JPS6324887A - 細菌性赤痢を予防するためのワクチン - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、赤痢菌（シゲラ・ジゼンテリエ、Ｓ　ｈｉｇ
ｅｌｌａ　　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）の０抗原の生合
成に関与している、染色体内のヌクレオチド糖合成酵素
（シンセターゼ）およびグリコシルトランスフェラーゼ
をコードしているＤＮＡフラグメント、該フラグメント
を含有している組換えＤＮＡ分子、該組換えＤＮＡ分子
を含有している宿主生物、細菌性赤痢を予防するための
ワクチン、並びに細菌性赤痢の予防法に関するものであ
る。

本発明は、赤痢菌ｌのＯ抗原の生合成に関与している、
染色体のヌクレオチド糖合成酵素およびグリコシルトラ
ンスフェラーゼをコードしているＤＮＡフラグメントに
関するものである。さらに詳しくは、本発明は、生きた
ままの、または不活　□化（殺すように）した、赤痢菌
ｌのＯ抗原産生菌を得るための生物工学的な方法、並び
にその様な菌を含有するワクチンに関するものである。

従来技術 赤痢菌（シゲラ属の菌）や、ある種の腸管浸入性の大腸
菌（エシェリヒア・コリ、Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉ）が、細菌性赤痢（急性であるが一般に自己限定
性の潰瘍性大腸炎である）を引き起こす。先進国におけ
る細菌性赤痢の発現率は低いが、開発途上国、とりわけ
、アフリカ、ラテンアメリカ、アジアのいくつかの国々
や中国では発現率が高く、それらの地域での下痢性疾患
（より正確には「出血性下痢疾患」）の主要部分を占め
ている。その上、栄養状態が適切でなかったり、他の感
染症を併発している場合には、赤痢は、−面では該疾患
の重篤化により、また他の面では、類白血病反応、溶血
性尿毒症々候群、敗血症、および発作の如き合併症の発
現により、生命をおびやかすこともまれ゛でなく、特に
幼児では高死亡率を示す傾向を特徴とする。赤痢菌１（
夏型赤痢菌）は最も重篤な下痢症状をもたらし、かつ、
最も頻繁に合併症を発現させることが分かっている。多
くの開発途上国では、現在、赤的の流行が深刻化してお
り、公衆衛生上、極めて重大な問題となっている。多く
の単離体が抗生物質に対する多剤耐性を示すことが、下
痢感染症の臨床管理を複雑にしている。従って、赤痢菌
ｌに対して有効なワクチンの開発が特に緊急の課題とい
える。

グラム陰性菌のリボ多糖（リポポリサッカライド、ＬＰ
Ｇ）層は、細胞表面の主要成分を構成すると共に、病原
性味にとっては重要なビルレンス（毒力）因子でもある
。リボ多糖分子の構造は３つの構成成分からなる。即ち
、 １、細胞表面に関して、最も奥の部分を構成するリピド
Ａ１ ２、オリゴ糖コア、並びに ３、様々な数の同じオリゴ糖の繰り返し単位で構成され
た、細胞から周囲の媒質中に延びる０特異性多糖から成
る。

細胞の周囲に抗−食細胞カプセル様の構造を形成し、産
生菌の〇−血清型にとって典型的な抗原特異性を付与す
るのは、ＬＰＳの０特異性多糖（０抗原または菌体抗原
）部分である。

赤痢菌１の０抗原の構造は下記の様に決定された［ドミ
トリエフら（ｏ　ｍｔｔｒｔｅｖ）、エン口・ジェイ・
バイオケム（Ｅｎｒ、　Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）６
６（１９７Ｂ）５５９〜５６６コが、繰り返し単位中の
糖の方向性、および繰り返し単位の最初の糖のいずれも
決定されていない。

α３ｏ　　　　　　　α　　　　　　　αα 従来の研究によると、腸内投与して、赤痢菌の〇−特異
性リボ多糖（ＬＰＳ）に対する粘膜免疫を最もよく刺激
すると思われるのは生ワクチンであると示唆されている
。従って、これまでに２つの異なるタイプの弱毒化赤痢
ワクチンが開発された。

、即ち、腸粘膜に侵入し得なくなった突発性の突然変異
体、並びに腸粘膜への侵入能力は有するが、組織内での
増幅能力を減少された赤痢菌−大腸菌ハイブリッドであ
る。チャレンジに対する防御は、ワクチン株による赤痢
菌Ｏ抗原の発現に関連する。

