JPS63502829A - 本態性高血圧マ−カ−の検出方法及びその診断的使用 - Google Patents

本態性高血圧マ−カ−の検出方法及びその診断的使用

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JPS63502829A JP62501461A JP50146187A JPS63502829A JP S63502829 A JPS63502829 A JP S63502829A JP 62501461 A JP62501461 A JP 62501461A JP 50146187 A JP50146187 A JP 50146187A JP S63502829 A JPS63502829 A JP S63502829A
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コワルスキ，ズロ−マ
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ザ・トラステイ−ズ・オブ・コロンビア・ユニヴア−シテイ・イン・ザ・シテイ・オブ・ニユ−・ヨ−ク
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 、性　血　マー　−の　゛　び　の袷 ここに記載する発明はＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａ ｌｔｈ。
Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａ ｎｄ　Ｈｕ＋ｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓによる認可＾８０１４８３、ＨＬ１６８５ １及び＾８２１２３８の下で政府の支援により実現したものである。政府は本発 明の権利の一部分を所有する。
１弧へＩＬ 本出願明細書では種々の出版物を引用し、その参照番号を括弧内に示した。これ らの出版物の完全なリストを「請求の範囲」の前で本明細書の最後に添付する０ 本発明に関連した技術分野の現状をより明らかにすべく、これらの出版物による 教示は総て参考として本出願明細書に包含される。
動脈高血圧とは、全身動脈血圧が持続的に高レベルを示す状態を言う、高血圧と 見なされる全身動脈圧の最低レベルは任意に１４０／９０ｍ１ａ　Ｈｇに設定さ れてきた。高血圧は通常平均血圧（ｍｅａｎ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）及び脈圧を上 昇させるが、拡張期圧の上昇は臨床的に臨界的判断基準（ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｃ ｒｉｔｅｒｉ−ｏｎ）と見なされ、高血圧が主として抹消抵抗の増加に起因する ことを示唆する。
高血圧は重大な心血管疾病である。高血圧は５０歳以上の人々の死因の約１０％ を占めている。しかしながら、このグループの人々の多くは１７０７９０程度の 高い血圧を有していても高血圧症状を示さないことがあり、これらの人々の約７ ５％が高血圧の原因となったと思われる病気で死亡している。
高血圧は重大な臨床的疾患であるが、その理由は高血圧が心臓、脳、腎臓及び動 脈脈管系の器官変化を生起するからである。高血圧にかかると、心臓は正常のレ ベルより高い圧力に逆らって血液を動脈系に送り込まなければならない、その結 果、心臓は余計な仕事をしなければならないことになり、従って肥大する。肥大 は場合によっては心筋不全につながり得る。大脳脈管系は体の他の部分に見られ るような組織支持体（ｔｉｓｓｕｅ　５ｕｐｐｏｒｔ）をもたず、高血圧患者の 大脳出血は珍しくない、動脈腎硬化（ａｒｔｅｒ　１ｏｎｅｐｈｒｏ−ｓｃｌｅ ｒｏｓｉｓ）に起因する腎不全はしばしば高血圧の合併症として生じる。高血圧 性動脈系にストレスが継続的に加えられると、最終的には動脈の壁が硬化する。
この血管系の変化は組織血液の流れを変化させ、その結果組織機能を破壊させ得 る。
高血圧症の約３０％においては、高い血圧は特定の病気、例えば腎不全の臨床的 兆候であって病気の実体そのものではない。このような高血圧状態は二次性高血 圧と称する。
残りの７０％においては、高血圧の発生を何等かの公知の原因に帰することがで きず、恐らくは特定の病気状態を表すと考えられる。
本態性高血圧は、この原因不明の全身動脈血圧の持続的上昇を指す、高血圧は何 年もの間にゆっくり且つ漸進的に進行するという意味で「良性」であり得、又は 短期間のうちに急速に進行する「悪性」であり得る０本態性高血圧の原因を究明 する努力はこれまで成果を見ながった。腎疾患、副腎機能不全又は心血管及び神 経性変化に起因する高血圧を除くと、現時点では納得のいく原因は不明である。
自然発生的高血圧症のラット（１）はヒト本態性高血圧（２−５）で観察される 特徴を示し、ヒト疾患のモデルとして大きく注目されてきた０例えば、カルシウ ム結合又は移行の異常は、遺伝学的に調べたラットの疾患（２，６−１５）とヒ トの病気の双方で検出された。これらのカルシウム異常は、高血圧の病因の基礎 となり得るため特に重要である（６−１２．１４−１６）。
自然発生的高血圧症ラット（ＳＩＲ）に見られる変化には、種々の細胞型（ｃｅ ｌｌ　ｔｙｐｅ）の細胞膜に対するカルシウム結合の低下（２，１３−１５）　 ；アデノシン三リン酸に依存する能動輸送を介する細胞質ゾルからのカルシウム 流出の減損（７−１２，１４）；及び陽イオン（カルシウムイオン）に対する赤 血球膜の受動透過性の増加（１４）がある、これらの変化は細胞質ゾルのイオン 化Ｃａ”″濃度を増加させることが予想され、興奮性細胞の場合には血管平滑筋 の緊張（ｔｏｎｅ）及び血液循環の抹消抵抗を増加させると思われる（１５）、 ヒト本態性高車と比べて低下しく２）、血小板中のイオン化Ｃａ　ｔ−’濃度が 増加する（１６）　。
前述の事実は、５ｔ（Ｒにおいて遺伝学的に検出されるカルシウム結合膜成分の 変化を示唆する。比較的大きな親和力でカルシウムと結合し且つビタミンＤと食 物カルシウムのレベルとで調節される膜内在住カルシウム結合タンパク質ＩＭＣ ＡＬをラットの腸粘膜から単離することは既に開示されている（１７−１９）　 、腸のＩＭＣＡＬのカルシウム結合活性が粘膜の陽イオン輸送能力に密接に関連 しているという事実（１７，２０）は、ＩＭＣＡＬがカルシウムの移行を媒介又 は調節する膜メカニズムの一成分であることを示唆する。　ＩＭＣＡＬに対する ポリクローナル抗血清又はマウスモノクローナル抗体を使用して行ったイムノア ッセイでは、前記タンパク質が多くのラット組織に存在することが判明した（１ ９）、　ＩＮＣＡＬ含量の低下は５ＨＲＲへのカルシウム結合の低下の原因であ り得ることから、ＳＨＲ，Ｗｉｓｔａｒ　Ｋｙｏｔｏ対照及び５ｈｅｒａ＋ｉｎ 株対照の組織に対するイムノアッセイを評価した。その結果、少なくとも７つの ＳＨＲ組織ではＩＭＣＡＬ含量が正常血圧対照より大幅に少ないことが判明した 。更に、この変化は、高血圧性血圧レベルが生じる前の生後４週間の若い５）Ｉ Ｒに観察される。
