JPS6324889A - Ｄｎａエレメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉ
ａｅ）　（Ｃ、ジフセリエ又はジフテリア菌と称す）の
菌株の染色体ＤＮＡの異なる部位に１又はそれ以上のコ
ピー数で存在し、菌株特異的ハイブリダイゼーションプ
ローブの調製に使用されるＤＮＡエレメントに係る。

本発明は、さらに、前記挿入エレメント又はそのフラグ
メントを含有するＤＮＡセグメントを有するクローニン
グセグメントの導入によって得られた組換ＤＮＡ分子、
及びかかる組換ＤＮＡ分子によって形質転換せしめた微
生物にも係る。

さらに、本発明は、Ｃ，ジフセリエ菌株の特徴づけ及び
疫学上の研究における上記ハイブリダイゼーションプロ
ーブの使用にも係る。

ジフテリアは、人、特に幼児に対し、粘膜の線維性滲出
物の形成及び壊死を伴なう局部的障害を生ずる感染症で
ある。

その臨床過程では、発熱及び貧血の如き一般的炙 症状を伴い、）も重篤な場合には、仕ん妄、度牽及び循
環系及び腎臓の障害を伴なう。

さらに、治療の間に、摩痺を伴なう心筋炎の合併症を生
ずることがあり、場合によっては心′Ｊ＆摩痺により死
に至ることがある。

ジフテリアの病因は、毒素暗号化遺伝子（ｔａｘ）を含
有するテンペレートファージによる溶原化の後、ジフテ
リア毒素を産生ずる能力を獲得するゲノム陽性のジフテ
リア菌である。

Ｃ，ジフセリエの菌株は、病原性のレベルの相同じ種類
の中でも、たとえ異なる毒素産生能を示したとしても、
そのバクテリオファージに基き容易には形態的に区別さ
れ得ない菌株も存在する。

現在、ジフテリアの診断の確認は、たとえば適しかし、
培養法は煩雑であり、事実、長い分析時間を必要とし、
サンプルの輸送及び試験の間、細菌を生かした状態に維
持しておく必要がある。

しかも、この方法では、健康な人間の咽頭及び唾液中に
比較的よく存在するＣ、ホッフマニ（Ｃ。

ｈｏｆｆｍａｎｉ）及びＣ，ケロシス（Ｃ、ｘｅｒｏｓ
ｉｓ）の如き偽ジフテリア菌（ジフテリア菌と非常に似
た形態及び培養上の特性を有する）から常にジフテリア
菌を区別できるというわけではない。

要するに、これらの分別法は操作時間が長いこと及び特
異性に乏しいこと等の多数の欠点を示す。

このため、常法の欠点を解消しうる他の利用可能な診断
法の開発が必要とされている。

これら新しい診断法の１つとして、たとえばヌクレオチ
ドハイブリダイゼーション法がある。この方法では、Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡのフラグメント　（これらのヌクレオチ
ド配列は、細菌のゲノムの配列と相捕的又は相同的であ
る）を使用することにより、サンプル中における病原体
の存在を高い効率でかつ特異的に検出できる。

ヌクレオチドハイブリダイゼーションの使用は、必然的
に、ＤＮＡの二重ら線構造及びヌクレオチド塩基間の相
補性に基くものである。かかる方法に従って操作するこ
とにより、各ＤＮＡら線棒の塩基間の水素結合が適当な
条件下で切断され、この変性により生じた各ら線棒の１
つを、適当に標識化したＤＮＡ又はＲＮＡ＠と接触させ
る。後者のハイブリダイゼーションプローブ（前者のら
線棒と充分に相捕的又は相同的な塩基配列を含有する）
は、適当な反応条件下で、ＤＮＡ／ＤＮＡ　、　ＤＮＡ
／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡの如きハイブリッドを生成
する。

このようなハイブリダイゼーション法はＤＮＡ配列を決
定するものであることから、反復ＤＮＡ配列を認識しう
るプローブが使用できれば、かかる方法の感度及び特異
性を改善できることが想起される。

さらに、この反復配列が種特異性又は菌株特異性であれ
ば、この配列を認識しうるプローブも種特異性又は菌株
特異性である。

一般に、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブはかかるプローブが
目的の細菌のいずれに必須的に存在する塩基の配列を含
むことを基準として選択される。

ハイブリダイゼーションプローブの調製に使用される相
同塩基配列は遺伝子又はそのフラグメント　（細菌にお
ける安定性は知られているか、あるいは実験法により測
定される）から選択される。

選択される遺伝子は構造遺伝子、調節遺伝子又は各種の
作用を果たす遺伝子である。

さら２こ、プローブは、膜タンパク質を暗号化する遺伝
子、挿入配列を暗号化する遺伝子、トランスボゾン等か
ら選択される。

特に、転置エレメントは、塩基対数５００ないしｔｏ、
０００でなり、これ自体細菌ゲノムの異なる位置にシフ
ト及び挿入される　（いわゆる転置と称される）ＤＮＡ
配列である。

