JPS63264499A - 肝炎Ｂｅ抗体の単離法 - Google Patents
肝炎Ｂｅ抗体の単離法Info
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- JPS63264499A JPS63264499A JP63065867A JP6586788A JPS63264499A JP S63264499 A JPS63264499 A JP S63264499A JP 63065867 A JP63065867 A JP 63065867A JP 6586788 A JP6586788 A JP 6586788A JP S63264499 A JPS63264499 A JP S63264499A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は肝炎Ｂｅ抗原または抗体を単離する方法に関す
る。本発明の精製された肝炎Ｂｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）ま
たは肝炎Ｂｅ抗体（Ｉ（Ｂｌ！Ａｂ）のための出発物質
は肝炎Ｂ面抗原（ＨＢｅＡｇ）を含有する人の生物学的
液体である。人体生物学的液体中にＨＢｓＡｇが存在す
ることは検定の結果がＨＢｅＡｇまたはＨＢｅＡｂの存
在に対してマイナスの反応を示した場合でもＲＢｅＡｇ
またはＨＢｅＡｂの存在を示す標識として役立つ。
る。本発明の精製された肝炎Ｂｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）ま
たは肝炎Ｂｅ抗体（Ｉ（Ｂｌ！Ａｂ）のための出発物質
は肝炎Ｂ面抗原（ＨＢｅＡｇ）を含有する人の生物学的
液体である。人体生物学的液体中にＨＢｓＡｇが存在す
ることは検定の結果がＨＢｅＡｇまたはＨＢｅＡｂの存
在に対してマイナスの反応を示した場合でもＲＢｅＡｇ
またはＨＢｅＡｂの存在を示す標識として役立つ。
生物学的液体はＨＢｅＡｇを含有するいかなる人体生物
学的液体であってもよ（、たとえば、血漿または経血が
使用しろる。最も容易に入手しうる生物学的液体は血漿
である。血漿は常用方法たとえば遠心器により血球と血
草とを分離する操作を含むいわゆるプラズマフオレシス
（ｐｌａｓｍａｐｈｏｒｅｓｉｓ）により得られる。人
体生物学的液体中のＨＢＪｇのレベルは公知方法により
任意適当な手段を用いて、例えば反転受動血漿凝集反応
または補体結合によって測定することができる。生物学
的液体が血漿である場合は、血漿をＣａＣβ２で処理し
てフィブリンを凝結させ、これを次に遠分心離により除
去する。転化された血漿を次に硫酸アンモニウムで沈殿
させるとグロブリンに冨んだ留分が得られる。
学的液体であってもよ（、たとえば、血漿または経血が
使用しろる。最も容易に入手しうる生物学的液体は血漿
である。血漿は常用方法たとえば遠心器により血球と血
草とを分離する操作を含むいわゆるプラズマフオレシス
（ｐｌａｓｍａｐｈｏｒｅｓｉｓ）により得られる。人
体生物学的液体中のＨＢＪｇのレベルは公知方法により
任意適当な手段を用いて、例えば反転受動血漿凝集反応
または補体結合によって測定することができる。生物学
的液体が血漿である場合は、血漿をＣａＣβ２で処理し
てフィブリンを凝結させ、これを次に遠分心離により除
去する。転化された血漿を次に硫酸アンモニウムで沈殿
させるとグロブリンに冨んだ留分が得られる。
このグロブリン沈殿物を遠心分離により集めそして４生
理食塩液に溶解しそして生理食塩液に対して透析して硫
酸アンモニウムの大部分を除去する。
理食塩液に溶解しそして生理食塩液に対して透析して硫
酸アンモニウムの大部分を除去する。
人の生物学的液体のＨＢａＡｇまたはＨＢｅＡｂは等密
度バンディング（ｉｓｏｐｙｃｎｉｃ ｂａｎｄｉｎｇ
）のステップと速度帯域別バンディング（ｒａｔｅ ｚ
ｏｎａｌ ｂａｎｄｉｎｇ）のステップによって単離さ
れる。
度バンディング（ｉｓｏｐｙｃｎｉｃ ｂａｎｄｉｎｇ
）のステップと速度帯域別バンディング（ｒａｔｅ ｚ
ｏｎａｌ ｂａｎｄｉｎｇ）のステップによって単離さ
れる。
等密度バンディングにおいては、すでに幾分か精製され
た濃縮物が、単離される特定物質の密度を含むある１つ
の密度勾配をその中に有する液体媒質と接触せしめられ
る。この液体媒質は次に超遠心分離にかけられ漿液の各
成分がその個々の密度に従って密度勾配の全体に亘って
平衡分配される。この媒質の順次留分を移動させそして
所望の抗原を含む留分すなわち約１．０４乃至１．１５
ｇ／ｃｃの密度を存する留分を分離する。上記勾配を形