本悪性高血圧は長期の有害な効果を有するため、組織に存在するＩＭＣＡＬの相 対量を同定する方法があると有益である。　ＩＭＣＡＬ量の減少はＳＩＲと同様 にヒト患者においても本態性高血圧を生じさせると考えられるからである。
また、ヒトの本態性高血圧の流行に鑑みて、本態性高血圧にかかり易い体質の個 体を同定する方法があると有益である。
このような方法は簡単且つ正確な診断テストとして経済上の観点から極めて重要 であり、当該疾病素質をもつ患者機することにもなると考えられる。
また、本態性高血圧に関与するタンパク質又はメツセンジャーＲＮＡの単離によ って、本悪性高血圧の治療に関する新しい薬の研究も可能になるであろう。
ｉｉへ１１ 本発明は、分子量が非変性界面活性剤中では約２００．０００ダルトン、ドデシ ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル中では約２０，５００ダルトンであり 、遮断されたアミノ末端を有し、等電点が約４．５であり、且つカルシウム複合 体形成のアフィニティ定数が約２．４マイクロモラー（＋＊ｉｃｒｏｍｏｌａｒ ）である、精製された膜内在住カルシウム結合タンパク質を提供する。
本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞系＾ＴＣ ＣＮｏ、　ＨＢ　９３１７を用いて製造し、ＲＣ２８６／１０１と名付けた。
本発明のタンパク質の製造方法の１つは下記のステップからなる： ａ、動物の組織から膜タンパク質を抽出して膜タンパク質抽出物を形成し； ｂ、前記抽出膜タンパク質を可溶化し；Ｃ，モノクローナル抗体ＲＣ２Ｂ６／Ｉ ＤＩを用いて免疫沈降又はイムノアフィニティクロマトグラフィーにより前記可 溶化膜タンパク質から請求の範囲１に記載のタンパク質を回収する。
本発明は、本態性高血圧に関与する膜内在住カルシウム結合タンパク（ＩＭＣＡ Ｌ）の存在をヒト体内で検出する方法に係わる。この方法は、ヒトから組織を単 離し、この組織を処理して膜内在住タンパク質を得、このタンパク質を膜内在住 カルシウム結合タンパク質に特異的に結合する唯一の第１抗体分子と接触させて 検出可能なタンパク質−抗体複合体を形成し、このようにして形成した複合体を 検出することからなる。
前記検出操作には、検出可能マーカーで標識した第１抗体又はマトリクスに結合 した第１抗体を使用し得る。前記複合体は酵素反応の検出可能生成物を形成させ 得、又はオートラジオグラフィーによって検出され得る。
前記検出操作はまた、タンパク質−第１抗体複合体に結合する第２抗体分子も使 用し得る。この第２抗体は検出可能マーカーで標識し得、この複合体はオートラ ジオグラフィー又は比色計で検出し得る。
本発明は、本態性高血圧に関与する膜内在性カルシウム結合タンパク質（ＩＭＣ ＡＬ）のヒト体内での量を定量的に測定する方法にも係わる。この方法はヒトか ら組織を単離し、この組織を処理して膜内在性タンパク質を得、このようにして 得たタンパク質を膜内在性カルシウム結合タンパク質に結合する抗体分子と接触 させて同定可能なタンパク質−抗体複合体を形成し、このようにして形成した複 合体の量を定量することからなる。
本発明はまた、本悪性高血圧に関与する膜内在性カルシウム結合タンパク質をコ ードするメツセンジャーリボ核酸（ｍＲＮ＾）の量をヒト体内で定量する方法に も係わる。この方法は、ヒトから組織を単離し、この組織を処理して−ＲＮ＾を 得、このようにして得たｍＲＮ＾を膜内在性カルシウム結合タンパク質をコード するｍＲＮ＾に結合するｃＤＮ＾プローブと接触させて同定可能なｍＲＮ八−ｃ ＤＮ＾複合体を形成し、この複合体の呈を定量することからなる。
本発明は更に、本態性高血圧にかかり易い体質をもつ個体を同定する診断方法に も係わる。この方法は個体から組織を単離し、この組織を処理して膜内在性タン パク質を得、このタンパク質を膜内在性カルシウム結合タンパク質と結合する抗 体分子に接触させて同定可能なタンパク質−抗体複合体を形成し、この複合体の 量を定量し、これを正常な個体の組織から得た結合タンパク質量と比較し、結合 量の大幅な減少をもって当該疾病に対する疾病素質を有するものとすることから なる。
本発明は更に、本態性高血圧に関与する膜内在性カルシウム結合タンパク質をコ ードするメツセンジャーリボ核酸（ｍＲＮ＾）の量をヒト体内で定量する方法に も係わる。この方法は、ヒトから組織を単離し、この組織を処理して−ＲＮ＾を 得、このようにして得た翰ＲＮ＾を膜内在性カルシウム結合タンパク質をコード するｍＲＮ＾に結合するｅＤＮ＾プローブと接触させて同定可能なｍＲＮ＾−ｃ ＤＮ＾複合体を形成し、この複合体の量を定量することからなる。
本発明はまた、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル中で約２０　 、５００ダルトンの分子量を有し且つ本態性高血圧に関与することを特徴とする 膜内在性カルシウム形成タンパク質にも係わる。
本発明は更に、動物の免疫系を膜内在性カルシウム結合タンパク質と接触させて 製造した抗体分子にも係わる。尚前記タンパク質は本態性高血圧に関与し、ドデ シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル中で約２０，５００ダルトンの分 子量を有し、該ゲルから単離したものである。
日　の；　４　ｔ　；　日 本発明は、非変性界面活性剤中の分子量約２００．０００ダルトン及びドデシル 硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル中の分子量約２０，５００ダルトンを有 し、遮断された（ｂｌｏｃｋｅｃｌ＞アミン末端をもち、筈電点約４．５をもち 、カルシウムとの複合体を形成するアフィニティ定数約２．４マイクロモラーを もつ精製された膜内在性カルシウム結合タンパク質を提供する。
本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞系＾ＴＣ ＣＮｏ、ＨＢ９３１７によって産生されＲＣ２Ｂ６／１０１と命名された。
本発明のタンパク質の調製方法は、 （、）動物組織から膜タンパク質を抽出して膜タンパク質抽出物を形成し、 （ｂ）抽出した膜タンパク質を可溶化し、（ｃ）モノクローナル抗体ＲＣ２Ｂ６ ／ＩＤ１を用いた免疫沈降又はイムノアフィニテイクロマトグラフイー処理によ って可溶化した膜タンパク質から請求の範囲１のタンパク質を回収する ことを特徴とする。
本発明はまた、ヒトの本態性高血圧に関連する膜内在性カルシウム結合タンパク 質の存在を検出する方法を提供する。該方法は、ヒトから組織を単離し、膜内在 性タンパク質を得るように組織を処理し、このように得られたタンパク質と膜内 在性カルシウム結合タンパク質に結合する第一抗体分子とを接触させて検出可能 なタンパク質−抗体複合体を形成し、このように形成された複合体を検出する処 理本発明の実施に最も有効な組織は赤血球膜又は胎盤である。しかしながら、腸 、腎臓、骨、脳、心臓、精巣、牌臓、骨格筋、肝臓又はその他の適当な組織も使 用し得る。
