JPS63287498A - 血清の検定法 - Google Patents
血清の検定法Info
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- JPS63287498A JPS63287498A JP12301887A JP12301887A JPS63287498A JP S63287498 A JPS63287498 A JP S63287498A JP 12301887 A JP12301887 A JP 12301887A JP 12301887 A JP12301887 A JP 12301887A JP S63287498 A JPS63287498 A JP S63287498A
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、例えば動物細胞培養における血清培地などに
用いられる血清の検定法に関する。
用いられる血清の検定法に関する。
（従来技術とその問題点）
近年、動植物の細胞や組織を大量に培養する培養技術が
開発され、これにより培養された特定の細胞や組織から
、例えばインクフエロン、モノクロナール抗体、成長ホ
ルモン等の生理活性物質など有用な物質が大量生産され
始めている。
開発され、これにより培養された特定の細胞や組織から
、例えばインクフエロン、モノクロナール抗体、成長ホ
ルモン等の生理活性物質など有用な物質が大量生産され
始めている。
ところで、このような細胞培養あるいは組織培養を行な
う際には、特に動物細胞や組織の場合に、細胞や組織の
成長促進因子として例えば牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む
培地が用いられることが多い。
う際には、特に動物細胞や組織の場合に、細胞や組織の
成長促進因子として例えば牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む
培地が用いられることが多い。
ところが、このような培地に使用可能なＦＣＳ等の血清
は、生産数量が限られている上、生産ロット間の品質差
が大きいため、この血清を培地に添加する際には、予め
血清の活性を検定しておく必要がある。
は、生産数量が限られている上、生産ロット間の品質差
が大きいため、この血清を培地に添加する際には、予め
血清の活性を検定しておく必要がある。
従来よ、す、このような血清の検定には、寒天培地を用
いた培養法（Ａｇａｒ ｐｌａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）
、限界希釈法（Ｌ ｉｓｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ
）などの検定法が知られている。
いた培養法（Ａｇａｒ ｐｌａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）
、限界希釈法（Ｌ ｉｓｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ
）などの検定法が知られている。
寒天培地を用いた培養法は、血清を含む寒天培地に所定
の細胞濃度の細胞液を塗布したのち、７〜１４日間程度
培養して培地上に発生したコロニー数を計数する方法で
ある。
の細胞濃度の細胞液を塗布したのち、７〜１４日間程度
培養して培地上に発生したコロニー数を計数する方法で
ある。
また、限界希釈法は、血清と細胞を含む培地を希釈し、
この希釈培地中の細胞数が数個以下となるようにマイク
ロプレートの各穴内に分注したのち、７〜１４日間培養
して細胞増殖が観察された穴の数を計数する方法である
。
この希釈培地中の細胞数が数個以下となるようにマイク
ロプレートの各穴内に分注したのち、７〜１４日間培養
して細胞増殖が観察された穴の数を計数する方法である
。
しかしながら、これら両横定法では、いずれも血清の検
定結果を得るまでに時間と手間がかかり面倒である゛な
どの問題があった。
定結果を得るまでに時間と手間がかかり面倒である゛な
どの問題があった。
また、これらの検定法は、いずれも血清を栄養として増
殖した細胞数を計数する方法であるが、一つの培地上あ
るいは一つの穴内の細胞数が統計的に信頼できるに足る
数に達することがなく、極めて少ないため、その点にお
いて検定結果が厳密性に欠ける問題もあった。
殖した細胞数を計数する方法であるが、一つの培地上あ
るいは一つの穴内の細胞数が統計的に信頼できるに足る
数に達することがなく、極めて少ないため、その点にお
いて検定結果が厳密性に欠ける問題もあった。
（問題点を解決するための手段）
そこで、本発明者らは、このような事情に鑑み鋭意検討
を重ねた結果、血清を栄養として増殖する細胞内の活動
性ミトコンドリアにより、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈ
ｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅ
ｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｓ ｂｒｏｍｉｄｅ（以下
