IFO12012, Bacillus megaterium
ATCC14945, Pseudomonas melanogenum ATCC17808, Pseudomonas aeruginosa IFO3451, Flavobacterium
sp.ATCC21429, Brevibacterium serinum ATCC15112, Protaminobacter alboflavus IFO13221, Proteus letgeli ATCC9250, Benechea hyperopteica
ATCC15803, Mycoplana brata
IFO13267, Mycoplana demorpha
IFO13213 and Rhodopseudomonas sphaeroidas ATCC21286 are used. As a medium, an aqueous solution containing 1% meat extract, 1% peptone, 0.3% salt, and 0.5% yeast extract was diluted with 5N-NaOH to pH 7.2.
A solution adjusted to 300 platinum loops per starter
The cells were inoculated into 30 ml of a medium in a 30 ml Erlenmeyer flask, and cultured with shaking at 30°C for 24 hours. The bacterial cells are removed from this culture solution by centrifugation,
After washing with 5 ml of 0.9% saline, the cells were collected by centrifugation again. The bacterial cells were dissolved in 1/30M phosphate buffer (PH).
7.0) with a bacterial cell concentration of 20 mg/ml (converted to dry weight)
It was suspended so that 5-2 Preparation of substrate solution (±)-cis-7-[(R)-2-phenyl-2-aminoacetamide]-1-azabicyclo[4,2,0] prepared in the same manner as Reference Example 4 described later
Oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid
150mg was dissolved in 15ml of 1/30M phosphate buffer (PH7.0). 5-3 Enzyme reaction 0.5 of various bacterial cell suspensions prepared by 5-1
ml and 0.5 ml of the substrate solution were mixed, and the reaction was carried out at 30°C for 20 hours. 5-4 Product confirmation By using high performance liquid chromatography, the substrate (±)-cis-7[(R)-2-
phenyl-2-aminoacetamide]-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-ene-
It was shown in Reference Example 4 below that 8-one-2-carboxylic acid is separated into diastereoisomers, and it was possible to quantify these diastereoisomers in the same manner. Moreover, since the peak of 7β-amino-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid is observed simultaneously at this time, it is possible to It was possible to quantify the produced substance. As shown in Table 2, the reaction solution contains a highly polar diastereoisomer, i.e. (-)-cis-7
-[(R)-2-phenyl-2-aminoacetamide]-1-azabicyclo[4,2,0]octo-
2-en-8-one-carboxylic acid remains without decreasing at all and is a low polar compound, i.e. (+)-
cis-7-[(R)-2-phenyl-2-aminoacetamide]-1-azabicyclo[4,2,0]
Only oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid is reduced. Correspondingly, (+)−
7β-amino-1-azabicyclo[4,2,0]
A peak of oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid occurred. In addition, (+)-cis-7-[(R)
-2-phenyl-2-aminoacetamide]-1
- Decreased amount of azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid and (+)-
7β-amino-1-azabicyclo[4,2,0]
The reason why the amount of oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid produced is not necessarily balanced is due to β-lactamase coexisting in the reaction system. In this way, the enzymes produced by all the bacterial cells shown in Table 2 have the ability to optically selectively deacylate cephalosporin analogs and produce optically active compounds with the absolute coordination of 6R.7S. was.
【表】【table】
【表】
実施例 ６
（＋）−7β−アミノ−１−アザビシクロ〔４，
２，０〕オクト−２−エン−８−オン−２−カ
ルボン酸の製造法
Potato Dextrose Broth（DIFCO Lab.製）培
地100mlにクロストリジウム・アセトブチリクム
IFO3346を植菌し、培養器内の空気を、滅菌窒素
に置換した後、密栓し、30℃で48時間培養する。
培養後集菌し、１回生理食塩水で洗浄した後、菌
体を２mlの1/30Ｍ燐酸カリウム緩衝液（PH7.0）
に懸濁させる。実施例５の５−２と同様にして作
成した基質溶液0.5mlと上記菌体懸濁液とを混合
し、30℃で20時間反応を行なつた。５−４と同様
にして反応を追跡したところ、（−）−シス−７−
〔（Ｒ）−２−フエニル−２−アミノアセトアミド〕
−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−
エン−８−オン−２−カルボン酸は全く減少せず
に残存しており、（＋）−シス−７−〔（Ｒ）−２−
フエニル−２−アミノアセトアミド〕−１−アザ
ビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−
オン−２−カルボン酸のみが減少した。減少量は
1.0mgであつた。（＋）−7β−アミノ−１−アザビ
シクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オ
ン−２−カルボン酸は0.2mg生成した。
参考例 １
（＋）−シス−７−アミノ−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オン−
２−カルボン酸の製造法
このものの製造は以下（１−１）〜（１−４）
の４工程を経て行なわれる。
(1‐1) ２−〔４−（３−ブテニル）−３−アジド−
２−オキソアゼチジン−１−イル〕−２−ジエ
チルホスホノ酢酸−ｔ−ブチルエステルの製造
法
ｔ−ブチル−α−アミノジエチルホスホノア
セテート447mg（1.78ｍmole）を無水エーテル
25mlに溶かし４−ペンテン−１−アール164mg
（1.96ｍmole）を加え室温で１時間撹拌後、モ
レキユラーシーブ（4A）〔和光純薬(株)製、以下
同じものを用いた〕200mgと無水硫酸マグネシ
ウム150mgを加えて更に１時間撹拌した。
反応液を減圧過し液を減圧濃縮し淡黄色
の油状物を得た。これに無水ベンゼンを加え再
び減圧濃縮して淡黄色の油状物を得た。（この
ものは核磁気共鳴スペクトルでシツフ塩基の生
成を確かめた。）これに12.5mlのシクロヘキサ
ンと12.5mlの無水ベンゼンを加えて溶かし、ト
リエチルアミン0.369ml（2.66ｍmole）とモレ
キユラーシーブを200mg加え、室温撹拌下、ア
ジドアセチルクロリド319mg（2.66ｍmole）を
12.5mlのシクロヘキサンに溶かした溶液を１時
間30分で滴下し、更に30分間撹拌した。反応液
に10mlのベンゼンを加えて薄め、５％稀塩酸、
飽和重曹水、脱イオン水、飽和食塩水の順で洗
滌し、芒硝で乾燥し減圧濃縮して褐色の油状物
を得た。このものは標記化合物の粗製品と同定
した。この油状物をシリカゲル〔ワコーゲル
Ｃ−200和光純薬(株)製、以下の参考例において
シリカゲルは同じものを用いた。〕45ｇを充実
したカラムにチヤージし、展開溶媒〔ｎ−ヘキ
サン：酢酸エチル＝１：２（容量比以下同じ）〕
を用いて溶出し、２種類の異性体を得た。これ
らの物性値は以下に示す通りであるが３位、４
位の水素についてのシス異性体（345mg）、およ
びトランス異性体（58mg）と同定した。併せて
収率54.2％。各物性値は以下の通り。
シス異性体 IRνCHCl3 nax（cm-1）；2120、1775、
1770（sh）、1750、1740（sh）、1645
NMR：δ（CDCl3）6.13〜6.33（1H、ｍ）、4.93
〜5.17（2H、ｍ）、4.50〜4.93（2H、ｍ）、3.80
〜4.40（5H、ｍ）、1.93〜2.17（4H、ｍ）、1.50
（9H、ｍ）、1.33（6H、ｔ）
トランス異性体 IRνCHCl3 nax（cm-1）；2120、1780
、
1755、1750（sh）、1650
NMR：δ（CDCl3）5.43〜6.20（1H、ｍ）、4.80
〜5.30（2H、ｍ）、3.75〜4.75（7H、ｍ）、2.0
〜2.50（4H、ｍ）、1.50（9H、ｄ）、1.17（6H、
ｍ）
(1‐2) （±）−シス−２−ｔ−ブチルオキシカル
ボニル−７−アジド−１−アザビシクロ〔４，
２，０〕オクト−２−エン−８−オン
上記（１−１）で得られたシス−２−〔４−
（３−ブテニル）−３−アジド−２−オキソアゼ
チジン−１−イル〕−２−ジエチルホスホノ酢
酸−ｔ−ブチルエステル298mg（0.716ｍmole）
を8.5mlのジオキサン、2.5mlの脱イオン水にと
かし、四酸化オスミウム30mg加えて30分撹拌し
た。黒色反応液に粉末状の過沃素酸ソーダ496
mg（2.32ｍmole）を20分で加え、一時間半撹
拌した後、反応液をエーテル50mlで３回抽出
し、合せたエーテル層を飽和食塩水で洗い芒硝
で乾燥し減圧濃縮すると黒褐色の油状物が得ら
れた。この油状物をシリカゲル５ｇを充填した
カラムにチヤージし、溶出溶媒（ベンゼン：酢
酸エチル＝１：２）を用いて溶出し、２，４−
ジニトロフエニルヒドラジン反応陽性を示す画
分を集めて濃縮すると235mgの油状物を得た。
（このものはアルデヒド化合物のシス体であ
る。）この油状物を15mlの無水アセトニトリル
に溶かし、室温で撹拌しながら窒素気流下27.1
mg（0.563ｍmole）50％水素化ナトリウムを加
える。20分撹拌後反応液を２％酢酸水（20）ml
中に注入しエーテル50mlで４回抽出し、エーテ
ル層を飽和食塩水で洗滌、芒硝で乾燥し減圧濃
縮すると180mgの油状物を得た。このものは目
的化合物（シス体）の粗製品と同定した。この
油状物をシリカゲル５ｇを充填したカラムにチ
ヤージし、溶出溶媒〔ｎ−ヘキサン：酢酸エチ
ル＝3.5：１（容量比）〕を用いて溶出し、91mg
の目的化合物の白色結晶を得た。
収率51％。このものの物性値は下記の通り。
融 点 64.5〜66.5℃
