JPS63500912A - 炭水化物の加水分解および分解生成物の微生物による同時再加工のための生命工学的連続方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 炭水化物の加水分解および分解生成物の微生物による同時再加工のための生命工 学的連続方法 本発明は、固定化され有利には橋絡された酵素が、有利には嫌気性又は微好気性 の微生物小薄片と共に塔反応器に投入される、代謝可能でない炭水化物の酵素に よる加水分析、及び、特にはエタノール、ブタノール、アセトン、乳酸及びグリ セリンへの分解生成物の同時再加工のための生命工学的連続方法に関る。

微生物にとって利用可能でない、または利用困難な基質への微生物の接近を実現 するために、従来幾つかの方法が用いられてきた。即ち、 １、多段方法；この場合、第一段で基質は対応する生物に合わせて酵素的に処理 され、その後火のステップで微生物分解が生じる（穀物醸造所、例えば、英国、 ウェスト　サセソクス　アール・エイチ　１０２キユー・ビー、フローリーに在 るエイ・ピー・ヴイ　カンパニーリミテッド（Ａ、Ｐ、Ｖ、　Ｃｏｍｐａｎｙ　 Ｌｔｄ、、　Ｃｒａｗｌｅｙ、　ＷｅｓｔＳｕｓｓｅｘ　ＲＨ１０２ＱＢ、　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　）の通常の方法）。

２、単一段の処理手続きを可能にするため、欠落している酵素的特性を遺伝学的 に組込む試み（雑誌バイオテクノロジー（Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）　、第１ 巻、第２１９頁−第２２８頁、ＡＥ　グツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ　）　、　Ａ 　Ｔ　ストルゼレツキ−（Ｓｔｒｚｅｌｅｃｋｉ）　、Ｐ　Ｌ　ロジャース（Ｒ ｏｇｅｒｓ　）による（１９８４年）「ジモモナスモビリスによるラクトーゼか らのエタノールの形成（Ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｆｒｏｍ　 １ａｃｔｏｓｅ　ｂｙ　ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ）　Ｊ　）　＊３ 、酵素が化学的又は物理的方法により微生物と結合されて反応空間に引き留めら れる、微生物と酵素との各種０：）共固定化（トレンズ　イン　バイオテクノロ ジー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）　、第３巻、第１４９頁− 第１５３頁、Ｗ　ハルトマイアー（Ｈａｒｔｍｅｉｅｒ　）による（１９８５年 ）［固定化生体触媒−単純システムから複合システムへ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ ｄ　ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ　−ｆｒｏｍ　ｓｉｍｐｌｅｔｏ　ｃｏｍｐｌｅ ｘ　ｓｙｓｔｅｍｓ）　Ｊ　）　ａ多段消化方法は、第二段が開始される前に最 初の変換が終了していなければならないために比較的時間がかかるという不都合 を有する。更に、酵素的変換の際にいわゆる最終生成物抑制がしばしば起こるの で、完全な基質変換の達成は困難である。

工業的規模では、遺伝学的に変更された生物を伴う作業の場合、しばしば請求め られる特性を最早もっていない復帰突然変異に至る。

生物とその場合に望ましい酵素との共固定化は、程度の差こそあれ著しい生物の 活動性の損失に通じるが、これは、生物が製造の際、細胞毒例えばグルタルアル デヒドとの接触を受け、又は付加的な拡散バリヤによって囲まれるためである。

大量生産性の上昇のためには反応器中の細胞密度を高めることが有利である。こ のためには原則的に次の可能性がある。

１、細胞の固定化（ＲＭ　ラファティ（Ｌａｆｆｅｒｔｙ）、Ｅ　マイアー（Ｍ ａｉｅｒ　）　ｌＪｊ集、シュブリンガー　フエツチ、−り（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ 　Ｖｅｒｌａｇ　）ベルリン、ハイデルベルク、ニューヨーク、東京　１９８３ 年刊行、「エンザイムテクノロジー、■　ローテンプルタ　フェルメンテ−ジョ ン　シンポジウム　１９８２　（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉ［ ＩＲｏｔｅｎｂｕｒｇ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　１９ ８２　）　Ｊ中のＫＤ　フオアロップ（Ｖｏｒｌｏｐ）　、Ｊ　クライン（Ｋｌ ｅｉｎ）による（１９８２年）「細胞固定化の分野における新発展−イオツドロ ビー性ゲル化による生体触媒の形成（Ｎｅｗｄｅｖｅｌｏｐ＋ｍｅｎｔｓ　ｉｎ 　ｔｈｅ　ｆｉｅｌｄ　ｏｆ　Ｃ１１ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ−Ｆｏｒａ ＋ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ　ｂｙ　１ｏｎｏｔｒｏｐｉｃ　 ｇｅｌａｔｉｏｎ　）」）。