しかし、これらのワクチンはいずれも、ワクチンの不安
定さ、ビルレンスの残留、多重ワクチン接種を要すると
いう理由で、完全に満足し得る乙のではなかった。

最近まで、赤痢菌！の０抗原を発現するハイブリッドワ
クチン株の組立てに関する努力は不成功に終わっていた
。その理由は、ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）およびチ
ミス（Ｔ　ｉｍａｉｓ）［１９８４、インフエ　、クト
・イミュン（Ｉ　ｎｆｅｃｔ、　　Ｉ　ｍ５ｕｎ、）４
３．３９１コにより、赤痢菌１株によって担持されてい
る小さい９ｋｂのプラスミド（１）ＨＷ４００と命名）
が、０抗原生合成の決定因子（ｒｆｐと命名）を含有し
ていることが示された結果、明らかにさ゛れた。次いで
、トランスボゾン突然変異誘発により、この決定因子は
、プラスミドの２ｋｂ領域に存在することと、その生産
物が４１．０００ダルトンのポリペプチドであることが
同定された。このプラスミドで大腸菌を形質転換したと
ころ、これは、０抗原ＬＰＳの生産にとって必要である
が充分とは言えなかった。即ち、０抗原生合成の情報は
、この９ｋｂのプラスミドと、細菌染色体の２つの別々
の遺伝子要素に分布しているのである。次いで、このプ
ラスミドと、赤痢菌１染色体内の、ｈｉｓ（ヒスチジン
生合成）遺伝子クラスター［従って、ｒｆｂ（Ｌ　Ｐ　
Ｓ生合成）遺伝子クラスターコと同時形質導入可能（ｃ
ｏｔｒａｎｓｄｕｃｉｂｌｅ）な領域とを、大腸菌に導
入すると、大腸菌内で赤痢菌１の０抗原が生産された。

この後者の実験方法は、赤痢菌遺伝子の大腸菌Ｋ１２染
色体への組換えを必要とする方法であり、従って、遺伝
子操作のためにそれらを単離する必要はなかった。種々
の、生きた細胞の抗原放出システムに、赤痢菌１の０抗
原を産生ずる能力を容易に導入し得るためには、０抗原
の産生を決定する染色体内遺伝子°の位置を正確に定め
ること、それらを遺伝子クローニングによって単離する
こと、それらを特性化すること、それらを単一の組換え
プラスミド中で、ｐＨＷ４００プラスミドに含有されて
いる０抗原決定因子と結合させることが重要である。

発明の目的および構成 本発明は、赤痢菌１のｒ４ｂ遺伝子領域を含有している
赤痢菌１の染色体内Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントであって、
赤痢菌ｌの０抗原の生合成に関与している染色体上のヌ
クレオチド糖合成酵素およびグリコシルトランスフェラ
ーゼをコードしているＤＮＡフラグメントを提供するこ
とを目的とするものである。この新規なり　Ｎ　Ａフラ
グメントは長さが８　、９　ｋｂであり、下の図式に示
す制限地図で表わされる。

ＵＣＨＨ［）ＨＨＣＣＸＶ （図中、各略語は以下の意味を有する。

１１、Ｐｖｕ■；Ｃ１以国１；Ｈ，山旦ＩＩＩ；Ｈｐ。

Ｈｐａｌ　；　Ｘ、没ｈｏｌ　；　Ｖ、ＥｃｏＲＶｏ）
また、本発明は、上記のＤＮＡとハイブリダイズ可能で
あって、赤痢菌ｌの０抗原、Ｏ抗原の１部、あるいはＯ
抗原と交差反応し得る抗体の形成を刺激する抗原の生合
成に関与する染色体のヌクレオチド糖合成酵素またはグ
リコシルトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡフ
ラグメントを提供することを目的にするものである。こ
のフラグメントは天然、合成または半合成供給源等、入
手し得るどんな供給源から得られてもよく、上記のＤＮ
Ａフラグメントに、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入お
よびヌクレオチド範囲（ストレッチ）の逆転が起こって
いるものが含まれる。

また、本発明は、上記ＤＮＡフラグメントのどれかを含
有する組換えＤＮＡ分子を提供することを目的とするも
のである。

また、本発明は、上記ＤＮＡフラグメントのどれかを、
プラスミドにコードされている、赤痢菌１のＯ抗原生合
成機能（または機能類）に関する遺伝情報を含有してい
るＤＮＡフラグメントと一緒に含んでいる組換えＤＮＡ
分子を提供することを目的とするものである。

本発明の好ましい態様では、プラスミドにコードされて
いる、赤痢菌ｌの０抗原生合成機能（類）の遺伝情報を
含有している組換えＤＮＡ分子は、赤痢菌ｌのプラスミ
ドｐＨＷ４００のｒｆｐ遺伝子領域である。

この組換えＤＮＡ分子を用いてクローンしたＤＮＡフラ
グメントを増幅させ、大腸菌等の腸内細菌内で赤痢菌ｌ
のＯ抗原を生産し、さらには、発現コントロール配列と
機能的（操作可能）に結合させた場合には高レベルで生
産することができる。

好ましい発現コントロールシステムには、大腸菌のプロ
モーター系、大腸菌のｌａｃ系、大腸菌のβ−ラクタマ
ーゼ系、大腸菌のｔｒｐ系または大腸菌のリポタンパク
質プロモーターが含まれる。

本発明のより好ましい＠様では、組換えＤＮＡ分子は寄
託番号ＤＳＭ３７６２の下、ＤＳＭに寄託されているプ
ラスミドｐＳＳ３７である。

また本発明は、上記の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子のいずれか
によって形質転換されたグラム陰性菌である、宿主生物
を得ることを目的とするものである。

本発明の好ましい実施態様における宿主生物はシゲラ（
Ｓ　ｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓ　ａ　１ｍｏｎ
ｅ　ｌ　Ｉａ）、またはエシェリヒア（Ｅ　５ｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ）属の種である。