成する各溶液の濃度は約１．０から約１．４１ ｇ ／
ｃｃまでの密度を包含するように選択される。この液
体媒質は線形勾配のものでも段階勾配のものでも使用し
うる。しかし、その固有分別能がより高い理由からして
段階勾配の形態のものを使用するのが好ましい。
た濃縮物が、単離される特定物質の密度を含むある１つ
の密度勾配をその中に有する液体媒質と接触せしめられ
る。この液体媒質は次に超遠心分離にかけられ漿液の各
成分がその個々の密度に従って密度勾配の全体に亘って
平衡分配される。この媒質の順次留分を移動させそして
所望の抗原を含む留分すなわち約１．０４乃至１．１５
ｇ／ｃｃの密度を存する留分を分離する。上記勾配を形
成する各溶液の濃度は約１．０から約１．４１ ｇ ／
ｃｃまでの密度を包含するように選択される。この液
体媒質は線形勾配のものでも段階勾配のものでも使用し
うる。しかし、その固有分別能がより高い理由からして
段階勾配の形態のものを使用するのが好ましい。
速度帯域別バンディングにおいては、上記等密度バンデ
ィング段階で得られた１、２０〜１．２２密度範囲の留
分がその中に密度勾配を有する液体媒質と接触せしめら
れて超遠心分離にかけられる。
ィング段階で得られた１、２０〜１．２２密度範囲の留
分がその中に密度勾配を有する液体媒質と接触せしめら
れて超遠心分離にかけられる。
ただし、この時には速度帯域別バンディングの技術が用
いられる。すなわち、その速度および時間においては平
衡に到達せず、ｕＢｅＡｇまたはＨＢｅＡｂおよび他の
残留漿液成分がその媒質中でのそれらの沈降係数に従っ
てその媒質中に分配されるような速度ならびに時間で超
遠心分離される。この際の段階勾配を形成する各溶液の
濃度は約１．０から約１、２８ ｇ ／ ｃｃの密度範
囲を包含するよう選択される。この速度帯域別バンディ
ングの工程は８８９４ｇまたは）ＩＢｅＡｂが１．０４
乃至１．１５ｇ／ｃｃの密度領域に到達するまで実施さ
れる。この時点で、その１（Ｂ 、Ａ ｇまたはＨＢｅ
ＡｂがＨＢｓＡｇおよび血漿の高分子マクログロブリン
成分から分離される。
いられる。すなわち、その速度および時間においては平
衡に到達せず、ｕＢｅＡｇまたはＨＢｅＡｂおよび他の
残留漿液成分がその媒質中でのそれらの沈降係数に従っ
てその媒質中に分配されるような速度ならびに時間で超
遠心分離される。この際の段階勾配を形成する各溶液の
濃度は約１．０から約１、２８ ｇ ／ ｃｃの密度範
囲を包含するよう選択される。この速度帯域別バンディ
ングの工程は８８９４ｇまたは）ＩＢｅＡｂが１．０４
乃至１．１５ｇ／ｃｃの密度領域に到達するまで実施さ
れる。この時点で、その１（Ｂ 、Ａ ｇまたはＨＢｅ
ＡｂがＨＢｓＡｇおよび血漿の高分子マクログロブリン
成分から分離される。
等密度バンディングおよび速度帯域別バンディングの段
階で使用される液体媒質は適当範囲内のいかなる密度勾
配であってもよい。かかる溶液のための従来技術による
溶質を例示すればスクロース、臭化カリウム、塩化セシ
ウム、酒石酸カリウム等である。
階で使用される液体媒質は適当範囲内のいかなる密度勾
配であってもよい。かかる溶液のための従来技術による
溶質を例示すればスクロース、臭化カリウム、塩化セシ
ウム、酒石酸カリウム等である。
上記等密度ハンデイング工程は遠心器たヒえばエレクロ
ヌクレオニクスーＫ （ＥＩｅｃｔｏｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ−Ｋ）中で、
その定置ロータに生理食塩液を充填し、そして段階勾配
が形成されるまで順次その生理食塩液を各液体媒質溶液
分の密度の増加の順に上方に移動させることによって実
施するのが好都合である。生物学的液体は底からいくつ
かの最高密度溶液を引き出しながらロータの頂部に導入
される。典型的には生物学的液体の量は段階勾配の液体
の約１５乃至４０％である。
ヌクレオニクスーＫ （ＥＩｅｃｔｏｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ−Ｋ）中で、
その定置ロータに生理食塩液を充填し、そして段階勾配
が形成されるまで順次その生理食塩液を各液体媒質溶液
分の密度の増加の順に上方に移動させることによって実
施するのが好都合である。生物学的液体は底からいくつ
かの最高密度溶液を引き出しながらロータの頂部に導入
される。典型的には生物学的液体の量は段階勾配の液体
の約１５乃至４０％である。
遠心器はプログラムされた速度制御装置を通じて初期再
配向位相の間の混合を防止するような速度に制御される
