【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は一般式〔〕
（式中、R1およびR2は水素原子またはアセチ
ル基を表わす。ただし、R1が水素原子の場合は
R2はアセチル基、R2が水素原子の場合はR1はア
セチル基とする。）で表わされるテトロカルシン
類（以下、R1が水素原子でR2がアセチル基の化
合物をテトロカルシンＥ―１，R1がアセチル基
でR2が水素原子の化合物をテトロカルシンＥ―
２とする。）およびその塩およびテトロカルシン
Ｅ―１およびＥ―２の製造法に関する。
本発明者らは有用な抗生物質を見い出す目的で
天然界より数多くの微生物を入手して抗生物質の
生産について研究した。その結果宮城県仙台市内
の土壌から分離した菌株（KY11091と称する）
を培地に培養すると培養物中に新規な抗生物質
DC―11，DC―11―Ａ―２，DC―11―Ａ―３，
DC―11―Ｂなどが生産されることを見い出した。
これらはいずれもその物理化学的物質から極めて
類似した構造式を有する化合物と考えられ、後に
本発明者らによつてテトロカルシン類と総称する
こととにした。DC―11，DC―11―Ａ―２，DC
―11―Ａ―３，DC―11―Ｂはそれぞれテトロカ
ルシンＡ，テトロカルシンＢ，テトロカルシン
Ｃ，テトロカルシンＤと命名されている。DC―
11に関してはすでに同一出願人により特願昭53−
45916（特開昭54−138501）および特願昭53−
153027（特開昭53−79322）に開示されている。
DC―11―Ａ―２，DC―11―Ａ―３，DC―11―
Ｂについても同一出願人による特願昭55−17498，
55−24924（特開昭56−115794，56−122392、以上
２件DC―11―Ａ―２），54−152253，55−24925
（特開昭56−75500，56−122393、以上２件DC―
11―Ａ―３），55―24926（特開昭56−122394、DC
―11―Ｂ）に記載されている。またさらにテトロ
ノライド類については特願昭55−80482（特開昭57
−7479）に記載されている。
上記においてテトロカルシンＡおよびＢについ
てはその後次の化学構造を有することが明らかに
なつた。
本発明者らはさらに研究を重ねた結果、上記菌
株培養物中に既出願に記載された物質とは異る新
規物質テトロカルシンＥ―１およびテトロカルシ
ンＥ―２を見い出しこれらを単離した。またテト
ロカルシンＥ―１およびテトロカルシンＥ―２は
テトロカルシンＡ，テトロカルシンＢ，テトロカ
ルシンＤの単独または混合物を化学的に分解して
も得られることを見い出した。このようにして得
られたテトロカルシンＥ―１およびテトロカルシ
ンＥ―２は抗菌作用を示す。またそれらの構造か
ら明らかなように既出願のテトロノライド類やテ
トロカルシン類およびそれらの誘導体製造の原料
として利用できる。
さらにそれ自身も抗腫瘍性を示すことが期待で
きる。
これらの化合物の具体的な理化学的性質は次の
通りである。
(1) テトロカルシンＥ―１
融点：207〜210℃
元素分析値
計算値：Ｃ：61.6％ Ｈ：7.0％ Ｎ：2.9％
実測値：Ｃ：61.3％ Ｈ：6.9％ Ｎ：3.0％
（C49H66N2O17として計算）
赤外部吸収スペクトル（KBr錠剤法）：第１
図
PMRスペクトル（CDCl3中、TMS基準）：
第２図
CMRスペクトルδ（ppm）（CDCl3中、TMS
基準）
206.1，201.3，192.4，170.4，166.5，
157.3，149.4，141.3，136.3，135.7，
126.6，125.5，123.3，118.3，100.9，
99.7，96.4，91.5，85.6，83.9，77.8，
75.1，69.4，69.2，65.5，62.1，54.1，
53.7，52.8，51.2，44.8，43.4，41.7，
38.4，35.9，35.3，34.2，31.1，30.7，
29.7，25.3，21.9，21.1，17.5，16.9，
16.1，15.0，14.4，14.3
比旋光度〔α〕28 D＝−31.6゜（ｃ，1.0，アセト
ン）
(2) テトロカルシンＥ―２
融点：205〜208℃
元素分析
計算値：Ｃ：61.6％ Ｈ：7.0％ Ｎ：2.9％
実測値：Ｃ：61.4％ Ｈ：7.1％ Ｎ：2.9％
（C49H66N2O17として計算）
赤外部吸収スペクトル（KBr錠剤法）：第３
図
PMRスペクトル（CDCl3中、TMS基準）：
第４図
CMRスペクトルδ（ppm）（CDCl3中，TMS
基準）
206.2，201.4，192.4，171.3，166.5，
157.3，149.5，141.2，136.2，136.0，
126.1，125.8，123.0，118.2，100.8，
97.7，96.4，91.5，83.9，83.8，77.7，
71.6，69.7，69.3（２本），64.6，54.2，
53.7，52.7，51.2，44.8，43.2，41.5，
38.4，35.9，34.4，33.1，31.1，30.6，
29.7，25.3，21.9，21.4，17.6，16.9，
16.0，15.0，14.3，13.9
比旋光度〔α〕28 D＝−27.4゜（ｃ，1.0，アセト
ン）
次にテトロカルシンＥ―１，テトロカルシンＥ
―２の薄層でクロマトグラフイーにおける挙動を
第１表に示す。
第１表
シリカゲルプレート（商品名DC―
Fertigplatteu Kieselgel 60F254，E.Merck）を
用いたとき。
展開剤：クロロホルム：メタノール＝９：１
（容量比）
物 質 Rf値
テトロカルシンＡ 0.57
〃 Ｂ 0.52
〃 Ｃ 0.56
〃 Ｄ 0.53
〃 Ｅ―１ 0.77
〃 Ｅ―２ 0.65
展開剤：トルエン：アセトン＝35：65（容量
比）
物 質 Rf値
テトロカルシンＡ 0.55
テトロカルシンＥ―１ 0.64
テトロカルシンＥ―２ 0.60
展開剤：酢酸エチル：酢酸＝20：１（容量比）
物 質 Rf値
テトロカルシンＡ 0.42
テトロカルシンＥ―１ 0.67
テトロカルシンＥ―２ 0.62
次にテトロカルシンＥ―１，テトロカルシンＥ
―２の各種微生物に対する抗菌活性（PH7.0の培
地使用）を第２表に示す。