本発明にとってより好ましい態様における宿主生物は大
腸菌Ｋ１２種である。

本発明の最も好ましい態様における宿主生物は、ヒトの
腸管上皮に侵入し得る生物である。

また本発明は、赤痢菌ｌの０抗原を産生ずる細菌の製造
方法であって、適当な培地中で上記の宿主のいずれかを
培養し、該細菌を回収し、所望により該細菌からＯ抗原
物質を単離することを特徴とする方法を提供することを
目的とするものである。

さらにまた本発明は、上記の如く形質転換された宿主生
物を含有する、細菌性赤痢の予防のためのワクチンであ
って、赤痢菌ｌの０抗原に対する腸粘膜の免疫応答を導
き得る、非病原性または弱病原性の腸内細菌を、所望に
より、薬学的に許容し得る希釈剤および／または担体と
一緒に含有するワクチンを提供することを目的とするも
のである。

図面の簡単な記載 第１図はプラスミドｐＳ　Ｓ　３７の組立て模式図であ
る。　　　　゛ 大腸菌Ｋ１２内で、赤痢菌ｌの０抗原を生産するのに必
要な染色体内決定因子の同定と単離を容易にするために
、ｐｓｓａ（プラスミドｐＨＷ４００のＴｎ５−添加誘
導体である）と−緒になって該宿主内での赤痢菌ＬＰＳ
の形成を刺激するＲ°プラスミド類を生成させた。アン
ピンリン、カナマイシンおよびテトラサイクリンに対す
る耐性を特定するＲ　Ｐ　４　：：　ｍｉｎｉＭｕプラ
スミドｐＵＬＢ１１３［ファン・ギジエゲン（Ｖ　ａｎ
　Ｇ　ｉｊｓｅｇｅｎ）およびトウーセン（Ｔ　ｏｕｓ
ｓａｉｎｔ）、プラスミド（Ｐ　ｌａｓｍｉｄ）７（１
９８２）３０〜４４］を、コンジュゲーションにより赤
痢菌ｌ昧　Ｗ３０８６２−２２［ワタナベおよびチミス
、インフェクト・イミュン４３（１９８４）３９１〜３
９６］（この菌株はストレプトマイシン、カナマイシン
およびアンピシリン耐性である）に移し、得られたトラ
ンスコンシュガント（ｔｒａｎｓ　ｃｏｎｊｕｇａｎｔ
）体を、ストレプトマイシン、カナマイシンおよびアン
ピシリンを含んだ培地上で選択した。次いで、Ｗ３０８
６４−２２由来のＲＰ　４　：：　ｍｉｎｉＭｕを大腸
菌Ｋ１２株０Ｔ９７（ｐＳ　Ｓ　８）ｒｅｃＡ　ｈｉｓ
　Ｒｔｒ’に移し、ヒスデシン原栄養性と、アンピシリ
ン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびリファンピ
シン耐性に関する選択法を用い、赤痢菌ｌのｈｉｓ遺伝
子領域を含有するＲ　Ｐ　４　：：　ｍｉｎｉＭｕ　Ｒ
’プラスミドを選択した。

赤痢菌ｒ４ｂ遺伝子クラスターを有するＲ°プラスミド
を含有している大腸菌に１２クローンを同定するために
、“Ｓ”型（Ｏ抗原含有）ＬＰＳの発現に関してヒスチ
ジン原栄養性トランスコンシュガントを計数した。

ラフ特異性のバクテリオファージＴ３（これに対し、０
Ｔ９７（ｐｓｓａ）は感受性を有する）に対する耐性を
測定することにより予備スクリーニングを行った。その
様なトランスコンシュガントを幾つか選択し、その内の
１つ（Ｒ’４０と命名）をさらに検討した。ウエストフ
ァル（ｗｅｓｔｐｈａりおよびジャン（Ｊａｎｎ）のフ
ェノール−本工程［メソ・カーボン・ケム（Ｍｅｔｈ、
　Ｃａｒｂｏｎ、　Ｃｈｅｍ、）５　（１９６５）８３
〜９１］により、このトランスコンシュガントからリボ
多糖類を単離した。このＬＰＳを、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法、および赤痢菌ｌのポリクローナル抗血
清を用いた免疫プロッティング法によって特性化したと
ころ、これは、赤痢菌ｌから単離した滑９面（スムース
）ＬＰＳと識別し得ないものであることが分かった。従
って、Ｒ゛４０は大腸菌Ｋｌ　２０Ｔ９７（ｐｓｓａ）
内での０抗原の生産に必要な情報を全て含んでいること
が分かった。