。平衡に到達しそしてその産物がその適当密度点となっ
た時にロータの速度を同じ速度制御装置を介してスピー
ドダウンさせて元の配 −置に再配向される時の混合を
防止する。そのあと、勾配液を下から抜き出しそして適
当密度留分を捕集する。同じような操作が速度帯域別バ
ンディングにおいても使用される。
配向位相の間の混合を防止するような速度に制御される
。平衡に到達しそしてその産物がその適当密度点となっ
た時にロータの速度を同じ速度制御装置を介してスピー
ドダウンさせて元の配 −置に再配向される時の混合を
防止する。そのあと、勾配液を下から抜き出しそして適
当密度留分を捕集する。同じような操作が速度帯域別バ
ンディングにおいても使用される。
等密度バンディング段階（ＮａＢｒ）からと速度帯域別
バンディング段階（スクロース）からとの１．０４〜１
．１５密度範囲留分は１つに合体される。このＨＢｅＡ
ｇまたはＩｔ Ｂ 、Ａ ｂ留分は透析されそして典型
的には約４倍濃度に濃縮される。この透析および濃縮作
業のためにはアミコン中空繊維装置（Ａｍｉｃｏｎｈｏ
ｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）が有効で
ある。
バンディング段階（スクロース）からとの１．０４〜１
．１５密度範囲留分は１つに合体される。このＨＢｅＡ
ｇまたはＩｔ Ｂ 、Ａ ｂ留分は透析されそして典型
的には約４倍濃度に濃縮される。この透析および濃縮作
業のためにはアミコン中空繊維装置（Ａｍｉｃｏｎｈｏ
ｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）が有効で
ある。
本発明の１つの実施態様によれば、多重負荷技術の使用
いかんにかかわらず、勾配は臭化ナトリウムを用いて形
成される。従来使用されてきた物質に比較して、臭化ナ
トリウムはいくつかの顕著な利点を有する。臭化ナトリ
ウムの溶解性は冷蔵庫温度（２〜６℃）において勾配形
成に各種高密度溶液を使用することを可能ならしめる。
いかんにかかわらず、勾配は臭化ナトリウムを用いて形
成される。従来使用されてきた物質に比較して、臭化ナ
トリウムはいくつかの顕著な利点を有する。臭化ナトリ
ウムの溶解性は冷蔵庫温度（２〜６℃）において勾配形
成に各種高密度溶液を使用することを可能ならしめる。
臭化ナトリウムを使用することは塩化セシウムのような
塩を使用するよりも明らかに経済的に有利であるばかり
でなく残存するセシウムイオンおよびＨＢｅＡｇと結合
したセシウムイオンにより生じる複素の問題がないとい
う利点を持つ。臭化ナトリウム勾配液中においては、生
物理学的特性の故にＨＢｅＡｇに結合させたイオンはナ
トリウム塩の形態であり、これは人の生物学的系と非常
に親和性があり、毒性の問題は生じない。
塩を使用するよりも明らかに経済的に有利であるばかり
でなく残存するセシウムイオンおよびＨＢｅＡｇと結合
したセシウムイオンにより生じる複素の問題がないとい
う利点を持つ。臭化ナトリウム勾配液中においては、生
物理学的特性の故にＨＢｅＡｇに結合させたイオンはナ
トリウム塩の形態であり、これは人の生物学的系と非常
に親和性があり、毒性の問題は生じない。
ＫＢｒに関して見た低温時のＮａＢｒのすぐれた溶解性
は生物学的物質の安定性にとってより有益な低温の使用
を可能ならしめる。線形勾配よりも段階勾配の使用が好
ましいのは次の理由による。すなわち、段階勾配ではそ
の段階境界に不純物が堆積され、したがって単一の勾配
中で大量の血漿を処理することが可能であるからである
。
は生物学的物質の安定性にとってより有益な低温の使用
を可能ならしめる。線形勾配よりも段階勾配の使用が好
ましいのは次の理由による。すなわち、段階勾配ではそ
の段階境界に不純物が堆積され、したがって単一の勾配
中で大量の血漿を処理することが可能であるからである
。
以下に本発明の実施例を記す。これは本発明を限定する
ものではない。
ものではない。
実用〔１１
補体結合によって測定したＨＢｅ Ａｇ力価が＞２５６
である血漿２０／を２．７７％のＣａＣｌ ２の２．２
１と混合しそして複数の大きい遠心器に移した。３７”
Ｃ（Ｈ２Ｏ浴）に２時間保持したのち、凝結した血漿を
遠心分離して転化血清を清澄化した。その上澄み液を等
量の硫酸アンモニウム溶液（４５０ｍｇ／ ｍ ！！
）と混合しそして５℃で一晩貯蔵した。形成された沈殿
をＪＡ−１０ロータ（１バッチ当りの容量３１）を用い
て３分間、７０００Ｘｇでバッチ遠心分離して捕集した
。遠心分離後のベレットを約２．２５１の生理食塩液に
