【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は新規なタイロシン誘導体に関する。
さらに詳しくは、本発明、式
（式中、Ｒは水素原子またはメチル基を示す）
で表わされるタイロシン誘導体またはその塩であ
る。
上記の塩としては医薬上許容できる塩である。
このような適当な塩としては、塩酸、硫酸、リ
ン酸などの無機酸との塩、酢酸、プロピオン酸、
酒石酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、アスパ
ラギン酸グルタミン酸などの有機酸との塩が包含
される。その他の非毒性塩も包含される。
上記の新規化合物〔１〕は既知抗生物質タイロ
シン（Tylosin）より約２‐４倍の強い抗菌力を
有しているばかりでなく、全マクロライド耐性
菌、例えばマクロライド耐性Ａ群菌（エリスロマ
イシン、オレアンドマイシン、16員環マクロライ
ド耐性患者分離株）に対しても強い抗菌力を有
し、臨床上優れた感染治療効果の期待される抗菌
剤である。また動物用治療剤、飼料添加剤として
も有用である。
本発明の目的化合物〔１〕は９位の水酸基の配
位により９（Ｒ）体、９（Ｓ）体および９（Ｒ）体
と９（Ｓ）体の混合物として存在する。これらの
抗菌スペクトラムは９（Ｒ）体が最も高い活性を
有するが、９（Ｓ）体および９（Ｒ）体と９（Ｓ）
体の混合物でも殆んど類似した活性を示す。
上記目的化合物〔１〕は式
（式中、Ｒは水素原子またはメチル基を示す）
で表わされる化合物を極性溶媒中NaBH4で還元
することにより得られる。
上記化合物〔２〕は新規化合物であつて、Ｒが
水素原子である化合物〔２〕は4′―デマイカロシ
ルタイロシンを不活性有機溶媒中加熱下
〔（C6H5）3P〕3RhClで脱ホルミル化することによ
り得られ（特願昭54−120269号）、Ｒがメチル基
である化合物〔２〕はタイロシンを7.5附近のPH
を有する含水メタノール中室温でNaBH4で還元
して20―ジヒドロタイロシンを得、次いでピリジ
ンの存在下ｐ―トルエンスルホニルハライドで20
位の水素基をトシル化し、NaI＋Znで還元的に脱
離して20―デオキソタイロシンを得、次いで
0.5N塩酸で室温下脱4′―マイカロシル化すること
により得られる（特願昭54−146642号）。
上記の還元反応は通常室温で行なわれる。反応
時間はシリカゲルなどの薄層クロマイトグラフイ
ーにより追跡できるので、出発物質〔２〕の消失
を待つて適宜反応を終了すればよい。反応溶媒と
しては低級アルカノール、例えばメタノール、エ
タノール、プロパノールあるいはジオキサンなど
の極性溶媒を用いるのが好ましい。
上記反応により得られる目的化合物〔１〕は通
常９（Ｒ）体と９（Ｓ）体の混合物として得られる
が、反応液から採取するには水性媒体の存在下、
PHを８〜10に調節し、非親水性有機溶媒、例えば
クロロホルム、酢酸エチルなどで抽出し、その抽
出液から溶媒を留去し、クロロホルム―メタノー
ル系の溶出溶媒を用いるシリカゲル、活性アルミ
ナ、吸着樹脂などのカラムクロマトグラフイーに
より分離精製することができる。この分離精製手
段により９（Ｒ）体と９（Ｓ）体を分別することが
できる。
また、本発明においては、Ｒがメチル基ある目
的化合物〔１〕を別法によつても製造することが
できる。即ち、4′―デマイカロシルタイロシンを
NaBH4で９位のカルボニル基をOH基に又19位
のCHO基をCH2OH基に還元し、この20位の水酸
基をトシル化し、次いでNaI＋Znでｐ―トルエン
スルホン酸エステルを還元的に脱離することによ
り得られる。
９位のカルボニル基のOH基への還元及び19位
CHO基のCH2OH基への還元はは、11.3附近のPH
を有する含水メタノール中室温でNaBH4を反応
させればよい。反応時間はシリカゲルなどの薄層
クロマトグラフイーにより追跡できるので、4′―
デマイカロシルタイロシンの消失を待つて適宜反
応を終了すればよい。得られた生成物は反応液を
非親水性有機溶媒、例えばクロロホルムで抽出す
ることにより採取され、特に精製することなく次
の反応に用いることができる。
19位CH2OH基をCH3基に変換するには、種々
の公知の方法によつて行なうことができる。例え
ばCH2OH基のOH基をトシル化し、次いでNaI
＋Znでｐ―トルエンスルホン酸エステルを還元
的に脱離する方法によつて行なうことができる。
上記のトシル化は脱酸剤および溶媒として第３
級有機アミン、例えばピリジンなどの存在下ｐ―
トルエンスルホニルハライドを反応させることに
より行なわれる。反応の経過はシリカゲルなどの
薄層クロマトグラフイーにより追跡できるので、
前記生成物、即ち９，20―テトラヒドロ体の消失
を待つて適宜反応を終了すればよい。反応液を水
中にあけ、PH８〜10に調節して適当な非親水性有
機溶媒、例えばクロロホルムで抽出することによ
り20位OH基がトシル化された生成物を採取する
ことができる。この生成物は、特に精製すること
なく、次の反応に用いることができる。次に、こ
のｐ―トルエンスルホン酸エステルを還元的に脱
離するのであるが、この反応は適当な有機溶媒、
例えばエチレングリコールジメチルエーテル中で
NaIとZnの存在下加熱することにより行なわれ
る。上記の反応は、先ずCH2O―トシル基が
CH2I基に変換し、これがZnにより還元されて
CH3に変換するものである。反応の経過はシリカ