膜内在性タンパク質は当業者に公知の種々の方法で単離され得る。単離は、洗浄 、遠心、低浸透圧条件下の溶解、掻取り及びホモジナイゼーション等の処理を含 み得る。その他の種々の処理の使用も可能である。遠心の時間及び力、ホモジナ イゼーションの時間及び速度、種々の緩衝液の粗製及び濃度、又はその他のパラ メータは、膜内在性タンパク質の単離に適した当業者に公知の種々の値に調整さ れ得る。
本発明の好ましい具体例において、第一抗体はモノクロ−ナル抗体でもよく又は ポリクローナル抗体でもよい、更に、第一抗体はアガロース、セファロース、管 壁、ビーズ又はその他の任意の支持マトリクスに結合され得る。
本発明の好ましい具体例において、第二抗体はポリクローナル抗体であり、これ に結合した検出可能マーカーは西洋ワサビペルオキシダーゼのごとき酵素である 。しかしながら、第−抗体及び第二抗体に結合したマーカーが、放射性標識例え ば１２５Ｉでもよく又は種々の比色マーカーもしくは蛍光定量マーカーでもよく 、又はその他の酵素反応産物でもよい。
本発明の好ましい具体例においては、第一抗体を膜内在住タンパク質と接触させ てタンパク質−第一抗体複合体を形成する０次に、この複合体を、例えば西洋ワ サビペルオキシダーゼで酵素標識した検出可能な第二抗体と接触させる０次に第 二複合体を、検出可能産物を形成する適当な基質例えば０−フェニレンジアミン との酵素反応によって検出する。
別の具体例では、第二抗体をｌ２ｓＩで標識し、第二複合体をオートラジオグラ フィーで検出する。別の具体例では、第二複合体が沈降物を形成しこれが肉眼観 察で検出される。
本発明はまた、ヒト本態性高血圧に関連する膜内在住カルシウム結合タンパク質 の量を定量的に測定する方法を提供する。該方法は、ヒトから組織を単離し、膜 内在住タンパク質を得るように組織を処理し、このように得られたタンパク質と 膜内在住カルシウム結合タンパク質に結合する抗体分子とを接触させて同定可能 なタンパク質−抗体複合体を形成し、このように形成された複合体の量を定量的 に測定する処理を含む。
前記のごとく本発明の好ましい組織は赤血球膜又は胎盤であるが、腸、腎臓、骨 、脳、心臓、精巣、ＩＩ臓、骨格筋、肝臓又はその他の適当な組織の使用も可能 である。
タンパク質は、例えば洗浄、遠心、低浸透圧溶解、掻取り、ホモジナイゼーショ ン等の処理又ははその他の任意の処理の組み合わせを用いて単離される。
第一抗体分子は好ましくはモノクローナルであるが、ポリクローナル又は選択さ れた組み合わせの１つを使用してもよい７第二抗体分子もまたモノクローナル又 はポリクローナルのいずれでもよく、検出可能マーカー例えば１２５■又は西洋 ワサビペルオキシダーゼによって標識される。
検出可能マーカーは、別の放射性標識例えばコバルトでもよく、又は、種々の比 色マーカーもしくは蛍光定量マーカーでもよく、又は酵素反応産物でもよい。
本発明の好ましい具体例においては、第一抗体分子を膜内在住タンパク質と接触 させてタンパク質−第一抗体複合体を形成する０次に複合体と酵素標識した検出 可能な第二抗体とを接触させて検出可能な第二複合体を形成する。別の具体例で は、第二抗体を１２９１又は別の検出可能成分で標識する。
次に検出可能な第二複合体の量を当業者に公知の方法によって定量的に測定し、 正常個体即ち本態性高血圧体質でない個体での測定量と比較する。双方の量の有 意な差の存在が疾患体質の指標となる。
本発明はまた、ヒトの本悪性高血圧に関連する膜内在住カルシウム結合タンパク 質をコードするメツセンジャーリポ核ＩＱ（ｍＲＮ＾）の量を定量的に測定する 方法を提供する。該方法は、ヒトから組織を単離し、ｍＲＮ＾を得るように組織 を処理し、このように得られたｍＲＮ＾と膜内在住カルシウム結合タンパク質を コードするｍＲＮ＾に結合するｃＤＮ＾プローブとを接触させて同定可能なｍＲ Ｎ＾−ｃＤＮ＾複合体を形成し、このように形成された複合体の量を定量的に測 定する処理を含む。
本発明によれば好ましい組織は胎盤であるが、腸、腎臓、骨、脳、心臓、精巣、 稗臓、骨格筋、肝臓又はその他の適当な組織の使用も可能である。
ｓ＋ＲＮ＾は、例えば洗浄、遠心、低浸透圧溶解、掻取り、ホモジナイゼーショ ン、オリゴ−ｄＴカラムによるポリ（＾）−輸ＲＮ＾の単離等の処理又はその他 の有効な処理の組み合わせを用いて単離され得る。
ｅＤＮ＾プローブは放射性であり、結合した複合体は放射線スペクトロメータで カウントされるか、又はオートラジオグラフィー又は当業者に公知のその他の方 法によって測定される。
検出可能マーカーは別の放射性標識例えばコバルトでもよく、又は種々の比色マ ーカーもしくは蛍光定量マーカーでもよ、＜、又は酵素反応産物でもよい。
本発明の好ましい具体例において、放射性ｃＤＮ＾プローブはｍＲＮ＾と接触し て定量可能な放射性複合体を形成する。
本発明はまた、本悪性高血圧体質の個体を同定するための診断方法を提供する。
該方法は、個体から邦織を単離し、膜内在住タンパク質を得るように組織を処理 し、このように得られたタンパク質と膜内在住カウント結合タンパク質に結合す る抗体分子とを接触させて同定可能なタンパク質−抗体複合体を形成し、このよ うに形成された複合体の呈を定量的に測定し、この測定量と正常個体の組織で観 察された対応する量とを比較し、結合抗体量の有意な減少を疾患体質の指標とす る。
前記のごとく本発明の好ましい組織は赤血球膜又は胎盤であるが、腸、腎臓、骨 、脳、心臓、精巣、牌臓、骨格筋、肝臓又はその他の適当な組織も使用し得る。
タンパク質は、例えば洗浄、遠心、低浸透圧溶解、掻取り、ホモジナイゼーショ ン等の処理又はその他の有効な処理の組み合わせを用いて単離され得る。
第一抗体分子は、モノクローナル、ポリクローナルのいずれでもよく、又は選択 された組み合わせの１つを使用してもよい、第二抗体分子は、検出可能マーカー 例えば１２５■又は西洋ワサビペルオキシダーゼによって標識され得る。
検出可能マーカーは別の放射性標識例えばコバルトでもよく、又は種々の比色マ ーカーもしくは蛍光定量マーカーでもよく、又は酵素反応産物でもよい。
本発明の好ましい具体例においては、第一抗体分子を膜内在住タンパク質と接触 させてタンパク質−第一抗体複合体を形成する０次に複合体を検出可能な第二抗 体と接触させて検出可能な第二複合体を形成する。第二抗体は酵素例えば西洋ワ サビペルオキシダーゼで標識されており、第二複合体は適当な基質例えば０−フ ェニレンジアミンと接触して検出可能産物を形成する。第二抗体はまた放射性標 識されてもよい。
次に検出可能な第二複合体の量を当業者に公知の方法によって定量的に測定し、 正常個体例えば本態性高血圧体質でない個体の測定量と比較する。比較量の有意 な差の存在が疾患体質の指標となる。