懸濁した。この濃縮懸濁物を次に生理食塩液４０１に対
して透析して硫酸アンモニウムを除去した。
である血漿２０／を２．７７％のＣａＣｌ ２の２．２
１と混合しそして複数の大きい遠心器に移した。３７”
Ｃ（Ｈ２Ｏ浴）に２時間保持したのち、凝結した血漿を
遠心分離して転化血清を清澄化した。その上澄み液を等
量の硫酸アンモニウム溶液（４５０ｍｇ／ ｍ ！！
）と混合しそして５℃で一晩貯蔵した。形成された沈殿
をＪＡ−１０ロータ（１バッチ当りの容量３１）を用い
て３分間、７０００Ｘｇでバッチ遠心分離して捕集した
。遠心分離後のベレットを約２．２５１の生理食塩液に
懸濁した。この濃縮懸濁物を次に生理食塩液４０１に対
して透析して硫酸アンモニウムを除去した。
遠心器、エレクレロヌクレニクスーにのロータにリン酸
塩緩衝液８４００ｎｌを充填した。装置のガス抜きのた
めロータを］、００００ｒｐｍまでランニングさせたの
ち、その定置ロータの底に下記の段階勾配液を送入した
。
塩緩衝液８４００ｎｌを充填した。装置のガス抜きのた
めロータを］、００００ｒｐｍまでランニングさせたの
ち、その定置ロータの底に下記の段階勾配液を送入した
。
１、１０％ＮａＢｒ２０００ｍ Ｉｔ 、 ｄ ＝ １
．０８２、 ２０％ＮａＮａＢｒ１００Ｏ、ｄ＝１．１
７３、 ３０％ＮａＢｒ１５００ｍｌ、ｄ＝１．２８４
、 ４０％ＮａＮａＢｒ３９Ｏ０、ｄ ＝１．４１導析
した上記懸濁物２２５０ｎｔ’をロータの底から４０％
ＮａＢｒの２２５０ｍ１を送り出しながら定置ロータの
頂部に導入した。このロータを３００００ｒｐｍまで加
速しそしてこの速度で１８時間運転を続けた。
．０８２、 ２０％ＮａＮａＢｒ１００Ｏ、ｄ＝１．１
７３、 ３０％ＮａＢｒ１５００ｍｌ、ｄ＝１．２８４
、 ４０％ＮａＮａＢｒ３９Ｏ０、ｄ ＝１．４１導析
した上記懸濁物２２５０ｎｔ’をロータの底から４０％
ＮａＢｒの２２５０ｍ１を送り出しながら定置ロータの
頂部に導入した。このロータを３００００ｒｐｍまで加
速しそしてこの速度で１８時間運転を続けた。
ロータを停止させたのち、１．０５〜１．１５ ｇ／ｃ
ｃ密度範囲にあるＨ Ｂ 、Ａ ｇに富んだ物質１００
０ｍ ｌを集めた。
ｃ密度範囲にあるＨ Ｂ 、Ａ ｇに富んだ物質１００
０ｍ ｌを集めた。
さらに高い１．１７〜１．２２ ｇ ／ ｃｃの密度範
囲の物質を２番目に捕集した（３０００ｍｌ）。ＨＢｓ
Ａｇに富むこの物質をリン酸塩緩衝生理食塩液（Ｐ Ｂ
Ｓ）に対して透析しそして１０００ｍ／まで濃縮した
。この作業にはアミコン中空繊維装置を使用した。
囲の物質を２番目に捕集した（３０００ｍｌ）。ＨＢｓ
Ａｇに富むこの物質をリン酸塩緩衝生理食塩液（Ｐ Ｂ
Ｓ）に対して透析しそして１０００ｍ／まで濃縮した
。この作業にはアミコン中空繊維装置を使用した。
次いでそのロータにリン酸援衝液を充填し、上記と同様
にガス抜きし、そして定置ロータの底部へ下記の段階勾
配液を送入した。
にガス抜きし、そして定置ロータの底部へ下記の段階勾
配液を送入した。
１．５％スクロース２０００ｍ ｌ、ｄ＝１．０２２、
１５％スクロース１６５０ｍｊ２ 、 ｄ ＝１．０６
３、２５％スクロース１７５０ｎｊ！ Ｓｄ ＝１．１
０４．５０％スクロース４３００＋＋ｌ 、 ｄ ＝１
．２３前記ＮａＢｒ等密度パンデイング工程で得られた
第２番目の高密度範囲物質１０１００Ｏをロータの頂部
にロータ底部から５０％スクロース１００１００Ｏを送
出しながら導入した。このあと、ロータを２８００Ｏｒ
ｐｍの速度で１８時間運転した。ロータを停止させたの
ち、１．０５〜１．１５ ｇ ／ ｃｃ密度範囲のｕｔ
ｔｅａｇに冨んだ物質１０００Ｉ１１１を集めた。
１５％スクロース１６５０ｍｊ２ 、 ｄ ＝１．０６
３、２５％スクロース１７５０ｎｊ！ Ｓｄ ＝１．１
０４．５０％スクロース４３００＋＋ｌ 、 ｄ ＝１
．２３前記ＮａＢｒ等密度パンデイング工程で得られた
第２番目の高密度範囲物質１０１００Ｏをロータの頂部
にロータ底部から５０％スクロース１００１００Ｏを送
出しながら導入した。このあと、ロータを２８００Ｏｒ
ｐｍの速度で１８時間運転した。ロータを停止させたの
ち、１．０５〜１．１５ ｇ ／ ｃｃ密度範囲のｕｔ
ｔｅａｇに冨んだ物質１０００Ｉ１１１を集めた。
上記等密度パンディング工程（ＮａＢｒ）と速度帯域別
バンディング工程（スクロース）とから得られた１、０
５〜１．１５密度の各留分を１つに合体した（約２１）
。このＨＢｅＡｇ留分をＰＢＳに対して透析しそして５
００ｍ１！まで４倍に濃縮した。この透析と濃縮との作
業にはアミコン中空繊維装置が使用される。
