JPS6332768B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

1974年１月１日に発行された米国特許第
3783098号明細書には、細胞に細胞結合ビールス
（cell−associated virus）を植えつけ、安定剤の
存在でそのビールスを抽出しそして凍結乾燥して
ワクチンとして使用しうる貯蔵安定なビールスと
することによつて製造されたヘルペスビールスワ
クチンが開示されている。凍結乾燥後、このビー
ルスは安定稀釈剤によつて再構成される。この公
知ワクチンは、特に家禽をマレツクス氏病
（Marek′sdisease）の感染に対して予防するため
に、かなり広く商業的に受入れられ使用されてい
る。しかしながら、凍結乾燥されたワクチンを再
構成するために安定稀釈剤を使用することが必要
なために、このワクチンのコストはかなり高くな
つている。 ここに本発明によつて、ヘルペスビールスワク
チンの稀釈剤として蒸溜水の使用が可能な新規な
ワクチン製造法が発見された。 マレツクス氏病ワクチンを製造する場合、凍結
乾燥前にSPGAを配合することが現在の慣用法と
なつている。ジエー・バクト（J.Bact.）59巻、
509〜522頁（1950年）にボバルニツク
（Bovarnick）等によつて記載された安定剤であ
り、本明細書に参考的に説明されるSPGAは、工
業的実施において、通常使用される安定剤であ
る。ボバルニツクにより記述されているように、
SPGAのノリツター中には、0.218M蔗糖（74.62
ｇ）、0.00376MH₂PO₄（0.52ｇ）、0.0071M
K₂HPO₄（1.25ｇ）、0.0049Mグルタミン酸カリウ
ム（0.912ｇ）及び１％血清アルブミン（10ｇ）
が含まれる。上記SPGAの各成分の量を必要に応
じて適宜に変更することは当業者にとつて自明な
事項であり、グルタミン酸ナトリウムは、しばし
ば、グルタミン酸カリウムと置き換えられるが、
その変更組成物もまたSPGAと呼ばれる。例えば
米国特許第3783098号は、グルタミン酸モノカリ
ウムよりむしろグルタミン酸モノナトリウムを含
有するSPGA安定剤を開示している。（コラム６、
第５〜11行）。米国特許第4000256号は、減菌蒸留
水１リツトル当り、74.62ｇ蔗糖、0.45ｇ
KH₂PO₄、1.35ｇ K₂HPO₄、0.956ｇＬ−グルタ
ミン酸モノナトリウム及び40mlの25％アルブミノ
ソール（albuminosol）（ヒトアルブミン）溶液
を含有するSPGA安定剤を記載している。一般的
にSPGA安定剤は、以下を含む。 (a) 約２〜約10％等、例えば、スクロース； (b) 約0.05〜約0.3％の１−又は２−塩基アルカ
リ金属リン酸塩又はそれらの混合物、例えば、
KH₂PO₄、K₂HPO₄、NaH₂PO₄又は
NaH₂PO₄； (c) 約0.05〜約0.2％のグルタミン酸アルカリ金
属塩、例えば、グルタミン酸ナトリウム又はカ
リウム；及び (d) 約0.5〜約２％血清アルブミン、例えば、牛
血清アルブミン又はヒトアルブミン： SPGA安定剤の処方において、成分は種々置き
換えができる。例えば、デンプン加水分解物、例
えば、グルコース又はデキストランは、米国特許
第3783098号（コラム３、第59〜61行）に開示さ
れているように、完全に又は部分的に蔗糖と置き
換えられ得、カゼイン又はPVPは、それぞれ、
米国特許第3783098号（コラム３、第８行）及び
第3915794号に記載されているようにアルブミン
と完全に又は部分的に置き換えられ得る。上記範
囲の成分又はそれらの等価物を有するSPGA組成
物であれば、どれでも、本発明において使用する
ことができる。マレツク氏病に対してて使用され