プラスミド−ｐｓｓａの組立て ｒｆｐ遺伝子は、既に、赤痢菌１プラスミドｐＨＷ′４
００［ワタナベら、インフェクト・イミューン、４．６
（１９８４）５５〜６３］の２ｋｂ領域に存在すること
がつきとめられている。この遺伝子とクローンしたｒｆ
ｂ遺伝子クラスターとを結合させるｆこめに、まず、ｐ
ｓｓａから４　、７　ｋｂＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩフラグ
メントを切除し、これを、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
ＶおよびＣ１ａＩで消化したｐＡＣＹＣｌ　８４プラス
ミドＤＮＡとライゲートさせた（第１図）。この様にし
て得られたハイブリッドプラスミドをｐｓ　Ｓ　３と命
名した。これを、ｐｉ−［Ｗ４００プラスミドを欠く赤
痢菌誘導体、Ｗ３．０８６４−２２株に導入すると、Ｏ
抗原ＬＰＳの生産が回復した。この様に、ｐｓｓａはｒ
ｆｐ遺伝子を含有しており、これを発現させる。プラス
ミドｐｓｓａは、寄託番号ＤＳＭ３７６０の下、ＤＳＭ
に寄託されている。

プラスミドｐＳＳ９の組立て Ｒ゛・４０プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
Ｐｓｔｌで開裂すると、ベクターｐＵＬＢｌ１３起源の
８フラグメントと、挿入された赤痢菌染色体ＤＮＡを起
源とする、分子量１１．５ｋｂ。

１１　ｋｂ（２Ｘ）、７　、３　ｋｂおよび４．８ｋｂ
の５フラグメントが生成した。この様に、Ｒ′４０プラ
スミドは約４６ｋｂの挿入体を含有している。Ｒ°４０
゛に含有されているＬＰＳ遺伝子のクローンを得るため
にＲ°４０プラスミドＤＮＡをＰｓｔｌで消化し、その
様にして生成したフラグメントをＰｓｔｌで開裂したｐ
ＢＲ２２ベクターＤ　Ｎ　Ａにライゲー。

トした。このライゲーション・ミックスを用いて大腸菌
Ｋ１２　０Ｔ９９（プラスミドＩ）ＳＳ３を含有してい
る細菌）を形質転換した。

アンピシリン感受性でテトラサイクリン耐性の形質転換
体をバクテリオファージＴ３に対する低抗性に関してス
クリーニングし、得られたクローンの２つからリボ多糖
を単離した。このＬＰＳ製品をポリアクリルアミドゲル
電気泳動と、赤痢菌１のポリクロナール抗血清を用いた
免疫プロッティングに付すことにより、これらのクロー
ンが赤痢菌ｌの０多糖を発現することが確認された。２
つのクローンから単離されたプラスミドＤＮＡをエンド
ヌクレアーゼＰｓｔＩで消化すると、これらのクローン
は両方共、ｐＳＳ３の外に、Ｒ’４０の１１　、５　ｋ
ｂフラグメントを含んだ、ｐＢＲ３２２ハイブリッドプ
ラスミドを含有していることが分かった。ｐＢＲ３２２
ハイブリッドの１つ（ｐＳＳ９と命名）を以後の研究の
ために選択した。このプラスミドは、寄託番号ＤＳＭ３
７６１の下、ＤＳＭに寄託されている。該組換えプラス
ミドまたは挿入されたＤＮＡフラグメントを、赤痢菌ｌ
のＯ抗原の生合成に関与する染色体性酵素の合成に用い
ることができる。また、これを、赤痢菌ｌの０抗原の生
合成に関与している染色体内酵素をコード゛しているヌ
クレオチド配列をスクリーニングするためのプローブと
して用いることもできる。

クローンしたｒｒｂ遺伝子クラスターの組織を分析する
と共に、そこにコードされているＬＰＳ生合成機能を同
定するために、一連の、ｐＳＳ９の、トランスボゾンＴ
ｎ１０００挿入突然変異体を、Ｆ媒介接合（コンシュガ
ル）トランスファーにより生成させた。この交差反応の
受容体として用いられた大腸菌に１２Ｃ６００ｒｅｃＡ
誘導体はｐｓｓａを担持している０Ｔ９９の誘導体であ
って、ｒｆｐ遺伝子を含有している。生成したトランス
コンシュガントのラフ特異性バクテリオファージＴ３に
対°子る感受性または耐性、トランスコンシュガントか
ら単離し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけたＬＰＳバンドのパターンまたは免疫反応性、並び
に化学分析に基づいて測定された、ＬＰＳの多糖部分の
糖成分に基づいて、０抗原の生産に関する６つの決定因
子が同定され、位置づけられた。大腸菌に１２のＬＰＳ
はピリドＡとコアオリゴ糖のみから成るが、ｐＳＳ３含
有誘導は、ガラクトース残基で置換されたコアオリゴ糖
をも含有している。ＴＤＰ−ラムノースの合成およびラ
ムノース残基のガラクトース置換コアへの移行には、少
なくと６２つの、赤痢菌ｌの染色体内ｒ４ｂ決定因子が
関与している。これらの機能の内の１つは、恐ら＜ＴＤ
Ｐ−ラムノース合成酵素であろう。第３の機能は、第２
のラムノース残基のｒｈａ−＋ｇａｌ置換コア転移にお
いて作用する。第４機能については、２つの決定因子（
シストロン）に関して証拠が得られており、Ｎ−アセチ
ルグルコザミントランスフェラーゼである。他方、第６
番目の決定因子は、第１の完壁な側鎖繰返し単位を伸長
させ、完全な０抗原ポリマーを得るために必要である。

以上の結果は、赤痢菌１の０抗原について既に決定され
ていた化学組成を追認するものであり、式： ％式％ で示される糖の配列を示すものである。ここで、ｇａｌ
は、コアと結合する第１番目の糖である。