転置は宿主細胞の遺伝子の活性化又は不活性化を生じ、
遺伝的変異性の発現の機構を構成する。

これらのエレメントは、実際、遺伝子の近く又は遺伝子
内に挿入される際、その作用を発揮し、一方、挿入位置
から離れる際には、遺伝子がその作用を再度発揮し、本
来の表現型が回復する。

細菌の転置エレメントは下記の３種類に分類される。

−単純（ｓｉｍｐｌｅ）　トランスボゾン又は単純Ｉｓ
エレメント； −配合（ｃｏｍｐｏｓｅｄ）　トランスボゾン又はＴＮ
。

及び −複合（ｃｏｍｐｌｅｘ）　ｈランスポゾン特に、Ｉｓ
エレメント　（その挿入配列は細菌ゲノムの標準的な構
成要素である）は、塩基対８００ないし２０００のサイ
ズを有し、その各末端に、互いに逆方向の短い繰返し塩
基配列を有する。

さらに、挿入部位では、Ｉｓは、一般に塩基対５ないし
９個でなる短い２つの同方向の同一配列を側面に有して
いる　（その長さは定められたトランスポゾンに対して
一定である）。

原核生物では、Ｉｓ及びＴＮエレメントは遍在し、染色
体、プラスミド及びバクテリオファージ中に見出だされ
る。しかしながら、技術文献中に記載されたＩｓ及びＴ
Ｎエレメントの多くは、Ｅ　コリ１又は他のゲノム陰性
菌から単離されており、ゲノム陽性菌、特にジフテリア
菌中にこれらエレメントが存在することに関してはほと
んど知られていない。

ジフテリア菌に関してかかるエレメントを利用できない
ため、そのゲノム（あまり知られていない）を研究する
ことは不可能であった。

発明者らは、Ｉｓ挿入エレメントの代表的な特性が付与
され、ジフテリア菌の染色体ＤＮＡ内においてｌ又はそ
れ以上のコピー数でかつ異なる部位に存在するＤｌｆＡ
エレメントを見出した（これにより、従来の問題点を解
消できる）。

本発明は、ジフテリア毒素の構造遺伝子に挿入されかつ
γ−バクテリオファージのｔＯｘ−表現型に関するＤＮ
ＡセグメントがＩｓ挿入エレメントの代表的な特性を発
現すること、及びこのエレメントがジフテリア菌の染色
体ＤＮＡ内に１又はそれ以上のコピー数でかつ異なる部
位に存在するとの知見に基きなされたものである。

上述の如く、本発明の目的は、Ｉｓ挿入エレメントの代
表的な特性が付与され、ジフテリア菌の染色体ＤＮＡ中
に１又はそれ以上のコピー数でかつ異的 なる部位に存在し、菌株特異ベハイブリダイゼーション
プローブの調製に使用される塩基対約１　、５００のＤ
ＮＡエレメントにある。

本発明の他の目的は、上記Ｉｓエレメント又はそのフラ
グメントを含有するＤＮＡセグメントとクローニングベ
クターとの結合により得られる組換ＤＮＡ分子、及びこ
の組換ＤＮＡ分子によって形質転換せしめた微生物にあ
る。

本発明のさらに他の目的は、ジフテリア菌の菌株の特徴
づけ及び疫学上の研究に利用されるハイブリダイゼーシ
ョンプローブの調製に上記ＩＳエレメント又はそのフラ
グメントを使用することにある。

本発明のさらに他の目的については下記の記載及び実施
例から明らかになるであろう。

本発明によれば、γ−バクテリオファージのｔｏｘ−遺
伝子に挿入されたＤＮＡエレメントをクローン化し、そ
の配列を公知の方法に従って分析する。

特に、ジフテリア菌の菌株の溶原菌ファージＣ７ンＣを
濃度０，３ないし０．８１１９／ｘ（！で添加すること
によって誘導する。

ついで、細胞懸濁液を遠心分離し、ファージを含有する
上澄液を回収する。

この上澄液の一定量（ファージ訃１０７ないし５・ＩＯ
１′を含有する）を、ジフテリア菌Ｃ７（）ｔｏｘ−培
養基を感染仕しめるために使用する。

溶原菌ファージ及びジフテリア菌Ｃ７（−）ＬｏＸ−の
細胞の混合物を３７°Ｃにおいて適当な培養基に推持し
、細胞を完全に溶解さける。

溶解反応後、反応混合物にポリエチレングリコールを添
加してファージを沈殿せしめ、ついでＹａｍａｍｏｔｏ
らの方法（「パイラロジー（Ｙｉｒｏｌｏｇｙ）Ｊ４０
　、７．３４−７４４　（１９７０））に従って塩化セ
シウム勾配で精製する。

↓ このようにして精製したファージ混合物６５℃に１０分
間維持し、ついでＯ，，５Ｍ　ＮａＣＱを添加し、０℃
にさらに１５分間維持して、ファージＤＮＡを抽出する
。

ファージＤＮＡをエタノール２．５容で沈殿せしめ、こ
れを分離し、緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁化させた後、
フェノール及びクロロホルムで抽出する。抽出終了時、
ファージＤＮＡを再度１ｌＳＩｌ：殿させ、分離後、再
びリン酸塩緩衝液（ｐＨＬＯ）に野田化させる。