IRνCHCl3 nax（cm-1）：2130、1790、1730、1640
NMRδ（CDCl3）ppm：6.30（1H、ｔ、Ｊ＝４
Hz）、4.93（1H、ｄ、Ｊ＝５Hz）、3.80（1H、
ｑ）、1.6〜2.6（4H、ｍ）、1.52（9H、ｓ）
(1‐3) （±）−シス−７−アジド−１−アザビシ
クロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オ
ン−２−カルボン酸の製造法
参考例（１−２）で得られた（±）−シス−
２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−７−アジド
−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２
−エン−８−オン55mg（0.224ｍmole）を２ml
のトリフロロ酢酸に溶かし室温で10分間放置し
た後、減圧濃縮し、再びベンゼンを加えて減圧
濃縮して黄色スラリー51mgを得た。このものの
物性値は下記に示す通りで、目的のカルボン酸
と同定した。収率100％。
IRνCHCl3 nax（cm-1）：2120、1760、1770（sh）、17
15、
1635
NMRδ（CD3OD）ppm：6.48（1H、ｔ、Ｊ＝４
Hz）、5.10（1H、ｄ、Ｊ＝５Hz）、3.83（1H、
ｑ）、1.1〜2.5（4H、ｍ）
(1‐4) （±）−シス−７−アミノ−１−アザビシ
クロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オ
ン−２−カルボン酸の製造法
参考例（１−３）と同様にして得られる
（±）−シス−７−アジド−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕−オクト−２−オン−８−オン−
２−カルボン酸91mgを6.5mlのエタノールに溶
かし26mgの10％パラジウム−炭素を加え撹拌し
ながら常圧室温で２時間水素ガスを通じ、過
して触媒を除き減圧濃縮後再びメタノール10ml
にとかし26mgの10％パラジウム炭素を加え更に
３時間50分室温常圧で接触還元を行い過助剤
（ハイフロスーパーセル）を通して過し、減
圧濃縮すると88mg（100％）の半固体が得られ
る。
このものの物性値は以下に示す通りで、目的
のアミノ化合物と同定した。
IRνKBr nax（cm-1）：3450、2950、1770、1650
参考例 ２
（±）−シス−７−アミノ−２−ｔ−ブチルオ
キシカルボニル−１−アザビシクロ〔４，２，
０〕オクト−２−エン−８−オンの製造。
参考例（１−２）で得られた（±）−シス−７
−アジド−２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−１
−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン
−８−オン178mg（0.67ｍmole）を10mlのエタノ
ールに溶かし、10％パラジウム−炭素（触媒）25
mgを加え、水素気流下室温で50分撹拌した。つい
で触媒を去して減圧濃縮すると目的とする化合
物が淡黄色油状物質として得られる。
収 量 159.5mg
収 率 100％
IRνCHCl3 nax（cm-1）：1775、1725、1640
NMRδ（CDCl3）ppm：6.27（ｍ、1H）、4.50（ｍ、
1H）、4.2〜3.1（ｍ、3H）、2.6〜1.7（ｍ、4H）、
1.5（ｓ、9H）
参考例 ３
（±）−シス−7β−アミノ−4α−メチル−１−
アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン
−８−オン−２−カルボン酸の製造法
本化合物は次の４工程を経て合成される。
(3‐1) ２−〔４−（２−メチル−３−ブテニル）−
３−アジド−２−オキソアゼチジン−１−イ
ル〕−２−ジエチルホスホノ酢酸第三ブチルエ
ステル
の製造
ｔ−ブチル−α−アミノジエチルホスホノ酢
酸2.13ｇ（８ｍmoles）を無水エーテル80mlに
とかし撹拌下90.2mg（9.2ｍmoles）の３−メチ
ル−４−ペンテナールを加え室温で１時間撹拌
した後、モレキユラーシーブ4A、900mgと硫酸
マグネシウム700mgを加え、さらに１時間30分
撹拌する。反応液を減圧過して液を濃縮し
淡黄色の油状物を得た。これに30mlの無水ベン
ゼンを加え再び濃縮し、油状物28.2ｇを得た。
（このものはnmrでシツフの塩基の生成を確認
した。）この油状物を56mlの乾燥シクロヘキサ
ン、56mlの無水ベンゼンにとかしモレキユラー
シーブ（4A）900mg、トリエチルアミン1.67ml
（12ｍmoles）を加えた後室温撹拌下アジドア
セチルクロリド1.43ｇ（12ｍmoles）を56mlの
乾燥シクロヘキサンに溶かした溶液を１時間30
分で滴下する。さらに30分撹拌した後ベンゼン
30mlを加えて分液ロートに移し、10％クエン
酸、飽和食塩水、飽和重曹水、それぞれ30mlで
この順序で洗滌し芒硝で乾燥して減圧濃縮する
と2.8ｇの油状物が得られる。このものは薄層
クロマトグラフ上〔シリカゲル、プレート、展
開溶媒ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（１：１）〕
主に２成分からなる異性体の混合物が認められ
る。このものをシリカゲル300ｇを充填したカ
ラムにチヤージし、展開溶媒（ｎ−ヘキサン：
酢酸エチル＝１：１）を用いて溶出し、目的化
合物の低極性異性体が380mg（収率11.0％）、高
極性異性体570mg（収率16.7％）および両者の
混合物201mg（収率5.8％）が得られた。
得られた各異性体の物質値は下記に示す通り
で、高極性異性体を目的物の中シス体と同定し
た。
低極性異性体
IR（CHCl3）νcm-1max 2110、1770、1745
NMR（CDCl3）δ（ppm）5.40〜6.10（1H、ｍ）、
5.27〜4.90（2.5H、ｍ）、4.68（0.5H、ｄ）、
4.23（6H、ｍ）、2.60〜1.77（3H、ｍ）、1.53
（9H、ｓ）、1.37（6H、ｔ、Ｊ＝7.0Hz）、1.10
（3H、ｄ、Ｊ＝6.0Hz）
高極性異性体（シス体）
IR（CHCl3）νcm-1max 2110、1765、1745
NMR（CDCl3）δ（ppm）5.45〜6.13（1H、ｍ）、
4.83〜5.20（2.5H、ｍ）、4.67（0.5H、ｄ）、
3.97〜4.45（6H、ｍ）、1.77〜2.55（3H、ｍ）、
1.50（9H、ｓ）、1.33（6H、ｔ）、1.08（3H、
ｄ）
(3‐2) （±）−シス−７−アジド−２−ｔ−ブチ
ルオキシカルボニル−４−メチル−７−アジド
−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２
−エン−８−オンの製造
参考例（３−１）と同様にして得られる
（±）−シス−２−〔４−（２−メチル−３−ブテ
ニル）−３−アジド−２−オキソアゼチジン−
１−イル〕−２−ジエチルホスホノ酢酸、第三
ブチルエステル240mg（0.56ｍmole）を6.6mlの
ジオキサン、２mlの脱イオン水にとかし20mgの
四酸化オスミウムを加え10分撹拌した。黒色の
反応溶液に390mg（1.82ｍmole）の粉末過沃素
酸ナトリウムを少しづつ30分で加える。その後
40分間撹拌し反応液をエーテル30mlで３回抽出
し併せた。エーテル層を飽和食塩水で洗い芒硝
で乾燥し濃縮すると230mgの油状物が得られる。
この油状物をシリカゲル６ｇを充填したカラ
ムにチヤージし溶出溶媒〔ベンゼン：酢酸エチ
ル（１：２）〕を用いて溶出し、２，４−ジニ
トロフエニルヒドラジン反応陽性を示す分画を
集めて濃縮すると油状物（アルデヒド体）185
mgが得られる。これをただちに８mlの無水アセ
トニトリルに溶かし、室温で撹拌しながら窒素
気流下21.6mg（0.45ｍmole）の50％水素化ナト
リウムを加える。30分撹拌した後、反応液を２
％酢酸水15ml中に注入しエーテル20mlで２回抽
出し、エーテル層を飽和食塩水で洗浄し、芒硝
で乾燥して減圧濃縮すると油状物を得る。
この油状物をシリカゲル20ｇを充填したカラ
ムにチヤージし、溶出溶媒〔ｎ−ヘキサン：酢
酸エチル＝3.5：１〕を用いて溶出し、目的物
が無色の油状物として得られる（70mg、収率
48.1％）。このものは放置すると結晶化する。
このものの物性値は下記の通り。
IR（KBr）νcm-1max 2110、1784、1715、1623
NMR（CDCl3）δ（ppm） 6.30（4/5Ｈ、ｄ、
Ｊ＝5.1Hz）、6.10（1/5Ｈ、ｄ、Ｊ＝2.7Hz）、
4.98（4/5Ｈ、ｄ、Ｊ＝5.0Hz）、4.89（1/5Ｈ、
ｄ、Ｊ＝5.0Hz）、3.60〜3.90（1H、ｍ）、2.65
（1H、ｍ）、1.70〜1.80（2H、ｍ）、1.51（9H、
ｓ）、1.20（3/5Ｈ、ｄ、Ｊ＝8.0Hz）、1.13（12/
５Ｈ、ｄ、Ｊ＝8.0Hz）
なお得られた結晶は上記nmrデータより4α−
メチル体と4β−メチル体の約４：１の混合物
であると同定した。
この混合物は再度シリカゲルクロマトグラフ
イー（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル ３：１）す
ることにより分離できる。高極性異性体（4β
体）は、（±）−シス−7β−アジド−４−β−
メチル−２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−１
−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エ
ン−８−オンであり低極性異性体はその4α体
であり、分離された両者は次の物性値をもつ。[Table] Example 6 (+)-7β-amino-1-azabicyclo[4,
2,0] Method for producing oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid Clostridium acetobutylicum in 100ml of Potato Dextrose Broth (manufactured by DIFCO Lab.) medium.
After inoculating IFO3346 and replacing the air in the incubator with sterile nitrogen, the incubator is sealed tightly and cultured at 30°C for 48 hours.
After culturing, collect the bacteria, wash once with physiological saline, and add the bacteria to 2 ml of 1/30M potassium phosphate buffer (PH7.0).
Suspend in 0.5 ml of the substrate solution prepared in the same manner as in 5-2 of Example 5 and the above cell suspension were mixed and reacted at 30°C for 20 hours. When the reaction was followed in the same manner as in 5-4, (-)-cis-7-
[(R)-2-phenyl-2-aminoacetamide]
-1-azabicyclo[4,2,0]octo-2-
En-8-one-2-carboxylic acid remained without decreasing at all, and (+)-cis-7-[(R)-2-
Phenyl-2-aminoacetamide]-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-ene-8-
Only one-2-carboxylic acid decreased. The amount of decrease is
It was 1.0 mg. 0.2 mg of (+)-7β-amino-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid was produced. Reference example 1 (+)-cis-7-amino-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-
Method for producing 2-carboxylic acid The production of this product is as follows (1-1) to (1-4)
It is carried out through four steps. (1-1) 2-[4-(3-butenyl)-3-azido-
Method for producing 2-oxoazetidin-1-yl]-2-diethylphosphonoacetic acid-t-butyl ester 447 mg (1.78 mmole) of t-butyl-α-aminodiethylphosphonoacetate was dissolved in anhydrous ether.
