JPS63501792A - 肺性界面活性蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

胚性界面活性蛋白質 発明の分野 本発明はヒト肺洗浄により単離される蛋白質、それらの蛋白質を得る方法および それらの使用に関する。 発明の背景 本明細書全体において種々の刊行物を参照した。引用されたこれらの刊行物をす べて本明細書の末尾に示す。本発明が関係する技術の水準につきより詳細に説明 するためにこれらの刊行物をここに参考として引用する。 ビアリン膜症（ＨＭＤ）および呼吸窮迫症候群は未熟児における肺機能不全の臨 床状態を表わす同義語である。この疾患は、肺における空気−肺胞界面を内張す し、呼吸に際して肺胞の虚脱を防ぐ界面活性物質が存在しないことに帰因する。 現行の治療法は主として支持性のものである。しかし最近の臨床研究によって、 将来有望な治療法の１つはウシ由来の界面活性物質を新生児の肺に点滴注入する ものであることを示している。 肺胞の表面張力は肝性界面活性物質と呼ばれるリポ蛋白質複合体により低下する 。この複合体はリン脂質および５〜１０％の蛋白質からなる（キング、　１９８ ２）。この界面活性物質の蛋白質画分は非血清蛋白質および血清蛋白質から構成 される。界面活性物質に付随する主要な蛋白質は報告によれば３５，０００ダル トンの非血清シアロ糖蛋白質である〔シェリーら、１９８２；バタカリャ（Ｂｈ ａｔｔａｃｈａｒｙｙａ）ら、１９７５；スエイシンおよびベンリン。 １９８１　；キングら、１９７３；カチャル（Ｋａｔｙａｌ　）およびシン（Ｓ ｔ　ｎｇｈ）。 １９８１）。この蛋白質は報告によれば肝性界面活性物質の正常な機能に重要で あると思われる（キングら、１９８３．ホーグツドら、１９８５）。これはのち に呼吸窮迫症候群を発現する新生児の出産直前に採取した羊水中に少量存在する （カチャルおよびシン。 １９８４　、シェリーら、１９８２；キングら、　１９７５）。最近、正常人の 肺組織における３５，０００ダルトンの蛋白質の生合成について研究がなされ、 インビトロ翻訳反応において２９および３１ｋＤａの蛋白質が一次翻訳反応生成 物であることが確認された（フローロスら、　１９８５）。肺胞蛋白症を伴う患 者の肺にも３５ｋＤａの蛋白質が蓄積する（バタカリャおよびリン、　１９７８ 、バタカリャおよびリン、　１９８０ａ）。この蛋白質は正常人の気管支−肺胞 洗浄により得られる３５ｋＤａの蛋白質と同じ電気泳動度、免疫決定因子および ペプチドマツピングをもつフェルプスら、１９８４；ホワイトセットら、　１９ ８５）。 上記の蛋白質のほかに、ラットの肺においてより低分子量の界面活性物質付随蛋 白質が多数存在することが最近報告されている。ディーゆエル・ワン、ニー・チ ャンドラ−およびニー・ビー・フィッシャ、フエデ、プロシ、（Ｆｅｄ、　Ｐｒ ｏｃ、　４４　（４）　：１０２４　（１９８５）、抄録Ｎｏ、３５８７　（約 ９，０００ダルトンのラット蛋白質）およびニス・カチャルおよびジー・シン、 フエデ、プロシ。 ４４　（６）　：　１８９０　（１９８５）、抄録慮８８３９　（１０，０００ 〜１２，０００ダルトンのラット蛋白質）を参照されたい。 最後に、カリフォルニア・バイオテクノロジー社からの１９８５年２月６日の新 聞発表は、“遺伝子コード化ヒト肺性界面活性蛋白質”のクローニングおよび“ 詳細な操作”について報告している。しかしこの新聞発表はその蛋白質の特性を 明らかにしておらず、また“詳細な操作”についても述べていない。界面活性物 質関連蛋白質と考えられるものについての他の２報告も最近公表された。すなわ ちホワイトセットら、　１９８Ｂ、ビープイアトリ、リサ、（Ｐｅｄｅａｔｒ、 　Ｒｅｓ、）　２０　：　４６０およびニー・タカハシら、　１９８６．　ＢＢ ＲＣ致：　５２７）である。 本発明は肺胞蛋白症を伴う患者の肺洗浄により採取され、精製された新規な一群 の蛋白質、これらの蛋白質を得る方法、対応する組換え蛋白質、これらの蛋白質 に対する診断用品に用いる抗体、これらの新規な蛋白質を含有する組成物、また これらの組成物をたとえば呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）などの状態を伴う乳児の治 療に、他の治療物質を肺その他の器官に投与する際のドラッグデリバリ−用ビヒ クルとして、また心肺手術中あるいは他の状況で肺が流体で満たされた場合なら びに天然の肝性界面活性物質の産生および／または機能が停止した場合に起こる 可能性がある成人ＲＤＳの治療に使用する方法に関する。以下に論じる蛋白質の うち１種または２種以上が上記報文中で論じられている蛋白質と類似するかまた は等しいという可能性はあるが、先行技術の蛋白質のアミノ酸またはヌクレオチ ド配列データ、界面活性などに関する先行技術の記述が不適当であるため現時点 では本発明の蛋白質と先行技術の蛋白質の厳密な関係を確認することはできない 。 発明の要約 本発明は肺の界面活性を高めるのに有用な新規な蛋白質、これらの蛋白質を得る 方法、およびこれらの蛋白質１種もしくは２種以上を含有する組成物に関する。 本発明の蛋白質には下記のものが含まれる。 １、分子量約３５ｋｄであり、表１に示したＤＮＡ配列によりコードされること を特徴とする蛋白質；２、分子量約３５ｋｄであり、表２に示したＤＮＡ配列に よりコードされることを特徴とする蛋白質；３、表６のＤＮＡ配列により、また はこれに対しハイブリダイズしうるＤＮＡ配列によりコードされ、かつ約５．