プラスミドｐＳ　Ｓ　３７　（Ｄ　Ｓ　Ｍ３７６２）の
組立て形質転換によってプラスミドｐＳＳ９を大腸菌０
Ｔ９９株（ｐｓｓａを欠く株）に導入し、得られた形質
転換体を、大規模なプラスミドＤＮＡの製造に用いた。

このプラスミドＤＮＡを、種々の酵素を単独で、または
適宜組み合わせて用いて行う制限エンドヌクレアーゼ開
裂分析に付し、エンドヌクレアーゼ開裂地図を作製した
、その結果、ｐＳＳｅ中の赤痢菌ｌＤＮＡ挿入体の大部
分を含有する９、２ｋｂＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲｌＤＮＡ
フラグメントが生成した。これを単離してＥｃｏＲＶ−
Ｅ・ＯＲＩ消化ＰＢＲ３２２ＤＮＡとライゲートさせ、
大腸菌に１２株０Ｔ９９（ｐＳＳ３）を形質転換し゛た
。この様にして組立てられたハイブリッドプラスミドの
１つをｐＳＳ２３（第１図）と命名した。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および、免疫プ
ロッティングで調べた結果、大腸菌０Ｔ９９Ｐ！８（＋
）ＳＳ３、ｐｓｓ２３）が、赤痢菌１（７）Ｑ多糖を発
現することが分かった。この様に、染色体のＬＰＳ生合
成遺伝子はプラスミドｐＳＳ９の９．２ｋｂ　ＥｃｏＲ
Ｖ−ＥｃｏＲｒフラグメントに含有されている。次いで
、ｐＳＳ９の８．９ｋｂ　ＥｃｏＲＶ−ＰｖｕＩ［フラ
グメントを生成させ、調製用アガロースゲルに適用して
分離し、単離した後、ｐＳＳ３の単一のＥｃｏＲＶ開裂
部位にライゲートさせた（第１図）。この様にして形成
されたハイブリッドプラスミド（ｐＳ　Ｓ　３７と命名
）を大腸菌Ｋ１２株０Ｔ９９に導入すると、赤痢菌ｌの
０特異性リボ多糖の生産が刺激された。従って、このも
のは、大腸菌Ｋ１２、および他の細菌株（おそらく）内
で赤痢菌、ｌの０倦原の産生を指令するのに必要な赤痢
菌ｌの全遺伝子を含有している単一のプラスミドを構成
しているといえる。

実施例Ｉ Ａ）赤痢菌ｌの染色体内、０多糖生合成遺伝子を担って
いるＲ°プラスミドの単離 次の様にしてＲＰ　４　：：　ｍｉｎｉＭＵをＭ　Ｘ　
Ｒ（ｐＵＬＢ　ｌ　１３）から赤痢菌１株Ｗ３０８６４
−２２に移した。供与体および受容体の株を穏やかに振
盪しながら３７℃において、Ｌブロス（ＬＢ）中で、Ａ
６００吸収か約０．８になるまで増殖させた。

゛次いで培養物の一部をとって混合し、該混合物に元の
培養物をプラスし、遠心してｌ／２０倍に濃縮した。次
いで、これらの懸濁物２０μｅを抗生物質培地（Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃ　　Ｍｅｄｉｕｍ）Ｎｏ３　（ＡＭ　３
、Ｄ　１ｒｃｏ）寒天プレート上におき、３７°Ｃで２
時間インキュベートした。次に、各滴下物から増殖した
細菌をりん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に再＠濁し、この
浮遊液をカナマイシンとクロラムフェニコールを含んだ
ＡＭ３寒天プレートに画線接種した。

培地中に加える抗生物質の濃度は次の通りである：カナ
マイシン、５０μ９／ＩＱ、クロラムフェニコール、５
０μ９／ｘｔ１．これらの抗生物質に対す゛る耐性、お
よび赤痢菌ｌ特異性抗血清［ベーリングベルク（Ｂ　ｅ
ｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ）、マルバーグ（Ｍａｒｂｕｒｇ
）］への付着に基づいてトランスコンシュガントを同定
した。

赤痢菌ｌ染色体のセグメントを含有しているＲＰ　４　
：　ｍｉｎｉＭｕ　Ｒ’プラスミドを次の様にして単離
した供与体株を静かに振盪しながら、ＬＢ培地中、３２
℃において八６００が０．５に達するまで増殖させた後
、４３℃で２時間インキュベートしてＭｕ機能を誘導し
た。受容体をＬＢ中、３７℃で同じ時間、増殖させた。

次いで、上記の如くにして交配（ｍａｔ　ｉｎｇ）を行
った（ただし、交配に要した時間は３〜６時間である）
。細菌増殖をＰＢＳに懸濁させた後、遠心と＠濁とを行
うことで細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、次いで、選択
用培地にブレーティングした。