このようにして得られたファージＤＮＡを、制限酵素Ｂ
ａｍ旧によって、この酵素の製造者によって指示された
方法に従って消化せしめ、消化混合物を１．３％アガロ
ースゲルに充填し、１００ｖで分画する。

ついで、毒素の構造遺伝子及び挿入エレメントを含む塩
基対５，４００のＢａｎ旧を電気溶出する。

このＢａｍ旧フラグメントを酵素旧ｎｄ　ｍで消化し、
酵素Ｃ１ａ　Ｉで部分的に消化する。

消化混合物を１％アガロースゲルに充填し、塩基対約２
，５００のＨｉｎｄ　ＩＩＩ　−Ｃ１ａ　ｆ　　フラグ
メントを電気溶出する。

このフラグメントは挿入エレメントの全配列及びｔｏｘ
遺伝子の５′末端部（Ｃ１ａ　Ｉ部位まで）を含有する
ものである。

ｔｏｘ遺伝子のヌクレオチド配列は既知であるため、挿
入エレメントのサイズを推論できる。挿入エレメントは
塩基対（ｂｐ）　ｔ、　５００で形成されていることが
わかる。

本発明に従って、ついでＬ　、　５０Ｑｂｐエレメント
の制限酵素地図（第１図及び第２図）及びそのヌクレオ
チド配列（第３Ａ図）を決定する。

分析では、両末端の配列が互いに逆方向の繰返し不完全
配列（４０ヌクレオチドの長さ）を形成していることを
示す（第３Ｂ図）。

さらに、挿入直前のｔｏｘ遺伝子の９塩基対がその端部
で繰返されていること、及び互いに逆方向の繰返し配列
内に、転置機構に含まれるタンパク質を暗号化するポテ
ンシャル遺伝子が存在することが観察される。

上記エレメントのサイズ、末端部の構造及び上記遺伝子
の存在は、細菌のＩｓ挿入エレメントに関して予想され
る特性とすべて一致する。

従って、γ−バクテリオファージのｔｏｘ遺伝子に挿入
されたＤＮＡエレメントがＩｓ挿入エレメントであると
結論される。

このエレメントに認識コード１ｓｃａｌを付与する。ｌ
５ｃａｌを含有する２、５００　ｂｐフラグメントを、
適当なベクターにクローン化することにより増幅及び精
製する（適当な制限酵素で消化することによって、この
フラグメントが得られる）。

この目的全通するクローニングベクターは当分野で使用
されるものの中から選択される。特に、Ｄｅｎｔｅらに
よって開示された（「ヌクレイツク・アシツズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）
１１　。

１６４５−１６５５　（１９８３））Ｅ　、コリーのプ
ラスミドｐＥＭＢＬ８を使用する。

本発明に従って、プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
　ＩＩＩ及びＡｃｅ　Ｉで切断し、つづいて、公知の常
法に従って、Ｔ　、　−ＤＮＡリガーゼの存在下、Ｈｉ
ｎｄｍ　−Ｃ１ａ　（ＤＮＡフラグメント（２，５００
ｂｐ）に結合させる。ついで、リガーゼ混合物をＥ、コ
リーＪＭ１０１（ＢＲＬ）のコンピテント菌の形質転換
に使用し、形質転換された菌を、アンピシリン（１００
γ／ｄ）を添加したＬＢ含有平板（ＤＩＦＣＯ）上、ア
ンピシリン耐性に基いて選択する。

陽性のクローンの１つから、ｐＥＭ　ＢＬ８及び２．５
００　ｂｐ　Ｈｉｎｄ　［［−Ｃ１ａｌ　　フラグメン
トでなる組換ＤＮＡ分子を単離する（第２図）。

この分子に認識コードｐＤｒ　２　　を付与する。なお
、この分子によって形質転換せしめたＥ。コリーＪＭ６
７０１１として寄託している。

本発明によれば、ついで、サザーンブロットハイブリダ
イゼーションによって、ジフテリア菌の染色体ＤＮＡに
おける挿入エレメントｌ５ｃｄ　１の存在を確認する。

この目的のため、ハイブリダイゼーションプローブの調
製にあたり、公知の一般法の１つに従って標識化した１
　、　５００ｂｐの全ｌ５ｃａｌ又はその制限フラグメ
ントを使用できる。

本発明の好適な１具体例によれば、ニックトランスレー
ンヨンによって標識化した６００ｂｐの制限フラグメン
トＤ−ＳａｌＩが使用できる。

特に、ジフテリア菌の菌株の染色体ＤＮＡを各種の制限
酵素で消化し、得られたフラグメントを、サザーンプロ
ット法（「ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ　、　Ｓｉ２０．　Ｂｉｏｌ、）Ｊ旦、５０３
−５１７，１９７５）に従って、ハイブリダイゼーショ
ン溶液中、Ｄ−Ｓａｌ？プローブとハイブリダイズさせ
る。

その結果、異なる菌株に関して異なる数のハイブリダイ
ゼーションバンドを示す。特に、Ｃ，ノフセリエ・ベル
ファンティ（ｂｅｌｆａｎｔｉ）１０３０については、
１５ないし２５個のハイブリダイゼーションバンドが確
認され、一方、Ｃ，ジフセリエＣ７（−）ｔｏ”−につ
いては、ただ２つのハイブリダイゼーションバンドが確
認されるのみである。