５ 〜９ｋｄの分子量を特徴とする蛋白質；ならびに４、約６ｋｄの分子量および表 ４に示すアミノ酸組成を特色とする蛋白質。 ト　ＯＩ−ｃ　（ＩＪ　ｏ　コ　σ　ｃ　←　（ＬＪＬ　Ｃ負　−σ　−ａ、− ｏ　ゎ Ｕ　α　α　α　ψ　ロ　ロ　Ｕ　ロ　Ｃりα　＞　ｆＩＪｌ−ＯＬ５ｍ　ｌ！ １コｔＪ罐１！ｌ　−ｒｌ　ＬＩ　Ｌ　Ｃ＞　（ｆ　−＋　Ｌｌ　−ロ　口　Ｉ Ｉ’）Ｌｌ　α　α　」　ロ　ロ　ロ　ασ　杭　ト　ｏ　ｏ　コ　ト　０　り 　ａ＞α　λ　ＬＩＬ　α　−切　α　−口、　−ＣＪ　Ｌｌ（Ｌ　Ｌ）Ｌ）　 ＷＬ）ｏ　ＬＩＯｕｍ＋　）−１１ｒｘ＞　）−ｃｔ　ｏ。 ト　り　ｅｌ　＞　ＬＪｌ　ｍ　（−〇　（口　＞　１−Ｌｌ　口　１！ｌ　Ｌ ＯＣα　αＩ−＼　α　Ｏト　ト　ロ　α　り　σ　（ロ　−ＬＩＬ　の　（５ Ｌ　ｌ−ロ　Ｕ　：ロ　ロ　Ｕ　α　ｌｌ’）ＬＩＣＬＪＪ　α　ト１−ａ　Ｃ ＸＬ　ロ　ゴ　１−ｍ１’ＪＯｅσ　−ｕＪ：　α　−α　−０α　− ＬＪＩＣＣＩ−１！ＩＬＩ　ｕ　エ　ト　ｕ　口σ　ロ　ト　σ　コ　α　飄　 ト　噌　ロ　コＬＩＬ　円　Ｃ−り　−　〇−′＋　・αα、ｎ＋！＋ｏ　ｔ！ １Ｉｔｐ　ｏａ　Ｌ）Ｊｔ！Ｊ＞　ａ＞　）−ＯＮｅ！ｏ　ＬＪａＬｌｍ　Ｌ） −ＬＩ　Ｌ　＃ＬＩ　Ｌ　１−−１０　ロ　リ　ロ　ＬＩＣＬ　ψ　Ｕ　α　σ 　−υ　α　Ｉ−ＯＬＪ−Ｈコ　３＋　＝ α　ｆｌ　ＬＩＬ　１−１ｍ　ｌ＋　ロＬ！ＩａＬＩＣＬ　Ｌ））　Ｌ）Ｊ　” ロロ５　ＬＩＯ（！＞　ｔ−Ｌｌ＞　Ｌ’α←ｅｌ　ＬＩＬ　σ− Ｕ　−υ　、　呂　宙　ぎ　呂　５　Ｌｌ　σｕ＞　ｕ＞　ｌ−Ｏｃｐ　Ｌｌｌ ｌｌ Ｉ！１　−　じ　−ｕ　−ＬＩ　Ｌ　ｃ　＋＋ＬＩＬ）　Ｉ！ＩＬ！ｌ　ＬＩＷ 　ＣＣＬｌ工ＵψαＯトロコロクＵり α　−（）　−ω　）＋　ａＩ　ｃ　−←　ＱＵ　工　Ｌｌ　（’Ｌ　ｋｌＬＩ 　Ｊ　ＬＩ　Ｌｌ　口　」ＬＩＬｈｏＩ！ｌ＞Ｌｌ＞／すＣ− ＬＩＶ　ＬＩＬ　Ｌ’ｌ−Ｌｌ−ｆ％ＬＩ！：）−ＬｌＩＬＩＣＬ　ｅ＋ｔ！１ １　ロロ　Ｑα←ｈＬＩＬト−罐電」仁Ｕロ ト　Ｕ　ａ　ｕ　−σ　＞ＣＬ ト）−ＬｌＬＩ　Ｃ＋　＋−ｕ　（Ｉ Ｏ仁トーロ０」

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Ｂｕｌｌ、）　３１１　：　４１００　（１９８３）に記載された蛋白質と有意 に異なる。さらに冷ブタノール不溶性の６ｋｄ蛋白質のＮ末端ペプチド配列を決 定した（表５）。簡略化のため、両方の低分子量ＰＳＰ蛋白質を、一般的な５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにより測定したそれらの平均見掛は分子量に基づいて、以下“６Ｋ ”蛋白質と呼ぶ。しかしこれらの蛋白質の実際の分子量は５．５〜９キロダルト ンであると解すべきである。 こうして上記方法により４種の蛋白質を純粋な形で得ることができるという事実 から、以下のことが可能となる。すなわち、常法によりこれらの蛋白質のアミノ 酸の組成および配列を解明すること；解明されたペプチド配列に基づいてオリゴ ヌクレオチドプローブを調製すること；これらの蛋白質をコードするゲノムＤＮ ＡまたはｃＤＮＡを常法により、たとえば（ａ）標識付きオリゴヌクレオチドプ ローブを適宜なライブラリーのＤＮＡにハイブリダイズすることにより（ヤコブ スら、　１９８５）　、（ｂ）界面活性増強活性についての発現クローン化（ワ ンら、　１９８５）およびスクリーニングにより、あるいは（Ｃ）発現した蛋白 質とその蛋白質または断片に対する抗体との免疫反応性により同定すること；な らびに同定されたゲノムＤＮＡもしくはｃ　ＤＮＡおよび一般的な発現技術を用 いて、すなわちこうして同定されたＤＮＡを含む、遺伝子工学的に調製された宿 主細胞、たとえば微生物、昆虫または哺乳動物由来の宿主細胞（たとえば上記Ｄ ＮＡにより、または上記ＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換されたもの） を培養することにより、対応する組換え蛋白質を製造することである。 たとえば２種の３５ｋｄ蛋白質のうち１種のトリプシン処理断片を調製し、配列 を決定した。解明されたトリプシン処理断片のペプチド配列に基づいてオリゴヌ クレオチドプローブを合成し、これを用いて、ヒト肺ｍＲＮＡから調製したラム ダｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。これらのプローブにハ イブリダイズする多数のクローンが同定された。これら陽性クローンのうち２種 （ＰＳＡＰ−１およびＰＳＡＰ−２）から得たＤＮＡをＤＮＡ配列決定のために Ｍ２Ｓにサブクローン化して、クローンＭＰＳＡＰ−ＩＡおよびＭＰＳＡＰ−６ Ａを得た。２種の３５ｋｄ界面活性蛋白質それぞれをコードするｃＤＮＡクロー ンに関するヌクレオチド配列がこれにより解明され、それぞれ前記の表１および ２に提示される。２種の３５ｋｄ蛋白質をコードするサブクローンの配列は類似 するが同一ではない。配列の相違によって、制限酵素ＰｓｔＩが認識するコード 領域に関して２種のクローン間に制限断片多型が生じる。 ２種のクローン間にはそれらの３′側非翻訳領域にかなり多数のヌクレオチドの 相違が認められた。