バンディング工程（スクロース）とから得られた１、０
５〜１．１５密度の各留分を１つに合体した（約２１）
。このＨＢｅＡｇ留分をＰＢＳに対して透析しそして５
００ｍ１！まで４倍に濃縮した。この透析と濃縮との作
業にはアミコン中空繊維装置が使用される。
尖旋貫主
補体結合による測定でＨａ、 Ａｇ力価かく１２８であ
る血漿２０！を２．７７％ＣａＣ１ｚの２．２１と混合
しそして複数の大型遠心器に移した。３７℃（Ｈ２Ｏ浴
）に２時間保持したのち、凝結した血漿を遠心分離にか
けて転化血清を清澄化した。その上澄み液を等量の硫酸
アンモニウム溶液（４５０ｍｇ ／ ｍ ｌ ）と混合
しそして一晩５℃で貯蔵した。生じた沈殿をＪＡ−１０
ロータ（１バッチ当りの容積３１）を用いて３０分間７
０００Ｘｇでバッチ遠心分離して捕集した。遠心分離後
のペレトを約２．２５ Ｊの生理食塩液に懸濁した。こ
の濃縮懸濁物を次に４０１の生理食塩液に対して透析し
て硫酸アンモニウムを除去した。
る血漿２０！を２．７７％ＣａＣ１ｚの２．２１と混合
しそして複数の大型遠心器に移した。３７℃（Ｈ２Ｏ浴
）に２時間保持したのち、凝結した血漿を遠心分離にか
けて転化血清を清澄化した。その上澄み液を等量の硫酸
アンモニウム溶液（４５０ｍｇ ／ ｍ ｌ ）と混合
しそして一晩５℃で貯蔵した。生じた沈殿をＪＡ−１０
ロータ（１バッチ当りの容積３１）を用いて３０分間７
０００Ｘｇでバッチ遠心分離して捕集した。遠心分離後
のペレトを約２．２５ Ｊの生理食塩液に懸濁した。こ
の濃縮懸濁物を次に４０１の生理食塩液に対して透析し
て硫酸アンモニウムを除去した。
遠心器、エレクロヌクレオニクスーにのロータにリン酸
塩緩衝液８．４００ｍ ｌを充填した。装置のガス抜き
のためロータをｉｏｏｏＯｒｐｍまでランニングさせた
のち、その定置ロータの底部へ下部の段階勾配液を送入
した。
塩緩衝液８．４００ｍ ｌを充填した。装置のガス抜き
のためロータをｉｏｏｏＯｒｐｍまでランニングさせた
のち、その定置ロータの底部へ下部の段階勾配液を送入
した。
１、１０％ＮａＢｒ２０００ｍｊ２ 、 ｄ ＝１．０
８２、２０％ＮａＢｒ１ＯＯＯｎｌ 、 ｄ ＝１．１
７３、３０％ＮａＢｒ１５００ｎｌ 、 ｄ ＝１．２
８４、４０％ＮａＮａＢｒ３９Ｏ０，ｄ ＝１．４１上
記の透析した懸濁物２２５０ｍｊ２を定置ロータの頂部
へ、底部から４０％ＮａＢｒの２２５０ｍＪを定置しな
がら導入した。しかるのち、ロータ速度を３００゜ｒｐ
ｍまで加速しそしてこの速度で１８時間運転を継続した
。ロータを停止したのち、１．０４〜１．１５ｇ／ ｃ
ｃの密度範囲にある１１８ 、Ａ ｂに富んだ物質１５
００ｍ Ｉｌを集めた。
８２、２０％ＮａＢｒ１ＯＯＯｎｌ 、 ｄ ＝１．１
７３、３０％ＮａＢｒ１５００ｎｌ 、 ｄ ＝１．２
８４、４０％ＮａＮａＢｒ３９Ｏ０，ｄ ＝１．４１上
記の透析した懸濁物２２５０ｍｊ２を定置ロータの頂部
へ、底部から４０％ＮａＢｒの２２５０ｍＪを定置しな
がら導入した。しかるのち、ロータ速度を３００゜ｒｐ
ｍまで加速しそしてこの速度で１８時間運転を継続した
。ロータを停止したのち、１．０４〜１．１５ｇ／ ｃ
ｃの密度範囲にある１１８ 、Ａ ｂに富んだ物質１５
００ｍ Ｉｌを集めた。
第２番目の捕集（３０００ｍ ｌ ）を密度がより高い
１．１７〜１．２２ｇ／ｃｃの範囲の物質について行な
った。ＨＢｓＡｇに冨むこの物質をＰＢＳに対して透析
しそして１０００ｆｆｌまで濃縮した。この操作にはア
ミコン中空繊維装置が使用された。
１．１７〜１．２２ｇ／ｃｃの範囲の物質について行な
った。ＨＢｓＡｇに冨むこの物質をＰＢＳに対して透析
しそして１０００ｆｆｌまで濃縮した。この操作にはア
ミコン中空繊維装置が使用された。
次にロータにリン酸塩緩衝液を充填し、上記と同様にガ
ス抜きしそして定置ロータの底部へ下記の段階勾配液を
送入した。
ス抜きしそして定置ロータの底部へ下記の段階勾配液を
送入した。
１．５％スクロース２０００ｍ ｌ、ｄ＝１．０２２、
１５％スクロース１６５０ｍ ｌ、ｄ＝１．０６３、２
５％スクロース１７５０ｍ ｌ、ｄ＝１．１０４、５０
％スクロース４３００ｍ ｌ、ｄ＝１．２３前記ＮａＢ
ｒ等密度パンデイング工程から得られた第２番目の高い
密度範囲留分ＩＱＯＯｍ４をロータの頂部へ、底部から
５０％スクロースの１０００＋ｎｊ７を送出しながら導
入した。このあとロータを２８００Ｏｒｐｍの速度で１
８時間運転した。ロータを停止した後に、１．０４〜１
．１５ ｇ／ｃｃ密度範囲のＨＢｅＡｂに富む留分１５
００ｍｆを捕集した。
