JPS6339582A - 酵素組成物 - Google Patents
酵素組成物Info
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- JPS6339582A JPS6339582A JP61181934A JP18193486A JPS6339582A JP S6339582 A JPS6339582 A JP S6339582A JP 61181934 A JP61181934 A JP 61181934A JP 18193486 A JP18193486 A JP 18193486A JP S6339582 A JPS6339582 A JP S6339582A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、遺伝子工学において使用される酵素の組成物
に関し、更に詳細にはＩ）ＨＡ塩基配列分析において使
用される一連の酵素群の組成物に関する。
に関し、更に詳細にはＩ）ＨＡ塩基配列分析において使
用される一連の酵素群の組成物に関する。
近年、特定の遺伝子の構造と機能を解析する目的から、
特定遺伝子の塩基配列を特定の酵素反応を利用して分析
する手法（以下、ジデオキシ法と呼称する）が開発され
た。
特定遺伝子の塩基配列を特定の酵素反応を利用して分析
する手法（以下、ジデオキシ法と呼称する）が開発され
た。
ジデオキシ法は、種々の手法により精製された一本鎖Ｄ
ＮＡに特定の配列を有するプライマーを融合させ、ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を有する酵素群より選択されたー酵
素を用いてＭム合成を行わせる手法であシ、酵素反応の
際に基質となる４種類のデオキシ５リン酸のほかに、特
定の一種と類似の阻害物であるジデオキシ５１７ン酸を
含む４連（又はＳ連）の反応を同時に行わせることを特
徴とする。本手法により合成されたＤＮＡは、上記阻害
物が取込まれた時に反応が終了するため、それぞれの特
定の塩基について反応停止した限定された鎖長の合成り
ＮＡ鎖を変性処理後、ポリアクリルアミド変性ゲルを用
いて電気泳動し、それぞれの限定鎖長のＤＮＡを分離、
検出し、その長さを比較することで塩基配列を決定する
ことができる。
ＮＡに特定の配列を有するプライマーを融合させ、ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を有する酵素群より選択されたー酵
素を用いてＭム合成を行わせる手法であシ、酵素反応の
際に基質となる４種類のデオキシ５リン酸のほかに、特
定の一種と類似の阻害物であるジデオキシ５１７ン酸を
含む４連（又はＳ連）の反応を同時に行わせることを特
徴とする。本手法により合成されたＤＮＡは、上記阻害
物が取込まれた時に反応が終了するため、それぞれの特
定の塩基について反応停止した限定された鎖長の合成り
ＮＡ鎖を変性処理後、ポリアクリルアミド変性ゲルを用
いて電気泳動し、それぞれの限定鎖長のＤＮＡを分離、
検出し、その長さを比較することで塩基配列を決定する
ことができる。
上記ジデオキシ法に使用されるＤＮＡポリメラーゼ活性
を有する酵素は、活性の安定化と溶液状態で保存するこ
とが用法上好ましい関係から、５０〜６５チグリセロー
ルを含む組成物として一２０℃で保存、販売されていた
。
を有する酵素は、活性の安定化と溶液状態で保存するこ
とが用法上好ましい関係から、５０〜６５チグリセロー
ルを含む組成物として一２０℃で保存、販売されていた
。
上記したジデオキシ法により塩基配列の決定を行う際に
、従来使用しているＤＮＡポリメラーゼ酵素組成物を用
いると、塩基数約３５０以上の電気泳動像に屈曲が生じ
、この領域の配列分析が不可能となるという欠点があっ
た。
、従来使用しているＤＮＡポリメラーゼ酵素組成物を用
いると、塩基数約３５０以上の電気泳動像に屈曲が生じ
、この領域の配列分析が不可能となるという欠点があっ
た。
本発明の目的は、前記した欠点のない酵素組成物を提供
することにある。
することにある。
本発明を概説すれば、本発明は酵素組成物に関する発明
であって、ゲル電気泳動法を用いるＤＮＡ塩基配列分析