本発明は最後に、本態性高血圧体質の個体を同定するための診断方法を提供する 。該方法は、個体から組織を単離し、ＩＩＲＮ＾を得るように組織を処理し、こ のように得られたｍＲＮＡと本態性高血圧に関連する膜内在住カルシウム結合タ ンパク質をコードするｍＲＮＡに結合する放射性ｃＤＮ＾プローブとを接触させ て同定可能なｍＲＮＡ−ｅＤＮ＾複合体を形成し、このように形成された複合体 の量を定量的に測定し、この測定量と正常個体の組織によって形成された＊ＲＮ ＾−ｅＤＮ＾複合体の量とを比較し、結合した量の有意な減少を疾患体質の指標 とする。
本発明によれば好ましい組織は胎盤であるが、腸、腎臓、骨、脳、心臓、精巣、 牌臓、骨格筋、肝臓又はその他の適当な組織の使用も可能である。
識ＲＮ＾は、例えば洗浄、遠心、低浸透圧溶解、掻取り、ホモジナイゼーション 、オリゴ−ｄＴカラムによるポリ（＾）−ｍＲＮＡの単離等の処理又はその他の 有効な処理の組み合わせを用いて単離され得る。
ｍＲＮＡに特異的なｃＤＮ八を３２ｐ又はその他の放射性元素（こよって放射性 標識する。形成されたｍＲＮＡとｃＤＮ＾との複合体番よ、放射線スペクトロメ ーターによる放射能測定、又↓よオートラジオグラフィー又は当業者に公知のそ の他の方法（こよって定量される。特異的＋ａＲＮ＾−ｃＤＮＡ複合体の量を正 常個体Ｈａち本態性高血圧体質の家系でない個体の対応する量と比較する。正常 個体に比較して観察された量の有意な減少力く疾患体質の指標となる。
材」１及」Ｌ方−法 ｕ匹ｋｍ土Ｌ ラット及びヒトの組織からＩＭＣＡＬを同定し単離した。う、。
）　ＩＭＣＡＬはラットの十二指腸粘膜から単離し電気泳動的ホモジネートが得 られるまで精製した。ヒトＩＨＣＡＬはヒト胎盤から採取し部分精製した。
ラット十二指腸粘膜を中性界面活性剤で抽出すると、非変性タンパク質はゲルｐ 過によって分子量２００，０００ダルトンを示した。ドデシル硫酸ナトリウム（ ＳＯＳ）で処理すると分子量２０，５００のモノマーが得られた。ヒト胎盤ＩＭ ＣＡＬは非変性及び５ＯＳ−処理のいずれの調製物もラットタンパク質と同じ分 子量を示した。
ラットＩＭＣＡＬのアミノ酸組成を分析すると（１７）、これはアスパラギン酸 とグルタミン酸とを多量に含んでいた。アミノ酸組成は特徴的（ｕｎｉｑｕｅ） でＣａＢＰ（２５）、カルモジュリン、バルブアルブミンのごとき別のカルシウ ム結合タンパク質から識別することが可能であった。　ＩＭＣＡＬのアミノ末端 は遮断（ｂｌｏｃｋｅｄ）されていた、ラットＩＭＣＡＬの等電点は約４．５で あった。　ＩＭＣＡＬとカルシウムとの複合体形成のアフイニティ定数は２．４ ＋　０．３マイクロモラーであった。
種々のカチオンに対するラットＩＭＣＡＬの結合能を競合テストによって検査し た。４０マイクロモラーの競合カチオンによる４５（ａ結合（Ｃａ”＋は４マイ クロモラーで存在）の阻害％Ｔｂコ◆７４．６％、Ｃｕ”　６２．９％、Ｚｎ” 　５９．３％、Ｍｎ”　４４．２％、Ｓｒ”　３９．９％、Ｂａ”　３４．３％ 、Ｈ，”　２１．７％及びＭｙ２”　５．１％。
ＩＮＣＡＬは水溶液中で凝集し易い、この膜タンパク質の溶解度を維持するため に界面活性剤を存在させる必要がある。
ラットＩＭＣＡＬに対する唯一のポリクローナル（ウサギ）及びモノクローナル （マウス）抗体を調製した。抗体は、カルモジュリン、バルブアルブミン又は（ ’ａＢＰ（２５）と有意に交差反応しない。
免疫化学アッセイによれば、ＩＭＣＡＬはラットの１４以上の組織に存在するこ とが判明した０組織ＩＭＣＡＬの量はビタミンＤ欠乏ラットに比較してビタミン Ｄ処置ラットではるかに多い、また高カルシウム食のラットに比較して低カルシ ウム食の動物ではるかに多い。
ヒトＩＭＣＡＬは抗うットＩＭＣＡＬ抗体と免疫化学的に交差反応する。イムノ アッセイによれば、赤血球ゴーろト膜、血小板及び胎盤にヒトＩＭＣＡＬが存在 することが判明した。
１１ＬＬ乱ｌ 特発性高血圧の雄へ１ｂｉｎｏラット（Ｔａｃ：Ｎ（ＳＨＲ）ｆＢＲ）と旧５− ｔｅｒ　Ｋｙｏｔｏ対照（Ｔｉｅ：Ｎ（−にＹ）ＦＯＲ）とをＴａｃｏｎｉｃ　 Ｆｉｒｍｓ　Ｉｎｃ。
（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、　ＮＹ）から入手した。４〜５週齢（体重５８〜８０ ｇ）と８〜９週齢（体重１６１〜１９５ｇ）との２つのエージグループで試験し た０尾のブレチスモグラフィーによって収縮動脈血圧を測定した。　ＳＩＲ及び ５ｉｓｔｅｒ　Ｋｙｏｔｏグループにおける平均値±ＳＥは夫々４〜５週齢では １３０±３１１ＩＩＩＩＨｇで８〜９週齢では１７２±３ａａＨｇ及び１２３± ４１１１１１ＨＩＦであった。　５ｈｅｒｖａｔｎ株対照をＣａＩＩＩＩＩＲｅ ｓｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ（Ｗａｙｎｅ、　ＮＪ）から購入し全部の動物 を栄養的に完全ベレット食（ＣａｌＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｒｏｄｅｎｔ　Ｄ ｉｅｔ；０．９％カルシウム；０．８％リン酸塩）と水ａｄ　１ｉｂｉｔｕ−と に維持した。ラットを１８〜２４時間絶食させて腸上部を空にした。
絶食動物の盲腸は空でなかった０次に動物を速やかに気絶させ放血（ｅｘｓａｎ ｇｕｉｎａｔｉｏｎ）によって殺した。ヒト成人被験者及び対照から常法で血液 を採取した。
血液をヘパリン処理し、赤血球を遠心によって単離し、０．１４５ＨのＮａＣｊ 　−５ｍＭのＫＣｆｔで２回洗浄し、（白色から淡紅色の）ゴースト膜を、公知 の方法（２１）で８ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４に浸透溶解した。腸切 片を水冷した０、１４５８のＮａＣｊ−５ｍＭのＫＣｊで洗浄し、下部コートか ら粘膜を掻取った（２）、別の固体組織を直ちに氷冷した０、１４５８のＮａＣ ｊ！　−５ｍＭのＫＣｊに浸漬させて洗浄し総血液（ｇｒｏｓｓ　ｂｌｏｏｄ） を除去した。更に２℃〜５℃で処理した。粘膜掻取りによって得られた採取物を Ｖｉｒ−Ｔｉｓホモジナイザー（Ｖｅｒｔｉｓ　Ｃｏ、、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、　 ＮＹ）に入れ１０容量の緩衝液（１１９ｍＨのＮａＣｆ１と４．７ｍＭのＫＣｊ とを含有する１３ｗｒＨのトリスバッファ、ｐ１１７．４）中で全速の７０％で ２５秒間ホモジナイズした。その他の固体組織も同様に全速で１分間ホモジナイ ズした。各ホモジネートを１００，０ＯＯｘ　ｇで２時間遠心しペレット（微粒 画分全部）をＦｈｌのホモジナイゼーションバッファに懸濁させ以下のイムノア ッセイの出発物質を調製した。参照標準としてウシ血清アルブミンを使用し改良 Ｌｏｗｅｒｙ法（２２）で測定したこれらの懸濁液のタンパク質濃度は３〜１０ ｗｇ／ｗ１であった。