、単にＭＴＴと略称する。）が特異的に分解されること
に着目し、このＭＴＴの分解生成物であるフォルマザン
化合物を比色定量することで、活動性ミトコンドリアの
呼吸活性や細胞の増殖を検知でき、さらには血清の活性
を検定できる知見を得るに至った。すなわち、この発明
の血清の検定法は、このような知見に基づいたもので、
その特徴とするところは血清を栄養として増殖する細胞
によりＭＴＴをフォルマザン化合物に分解させ、このフ
ォルマザン化合物を比色定量することにある。
を重ねた結果、血清を栄養として増殖する細胞内の活動
性ミトコンドリアにより、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈ
ｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅ
ｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｓ ｂｒｏｍｉｄｅ（以下
、単にＭＴＴと略称する。）が特異的に分解されること
に着目し、このＭＴＴの分解生成物であるフォルマザン
化合物を比色定量することで、活動性ミトコンドリアの
呼吸活性や細胞の増殖を検知でき、さらには血清の活性
を検定できる知見を得るに至った。すなわち、この発明
の血清の検定法は、このような知見に基づいたもので、
その特徴とするところは血清を栄養として増殖する細胞
によりＭＴＴをフォルマザン化合物に分解させ、このフ
ォルマザン化合物を比色定量することにある。
以下、この発明の詳細な説明する。
この発明では、まず血清の検定に用いられる細胞を用意
する。この細胞としては、例えば白血病細胞、骨髄腫細
胞等の増殖能力に富む細胞などが好適に用いられるが、
これらに限定されるものではない。そして、この細胞濃
度は、細胞種、後述、の血清の活性などにより左右され
るが、通常はＩ Ｘ １Ｇ’ 〜Ｉ Ｘ ｌＯ”ｃｅｌ
ｌｓ／ ＲＱ程度の範囲とされる。
する。この細胞としては、例えば白血病細胞、骨髄腫細
胞等の増殖能力に富む細胞などが好適に用いられるが、
これらに限定されるものではない。そして、この細胞濃
度は、細胞種、後述、の血清の活性などにより左右され
るが、通常はＩ Ｘ １Ｇ’ 〜Ｉ Ｘ ｌＯ”ｃｅｌ
ｌｓ／ ＲＱ程度の範囲とされる。
また、この細胞液のｐｌ（は、６．８〜７，６程度の中
性に調製される。
性に調製される。
次に、このような細胞液中に細胞の栄養となる血清を添
加して検定液を調製する。ここで、上記の血清としては
、前述の牛胎児血清（Ｆｅ２）などが用いられる。この
血清の上記検定液中での濃度は、予想される血清の活性
などに応じて適宜法められ、通常は１０〜２０体積％程
度とされる。
加して検定液を調製する。ここで、上記の血清としては
、前述の牛胎児血清（Ｆｅ２）などが用いられる。この
血清の上記検定液中での濃度は、予想される血清の活性
などに応じて適宜法められ、通常は１０〜２０体積％程
度とされる。
次に、このようにして調製された検定液を恒温槽内で培
養する。ここで、恒温槽としては、上記の検定液を炭酸
ガス雰囲気中で培養できる炭酸ガスインキュベータなど
が好適に用いられる。そして、炭酸ガス濃度は、検定液
のｐＨ調製、炭酸ガスによる検定液中の細胞に対する刺
激の程度などを考慮して決められ、通常５〜ｌＯ％程度
の範囲とされる。また、恒温槽内の温度は、上記検定液
の培養に適した温度とされ、通常は３０〜４０℃程度の
範囲とされる。さらに、培養時間は、上記培養温度など
により左右され、例えば培養温度が３７℃程度であれば
、２４時間程度で十分である。
養する。ここで、恒温槽としては、上記の検定液を炭酸
ガス雰囲気中で培養できる炭酸ガスインキュベータなど
が好適に用いられる。そして、炭酸ガス濃度は、検定液
のｐＨ調製、炭酸ガスによる検定液中の細胞に対する刺
激の程度などを考慮して決められ、通常５〜ｌＯ％程度
の範囲とされる。また、恒温槽内の温度は、上記検定液
の培養に適した温度とされ、通常は３０〜４０℃程度の
範囲とされる。さらに、培養時間は、上記培養温度など
により左右され、例えば培養温度が３７℃程度であれば
、２４時間程度で十分である。
次に、培養後の上記検定液にＭＴＴ溶液を添加したのち
、直ちにインキュベートする。ここで、上記ＭＴＴ溶液
は、１ ＝ １０ ｓｔ／ｌＱ程度の濃度に調製される
ことが望ましい。インキュベートの温度およびインキュ
ベート時における炭酸ガス雰囲気の炭酸ガス濃度は、前
述の培養時と同様の条件とされる。そして、インキュベ
ート時間は、検定液中の生細胞の基質として分解される
ＭＴＴＩＩ！、分解速度などに応じて決められ、通常１
２０〜２４０分程度の範囲とされる。
、直ちにインキュベートする。ここで、上記ＭＴＴ溶液
は、１ ＝ １０ ｓｔ／ｌＱ程度の濃度に調製される
ことが望ましい。インキュベートの温度およびインキュ
ベート時における炭酸ガス雰囲気の炭酸ガス濃度は、前
述の培養時と同様の条件とされる。そして、インキュベ
ート時間は、検定液中の生細胞の基質として分解される
ＭＴＴＩＩ！、分解速度などに応じて決められ、通常１
２０〜２４０分程度の範囲とされる。
このようなインキュベートを行なうことで、上記検定液
中のＭＴＴは、生細胞中の活動性ミトコンドリアにより