るべき濃度への希釈、すなわち500又は1000回投
与を与えるに十分な水で希釈された場合のSPGA
水性組成物は、PH約5.0〜約5.7を有する。 本発明によれば、ヘルペスビールスワクチンは
予備凍結乾燥の段階において、SPGA安定剤およ
び使用濃度へ再構成された後の凍結乾燥ワクチン
のPHを約6.8ないし7.2の範囲の値に保持するのに
有効な緩衝剤系を配合して製造される。このよう
な緩衝剤系の存在で凍結乾燥されると、その凍結
乾燥されたビールスは、水で再構成することがで
き、これにより安定で活性なワクチンが与えられ
る。好ましい緩衝剤系は、再構成時にKH₂PO₄に
関して約0.12ミリモル溶液、そしてK₂HPO₄に関
して約0.88ミリモル溶液を与えるのに十分な量の
KH₂PO₄とK₂HPO₄との混合物である。 マレツクス氏病に対する防護のためのワクチン
を製造するために使用されるウイルスは、七面鳥
ヘルペスウイルス（turkey herpes virus）であ
る。そういつたウイルスの特別な例としては、カ
ルネツク等アプル・マイクロバイオル、（Calnek
et al.、Appl.Microbiol.）20巻、723〜726頁
（1970年）により、マレツクス氏病に対して防護
することが知られているFC−126株（ATCC VR
−584）が挙げられる。ウイルスは、約0.2mlの各
投与量中に少なくとも1000プラーク形成単位を含
むような濃度で投与される。以下の実施例におい
ては、独特な株が使用されるが、七面鳥ヘルペス
ウイルスの株であればどれでも本発明の水再構成
マレツクス氏病ワクチンを製造するために使用し
得ることを理解すべきである。最終ウイルス懸濁
物は、凍結乾燥用薬びんに分注される。各薬びん
中に存在するウイルス量及び、それから作られる
ワクチンの投与回数は、アツセイにより決定され
る。各投与量は約0.2mlであるゆえに、再構成量
は薬びん当たりの投与回数を0.2倍することによ
り決定される。薬びんは、ワクチンの500回投与
か又は1000回投与量を含むようにパツケージされ
るゆえに、薬びんは、それぞれ水100mlか又は200
mlで構成される。本発明は以下の実施例に限定さ
れるものではない。 実施例 １ 無菌の牛の胎児血清５％を含む培養基119−
F10（Gibco）中、38.5℃温度で４日間鶏卵線維母
細胞内で育成した七面鳥ヘルペスウイルス
（ATCC VR584株）の製品ロツトから標準法に
より10本のローラびんに試料を採取した。これら
ローラびんから採取された流体を２個の円錐形遠
心びんに分配しそして３〜５℃の温度、
1000RPMの回転速度で遠心分離を行なつた。 上澄みを流し出しそして一方のびんには理論的
細胞濃度が20×10⁶細胞となるように、PH制御さ
れた緩衝安定剤20.4ml（SPGA90ml＋１モルリン
酸カリウム緩衝液10ml、PH7.8のもの）を加えた。
他方のびんには同様にして希釈剤SPGAを加え
た。 上記２つのびんのそれぞれの内容物を30mlの薬
びんに分配しそして各バツチを３〜５℃の温度且
つ約35ワツトで２分間音波処理（sonication）し
た。音波処理後、各サンプルを３c.c.のガラスびん
（1.1c.c.まで充填）に分配しそして−70℃で約６時
間凍結させた。各ガラスびんを凍結乾燥後にシー
ルしそしてラベルを貼つた。 凍結乾燥された粉末の安定性を37℃で３日間貯
蔵した後に評価しそして200mlの蒸留水で再構成
した。力価アツセイは、各薬びんが1000回投与に
十分な、すなわち、少なくとも1500000プラーク
形成単位のウイルスを含有することを示す。結果
は下記表１に示す通りであつた。

【表】 実施例 ２ 無菌の牛の胎児血清５％を含む培養基199−
F10（Gibco）中、38.5℃の温度で４日間鶏卵線維