Dissolved in 25ml 4-penten-1-al 164mg
(1.96 mmole) and stirred at room temperature for 1 hour, 200 mg of molecular sieve (4A, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter used) and 150 mg of anhydrous magnesium sulfate were added and stirred for another 1 hour. . The reaction solution was filtered under reduced pressure and the liquid was concentrated under reduced pressure to obtain a pale yellow oil. Anhydrous benzene was added to this and the mixture was again concentrated under reduced pressure to obtain a pale yellow oil. (The formation of Schiff's base in this product was confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy.) 12.5 ml of cyclohexane and 12.5 ml of anhydrous benzene were added and dissolved, and 0.369 ml (2.66 mmole) of triethylamine and 200 mg of molecular sieve were added. , 319 mg (2.66 mmole) of azidoacetyl chloride was added under stirring at room temperature.
A solution dissolved in 12.5 ml of cyclohexane was added dropwise over 1 hour and 30 minutes, and the mixture was further stirred for 30 minutes. Add 10ml of benzene to the reaction solution to dilute it, add 5% diluted hydrochloric acid,
The mixture was washed with saturated sodium bicarbonate solution, deionized water, and saturated brine in this order, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to obtain a brown oil. This product was identified as a crude product of the title compound. This oil was mixed with silica gel [Wako Gel C-200, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and the same silica gel was used in the following reference examples. ] Charge 45 g into a well-filled column, and use the developing solvent [n-hexane: ethyl acetate = 1:2 (volume ratio below)]
Two types of isomers were obtained. These physical property values are shown below, and the 3rd and 4th
It was identified as a cis isomer (345 mg) and a trans isomer (58 mg) regarding the hydrogen at the position. Combined yield is 54.2%. The physical property values are as follows. Cis isomer IRν CHCl3 nax (cm -1 ); 2120, 1775,
1770 (sh), 1750, 1740 (sh), 1645 NMR: δ ( CDCl3 ) 6.13-6.33 (1H, m), 4.93
~5.17 (2H, m), 4.50 ~ 4.93 (2H, m), 3.80
~4.40 (5H, m), 1.93 ~ 2.17 (4H, m), 1.50
(9H, m), 1.33 (6H, t) Trans isomer IRν CHCl3 nax (cm -1 ); 2120, 1780
,
1755, 1750 (sh), 1650 NMR: δ ( CDCl3 ) 5.43-6.20 (1H, m), 4.80
~5.30 (2H, m), 3.75 ~ 4.75 (7H, m), 2.0
~2.50 (4H, m), 1.50 (9H, d), 1.17 (6H,
m) (1-2) (±)-cis-2-t-butyloxycarbonyl-7-azido-1-azabicyclo[4,
2,0] Oct-2-en-8-one Cis-2-[4- obtained in (1-1) above
(3-Butenyl)-3-azido-2-oxoazetidin-1-yl]-2-diethylphosphonoacetic acid-t-butyl ester 298 mg (0.716 mmole)
was dissolved in 8.5 ml of dioxane and 2.5 ml of deionized water, 30 mg of osmium tetroxide was added, and the mixture was stirred for 30 minutes. Powdered sodium periodate 496 in the black reaction solution
mg (2.32 mmole) was added over 20 minutes, and after stirring for one and a half hours, the reaction solution was extracted three times with 50 ml of ether, and the combined ether layers were washed with saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to produce a blackish brown oil. was gotten. This oil was charged to a column packed with 5 g of silica gel, eluted using an elution solvent (benzene: ethyl acetate = 1:2), and 2,4-
Fractions showing a positive dinitrophenylhydrazine reaction were collected and concentrated to yield 235 mg of oil.
(This is the cis isomer of an aldehyde compound.) Dissolve this oil in 15 ml of anhydrous acetonitrile and add 27.1 ml of the oil under a nitrogen stream while stirring at room temperature.
Add mg (0.563 mmole) 50% sodium hydride. After stirring for 20 minutes, add the reaction solution to 2% acetic acid (20) ml.
The ether layer was washed with saturated brine, dried over Glauber's salt, and concentrated under reduced pressure to obtain 180 mg of oil. This product was identified as a crude product of the target compound (cis form). This oil was charged to a column packed with 5 g of silica gel, and eluted using an elution solvent [n-hexane: ethyl acetate = 3.5:1 (volume ratio)].
White crystals of the desired compound were obtained. Yield 51%. The physical properties of this product are as follows. Melting point 64.5-66.5℃ IRν CHCl3 nax (cm -1 ): 2130, 1790, 1730, 1640 NMRδ (CDCl 3 ) ppm: 6.30 (1H, t, J=4
Hz), 4.93 (1H, d, J=5Hz), 3.80 (1H,
q), 1.6-2.6 (4H, m), 1.52 (9H, s) (1-3) (±)-cis-7-azido-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-ene-8 -Production method of -one-2-carboxylic acid (±)-cis- obtained in Reference Example (1-2)
2-t-butyloxycarbonyl-7-azido-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2
-en-8-one 55 mg (0.224 mmole) in 2 ml
The solution was dissolved in trifluoroacetic acid, left at room temperature for 10 minutes, concentrated under reduced pressure, benzene was added again, and concentrated under reduced pressure to obtain 51 mg of a yellow slurry. The physical properties of this product were as shown below, and it was identified as the target carboxylic acid. Yield 100%. IRν CHCl3 nax (cm -1 ): 2120, 1760, 1770 (sh), 17
15,
1635 NMRδ (CD 3 OD) ppm: 6.48 (1H, t, J = 4
Hz), 5.10 (1H, d, J=5Hz), 3.83 (1H,
q), 1.1-2.5 (4H, m) (1-4) (±)-cis-7-amino-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid manufacturing method (±)-cis-7-azido-1-azabicyclo[4,2,0]-oct-2-one-8-one- obtained in the same manner as Reference Example (1-3)
Dissolve 91 mg of 2-carboxylic acid in 6.5 ml of ethanol, add 26 mg of 10% palladium on carbon, and pass hydrogen gas through it at normal pressure and room temperature for 2 hours with stirring, remove the catalyst by filtration, concentrate under reduced pressure, and add 10 ml of methanol again.
After stirring, 26 mg of 10% palladium on carbon is added, followed by catalytic reduction at room temperature and normal pressure for 3 hours and 50 minutes, filtered through a supernatant (Hyflo Super Cell), and concentrated under reduced pressure to obtain 88 mg (100%) of a semi-solid. The physical properties of this product were as shown below, and it was identified as the target amino compound. IRν KBr nax (cm -1 ): 3450, 2950, 1770, 1650 Reference example 2 (±)-cis-7-amino-2-t-butyloxycarbonyl-1-azabicyclo[4,2,
0] Production of oct-2-en-8-one. (±)-cis-7 obtained in Reference Example (1-2)
-azido-2-t-butyloxycarbonyl-1
- Dissolve 178 mg (0.67 mmole) of azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one in 10 ml of ethanol and dissolve 10% palladium on carbon (catalyst) 25
mg was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 50 minutes under a hydrogen stream. Then, the catalyst is removed and the mixture is concentrated under reduced pressure to obtain the desired compound as a pale yellow oil. Yield 159.5mg Yield 100% IRν CHCl3 nax (cm -1 ): 1775, 1725, 1640 NMRδ (CDCl 3 ) ppm: 6.27 (m, 1H), 4.50 (m,
1H), 4.2-3.1 (m, 3H), 2.6-1.7 (m, 4H),
1.5 (s, 9H) Reference example 3 (±)-cis-7β-amino-4α-methyl-1-
Process for producing azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid This compound is synthesized through the following four steps. (3-1) 2-[4-(2-methyl-3-butenyl)-
3-azido-2-oxoazetidin-1-yl]-2-diethylphosphonoacetic acid tert-butyl ester Production of 2.13 g (8 mmoles) of t-butyl-α-aminodiethylphosphonoacetic acid was dissolved in 80 ml of anhydrous ether, and while stirring, 90.2 mg (9.2 mmoles) of 3-methyl-4-pentenal was added, followed by stirring at room temperature for 1 hour. Add 900 mg of molecular sieve 4A and 700 mg of magnesium sulfate, and stir for an additional 1 hour and 30 minutes. The reaction solution was concentrated under reduced pressure to obtain a pale yellow oil. To this was added 30 ml of anhydrous benzene and concentrated again to obtain 28.2 g of an oily substance.
(The formation of Schiff's base was confirmed by NMR.) This oil was dissolved in 56 ml of dry cyclohexane, 56 ml of anhydrous benzene, 900 mg of molecular sieve (4A), and 1.67 ml of triethylamine.
After adding (12 mmoles), a solution of 1.43 g (12 mmoles) of azidoacetyl chloride dissolved in 56 ml of dry cyclohexane was stirred at room temperature for 1 hour.
Drips in minutes. After stirring for another 30 minutes, the benzene
Add 30 ml and transfer to a separating funnel, wash with 30 ml each of 10% citric acid, saturated saline, and saturated sodium bicarbonate in this order, dry with Glauber's salt, and concentrate under reduced pressure to obtain 2.8 g of oil. This product was tested on a thin layer chromatograph [silica gel, plate, developing solvent n-hexane: ethyl acetate (1:1)]
A mixture of isomers consisting mainly of two components is observed. This was charged to a column packed with 300 g of silica gel, and the developing solvent (n-hexane:
Elution using ethyl acetate = 1:1) yielded 380 mg (yield 11.0%) of the low polar isomer of the target compound, 570 mg (yield 16.7%) of the high polar isomer, and 201 mg (yield 5.8%) of the mixture of both. )was gotten. The substance values of each isomer obtained are as shown below, and the highly polar isomer was identified as the middle cis isomer of the target product. Low polar isomer IR (CHCl 3 ) νcm -1 max 2110, 1770, 1745 NMR (CDCl 3 ) δ (ppm) 5.40-6.10 (1H, m),
5.27-4.90 (2.5H, m), 4.68 (0.5H, d),
4.23 (6H, m), 2.60-1.77 (3H, m), 1.53
(9H, s), 1.37 (6H, t, J=7.0Hz), 1.10
(3H, d, J = 6.0Hz) Highly polar isomer (cis form) IR (CHCl 3 ) νcm -1 max 2110, 1765, 1745 NMR (CDCl 3 ) δ (ppm) 5.45-6.13 (1H, m),
4.83~5.20 (2.5H, m), 4.67 (0.5H, d),
3.97~4.45 (6H, m), 1.77~2.55 (3H, m),
1.50 (9H, s), 1.33 (6H, t), 1.08 (3H,
d) (3-2) (±)-cis-7-azido-2-t-butyloxycarbonyl-4-methyl-7-azido-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2
-Production of en-8-one (±)-cis-2-[4-(2-methyl-3-butenyl)-3-azido-2-oxoazetidine- obtained in the same manner as Reference Example (3-1)
1-yl]-2-diethylphosphonoacetic acid, tert-butyl ester (240 mg (0.56 mmole)) was dissolved in 6.6 ml of dioxane and 2 ml of deionized water, 20 mg of osmium tetroxide was added, and the mixture was stirred for 10 minutes. Add 390 mg (1.82 mmole) of powdered sodium periodate to the black reaction solution in portions over 30 minutes. after that
After stirring for 40 minutes, the reaction solution was extracted three times with 30 ml of ether and combined. The ether layer was washed with saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated to obtain 230 mg of oil. This oil was charged to a column packed with 6 g of silica gel, eluted using an elution solvent [benzene: ethyl acetate (1:2)], and fractions showing a positive 2,4-dinitrophenylhydrazine reaction were collected and concentrated. Then an oily substance (aldehyde) 185
mg is obtained. This is immediately dissolved in 8 ml of anhydrous acetonitrile, and 21.6 mg (0.45 mmole) of 50% sodium hydride is added under a nitrogen stream while stirring at room temperature. After stirring for 30 minutes, the reaction solution was
The mixture was poured into 15 ml of aqueous % acetic acid and extracted twice with 20 ml of ether. The ether layer was washed with saturated brine, dried over Glauber's salt, and concentrated under reduced pressure to obtain an oil. This oily substance was charged to a column packed with 20g of silica gel and eluted using an elution solvent [n-hexane:ethyl acetate = 3.5:1] to obtain the target product as a colorless oily substance (70mg, yield
48.1%). This stuff crystallizes if left alone.