Ｂ）大腸菌Ｋ１２株のラフ特異性バクテリオファージＴ
３に対する感受性 バクテリオファージＴ３はＬＩ’Ｓのコアオリゴ糖のレ
セプター構造を認識し得るラフ特異性ＬＰＳファージで
ある。高分子量の０多糖を産生ずる細菌においては、コ
アがＯ側鎖の繰り返し単位で置換され、コアのレセプタ
ー構造が遮断（ブロック）または遮蔽（マスク）させる
ために、その様な細菌はＴ３に抵抗性を示す。

適当なファージ希釈液の試料（０，１ｄ）を細菌培養物
（指数増殖期の手頃まで増殖させたもの）０１ｍ（ｌと
混合して３７℃で２０分間インキュベートしく予備吸着
）、軟寒天４ｘＱと混合した後、固型のし一寒天プレー
ト上に重層した。これらを３７℃で一夜インキエベート
した後、菌叢中のファージプラークを調べた。

Ｃ）ＬＰＳのゲル電気泳動、および免疫プロッティング ウエストファルとジャンのフェノール−水性に従って細
菌株からリボ多糖を単離した。純化ＬＰＳのＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を、レムリ（Ｌａｅａ＋Ｉ
ｉ）の記述［ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２２７（
１９７０）、６８０〜６８５コに従い、４Ｍの尿素を含
んだ１４％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。Ｌ
ＰＳのバンドを、銀染色［バイオラド（Ｂ　１ｏｒａｄ
）、あるいはツァイ（Ｔｓａｉ）およびフラッシュ（Ｆ
ｒａｓｈ）の方法（アナル・バイオケム（Ａｎａｌ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）ｌ　ｌ　９（１９８２）１１５〜ｌ
　１９）によって調製コして観察するか、エレクトロブ
ロッティング法でニトロセルロース上に移し、スターム
ら（Ｓｔｕｒ＋ｎ）の記述［アーク・マイクロバイオｏ
（Ａｒｃｋ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）１４０（１９８
４）１９８〜２０１１に従い、赤痢菌１のポリクローナ
ル抗血清を用いて検出した。

実施例２ プラスミドｐＳＳ３（ＤＳＭ３７６０）の組立てプラス
ミドｐＳＳ８は赤痢菌１株Ｗ３０８６４のｒｆｐ遺伝子
を担っているプラスミドｐＨＷ４００のＴｎ５　トラン
スボゾン含有誘導体である。制限バッファー（１０ｍＭ
）リス−ＨＣ１２，ｐＨ７，５，１０ｍＭ　　ＭＦＩＣ
Ｑｘ、１ｍＭｍナノスレイトール、５０ｍＭ　　ＮａＣ
ｌ２）２５μＣ中のｐｓｓ８ＤＮＡ１μ９にＥｃｏＲＶ
およびＣ１ａｌ工ンドヌクレアーゼ各２単位を加え、得
られた溶液を３７℃で１時間インキュベートした。同様
に、クローニングベクターｐＡｃＹｃ１８４ＤＮＡｌｌ
ＪをＥｃｏＲＶおよびＣ１ａｌによって別々に反応させ
、開裂させた。次いで、２種類の反応溶液を６５℃で１
５分間インキュベートすることにより制限エンドヌクレ
アーゼを不活化した。次いで、エタノールを加えて各溶
液からＤＮＡを析出させ、これをライゲーションバッフ
ァー（５０ｍＭ　）リス−ＨＣＱ、　ｐ＋−ｒ　７　、
５、ｌ　ＱｍＭ　ＭｇＣＱｔ、ｌｏｍｔｖ’［ジチオス
レイトール、２ｍＭＡＴＰ）に再懸濁した。次に、２種
類のＤＮＡ溶液を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位を
加えた後、混合物を１５℃で一夜インキユベートしたつ
次に、これを用いて大腸菌Ｋ１２０Ｔ９９のコンピテン
ト（受容能力のある）細胞を、マンデル（Ｍａｎｄｅｌ
）とヒガ（Ｈｉｇａ）の記載［ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジイ（１９７０）５３．１５９］に
従って形質転換した。

クロラムフェニコール耐性でテトラサイクロン感受性の
形質転換体クローン由来のプラスミドＤＮＡのミニプレ
バレージョン（ミニ調製品）［ホル去ス（Ｈｏｌｍｅｓ
）およびキグレイ（Ｑｕｉｇｌｅｙ）、１９８！、アナ
リティカル・バイオケミストライ（Ａｎａｌ、　Ｂ　ｉ
ｏｃｈｅｍ、）］をＥｃｏＲＶ＋Ｃ１ａＩ開裂、および
アガロースゲル電気泳動によって分析し、ｐＡＣＹＣ１
８４とｐＳＳ８の４．７ｋｂＥｃｏＲＶ−Ｃ１ａＩフラ
グメントとで構成されているハイブリッド分子を含有し
ているクローンを保持した。その様なハイブリッドプラ
スミドの１つであって、ｐＨＷ４００プラスミドを欠く
赤痢菌１単離体［Ｗ３０８６４−２２、ワタナベおよび
チミス、インフェクト・イミューン４３（１９８４）３
９１］の、赤痢菌ｌの０抗原合成能を維持しているグラ
スミ下を、ｐｓｓ３と命名した。