１５％スクロース１６５０ｍ ｌ、ｄ＝１．０６３、２
５％スクロース１７５０ｍ ｌ、ｄ＝１．１０４、５０
％スクロース４３００ｍ ｌ、ｄ＝１．２３前記ＮａＢ
ｒ等密度パンデイング工程から得られた第２番目の高い
密度範囲留分ＩＱＯＯｍ４をロータの頂部へ、底部から
５０％スクロースの１０００＋ｎｊ７を送出しながら導
入した。このあとロータを２８００Ｏｒｐｍの速度で１
８時間運転した。ロータを停止した後に、１．０４〜１
．１５ ｇ／ｃｃ密度範囲のＨＢｅＡｂに富む留分１５
００ｍｆを捕集した。
等密度パンディング工程（ＮａＢｒ）ならびに速度帯域
別バンディング工程（スクロース）からの１．０４〜１
．１５密度範囲の留分を１つにまとめた（約３７り。こ
のＨＢｅＡｂ留分をＰＢＳに対して透析しそして５００
ＩＩｌｌまで６倍に濃縮した。この透析と濃縮の操作に
はアミコン中空繊維装置が使用された。
別バンディング工程（スクロース）からの１．０４〜１
．１５密度範囲の留分を１つにまとめた（約３７り。こ
のＨＢｅＡｂ留分をＰＢＳに対して透析しそして５００
ＩＩｌｌまで６倍に濃縮した。この透析と濃縮の操作に
はアミコン中空繊維装置が使用された。
大践拠主
０．８％アガロースレオフオレシス（Ａｇａｒｏｓｅ
Ｒｈｅｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）プレー） （Ａｂｂｏｔｔ
Ｌａｂｓ製）を用いて免疫拡散判定試験を実施した。
Ｒｈｅｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）プレー） （Ａｂｂｏｔｔ
Ｌａｂｓ製）を用いて免疫拡散判定試験を実施した。
プレートからプラスチックリングを慎重にはずしそして
寒天が無傷のままであるかどうかをチェックするためト
ラフにトリス緩衝液を充填した。そして６個の外側の穴
にＨＢｅＡｂの有無の判定を受ける被験血漿各５０μｌ
を充填した。実施例１のＮａＢｒによる分離段階で得ら
れたＨＢｅＡｇに富んだ物質の一部をＰＢＳに対して透
析しそして４倍に濃縮した。この濃縮物質の２０μｌを
中央の穴に充填した。このレオフオレシスプレートを調
湿したプラスチックの箱に入れて室温で培養させた。培
養７日目にその結果を記録した。沈殿が形成されたこと
で被験血漿中にＩＩ Ｂ 、Ａ ｂの存在することが確
認された。結果を最終的に記録するため、その培養プレ
ートを写真にとった。
寒天が無傷のままであるかどうかをチェックするためト
ラフにトリス緩衝液を充填した。そして６個の外側の穴
にＨＢｅＡｂの有無の判定を受ける被験血漿各５０μｌ
を充填した。実施例１のＮａＢｒによる分離段階で得ら
れたＨＢｅＡｇに富んだ物質の一部をＰＢＳに対して透
析しそして４倍に濃縮した。この濃縮物質の２０μｌを
中央の穴に充填した。このレオフオレシスプレートを調
湿したプラスチックの箱に入れて室温で培養させた。培
養７日目にその結果を記録した。沈殿が形成されたこと
で被験血漿中にＩＩ Ｂ 、Ａ ｂの存在することが確
認された。結果を最終的に記録するため、その培養プレ
ートを写真にとった。
尖施炎↓
実施例３と同様に０．８％アガロースレオフオレシスプ
レート（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ製）を用いて免疫拡散
判定試験を行なった。プレートからプラスチックリング
を慎重にはずしそして寒天が無傷のままであるかをチェ
ックするためトリス緩衝液をトラフに充填した。外側の
６個の穴にＨＢｅＡｇの存在を判定する被験血漿を各５
０μβずつ充填した。実施例２のＮａＢｒによる分離段
階で得られたＨＢｅＡｂに富む物質の一部をＰＢＳに対
して透析しそして５倍に濃縮した。この濃縮物質の２０
μｌを中央の穴に入れた。このレオフオレシスプレート
を調湿されたプラスチック箱に入れて室温で培養させた
。
レート（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ製）を用いて免疫拡散
判定試験を行なった。プレートからプラスチックリング
を慎重にはずしそして寒天が無傷のままであるかをチェ
ックするためトリス緩衝液をトラフに充填した。外側の
６個の穴にＨＢｅＡｇの存在を判定する被験血漿を各５
０μβずつ充填した。実施例２のＮａＢｒによる分離段
階で得られたＨＢｅＡｂに富む物質の一部をＰＢＳに対
して透析しそして５倍に濃縮した。この濃縮物質の２０
μｌを中央の穴に入れた。このレオフオレシスプレート
を調湿されたプラスチック箱に入れて室温で培養させた
。