The physical properties of this product are as follows. IR (KBr) νcm -1 max 2110, 1784, 1715, 1623 NMR (CDCl 3 ) δ (ppm) 6.30 (4/5H, d,
J = 5.1Hz), 6.10 (1/5H, d, J = 2.7Hz),
4.98 (4/5H, d, J=5.0Hz), 4.89 (1/5H,
d, J=5.0Hz), 3.60-3.90 (1H, m), 2.65
(1H, m), 1.70-1.80 (2H, m), 1.51 (9H,
s), 1.20 (3/5H, d, J = 8.0Hz), 1.13 (12/
5H, d, J = 8.0Hz) The obtained crystal has a 4α-
It was identified as an approximately 4:1 mixture of methyl form and 4β-methyl form. This mixture can be separated again by silica gel chromatography (n-hexane-ethyl acetate 3:1). Highly polar isomer (4β
body) is (±)-cis-7β-azido-4-β-
Methyl-2-t-butyloxycarbonyl-1
-Azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one, and the low polar isomer is its 4α isomer, and the separated two have the following physical properties.
【式】【formula】
【式】
4β体
融 点 84.0〜86.5℃
IR（KBr）νcm-1max 2135、1783、1715、1622
NMR（CDCl3）δ（ppm） 6.13（1H、ｄ、Ｊ
＝2.7Hz）、4.90（1H、ｄ、Ｊ＝5.0Hz）、3.93〜
3.73（1H、ｍ）、2.53（1H、ｍ）、2.16〜1.75
（2H、ｍ）、1.53（9H、ｓ）、1.20（3H、ｄ、
Ｊ＝6.0Hz）
4α体
融 点 82.0〜84.0℃
IR（KBr）νcm-1max 2120、1790、1721、1630
NMR（CDCl3）δ（ppm） 6.33（1H、ｄ、Ｊ
＝5.0Hz）、5.00（1H、ｄ、Ｊ＝5.5Hz）、3.89〜
3.68（1H、ｍ）、2.66（1H、ｍ）、1.82〜1.57
（2H、ｍ）、1.53（9H、ｓ）、1.12（3H、ｄ、
Ｊ＝7.0Hz）
(3‐3) （±）−シス−7β−アミノ−4α−メチル−
２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−１−アザビ
シクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−
オンの製造
（３−２）により合成される低極性異性体
（±）−シス−7β−アジド−4α−メチル−２−
ｔ−ブチルオキシカルボニル−１−アザビシク
ロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オン
255mgを10mlのエタノールに溶かし100mgの10％
パラジウム炭素を加えて1.5時間水素添加を行
う。触媒を別しよくメタノールで洗い、
液・洗液を合せて減圧濃縮すると淡黄色油が得
られる。８mlの酢酸エチルに溶かし10％のクエ
ン酸３mlで５回抽出し、水層を炭酸カリウムで
PH６〜７に中和すると白濁する。酢酸エチル５
mlで２回抽出し飽和食塩水で洗い芒硝乾燥する
と177mg（76.6％）の油状の目的物を得る。
IR（CHCl3）νcm-1max 3400、1770、1720、1630
NMR（CDCl3）δ（ppm） 6.23（1H、ｄ、Ｊ
＝5.0Hz）、4.53（1H、ｄ、Ｊ＝5.8Hz）、3.93〜
3.47（1H、ｍ）、2.56（1H、ｍ）、1.92（2H、
br）、1.80〜1.60（2H、ｍ）、1.50（9H、ｓ）、
1.31（3H、ｄ、Ｊ＝7.0Hz）
尚この還元を１当量の塩酸を添加して行なう
と目的物の塩酸塩が得られる。
(3‐4) （±）−シス−7β−アミノ−4α−メチル−
１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−
エン−８−オン−２−カルボン酸・トリフロロ
酢酸塩の製造
（３−３）と同様にして得られる（±）−シ
ス−7β−アミノ−4α−メチル−２−ｔ−ブチ
ルオキシカルボニル−１−アザビシクロ〔４，
２，０〕オクト−２−エン−８−オン196mg
（0.78ｍmole）を無水ジクロロメタン4.2mlに溶
解し、室温で撹拌下1.8mlのトリフロロ酢酸を
加える。1.5時間後減圧濃縮し、無水ベンゼン
を加えて共沸留去して得られる油状物にエーテ
ルを加えて、トリチユレートし、取して粉末
状の目的物167mg（69.3％）を得る。
IR（KBr）νcm-1max 3460、2980〜2500、1780、
1685、1630
pmr（D2O、内部基準DSS）δ：6.77（1H、ｄ、
Ｊ＝5.8Hz）、5.00（1H、ｄ、Ｊ＝5.6Hz）、4.10
（1H、ｍ）、2.83（1H、ｍ）、1.86（2H、ｍ）、
1.15（3H、ｄ、Ｊ＝8.0Hz）
参考例 ４
（±）−シス−７−〔（Ｒ）−２−フエニル−２−
アミノアセトアミド〕−１−アザビシクロ〔４，
２，０〕オクト−２−エン−８−オン−２−カ
ルボン酸の製造法
本化合物は次の２工程で製造される。
(4‐1) （±）−シス−７−〔（Ｒ）−２−フエニル−
２−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノアセト
アミド〕−２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−
１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−
エン−８−オンの製造法
（ａ法）
参考例２と同様にして得られる（±）−シス
−７−アミノ−２−ｔ−ブチルオキシカルボニ
ル−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−
２−エン−８−オン81mg（0.34ｍmole）と
（Ｒ）−Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニルフエニ
ルグリシン94.0mg（0.34ｍmole）を２mlの無水
塩化メチレンに溶かし氷−食塩で冷却下77mg
（0.34ｍmole）のジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを１mlの無水塩化メチレンに溶かして加え
る。氷冷下２時間反応させた後２滴の酢酸を加
え更に20分撹拌し減圧過する。ケーキを2.0
mlの酢酸エチルで洗い、液および洗液にエー
テル20mlを加え１％リン酸水溶液、飽和重曹
水、飽和食塩水の順で洗い芒硝で乾燥して減圧
濃縮すると187mgの粗生成物が得られる。これ
をシリカゲルクロマト（シリカゲル９ｇ、溶媒
ｎ−ヘキサン：酢酸エチル１：１）で精製して
無色ガラス状の目的物104mg（64.9％）を得た。
IR（KBr）νmax（cm-1）：1770、1750、1720、
1630
NMR：δ（CDCl3）7.32（ｓ、5H）、6.31（ｍ、
1H）、5.90（ｍ、1H）、2.50〜1.70（ｍ、4H）、
1.50（ｓ、9H）、1.40（ｓ、9H）
（ｂ法）
（Ｒ）−Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニルフ
エニルグリシン297.3mg（1.18ｍmole）を５ml
の無水テトラヒドロフランに溶かし−30℃で
1N−Ｎメチルモルホリン−テトラヒドロフラ
ン1.18ml（1.18ｍmole）、1N−クロル蟻酸イソ
ブチル1.18ml（1.18ｍmole）を加え30分撹拌す
る。参考例２と同様にして得られる（±）−シ
ス−７−アミノ−２−ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト
−２−エン−８−オン234mg（0.983ｍmole）
を５mlの無水塩化メチレンに溶かして加え−30
℃で45分反応させ更に０℃で４時間15分反応さ
せた。塩化メチレン（15ml）で希釈し水、1N
−HCl、水、飽和食塩水の順で洗い、芒硝で乾
燥後濃縮し粗アシル体588mgを得、（ａ法）に従
いシリカゲルクロマト（シリカゲル28ｇ）で精
製し、目的物を無色ガラス状として322mg
（69.4％）得た。このもののIR、NMRスペク
トルは（ａ法）で得られたもののそれと一致し
た。
(4‐2) （＋）−シス−７−〔（Ｒ）−２−フエニル−
２−アミノアセトアミド〕−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オン−
２−カルボン酸トリフロロ酢酸塩の製造法。
参考例４−１で得られる（±）−シス−７−
〔（Ｒ）−２−フエニル−２−ｔ−ブチルオキシ
カルボニルアミノアセトアミド〕−２−ｔ−ブ
チルオキシカルボニル−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オン280
mg（0.59ｍmole）を2.5mlの無水塩化メチレン、
2.5mlのアニソールに溶かし、氷冷下5.0mlのト
リフロロ酢酸を加え４時間50分氷冷下放置後濃
縮し残渣にエーテル10mlを加え室温で１時間撹
拌し生じた沈殿を取し淡黄色粉末の目的物を
202mg（70.9％）得た。
IR（KBr）νmax（cm-1） 1765、1680、1630
NMR：δ（D2O、内部標準としてDSSを用い
た）7.51（ｄ、5H）、6.31（ｍ、1H）、4.95
（ｄ、1H）、3.8〜3.5（ｍ、1H）、2.6〜2.9（ｍ、
4H）
（±）−シス−７−〔（Ｒ）−２−フエニル−２
−アミノアセトアミド〕−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オン−
２−カルボン酸のジアステレオアイソマーの分
離
上記で得られた化合物50mgを水150μに溶
かし、ボンダパツクＣ−18（Waters社製）を担
体とし７％−メタノール−0.2N燐酸二カリの
溶媒を用いた高速液体クロマトに８回分注す
る。254nｍでの吸光分析で２つの分画を集め、
それぞれ減圧下メタノールを除去後、凍結乾燥
する。再び水に溶解してダイヤイオンHP−10
（三菱化成社製）20mlのカラムに吸着させ、200
mlの水で洗浄後、20％エタノール水で溶出し、
ニンヒドリン発色のフラクシヨンを集め、凍結
乾燥してそれぞれＡ異性体14.0mg、Ｂ異性体
24.6mgの白色粉末を得た。