に使用される酵素と、２価アルコールとを含有すること
を特徴とする。
であって、ゲル電気泳動法を用いるＤＮＡ塩基配列分析
に使用される酵素と、２価アルコールとを含有すること
を特徴とする。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明において使用される酵素はゲル電気泳動法を用い
るＤＮＡ塩基配列分析に使用される酵素であれば何ら限
定はな（、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する大腸菌Ｄｌ
ｉＡポリメラーゼ１１クレノウ酵素〔プロシーディング
オブ ナショナル アカデミ−オプ サイエンス オ
ブ ザＵＥ？Ａ （Ｐｒｏ、 ＮａｔＬムｃａｄ、 Ｅ
ｌｃｉ、 ＵＳＡ ）第８０巻第１８３０〜１８３４頁
（１９８５））及び逆転写酵素等が挙げられる。
るＤＮＡ塩基配列分析に使用される酵素であれば何ら限
定はな（、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する大腸菌Ｄｌ
ｉＡポリメラーゼ１１クレノウ酵素〔プロシーディング
オブ ナショナル アカデミ−オプ サイエンス オ
ブ ザＵＥ？Ａ （Ｐｒｏ、 ＮａｔＬムｃａｄ、 Ｅ
ｌｃｉ、 ＵＳＡ ）第８０巻第１８３０〜１８３４頁
（１９８５））及び逆転写酵素等が挙げられる。
本発明におけるゲル電気泳動法に使用されるゲルの例と
してはポリアクリルアミド、アガロース及びそれらの変
性ゲルが挙げられる。
してはポリアクリルアミド、アガロース及びそれらの変
性ゲルが挙げられる。
また本発明において使用される２価アルコールの例とし
てはアルキレングリコール及びポリアルキレングリコー
ルが挙げられ、その具体的な例にはエチレングリコール
、ジエチレングリコール、プロピレングリコール等があ
る。これら２価アルコールは単独又は２種類以上？同時
に使用してもよい。
てはアルキレングリコール及びポリアルキレングリコー
ルが挙げられ、その具体的な例にはエチレングリコール
、ジエチレングリコール、プロピレングリコール等があ
る。これら２価アルコールは単独又は２種類以上？同時
に使用してもよい。
これら２価アルコールの酵素組成物中における濃度は特
に限定はないが、通常３０％〜７５チ（Ｖ／’Ｖ）の範
囲で、好ましくは４０チ〜６０条（ｖ／ｖ）で使用され
る。
に限定はないが、通常３０％〜７５チ（Ｖ／’Ｖ）の範
囲で、好ましくは４０チ〜６０条（ｖ／ｖ）で使用され
る。
また、一般に酵素の安定保存のためには各々に特定の緩
衝液や塩類、糖、還元剤、界面活性剤等の共存が不可欠
で１、本発明の安定化酵素組成物にもそれぞれの酵素に
適当な添加物が含まれていてよく、フレノウ酵素を例に
とると通常５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ＆５．
１０ｍＭβ−メルカプトエタノールが使用される。
衝液や塩類、糖、還元剤、界面活性剤等の共存が不可欠
で１、本発明の安定化酵素組成物にもそれぞれの酵素に
適当な添加物が含まれていてよく、フレノウ酵素を例に
とると通常５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ＆５．
１０ｍＭβ−メルカプトエタノールが使用される。
以下実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されない。
発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１
フレノウ酵素〔全酒造＠製］ ２ Ｕ／ｐｔｚエチレン
グリ−ｙ−ルｓ ｏ ％ （ｖ／ｖ）、１０ｍＭβ−メ
ルカプト・エタノールを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝−１（ｐＨ６，５）よりなる酵素組成物を調製した。
グリ−ｙ−ルｓ ｏ ％ （ｖ／ｖ）、１０ｍＭβ−メ
ルカプト・エタノールを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝−１（ｐＨ６，５）よりなる酵素組成物を調製した。