２、分離器を伴う作業（ビオシュティルア、アルファラヴアル（Ｂｉｏｓｔｉｌ ｌ”　、　Ａｌｆａ　Ｌａｖａｌ）　）。

３、フィルター膜の投入（ブラウンシュヴアイクのシュタルコザ　ゲゼルシャフ ト　ミツト　へシュレンクテルハフツンク（Ｓｔａｒｃｏｓａ　Ｇｍｂ）Ｉ　、 　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）　）。

４、塔反応器への小薄片状生物の投入（「バイオテクノロジカル　レター　（Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｌｅｔｔ　）　Ｊ第４巻、第３４７頁−第３５２頁、ＧＷ 　シュトラントベルク（Ｓｔｒａｎｄｂｅｒｇ）　、Ｔ　Ｌ　ドナルドソン（Ｄ ｏｎａｌｄｓｏｎ　）、ＥＪ　アルキユリ　（＾ｒｃｕｒｉ）による（１９８２ 年）「ジモモナスモビリスの小薄片状菌株による連続的なエタノールの生成（Ｃ ｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｆｌｏ ’ｃｃｕｌｉｎｔ　５ｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｚｙａ＋ｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉ ｓ　）　Ｊ　）　ｓｌ乃至３の方法は望ましい生物のほかに雑菌も反応空間に戻 されて濃縮されるという不都合を有する。フィルター膜の投入は膜が破損し易い ために工業的な長時間操業においては問題となり得る。

塔反応器を使用する場合、小薄片状でない雑菌は生成物流と共に押し流されるた め、この不都合は生じない。

しかしながら、従来用いられてきた装着された分離器を有する塔反応器は、ａ） 直径を大きくすることによる流速の低下による効果と、同時にｂ）生成物を浴出 させる乱流のない外部区域を創出するために投入される円筒体又は上部の開放さ れた円錐体による効果との、二重の効果はもたらさない。

本発明の基礎には、そうでない場合に作用不可能又は作用困難な基質への微生物 の接近を可能にし、しかも加水分解のための更に別の方法による処置が必要とな ることのないようにするという課題が存する。

この課題は本発明によれば、微生物小薄片が、生物小薄片と類似の物理的特性を 有する固定化酵素と、反応空間中で協働することによって解決される。酵素によ って準備された基質が同時的に微生物によって最終生成物に変換される。塔反応 器への流入は下から行われる。反応器は拡大された上端部を存しており、これに よって流速が減じられる。拡大された端部内には、直径が反応器の内径よりも僅 かに大きい円筒体が挿入されている（図面参照）。円筒体の内部においては反応 の際に発生する気体が上昇し、他方、外部には浴出の行われる乱流のない区域が 存在する。この構成により生成物流は細菌の小薄片や酵素の小薄片を伴っておら ず、細菌は反応器中で濃縮される。大抵の生物の成長速度よりも早い流速を達成 して、小薄片状の生物だけは反応器中に保たれ得るが、小薄片状でない雑菌は生 成物流により押し流されるようにすることが可能である。

基質としては、固体分を全く或いは僅かしか伴わない、炭水化物を含有している 液体媒質、例えば乳清又はラクトーゼシロップ、Ｉ！蜜、砂糖大根の拡散ジュー ス、イヌリン含有シロップ、澱粉水溶液などが問題になる。

更に本発明は糖蜜と乳糖シロップとの混合物を用いることを意図している。乳糖 は高い濃度ではラクターゼにより完全に分解されることは困難であるが、これは 、反応の際に発生するガラクトーゼによって酵素が抑制され得るからである。し かしながら、生成物の濃度を高めるためには基質の糖の濃度が高いことが望まし い、Ｉ！蜜は塩の濃度が高いためにこの場合も一定の糖の濃度を越えることがで きないので、薄められた糖蜜と乳糖との混合物が提供される。これによって、高 い総Ｉ！濃度においては塩の負荷が糖蜜によって減じられ、乳糖の濃度が減じら れ得る。