Ａ：14mg 高速液体クロマトで先に溶出する分
画
〔α〕22°
Ｄ（H2O、Ｃ＝0.5）−74.2゜
IR（KBr）νcm-1max：1750、1690、1640
PMR（D2O）δ：7.51（5H、ｓ）、6.15（1H、
ｔ、Ｊ＝3.9Hz）、5.20（1H、ｄ、Ｊ＝4.9
Hz）、5.19（1H、ｓ）、3.88（1H、octet、Ｊ
＝8.6、3.7、4.9Hz）、2.41〜1.41（4H、ｍ）
Ｂ：24.6mg 高速液体クロマトで後に出てくる
分画
〔α〕22°
Ｄ（H2O、ｃ＝0.5）＋57.2゜
IR（KBr）νcm-1max：1760、1690、1640
PMR（D2O）δ：7.51（5H、ｓ）、6.08（1H、
ｔ、Ｊ＝4.2Hz）、5.41（1H、ｄ、Ｊ＝4.9
Hz）、3.83（1H、octet、Ｊ＝8.6、3.7、4.9
Hz）、2.28〜1.01（4H、ｍ）
参考例 ５
（±）−シス−7β−〔（Ｒ）−２−フエニル−２
−アミノアセトアミド〕−4α−メチル−１−ア
ザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−
８−オン−２−カルボン酸・トリフロロ酢酸塩
の製造法
この化合物は次の２工程により製造される。
(5‐1) （±）−シス−7β−〔（Ｒ）−２−フエニル−
２−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノアセト
アミド〕−4α−メチル−２−ｔ−ブチルオキシ
カルボニル−１−アザビシクロ〔４，２，０〕
オクト−２−エン−８−オンの製造法
（Ｒ）−Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニルフ
エニルグリシン132mg（0.53ｍmole）を５mlの
乾燥テトラヒドロフランに溶かし０℃で1N−
Ｎ−メチルモルホリン0.53ml（0.53ｍmole）、
1N−クロル蟻酸イソブチル0.53ml（0.53ｍ
mole）を加え15分撹拌した後、トリエチルア
ミン0.07ml（0.5ｍmle）と前記（３−３）と同
様にして得られた（±）−シス−7β−アミノ−
4α−メチル−２−ｔ−ブチルオキシカルボニ
ル−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−
２−エン−８−オンの塩酸塩144mg（0.5ｍ
mole）を加えて１時間０℃で撹拌後一夜５〜
10℃で撹拌する。
酢酸エチル10mlで稀釈して10％クエン酸、飽
和重曹水、飽和食塩水の順で洗い、芒硝で乾燥
後濃縮して得られる粗アシル体をシリカゲルク
ロマトグラフイー〔ワコーゲルＣ−200 30ｇ、
溶媒、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル容量比３：１
以下同じ〕で精製して、目的物を粉末状として
140mg（57.6％）得た。
IR（KBr）νcm-1max 3330、1792（sh）、1782、
1730、1692、1675
NMR（CDCl3）δ（ppm） 7.34（5H、ｓ）、
6.73、6.60（1H、各々ｄ、Ｊ＝７Hz）、6.28
（1H、ｔ、Ｊ＝６Hz）、5.60（1H、ｍ）、5.43
〜5.18（2H、ｍ）、3.82（1H、ｍ）、2.55（1H、
ｍ）、1.69（2H、ｍ）、1.51（9H、ｓ）、1.41
（9H、ｓ）、1.09、1.03（3H、各々ｄ、Ｊ＝７
Hz）
(5‐2) （±）−シス−7β−〔（Ｒ）−２−フエニル−
２−アミノアセトアミド〕−4α−メチル−１−
アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン
−８−オン−２−カルボン酸・トリフロロ酢酸
の製造法
参考例（５−１）で得られる（±）−シス−
7β−〔（Ｒ）−２−フエニル−２−ｔ−ブチルオ
キシカルボニルアミノアセトアミド〕−4α−メ
チル−２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−１−
アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン
−８−オン80mg（0.17ｍmole）を１mlの無水
塩化メチレンにとかし氷水浴で冷却下トリフロ
ロ酢酸１mlを加え０〜５℃で3.5時間放置する。
この間時折振盪する。
減圧濃縮し残渣に無水エーテル５mlを加えよ
くリチユートし、エーテル層をデカンテーシヨ
ンで除く。この操作を３回くり返しケーキを減
圧乾燥し目的物を粉末状として80mg（100％）
得た。
IR（KBr）νcm-1max 3430、3200、3060、2960〜
2650、1780（sh）、1770、1695（sh）、1680
NMR（DMSO−d6）δ（ppm） 9.36（1H、ｄ、
Ｊ＝８Hz）、7.47（5H、ｓ）、6.28（1H、ｄ、
Ｊ＝６Hz）、5.40（1H、ｍ）、4.98（1H、ｍ）、
3.70（1H、br）、2.45（Br、DMSO−d6のシグ
ナルと一部重なる）、1.80（2H、ｍ）、1.06、
0.95（3H、各々ｄ、Ｊ＝7.5Hz）
上記（５−２）と同様にして得られる化合物30
mgを水100μに溶かし、ボンダパツクＣ−18を
担体とし７％−メタノール−0.2N燐酸二カリの
溶液を用いた高速液体クロマトに５回分注する。
254nｍでの吸光分析で２つの分画を集め、それ
ぞれ減圧下メタノールを除去後、凍結乾燥する。
再び水に溶かしてダイヤイオンHP−10 20mlの
カラムに吸着させ200mlの水次に20％エタノール
水で溶出し、20mlづつ分画する。
それぞれニンヒドリン発色の分画を集めて高極
性異性体Ａ（液体クロマトで先に出る分画）を8.9
mg（回収率29％）、低極性異性体Ｂ（液体クロマト
で後に出る分画）を11.4mg（同38％）得る。
それぞれの旋光度は以下の通りである。
Ａ異性体 〔α〕15°
Ｄ −38.4゜（H2O、ｃ＝0.5）
Ｂ異性体 〔α〕15°
Ｄ ＋4.23゜（H2O、ｃ＝0.52）
参考例 ６
（±）−シス−７−フエニルアセトアミド−１
−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エ
ン−８−オン−２−カルボン酸（下式）の製造
法
参考例１と同様にして得られる（±）−シス−
７−アミノ−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オ
クト−２−エン−８−オン−２−カルボン酸50.1
mg（0.28ｍmole）を１mlの水と２mlのアセトン
にとかし55.5mgの炭酸水素ナトリウムを加え、−
20℃に冷却下1N−フエニルアセチルクロリド−
塩化メチレン溶液0.3mlを加え20分撹拌後室温に
もどし更に２時間撹拌してから氷冷しながら10％
塩酸でPH1.5に調整した。酢酸エチル５mlで３回
抽出し飽和食塩水で洗い芒硝で乾燥し減圧濃縮す
る。析出する結晶を取し少量の酢酸エチルで洗
い目的物39.7mg（47.8％）を得る。
このものの物性値は以下の通り。
mp.192.0〜193.0℃
IR（KBr）νcm-1max 1770、1690、1650、1615
NMR（CD3OD）δ：7.22（5H、ｓ）、6.40（1H、
ｔ、Ｊ＝4.0）、5.33（1H、ｄ、Ｊ＝5.0）、3.57
（2H、ｓ）、2.5〜1.5（9H、ｍ）
参考例 ７
（±）−シス−7β−フエニルアセトアミド−4α
−メチル−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オ
クト−２−エン−８−オン−２−カルボン酸
（下式）の製造法
参考例３と同様にして得られる（±）−7β−ア
ミノ−4α−メチル−１−アザビシクロ〔４，２，
０〕−オクト−２−エン−８−オン−２−カルボ
ン酸・トリフロロ酢酸塩399mg（1.12ｍmole）を
水6.4ml−アセトン12.8ml中に溶かし炭酸水素ナ
トリウム432mg（5.14ｍmole）を加えて氷冷下撹
拌する。これにフエニルアセチルクロリド258.5
mg（5.14ｍmole）を加えて、氷冷下３時間反応
させた後0.1N−塩酸を加えてPH３として酢酸エ
チル10mlで５回抽出し飽和食塩水で洗い芒硝乾燥
後減圧濃縮する。エーテルを加えて析出した結晶
を取して242.7mgの目的物を得る。
上記酸性の水層を更に10mlの酢酸エチルで５回
抽出し同様の操作をくり返して27.6mgの目的物を
回収する。最後に上記酸性の水層に過剰の食塩を
加えて飽和にし酢酸エチル10mlで５回抽出して
21.3mgの目的物を得る。
合計得量291.6mg（72.6％）。
このものの物性値は以下の通り。
IR（KBr）νcm-1max 1775、1698、1655
NMR（CD3OD）δ：7.31（5H、ｓ）、6.48（1H、
ｄ、Ｊ＝5.0）、5.42（1H、ｄ、Ｊ＝5.2）、3.85
（1H、ｍ）、3.60（2H、ｓ）、2.62（1H、ｍ）、
1.60（2H、ｍ）、1.10（3H、ｄ、Ｊ＝7.5）
参考例 ８
（＋）7β−〔２−（２−アミノ−４−チアゾリ
ル）−２−シン−メトキシイミノアセトアミド〕
−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２
−エン−８−オン−２−カルボン酸〔式（）
で表わされる化合物〕の製造法。
２−（２−トリチルアミノ−４−チアゾリル）−
２−シン−メトキシイミノ酢酸131.3mg（0.30ｍ
mole）を１mlの無水ジクロルメタンに溶解し、−
20℃で4.1μのトリエチルアミンを加える。
次いで、五塩化燐61.7mgを加え−20℃で30分間
撹拌下に反応し、減圧濃縮し、残渣を１mlの無水
テトラヒドロフランに溶かして酸クロリド溶液を
つくる。
一方、実施例１と同様にして得られる（＋）−
7β−アミノ−１−アザビシクロ〔４，２，０〕
オクト−２−エン−８−オン−２−カルボン酸・
塩酸塩、１水和物40.2mg（0.17ｍmole）を１mlの
テトラヒドロフランと１mlの水の混合液に溶解
し、これに116.2μのトリエチルアミンを加え
る。氷冷撹拌下この溶液に上記で調製した酸クロ
リド溶液を滴下し、１時間反応させる。次いで５
％塩酸でPH2.0とし、酢酸エチル10mlで３回抽出
した後、該酢酸エチル層を飽和食塩水10mlで洗浄
し、次いで芒硝で乾燥後、減圧濃縮すると粗製の
アシル体93mgが得られる。これに50％酢酸10mlを
加え溶かし50℃で１時間30分撹拌した後、室温迄
却し析出した白色沈殿を去し、反応液を濃縮
し、残渣を少量のジメチルスルホキシドに溶か
し、10mlのHP−10を充填したカラムにチヤージ
する。溶出は水〜水：メタノール（１：２）で行
なう。シリカゲル薄層クロマト〔プレート：メル
クArt.5719（E.Merck製）、展開溶媒：ブタノー
ル：酢酸：水＝４：１：１〕で、Rf＝0.3のスポ
ツトに相当するフラクシヨンを集め、減圧濃縮す
ると13.5mg（収率22.4％）の目的物の白色結晶を
得る。