培養７日目にその結果を記録した。被験血漿中の１１８
、Ａ ｇの存在が沈殿が生じることにより確認された
。結果の最終的記録として培養プレートの写真をとった
。
、Ａ ｇの存在が沈殿が生じることにより確認された
。結果の最終的記録として培養プレートの写真をとった
。
次１１粗１
ＮａＢｒによる分離段階で得られたＨＢＪｇに富んだ物
質の代りにスクロースによる分離段階で得られたＨＢＪ
ｇに冨む物質を用いて実施例４の試験をくり返した。被
験血漿中のＨＢ 、Ａ ｇの存在が沈殿の形成により確
認された。
質の代りにスクロースによる分離段階で得られたＨＢＪ
ｇに冨む物質を用いて実施例４の試験をくり返した。被
験血漿中のＨＢ 、Ａ ｇの存在が沈殿の形成により確
認された。
去隻皿旦
実施例１の最終段階で得られた合体したＨＢａＡｇ留分
の２０μｌを中央の穴に充填した点のみを相違点として
実施例３の試験を反復した。沈殿の存在が被験血漿中の
ＨＢａＡｇの存在を確認させた。
の２０μｌを中央の穴に充填した点のみを相違点として
実施例３の試験を反復した。沈殿の存在が被験血漿中の
ＨＢａＡｇの存在を確認させた。
大侮炭工
実施例２の最終段階で得られた合体したＨＢｅ＾ｇ留分
を中央の穴に充填したことをのみを相違点として実施例
４の操作を反復した。沈殿の形成により被験血漿中のＨ
ＢＪｇの存在が確認された。
を中央の穴に充填したことをのみを相違点として実施例
４の操作を反復した。沈殿の形成により被験血漿中のＨ
ＢＪｇの存在が確認された。
なお本発明の技術の態様は例えば次のとおりである。
１ 肝炎Ｂ面抗原を含有する人間の生物学的液体を等密
度バンディングにかけ、密度範囲が約１．０４乃至１．
１５ ｇ ／ｃｃである留分を回収し、そして回収され
た留分を透析しそして濃縮する段階よりなることを除去
する肝炎Ｂ０抗原または肝炎Ｂｅ抗体の単離法。
度バンディングにかけ、密度範囲が約１．０４乃至１．
１５ ｇ ／ｃｃである留分を回収し、そして回収され
た留分を透析しそして濃縮する段階よりなることを除去
する肝炎Ｂ０抗原または肝炎Ｂｅ抗体の単離法。
２ 濃縮段階で分子量が約ｉｏｏ、ｏｏｏ以下である物
質を除去する第１項の方法。
質を除去する第１項の方法。
３ 上記人間の生物学的液体が清澄化された血漿である
第１項の方法。
第１項の方法。
４ 等密度バンディングがＮａＢｒの水溶液中で実施さ
れる第１項の方法。
れる第１項の方法。
５ 補体結合によって測定されたＩＩＢｅＡｇ力価が少
なくとも約２５６であり、そしてＨＢ 、Ａ ｂが単離
される第１項の方法。
なくとも約２５６であり、そしてＨＢ 、Ａ ｂが単離
される第１項の方法。
６ 補体結合によって測定されたｏＢｉＡｇ力価が約１
２８以下であり、そしてＨＢｅＡｂが単離される第１項
の方法。
２８以下であり、そしてＨＢｅＡｂが単離される第１項
の方法。
７ 肝炎Ｂ面抗原を含有する人間の生物学的液体を等密
度バンディングにかけ、密度範囲が約１．０４乃至１．
１５ｇ／ｃｃである第１の留分を回収し、密度範囲が約
１．１７乃至１．２２ ｇ ／ ｃｃである第２の留分
を回収し、その第２の留分を透析しそして濃縮し、その
濃縮された第２の留分を速度帯域別バンディングにかけ
そして密度範囲が約１．０４乃至１、１５ ｇ ／ｃｃ
である第３留分を回収し、上記第１と第３の留分とを合
体しそしてその第２留分を透析しそして濃縮することを
除去する肝炎Ｂｅ抗原の単離法。
度バンディングにかけ、密度範囲が約１．０４乃至１．
１５ｇ／ｃｃである第１の留分を回収し、密度範囲が約
１．１７乃至１．２２ ｇ ／ ｃｃである第２の留分
を回収し、その第２の留分を透析しそして濃縮し、その
濃縮された第２の留分を速度帯域別バンディングにかけ
そして密度範囲が約１．０４乃至１、１５ ｇ ／ｃｃ
である第３留分を回収し、上記第１と第３の留分とを合
体しそしてその第２留分を透析しそして濃縮することを
除去する肝炎Ｂｅ抗原の単離法。
８ 上記人間の生物学的液体が清澄化された血漿である
第７項の方法。
第７項の方法。
９ 肝炎Ｂ面抗原を含有する人間の生物学的液体を等密
度バンディングにかけ、密度範囲が約１．０４乃至１．
１５ｇ／ｃｃである第１の留分を回収し、密度範囲が約
１．１７乃至１．２２ ｇ ／ ｃｃである第２の留分
を回収し、その第２の留分を透析し濃縮し、その濃縮し
た第２留分を速度帯域別バンディングにかけそして密度
範囲が約１．０４乃至１．１５ｇ／ｃｃである第３の留
分を回収し、第１と第３の留分とを合体しそして合体し
た留分を透析且つ濃縮することを除去する肝炎Ｂ０抗体
の単離法。