これらの結果を証明するため、Ｃ，ジフセリエ・ベルフ
ァンティ　１０３０を原料として生成されたゲノムライ
ブラリーを、Ｄ−３ａｌｌフラグメントに相同の配列に
関する平板−ハイブリダイゼーションによって分析する
。

陽性のクローン、すなわちＤ−８ａｌＩとハイブリダイ
ゼーションを生ずるものについて、制限酵素Ｂｇｌ　Ｉ
　ＳＢａｍ旧、ＨｉｎｄＩ［ｌ、ＥｃｏＲＩ及びＳａ目
による遺伝地図の作製を行なう。このようにして、その
９０％が約１．５００ｂｐのＤＩＩＡセグメント（その
制限地図はｌ５ｃａｌのものと同一）を含有しているこ
とがわかる。

さらに、制限フラグメントＢ、Ｃ及びＤの長さはいずれ
のクローンにおいても同一であるが、制限フラグメント
Ａ及びＥの長さは各クローンにおいて各々最小５００−
７ＱＱｂｐから最大９．ＱＱＱ−ＬＱ、Ｑ（ＩＱｂｐま
での範囲であることが観察される。

本発明によれば、制限フラグメントＤ−３ａｌＩから得
られたハイブリダイゼーションプローブにツクトランス
レーションにより標識化したもの）を、従来の細菌学法
により又は染色体ＤＩＪＡの遺伝地図作製によって既に
検討されているジフテリア菌の各種菌株についての疫学
的検討に使用する。この場合、既知の結果と単に一致す
るだけでなく極めて明確な結果が得られ、しかも従来の
ものと比ベサイクリン耐性菌株に関してハイブリダイゼ
ーション方式が同一であり、従ってテトラサイクリン耐
性はジフテリア菌のテトラサイクリン感受性菌株によっ
て新たに獲得された特性であることが示された。

さらに、染色体ＤＮＡの分析により、米国、カナダ、ス
ウェーデン、オーストリア及びインドネシアで単離され
た菌殊における上記エレメントｌ５ｃｄ■の存在が確認
され、ｌ５ｃｄｌの染色体分布が、同一地域においてか
つ同一時期において単離された菌株では一致するが、異
なる地域において異なる時期に単利された同じ菌株では
相違することがわかった。

これら結果は、エレメントｌ５ｃａｌがジフテリア菌の
多くの菌株に存在すること、このエレメントの転置の発
生は菌株特異的であることを示している。

従って、１ｓｃａｌ又はその制限フラグメントを、診断
及びジフテリア菌の各菌株の疫学的研究で利用されろハ
イブリダイゼーションプローブの調製に使用できる。

次に、図面について述べる。

第１図は、Ｉｓ　ｃａｌ　　ＤＮＡエレメントの制限地
図を示す。制限フラグメントのサイズは、Ａ＝３００ｂ
ｐＸＢ＝２７０ｂｐ、　Ｃ＝１８０ｂｐ、　Ｄ＝６００
ｂｐ及びＥ−１５０ｂｐである。

第２図は、ハイブリッドプラスミドｐＤｒ　２　　の制
限地図である。

第３Ａ図は、γ−バクテリオファージのジフテリア毒素
の遺伝子内に挿入されるｌ５ｃａｌ　　挿入エレメント
のヌクレオチド配列を示す。小文字で示す配列は、ｌ５
ｃａｌエレメントが挿入されるジフテリア毒素の遺伝子
に属する。１ｓｃａｌの両端で繰返す配列ＧＧＡＴＡＧ
ＧＧＧを下線で示す。

第３Ｂ図は、ｌ５ｃａｌエレメントの末端のヌクレオチ
ド配列を示すもので、これらが互いに逆方向の繰返し配
列（図に示す２次構造を形成しうる）により如何に構成
されるかを示す。小文字の配列は、ｌ５ｃａｌエレメン
トが挿入されるジフテリア毒素の遺伝子に属する。これ
に対して、下線で示す配列は、挿入エレメントの基点及
び終点で繰返される配列である。

第４図は、各種の制限酵素で切断し、Ｄ−３ａｌｌ制限
フラグメント（６００ｂｐ）とハイブリダイズさせたＣ
、ジフセリエ・ベルファンティ１０３０の染色体ＤＮＡ
のサザーンプロットを示す。

第５八図ないし第５Ｄ図は、Ｂａｍ旧での消化によって
、各種ジフテリア菌から得られた染色体ＤＮＡのサザー
ンプロットを示す。ハイブリダイゼーションプローブと
してＤ−３ａｌｌを使用する。

さらに詳しくは、第５Ａ図はスウェーデンで単離された
菌株に係り、ラインｌないし４はジフテリア菌ｍ１ｔｉ
ｓ　ＣＣＵＧ（カルチャー・コレクション、ユニパージ
ティー・才ブ・イエーテボにル（Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｏ’
ｔｅｂｏｒｇ　））　１５９３５．１６５７４、１７９
０３及び１？２８９菌株からそれぞれ得られたＤＮＡを
含有し、ライン５及び６はジフテリア菌ｇｒａｖｉｓ　
ＣＣＵＧ　１？２７４及び１？１４１菌株から得られた
ＤＮＡを含有する。