The present invention is based on the general formula [] (In the formula, R 1 and R 2 represent a hydrogen atom or an acetyl group. However, if R 1 is a hydrogen atom,
R 2 is an acetyl group, and when R 2 is a hydrogen atom, R 1 is an acetyl group. ) (Hereinafter, compounds in which R 1 is a hydrogen atom and R 2 is an acetyl group are referred to as tetrocalcin E-1, and compounds in which R 1 is an acetyl group and R 2 is a hydrogen atom are referred to as tetrocalcin E-1.
Set it to 2. ) and its salt, and a method for producing tetrocalcin E-1 and E-2. In order to find useful antibiotics, the present inventors obtained a large number of microorganisms from the natural world and conducted research on the production of antibiotics. As a result, a bacterial strain (referred to as KY11091) was isolated from soil in Sendai City, Miyagi Prefecture.
When cultured in a culture medium, a novel antibiotic appears in the culture.
DC-11, DC-11-A-2, DC-11-A-3,
It was discovered that models such as DC-11-B were produced.
All of these are considered to be compounds having extremely similar structural formulas based on their physicochemical substances, and the present inventors later decided to collectively refer to them as tetrocalcins. DC-11, DC-11-A-2, DC
-11-A-3 and DC-11-B are named tetrocalcin A, tetrocalcin B, tetrocalcin C, and tetrocalcin D, respectively. DC―
Regarding No. 11, the same applicant has already filed a patent application in 1983-
45916 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 138501) and patent application No. 1385-
153027 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 53-79322).
DC-11-A-2, DC-11-A-3, DC-11-
Regarding B, a patent application filed in 17498, filed by the same applicant,
55-24924 (JP 56-115794, 56-122392, above two DC-11-A-2), 54-152253, 55-24925
(Japanese Patent Publication No. 56-75500, 56-122393, above two DC-
11-A-3), 55-24926 (Unexamined Japanese Patent Publication No. 56-122394, DC
-11-B). Furthermore, regarding tetronolides, Japanese Patent Application No. 55-80482
-7479). In the above, it was later revealed that tetrocalcins A and B have the following chemical structures. As a result of further research, the present inventors discovered and isolated new substances tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-2, which are different from the substances described in the previous application, in the above-mentioned bacterial strain culture. It has also been found that tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-2 can be obtained by chemically decomposing tetrocalcin A, tetrocalcin B, and tetrocalcin D, either alone or as a mixture. Tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-2 thus obtained exhibit antibacterial activity. Furthermore, as is clear from their structures, they can be used as raw materials for the production of tetronolides and