それぞれ表１および２に示したヌクレオチド約９４０〜９５ ０個のＥｃｏＲＩ断片をプラスミド５Ｐ６５のＥｃｏＲＩ部位に挿入することに より、プラスミドＰＳＰ３５に−ＩＡ−１０およびＰＳＰ３５に一６Ａ−８を構 成した（後記参照）。ＰＳＰ３５に−ＩＡ−１０はｃＤＮＡ位置１のＥｃｏＲＩ 部位に隣接したポリリンカ一部位を含み、一方ＰＳＰ３５に一６Ａ−８はｃＤＮ Ａ位置９４７のＥｃｏＲＩ部位に隣接したポリリンカ一部位を含む。ＰＳＰ３５ に−ＩＡ−１０およびＰＳＰ３５に一６Ａ−８はアメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクション（ＡＴＣＣ）（マリーランド州ロックビル）にそれぞれ受理番 号Ａ　Ｔ　ＣＣ４０２４３および４０２４４で寄託された。 さらに、冷ブタノール不溶性６に蛋白質（表５参照）のＮ−末端配列に基づいて オリゴヌクレオチドプローブを合成し、これをヒト肺ｍＲＮＡから調製したｃＤ ＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた（ツールら、　１９８４）　（後記 実施例４に、より詳細に記述する）。これらのプローブにハイブリダイズするク ローン数種が同定された。ハイブリダイゼーションの強さに基づいて１種のクロ ーンが選択され、Ｍ２Ｓにサブクローン化され、配列決定された。こうしてＥｅ ｏＲＩ断片として同定されたクローン化ｃＤＮＡをプラスミド５Ｐ８５のＥｃｏ ＲＩ部位に挿入することによりプラスミドＰＳＰ６に−１７−３が構成された（ ディー・ニー中メルトンら、　１９８４．　ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ 、　１２　：　７０３５−７０５６）。ＰＳＰ６に−１７−３はＡＴＣＣに受理 番号Ａ　Ｔ　ＣＣ４０２４５で宵託された。このクローン化ｃＤＮＡ挿入因子の ヌクレオチド配列を表５に示す。 Ｆ　Ｐ　Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｐ　Ｙ　（−）νＬ　（−）　（−）　Ａ　Ｌ（−）−決 定されていない ８．１１および１２の位置は同定されなかった。 当業者には認識されるように、ＰＳＰ６に−１７−３中のｃＤＮＡ挿入因子は分 子量４０ｋｄ以上の蛋白質をコードする開放読み枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ 　ｆｒａｍｅ）を含む。現時点では一次翻訳産物をさらにたとえば■型肺細胞（ 肺胞■型細胞）で処理すると、はぼ６にの蛋白質が得られると考えられる。上記 のｃＤＮＡ、その一部またはそれにハイブリダイズしうる配列を一般的な発現法 により宿主細胞または細胞系列中に発現させて、界面活性または界面活性増強活 性をもつ“組換え”蛋白質を産生させることができると考えられる。 はぼ６にのクローン化蛋白質に関しては、本発明は表６に示した配列のヌクレオ チドＡ　−６５６〜Ｃ−７５７に対応する特徴的ペプチド配列■Ωｅ−Ｃｙ　ｓ 　ｓすなわちＩＫＲＩＱＡＭＩＰＫＧＡＬＡＶＡＶＡＱＶＣＲＶＶＰＬＶＡＧＧ Ｉ　ＣＱＣをコードする異種ＤＮＡ配列を含むベクターを包含する。この種のベ クターの１種は下記ヌクレオチド配列を含む。 ＡＴＣＡＡＧ　ＣＧＧ　ＡＴＣＣＡＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＡＴＴＣＣＣＡＡＧ　Ｇ ＧＴ　ＧＣＧ　ＣＴＡ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＧＣＡＧＴＧ　ＧＣＣＣＡＧ　ＧＴＧ 　ＴＧＣＣＧＣＧＴＧ　ＧＴＡＣＣＴ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣＧＧＣ ＡＴＣＴＧＣＣＡＧ　ＴＧＣ本発明の他のベクターは、表６のアンダーラインを 付したペプチド領域に実質的に示された特徴的ペプチド配列、すなわちＦＰＩＰ ＬＰＹＣＷＬＣＲＡＬＩＫＲＩＱＡＭＩＰＫＧＡＬＡＶＡＶＡＱＶＣＲＶＶＰＬ ＶＡＧＧＩＣＱＣＬＡＥＲＹＳＶＩＬＬＤＴＬＬＧＲＭＬをコードする異種ＤＮ Ａ配列を含む。この種のベクターの１種は表６のアンダーラインを付したヌクレ オチド配列に実質的に示される下記のＤＮＡ配列を含む。 ＴｒＣＣＣＣＡＴＴα７　ＣＴＣＣＣＣＴＡＴ　ＴＧＣＴＧＧ　ＣＴＣＴＧＣＡ ＧＧ　−Ｇ（Ｔ　ＣＴＧＡＴＣＡＡＧ　ＣＧＧ　ＡＴＣＣＡＡ　ＧＣＣＡＴＧ　 ＡＴｒ　ＣＣＣＡＡＧαＴ　ＧＣＧ　ＣＴＡ　ＧＣＴ　ＧＴＧＧＣＡ　ＧＴＧ　 ＧＣＣＣＡＧ　ＧＴＧ　ＴＯＯＣＧＣσｒＧ　ＧＴＡ　ＣＣＴ　Ｃ１℃ＧＴＧ　 ＧＣＧ　ＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧ　ＴＧＣＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧαｆ 　ＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＴＣＣＴＧ　ＣＴＣＧＡＣＡＣＧ　ＣＴＧ　Ｃ：ｒＧＧ ＧＣＡＴＧ　Ｃ１℃他のベクターの一例は表６の全長ペプチド配列をコードする 、表６に示したヌクレオチド配列などの異種ＤＮＡ配列を含む。 表６に示したＰＳＰ６に−１７−３の全長ｃＤＮＡよりも短いＤＮＡ配列からな るベクターに対するＤＮＡ挿入因子は既知の方法により、たとえば自動ＤＮＡ合 成装置を用いて合成でき、あるいは全長ｃＤＮＡ配列から常法により、たとえば ループアウトによる変異誘発、あるいは制限酵素による開裂およびリゲーション により調製できる。