（以下余白） ＫＪ！ｉ　ＩＭＣＡＬをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）で変性させ、分子量 ２０５００のモノマーを得た（１７）、　５ＯＳ−モノマーをポリアクリルアミ ドスラブゲル電気泳動により精製し、ゲルバンドを切除し、ウサギに免疫するた めの抗原として使用した（２３）　、エレクトロブロッティング法により抗血清 の特異性を決定した。セファデックスに−１５０ゲル濾過により得られた十二指 腸粘膜タンパク質の粗野溶性調製物（１））をＳＤＳで１００℃で３分間処理し 、形成された５ＯＳ−タンパク質を不連続（４％７１２％）ＳＯＳ−ポリアクリ ルアミドスラブゲル中に電気泳動により分解させた０分解したタンパク質をＢｉ ｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｅｈｍｏｎｄ、　Ｃ＾）Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ装置内でエレク トロブＯ−／ティング（２４）によりニトロセルロースシートに移した。ニトロ セルロースのストリップをウサギ抗血清又は対照血清で処理し、適当な洗浄後、 西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｋｉｒｋ−ｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、　ＨＤ）と結合したアフ ィニティ精製ヒツジ抗つサギＩｇＧ抗体、及び染色反応用担体として３，３゛− ジアミノベンジジンを使用して結合した抗体を局在化させた。一方のウサギ抗血 清はＩＮＣＡＬＳＤＳ−モノマーに対しては単一特異性であったが、第２の抗血 清はＩＭＣＡＬバンドの主要な染色（９０％を越える）に加えていくつかの高分 子量バンド（約１０００００ダルトン）の染色を示した。　ＩＭＣＡＬ　５ＤＳ −モノマーのイムノアッセイの特異性を確保するために、以下のように定量用エ レクトロブロッティング手順を行った。
マウスハイプリドーマクローン（ＲＣ２Ｂ６／１０１）を増殖することにより、 ネイティブＩＭＣＡＬに対するモノクローナル抗体を作製した。バイプリドーマ 細胞系ＲＣ２Ｂ６／１０１は＾ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ　（＾ＴＣＣ）’、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉ ｖｅ。
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２に寄託し、＾ＴＣＣ受託番号ＨＢ９３ １７を付された。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する ブダペスト条約に従って行った。細胞は懸濁培地中で増殖させ、プリスタンで感 作したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔組織内に約５〜１０ｘ　１０’の細胞を注射し た。２〜３週後に腹水液を集め、タンパク質＾−セファロース（Ｐｈａｒａｉａ ｃｉａ　Ｐ−ＬＢｉｏｅｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｎｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｍｌ）を 使用するカラムクロマトグラフィによりＩｇＧフラクションを分離させた。ラッ トＩＭＣＡＬに対する抗体の特異性を立証するために２つの手順を使用した。ラ ット−二指腸膜の粗混合物を１−ブタノール抽出により可溶化させ、従来記載さ れているように（１７）スラブポリアクリルアミドゲル（非変性）中の電気泳動 により認証されたラットＩＭＣＡＬのレーンに沿って抽出物を分解させた。エレ クトロブロッティングによりゲルをニトロセルロースに移し、上述のようにマウ スモノクローナル−次抗体及びヒツジ抗マウスペルオキシダーゼと結合した二次 抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ；　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ 、　ＩＮ）を使用した処、粗フラクション中で免疫反応ＩＭＣＡＬの１つのバン ドが観察された。第２の手順では、腹水液から単離したマウスモノクローナル抗 体を活性化ＣＢセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合することにより 固定化し、免疫アフィニティカラムを調製した。ブタノールで可溶化した十二指 腸膜タンパク質（上記参照）の粗混合物をカラム中で平衡化させ、十分に洗浄後 、結合したタンパク質を５０ｍＭのｐｉ（２，６の酢酸−クエン酸ナトリウム緩 衝液で溶離させた。フラクションを２％のＳＤＳで上述のように処理し、４〜３ ０％の連続勾配スラブゲル（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ）で５ＯＳ−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動により分解させた。クーマシーブリリアントブルーで染色した 処、ＩＭＣＡＬバンドのみが現れた。
ポリクローナル　゛によるイムノアッセ　全粒子フラクションのＩＭＣＡＬ含有 量を電気泳動ブロッティング法により定量した。アッセイにあたり、精製したラ ットＩＭＣＡＬ（１７）を固相ラクトペルオキシダーゼ−グルコースオキシダー ゼ反応混合物（Ｂｉｏ−Ｒａｄ″Ｅｎｚｙｍｏ−ｂｅａｄｓ″）により１２５１ で約６５０ｃｐｗｓ／ｎｇの比放射能に標識した。　１００．、のタンパク質を 含む組織粒子の試料を、内部標準として加えた１７ｎｙの［＋２５）］ＩＭＣＡ Ｌと混合した０粒子混合物を２％のＳＤＳで１００℃で３分間処理することによ り溶解させ、形成されたタンパク質溶液を不連続（４％／１２％）ポリアクリル アミドスラブゲルで電気泳動により分解させた０分子量２１５００の少量のダン シル化大豆トリプシンインヒビターを各試料に加え、紫外線照射によりＩＭＣＡ Ｌモノマーを局在化させた。各ゲル上の各レーンは外部標準として３００ｎｙの ＩＭＣＡＬ＋　［目Ｓｒ］ＩＭＣＡＬを含んでいた０分解したタンパク質をエレ クトロブロッティングによりニトロセルロースに移し、ＩＭＣＡＬモノマーゾー ンをニトロセルロースシートから切除し、エンザイムイムノアッセイにより１２ ５Ｉ及びＩＭＣＡＬの両方をアッセイした。後者の手順はＩＭＣＡＬモノマーに 対するウサギ抗血清を使用し、二次抗体としてペルオキシダーゼに結合したヒツ ジ抗ウサギＩｇＧ、ペルオキシダーゼ基質として０−フェニレンジアミンを使用 した。　ＩＭＣＡＬの組織含有量は外部標準に関して計算し、各レーン中の［’ 　”　Ｓ　Ｉ］　ＩＭＣＡＬの回収を使用して組織粒子タンパク質の試料間の回 収の差を修正した。従来記載されているように（１８）、アッセイはＩＯＨのＩ ＭＣＡＬを検出することができ、少なくとも３００ｎｆＩまで線形である。更に 、Ｗａｓｓ−ｅｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｔａｙｌｏｒ（２５）の可溶性カルシウム結 合タンパク質又は精巣からのカルモジュリン（Ｃ＾＾ＢＣＯ，Ｉｎｃ、、　Ｈｏ ｕｓｔｏｎ。