tetrocalcins and their derivatives, which have already been filed. Furthermore, it can be expected that it itself exhibits antitumor properties. The specific physical and chemical properties of these compounds are as follows. (1) Tetrocalcin E-1 Melting point: 207-210℃ Elemental analysis value Calculated value: C: 61.6% H: 7.0% N: 2.9% Actual value: C: 61.3% H: 6.9% N: 3.0% (C 49 H 66 N 2 O 17 ) Infrared absorption spectrum (KBr tablet method): 1st
Figure PMR spectrum (in CDCl 3 , TMS reference):
Figure 2 CMR spectrum δ (ppm) (in CDCl 3 , TMS
Standard) 206.1, 201.3, 192.4, 170.4, 166.5,
157.3, 149.4, 141.3, 136.3, 135.7,
126.6, 125.5, 123.3, 118.3, 100.9,
99.7, 96.4, 91.5, 85.6, 83.9, 77.8,
75.1, 69.4, 69.2, 65.5, 62.1, 54.1,
53.7, 52.8, 51.2, 44.8, 43.4, 41.7,
38.4, 35.9, 35.3, 34.2, 31.1, 30.7,
29.7, 25.3, 21.9, 21.1, 17.5, 16.9,
16.1, 15.0, 14.4, 14.3 Specific optical rotation [α] 28 D = -31.6° (c, 1.0, acetone) (2) Tetrocalcin E-2 Melting point: 205-208℃ Elemental analysis Calculated value: C: 61.6% H: 7.0% N: 2.9% Actual value: C: 61.4% H: 7.1% N: 2.9% (calculated as C 49 H 66 N 2 O 17 ) Infrared absorption spectrum (KBr tablet method): 3rd
Figure PMR spectrum (in CDCl 3 , TMS reference):
Figure 4 CMR spectrum δ (ppm) (in CDCl 3 , TMS
Standard) 206.2, 201.4, 192.4, 171.3, 166.5,
157.3, 149.5, 141.2, 136.2, 136.0,
126.1, 125.8, 123.0, 118.2, 100.8,
97.7, 96.4, 91.5, 83.9, 83.8, 77.7,
71.6, 69.7, 69.3 (2 pieces), 64.6, 54.2,
53.7, 52.7, 51.2, 44.8, 43.2, 41.5,
38.4, 35.9, 34.4, 33.1, 31.1, 30.6,
29.7, 25.3, 21.9, 21.4, 17.6, 16.9,
16.0, 15.0, 14.3, 13.9 Specific optical rotation [α] 28 D = -27.4° (c, 1.0, acetone) Next, tetrocalcin E-1, tetrocalcin E
Table 1 shows the behavior in chromatography of a thin layer of -2. Table 1 Silica gel plate (product name DC-
Fertigplatteu Kieselgel 60F 254 , E. Merck). Developer: Chloroform:methanol = 9:1
(Volume ratio) Substance Rf value Tetrocalcin A 0.57 〃 B 0.52 〃 C 0.56 〃 D 0.53 〃 E-1 0.77 〃 E-2 0.65 Developer: Toluene: Acetone = 35:65 (Volume ratio) Substance Rf value Tetrocalcin A 0.55 Tetrocalcin E-1 0.64 Tetrocalcin E-2 0.60 Developer: Ethyl acetate:acetic acid = 20:1 (volume ratio) Substance Rf value Tetrocalcin A 0.42 Tetrocalcin E-1 0.67 Tetrocalcin E-2 0.62 Next, Tetrocalcin E-1, Tetrocalcin E
Table 2 shows the antibacterial activity of -2 against various microorganisms (using a pH7.0 medium).
【表】
サ
ATCC 9992
上記の理化学的性質等よりテトロカルシンＥ―
１とＥ―２とを区別することができるのみなら
ず、これらと他のテトロカルシン類とを区別する
こともできる。
次に本発明のテトロカルシン類の製造法につい
て述べる。
テトロカルシンＥ―１，テトロカルシンＥ―２
は、前述のとおり、醗酵法でも製造できるし、ま
たテトロカルシンＡ，テトロカルシンＢ，テトロ
カルシンＤなどを加水分解することによつても製
造できる。
テトロカルシンＥ―１およびテトロカルシンＥ
―２を微生物の培養物中から得るには、ミクロモ
ノスボラ属に属し、テトロカルシンＥ―１およ
び／またはテトロカルシンＥ―２生産能を有する
微生物を栄養培地に培養し、該化合物を培養物中
に蓄積せしめ該培養物からテトロカルシンＥ―１
および／またはテトロカルシンＥ―２を採取する
ことによつてテトロカルシンＥ―１および／また
はテトロカルシンＥ―２が得られる。