こうして調製されたベクターを常法により目的蛋白質の発現 に用いるか、あるいはより長鎖のｃＤＮＡ挿入因子を含むベクターの組立てに用 いることができる。前者の場合、ベクターはＤＮＡ挿入因子が操作可能な状態で 結合したプロモーターをも含み、さらに増幅可能なおよび／または選択可能なマ ーカーを含んでいてもよい。これらはすべて当技術分野で周知である。 以上のように本発明の蛋白質は天然蛋白質をヒト肺胞材料から採取および精製す ることにより製造できる。あるいは微生物もしくは昆虫、または好ましくは哺乳 動物由来の宿主細胞を用いて一般的な発現法により、目的蛋白質をコードするＤ ＮＡ配列の発現によって、対応する“組換え”蛋白質を産生ずるこ入する方法は 当技術分野で周知である。この種のベクターによるトランスフェクションまたは 形質転換に適した宿主細胞、ならびにｃＤＮＡの発現も当技術分野で周知である 。たとえば哺乳動物細胞発現ベクターは当業者に周知の技術により合成できる。 これらのベクターの成分、たとえば細菌レプリコン、選択遺伝子、エンハンサ− 、プロモーターなどは天然材料から得られるか、あるいは既知の方法で合成でき る。カウフマン、プロ株細胞系列（トランスフオームした細胞系列を含む）は宿 主として適している。正常な二倍体細胞、−次組織のインビトロ培養により得た 細胞株、および−法外植体も適している。候補細胞は選択遺伝子が優性に作用す る限り遺伝子型に選択遺伝子が欠損している必要はない。 宿主細胞は好ましくは哺乳動物の株細胞系列であろう。ベクターＤＮＡを染色体 ＤＮＡに安定な状態で一体化するためには、また一体化したベクターＤＮＡを次 いで増幅するためには（双方とも常法による）　、ＣＨＯ（チャイニーズ　ハム スター卵巣）体または一部を含んでいてもよく、またＣ１２７マウス細胞などの 細胞系列中に保有されていてもよい。使用できる他の哺乳動物細胞系列にはヒー ラ細胞、ＣＯ８−１モンキー細胞、マウスＬ　−９２９細胞、３Ｔ３系列（スイ ス、バルブ−ＣもしくはＮＩＨマウス、ＢＨＫもしくはＨａＫハムスターなどの 細胞系列由来のもの）などが含まれる。肺胞■型細胞由来の細胞系列は特定の場 合、たとえばＰＳＰ６Ｋ１３−７からのｃＤＮＡ挿入因子またはその断片を用い る６に蛋白質（単独または本発明の他の蛋白質１種もしくは２種以」二と共に） の発現などには好ましいであろう。 次いで産物の発現に関して安定な形質転換体を免疫学的または酵素アッセイ法に よりスクリーニングする。」二記蛋白質をコードするＤＮＡの存在は標準法、た とえばサザーンブロツティング法により検出できる。発現ベクターＤＮＡを適切 な宿主細胞、たとえばＣ０８−１モンキー細胞に導入したのち数日間における上 記蛋白質コード化ＤＮＡの一過性発現は、選択なしに培地における上記蛋白質の 活性または免疫学的アッセイ法により測定される。 細菌による発現の場合、上記蛋白質をコードするＤＮＡをさらに修飾して、当技 術分野で知られておりかつ好ましくは細菌による成熟バリアント蛋白質の分泌が 可能な分泌型リーダーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に枠内で操作 可能な状態で結合している（同様に当技術分野で知られている）、細菌発現に好 ましいコドンを含有させることができる。哺乳動物、昆虫または微生物由来の宿 主細胞中に発現された化合物は、次いで採取され、精製され、ならびに／あるい は物理化学的、生化学的および／または臨床的パラメーターに関して特性が明ら かにされるであろう。これらはすべて既知の方法により行われる。 本発明の蛋白質１種または２種以上を、薬剤学的に受容できる脂肪酸もしくは脂 質（たとえばジパルミトイルホスファチジルコリン）と、またはこの種の脂肪酸 もしくは脂質の混合物と（これらは市販されているか、または常法により得られ る）、あるいは天然の界面活性脂質と組合わせて、肝性界面活性物質配合組成物 を得ることができる。天然の界面活性脂質は既知の方法で肺胞、たとえばウシま たはヒトの肺胞から抽出できる。 一般に組成物中の総脂質対総蛋白質の重量比は約２０：１〜約ｔｏｏ：１であろ う。現在、臨床試験において試験されている水準においては、−同量の界面活性 組成物は総蛋白質１〜２ｍｇおよび総脂質９８〜９９ｍｇに相当する。 （１）表１のヌクレオチド配列によりコードされた３５ｋｄ蛋白質、（２）表２ のヌクレオチド配列によりコードされた３５ｋｄ蛋白質、（３）表６のｃＤＮＡ 配列によりコードされ、表３に示すアミノ酸組成をもつ６ｋｄ蛋白質、および（ ４）表４に示されるアミノ酸組成をもつ６ｋｄ蛋白質の特定の組合わせが、特定 の臨床適用症を伴う患者の治療に特に有用であろう。たとえば本発明は特に下記 の部分組合わせ、およびこの種の部分組合わせを含む組成物を意図する。 （ａ）　蛋白質（１）　、　（２）　、　（３）または（４）；（ｂ）　蛋白質 （１）および（２）； （ｃ）　蛋白質（１）および（３）； （ｄ）　蛋白質（１）および（４）； （ｅ）　蛋白質（２）および（３）； （ｆ）　蛋白質（２）および（４）； （ｇ）　蛋白質（１）　、　（２）および（３）；（ｈ）　蛋白質（２）、（３ ）および（４）；（ｊ）　蛋白質（３）および（４）； （ｊ）　蛋白質（１）、（２）および（４）；ならびに（ｋ）　蛋白質（１）　 、　（３）および（４）。 