母細胞内で生育させた七面鳥ヘルペスウイルス
（ATCC VR584株）の製品ロツトから10本のロ
ーラびんに試料を標準法により採集した。採集し
た流体をそれらローラびんから２個の円錐形遠心
びんに分配して入れそして３〜５℃の温度、
1000RPMの回転数で10分間遠心分離を行なつた。 上澄みを流して捨て、そして理論的細胞濃度が
20×10⁶細胞となるように、一方のびんにはPH制
御された緩衝安定剤20.4ml（SPGA90ml＋１モル
リン酸ナトリウム緩衝液10ml、PH7.8のもの）を
加えた。他方のびんには同様にして希釈剤SPGA
を加えた。 ２つのびんの各内容物を30mlの薬びんに分配し
そして各バツチを３〜５℃の温度且つ約35ワツト
で２分間音波処理した。音波処理後に、各サンプ
ルを３mlのガラスびん（1.1mlまで充填）に分配
して−70℃で約６時間凍結させた。これらのガラ
スびんを凍結乾燥後にシールしそしてラベルを貼
つた。 凍結乾燥された粉末の安定性を37℃で３日間貯
蔵したのち評価しそして200mlの蒸留水で再構成
した。力価アツセイは、各薬びんが1000回投与に
十分な、すなわち少なくとも、1500000プラーク
形成単位のウイルスを含有することを示す。下記
表２に示す結果が得られた。

【表】 実施例 ３ 標準法により１つの七面鳥ヘルペスウイルス
（ATCCVR−584株）の製品ロツトから132本の
ローラびんに試料を採取した。採取した試料を複
数の円錐形遠心びんに入れて３〜５℃、
1000RPMで10分間遠心分離した。 上澄みを捨てそしてPH調整された緩衝安定剤
（90mlのSPGA＋10mlの１モルリン酸カリウム緩
衝液、PH7.8）の約30mlを各びんに加えた。最終
体積は700mlそして理論的細胞濃度は約15.1×10⁶
細胞／mlとなるようにした。 この700mlの懸濁物を氷浴内に保持しそして流
動音波処理装置（FLOW Sonicating
apparatus）を用いて音波処理した。音波処理後
に、そのワクチンを金属製罐に移しそしてアルコ
ール冷凍機内で凍結しそして−70℃の冷凍庫内に
貯蔵した。 １週間後に罐の内容物を29℃の水浴に入れて解
凍し、最終的に希釈しそして３mlの薬びんに分配
した。これらの薬びんを−70℃で約６時間凍結し
た。凍結乾燥したのち、これらの薬びんをシール
しそしてラベルを貼つた。 実施例 ４ 無菌の牛の胎児血清５％を含む培養基199−
F10（Gibco）中、38.5℃で４日間鶏卵線維母細胞
内で育成した七面鳥ヘルペスウイルス（ATCC
VR584株）の製品ロツトから10本のローラびん
に標準法に従つて試験を採集した。採集した流体
をこれらローラびんから２個の円錐形遠心びんに
分配しそして３〜５℃の温度、1000RPMの回転
数で10分間遠心分離を行なつた。 上澄みを捨てそして一方のびんには理論的細胞
濃度が20×10⁶細胞となるように、20.4mlのPH制
御された緩衝安定剤（90mlのSPGA＋10mlの１モ
ルリン酸塩緩衝液、PH7.8）を加えた。他方のび
んには別のPH制御された緩衝安定剤（90mlの
SPGA＋10mlの１モルリン酸塩緩衝液、mm²6.2）
を同様にして加えた。 ２つのびんの各内容物を30mlの薬びんに分配し
そして各バツチを３〜５℃の温度そして約35ワツ
トで２分間音波処理した。音波処理後各試料を３
c.c.のガラスびん（1.1c.c.まで充填）に分配しそし
て−70℃で約６時間凍結した。凍結乾燥後、各ガ
ラスびんをシールしそしてラベルを貼つた。 この凍結乾燥された粉末の安定性を37℃で３日
間貯蔵した後に評価しそして200mlの蒸留水で再
構成した。力価アツセイは、各薬びんが1000回投
与に十分な、すなわち少なくと1500000プラーク