使用しうる微生物としてはミクロモノスポラ属
に属しテトロカルシンＥ―１および／またはテト
ロカルシンＥ―２生産能を有する微生物であれ
ば、いずれの微生物も用いることができるが好適
な菌としては、ミクロモノスポラ・チヤルセア
KY11091株があげられる。該菌株は微工研菌寄
第4458号、NRRL11289として、それぞれ寄託さ
れている。該菌株の菌学的性質は特願昭53−4596
（特開昭54−138501）、特願昭54−152253（特開昭
56−75500）、特願昭55−17498（特開昭56−
115794）、特願昭55−24926（特開昭56−122394）
明細書に記載されている。
次に培養方法について述べる。
本発明の培養においては通常の放線菌の培養法
が一般に用いられる。培養のための栄養源として
は下記に示すごとくいろいろのものが用いられ
る。炭素源としてはブドウ糖、殿粉、デキストリ
ン、マンノース、フラクトース、シユークロー
ス、糖蜜などが単独または組み合わせて用いられ
る。さらに、菌の資化能によつては炭化水素、ア
ルコール類、有機酸なども用いうる。無機および
有機の窒素化合物として塩化アンモン、硫酸アン
モン、硝酸アンモン、硝酸ソーダ、尿素などがま
た天然の窒素源としてはペプトン、肉エキス、酵
母エキス、乾燥酵母、コーン・スチーブ・リカ
ー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合
わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食
塩、塩化カリ、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウ
ム、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カリウム、
硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫
酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類を加える。さらに
使用菌の生育やテトロカルシンＥ―１およびテト
ロカルシンＥ―２の生産を促進する微量成分例え
ばビタミンB1、ビオチンなどを適当に添加する
ことができる。
培養法としては、液体培養法、とくに深部撹拌
培養法がもつとも適している。培養温度は25〜40
℃、特に28〜38℃が最適で培地のPHはアンモニア
水や炭酸アンモン溶液などを添加して、PH４〜
10、好ましくは６〜８で培養を行なうことが望ま
しい。
液体培養で通常１日ないし７日培養を行なう
と、目的物質が培養液中に生成蓄積される。培養
液中の生成量が最大に達したときに培養を停止
し、菌体を別して得られる培養液中より目的物
を単離精製する。
培養液からのテトロカルシンＥ―１およびテ
トロカルシンＥ―２の単離精製には微生物代謝生
産物をその培養液から単離するためにふつう用い
られる分離・精製の方法が利用される。
例えば、培養生産物を培養液と菌体とに分離
し、培養液そのまま（PH6.0）非イオン性多孔性
樹脂（商品名「HP―20」三菱化成製など）を通
過させ、抗菌活性を有する成分を吸着させた後、
メタノール、アセトン、酢酸エチルなどを用いて
吸着物質を脱着させる。この脱着液を濃縮乾固
し、水に溶解して活性炭素に吸着させる。活性炭
素からはアセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒で
活性物質を溶出する。この溶出液を濃縮乾固しク
ロロホルムに溶解させ、予めクロロホルムに懸濁
後カラム充填したシリカゲルを用いてクロマトグ
ラフイーを行う。まずクロロホルムを通塔するこ
とによつて不純物である黄色系の色素が除去され
る。次いでクロロホルム：メタノール（98：２、
容量比）の混合液で活性物質を溶出することがで
きる。ここではテトロカルシンＡ、テトロカルシ
ンＢ、テトロカルシンＣ、テトロカルシンＤ、テ
トロノライド類化合物Ｆ―１、テトロカルシンＥ
―１、テトロカルシンＥ―２の混合物として溶出
させる。これらの分離を行うには、この活性画分
を濃縮乾固し、少量のクロロホルム：メタノー
ル：水（３：１：１、容量比）の混合物の下層溶
媒に溶解する。これを前記下層溶媒で充填したシ
リカゲルのカラムに通塔し、同じ溶媒で溶出する
とテトロカルシンＥ―１、テトロカルシンＥ―
２、テトロノライド類化合物Ｆ―１、テトロカル
シンＡ、テトロカルシンＢ、テトロカルシンＤ、
テトロカルシンＣの順に溶出されてくる。テトロ
カルシンＥ―１、テトロカルシンＥ―２の多く含
まれる画分をとり、それぞれをさらに再クロマト
処理に付すか、またはシリカゲル薄層クロマトで
処理することによつてテトロカルシンＥ―１、Ｅ
―２をそれぞれ得ることができる。薄層クロマト
による場合はシリカゲル薄層（商品名DC
FertigPlatten Kieselgel 60F254，E.Merck）を
用い、クロロホルム：メタノール（９：１、容量
比）で展開後相当する部分をかきとり、該展開溶
媒もしくはアセトン等で溶出し、溶出液を濃縮乾
固する。
さらに必要に応じ抽出、晶析等の手段を加えて
もよい。また分離を完全にするために、上記と同
じクロマトグラフイーを繰返すかあるいはセフア
デツクスLH―20（Pharmacia Fine Chemicals
Inc.，スウエーデン）のカラムに通塔する操作を
加えてもよい。
次にテトロカルシンＥ―１、テトロカルシンＥ
―２の加水分解による製造法について述べる。
テトロカルシンＡ，Ｂ，Ｄのいずれかまたはこ
れらの混合物（その組成は問わない）を塩酸、硫
酸などの酸水溶液と有機溶媒（アセトンなど）の
混合物中で加水分解する。加水分解は例えば実施
例３に示したごとき条件下に行えばよい。加水分
解後溶媒を留去し、残水溶液を酢酸エチルで抽出
し、酢酸エチル層を濃縮乾固後、クロロホルムに
溶解する。これを予めクロロホルムで充填したシ
リカゲルのカラムに通塔し、クロロホルム：メタ
ノール（100：0.5、容量比）で展開するとテトロ
カルシンＥ―１、テトロカルシンＥ―２の順に溶
出されてくる。これを再クロマト法、薄層クロマ
ト法などでさらに精製して純粋なテトロカルシン
Ｅ―１、テトロカルシンＥ―２を得ることができ
る。
ここでは単一物質から２種の物質テトロカルシ
ンＥ―１、テトロカルシンＥ―２が得られてき