同時に上記エチレングリコールに替えてグリセロール５
０ ％ （ｖ／ｖ）を含む酵素組成物を調製した。
０ ％ （ｖ／ｖ）を含む酵素組成物を調製した。
両酵素組成物を一２０℃で１か月間保存し、安定性を検
討した。その結果を第１表に示す。
討した。その結果を第１表に示す。
溶液調製直後の活性を１００％とした。
第 １ 表
いずれの組成物も約１か月間の保存で活性の低下は認め
られなかった。なお、エチレングリコールの替すにジエ
チレングリコール、プロピレングリコールを使用した場
合にも同様の結果を示した。
られなかった。なお、エチレングリコールの替すにジエ
チレングリコール、プロピレングリコールを使用した場
合にも同様の結果を示した。
実施例２
逆転写酵素〔全酒造■製） ２０ Ｕ／μ１１プロピレ
ンクリコール５０％（ｖ／ｖ） 、２ｍＭジチオスレイ
トール、ノニデットＰ−４０（半井化学薬品■販売）
ａ、２％ （ｖ／’ｖ）を含む２００ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，２）よシなる酵素組成物を調製した
。実施例１と同様に安定性を検討した結果、約１か月間
の保存で活性の低下は認められなかった。
ンクリコール５０％（ｖ／ｖ） 、２ｍＭジチオスレイ
トール、ノニデットＰ−４０（半井化学薬品■販売）
ａ、２％ （ｖ／’ｖ）を含む２００ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，２）よシなる酵素組成物を調製した
。実施例１と同様に安定性を検討した結果、約１か月間
の保存で活性の低下は認められなかった。
実施例５
実’Ｘｆ４例１にて調製したフレノウ酵床組成物を用い
てジデオキシ法による塩基配列分析を行った。
てジデオキシ法による塩基配列分析を行った。
ジデオキシ法は、宝酒＠■のＭ１５シーケンスキットの
手法に従った。また、別に〔α−Ｐ〕デオキシシチジン
３リン酸（以下、〔α−ＦｅｄＣＴＰと略記する、アマ
−ジャム社製、約４０００１／ｍｍ Ｑ １．１ｏ ｍ
Ｃ！ｉ／ｍ ） 、及び反応停止後（９５チ脱塩したホ
ルムアミド、α１チキシレンシアノール、Ｉ］、１チフ
ロムフエノールブルーヲ含ム）を準備した。
手法に従った。また、別に〔α−Ｐ〕デオキシシチジン
３リン酸（以下、〔α−ＦｅｄＣＴＰと略記する、アマ
−ジャム社製、約４０００１／ｍｍ Ｑ １．１ｏ ｍ
Ｃ！ｉ／ｍ ） 、及び反応停止後（９５チ脱塩したホ
ルムアミド、α１チキシレンシアノール、Ｉ］、１チフ
ロムフエノールブルーヲ含ム）を準備した。
酵素反応前に基質となるＤＮＡの調製を行った。
Ｍ１５一本領ファージＤＮＡ ｓ ｐｚ （ｏ、 ｓ
ｐｍｏｌ）、ブライマー１μ！１１０倍濃縮緩衝液１．
５μｌを混和し、蒸留水を加えて全量１２μｌとした。
ｐｍｏｌ）、ブライマー１μ！１１０倍濃縮緩衝液１．
５μｌを混和し、蒸留水を加えて全量１２μｌとした。
混合液を６０℃の恒温槽にて２０分加熱し、Ｉ）ＮＡと
プライマーを融和させた。次いで〔α−Ｐ）（１０ＴＰ
２μｌとエチレングリコールによシ安定化されたフレノ
ウ酵素１μ／（２１１Ｔ）を注意深く混和し、直ちにあ
らかじめ２μｌずつ分注しておいた各々のデオキシ３リ
ン酸・ジデオキシ３リン酸混合液４種に五５ｐｔずつ分
注、混、１口し、２５℃で２０分間反応させた。更にチ
エイス混合液１μｌ を添加し、２０分間反応後、反応
停止液６μ−を添加、９５℃３分間加熱して生成りＮＡ
を変性させた。合成された特定鎖長のＤＮＡ Ｍ液４μ
ｌ は７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミド変性ケル
（８９ｍＭ トリス・ヒドロキシメチルアミンメタン、
８９ｍＭホウ酸、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸緩衝
液（ｐＥＩａ３）’＆含む〕に重層し、上記緩衝液中に
て４０〜５０ Ｖ ／ ｃｍの電圧で４時間泳動した。
プライマーを融和させた。次いで〔α−Ｐ）（１０ＴＰ
２μｌとエチレングリコールによシ安定化されたフレノ
ウ酵素１μ／（２１１Ｔ）を注意深く混和し、直ちにあ