特異的にフォルマザン化合物に分解される。このＭＴＴ
の分解により生じる黄色（ＭＴＴ）から暗青色（フォル
マザン化合物）への色調変化は、活動性ミトコンドリア
の呼吸活性や細胞の増殖に比例し、さらに血清の活性に
比例する。
中のＭＴＴは、生細胞中の活動性ミトコンドリアにより
特異的にフォルマザン化合物に分解される。このＭＴＴ
の分解により生じる黄色（ＭＴＴ）から暗青色（フォル
マザン化合物）への色調変化は、活動性ミトコンドリア
の呼吸活性や細胞の増殖に比例し、さらに血清の活性に
比例する。
したがって、次に、上記のフォルマザン化合物特有の波
長域で吸光度を測定し、この吸光度からフォルマザン化
合物の生成量を算出する。そして、上記の測定波長域は
、５６０〜６３０ ｎｍの範囲とされる。
長域で吸光度を測定し、この吸光度からフォルマザン化
合物の生成量を算出する。そして、上記の測定波長域は
、５６０〜６３０ ｎｍの範囲とされる。
このような血清の検定法によれば、血清を栄養として増
殖する細胞の活動性ミトコンドリアによりＭＴＴをフォ
ルマザン化合物に分解させ、このフォルマザン化合物を
比色定量するようにしたので、フォルマザン化合物の生
成量から細胞の増殖を検知でき、さらにはこの細胞の増
殖から血清の活性を検定できる。したがって、この検定
法によれば、従来の検定法のように長い培養期間を設定
する必要がなく、また細胞数を計数する必要もないこと
から、血清の検定を迅速かつ簡便に行なうことができる
。
殖する細胞の活動性ミトコンドリアによりＭＴＴをフォ
ルマザン化合物に分解させ、このフォルマザン化合物を
比色定量するようにしたので、フォルマザン化合物の生
成量から細胞の増殖を検知でき、さらにはこの細胞の増
殖から血清の活性を検定できる。したがって、この検定
法によれば、従来の検定法のように長い培養期間を設定
する必要がなく、また細胞数を計数する必要もないこと
から、血清の検定を迅速かつ簡便に行なうことができる
。
また、この検定法によれば、−検定液中に含まれる細胞
数を統計的に信頼できるに足る数とすることが可能であ
るので、検定結果に厳密性および信頼性をもたせること
ができる。
数を統計的に信頼できるに足る数とすることが可能であ
るので、検定結果に厳密性および信頼性をもたせること
ができる。
（実施例）
液体窒素中で凍結していｔこＢａ１ｂ／ｃマウス由来ミ
エローマ細胞（Ｐ（Ｘ６３−Ａｇ８．６．５．３）を手
早く解凍し、ＲＰＭ１１６４０培地により上記細胞を洗
浄した。次いで、上記培地中の細胞濃度をｌ Ｘ Ｉ
Ｏ’ｃｅｌｌｓ／ｙＱに調製したのち、この培地を２４
穴（以下、ウェルと言う。）のマイクロプレートの各ウ
ェル内に１ｘＱずつ分注した。
エローマ細胞（Ｐ（Ｘ６３−Ａｇ８．６．５．３）を手
早く解凍し、ＲＰＭ１１６４０培地により上記細胞を洗
浄した。次いで、上記培地中の細胞濃度をｌ Ｘ Ｉ
Ｏ’ｃｅｌｌｓ／ｙＱに調製したのち、この培地を２４
穴（以下、ウェルと言う。）のマイクロプレートの各ウ
ェル内に１ｘＱずつ分注した。
次に、このマイクロプレートの各ウェル内にロットｌ〜
５の牛胎児血清（ＦＣＳ）を、培地中のＦＣ８′ａ度が
１０〜２０体積％となるように添加して検定液とした。
５の牛胎児血清（ＦＣＳ）を、培地中のＦＣ８′ａ度が
１０〜２０体積％となるように添加して検定液とした。
次いで、上記のマイクロプレートを３７℃、５％炭酸ガ
ス雰囲気のインキュベータ内に入れ、各ウェル内のミエ
ローマ細胞を２４時間培養した。
ス雰囲気のインキュベータ内に入れ、各ウェル内のミエ
ローマ細胞を２４時間培養した。
次に、上記のマイクロプレートの各ウェル内の検定液中
に、Ｉ）Ｈ７，４のリン酸緩衝液で５ｙｚｇ／ｚＱの濃
度に調製したＭＴＴ溶液を１００μＱずつ添加したのち
、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気のインキュベータ内で３
時間インキュベートした。
に、Ｉ）Ｈ７，４のリン酸緩衝液で５ｙｚｇ／ｚＱの濃
度に調製したＭＴＴ溶液を１００μＱずつ添加したのち
、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気のインキュベータ内で３
時間インキュベートした。
次に、上記のマイクロプレートの各ウェル内の培養液中
の細胞をそれぞれ冷却遠心器により遠心洗浄したのち、
その沈澱物であるペレットにイソプロパツールを１ ｙ
ｚ（ｌ添加してペレット中のフォルマザン化合物を溶解
させた。次いで、この溶液を比色計にかけ、波長５６０
ｎ＋＊における吸光度を測定し、その結果を第１表に
示した。なお、第１表に示した吸光度は、ＦＣＳを含ま
ない白試験の吸光度を差し引いたものである。
の細胞をそれぞれ冷却遠心器により遠心洗浄したのち、
その沈澱物であるペレットにイソプロパツールを１ ｙ
ｚ（ｌ添加してペレット中のフォルマザン化合物を溶解
させた。次いで、この溶液を比色計にかけ、波長５６０
ｎ＋＊における吸光度を測定し、その結果を第１表に
示した。なお、第１表に示した吸光度は、ＦＣＳを含ま
ない白試験の吸光度を差し引いたものである。
また、比較例として、限界希釈法（Ｌ ｉｍｉｔｉｎｇ
ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を用いて、上記実施例と同ロフトの