た。その後の実験からテトロカルシンＥ―１が本
来母化合物中に含まれていて、加水分解中および
分解後溶液中に存在しているときに隣酸する水酸
基にアセチル基が転移することによつてテトロカ
ルシンＥ―２が生成したと考えられる。また一方
テトロカルシンＥ―２もまたアセチル基の転移に
よつてテトロカルシンＥ―１に変ることができ
る。このようなアセチル基の転移は、テトロカル
シンＥ―１およびテトロカルシンＥ―１の純品を
溶液にすると徐々に変換をしてテトロカルシンＥ
―１とＥ―２の混合物ができることからも証明さ
れた。さらに同様の反応が培養液中でも起つてい
ると容易に推定できる。
次に実施例をあげて本発明化合物を具体的製法
を示す。
実施例中、物質の動向は、バチルス・ズブチリ
スNo.10707を用いるバイオアツセイまたはTLCク
ロマトスキヤンナー法（島津クロマトスキヤンナ
ーCS910）（紫外部反射法、ダブルビーム、シン
グルスキヤン、波長サンプル260nm、リフアレン
ス350nm）を用いて追跡した。
実施例 １
種菌としてミクロモノスポラ・チヤルセア
KY11091を用いた。該菌株を２容量の三角フ
フラスコ中の種培地〔KCl ４ｇ／MgSO4・
7H2O0.5ｇ／、KH2PO41.5ｇ／、硫安5.0
ｇ／、シユークロース20ｇ／、フラクトース
10ｇ／、グルコース10ｇ／、コーンスチーブ
リカー5.0ｇ／、CaCO320ｇ／PH7.0〕300ml
に植菌し、30℃で48時間振とう（220r.p.m）培養
した。かくして得られた種培養液を30容量のジ
ヤーフアーメンター中の下記組成の発酵培地15
に５％（容量）の割合で移し、30℃で通気撹拌方
式（回転数250r.p.m通気量15／min）により培
養を行つた。
発酵培地組成：可溶性デンプン60ｇ／、大豆
粕粉末10ｇ／、ペプトン10ｇ／、
K2HPO40.5ｇ／、MgSO4・7H2O0.5
ｇ／、CaCO31ｇ／、PH7.2（殺菌前）
にNaOHで調整する。
培養中培地のPHは制御しないで、72時間培養し
た。培養液より菌体および沈殿物を別し、別液
13を得た。まず液13を１の非イオン性多
孔性樹脂（商品名「HP―10」三菱化成製）に通
塔して活性物質を吸着させ水洗後さらに30％
（Ｖ／Ｖ）アセトン水溶液で洗い不純物を除去す
る。次いでアセトンで溶出する。アセトン画分を
濃縮乾固し、30％（Ｖ／Ｖ）アセトン水溶液に溶
解する。この溶液を活性炭500mlを充填したカラ
ムに吸着させる。30％（Ｖ／Ｖ）アセトン水溶液
で洗滌後アセトンで活性画分を溶出する。この操
作で不純物として存在する色素の大部分を除くこ
とができる。活性画分を濃縮乾固し、少量のクロ
ロホルム（約10ml）に溶解する。このクロロホル
ム溶液を予めクロロホルムを溶媒として充填した
シリカゲル〔商品名：クロマトグラフ用シリカゲ
ル（100〜200メツシユ）関東化学、以下も同じ〕
（500ml）のカラムに静かに乗せ、まずクロロホル
ムで充分（約２）に洗い、次いでクロロホル
ム：メタノール（98：２、容量比）で溶出を行う
とテトロカルシンＡ〜Ｄ、テトロノライド類化合
物Ｅ―１、テトロカルシンＥ―１、Ｅ―２が混合
して溶出される。これを濃縮乾固し、少量のクロ
ロホルム：メタノール：H2O（３：１：１、容量
比）の混合物の下層溶媒に溶解する。これを前記
下層溶媒で充填したシリカゲルカラム（500ml）
に静かに乗せ、同じ溶媒で展開するとテトロカル
シンＥ―１，Ｅ―２、テトロノライド類化合物Ｆ
―１、テトロカルシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｃの順に溶出
されてくる。さらに同様にして再クロマトを行つ
て、テトロカルシンＥ―１、Ｅ―２をそれぞれ主
成分とする分画を濃縮乾固する。これをアセトン
またはクロロホルムに溶解し、シリカゲル薄層を
用い、クロロホルム：メタノール（９：１、容量
比）で展開した。Ｅ―１に相当する部分もしくは
Ｅ―２に相当する部分をかきとり、それぞれを展
開溶媒又はアセトンで溶出後、濃縮乾固し酢酸エ
チルに溶解する。これを0.1N HClと振りまぜ溶
媒層を取り、濃縮乾固する。このとき乾固したも
のを酢酸エチルに再溶解後ヘキサンで沈殿させる
ことによつても粉末が得られる。このようにして
約５mgのテトロカルシンＥ―１と約３mgのテトロ
カルシンＥ―２を得た。ここで得たテトロカルシ
ンＥ―１，Ｅ―２の理化学的性質、抗菌活性は前
記の通りである。
実施例 ２
実施例１において、発酵培地組成を次のものに
代えて行う以外は実施例１と同様に培養を行つ
た。
発酵培地組成：可溶性デンプン40ｇ／、大豆
粕粉末30ｇ／、デキストリン５ｇ／、
コーンスチーブリカー５ｇ／、
K2HPO40.5ｇ／、MgSO4・7H2O0.5
ｇ／、CaCO31ｇ／、PH7.0（殺菌前）
にNaOHで調整する。
培養液を、実施例１と同様に処理して、テトロ
カルシンＥ―１，Ｅ―２をそれぞれ約４mg、約２
mg得た。これらの理化学的性質、抗菌活性は実施
例１で得られたものとよく一致した。
実施例 ３
テトロカルシンＡ、Ｂ、Ｄの混合物（組成比は
８：1.7：0.3、重量比）３ｇを50％アセトン２
に溶解し、PH20にHClで調整した後、50℃で17時
間還流して分解させた。分解液を減圧下で濃縮
し、アセトンを除去した後、500mlの酢酸エチル
を加えて抽出した。抽出液を濃縮乾固し、クロロ
ホルムに溶解し、予めクロロホルムで充填したシ
リカゲルのカラム（500ml）に、静かに乗せ、ク
ロロホルム：メタノール（100：0.5、容量比）展
開した。テトロカルシンＥ―１，Ｅ―２を含む画
分を集め、それぞれ濃縮後石油エーテルで沈殿さ
せた。この方法でテトロカルシンＥ―１，Ｅ―２
をそれぞれ150mg、160mgを得た。これらの理化学
的性質、抗菌活性などは実施例１で得られたもの
とよく一致した。[Table]
ATCC 9992
From the above physical and chemical properties, tetrocalcin E-
Not only can one distinguish between 1 and E-2, but also between these and other tetrocalcins. Next, the method for producing tetrocalcins of the present invention will be described. Tetrocalcin E-1, Tetrocalcin E-2