ゲルなどの薄層クロマトグラフイーにより追跡で
きるので、20位OH基がトシル化された生成物の
消失を待つて適宜反応を終了すればよい。このよ
うにして得られた９―ジヒドロ―4′―デマイカロ
シルー20―デオキソタイロシンを反応液から採取
するには、Znを別した反応液を水中にあけPH
８〜10に調節し、非親水性有機溶媒、例えばクロ
ロホルムで抽出することにより行なわれる。
この９―ジヒドロ―4′―デマイカロシル―20―
デオキソタイロシンはほとんど９（Ｒ）体の形で
存在し、前記と同様の分離精製手段により精製す
ることができる。
次に、本発明の目的化合物〔１〕の微生物生育
最少阻止濃度（MIC）を測定した結果を第１表
の通り挙げる。
The present invention relates to novel tylosin derivatives. More specifically, the present invention, formula (In the formula, R represents a hydrogen atom or a methyl group.) This is a tylosin derivative or a salt thereof. The above salts are pharmaceutically acceptable salts. Such suitable salts include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, propionic acid,
Salts with organic acids such as tartaric acid, citric acid, succinic acid, malic acid, aspartic acid and glutamic acid are included. Other non-toxic salts are also included. The above novel compound [1] not only has antibacterial activity about 2-4 times stronger than the known antibiotic Tylosin, but also has antibacterial activity against all macrolide-resistant bacteria, such as macrolide-resistant group A bacteria (erythromycin, It has strong antibacterial activity against oleandomycin (patient isolates resistant to 16-membered ring macrolides), and is an antibacterial agent that is expected to have excellent clinical efficacy in treating infections. It is also useful as a therapeutic agent for animals and a feed additive. The object compound [1] of the present invention exists as a 9(R) form, a 9(S) form, and a mixture of a 9(R) form and a 9(S) form due to the coordination of the hydroxyl group at the 9-position. Regarding these antibacterial spectra, 9(R) form has the highest activity, but 9(S) form and 9(R) form and 9(S) form have the highest activity.
Mixtures of these substances show almost similar activity. The above target compound [1] has the formula (In the formula, R represents a hydrogen atom or a methyl group)
It is obtained by reducing the compound represented by with NaBH 4 in a polar solvent. The above compound [2] is a new compound, and the compound [2] in which R is a hydrogen atom is obtained by heating 4'-demycarosyltylosin in an inert organic solvent [(C 6 H 5 ) 3 P] 3 RhCl Compound [2], in which R is a methyl group, is obtained by deformylating tylosin with a pH of around 7.5 (Japanese Patent Application No. 120269/1983).