形成単位のウイルスを含有することを示す。結果
を表３にまとめて示す。

【表】 上記実施例に見られるごとく、PH制御された緩
衝安定剤を用いて製造されたワクチンは公知技術
による単なる希釈安定剤を用いて製造されたワク
チンに比較して蒸留水で再構成された場合はるか
に高い安定性を有する。これらの実施例では
SPGA、すなわち最初からリン酸塩を含有してい
る安定剤を使用した。例えばSPGAの200mlは、
スクロース14.92ｇｍ、KH₂PO₄ 0.10ｇｍ、
K₂HPO₄ 0.32ｇｍ、グルタミン酸ナトリウム0.01
ｇｍおよびアルブミン2.0ｇｍを含有している。
これに対し本発明による新規ワクチン製品の１び
ん（200mlの水で希釈される）中のそれら成分の
乾燥重量は、それぞれ、スクロース73.9mg、
KH₂PO₄ 3.4mg、K₂HPO₄ 16.6mg、グルタミン酸
ナトリウム0.9mgおよびアルブミン9.9mgである。
最終のワクチンびん１本に総量約20mgの好ましい
レベルのリン酸塩緩衝剤が存在しているのであれ
ば、凍結乾燥の間いかなる安定剤を使用してもか
まわないことが判明した。この計算は使用者によ
つて簡単になし得ることである。さらに、最終ワ
クチンびん１本当り総量約10ないし60mgの範囲で
リン酸塩緩衝剤が有効的に使用しうることが確認
された。本発明の組成物の１に対して含有され
る成分の重量部で示す範囲は、スクロース約33な
いし135部、KH₂PO₄約1.5ないし15部、K₂HPO₄
約７ないし30部、グルタミン酸モノナトリウム約
0.4乃至0.17部、そしてアルブミン約4.5ないし18
部である。これら範囲内にあつて、K₂HPO₄／
KH₂PO₄の比は10ないし２、好ましくは約５であ
るべきである。これらの与えられた数値にもとづ
き、任意の通常使用されている安定剤系の調整を
行なつて、蒸溜水で使用時に簡単に稀釈できると
いう利点を有する本発明の安定化されたワクチン
を製造することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水で再構成しうる凍結乾燥された七面鳥ヘル
   ペスビールスの製造方法において、ヘルペスビー
   ルス安定剤の存在且つ、水1000重量部に対して、
   約1.5〜約15重量部のKH₂PO₄及び約７〜約30重
   量部のK₂HPO₄よりなる、再構成後のPHを約6.8
   ないし7.2に維持するのに有効な量の緩衝剤の存
   在下で七面鳥ヘルペスビールスを凍結乾燥するこ
   とを特徴とする方法。 ２ 該ビールスがATCC VR−584である特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３ 該安定剤が、スクロース、グルコース又はデ
   キストラン、グルタミン、リン酸塩より成る群か
   ら選択された少なくとも一つ及びアルブミン、カ
   ゼイン、ポリビニルピロリドンより成る群から選
   択された少なくとも一つを包含する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ４ 該安定剤がスクロース、リン酸塩、グルタミ
   ン及びアルブミンよりなる特許請求の範囲第２項
   記載の方法。 ５ 凍結乾燥された七面鳥ヘルペスビールスが、
   水1000重量部に対して、約33〜約135重量部のス
   クロース、約1.5〜約15重量部のKH₂PO₄、約７
   〜約30重量部のK₂HPO₄、約0.4〜約0.17重量部の
   グルタミン酸モノナトリウム及び約4.5〜約18重
   量部のアルブミンを含有する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。