As mentioned above, can be produced by fermentation, or by hydrolyzing tetrocalcin A, tetrocalcin B, tetrocalcin D, etc. Tetrocalcin E-1 and Tetrocalcin E
-2 from a microbial culture, a microorganism belonging to the genus Micromonosvora and capable of producing tetrocalcin E-1 and/or tetrocalcin E-2 is cultured in a nutrient medium, and the compound is added to the culture. Tetrocalcin E-1 was accumulated from the culture.
And/or by collecting tetrocalcin E-2, tetrocalcin E-1 and/or tetrocalcin E-2 can be obtained. Any microorganism can be used as long as it belongs to the genus Micromonospora and has the ability to produce tetrocalcin E-1 and/or tetrocalcin E-2.・Chaarcea
KY11091 stock is mentioned. The strain has been deposited as FIKEN Bibori No. 4458 and NRRL11289, respectively. The mycological properties of this strain were disclosed in Japanese Patent Application 1986-4596.
(Japanese Patent Publication No. 54-138501), Patent Application No. 152253 (Japanese Patent Application
56-75500), patent application No. 55-17498 (Japanese Patent Application No. 1983-17498
115794), patent application No. 1157-24926 (Japanese Patent Application No. 1983-122394)
It is stated in the specification. Next, the culture method will be described. In the cultivation of the present invention, ordinary methods for culturing actinomycetes are generally used. Various nutrient sources can be used for culturing, as shown below. As the carbon source, glucose, starch, dextrin, mannose, fructose, sucrose, molasses, etc. are used alone or in combination. Furthermore, depending on the assimilation ability of the bacteria, hydrocarbons, alcohols, organic acids, etc. may also be used. Inorganic and organic nitrogen compounds include ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, sodium nitrate, urea, etc. Natural nitrogen sources include peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn stew liquor, soy flour, and casamino. Acids and the like are used alone or in combination. In addition, salt, potassium chloride, magnesium sulfate, calcium carbonate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate,
Add inorganic salts such as ferrous sulfate, calcium chloride, manganese sulfate, zinc sulfate, and copper sulfate. Furthermore, trace components that promote the growth of the bacteria used and the production of tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-2, such as vitamin B 1 and biotin, can be appropriately added. As a culture method, a liquid culture method, especially a deep agitation culture method, is suitable. Culture temperature is 25-40
℃, especially 28 to 38℃, is optimal, and the pH of the culture medium is adjusted to PH4 to 4 by adding aqueous ammonia or ammonium carbonate solution.