第５Ｂ図は、インドネシアで単離されたジフテリア菌（
Ｕ、Ｓ、Ｎａｖａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｕｎｉｔから供給されたもの）に係り、ライン１及
び２はテトラサイクリン耐性菌株１０５及び１２６のＤ
ＮＡを含有し、ライン３及び４はテトラサイクリン感受
性菌株２２７及び４０２のＤＮＡを含有する。

第５Ｃ図は、トロントで単離されたジフテリア菌の菌株
ＡＳＢ及びＣ（ハワード大学、微生物研究所から得たも
の）に係る。第１のラインはＣ，ジフセリエ・ベルファ
ンティ１０３０の染色体ＤＮＡを含有し、菌株Ａ及びＢ
のバンドの多くはＣ９ジフセリエ・ベルファンティ１０
３０のものと同様に移動する。

第５Ｄ図は、マンチェスターで単離されたジフテリア菌
の菌株（同じくハワード大学、微生物研究所から得たも
の）に係る。

以下の実施例は本発明を説明するためのもので、限定す
るものではない。

実施例１ ジフテリア菌Ｃ７（γ）（Ｂｕｃｋ　Ｇ、　ら［ジャー
ナル・才ブ・バクチリアル（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
）Ｊ　１４８　、１４３−１５嶌、　１９８１）の細胞
を、ＰＴＹ培地ＬＯＯｚＱ中、３７°Ｃで１夜培養した
。なお、この培地は下記の組成を有する。

組成 カサミノ酸（Ｄｉｆ’ｃｏ）　　　　　　１０　９１．
０％Ｌ−トリプトファン　　１０　　ｘσ溶液ＩＩ　　
　　　　　　　　　　２．ＯｍＱ水　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ｔＱ組成中の溶液■及び■の組成
を次表に示す。

溶液■ Ｍｇ５Ｏ＋・７　Ｈ，０２２，５９ β−アラニン　　　　　　　　１１５　　Ｎニコチン酸
　　　　　　　　１１５　　ｍｇ（ｕ、ｏｔｘｃを添加
し、ついで ａ＋１ｃＱを添加。溶解後、溶液 の他の成分を添加。） ピメリン酸　　　　　　　　　　７　、５ｍｇ１％Ｃｕ
ＳＯ４・５ＨｔＯ５ｙｔＱ １％ＺｎＳＯ４・５ＨｚＯ４ＲＱ １％ＭｎＣＬ　・４ＨｔＯ１，５ｘｄ ｆｉｔｌｃ１２３　　ｍ（１ 水　　　　　　　全量を１ｏｏｘＱとする量溶液■ Ｌ−シスチン　　　　　　　　２０　９ｌ 濃１ｔ（４２０！ 水　　　　　　　全量を１００ｕｆ２とする量上記培地
を１１５℃で１５分間殺菌し、使用前に、殺菌した下記
５０％マルトース−０，５％ＣａＣｌ２１溶液３、Ｏｍ
Ｑを添加した。

マルトース−ＣａＲ’ｚ溶液 マルトース　　　　　　　　　５０　９５０％ＣａＣＱ
＊　　　　　　　　　　　２　　ｚ（ＩＫＨｔＰＯ４１
９ （全量を１００１１１２に調整し、ＰＨを７．４に調整
し、ｗｈａｔｍａｎ　４０１Ｐ紙で濾過し、その後オー
トク レープで処理する） ついで、光学密度（５９０ｎｍで測定）０．１となるま
で培養物をＰＴＹ培地で希釈し、光学密度（５９０ｎｍ
で測定）０．４となるまで３７℃に維持した。

この時間の経過後、培養物にマイトマイシンＣＯ，５ｔ
ｎ９／ｘＱを添加し、室温に２時間推持した後、遠心分
離し、上澄液（１０８フアージ／１ｒｔＱを含有）を回
収した。

ファージ混合物１＋ｆ２を、光学密度０．３となるまで
培養したジフテリア菌Ｃ７（）ｊＯＸ″培養物０．１ｚ
Ｑの感染に使用した。

実際には、ファージ及びジフテリア菌 Ｃ７（−）ｔｏｘ−ノ細胞ヲＰＴＹトッフ・アーカー３
ＲＱ中で配合し、この配合物をＰＴＹ培地−アーガー平
板上に接種することにより実施した。

３７℃で１夜放置した後、ファージ（細胞を完全に溶解
させた）を集め、１０．ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心分
離することによってアーガーから分離し、ＰＴＹ培地３
ＱＯｘ（中、光学密度０．２５のジフテリア菌Ｃ７（−
）”ｘ−の培養物の感染に使用した。