現時点では蛋白質（３）および／または（４）を含有する組成物が好ましい。 肺胞蛋白症を伴う患者からの肺胞（５０ｔｎｌ）を１０．０００Ｘ　ｇで５分間 遠心分離した。ベレットを採取し、２０ａ＋Ｍ　トリスＨＣΩ、０．５　Ｍ　− Ｎａ　Ｃ４）　（ｐＨ７，４）中で５回洗浄した。脂質および脂質付随蛋白質を 洗浄ベレットから１−ブタノール５０ｍ１と共に室温で１時間振とうすることに より抽出した。ブタノール不溶性物質を遠心分離により採取し、蒸留水で洗浄し 、５０ｄリン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）および６ＭグアニジンＨＣｇに溶解し た。蛋白質をバイダック（Ｖｙｄａｃ）　Ｃ４逆相カラムに施し、０．１％トリ フルオル酢酸を含有するアセトニトリル：２−プロパツール（２：１．Ｖ：Ｖ） の濃度勾配を用いて溶離した。５０％Ｂで溶出する主蛋白質ピークを採取し、蒸 発乾固した。存在する蛋白質を５Ｄｓ−ＰＡＧＥ＋：より分析した（レムリ、　 １９７０）。 アルキル化およびトリプシン処理によるマツピングこうして得た蛋白質（約５０ μｇ）を２００ｍＭ　・ＨＣρ、１關・ＥＤＴＡ、６Ｍグア＝ジンＨＣＤ　、　 ２（１ｍＭ・ＤＴＴ　（ｐＨ８，５）に入れ、３７℃で２時間還元した。固体ヨ ードアセトアミドを最終濃度６０ｍＭとなるように添加し、反応物を０℃で２時 間、アルゴン下に暗所でインキュベートした。反応を停止し、０．１Ｍ−ＮＨ４ ＨＣＯ３，５０ｍＭ・２−メルカプトエタノール（ｐＨ７，５）中へ透析し、次 イテサらにｌｏｏｍＭ・ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７，５）中へ透析することにより 試薬を除去した。アルキル化蛋白質をトリプシン（トリプシン３０重量％）で３ ７℃において１６時間消化し、消化物をＣ１８バイダツク逆相ＨＰＬＣカラム（ ４，６Ｘ２５Ｏｎｏｎ）上でクロマトグラフィー処理した。 トリプシン処理したペプチドを９５％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直 線的濃度勾配により溶離し、採取し、アブライドーバイオシステムズ・モデル４ ７０　Ａ蛋白質シーケンサ−を用いてＮ−末端エドマン分解を行った。ＰＴＨ− アミノ酸はバンカピラーおよびフード（１９８３）の方法により分析した。こう してトリプシン処理断片Ｔ１９．　Ｔ２ＢおよびＴ２８について得た断片の配列 分析データを下記の表７に示す。 Ｔ１９　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＨｙｐＧｌｙ　Ｉ ｌｅ　Ｈｙｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ＨｙｐＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅ ｕ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＴ２６　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ 　５ｅｒ１１ｅ　ＭＥＴ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　（−）　（−）　ＬｙｓＴ２８　Ａ ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ｌｉｅ実施例　２ 実施例１で得たブタノール抽出液を一２０℃で保存し、低分子量蛋白質のうちの １種を沈殿させた。沈殿を遠心分離により採取し、真空下に乾燥させた。ブタノ ール可溶性蛋白質を含有するブタノールを蒸発乾固した。沈殿した冷ブタノール 不溶性蛋白質および冷ブタノール可溶性蛋白質を次いで下記の同一方法で平行し て精製した。粗蛋白質それぞれを別箇にクロロホルム：メタノール（２：　１． 　ｖ／ｖ）に溶解し、セファデックスＬＨ２０カラムに施し、クロロホルム：メ タノール（２：　１）で溶離した。 これらの蛋白質を次いで５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。蛋°　白質を含有す る画分をプールし、蒸発乾固し、６Ｎ−ＨＣｇ中で１１０℃において２２時間加 水分解したのちベックマン・モデル６３．０００アミノ酸分析器によるクロマト グラフィーによって、アミノ酸組成を測定した。Ｎ−末端配列はアプライド・バ イオシステムズ４７０Ａシーケンサ−により測定された。１０〜２０％ＳＤＳポ リアクリルアミドゲル上で分子量を測定した。 トリプシン処理断片Ｔ２８のアミノ酸配列（表７）に基づいて、オリゴヌクレオ チドプローブを合成した。このプローブは２０ｍｅｒのプール４種からなり、各 プールは３２種の異なる配列か表　８ ＧＣＣＴＣＧＴＴＴＴＣＴＴＣＮＧＧＧＴＴＴＡ　Ａ ＧＣＣＴＣＧＴＴＴＴＣＣＴＣＮＧＧＧＴＴＴＡ　Ａ ＧＣＣＴＣＧＴＴＣＴＣＴＴＣＮＧＧＧＴＴヒト肺ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライ ブラリーをツールら（１９８４）の記載に従って調製し、４種のプールの全混合 物につき塩化テトラメチルアンモニウムをハイブリダイゼーション溶剤として用 いてスクリーニングした（ヤコブスら、　１９８５）。 ０．５〜１％のファージクローンがこのプローブつき陽性であった。 これらのクローンのうち２種から得たＤＮＡをＤＮＡ配列分析のためにＭ２Ｓに サブクローン化した。プール■を配列決定プライマーとして用いることにより、 トリプシン処理断片Ｔ２６に対応するヌクレオチド配列を両クローンにおいて同 定し、単離されたクローンが肺胞蛋白症患者の肺胞材料から得た部分精製３５ｋ Ｄ蛋白質中に見られる主蛋白質種をコードすることを確認した（前記参照）。 これら２種のクローンはヌクレオチド２５０個のうち３個の位置においてヌクレ オチド配列が異なっていた。両クローンは、Ｂａｆ１３１ヌクレアーゼにより、 指令した一組の欠失を生じさせ、他のＭＬ３ベクター中に再クローン化し、ジデ オキシヌクレオチドチェーンターミネーションにより配列決定することによって 、再クローンを完全に配列決定した（ビエラおよびメツシング。 １９８２　、サンガーら、　１９７７）。一方のクローンはＩＡと呼ぶ型の全長 コピー（表１）に対応し、第２のものは６Ａと呼ぶ型の不完全なコピー（表２） に対応していた。６Ａ型に特異的なオリゴヌクレオチドを用いることにより、こ の型の全長クローンが同定された。ラムダｇｔｌＯｃＤＮＡクローンの５′側Ｅ ｃｏＲＩ断片をＭ２Ｓ中にサブクローン化し、上記のように特異的オリゴヌクレ オチドをプライマーとして用いることにより配列決定した。この配列を表２に示 す。２種のクローンはコード領域内でアミノ酸の変化をもたらす７個のヌクレオ チド、および沈黙変化をもたらす６個のヌクレオチドにおいて異なる。これらの 変化により、２種のクローン間で制限酵素ＰｓｔＩに対するコード領域内に制限 断片多形が生じる。クローン６Ａはヌクレオチド位置４５４および４７８（表２ ）に２個のＰｓｔＩ部位をもち、クローンＩＡは４５４　、４７８および７５６ （表１）に３個のＰｓｔＩ部位をもつ。各クローンを３′側非翻訳領域において さらにＤＮＡ配列決定を行うことにより、大きなｌｋｂ非翻訳領域があること、 およびＭＰＳＡＰ−ＩＡとＭＰＳＡＰ−６Ａの間にかなり大きなヌクレオチドの 相違があることが明らかにされた。 ＤＮＡ結合およびハイブリッドの選択 サブクローンＭＰＳＡＰ−ＩＡまたはＭＰＳＡＰ−ＩＢから得たきわめて希薄な （１０〜１５μｇ／ｍり一本鎖ＤＮＡを真空下にニトロセルロース紙に施した（ １０Ｍｇ／ｃｍ）　（カファトスら、　１９７９）。ＭＰＳＡＰ−ＩＡはＭ２Ｓ 中で一方向に０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片のＭ１３サブクローンを示す。ＭＰＳ ＡＰ−ＩＢはＭ２Ｓ中で反対方向にクローン化した同一断片を示す。各濾紙（ｌ ｃ♂）を９枚の同一寸法の片に切断し、各片を２０〜３０μｇのハイブリダイゼ ーション反応に用いた。各反応液はヒト肺ＲＮＡ　（５ｍｇ／ｍｌ）　、５０％ 脱イオン化ホルムアミド（フル力・ニー・ジー・ケミカル・コーポレーション） 、ｌＯＩＩＩＭ・ＰＩＰＥＳ（（ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス）（２−エタンス ルホン酸）　）　（ｐＨ６，４）　、および０．４Ｍ−Ｎａ　Ｃ９を含有してい た（ミラーら、　１９８３）。ＲＮＡの供給材料および製法については先に報告 されている（フローロスら、　１９８５）。各ハイブリダイゼ一シヨン反応液を ルーティンに５０℃で３時間インキュベートした。インキュベーション期間の終 了時に各濾紙を１ｍ１１　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（，１５Ｍ−Ｎａ　ＣＤ　、０．０１ ５Ｍクエン酸ナトリウム、０．５％５ＤＳ）により６０℃で５分間、５回洗浄し た。次いでこれを２ｍＭ・ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，９）　１ｍｌにより６０℃で５ 分間、３回洗浄した。１ｍＭ・ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，９）　３００　ｕｌおよび 酵母ｔ　、ＲＮ　Ａ　１０Ｍｇ（ベーリンガーφマンハイム）中で１分間煮沸す ることにより、選ばれたＲＮＡを溶出させた。沈殿したＲＮＡを翻訳し、免疫沈 殿させ、−次元および二次元ゲル電気泳動処理した（フローロスら、　１９８５ ）。 実施例　４ 表５に示した配列の最初の６個のアミノ酸に基づいて、オリゴヌクレオチドプロ ーブを合成した。このプロ・−ブは１７ｍａｒのプール６種からなっていた。３ 種のプールはそれぞれ１２８種の配列を含み、３種のプールはそれぞれ６４種の 配列を含んでいた。 最初の７個のアミノ酸に基づいて、２０ｍｅｒのプール２種を合成した。これら のプールは３８４種または１９２種の配列を含んでいた。 ヒト肺ｍＲＮＡから得たｃＤＮＡライブラリーをツールら（１９８４）の記載に 従って調製し、６種のプールの全混合物につき塩化テトラメチルアンモニウムを ハイブリダイゼーション溶剤として用いてスクリーニングした（ヤコブスら、　 １９８５）。 約１００．０００種のファージをスクリーニングし、プローブにハイブリダイズ したファージ１００種をプラーク精製した。次いでファージを２５群のプールに 分け、各１７ｍｅｒおよび２０ｍｅｒプールにつきスクリーニングした。