20-dihydrotaylosin was obtained by reduction with NaBH4 in aqueous methanol at room temperature, followed by reduction of 20-dihydrotaylosin with p-toluenesulfonyl halide in the presence of pyridine.
The hydrogen group at the position was tosylated and reductively eliminated with NaI + Zn to obtain 20-deoxotylocine, and then
It can be obtained by de-4'-mycarosylation with 0.5N hydrochloric acid at room temperature (Japanese Patent Application No. 146642/1982). The above reduction reaction is usually carried out at room temperature. Since the reaction time can be monitored by thin layer chromatography using silica gel or the like, the reaction can be appropriately terminated after waiting for the disappearance of the starting material [2]. As the reaction solvent, it is preferable to use a polar solvent such as a lower alkanol such as methanol, ethanol, propanol or dioxane. The target compound [1] obtained by the above reaction is usually obtained as a mixture of the 9(R) form and the 9(S) form, but in order to collect it from the reaction solution, in the presence of an aqueous medium,
Adjust the pH to 8 to 10, extract with a non-hydrophilic organic solvent such as chloroform or ethyl acetate, distill the solvent off from the extract, and use a chloroform-methanol elution solvent to silica gel, activated alumina, or adsorption. It can be separated and purified by column chromatography using resin or the like. This separation and purification means can separate the 9(R) form and the 9(S) form. In addition, in the present invention, the target compound [1] in which R is a methyl group can also be produced by another method. That is, 4′-demycarosyltylosin
The carbonyl group at position 9 is reduced to an OH group and the CHO group at position 19 is reduced to a CH 2 OH group with NaBH 4 , the hydroxyl group at position 20 is tosylated, and then the p-toluenesulfonic acid ester is reductively eliminated with NaI+Zn. Obtained by separating. Reduction of carbonyl group at position 9 to OH group and position 19
The reduction of the CHO group to the CH 2 OH group occurs at a pH around 11.3.
What is necessary is to react NaBH 4 at room temperature in aqueous methanol with . The reaction time can be tracked by thin layer chromatography such as silica gel, so 4′-
The reaction may be appropriately terminated after waiting for the disappearance of demycarosyltylosin. The obtained product is collected by extracting the reaction solution with a non-hydrophilic organic solvent, such as chloroform, and can be used in the next reaction without particular purification. The CH 2 OH group at position 19 can be converted to a CH 3 group by various known methods. For example, the OH group of CH 2 OH group is tosylated and then NaI
This can be carried out by a method in which p-toluenesulfonic acid ester is reductively eliminated using +Zn. The above tosylation can act as a tertiary deoxidizer and solvent.
In the presence of an organic amine such as pyridine, p-
It is carried out by reacting toluenesulfonyl halide. The progress of the reaction can be tracked using thin layer chromatography such as silica gel.
The reaction may be appropriately terminated after waiting for the disappearance of the product, ie, the 9,20-tetrahydro compound. A product in which the 20-OH group is tosylated can be collected by pouring the reaction solution into water, adjusting the pH to 8 to 10, and extracting with a suitable non-hydrophilic organic solvent, such as chloroform. This product can be used in the next reaction without particular purification. Next, this p-toluenesulfonic acid ester is reductively eliminated, and this reaction is carried out using an appropriate organic solvent,
For example in ethylene glycol dimethyl ether
This is done by heating in the presence of NaI and Zn. In the above reaction, first the CH 2 O-tosyl group is
CH 2 I group is converted into CH 2 I group, which is reduced by Zn.
It converts to CH3 . Since the progress of the reaction can be monitored by thin layer chromatography using silica gel or the like, the reaction can be appropriately terminated after waiting for the disappearance of the product in which the OH group at the 20-position is tosylated. To collect the 9-dihydro-4'-demycarosyl-20-deoxotylosin thus obtained from the reaction solution, pour the reaction solution from which Zn has been removed into water and PH
8 to 10 and extraction with a non-hydrophilic organic solvent such as chloroform. This 9-dihydro-4'-demycarosyl-20-
Deoxotylosin mostly exists in the form of the 9(R) form, and can be purified by the same separation and purification means as described above. Next, the results of measuring the minimum inhibitory concentration (MIC) of the target compound [1] of the present invention for microbial growth are shown in Table 1.