で１ ついで、細胞を光学密度的０．８−０．９ま入育生し、
細胞溶解反応の開始（光学密度の急激な低下により検知
）後直ちに、クロロホルム５１を添加した。

培養物を３７℃に３０分間維持することによって細胞溶
解反応を完了させた。

この時間の経過後、Ｙａｍａｍｏｔｏの記載の如く、ポ
リエチレングリコール及び塩化セシウムによる勾配によ
ってファージを沈殿さ仕た。

ついでファージを１０ｍＭ　）リス緩衝液、１　ｍＭ　
ＥＤＴＡ（ｐＨａ、ｏ）に対して透析して残留する塩化
セシウムを除去し、最終濃度が０．５％となるまで硫酸
ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を添加した。

このようにして得られた混合物を６５℃に１０分間、０
℃に１５分間ｆａ持し、最終へ度が０．５Ｍ　となるま
でＮａＣｌ２を添加し、さらに０℃に１５分間維持し、
最後に遠心分離した。等量のイソプロパツールを添加す
ることによって沈殿させた後、ファージＤＮＡを反応混
合物から遠心分離し、ｌｏｍＭ　トリス、１ｍＭＥＤＴ
Ａ（ｐｆ（８，０）（１，５ａｇ中に懸濁化し、７　ｘ
　／　−ルＱ、５峠で２回、クロロホルム０．５ｚＱで
２回抽出した。

８．０）　０．５尻Ｑに再び懸濁化した。

ファージＤＮＡ　１０μ９を制限酵素Ｂａｍ旧１０単位
（Ｕ）により、この酵素の製造者（ＢＲＬ）によって指
示された方法に従って操作して消化せしめ、消化混合物
を酢酸塩緩衝液（５０ｍＭ　）リス、２０ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ、１８Ｊ　ＮａＣＱ　）中１．３％アガロースゲル
に充填し、電位差ＩＱＯＶを通電した。

毒素遺伝子及び挿入エレメントを含有する塩基対５，４
００のＢａｍ旧フラグメントを電気溶出し、つづいて酵
素ｔｌｉｎｄ　ＩＩＩ　ＬＯＵにより、つづいて、酵素
Ｃ１ａＩＩＵにより部分的に切断した（各々、酵素製造
者の指示した方法に従って操作した）。

全消化、混合物を１％アガロースゲルに充填し、塩基対
約２，５００の旧ｎｄｌＩ［−Ｃ１ａ　Ｉフラグメント
を電気溶出した。

上記フラグメント（２００ｂｐ）は全挿入エレメント及
びＣ１ａ　１部位までの毒素遺伝子の５′末端部を含有
する。

エレメントが挿入された毒素遺伝子のヌクレオチド配列
が既知であることに基き該エレメントのサイズを算定し
た。この結果、約１，５００ｂｐであった。

第２図にエレメント１．５００　ｂｐの制限地図を示す
。

その制限フラグメントのサイズはＡ＝３００　ｂｐＳＢ
＝２７０ｂｐＳＣ＝Ｌ８Ｑｂｐ１ｐ＝ａｏｏｂｐ及びＥ
　＝　１５０ｂｐである。

ついで、２，５００ｂｐのＨｉｎｄｌＩ［−Ｃ１ａ　Ｉ
フラグメントを、予じめＨｉｎｄＩＩ［ＩＵ及びＡｃｃ
ＩＩＵで切断したプラスミドｐＥＭ　ＢＬ８にクローン
化せしめた。

このようにして得られたハイブリッド分子（ｐＤｒ２と
称する）を使用して、Ｅ、コリ菟ＪＭＩＯＩ（ＢＲＬ）
の細胞を形質転換さｔ＋鵠だ。

ｐＤｒ２ハイブリッドを単一フィラメントベクターＭＨ
ｍｐ８及びｍｐ９にサブクローン化することによって、
全挿入エレメントのヌクレオチド配列の確認が可能とな
った。

図面（第３Ａ図及び第３Ｂ図）に示す結果は、挿入エレ
メント直前の毒素遺伝子の塩基対９個が挿入エレメント
の末端で繰返されていることを表わす。

挿入エレメントの２つの末端の配列は、ヌクレォチド４
０個以上に伸びる互いに逆方向の不完全な繰返し配列を
形成する。さらに、２つの逆方向の繰返し配列の間には
、転置機構に関与するタンパク質を暗号化するポテンシ
ャル遺伝子が存在する。

このようにして得られたＩｓ挿入エレメントをｌ５ｃａ
ｌと称する。

実施例２ ントの使用 ハイブリッドプラスミドｐＤｒ　２　１０９を、制限酵
素５ａｌＩ’　２０Ｕにより、製造者の指示による方法
に従って消化せしめた。

このようにして消化したＤＮＡを１，５％アガロースゲ
ルに充填し、１００Ｖで２時間泳動した。

この時間の経過時、ゲル上に２つの良好に分離されたバ
ンドが観察された。１つは約６．ＱＯＯｂｐのもので、
他はｌ５ｃａｌエレメントのＤ−３ａｌｔ　　フラグメ
ントに相当する６００ｂｐのものであった。

６００ｂｐフラグメントをゲルから電気溶出し、エタノ
ールで沈殿さ亡て相同形として、回収した。

精製したフラグメントをニックトランスレーンヨンによ
り標識化し、ジフテリア菌の各種菌株からの変性染色体
ＤＮＡを含有するニトロセルロースフィルター上でのハ
イブリダイゼーションプローブとして使用した。