２０ｍ ａｒオリゴヌクレオチドプローブのうち１種および対応する１７ｍｅｒプールの うち１種（１２８種の配列を含むプール１４４７）に最も強くハイブリダイズし た６種のファージをプラーク精製した。１７ｍａｒのプール１４４７を３２種の 配列をもつ４種のプールに分け、これらのファージから調製したＤＮＡ斑点にハ イブリダイズさせた。 ハイブリダイゼーションの強さに基づいて、これら６種のファージのうち１種か ら得たＤＮＡをＤＮＡ配列分析のためにＭ１３中へサブクローン化した。表５に 示すアミノ酸の種類および位置に対応する配列が得られ、単離されたクローンが 肺胞蛋白症患者の肺胞材料中に認められる約６ｋｄの冷ブタノール不溶性蛋白質 にコードすることが確認された（前記参照）。 得られた第１クローンは開始メチオニンを欠如するので、ｍＲＮＡの不完全なコ ピーであると推定され、より長鎖のクローンを単離するために用いられた。２種 のクローンは、ＢａΩ３１ヌクレアーゼを用いて、指令した一組の欠失を生じさ せ、他のＭ１３ベクター中へ再クローン化し、ジデオキシヌクレオチドチェーン ターミネーション法により配列決定することによって、完全に配列決定された（ ビエラおよびメッシング、１９８２；サンガーら、　１９７７）。一方のクロー ンは１７と呼ぶ型の全長コピー（表６）に対応し、第２のものはクローン１７の ヌクレオチド１４８に始まるものであった。第３クローンの５′側末端の配列に より、クローン１７の５′末端の配列が確認された。これらのクローンはコード 領域全体を通して同一であり、３′非翻訳領域の２個の位置においてのみ異なっ ていた。 参考文献 １、ニス、エヌ、バタカリャおよびダブり二一、ニス、リン（１９７８）ビオヘ ミ、ビオフィシ、アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ａｃｔａ）　５３７．３２９−３３５ ２、ニス、エヌ、バタカリャおよびダブリュー、ニス、リン（１９８０）ビオヘ ミ、ビオフィシ、アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ａｃｔａ）　８２５．４５１−４５８ ３、ニス、エヌ、バタカリャ、エム、ニー、パセロ、アール。 ビー、ジオ−ガスチン、およびダブり二一、ニス、リン（１９７５）ジエイ、ク リニ、インベスト、（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）５５、９１４−９２ ０ ４、ジエイ、フローロス、ディー、ニス、フエルプスおよびダブり二一、エッチ 、トイシュ（１９８５）ジエイ、バイオロ、ケミ　（Ｊ、Ｂｆｏｌ、Ｃｈｅｗ、 ）　２６０．　４９５−５００５、ニス、ホーグツド、ビー、ジエイ、ベンソン およびアール、エル、ハミルトン、ジュニア（１９８５）バイオケミストリー２ ４．１８４−１９０ ６、エム、ダブリュー、バンカピラーおよびエル、イー、フード（１９８３）メ ソッズ、イン、エンザイモロジ−９１，４８６−７、ケー、ヤコブス、シー、シ ューメーカー、アール、ルーデルスドルフ、ニス、ディー、ネイル、アール、ジ ェイ、カウフマン、ニー、マフソン、ジエイ、セーラ、ニス、ニス。 ジョーンズ、アール、ヘーウィック、イー、イー、フリッチュ、エム、カワキタ 、ティー、シミズおよびティー、ミャケ（１９８５）ネイチャー（ロンド、　） 　（Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ、））　３１３゜５ｏｅ−ｓｉｏ。 ８、イー、カファトス、ダブり二一、シー、ジョーンズおよびニー、エフストラ ティアディス（１９７９）ヌクレイツク、アシッド、レスト、（Ｎｕｃｌｅｉｃ 　ａｃｉｄ　Ｒｅ５ｔ、）　７．１５４１−１５５２９、ニス、エル、カチャル 、ジエイ、ニス、アメンタ、ジー。 シンおよびジエイ、ニー、シルバーマン（１９８４）アメ、ジエイ。 オブステト、ジャイネ：］ｏ、　（Ａａ＋、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅ ｃｏｌ、）１４８．４８−５３ １０、ニス、エル、カチャルおよびジー、シン（１９８１）ビオヘミ。 ビオフィシ、アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　６７０ ．３２３−３３１゜ １１、アール、ジエイ、キング、エム、シー、カルミカエルおよびビー、エム、 ホロビッツ（１９８３）ジェイ、バイオロ、ケミ。 （Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　２５８．　Ｌ０６７２−１０６８０゜１２ 、アール、ジエイ、キング（１９８２）ジエイ、アブラ、フィジオｏ、（Ｊ、　 Ａｐｐｌ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｅｘｅｒｃｌｓｅ、　Ｐｈｙｓｆｏｌ、）　５ ３．１−Ｌ１３、アール、ジエイ、キング、ディー、ジエイ、クラス、イー。 ジー、ジャイカスおよびジエイ、ニー、クレメンッ（１９７３）アメ、ジエイ、 フィジオＣ７，（Ａｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）　２４４．７８８−７９５ ゜ １４、アール、ジエイ、キング、ジエイ、ルーフ、イー、ジー。 