10, preferably 6 to 8. When culture is carried out in liquid culture for usually 1 to 7 days, the target substance is produced and accumulated in the culture solution. When the production amount in the culture solution reaches the maximum, the culture is stopped, the bacterial cells are separated, and the target product is isolated and purified from the obtained culture solution. Isolation and purification of tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-2 from the culture solution utilizes separation and purification methods commonly used to isolate metabolic products of microorganisms from the culture solution. For example, the culture product is separated into a culture solution and bacterial cells, and the culture solution (PH6.0) is passed through a nonionic porous resin (trade name "HP-20" manufactured by Mitsubishi Kasei, etc.) to detect antibacterial activity. After adsorbing the components that have
Desorb the adsorbed substance using methanol, acetone, ethyl acetate, etc. This desorption solution is concentrated to dryness, dissolved in water, and adsorbed onto activated carbon. The active substance is eluted from the activated carbon using an organic solvent such as acetone or ethyl acetate. This eluate is concentrated to dryness, dissolved in chloroform, and chromatographed using silica gel that has been suspended in chloroform and filled in a column. First, impurity yellow pigment is removed by passing chloroform through the column. Then chloroform:methanol (98:2,
The active substance can be eluted with a mixed solution (volume ratio). Here, tetrocalcin A, tetrocalcin B, tetrocalcin C, tetrocalcin D, tetronolide compound F-1, tetrocalcin E
Elute as a mixture of -1 and tetrocalcin E-2. To carry out these separations, the active fractions are concentrated to dryness and dissolved in a small amount of the lower solvent of a mixture of chloroform:methanol:water (3:1:1, by volume). This was passed through a silica gel column filled with the lower layer solvent, and when eluted with the same solvent, tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-
2. Tetronolide compound F-1, tetrocalcin A, tetrocalcin B, tetrocalcin D,
Tetrocalcin C is eluted in this order. Fractions containing a large amount of tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-2 are taken and each is further subjected to re-chromatography or treated with silica gel thin layer chromatography to obtain tetrocalcin E-1 and E-2.
-2 each. For thin layer chromatography, use a thin layer of silica gel (product name: DC
After developing with chloroform:methanol (9:1, volume ratio) using FertigPlatten Kieselgel 60F 254 (E. Merck), a corresponding portion is scraped off, eluted with the developing solvent or acetone, and the eluate is concentrated to dryness. Furthermore, if necessary, means such as extraction and crystallization may be added. In addition, to complete the separation, repeat the same chromatography as above or use Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals).
Inc., Sweden) may be added. Next, tetrocalcin E-1, tetrocalcin E
-2 The production method by hydrolysis will be described. Tetrocalcin A, B, D or a mixture thereof (the composition thereof does not matter) is hydrolyzed in a mixture of an aqueous acid solution such as hydrochloric acid or sulfuric acid and an organic solvent (such as acetone). Hydrolysis may be carried out under the conditions shown in Example 3, for example. After hydrolysis, the solvent is distilled off, the remaining aqueous solution is extracted with ethyl acetate, the ethyl acetate layer is concentrated to dryness, and then dissolved in chloroform. When this is passed through a silica gel column previously filled with chloroform and developed with chloroform:methanol (100:0.5, volume ratio), tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-2 are eluted in this order. This can be further purified by rechromatography, thin layer chromatography, etc. to obtain pure tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-2. Here, two substances, tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-2, have been obtained from a single substance. Subsequent experiments showed that tetrocalcin E-1 was originally contained in the parent compound, and that tetrocalcin -2 is thought to have been generated. On the other hand, tetrocalcin E-2 can also be converted to tetrocalcin E-1 by transfer of the acetyl group. Such acetyl group transfer occurs when pure tetrocalcin E-1 and tetrocalcin E-1 are converted into a solution, gradually converting into tetrocalcin E.
This was also proven by the fact that a mixture of -1 and E-2 was formed. Furthermore, it can be easily assumed that a similar reaction occurs in the culture solution. Next, examples will be given to show specific methods for producing the compounds of the present invention. In the examples, the trend of substances was determined by bioassay using Bacillus subtilis No. 10707 or TLC chromatography scanner method (Shimadzu chromatography scanner CS910) (ultraviolet reflection method, double beam, single scan, wavelength sample 260 nm, reference 350 nm) was tracked using. Example 1 Micromonospora charcea as seed fungus
KY11091 was used. The strain was grown in a seed medium [KCl 4g/MgSO 4 .
7H 2 O 0.5g/, KH 2 PO 4 1.5g/, Ammonium sulfate 5.0
g/, sucrose 20g/, fructose
10g/, glucose 10g/, corn steep liquor 5.0g/, CaCO 3 20g/PH7.0〕300ml
The cells were inoculated and cultured at 30°C for 48 hours with shaking (220 rpm). The seed culture thus obtained was mixed into a fermentation medium 15 with the following composition in a 30-volume jar fermenter.