【表】
次に、実験例を挙げて本発明の製造例を具体的
に説明する。
尚、実施例中のRf値は、特記しない限り次の
担体および展開溶媒を用いる薄層クロマトグラフ
イー（TLC）により測定したものである。
担体；メルク社製シリカゲル60Art5721
展開溶媒；クロロホルム―メタノール―濃アン
モニア水（150：10：１）
実施例 １
19―デホルミル―９―ジヒドロ―4′―デマイカ
ロシルタイロシン
特願昭54−120269号記載の方法で製造した19―
デホルミル―4′―デマイカロシルタイロシン１ｇ
をメタノール20mlに溶かし、これにNaBH4168mg
を加え、室温で１時間反応させる。反応液に水50
mlを加え、クロロホルムで抽出する。クロロホル
ム層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、
減圧濃縮して粗生成物850mgを得る。これをでき
るだけ少量のクロロホルム―メタノール（15：
１）の混合溶媒に溶かし、シリカゲルのカラムに
チヤージし、クロロホルム―メータノール（15：
１）で溶出するカラムクロマトグラフイーにより
精製して、順次９（Ｒ）―19―デホルミル―９―
ジヒドロ―4′―デマイカロシルタイロシン180mg、
９（Ｓ）―19―デホルミル―９―ジヒドロ―4′―
デマイカロシルタイロシン143mgを得る。
９（Ｒ）体
Rf；0.28
UV；λEtOH nax235.5nm（εmax2.8×104）
Mass（ｍ／ｅ）；745（M+）、555（M+−190）、
537，365，347，191，190，174，173
NMR（100MHz，CDCl3中）；1.72（s.，12−
CH3）、2.48（s.，3′−Ｎ（CH3）2），3.50（s.，
２−OCH3）、3.61（s.，３−OCH3）、
5.67（d.d.10−Ｈ、J9,10＝７Hz，J10,11＝16
Hz，6.10（d.，11―Ｈ，J10,11＝16Hz）ppm
９（Ｓ）体
Rf；0.19
UV；λEtOH nax237.5nm（εmax2.6×104）Mass（ｍ／
ｅ）；745（M+）、555（M+−190）NMR
（100MHz，CDCl3中）；1.72（s.，12−
CH3）、2.48（s.，3′―Ｎ（CH3）2），3.50（s.，
２―OCH3）、3.61（s.，３−OCH3）、
5.95（d.d.，10−Ｈ，J9,10＝４Hz，J10,11＝16
Hz）、6.43（d.，11−Ｈ，J10,11＝16Hz）ppm
実施例 ２
９―ジヒドロ―4′―デマイカロシル―20―デオ
キソタイロシン
特願昭54−120269号に記載されている方法で製
造した4′―デマイカロシルタイロシン3.85ｇを
0.25MNa2HPO4水溶液（0.1NNaOHでPH11.3に
調節）とメタノールの混合溶媒（１：１）25mlに
溶かし、これにNaBH4756mgを加え、室温で１時
間反応させる。反応液に水100mlを加えクロロホ
ルム100mlで抽出し、クロロホルム層を水洗し、
無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧乾固して
９，20―テトラヒドロー4′―デマイカロシルタイ
ロシンの粗生成物3.6ｇを得る。
UV；λEtOH nax237nm（εmax2.5×104）
Mass（ｍ／ｅ）；775（M+）、757，585（M+−
190）
上記粗生成物をジクロロメタン38mlに溶かし、
これにピリジン1.2mlおよびトシルクロライド
2.35ｇを加え、室温で17時間反応させる。反応液
を濃アンモニア水で中和してからクロロホルム
150mlで抽出する。クロロホルム層を希塩酸、水、
希アンモニア水の順に洗浄し、無水硫酸マグネシ
ウムで乾燥後、減圧乾固する。得られた粗生成物
3.0ｇをエチレングリコールジメチルエーテル30
mlに溶かし、これにMaI2.25ｇおよびZn末1.95ｇ
順次加えて３時間加熱還流する。Zn末を別し、
反応液に水100mlを加えクロロホルム150mlで抽
出する。クロロホルム層を水洗し、無水硫酸マグ
ネシウムで乾燥後、減圧乾固する。残渣をベンゼ
ン150mlに溶かし、冷去却下1N塩酸150mlで２回
抽出し、水層を直ちに濃アンモニア水でPH９に調
節した後、クロロホルム150mlで抽出する。クロ
ロホルム層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾
燥後、減圧乾固して９（Ｒ）―９―ジヒドロ―
4′―デマイカロシル―20―デオキソタイロシンの
粗成物2.1ｇを得る。
これをクロロホルム―メタノール（15：１）で
溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフイーに
より精製し、精製品1.34ｇを得る。
Rf；０，32
UV；λEtOH nax237nm（εmax2.6×104）
Mass（ｍ／ｅ）；759（M+）、568（M+−191）、
550，422，406，378，377，361，346，
190，174
NMR（100MHz，CDCl3中）；1.72（12−CH3）、
2.50（3′―NCH3）2）、3.49（２―OCH3）、
3.62（３―OCH3）、5.67（d.d.，10―Ｈ，
J9,10＝７Hz，J10,11＝16Hz）、6.1（d.，11―
Ｈ，J10,11＝16Hz）
実施例 ３
９―ジヒドロ―4′―デマイカロシル―20―デオ
キソタイロシン
特願昭54−146642号に記載されている方法で製
造した4′―デマイカロシル―20―デオキソタイロ
シン100mgをメタノール２mlに溶かし、これに
NaBH417mgを加え、室温で１時間反応させる。
反応液に水10mlを加え、クロロホルム10mlで抽出
する。クロロホルム層を水洗し、無水硫酸マグネ
シウムで乾燥後、減圧乾固して目的物の粗生成物
80mgを得る。これをクロロホルム―メタノール
（15：１）で溶出するシリカゲルカラムクロマト
グラフイーにより精製し、９（Ｒ）―９―ジヒド