ハイブリダイゼーションを、５ＸＳＳＣ培地（ＩＸＳＳ
Ｃ＝０．’ｉ５Ｍ　ＮａＣＱ、　０．０１５％　Ｍ　ク
エン酸ナトリウム）（ｐＨ７，２）上、６５℃、２０時
間で実施した。

ハイブリダイゼーション終了後、フィルターを２　Ｘ　
ＳＳＣ５（ｍ２により３回、合計２時間で洗浄し、つい
でオートラジオグラフィーにかげた。

照射時間１８ないし４８時間後、フィルムを現像し、検
討した。

実施例３ Ｃ，リフセリエ・ベルファンティ１０３０（Ｒａｐｐｕ
ｏｌｉＲｌらｒＪ、　Ｎ１ｒｏ１．Ｊ　４５　、５２４
−５３０　（１９８３））をｐ’ｒｙ培地１００ｉｌＪ
中、３７℃で１夜育生し、この培養物０　、　ｈｔＱを
予じめ殺菌したＰＴＹ培地１０ｙｎＱに接種した。培養
基をゆるやかに撹拌しながら（２０Ｏｒｐｍ）、３７℃
で３時間インギュベートシ、ペニシリンＧｌμｇ／Ｊを
添加後、３７℃に３時間維持した。

この時間の経過後、遠沈によって細胞を培養基から分離
し、ｌｏｍＭ　トリス、０，５Ｍサッカロース、５　ｕ
／　ｍＱリゾチーム溶液（ｐＨＣ２）　２　ｘＱ中に懸
濁化させた。

ついで、細胞懸濁液を３７°Ｃに１０分間維持し、遠心
分離し、分離した細胞をｌｏｍＭ　トリス、ｌＯ＋ｎＪ
　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，２）に再度懸濁化させた。

この溶液に２０％ＳＤＳ　４０μＱを添加することによ
り、細胞を６５℃で２０分間溶解させた。

ついで、細胞懸濁液を３７°Ｃに冷却し、プロナーゼ５
０ｍｇ／ｒｐＱを含有する溶液５０μ９／ｍＱを添加し
た。

培養物を３７℃で１夜インキユベートし、フェノール０
　、５ｘＣで１回、フェノール０，５１で２回、りるこ
とにより、反応混合物から染色体ＤＮＡを沈殿させた。

沈殿したＤＮＡを１０，０００　ｒｐｍで２０分間遠沈
して分離し、水１００μσ中に再び懸濁化させた（最終
濃度ｌμｇ／μり）。

ＤＮＡ３μ９を制限酵素Ｂｇｌｌ、Ｘｈｏ　ｒ、Ｃ１ａ
　Ｉ、ＥｃｏＲＩ　、　ＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＢａｍＨＩ
（各々５Ｕ）で消化し、消化混合物をトリス−酢酸塩緩
衝液中の１．３％−アガロースゲルに充填した。

ｔｔｏｖ　で４時間分画した後、サザーンプロット法に
従い、ゲルを除去し、エチジウムブロマイドで着色し、
ニトロセルロースフィルター上に移した。

から得られた１５ないし２５個のフラグメントとハイブ
リダイズすることを表していた。

このプローブは個々のＳａＬ　Ｉフラグメントを明確に
認識するものである。従って、Ｃ，ジフセリエ・ベルフ
ァンティ　１０３０の染色体中には、フラグメントＤに
相同の配列が複数のコピー数でかつ異なる部位に存在す
ることを表す。

ジフテリア菌Ｃ７（）ｔｏｘ−について行なった同じテ
ストでは、ハイブリダイゼーションの２つのバンドを示
し、従って２個のｌ５ｃａｌ　　エレメントの存在を表
した。

これらの事実を説明するため、ＡＥＭＢＬ４　ベクター
（ＦｒｉｓｈａｕｒＡ、ら「ジャーナル・オフ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）
Ｊ　ｌ’リー、８２７−８４２　（１９’Ｈ））に関す
るジフテリア菌の遺伝子ライブラリーを、Ｄ−３ａｉｌ
フラグメントと相同の配列を同定するため、平板上での
ハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。

平板１２０個でテストを行ない、陽性のクローン１４個
を見出した。これらクローンのうち１２個について制限
酵素Ｂａｌ　Ｉ　、　Ｂａｌ１ｌＨＩ　、　Ｈｉｎｄｎ
、ＥｃｏＲＩ及び３ａｌｌ（ベーリンガー社）を使用し
、製造者の推奨する方法に従って操作して遺伝地図を作
製したところ、これらＤＮＡ中にｌ５ｃａｌに一致する
約１，５００ｂｐのセグメントが存在していた。

実施例４ 疫学的調査におけるｌ５ｃｄＬ　　エレメントの史」 前記実施例２に記載の如くして調製した／％イブリダイ
ゼーションプローブを、従来の方法によって既に研究さ
れている各種のジフテリア菌゛（後述のｌｉ表）につい
ての疫学的調査に使用した。