ジャイカス、ニー、シー、ジー、プラッッカーおよびビー。 グー。クリージー（１９７５）ジエイ、オブ、アプライド、フィシ。 （Ｊ、　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｓ、）　３９．７３５−７４１゜１５、 ニー、ケー、レムリ（１９７０）ネイチャー（ロンド、）（Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌ ｏｎｄ、））　２２７．６８０−６８５゜１６、ジエイ、ニス、ミラー、ビー、 エム、ペーダーリン、アール、ビー、リシアルディ、エル、ニーエンおよびビー 、イー。 ロバーツ（１９８３）メソツブ。イン、エンザイモロジ−１０１ｐ。 ６５０−６７４゜ １７、ディー、ニス、フエルプス、ダブり二一、エッチ、トイシュ、ビー、ベン ツンおよびニス、ホーグツド（１９８４）ビオヘミ、ビオフィシ、アクタ（Ｂｉ ｏｅｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｓ、　Ａｅｔａ）　７９１−２２６−２３８゜ １８、ニス、ニー、シェリー、ジエイ、ニー、パリス、ジェイ。 イー、パシガ、アール、ニー、クヌッペル、イー、エッチ。 ルフォロ、およびピー、ジエイ、ブイス（１９８２）アメ、ジエイ。 オブステト、ジャイネコｏ、　（Ａｍ、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏ ｌ、）１４４、２２４−２２８゜ １９、エッチ、シダリスト、ケー、シダリストーネルソンおよびジー、ギター（ １９７７）　ＢＢＲＣ７４，１７８，１８４゜２０、ケー、スエイシおよびジー 、ジエイ、ベンソン（１９８１）ビオヘミ、ビオフィシ、アクタ（Ｂｊｏｃｈｅ ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｅｔａ）６６５、４４２−４５３゜ ２１、ジエイ、ジエイ、ツーレ、ジェイ、エル、ノツプ、ジエイ６エム、ウォツ ニー、エル、ニー、スルツマン、ジエイ、エル。 バッカー、ディー、ディー、ビッツマン、アール、ジエイ。 カウフマン、イー、ブラウン、シー、シューメーカー、イー。 シー、オル、ジー、ダブリュー、アンフレット、ダブりニー。 ジー、フォスター、エム、エル、ニー、ジー、エル、ヌートソン、ディー、エヌ 、イース、アール、エム、ヒーライック（１９８４）ネイチャー（ロンド、　） 　（Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ、））　３１２゜３４２−３４７゜ ２２、ジエイ、ニー、ホワイトセット、ダブり二一、ハル、ジー。 ロスおよびティー、ウィーμ−（１９８５）ビープイアトリック。 リサ、（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓ、）　１９．５０１−５０８゜２３、ジー 、ジー、ワンら、　１９８５．サイエンス２２８　：　１１１１０−８１５゜国 際調査報告 ＋′＋ａ＋ｎ°゛０°°゛１°ｌｌ’＋Ｉｂ６′”’ｒ、、ｃ％／’ｌフｎ１４

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．分子量約３５，０００ダルトン、および表１に示すＤＮＡ配列によりコード されることを特徴とする、肺の界面活性を増強するために用いられる精製蛋白質 。
2. ２．分子量約３５，０００ダルトン、および表２に示すＤＮＡ配列によりコード されることを特徴とする、肺の界面活性を増強するために用いられる精製蛋白質 。
3. ３．分子量約５．５〜９キロダルトンの分子量を特徴とし、表６のＤＮＡ配列に よりコードされる、肺の界面活性を増強するために用いられれる精製蛋白質。
4. ４．分子量約５．５〜９キロダルトン、および表４に示すアミノ酸組成を特徴と する、肺の界面活性を増強するために用いられる精製蛋白質。
5. ５．表１または表２に示される蛋白質配列をコードする組換えＤＮＡ分子。
6. ６．肺の界面活性増強活性を有する蛋白質をコードする、表６に示す蛋白質配列 をコードする組換えＤＮＡ分子、またはこれにハイプリダイズしうるＤＮＡ分子 。
7. ７．請求の範囲第５項または第６項のＤＮＡにより形質転換された宿主細胞また は細胞系列。
8. ８．請求の範囲第７項に記載の細胞または細胞系列を培養することからなる、肺 の界面活性を増強するために用いられる蛋白質の製法。
9. ９．請求の範囲第８項により製造された、肺の界面活性を増強するために用いら れる蛋白質。
10. １０．界面活性を増強するのに有効な量の、請求の範囲第１項、第２項、第３項 、第４項または第９項に記載の蛋白質１種または２種以上、ならびに薬剤学的に 受容できる脂肪酸および／または脂質からなる肺性界面活性物質組成物。
11. １１．下記の配列 【配列があります】 からなるペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列を含むベクター。
12. １２．下記の異種ＤＮＡ配列 【配列があります】 を含むベクター。
13. １３．下記の配列 【配列があります】 からなるペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列を含むベクター。
14. １４．下記の異種ＤＮＡ配列 【配列があります】 を含むベクター。