ロ―4′―デマイカロシル―20―デオキソタイロシ
ン（Rf＝0.32）15mgおよび９（Ｓ）−９―ジヒドロ
―4′―デマイカロシル―20―デオキソタイロシン
（Rf＝0.19）12mgを得る。[Table] Next, production examples of the present invention will be specifically explained with reference to experimental examples. The Rf values in the examples were measured by thin layer chromatography (TLC) using the following carrier and developing solvent, unless otherwise specified. Support: Silica gel 60Art5721 manufactured by Merck & Co., Ltd. Developing solvent: Chloroform-methanol-concentrated aqueous ammonia (150:10:1) Example 1 19-Deformyl-9-dihydro-4'-demycarosyltylosin Described in Japanese Patent Application No. 120269/1982 19 produced by the method of
Deformyl-4′-demycarosyltylosin 1g
Dissolve in 20ml of methanol and add 168mg of NaBH 4 to this.
and react at room temperature for 1 hour. 50% water to reaction solution
ml and extracted with chloroform. After washing the chloroform layer with water and drying with anhydrous magnesium sulfate,
Concentrate under reduced pressure to obtain 850 mg of crude product. Mix this with as little chloroform-methanol (15:
Dissolve in the mixed solvent of 1), charge it to a silica gel column, and add chloroform-methanol (15:
1) was purified by column chromatography eluting with 9(R)-19-deformyl-9-
Dihydro-4′-demycarosyltylosin 180mg,
9(S)-19-deformyl-9-dihydro-4'-
Obtain 143mg of demycarosyltylosin. 9(R) body Rf; 0.28 UV; λ EtOH nax 235.5 nm (εmax2.8×10 4 ) Mass (m/e); 745 (M + ), 555 (M + −190),
537, 365, 347, 191, 190, 174, 173 NMR (100MHz, in CDCl 3 ); 1.72 (s., 12−
CH 3 ), 2.48 (s., 3'-N(CH 3 ) 2 ), 3.50 (s.,
2-OCH 3 ), 3.61 (s., 3-OCH 3 ),
5.67 (dd10−H, J 9,10 = 7Hz, J 10,11 = 16
Hz, 6.10 (d., 11-H, J 10,11 = 16Hz) ppm 9(S) body Rf; 0.19 UV; λ EtOH nax 237.5nm (εmax2.6×10 4 ) Mass (m/
e); 745 (M + ), 555 (M + −190) NMR
(100MHz, in CDCl 3 ); 1.72 (s., 12−
CH 3 ), 2.48 (s., 3'-N(CH 3 ) 2 ), 3.50 (s.,
2-OCH 3 ), 3.61 (s., 3-OCH 3 ),
5.95 (dd, 10-H, J 9,10 = 4Hz, J 10,11 = 16
Hz), 6.43 (d., 11-H, J 10,11 = 16 Hz) ppm Example 2 9-dihydro-4'-demycarosyl-20-deoxotylosin Method described in Japanese Patent Application No. 120269/1983 3.85g of 4′-demycarosyltylosin produced in
Dissolve in 25 ml of a mixed solvent (1:1) of 0.25 M Na 2 HPO 4 aqueous solution (adjusted to PH 11.3 with 0.1 N NaOH) and methanol, add 756 mg of NaBH 4 and react for 1 hour at room temperature. Add 100ml of water to the reaction solution, extract with 100ml of chloroform, wash the chloroform layer with water,
After drying over anhydrous magnesium sulfate, the mixture was dried under reduced pressure to obtain 3.6 g of a crude product of 9,20-tetrahydro-4'-demycarosyltylosin. UV; λ EtOH nax 237 nm (εmax2.5×10 4 ) Mass (m/e); 775 (M + ), 757, 585 (M + −