度バンディングにかけ、密度範囲が約１．０４乃至１．
１５ｇ／ｃｃである第１の留分を回収し、密度範囲が約
１．１７乃至１．２２ ｇ ／ ｃｃである第２の留分
を回収し、その第２の留分を透析し濃縮し、その濃縮し
た第２留分を速度帯域別バンディングにかけそして密度
範囲が約１．０４乃至１．１５ｇ／ｃｃである第３の留
分を回収し、第１と第３の留分とを合体しそして合体し
た留分を透析且つ濃縮することを除去する肝炎Ｂ０抗体
の単離法。
１０ 上記人間の生物学的液体が清澄化した血漿であ
る第９項の方法。
る第９項の方法。
出願人 ： メルク エンド カムパニーインコーポレ
ーテソド
ーテソド
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 肝炎Ｂ面抗原を含有する人間の生物学的液体を等密
度バンディングにかけ、密度範囲が約１．０４乃至１．
１５ｇ／ｃｃである留分を回収し、そして回収された留
分を透析しそして濃縮する段階よりなることを特徴とす
る肝炎Ｂｅ抗体の単離法。 ２ 濃縮段階で分子量が約１００，０００以下である物
質を除去する特許請求の範囲第１項の方法。 ３ 上記人間の生物学的液体が清澄化された血漿である
特許請求の範囲第１項の方法。 ４ 等密度バンディングがＮａＢｒの水溶液中で実施さ
れる特許請求の範囲第１項の方法。 ５ 補体結合によって測定されたＨＢ＿ｓＡｇ力価が約
１２８以下であり、そしてＨＢ＿ｅＡｂが単離される特
許請求の範囲第１項の方法。 ６ 肝炎Ｂ面抗原を含有する人間の生物学的液体を等密
度バンディングにかけ、密度範囲が約１．０４乃至１．
１５ｇ／ｃｃである第１の留分を回収し、密度範囲が約
１．１７乃至１．２２ｇ／ｃｃである第２の留分を回収
し、その第２の留分を透析し濃縮し、その濃縮した第２
留分を速度帯域別バンディングにかけそして密度範囲が
約１．０４乃至１．１５ｇ／ｃｃである第３の留分を回
収し、第１と第３の留分とを合体しそして合体した留分
を透析且つ濃縮することを特徴とする肝炎Ｂｅ抗体の単
離法。 ７ 上記人間の生物学的液体が清澄化した血漿である特
許請求の範囲第６項の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/968,896 US4204989A (en) | 1978-12-13 | 1978-12-13 | Isolation of hepatitis B e antigen |
| US968,896 | 1992-10-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63264499A true JPS63264499A (ja) | 1988-11-01 |
| JPH0240987B2 JPH0240987B2 (ja) | 1990-09-14 |
Family
ID=25514908
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16215579A Granted JPS5583714A (en) | 1978-12-13 | 1979-12-13 | Isolation of hepatitis be antigen |
| JP63065867A Granted JPS63264499A (ja) | 1978-12-13 | 1988-03-22 | 肝炎Ｂｅ抗体の単離法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16215579A Granted JPS5583714A (en) | 1978-12-13 | 1979-12-13 | Isolation of hepatitis be antigen |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4204989A (ja) |
| EP (1) | EP0012686B1 (ja) |
| JP (2) | JPS5583714A (ja) |
| AT (1) | ATE2048T1 (ja) |
| CA (1) | CA1129768A (ja) |
| DE (1) | DE2964390D1 (ja) |
| DK (1) | DK528279A (ja) |
| IE (1) | IE48665B1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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