菌株を実施例２と同様に操作してＰＴＹ培地中で育生し
、分離後、染色体ＤＦｌＡ　３μｑを制限酵素ＢａｎＨ
１５Ｕで消化した。

消化混合物をトリス−酢酸塩緩衝液中１，３％−アガロ
ースゲルに充填し、１１０℃で３時間分画した。その後
、サザーンプロット法に従い、ゲルを゛除去し、エチジ
ウムブロマイドで着色し、ニトロセル口・−スフイルタ
ーに移し、ハイブリダイゼーションプローブとハイブリ
ダイズさせた。

得られた結果を第５八図ないし第５Ｄ図に示す。

特に、スウェーデンで単離された菌株に係る第５Ａ図に
示す結果は、ｍ１ｔｉｓ形と表示された菌株が同じハイ
ブリダイゼーション様式を有すること（ライン１ないし
４）、及びこれらはｇｒａｖｉｓ形と表示された菌株に
よって示されるもの（ライン５及び６）とは明確に区別
されることを示している。

インドネシアからの菌株（第５Ｂ図）は、テトラサイク
リン感受性菌株（ライン３及び４）及びテトラサイクリ
ン耐性菌株（ラインｌ及び２）のいずれについても唯１
個のハイブリダイゼーションバンドのみを示した。

これは、この抗生物質に対する耐性は新たに獲得された
性質であることを表わしている。

１５ｃｌＤには、トロントで単離された菌株（Ａ。

Ｂ及びＣ）及びオーストリアで１９５３年に単離された
Ｃ、ジフセリエ・ベルファンティ　１０３０に関して得
られた結果が示しである。

菌株Ａ、Ｂ及びＣについては、Ｃｈａｎｇらにより「ジ
ャーナル・オフ・クリニカル・ミクロノくイオロジー（
Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）Ｊ　８　、
７６？　−７６８（１９７８）に開示されており、Ｃ，
ベルファンティと命名されている。

菌株Ａ及びＣは有毒性であり、相互に形態上及びバクテ
リオファージにより区別される。

菌株Ｂは無毒性であり、形態的には菌株Ａから区別され
ない。

菌株Ａ及びＢの類似性及びこれらと菌株Ｃとの差異は第
５Ｃ図に示されている。

実際、菌株Ａ及びＢは同じハイブリダイゼーション様式
を示し、一方、菌株Ｃは挿入エレメントｌ５ｃａｌのコ
ピーを全く倉荷していない。

最後に、第５Ｄ図に、マンチェスターからの有毒性及び
無毒性の菌株について得られた結果を示す。

これら菌株は、異なった毒素産生能を示すが、相互に区
別不能であり、以前の流行の間に単離されたものと比べ
て相違点を示す。

第５Ｄ図に示す結果は、上記ジフテリア菌に関するＰａ
ｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒらの知見（Ｊ、　Ｈｙｇ、　９３
　、３９７−４０４（１９８４））を追認するものであ
る。

曾　※ Ｑ ζ　　　ｋ　　　染　　　ζ　　　丸　　　凝　　　鞭
　　：条　　　（（灸　　；　　う ：　Ｑ　　Ｑ

【図面の簡単な説明】

第１図はＩｓ　ｃａｌ　　ＤＮＡエレメントの制限地図
を表わす図、第２図はハイブリッドプラスミドｐＤｒ２
の制限地図を表わす図、第３Ａ図はｌ５ｃａｌ挿入エレ
メントのヌクレオチド配列を示す図、第３Ｂ図はｌ５ｃ
ｄｌ　　エレメントの末端のヌクレオチド配列を示す図
、第４図はハイブリッドさ仕たＣ１ジフセリエ・ベルフ
ァンティ１０３０の染色体ＤＮＡのサザーンプロットを
示す写真、第５八図ないし第５Ｄ図はＢａｍＨＩでの消
化によって各種ジフテリア菌から得られた染色体のサザ
ーンプロットを示す写真であ（ほか１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ＩＳ挿入エレメントの代表的な特性が付与され、ジ
   フテリア菌の染色体ＤＮＡ中に１又はそれ以上のコピー
   数で存在し、菌株特異的ハイブリダイゼーションプロー
   ブの調製に使用される塩基対約１，５００のＤＮＡエレ
   メント。 ２　特許請求の範囲第１項記載のものにおいて、下記ヌ
   クレオチド配列を有するものである、ＤＮＡエレメント
   。 【遺伝子配列があります。】 ３　特許請求の範囲第１項記載の挿入エレメントを含有
   するＤＮＡフラグメントを有するクローニングベクター
   のスプライシングによって得られた組換ＤＮＡ分子。 ４　特許請求の範囲第３項記載のものにおいて、前記ク
   ローニングベクターがＥ．コリのプラスミドｐＥＭＢＬ
   ８である、組換ＤＮＡ分子。 ５　特許請求の範囲第３項又は第４項記載の組換ＤＮＡ
   分子で形質転換せしめた微生物。 ６　特許請求の範囲第５項記載のものにおいて、Ｅ．コ
   リＡＴＣＣ６７０１１である形質転換微生物。 ７　ジフテリア菌の菌株の特徴づけ及び疫学上の研究に
   利用されるハイブリダイゼーションプローブの調製に使
   用する、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡエレメント
   又はその制限フラグメントの使用法。