ＦＣＳの検定を行なった。また、細胞には上記のミエロ
ーマ細胞を用い、これを１０日間培養した。
ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を用いて、上記実施例と同ロフトの
ＦＣＳの検定を行なった。また、細胞には上記のミエロ
ーマ細胞を用い、これを１０日間培養した。
この第１表から明らかなように、培養期間が１日間の実
施例の結果は、培養期間にｌθ日日間要した比較例の結
果と良好な相関関係を示していることがわかる。また、
実施例は、比較例に比べて結果の再現性や精度に優れて
いることもわかった。
施例の結果は、培養期間にｌθ日日間要した比較例の結
果と良好な相関関係を示していることがわかる。また、
実施例は、比較例に比べて結果の再現性や精度に優れて
いることもわかった。
（発明の効果）
以上説明したように、本発明によれば、血清を栄養とし
て増殖する細胞によりＭＴＴをフォルマザン化合物に分
解させ、このフォルマザン化合物を比色定量するように
したので、フォルマザン化合物の生成量から細胞の増殖
を検知でき、さらにはこの細胞の増殖から血清の活性を
検定できる。
て増殖する細胞によりＭＴＴをフォルマザン化合物に分
解させ、このフォルマザン化合物を比色定量するように
したので、フォルマザン化合物の生成量から細胞の増殖
を検知でき、さらにはこの細胞の増殖から血清の活性を
検定できる。
したがって、この検定法によれば、従来の検定法のよう
に長い培養期間を設定する必要がなく、また細胞数を計
数する必要もないことから、血清の検定をフォルマザン
化合物の比色定量により迅速かつ簡便に行なうことがで
きる。
に長い培養期間を設定する必要がなく、また細胞数を計
数する必要もないことから、血清の検定をフォルマザン
化合物の比色定量により迅速かつ簡便に行なうことがで
きる。
また、この検定法によれば、−検定液中に含まれる細胞
数を統計的に信頼できるに足る数とすることが可能であ
るので、検定結果に厳密性および信頼性をもたせること
ができる。
数を統計的に信頼できるに足る数とすることが可能であ
るので、検定結果に厳密性および信頼性をもたせること
ができる。
Claims (1)
- 血清を栄養として増殖する細胞により、３−（４，５−
ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５
−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍ
ｉｄｅをフォルマザン化合物に分解させ、このフォルマ
ザン化合物を比色定量することを特徴とする血清の検定
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12301887A JPS63287498A (ja) | 1987-05-20 | 1987-05-20 | 血清の検定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12301887A JPS63287498A (ja) | 1987-05-20 | 1987-05-20 | 血清の検定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63287498A true JPS63287498A (ja) | 1988-11-24 |
Family
ID=14850188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12301887A Pending JPS63287498A (ja) | 1987-05-20 | 1987-05-20 | 血清の検定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63287498A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009028011A (ja) * | 2007-07-30 | 2009-02-12 | Kao Corp | 細胞呼吸活性の測定方法及びそのキット、タンパク質生産性向上株のスクリーニング方法及びそのキット |
| CN102830075A (zh) * | 2012-08-30 | 2012-12-19 | 上海交通大学 | 一种mtt法检测木霉菌活性的方法 |
-
1987
- 1987-05-20 JP JP12301887A patent/JPS63287498A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009028011A (ja) * | 2007-07-30 | 2009-02-12 | Kao Corp | 細胞呼吸活性の測定方法及びそのキット、タンパク質生産性向上株のスクリーニング方法及びそのキット |
| CN102830075A (zh) * | 2012-08-30 | 2012-12-19 | 上海交通大学 | 一种mtt法检测木霉菌活性的方法 |
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