実施例３ Ａ）プラスミドｐＳ　Ｓ　９　（Ｄ　Ｓ　Ｍ３７６１）
の組立て制限バッファー２５酎中のプラスミドＲ゛４０
ＤＮＡ２μ・９にＰｓｔｌエンドヌクレアーゼ４単位を
加え、得られた溶液を３７℃で１時間インキ一二ベート
した。次いで、６５℃で１５分間インキュベートし、充
填溶液［水中、０．２５％ブロモフェノールブルー、１
５％フィコル（Ｐ　１ｃｏ１１）４００型、０．ＩＭＥ
Ｄ−ＴＡコ３μｇと混合し、アガロースゲル（９０ｍＭ
）リス、９０ｍＭホウ酸、２．ｓＭＥＤＴＡ中０．６％
ゲル）に適用した。２０Ｖで一夜電気泳動した後、臭化
エチジウム（水中０．５μｇ／ｆｆ１２）で３０分間処
理してゲルを染色し、長波長のＵＶ光を照射して観察し
た。少なくとも１３のフラグメントが認められ、その内
の５個は分子す・イズが４．８ｋｂ、７．３ｋｂ、　　
１１．ｏｋｂ（２フラグメント）および１１．５ｋｂで
あり、赤痢菌ｌ染色体を起源としている。１１．Ｏｋｂ
フラグメントと１１゜５ｋｂフラグメントを含有するゲ
ル切片を切り取り、透析バッグに入れ、マニアナイスら
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）の記載に従って電気溶離法でＤＮ
Ａを回収した［モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験の手引（Ａ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａυ１９８２、コール
ドスプリングハーバーコ。これらＰｓｔＩ処理で生じた
、Ｒ゛４０のフラグメントを、次に、ＰｓｔＩで開裂し
たｐＢＲ２２ベクターＤＮＡとライゲートさせ、それに
よって形成されたハイ′ニブリッドプラスミドを７コン
ビテントな大腸菌Ｋ１２０Ｔ９９（＋）ＳＳ３）に導入
した。テトラサイクリン耐性でアンピシリン感受性の形
質転換体をバクテリオファージＴ３に対する抵抗性に関
してスクリーニングした。Ｔ３−耐性クローンからリボ
・多糖を単離し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動、並びに赤痢菌１のポリクロナール抗血清による免疫
プロッティングにより分析した。大腸菌ＫＩ２形質転換
体中に存在するハイブリッドｐＢＲ３２２プラスミドで
あって、赤痢菌ｌの０抗原を合成し、従って、ｐＳ　Ｓ
　３のｒｆｐ遺伝子のみならず、赤痢菌ｌの染色体に由
来するｒｆｂ遺伝子をも含有しているプラスミドは、Ｒ
’４０の１１．５ｋｂＰｓｔｌフラグメントを含んでい
ることが分かった。その様なハイブリッドプラスミドの
１つであって、このＩｌ、５ｋｂフラグメントのみを含
んでいるプラスミドをｐＳ　Ｓ　９と命名した。

Ｂ）ｐＳＳ９のＴｎｌＯＯＯ（ガンマ−デルタ）挿入突
然変異体の生成 以下に示す方法で大腸菌Ｋ　１２妹ＴＨ６１２（Ｆ１３
１、ｐＳＳ９）供与体と０Ｔ９９株（１）Ｓ　Ｓ　３）
受容体とを液体培地中で交配させた。即ち、供与体株を
振盪せずに増殖させ、中期−指数増殖期の培養物０　、
１　ｄを受容体株の一夜培養物０　、１　ｙｘＱと混合
した、Ｌブロス１ｘＱを加え、得らたれコンジュゲーシ
ョン混合物を、振盪せずに、３７℃で２時間インキュベ
ートした、その０　、１　ｍＱを、テトラサイクリンお
よびクロラムフェニコールを含んだＡＭ３プレートに延
ばした。テトラサイクリンとクロラムフェニコールに耐
性のトランスコンシュガントを単一コロニーとして２回
単離し、これをファージＴ３を用いた、Ｏ特異性多糖の
発現に関するスクリーニングにかけた（実施例１参照）
。

トランスボゾンＴｎｌ　０００は一方の端から３ｋｂの
位置にある１個のＣ１ａＩの部位と、２個のＨｉｎｄ１
１１部位および２個のＥｃｏＲＩ部位とを含有している
［ガイヤー（Ｇ　ｕｙｅｒ）、ジャーナル・才ブ・モケ
キュラー・バイオロジイ（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、
）１２６（１’１７８）３４７〜３６３］。トランスボ
ゾンの末端からの距離は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に関して
１゜１ｋｂおよび２　、１　ｋｂＳＥｃｏＲｒ部位に関
して０．９ｋｂおよび４ｋｂである。ｐＳ　Ｓ　９　：
：Ｔ、ｎｌ　０００ｍ導体中の挿入部位はこれらのエン
ドヌクレアーゼ開裂部位と関連させて位置決めされた。