このものの物性値は下記の通り。
mp.172℃分解
〔α〕15°
Ｄ ＋32.6゜（DMSO、Ｃ＝0.5）
IR（KBr）νcm-1max 1765、1660、1630、1545
PMR（DMSO−d6）δ9.26（1H、ｄ）、7.19（2H、
ｓ）、6.75（1H、ｓ）、6.28（1H、ｔ）、5.50（1H、
ｄ−ｄ、Ｊ＝8.9、4.7）、3.83（3H、ｓ）、2.5〜
1.0（4H、ｍ）
これらの値は相当するdl体の値とよく一致す
る。
参考例 ９
（−）−7β−〔２−（２−アミノ−４−チアゾリ
ル）−２−シン−メトキシイミノアセトアミド〕
−4α−メチル−１−アザビシクロ〔４，２，
０）オクト−２−エン−８−オン−２−カルボ
ン酸〔式（）で表わされる化合物〕の製造
法。
２−（２−トリチルアミノ−４−チアゾリル）−
２−シン−メトキシイミノ酢酸76mg（0.17ｍ
mole）を1.52mlの無水ジクロルメタンに溶解し、
−15℃で17.3mg（0.17ｍmole）のトリエチルアミ
ンを加える。次いで五塩化燐35.7mg（0.17ｍ
mole）を加え、−15℃で30分間撹拌下に反応した
後、減圧濃縮し残渣を２mlの無水テトラヒドロフ
ランに溶かして酸クロリド溶液をつくる。
一方、後記実施例３と同様にして得られる
（−）7β−アミノ−１−アザビシクロ〔４，２，
０〕−オクト−２−エン−８−オン−２−カルボ
ン酸・カリウム塩・２水和物28mg（0.10ｍmole）
を1.5mlのテトラヒドロフラン−水（１：１）混
合溶媒に懸濁し、これにトリエチルアミン36.3mg
（0.36ｍmole）を加えると均一溶液となる。この
溶液に氷冷撹拌下、上記で調製した酸クロリド溶
液を滴下して、45分反応させる。次いで酢酸エチ
ル３mlで４回抽出した後、該酢酸エチル層を飽和
食塩水５mlで洗い、次いで芒硝で乾燥後、減圧濃
縮すると粗製のアシル体（式〔〕で表わされる
化合物）107.1mgが得られる。これに50％酢酸4.5
mlを加え溶かし、50−55℃で45分間撹拌した後、
室温迄冷却し、析出した白色沈殿を去し、ケー
キを50％酢酸２mlで洗う。この洗液と液を合し
て減圧濃縮する。残渣を少量のジメチルスルホキ
シドに溶かし、10mlのHP−10を充填したカラム
にチヤージする。
溶出は水：メタノール５：１〜２：１で行な
う。シリカゲル薄層クロマト（条件は前に同じ）
でRf＝0.54のスポツトに相当するフラクシヨンを
集めて減圧濃縮すると12.9mg（収率23.8％）の目
的物の白色粉末を得る。
このものの物性値は下記の通り。
mp.180℃近辺から分解
〔α〕15°
Ｄ −27゜（DMSO、Ｃ＝0.5）
IR（KBr）νcm-1max 1770、1672、1633、1540
pmr（DMSO−d6）δ：9.26（1H、ｄ、Ｊ＝8.3）、
7.18（2H、ｓ）、6.75（1H、ｓ）、6.31（1H、ｄ、
Ｊ＝5.1）、5.51（1H、ｄ−ｄ、Ｊ＝8.3、5.0）、
3.83（3H、ｓ）、1.67（2H、ｍ）、1.07（3H、ｄ、
Ｊ＝7.3）
この値は相当するdl体の値とよく一致する。
参考例 10
参考例８および９により得られる化合物の抗菌
活性は次のとおりである。
測定はHeart Infusion Agar Dilution法（PH
7.2）によつて行つた。
対応するdl体と同一側鎖をもつセフアロスポリ
ン化合物を対照とした。
Ａ：参考例８の化合物
A′：参考例８の化合物に対応するdl体
Ｂ：参考例９の化合物
B′：参考例９の化合物に対応するdl体
Ｃ：セフアロスポリン化合物
[Formula] 4β melting point 84.0-86.5℃ IR (KBr) νcm -1 max 2135, 1783, 1715, 1622 NMR (CDCl 3 ) δ (ppm) 6.13 (1H, d, J
= 2.7Hz), 4.90 (1H, d, J = 5.0Hz), 3.93~
3.73 (1H, m), 2.53 (1H, m), 2.16-1.75
(2H, m), 1.53 (9H, s), 1.20 (3H, d,
J=6.0Hz) 4α form Melting point 82.0-84.0℃ IR (KBr) νcm -1 max 2120, 1790, 1721, 1630 NMR (CDCl 3 ) δ (ppm) 6.33 (1H, d, J
= 5.0Hz), 5.00 (1H, d, J = 5.5Hz), 3.89~
3.68 (1H, m), 2.66 (1H, m), 1.82-1.57
(2H, m), 1.53 (9H, s), 1.12 (3H, d,
J=7.0Hz) (3-3) (±)-cis-7β-amino-4α-methyl-
2-t-Butyloxycarbonyl-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-ene-8-
on manufacturing Low polar isomer (±)-cis-7β-azido-4α-methyl-2- synthesized by (3-2)
t-Butyloxycarbonyl-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one
Dissolve 255mg in 10ml ethanol, 10% of 100mg
Add palladium on carbon and hydrogenate for 1.5 hours. Separate the catalyst and wash thoroughly with methanol.
When the liquid and washing liquid are combined and concentrated under reduced pressure, a pale yellow oil is obtained. Dissolved in 8 ml of ethyl acetate, extracted 5 times with 3 ml of 10% citric acid, and extracted the aqueous layer with potassium carbonate.
It becomes cloudy when neutralized to pH 6-7. ethyl acetate 5
ml twice, washed with saturated saline and dried with mirabilite to obtain 177 mg (76.6%) of the target product as an oil. IR (CHCl 3 ) νcm -1 max 3400, 1770, 1720, 1630 NMR (CDCl 3 ) δ (ppm) 6.23 (1H, d, J
= 5.0Hz), 4.53 (1H, d, J = 5.8Hz), 3.93~
3.47 (1H, m), 2.56 (1H, m), 1.92 (2H,
br), 1.80-1.60 (2H, m), 1.50 (9H, s),
1.31 (3H, d, J=7.0Hz) If this reduction is carried out by adding 1 equivalent of hydrochloric acid, the hydrochloride of the target product is obtained. (3-4) (±)-cis-7β-amino-4α-methyl-
1-Azabicyclo[4,2,0]octo-2-
Production of en-8-one-2-carboxylic acid trifluoroacetate (±)-cis-7β-amino-4α-methyl-2-t-butyloxycarbonyl-1-azabicyclo[4,
2,0] Oct-2-en-8-one 196 mg
(0.78 mmole) is dissolved in 4.2 ml of anhydrous dichloromethane, and 1.8 ml of trifluoroacetic acid is added while stirring at room temperature. After 1.5 hours, the mixture was concentrated under reduced pressure, anhydrous benzene was added, and the resulting oil was azeotropically distilled off. Ether was added to the resulting oil, tritiated, and the mixture was collected to obtain 167 mg (69.3%) of the desired product in the form of a powder. IR (KBr) νcm -1 max 3460, 2980~2500, 1780,
1685, 1630 pmr (D 2 O, internal standard DSS) δ: 6.77 (1H, d,
J=5.8Hz), 5.00 (1H, d, J=5.6Hz), 4.10
(1H, m), 2.83 (1H, m), 1.86 (2H, m),
1.15 (3H, d, J = 8.0Hz) Reference example 4 (±)-cis-7-[(R)-2-phenyl-2-
Aminoacetamide]-1-azabicyclo[4,
2,0] Method for producing oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid This compound is produced in the following two steps. (4-1) (±)-cis-7-[(R)-2-phenyl-
2-t-butyloxycarbonylaminoacetamide]-2-t-butyloxycarbonyl-
1-azabicyclo[4,2,0]octo-2-
Production method of en-8-one (Method a) (±)-cis-7-amino-2-t-butyloxycarbonyl-1-azabicyclo[4,2,0]octo- obtained in the same manner as in Reference Example 2
81 mg (0.34 mmole) of 2-en-8-one and 94.0 mg (0.34 mmole) of (R)-Nt-butyloxycarbonylphenylglycine were dissolved in 2 ml of anhydrous methylene chloride and cooled with ice-salt to give 77 mg.