更に本発明は、同時にいくつかの酵素がもちいられるようにすることを意図して いる。これによっても・生成物抑制の危険を冒すことなしに、より高い基Ｐｉ濃 度を保障することができるという利点が提供される。

次に実施例により本発明を説明する。

固定化されたアミログルコシダーゼとジモモナスモビリスの小薄片状菌株とを用 いたマルトデキストリンのエタノールへの発酵。

細菌の前培養：細菌は、１　ｇ　＋７）Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　Ｘ　７　Ｈ！’　０ と１ｇの硫酸アンモニウムと１ｇのリン酸カリウムと５ｇの酵母抽出物と１００ ｇのグルコーゼを含むＩＩｌの培地で、２４時間２８℃で前もって培養された。

酵素の固定化ニア００ｍ７！の反応容積に対し２１ｇのグルクザイム（アマノ） 　（Ｇｌｕｃｚｙｍｅ（Ａ＋ａａｎｏ）　）と１５０ｍ１の蒸溜水と１．４ｇの アルブミンが混合されて、３゜Ｑ　ｍ　ｌのアセトンを含む水浴中に沈澱させら れ、１０ｍ１の（２５％の、水に溶けた）グルグルアルデヒドと共に２時間２５ ℃で定温放置された０次いで３回水で洗われた。

発酵：固定化された酵素と細菌とが塔反応器（図面参照）中に移された。基質と しては、（グルコーゼの代わりに）　１０％のマルトデキストリンを含む上記の 培地中のマルトデキシトリンが用いられた。流速が０．２１４の場合、生成物流 中には４８　ｇ　／　ｊ！のエタノールと２．９ｇ／ｌのグルコーゼと１．８ｇ ／ｌのマルトデキシトリンとが得られた。

発酵の間、温度は３０℃に保たれ、（１モルの）苛性国際調査報告 □＾−””””ＰＣＴ／ＥＰ　８６１００５３９ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　Ｉ ｈＪＴＥＲＮＡＴｒＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡ ＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬ４ＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＥＰ　８６１００５ ３９　（ＳＡ　１４４９８１０発　明　者　ハルトマイヤー、つ“インフリー　 トド　セ ゛イツ連邦共和国、デー５１００　アーヘン、メラテナー　シュトラ−！１４５ 　アー

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．代謝可能でない炭水化物の酵素による加水分解及びとくにはエタノール，ブ タノール，アセトン，乳酸，グリセリン等への分解生成物の微生物による同時再 加工のための生命工学的連続方法において、 固定化された酵素が、類似の物理的特性を有する固定化された好ましくは小薄片 状の微生物と共に、塔反応器において用いられることを特徴とする方法。
2. ２．基質として、炭水化物を含有する異なる基質の混合物も投入されることを特 徴とする、請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．好ましくは少なくとも１４％の総糖濃度を有する、薄められた糖蜜と乳糖含 有シロップとから成る混合物が、基質として投入されることを特徴とする、請求 の範囲２に記載の方法。
4. ４．同時に様々な固定化された酵素が用いられることを特徴とする、請求の範囲 ２に記載の方法。
5. ５．同時に異なる固定化された、好ましくは小薄片状の微生物が用いられること を特徴とする、請求の範囲２に記載の方法。
6. ６．反応に、固定化されたサッカラーゼと固定化されたラクターゼとが添加され ることを特徴とする、請求の範囲１又は３に記載の方法。
7. ７．円筒体又は上部の開いた円錐体が反応器の内壁からわずかに離して挿入され た広げられた上端部を有する塔反応器において、反応が生じることを特徴とする 、請求の範囲１に記載の方法。
8. ８．乳酸の製造のために、乳酸菌を凝集タンパク質中にも含む（例えばケフィア 穀物（Ｋｅｆｉｒｋｏｅｎｅｒ）のような）混合コロニーの小薄片状菌株、又は 固定化された乳酸菌が用いられることを特徴とする、請求の範囲２に記載の方法 。
9. ９．多段処理手続きが実施可能であることを特徴とする、請求の範囲２に記載の 方法。
10. １０．好ましくは嫌気的又は微好気的に実施されることを特徴とする、請求の範 囲１に記載の方法。
11. １１．酵素小薄片の物理的特性が、溶解素に富んだタンパク質、好ましくはアル ブミンの添加によって制御されることを特徴とする、請求の範囲１に記載の方法 。