らかじめ２μｌずつ分注しておいた各々のデオキシ３リ
ン酸・ジデオキシ３リン酸混合液４種に五５ｐｔずつ分
注、混、１口し、２５℃で２０分間反応させた。更にチ
エイス混合液１μｌ を添加し、２０分間反応後、反応
停止液６μ−を添加、９５℃３分間加熱して生成りＮＡ
を変性させた。合成された特定鎖長のＤＮＡ Ｍ液４μ
ｌ は７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミド変性ケル
（８９ｍＭ トリス・ヒドロキシメチルアミンメタン、
８９ｍＭホウ酸、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸緩衝
液（ｐＥＩａ３）’＆含む〕に重層し、上記緩衝液中に
て４０〜５０ Ｖ ／ ｃｍの電圧で４時間泳動した。
泳動終了後、ゲルは脱気加熱によって乾燥させ、−７０
℃で１５時間Ｘ線フィルムに感光させ、常法にて現像し
、ＤＮＡ配列図を得た。
℃で１５時間Ｘ線フィルムに感光させ、常法にて現像し
、ＤＮＡ配列図を得た。
グリセロール含有フレノウ酵素を用いた泳動図では塩基
数４００付近から屈曲が認められ、分析が不可能になる
のに対してエチレングリコール含有フレノウ酵素を用い
た泳動図にはこうした障害は認められず、塩基数５００
付近まで鮮明な配列図が得られた。
数４００付近から屈曲が認められ、分析が不可能になる
のに対してエチレングリコール含有フレノウ酵素を用い
た泳動図にはこうした障害は認められず、塩基数５００
付近まで鮮明な配列図が得られた。
ナオジエチレングリコール、プロピレングリコール含有
フレノウ酵素を用いた場合においても、エチレングリコ
ール含有フレノウ酵素の場合と同様の泳動図が得られた
。
フレノウ酵素を用いた場合においても、エチレングリコ
ール含有フレノウ酵素の場合と同様の泳動図が得られた
。
以上詳細に説明したように、本発明の酵素組成物を用い
ることにより塩基数約５５０以上の塩基配列の解析が可
能となった。
ることにより塩基数約５５０以上の塩基配列の解析が可
能となった。
Claims (1)
- １、ゲル電気泳動法を用いるＤＮＡ塩基配列分析に使用
される酵素と、２価アルコールとを含有することを特徴
とする酵素組成物。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61181934A JPS6339582A (ja) | 1986-08-04 | 1986-08-04 | 酵素組成物 |
| US07/072,843 US4868115A (en) | 1986-08-04 | 1987-07-09 | Enzyme composition |
| GB8717145A GB2193500B (en) | 1986-08-04 | 1987-07-21 | Method for dna base sequencing |
| DE3725696A DE3725696A1 (de) | 1986-08-04 | 1987-08-03 | Enzymzubereitung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61181934A JPS6339582A (ja) | 1986-08-04 | 1986-08-04 | 酵素組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6339582A true JPS6339582A (ja) | 1988-02-20 |
| JPH0430280B2 JPH0430280B2 (ja) | 1992-05-21 |
Family
ID=16109448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61181934A Granted JPS6339582A (ja) | 1986-08-04 | 1986-08-04 | 酵素組成物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
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