190) Dissolve the above crude product in 38 ml of dichloromethane,
Add 1.2ml of pyridine and tosyl chloride to this.
Add 2.35g and react at room temperature for 17 hours. Neutralize the reaction solution with concentrated aqueous ammonia and then add chloroform.
Extract with 150ml. Dilute the chloroform layer with dilute hydrochloric acid, water,
Wash with dilute ammonia water, dry over anhydrous magnesium sulfate, and dry under reduced pressure. Crude product obtained
3.0g ethylene glycol dimethyl ether 30
ml and add 2.25 g of MaI and 1.95 g of Zn powder to this.
Add the mixture one by one and heat under reflux for 3 hours. Separate the Zn end,
Add 100 ml of water to the reaction solution and extract with 150 ml of chloroform. The chloroform layer is washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, and then dried under reduced pressure. The residue was dissolved in 150 ml of benzene, extracted twice with 150 ml of 1N hydrochloric acid under cooling, and the aqueous layer was immediately adjusted to pH 9 with concentrated aqueous ammonia, and then extracted with 150 ml of chloroform. The chloroform layer was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, and dried under reduced pressure to give 9(R)-9-dihydro-
2.1 g of a crude product of 4'-demycarosyl-20-deoxotylosin was obtained. This was purified by silica gel column chromatography eluting with chloroform-methanol (15:1) to obtain 1.34 g of purified product. Rf; 0,32 UV; λ EtOH nax 237 nm (εmax2.6×10 4 ) Mass (m/e); 759 (M + ), 568 (M + −191),
550, 422, 406, 378, 377, 361, 346,
190, 174 NMR (100MHz, in CDCl 3 ); 1.72 (12−CH 3 ),
2.50 (3′-NCH 3 ) 2 ), 3.49 (2-OCH 3 ),
3.62 (3-OCH 3 ), 5.67 (dd, 10-H,
J 9,10 = 7Hz, J 10,11 = 16Hz), 6.1 (d., 11―
H, J 10,11 = 16Hz) Example 3 9-dihydro-4'-demycarosyl-20-deoxotylosin 4'-demycarosyl-20-deoxotylosin produced by the method described in Japanese Patent Application No. 146642/1983 Dissolve 100 mg of oxotylosin in 2 ml of methanol and add
Add 17 mg of NaBH 4 and react for 1 hour at room temperature.
Add 10 ml of water to the reaction solution and extract with 10 ml of chloroform. The chloroform layer was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, and dried under reduced pressure to obtain the desired crude product.
Get 80mg. This was purified by silica gel column chromatography eluting with chloroform-methanol (15:1), and 15 mg of 9(R)-9-dihydro-4'-demycarosyl-20-deoxotylosin (Rf = 0.32) and 9( 12 mg of S)-9-dihydro-4'-demycarosyl-20-deoxotylosin (Rf=0.19) is obtained.