(0.34 mmole) of dicyclohexylcarbodiimide dissolved in 1 ml of anhydrous methylene chloride is added. After reacting for 2 hours under ice cooling, 2 drops of acetic acid were added, stirred for an additional 20 minutes, and filtered under reduced pressure. cake 2.0
ml of ethyl acetate, add 20 ml of ether to the liquid and the washing liquid, wash with 1% aqueous phosphoric acid, saturated aqueous sodium bicarbonate, and saturated saline in that order, dry with sodium sulfate, and concentrate under reduced pressure to obtain 187 mg of crude product. This was purified by silica gel chromatography (9 g of silica gel, solvent n-hexane: ethyl acetate 1:1) to obtain 104 mg (64.9%) of the desired product as a colorless glass. IR (KBr) νmax (cm -1 ): 1770, 1750, 1720,
1630 NMR: δ (CDCl 3 ) 7.32 (s, 5H), 6.31 (m,
1H), 5.90 (m, 1H), 2.50-1.70 (m, 4H),
1.50 (s, 9H), 1.40 (s, 9H) (Method b) 297.3 mg (1.18 mmole) of (R)-Nt-butyloxycarbonylphenylglycine in 5 ml
Dissolved in anhydrous tetrahydrofuran at -30℃
Add 1.18 ml (1.18 mmole) of 1N-N methylmorpholine-tetrahydrofuran and 1.18 ml (1.18 mmole) of 1N-isobutyl chloroformate and stir for 30 minutes. (±)-cis-7-amino-2-t-butyloxycarbonyl-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one 234 mg (0.983 mmole )
Dissolve it in 5 ml of anhydrous methylene chloride and add -30
The reaction was allowed to proceed at 0.degree. C. for 45 minutes, and then at 0.degree. C. for 4 hours and 15 minutes. diluted with methylene chloride (15 ml) water, 1N
- Washed with HCl, water, and saturated saline in that order, dried with Glauber's salt, and concentrated to obtain 588 mg of crude acyl compound. Purified with silica gel chromatography (28 g of silica gel) according to (method a) to obtain 322 mg of the target product in the form of a colorless glass.
(69.4%) obtained. The IR and NMR spectra of this product matched those obtained by (method a). (4-2) (+)-cis-7-[(R)-2-phenyl-
2-Aminoacetamido]-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-
Method for producing 2-carboxylic acid trifluoroacetate. (±)-cis-7- obtained in Reference Example 4-1
[(R)-2-phenyl-2-t-butyloxycarbonylaminoacetamide]-2-t-butyloxycarbonyl-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one 280
mg (0.59 mmole) in 2.5 ml anhydrous methylene chloride,
Dissolved in 2.5 ml of anisole, added 5.0 ml of trifluoroacetic acid under ice cooling, left under ice cooling for 4 hours and 50 minutes, concentrated, added 10 ml of ether to the residue, stirred at room temperature for 1 hour, collected the resulting precipitate, and obtained a pale yellow powder. the object
202 mg (70.9%) was obtained. IR (KBr) νmax (cm -1 ) 1765, 1680, 1630 NMR: δ (D 2 O, using DSS as internal standard) 7.51 (d, 5H), 6.31 (m, 1H), 4.95
(d, 1H), 3.8-3.5 (m, 1H), 2.6-2.9 (m,
4H) (±)-cis-7-[(R)-2-phenyl-2
-aminoacetamide]-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-
Separation of diastereoisomers of 2-carboxylic acid 50 mg of the compound obtained above was dissolved in 150μ of water, and a solvent of 7% methanol and 0.2N dipotassium phosphate was used with Bondapak C-18 (manufactured by Waters) as a carrier. Dispense into high performance liquid chromatography 8 times. Two fractions were collected by absorbance analysis at 254 nm.
After removing methanol under reduced pressure, each sample is freeze-dried. Dissolve in water again and use Diamond Ion HP-10.
(manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd.) Adsorbed on a 20 ml column, 200
After washing with ml of water, elute with 20% ethanol water,
The ninhydrin colored fractions were collected and lyophilized to yield 14.0 mg of A isomer and 14.0 mg of B isomer, respectively.
24.6 mg of white powder was obtained. A: 14 mg Fraction eluting first in high performance liquid chromatography [α] 22° D (H 2 O, C = 0.5) −74.2° IR (KBr) νcm -1 max: 1750, 1690, 1640 PMR (D 2 O ) δ: 7.51 (5H, s), 6.15 (1H,
t, J = 3.9Hz), 5.20 (1H, d, J = 4.9
Hz), 5.19 (1H, s), 3.88 (1H, octet, J
=8.6, 3.7, 4.9Hz), 2.41-1.41 (4H, m) B: 24.6mg Fraction that comes out later in high performance liquid chromatography [α] 22° D (H 2 O, c = 0.5) + 57.2° IR (KBr) νcm -1 max: 1760, 1690, 1640 PMR (D 2 O) δ: 7.51 (5H, s), 6.08 (1H,
t, J = 4.2Hz), 5.41 (1H, d, J = 4.9
Hz), 3.83 (1H, octet, J=8.6, 3.7, 4.9
Hz), 2.28-1.01 (4H, m) Reference example 5 (±)-cis-7β-[(R)-2-phenyl-2
-aminoacetamide]-4α-methyl-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-ene-
Method for producing 8-one-2-carboxylic acid trifluoroacetate This compound is produced by the following two steps. (5-1) (±)-cis-7β-[(R)-2-phenyl-
2-t-butyloxycarbonylaminoacetamide]-4α-methyl-2-t-butyloxycarbonyl-1-azabicyclo[4,2,0]
Method for producing oct-2-en-8-one (R)-N-t-Butyloxycarbonylphenylglycine (132 mg (0.53 mmole)) was dissolved in 5 ml of dry tetrahydrofuran and heated to 1N-
N-methylmorpholine 0.53ml (0.53mmole),
1N-isobutyl chloroformate 0.53ml (0.53m
After stirring for 15 minutes, 0.07 ml (0.5 mmle) of triethylamine and (±)-cis-7β-amino-
4α-Methyl-2-t-butyloxycarbonyl-1-azabicyclo[4,2,0]octo-
2-en-8-one hydrochloride 144mg (0.5m
mole) and stirred at 0℃ for 1 hour, then overnight at 5~
Stir at 10°C. The crude acyl compound obtained by diluting with 10 ml of ethyl acetate, washing with 10% citric acid, saturated sodium bicarbonate solution, and saturated saline in this order, drying with sodium sulfate, and concentrating the resulting crude acyl compound was subjected to silica gel chromatography [Wakogel C-200 30 g,
Solvent, n-hexane-ethyl acetate volume ratio 3:1
The same applies hereafter] to obtain the desired product in powder form.
140 mg (57.6%) was obtained. IR (KBr) νcm -1 max 3330, 1792 (sh), 1782,
1730, 1692, 1675 NMR (CDCl 3 ) δ (ppm) 7.34 (5H, s),
6.73, 6.60 (1H, each d, J = 7Hz), 6.28
(1H, t, J=6Hz), 5.60 (1H, m), 5.43
~5.18 (2H, m), 3.82 (1H, m), 2.55 (1H,
m), 1.69 (2H, m), 1.51 (9H, s), 1.41
(9H, s), 1.09, 1.03 (3H, each d, J=7
Hz) (5-2) (±)-cis-7β-[(R)-2-phenyl-
2-aminoacetamide]-4α-methyl-1-
Process for producing azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid/trifluoroacetic acid (±)-cis- obtained in Reference Example (5-1)
7β-[(R)-2-phenyl-2-t-butyloxycarbonylaminoacetamide]-4α-methyl-2-t-butyloxycarbonyl-1-
80 mg (0.17 mmole) of azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one is dissolved in 1 ml of anhydrous methylene chloride, and while cooling in an ice water bath, 1 ml of trifluoroacetic acid is added and allowed to stand at 0 to 5°C for 3.5 hours.
Shake occasionally during this time. Concentrate under reduced pressure, add 5 ml of anhydrous ether to the residue, rejuvenate well, and remove the ether layer by decantation. Repeat this operation 3 times and dry the cake under reduced pressure to obtain 80 mg (100%) of the target product in powder form.
Obtained. IR (KBr) νcm -1 max 3430, 3200, 3060, 2960~
2650, 1780 (sh), 1770, 1695 (sh), 1680 NMR (DMSO-d 6 ) δ (ppm) 9.36 (1H, d,
J=8Hz), 7.47 (5H, s), 6.28 (1H, d,
J=6Hz), 5.40 (1H, m), 4.98 (1H, m),
3.70 (1H, br), 2.45 (Br, partially overlaps with DMSO-d 6 signal), 1.80 (2H, m), 1.06,
0.95 (3H, each d, J = 7.5Hz) Compound 30 obtained in the same manner as in (5-2) above
mg was dissolved in 100 μm of water and dispensed five times onto a high performance liquid chromatograph using Bondapak C-18 as a carrier and a solution of 7% methanol and 0.2N dipotassium phosphate.
Two fractions are collected by absorbance analysis at 254 nm, and each fraction is lyophilized after removing methanol under reduced pressure.
Dissolve in water again, adsorb onto a 20ml Diaion HP-10 column, elute with 200ml of water, then 20% ethanol water, and fractionate into 20ml portions. Collect the ninhydrin-colored fractions and collect the highly polar isomer A (the fraction that appears first in liquid chromatography) at 8.9%.
mg (recovery rate 29%) and 11.4 mg (recovery rate 38%) of low polar isomer B (fraction that appears later in liquid chromatography). The respective optical rotations are as follows. A isomer [α] 15° D −38.4° (H 2 O, c=0.5) B isomer [α] 15° D +4.23° (H 2 O, c=0.52) Reference example 6 (±) − cis-7-phenylacetamide-1
-Production method of azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid (formula below) (±)-cis- obtained in the same manner as Reference Example 1
7-amino-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid 50.1
Dissolve mg (0.28 mmole) in 1 ml of water and 2 ml of acetone, add 55.5 mg of sodium bicarbonate, and -
1N-phenylacetyl chloride under cooling to 20℃
Add 0.3ml of methylene chloride solution, stir for 20 minutes, return to room temperature, stir for another 2 hours, and add 10% methylene chloride solution while cooling on ice.
The pH was adjusted to 1.5 with hydrochloric acid. Extract three times with 5 ml of ethyl acetate, wash with saturated brine, dry with sodium sulfate, and concentrate under reduced pressure. Take the precipitated crystals and wash with a small amount of ethyl acetate to obtain 39.7 mg (47.8%) of the desired product. The physical properties of this product are as follows. mp.192.0~193.0℃ IR (KBr) νcm -1 max 1770, 1690, 1650, 1615 NMR (CD 3 OD) δ: 7.22 (5H, s), 6.40 (1H,
t, J=4.0), 5.33 (1H, d, J=5.0), 3.57
(2H, s), 2.5-1.5 (9H, m) Reference example 7 (±)-cis-7β-phenylacetamide-4α
-Production method of methyl-1-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid (formula below) (±)-7β-amino-4α-methyl-1-azabicyclo[4,2,
0] - Oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid trifluoroacetate 399 mg (1.12 mmole) was dissolved in 6.4 ml of water - 12.8 ml of acetone and 432 mg (5.14 mmole) of sodium bicarbonate was added and cooled on ice. Stir under. In this, phenylacetyl chloride 258.5
After reacting for 3 hours under ice-cooling, 0.1N hydrochloric acid was added to adjust the pH to 3, and the mixture was extracted five times with 10 ml of ethyl acetate, washed with saturated brine, dried with sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. Add ether and collect the precipitated crystals to obtain 242.7 mg of the desired product. The above acidic aqueous layer was further extracted five times with 10 ml of ethyl acetate, and the same operation was repeated to recover 27.6 mg of the target product. Finally, add excess common salt to the acidic aqueous layer to saturate it, and extract 5 times with 10 ml of ethyl acetate.