ＴＸ）とほとんど反応しない。
してＩＮＣＡＬ含有量の多い膜懸濁液（「カルシウム結合複合体」）を得、この 材料を従来記載されているように（１７）１−ブタノールで処理することにより 可溶化させた。タンパク質溶液を０．０１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−Ｘ−１００（ Ｓｉ＋ａ　Ｃｈｅａ＋１ｅａｌ）を含有するｐＨ７，４の１．３ｍＨのＴｒｉｓ ３０倍等量で３６〜４８時間透析し、痕跡量のブタノールを除去し、５〜１５Ｉ Ｉｇのタンパク質を含むアリコートをドットエンサザイムイムノアッセイ用の洗 浄済みニトロセルロースディスクにスポットした（２ａ）、ディスクをモノクロ ーナル抗体（ＲＣ２Ｂ６／１旧）で処理後、ペルオキシダーゼと結合したヒツジ 抗マウスｔｇｃ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ−ｈｅｉ＋＊）及び酵素 基質として。−フェニレンジアミンで処理した。出発物質がポリクローナル抗血 清定量用に使用した完全に可溶化した粒子以外のブタノール抽出物であったので 、結果は比較のためにＱＣ＜ｓｚ／Ｔｓｉｎ／ｚｇタンパク質として表した。
従って、ポリクローナルアッセイのみで組織粒子中のＩＨＣＡＬの絶対含有量を 定量した。
１」 ボ１　ローナル　゛に　るアッセイ　８〜９週齢の５）ＩＲ及び対照系ラットの 組織のＩＭＣＡＬモノマー含有量の値を第１表に比較した。　ＳＨＲの平均値は ｌ１ｉｓｔａｒ　Ｋｙｏｔｏ又はＳｈｅｒｍａｎ系対照に比較すると、赤血球（ ５８，１％低下）、十二指腸粘膜（３７，９〜４５，４％）、盲腸粘膜（４２， ９〜５３．８％）、腎ｇＡ（４１，７％〜４６．２％）、心臓（５５，８〜５８ ．７％）及び精巣（４４，２〜５７．１％）で著しく減少していることが認めら れた。空腸粘膜値における同様の傾向は、４回の実験で統計的有意値に達しなが った。しかしながら、空腸の値は従来の結果（１８）に一致する対応する十二指 腸セグメントの値（Ｐ＜０．０２）よりも著しく小さかった。カルシウム輸送活 性は十二指腸のほうが空腸粘膜（２０）よりも大きく、盲腸粘膜もカルシウムを 容易に輸送する（２７）、更に注目すべき点として、膵臓（Ｎ＝　３）及び骨格 筋（Ｎ＝２）の数回の試験においてＳＩＲ組織は終始一貫して対照系よりも低い ＩＨＣＡＬ値を示した。
組＠　ＩＭＣＡＬの減少のパターンが動脈性高血圧症の結果であるかどうがを決 定するために、４〜５週齢のラットの組織を比較し、結果を第２表に示した。こ の場合も、５ｌ（Ｒ試料の平均値は赤血球ゴースト（５８，８〜６７．４％減少 ）、十二指腸粘Ｊｌ！（３ｏ、ｓ　〜４３．ｓ％）、空腸粘膜（４０，９〜５６ ．７％）、腎１ｉｉｉ　（１６−７〜３１．８％）及び精巣（４０，６〜４２． ４％）で低下していた。
第２表、４〜５週齢のＳＨＲ，Ｗｉｓｔａｒ　Ｋｙｏｔｏ及びＳｈｅｒｍａｎ系 ラットがら調製した全粒子フラクションのＩＭＣＡＬ含有量 車群当たりラット（５０〜８０ｇ）５匹。
０数値は平均±ＳＥである。アッセイ方法については第１表及び材料と方法の項 に記載した通りである。
ｔｐ値は、ＳＩＲ対旧５ｔａｒ　Ｋｙｏｔｏ＋　Ｓｈｅｒｍａｎ系対照の対比較 として５ｔｕｄｅｎｔのｔ試験により計算した。　ＳＨＲ対Ｗｉｓｔａｒ　Ｋｙ ｏｔｏ及びＳｈｅｒｍａｎラットのＬ試験の各Ｐ値は、夫々赤血球ゴースト及び 十二指腸粘膜で０．０５＜　Ｐ＜　０．０１であった。
人体実験の結果を第３表に示す、この場合、ラットＩＭＣＡＬに対するウサギポ リクローナル抗血清をヒト赤血球膜に適用した０本態性高血圧症のヒト被験者は 、正常被験者に対して赤血球膜のＩＭＣＡＬ含有量が低下していることが明示さ れる。
第３表、正常ヒト被験者及び３人の本態性高血圧症患者の赤血球膜におけるＩＭ ＣＡＬのアッセイ（１）　１１：ラットＩＭＣＡＬに対するウサギポリクローナ ル抗血清による定量的エレクトロブロッティング（２）結果 被験者　状Ｂ　ＩＭＣＡＬ含有量（全膜タンパク質の％）１　正常　０．３８ ２　正常　０．２７ ３　正常　０．９２ ４　患者　０，４４ ５　患者　０．２１ ６　患者　０，２０ クロ一ナル抗体で試験した場合に５）ＩＲの免疫活性ＩＭＣＡＬがＷｉｓｔａｒ 　Ｋｙｏｔｏ組織に比較して著しく減少していることを示している。減少は十二 指腸粘ｌｉｄ　（４０％低下）、空腸粘［（５２，８％）、盲腸粘膜（３７゜６ ％）、心１ｉｉ　（４０，３％）、腎１ｉ（３９，１％）及び肝臓（１８，２％ ）で観察され、同様の傾向は骨格筋肉（２９，９％低下、０．０５＜Ｐ＜０．１ ）でも観察された。
第４表　ＳＨＲ及びＷｉｓｔａｒ　Ｋｙｏｔｏ系ラットの組織から調製したブタ ノール抽出粒子のＩＨＣＡＬ含有量のマウスモノクローナル抗体によるエンザイ ムイムノアッセイ 京群当たりラット（８〜９週＠）５匹。
０全組織粒子又はカルシウム結合複合体のブタノール抽出物を上述（材料と方法 ）のようにアッセイした。数値（平均±ＳＥ、００＜ｓｔ単位で表す）は従って 、組織ＩＭＣＡＬ含有量の絶対定量値を与える第１表及び第２表でアッセイした ＳＤＳ可溶化調製物と直接には比較できない。
ｔｐは対比較に関する５ｔｕｄｅｎｔのｔ試験により計算した。
Ｌ 以上の結果から明らかなように、５ｔ（Ｒ組織における免疫反応ＩＭＣＡＬの含 有量の低下は従来の研究者により報告されているカルシウム結合の低下を少なく とも部分的に説明することができる０例えばＤｅｖｙｎｅｋ他（１５）は、４種 の異なるＳＨＲ［織の細胞膜のカルシウム結合能力の低下を観察しており、症候 群が「逼在膜成分（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ　ｓ＋ｅｍｂｒａｎｅ　ｅｏｍｐｏ− ｎｅｎｔｓ）　Ｊの異常を含んでいることを示唆している。彼らはＨｉｓｔａｒ 　Ｋｙｏｔｏ対照から調製した赤血球小胞のカルシウム結合能力が５ＩＩＲに比 較して０．３０ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質だけ増加していると報告している。正 常ヒト被験者から調製した赤血球小胞のカルシウム結合能力が本態性高血圧症患 者に比較して０．３５ｎ＋＊ｏｌ／ｍｙタンパク質という比較可能な増加を示す という事実は、０ｒｉｏｖ及びＰｏ５ｔｎｏｖ（２８）の結果により報告されて いる。これに対して、発明者が第１表の値及びＩＮＣＡＬのモノマー分子量から 計算した処では、５ｔｌＲに比較した対照ラットの赤血球ゴースト中のＩＭＣＡ Ｌの平均増加は膜タンパク質１１ｇ当たり０．２２ｎｍｏｌであった。　ＩＭＣ ＡＬモノマー当たり１カルシウムイオンが膜中で結合していると仮定すると、Ｉ ＨＣＡＬ含有量の減少はカルシウム結合の減少の多くを説明できるといってよい だろう、更に、まだ高血圧症の進んでいない４〜５週齢適齢ＩＨにＩＭＣＡＬ含 有量の減少が観察されたという事実は、３適齢のカルシウム結合の減少という従 来の報告（１５）に一致しており、ＩＭＣＡＬ変質は高血圧の二次的変化ではな いと考えられる。