実施例４ プレートｐＳＳ３７（ＤＳＭ３７６２）の組立て制限バ
ッファー中のｐｓｓ９ＤＮＡ２μｙにＥｃ。

ＲＶおよびＰｖｕＵ各４単位を加え、得られた溶液を３
７℃で１時間インキュベートした。次いで、これを６５
℃で１５分間インキュベートし、３ｙ（１の充填溶液と
混合して０．６％アガａ−スゲルに適用した。２０Ｖで
一夜電気泳動した後、臭化エチジウムでゲルを染色し、
長波長ＵＶ光を照射して観察した。８．９ｋｂＥｃｏＲ
１−Ｐｖｕ■フラグメントを含んだゲル切片を切り取り
、電気溶離してそのＤＮＡを回収した。この様にして得
られたフラグメントをＥｃｏＲＶで開裂したｐＳＳ３プ
ラスミドＤＮＡとライゲートさせ、このライゲーション
ミックスを用いてコンピテントな大腸菌Ｋ１２０Ｔ９９
細胞を形質転換した。バタテリオファージＴ３に低抗性
を示す形質転換体のクローンは、赤痢菌ｌのＬＰＳと電
気泳動的に識別し得ないＬＰＳを合成することが分かっ
た。その様なりローンに含まれている１つのプラスミド
をｐＳＳ３７と命名した。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐｓ　Ｓ　３７の組立て模式図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、赤痢菌１の染色体のＤＮＡフラグメントであって、
   赤痢菌１のＯ抗原の生合成に関与する染色体のヌクレオ
   チド糖合成酵素およびグリコシルトランスフェラーゼを
   コードし、長さが８．９ｋｂであり、その制限地図が、
   図式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （図式中、IIはＰｖｕII、ＣはＣｌａ I 、、ＨはＨｉ
   ｎｄIII、ＨｐはＨｐａ I 、ＸはＸｈｏ I 、ＶはＥｃ
   ｏＲＶを表わす） で示される、赤痢菌１のｒｆｂ遺伝子領域を含有するこ
   とを特徴とするＤＮＡフラグメント。 ２、第１項記載のＤＮＡフラグメントとハイブリダイズ
   するＤＮＡフラグメントであって、赤痢菌１のＯ抗原、
   Ｏ抗原の１部、あるいはＯ抗原と交差反応する抗体の形
   成を刺激する抗原の生合成に関与する染色体性のヌクレ
   オチド糖合成酵素およびグリコシルトランスフェラーゼ
   をコードしていることを特徴とするＤＮＡフラグメント
   。 ３、第１項または第２項記載のＤＮＡフラグメントを含
   有することを特徴とする組換えＤＮＡ分子。 ４、第１項または第２項記載のＤＮＡフラグメントと、
   プラスミドにコードされている、１または１以上の赤痢
   菌１のＯ抗原の生合成機能に関する遺伝情報を含有して
   いるＤＮＡフラグメントとを含有していることを特徴と
   する組換えＤＮＡ分子。 ５、２個のＤＮＡフラグメントが発現コントロール配列
   と機能的に結合していることを特徴とする第４項記載の
   組換えＤＮＡ分子。 ６、発現コントロール配列が、大腸菌のプロモーター系
   、大腸菌のｌａｃ系、大腸菌のβ−ラクタマーゼ系、大
   腸菌のｔｒｐ系および大腸菌のリポタンパク質プロモー
   ターから選択されることを特徴とする第５項記載の組換
   えＤＮＡ分子。 ７、プラスミドにコードされている赤痢菌１のＯ抗原の
   生合成機能に関する遺伝情報を含有しているＤＮＡフラ
   グメントが、赤痢菌１のプラスミドｐＨＷ４００のｒｆ
   ｐ遺伝子領域であることを特徴とする第４項または第５
   項記載の組換えＤＮＡ分子。 ８、寄託番号ＤＳＭ３７６２の下、ＤＳＭに寄託されて
   いるプラスミドｐＳＳ３７であることを特徴とする第７
   項記載の組換えＤＮＡ分子。 ９、第４項〜第８項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分
   子によって形質転換されたグラム陰性菌であることを特
   徴とする宿主生物。 １０、シゲラ属、サルモネラ属、またはエシェリヒア属
   の種であることを特徴とする第９項記載の宿主生物。 １１、大腸菌Ｋ１２種であることを特徴とする第９項記
   載の宿主生物。 １２、ヒト腸管上皮に侵入し得ることを特徴とする第１
   １項記載の宿主生物。 １３、第９項〜第１２項のいずれかに記載の形質転換さ
   れた宿主を適当な培地で培養し、該細菌を回収すること
   を特徴とする、赤痢菌１のＯ抗原を産生する細菌の製造
   方法。 １４、形質転換された、非病原性または弱病原性の宿主
   を薬学的に許容し得る希釈剤および／または担体と一緒
   に含有することを特徴とする細菌性赤痢の予防ワクチン
   。 １５、第１項または第２項に記載のＤＮＡフラグメント
   によってコードされている、赤痢菌１のＯ抗原を含有す
   る物質と、薬学的に許容し得る希釈剤および／または担
   体とを含有する、細菌性赤痢の予防ワクチン。 １６、細菌性赤痢の予防法であって、第１４項記載のワ
   クチンの、免疫応答の誘導または免疫反応の変調に充分
   な量を、ヒトに対して経腸投与することからなる方法。 １７、細菌性赤痢の予防法であって、第１５項記載のワ
   クチンをヒトに経腸投与することからなる方法。