Obtain 21.3 mg of target product. Total yield 291.6 mg (72.6%). The physical properties of this product are as follows. IR (KBr) νcm -1 max 1775, 1698, 1655 NMR (CD 3 OD) δ: 7.31 (5H, s), 6.48 (1H,
d, J=5.0), 5.42 (1H, d, J=5.2), 3.85
(1H, m), 3.60 (2H, s), 2.62 (1H, m),
1.60 (2H, m), 1.10 (3H, d, J = 7.5) Reference example 8 (+)7β-[2-(2-amino-4-thiazolyl)-2-syn-methoxyiminoacetamide]
-1-azabicyclo[4,2,0]octo-2
-en-8-one-2-carboxylic acid [formula ()
A method for producing a compound represented by 2-(2-tritylamino-4-thiazolyl)-
2-syn-methoxyiminoacetic acid 131.3mg (0.30m
mole) in 1 ml of anhydrous dichloromethane, -
Add 4.1μ triethylamine at 20 °C. Next, 61.7 mg of phosphorus pentachloride was added and reacted at -20°C for 30 minutes with stirring, concentrated under reduced pressure, and the residue was dissolved in 1 ml of anhydrous tetrahydrofuran to prepare an acid chloride solution. On the other hand, (+)− obtained in the same manner as in Example 1
7β-amino-1-azabicyclo[4,2,0]
Oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid.
40.2 mg (0.17 mmole) of the hydrochloride monohydrate is dissolved in a mixture of 1 ml of tetrahydrofuran and 1 ml of water, and 116.2 μ of triethylamine is added thereto. The acid chloride solution prepared above was added dropwise to this solution under ice-cooling and stirring, and the mixture was allowed to react for 1 hour. then 5
After adjusting the pH to 2.0 with % hydrochloric acid and extracting three times with 10 ml of ethyl acetate, the ethyl acetate layer was washed with 10 ml of saturated brine, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to obtain 93 mg of the crude acyl compound. Add 10 ml of 50% acetic acid to the solution, stir at 50℃ for 1 hour and 30 minutes, cool to room temperature, remove the white precipitate, concentrate the reaction solution, dissolve the residue in a small amount of dimethyl sulfoxide, and add 10 ml of HP. Charge the column packed with -10. Elution is performed with water to water:methanol (1:2). Using silica gel thin layer chromatography [plate: Merck Art.5719 (manufactured by E.Merck), developing solvent: butanol:acetic acid:water = 4:1:1], the fraction corresponding to the spot with Rf = 0.3 was collected and concentrated under reduced pressure. Obtain 13.5 mg (yield 22.4%) of the desired product as white crystals. The physical properties of this product are as follows. mp.172℃ decomposition [α] 15° D +32.6° (DMSO, C=0.5) IR (KBr) νcm -1 max 1765, 1660, 1630, 1545 PMR (DMSO−d 6 ) δ9.26 (1H, d), 7.19 (2H,
s), 6.75 (1H, s), 6.28 (1H, t), 5.50 (1H,
dd, J=8.9, 4.7), 3.83 (3H, s), 2.5~
1.0 (4H, m) These values agree well with the values of the corresponding dl body. Reference example 9 (−)-7β-[2-(2-amino-4-thiazolyl)-2-syn-methoxyiminoacetamide]
-4α-methyl-1-azabicyclo[4,2,
0) Method for producing oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid [compound represented by formula ()]. 2-(2-tritylamino-4-thiazolyl)-
2-syn-methoxyiminoacetic acid 76mg (0.17m
mole) in 1.52 ml of anhydrous dichloromethane,
Add 17.3 mg (0.17 mmole) of triethylamine at -15°C. Next, 35.7 mg (0.17 m
After reacting at -15°C for 30 minutes with stirring, the mixture was concentrated under reduced pressure and the residue was dissolved in 2 ml of anhydrous tetrahydrofuran to prepare an acid chloride solution. On the other hand, (-)7β-amino-1-azabicyclo[4,2,
0]-Oct-2-en-8-one-2-carboxylic acid potassium salt dihydrate 28mg (0.10mmole)
was suspended in 1.5 ml of tetrahydrofuran-water (1:1) mixed solvent, and 36.3 mg of triethylamine was added to this.
(0.36 mmole) becomes a homogeneous solution. The acid chloride solution prepared above was added dropwise to this solution while stirring on ice, and the mixture was allowed to react for 45 minutes. Then, after extraction four times with 3 ml of ethyl acetate, the ethyl acetate layer was washed with 5 ml of saturated saline, dried over sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to obtain 107.1 mg of the crude acyl compound (compound represented by formula []). . Add this to 50% acetic acid 4.5
After adding ml and dissolving it, stirring at 50-55℃ for 45 minutes,
Cool to room temperature, remove the white precipitate, and wash the cake with 2 ml of 50% acetic acid. This washing liquid and liquid are combined and concentrated under reduced pressure. Dissolve the residue in a small amount of dimethyl sulfoxide and charge it to a column packed with 10 ml of HP-10. Elution is carried out with water:methanol 5:1 to 2:1. Silica gel thin layer chromatography (conditions are the same as before)
The fraction corresponding to the spot with Rf = 0.54 is collected and concentrated under reduced pressure to obtain 12.9 mg (yield 23.8%) of the target product as a white powder. The physical properties of this product are as follows. mp. Decomposes from around 180℃ [α] 15° D −27° (DMSO, C=0.5) IR (KBr) νcm -1 max 1770, 1672, 1633, 1540 pmr (DMSO−d 6 ) δ: 9.26 (1H , d, J=8.3),
7.18 (2H, s), 6.75 (1H, s), 6.31 (1H, d,
J = 5.1), 5.51 (1H, dd, J = 8.3, 5.0),
3.83 (3H, s), 1.67 (2H, m), 1.07 (3H, d,
J = 7.3) This value agrees well with the value of the corresponding dl body. Reference Example 10 The antibacterial activities of the compounds obtained in Reference Examples 8 and 9 are as follows. The measurement was performed using the Heart Infusion Agar Dilution method (PH
7.2). A cephalosporin compound with the same side chain as the corresponding dl form was used as a control. A: Compound A' of Reference Example 8: dl form corresponding to the compound of Reference Example 8 B: Compound B' of Reference Example 9: dl form corresponding to the compound of Reference Example 9 C: Cephalosporin compound
Claims (1)
表わされるセフアロスポリン類縁体およびその塩
類。 ２ 一般式（） （式中、Ｒは置換もしくは非置換の不飽和炭素６
員環基、または置換もしくは非置換の複素５員環
基を表わし、Ｘは水素、アミノ基、水酸基または
低級アルキル基を表わし、R1は水素またはメチ
ル基を表わし、６位、７位の水素はシスの関係に
ある）で表わされる化合物を光学選択的に脱アシ
ル化して一般式（） （式中、R1は水素またはメチル基を表わす）で
表わされるセフアロスポリン類縁体を生成する能
力を有するアロエモナス属、アクロモバクター
属、アースロバクター属、アセトバクター属、ア
ルカリゲネス属、エシエリシア属、キサントモナ
ス属、クルイベラ属、グルコノバクター属、クロ
ストリジウム属、コマモナス属、コリネバクテリ
ウム属、ザルシナ属、スタフイロコツカス属、ス
ピリルム属、バチルス属、プシユードモナス属、
フラボバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、
プロタミノバクター属、プロテウス属、ベネケア
属、ミコプラーナ属、ロドプシユードモナス属に
属する微生物および／または該微生物の培養処理
物を用いて光学選択的に脱アシル化することを特
徴とする一般的（）で表わされるセフアロスポ
リン類縁体またはその塩類の製造法。[Claims] 1 General formula () (In the formula, R 1 represents hydrogen or a methyl group.) A cephalosporin analog and its salts. 2 General formula () (In the formula, R is substituted or unsubstituted unsaturated carbon 6
represents a membered ring group or a substituted or unsubstituted 5-membered heterocyclic group, X represents hydrogen, an amino group, a hydroxyl group, or a lower alkyl group, R 1 represents hydrogen or a methyl group, and hydrogen at the 6th and 7th positions is in a cis relationship) is optically selectively deacylated to form the general formula (). Aloemonas, Achromobacter, Arthrobacter, Acetobacter, Alcaligenes, Escherichia, and Xanthomonas have the ability to produce cephalosporin analogs represented by (wherein R 1 represents hydrogen or a methyl group) Genus, Kluybella, Gluconobacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Sarcina, Staphylococcus, Spirillum, Bacillus, Pseudomonas,
Flavobacterium, Brevibacterium,
A general method characterized by optically selective deacylation using a microorganism belonging to the genus Protaminobacter, Proteus, Benecea, Mycoplana, or Rhodopseudomonas and/or a cultured product of the microorganism. A method for producing a cephalosporin analog represented by () or its salts.
Priority Applications (10)
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| DE8080100663T DE3066533D1 (en) | 1979-02-10 | 1980-02-08 | Optically active cephalosporin analogs, process for their preparation and their use in the preparation of pharmaceutical compositions |
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Citations (4)
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| JPS5549376A (en) * | 1978-10-04 | 1980-04-09 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Cephalosporin analog |
| JPS5559186A (en) * | 1978-10-28 | 1980-05-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Cephalosporin analog |
| JPS5587788A (en) * | 1978-12-26 | 1980-07-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Cephalosporin analog |
-
1979
- 1979-08-24 JP JP10707079A patent/JPS5630976A/en active Granted
Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| JPS54128591A (en) * | 1978-03-25 | 1979-10-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Cephalosporin analog |
| JPS5549376A (en) * | 1978-10-04 | 1980-04-09 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Cephalosporin analog |
| JPS5559186A (en) * | 1978-10-28 | 1980-05-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Cephalosporin analog |
| JPS5587788A (en) * | 1978-12-26 | 1980-07-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Cephalosporin analog |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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