ＳＨＨの遺伝子変化は例えばタンパク質をコードする構造遺伝子の変質により直 接組織ＩＭＣＡＬ含有量に影響するのか、あるいは関係はさほど直接でないのか という問題が生じる。
ＩＭＣＡＬレベルはビタミンＤ及び食餌性カルシウムにより調節される。（１７ ，１８）ので、酵素又は他の調節経路成分の一次変化は副次的にＩＭＣＡＬ含有 量を減少させ得ると想像できる。
第１表及び第２表に示した十二指腸ＩＭＣＡＬ含有量の変化及びカルシウム移行 の調節（１７，１８）にＩＭＣＡＬが関与するという仮説と一致して、十二指腸 粘膜を通るカルシウム輸送は、ＳＨＲのほうがＷｉｓｔａｒ　Ｋｙｏｔｏ対照に 比較して少ないことを５ｃｈｅｄｌ他は報告している（２９）、更にこれらの著 者によると、カルシウムの腸吸収の低下及び血漿中の免疫反応副甲状腺ホルモン の増加にも拘わらず１．２５−ジヒドロキシビタミンＤの血清濃度は増加しない ので、ＳＨＨにおけるビタミンＤ代謝不全の可能性が予想される。　ＩＨＣＡＬ 含有量の減少の正確なメカニズム及び減少の機能的結果はまだ解明されていない が、ＳＨＲのタンパク質異常を立証することにより、動物症候群及びヒト本態性 高血圧症の研究に新たな道が開かれる。
（以下余白） 」弘羨改」岨 １、　０ｋａｍｏヒロ、　に、＆　Ａａｋｉ、Ｋ、（１９６ｉ３）　シ≧ｕズ− ζ」−；；、ｊ−２７゜２８２−２９３゜ ２、　Ｐａｓヒｖｒ！ｏｑ、　Ｙ、′１．．　Ｏｒ：ユａｖ、　Ｓ、Ｈ，＆　Ｐ ｏｋｕｄｉｎ、　Ｎ、ｒ。
（１９７９）　Ｗエニー；二二二とニニニＬヱ　１７９．ｌり１−１９５゜３、 　Ｍｏｎｅｅｎａｖ−Ｇａｘ＝ｓｔｉｅｒ：、τ−Ｉ　Ａｒａｇａｎ、Ｌ＠　ロ ｅｖｙｎｃｋ　。
Ｍ、　−Ａ、、　Ｍｅｙｅｒ、　Ｐ、　忌　Ｈｅ１ｅｒｘ、　Ｃ，（１り８１） 　Ｂ」−ユぷピュ＝：ユ。
Ｊユ１エユ迦、Ω＝二に、　１００．６６０−６６５゜４、　０ｒｉａｖ、　５ ．Ｌ、ＧｕｌａｋＩ　Ｐ、Ｖ、、　ＬＬ？：フ１ｎｏｖ、　１．ｓ、　＆？ｏｓ ＝：１ｏｑｔ、Ｙ、Ｖ、（１９８２）　（、ニーＬｚ、ｔ−６コ、　４コー４５ ゜５、　０ｒｉｏｖ、５−Ｍ−、Ｇｕｉａｋ、Ｐ、Ｖ、＆　Ｐａ５ｔ：ｗｏｖ、 Ｌ”ｉ、（１９１３２）Ｃ１エユ、　ＳニＬ、　６コ、２８１−２”ａＪ。
６、　入ａｋｉ　に、、　Ｙａｍａｓｈｉｔａ、　Ｋ、ｐ　τｏｒｎＬｔわ　Ｎ ｂｔ　τ１ＺｕｃｌＬｔ　に。
＆　Ｆｉｏ＝’−ｘ、Ｋ、（１９）４）　１ｗ、旦亀ユニ二、１．　１５，１１ ３０−１８１゜７、　Ｍｏｏｒａ、ｒａ、、Ｅｒｕｒｙｉヒ！、Ｌ、、　ｏａｖ ｅｒ＋、ｃｏｒｔ、ｃ、ａ、＆　ムｎ−ｄｏｎ、Ｅ、Ｊ、（１９７５１Ｌｚ＝− 、−Ｌｚ訟ニ、ｋ２４１３ｔ４３２−４４３゜ ８、　ＭａｎｇｅＬｓｅｎ、　Ｅ、Ｌ、　＆　Ｂｏｈｒ、　Ｄ、？、（１り７５ ）　と二±亡−；シよ、１８，３０２゜ り、　Ｗｅｂｂ、Ｒ，Ｃ，＆　Ｂｈａｌｌａ、Ｒ，（、（１９７ｇ）　、；１． 　二二二、二。
Ωじニジ上、　８．６５１−ｆｉｉｃｉｌ。
１０、　ＷｅＬ、Ｊ、−Ｗ、’、Ｊａｎｉｓ、Ｒ，入、’ｔａ　ＤａｎｉｅＬ、 Ｅ、Ｅ、（１９７６３ζ１ニニ、−、１９，１３３−１４０゜１１、　Ｂｈａｌ Ｌａ、Ｒ，（、、ｗｅｂｂｅ　Ｒ，（、／　５Ｌｎｑｈｔ　Ｄ−ｔ　Ａｓｈ１＝ ｙ、で。
６　已Ｈ口ｃｋｅ　τ、　（１９７ｇ）　だ２ユ」１．　２シー；：＝：ａ≦； ＝」１．１４ｆ　”−４７７゜１２＋　にｖａｎ、ｃ、−τ、２日ｅ　Ｌ　ｂ　 ｅ（ＩＣ／　乙−＆　Ｄａｎｉｅｌ、シー＝、（１９１３０１とΩコ２．２ｈ己 ：：ニＱユＬ、　ｌ〕、１３フー１４０゜１３、　Ｄｅｖｙｎｃｋ、Ｍ−−Ａ、 、ＰＨｈｏｌｉａセｐ　Ｍ、−Ｇ、１　Ｎｕｎｅ：ｒ　Ａ、−Ｍ−＃＆　ｘｅｙ ｅｃｔ　？、　（Ｌり６１）　ＩＣｕ二：Ｌ”　：；；λａ　ロ＠ｊ４Ｆ”６、 　臀　３゜７り７−ａＱ７゜ １４、　０ｅｆｒ７ｒｒｃｋ、Ｍ、−Ａ、、Ｐｅｒ：ｚｏｌｌｅセ、ｎ、−Ｇ− 、Ｈｕｒｔｅ：、Ａ、−Ｍ、ｚｂ　Ｍｅｙ：ｒ、Ｐ、（１９８１）　：ヱ；工よ よ１．！！ＪＬＬＬＱ！Ｌ　３　ｔ　３り７−４０３゜１５、　Ｄｅｖｙｎｃｋ 、Ｍ、−Ａ、、Ｐａｒ：ｚｏｌｌａｅ、に、−Ｇ、’、Ｎｕｎｅ：ｔ　Ａ、−Ｍ 、。
ＡＩ：１ｑＯｎｐ　Ｘ−ｐ　Ｍａｎセｅｎ＆Ｖ−Ｃａｔｅ５ｅＬｅ’ｌ：１　で −、ＨｅＬ＝ｎｅ、Ｃ。
＆　ＭｅＹ＝：ｔ　Ｐ−（１９８２）　ＰＬ、；ｈ、悉嘘上＊　Ｍｅ　ＬａユΣ ：　ｌ　７９，５０５７−５０６０゜１ｏ、　Ｅ：：−１ｅｚ　Ｐ、、　Ｂａ１ ｌ土ｚ　Ｐ−＃　Ｂｕｒｇｉｓｓｅｒ、　！＋＋　＆　Ｂｕｈｌ＝ｒ。
ｒ、Ｒ，（１９８４）　Ｉｉ、旦二一ュ、　１．ｔｌｍ、３１０．　１０８４− １０８８゜エフ、　Ｋｃｗａｒｓｋｉ、５．　＆　５ｃｈａｃｈｃｅｒ、Ｏ，（ １９８０）　！、旦エユＬ。
ζ】２Ｌコ、２５５．　１０日コ４−１ａａ４ｏ。
ム拒シと４山＝エミユユと温、ｅｄｓ、Ｒｕｂｉｎ、ＬＰ、、ＷｅＬｓｓ、。
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Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. １．非変性界面活性剤中の分子量約２００，０００ダルトン及びドデシル硫酸ナ トリウムポリアクリルアミドゲル中の分子量約２０，５００ダルトンを有し、　 遮断された（ｂｌｏｃｋｅｄ）アミノ末端をもち、　等電点約４．５を有し、カ ルシウムとの複合体を形成するアフィニティ定数約２．４マイクロモラーをもつ 精製された膜内在性カルシウム結合タンパク質。
  2. ２．請求の範囲１のタンパク質に対するモノクローナル抗体。
  3. ３．　ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９３１７によって産生されたモ ノクローナル抗体ＲＣ２Ｂ６／１Ｄ１。
  4. ４．（ａ）動物組織から膜タンパク質を抽出して膜タンパク質抽出物を形成し、 （ｂ）抽出した膜タンパク質を可溶化し、（ｃ）モノクローナル抗体ＲＣ２Ｂ６ ／１Ｄ１を用いた免疫沈降又はイムノアフィニティクロマトグラフィー処理によ って可溶化した膜タンパク質から請求の範囲１のタンパク質を回収することを特 徴とする請求の範囲１のタンパク質の調製方法。
  5. ５．ヒト被験者から組織を単離し、膜内在性タンパク質を得るように組織を処理 し、このように得られたタンパク質と請求の範囲１のタンパク質に結合する第一 抗体分子とを接触させて検出可能なタンパク質一抗体複合体を形成し、このよう に形成された複合体を検出することを特徴とする請求の範囲１のタンパク質の存 在をヒト被験者で検出する方法。