The culture was carried out at 30° C. using an aeration stirring method (rotation speed: 250 rpm, aeration rate: 15/min). Fermentation medium composition: soluble starch 60g/, soybean meal powder 10g/, peptone 10g/,
K 2 HPO 4 0.5g/, MgSO 4・7H 2 O0.5
g/, CaCO 3 1g/, PH7.2 (before sterilization)
Adjust with NaOH. Culture was carried out for 72 hours without controlling the pH of the culture medium. Separate the bacterial cells and precipitate from the culture solution and separate the
Got 13. First, liquid 13 is passed through a column of nonionic porous resin 1 (product name "HP-10" manufactured by Mitsubishi Kasei) to adsorb the active substance, and after washing with water, an additional 30%
(V/V) Wash with acetone aqueous solution to remove impurities. Then elute with acetone. The acetone fraction is concentrated to dryness and dissolved in a 30% (V/V) acetone aqueous solution. This solution is adsorbed onto a column packed with 500 ml of activated carbon. After washing with a 30% (V/V) acetone aqueous solution, the active fraction is eluted with acetone. This operation can remove most of the dyes present as impurities. The active fraction is concentrated to dryness and dissolved in a small amount of chloroform (approximately 10 ml). Silica gel filled with this chloroform solution in advance using chloroform as a solvent [Product name: Silica gel for chromatography (100-200 mesh) Kanto Kagaku, the same applies below]
(500 ml), washed thoroughly with chloroform (approximately 2 times), and then eluted with chloroform:methanol (98:2, volume ratio). Tetrocalcins A to D, tetronolide compounds E-1, Tetrocalcin E-1 and E-2 are mixed and eluted. This is concentrated to dryness and dissolved in a small amount of the lower solvent of a mixture of chloroform:methanol:H 2 O (3:1:1, volume ratio). A silica gel column (500ml) filled with this lower layer solvent
When placed gently on the gel and developed with the same solvent, tetrocalcin E-1, E-2, tetronolide compound F
-1, tetrocalcin A, B, D, and C are eluted in this order. Further, rechromatography is performed in the same manner, and the fractions containing tetrocalcins E-1 and E-2 as main components are concentrated to dryness. This was dissolved in acetone or chloroform and developed with chloroform:methanol (9:1, volume ratio) using a thin layer of silica gel. The portion corresponding to E-1 or E-2 is scraped off, each is eluted with a developing solvent or acetone, concentrated to dryness, and dissolved in ethyl acetate. Shake this with 0.1N HCl, remove the solvent layer, and concentrate to dryness. A powder can also be obtained by redissolving the dried product in ethyl acetate and precipitating it with hexane. In this way, about 5 mg of tetrocalcin E-1 and about 3 mg of tetrocalcin E-2 were obtained. The physicochemical properties and antibacterial activity of the tetrocalcins E-1 and E-2 obtained here are as described above. Example 2 Culture was carried out in the same manner as in Example 1 except that the composition of the fermentation medium was changed to the following. Fermentation medium composition: soluble starch 40g/, soybean meal powder 30g/, dextrin 5g/,
Corn stew liquor 5g/,
K 2 HPO 4 0.5g/, MgSO 4・7H 2 O0.5
g/, CaCO 3 1g/, PH7.0 (before sterilization)
Adjust with NaOH. The culture solution was treated in the same manner as in Example 1 to give about 4 mg and about 2 mg of tetrocalcin E-1 and E-2, respectively.
I got mg. These physicochemical properties and antibacterial activity were in good agreement with those obtained in Example 1. Example 3 3 g of a mixture of tetrocalcins A, B, and D (composition ratio: 8:1.7:0.3, weight ratio) was mixed with 50% acetone 2
After adjusting the pH to 20 with HCl, the solution was refluxed at 50°C for 17 hours for decomposition. The decomposed solution was concentrated under reduced pressure to remove acetone, and then extracted with 500 ml of ethyl acetate. The extract was concentrated to dryness, dissolved in chloroform, gently placed on a silica gel column (500 ml) filled with chloroform in advance, and developed with chloroform:methanol (100:0.5, volume ratio). Fractions containing tetrocalcin E-1 and E-2 were collected, concentrated, and precipitated with petroleum ether. In this method, tetrocalcin E-1, E-2
150mg and 160mg of each were obtained. These physicochemical properties, antibacterial activity, etc. were in good agreement with those obtained in Example 1.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図はテトロカルシンＥ―１の赤外部吸収ス
ペクトルを示す。第２図はテトロカルシンＥ―１
のPMRスペクトルを示す。第３図はテトロカル
シンＥ―２の赤外部吸収スペクトルを示す。第４
図はテトロカルシンＥ―２のPMRスペクトルを
示す。
FIG. 1 shows the infrared absorption spectrum of tetrocalcin E-1. Figure 2 shows tetrocalcin E-1
The PMR spectrum of FIG. 3 shows the infrared absorption spectrum of tetrocalcin E-2. Fourth
The figure shows the PMR spectrum of tetrocalcin E-2.