  6. ６．組織が赤血球膜であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  7. ７．組織が胎盤であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  8. ８．組織が腸であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  9. ９．組織が腎臓であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  10. １０．組織が骨であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  11. １１．組織が脳であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  12. １２．組織が心臓であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  13. １３．組織が精巣であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  14. １４．組織が脾臓であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  15. １５．組織が骨格筋であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  16. １６．組織が肝臓であることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  17. １７．第一抗体分子がモノクローナル抗体分子であることを特徴とする請求の範 囲５に記載の方法。
  18. １８．第一抗体分子がポリクローナル抗体分子であることを特徴とする請求の範 囲５に記載の方法。
  19. １９．第一抗体が検出可能マーカーで標識されていることを特徴とする請求の範 囲５に記載の方法。
  20. ２０．検出可能マーカーが放射性標識であることを特徴とする請求の範囲１９に 記載の方法。
  21. ２１．放射性標識が１２５Ｉであることを特徴とする請求の範囲２０に記載の方 法。
  22. ２２．検出可能マーカーが比色マーカーであることを特徴とする請求の範囲１９ に記載の方法。
  23. ２３．検出がオートラジオグラフィーを含むことを特徴とする請求範囲５に記載 の方法。
  24. ２４．検出が比色定量を含むことを特徴とする請求の範囲５に記載方法。
  25. ２５．検出可能マーカーが酵素反応産物であることを特徴とする請求の範囲１９ に記載の方法。
  26. ２６．更に、タンパク質抗体複合体と検出可能マーカーで標識した第二抗体分子 とを接触させて検出可能な第二複合体を形成し、このように形成された第二複合 体を検出することを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
  27. ２７．検出可能マーカーが酵素反応産物であることを特徴とする請求の範囲２６ に記載の方法。
  28. ２８．検出可能マーカーが放射性標識であることを特徴とする請求の範囲２７に 記載の方法。
  29. ２９．放射性標識が１２５Ｉであることを特徴とする請求の範囲２８に記載の方 法。
  30. ３０．検出可能マーカーが比色マーカーであることを特徴とする請求範囲２６に 記載の方法。
  31. ３１．検出がオートラジオグラフィーを含むことを特徴とする請求の範囲２６に 記載の方法。
  32. ３２．検出が比色定量を含むことを特徴とする請求の範囲２６に記載の方法。
  33. ３３．第一抗体がマトリクスに結合していることを特徴とする請求の範囲５に記 載の方法。
  34. ３４．マトリクスがアガロースであることを特徴とする請求の範囲３３に記載の 方法。
  35. ３５．マトリクスがセファロースであることを特徴とする請求の範囲３３に記載 の方法。
  36. ３６．第一抗体が管に結合していることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法 。
  37. ３７．第一抗体がビーズに結合していることを特徴とする請求の範囲５に記載の 方法。
  38. ３８．ヒト被験者から組織を単離し、膜内在性タンパク質を得るように組織を処 理し、このように得られたタンパク質と請求の範囲１のタンパク質に結合する抗 体分子とを接触させて同定可能なタンパク質一抗体複合体を形成し、このように 形成された複合体を定量的に測定することを特徴とする請求の範囲１のタンパク 質をヒト被験者で定量的に測定する方法。
  39. ３９．ヒト被験者から組織を単離し、ｍＲＮＡを得るように組織を処理し、この ように得られたｍＲＨＡと請求の範囲１のタンパク質をコードするｍＲＮＡに結 合するｃＤＮＡプローブとを接触させて同定可能なｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を 形成し、このように形成された複合体を定量的に測定することを特徴とする請求 の範囲１のタンパク質をコードするメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）をヒト 被験者で定量的に測定する方法。
  40. ４０．個体から組織を単離し、膜内在性タンパク質を得るように組織を処理し、 このように得られたタンパク質と請求の範囲１のタンパク質に結合する抗体分子 とを接触させて同定可能なタンパク質一抗体複合体を形成し、このように形成さ れた複合体を定量的に測定し、この測定量と正常個体の組織からの結合タンパク 質の量とを比較し、結合した量の有意な減少を疾患体質の指標とすることを特徴 とする本態性高血圧体質の個体を同定する診断方法。
  41. ４１．個体から組織を単離し、メッセンジャーリポ核酸（ｍＲＮＡ）を得るよう に組織を処理し、このように得られたｍＲＮＡと請求範囲１のタンパク質をコー ドするｍＲＮＡに結合する放射性ｃＤＮＡプローブとを接触させて同定可能なｍ ＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を形成し、このように形成された複合体を定量的に測定 し、この測定量と正常個体の組織からの結合ｍＲＮＡの量とを比較し、結合した 量の有意な減少を疾患体質の指標とすることを特徴とする本態性高血圧体質の個 体を同定するための診断方法。
  42. ４２．請求の範囲１の膜内在住カルシウム結合タンパク質をコードするメッセン ジャーリポ核酸分子。
  43. ４３．請求の範囲１のタンパク質と動物の免疫系とを接触させることによって産 生される抗体分子。
JP62501461A 1986-03-04 1987-02-24 本態性高血圧マ−カ−の検出方法及びその診断的使用 Pending JPS63502829A (ja)

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