JPS6324156A - 可変容量検定装置及び方法 - Google Patents
可変容量検定装置及び方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
(産業上の利用分野)
この発明は免疫診断手法を用いて、液体特に生物の体液
から得たサンプルを試験する装置及び方法に関する。 (従来の技術) 従来広範囲のさまざまな免疫検定が存在し、これらの検
定では免疫対の一方の成分、例えば抗原または抗体が標
識付は抗原または抗体を用いて検出または測定される。 競合的結合法として知られる1つの手法では、検出すべ
き成分と同一免疫(小の標識11け試薬との間で競合が
設定される。1シ1]えば、α体サンプル中における抗
原の検出の場合、サンプルと標識付は抗原がその抗原に
特有な抗体に接触させられる。抗体と結合する標識(寸
は抗原の量が、サンプル中に存在する抗原の量に逆比例
する。 サンドイッチ検定として知られる別の検定法でBl、固
定された捕獲抗体が固体表面に結合され、サンプル中の
抗原が免疫的に抗体と反応する。別の標識付は抗体も抗
原と反応し、固定反応生成物を形成する。反応生成物中
の標識物が、サンプル中の抗原の存在を指示するものと
して検出される。 ここで「標識付け」という用語は、免疫試薬が信号をそ
れ自体で発するか、あるいは信号を発生せしめる標識(
ラヘルまたはタグ)を持った共役体に形成されているこ
とを意味する。各種のは識には、放射性同位体、クロモ
ゲン(色原体)、金属ゾル粒子(特にコロイド金、銀及
びキレート化合)、及び酵素が含まれる。各か1のおい
て、これらの標識は直接的または間接的に検出可能であ
る。 酵素標識は、その酵素が存在するときにだけ可視信号(
光や蛍光など)へと変換される基質と反応する。 サンドイツチ法を用いた抗原の検出または測定の場合、
動物から採取した多クローン性の抗血清つまり抗体が、
標識付は抗体及び表面上の捕S貢抗体として長年使われ
てきている。最近、多クローン性抗体の代わりに、単ク
ローン性抗体が検定で使われるようになった。このよう
な1つの方式はWadaft!!の論文、 Cl1n、
Chem、、 Vol、 28. No、
9゜1982、 I)p、 +862−1866に記
されており、固相の抗体が特定抗原、hCG 、の1サ
ブユニツトに差し向けられる一方、酵素と結合した単ク
ローン性抗体が別のサブユニットに差し向けられる。こ
の→lンドイッチ検定では、サンプルの加えられる試験
管のない部が固体表面で、その上に捕獲抗体が固定され
る。他の固体表面として、計量棒、プラスチックボール
または磁気ボールがあり、これにも浦Sf抗体が担持さ
れろ。 固体表面での反応は、固定または可溶試薬とサンプル成
分との間の接触が制限されるため比較的遅い。抗体分子
が3次元のマトリックスで露出されるように、捕獲抗体
を多孔性膜内に固定することによって検定時間が減じら
れてきた。かかる方式では、抗原を含む液体サンプルが
膜を通り、その下側のサンプルを引き寄せる吸収物質内
へと移動する。競合的結合検定で用いるためのこのよう
な一方式は、Bagshaweの米国特許第3,888
,629号に開示されている。サンドイッチ検定用の別
の方式は、Valkris他の論文、Cl1n、 Ch
em、、 Vol’、3+。 No、 9.1985. l111.1427−143
1に開示されている。 この方式でも、液体サンプルがそこを通って吸収床内へ
と移動する多孔性膜を用いている。反応時間を−i短縮
するため、試薬と液体サンプルがそこを通って吸収物質
内へと移動する膜中で免疫反応が生じるようにした更に
別の方式も、Tom他の米国特許第4,366.241
号に開示されている。 下側に吸収物質を備えた別の膜力式が、Co1e他の米
国特許第4,246,339号に開示されている。この
方式では、初めに液体サンプルが、装置頂部のミクロ多
孔性膜の底壁を持つ試験ウェルのアレイ内に置かれろ。 多孔性吸収物質を含む反応表面膜がアレイの下側に配置
され、両者間に中間チャンバが形成される。反応手順の
開始まで試験ウェルの膜は反応表面膜と接触しないよう
に保たれ、反応手順の開始時点で両膜が相互に接触し、
液体が両膜を通って吸収物質に引き寄せられる。反応生
成物から発せられる信号を、反応表面膜上て観察する。 容量の変化が内圧を左右しないように、空気口が中間子
ャンバに設けられる。 (発明が解決しようとする問題点) 上記の膜装置は全て1貫流(ワンススルー〉」方式で、
膜を通過する液体が吸収物質で吸収され。 反対方向には通過しない。つまり、捕獲抗体が膜上の特
定点に集中すると、その点の真上の想像上の円柱内に存
在する物質だけが線点の抗体と出会うことになる。これ
は混合度、ひいては系の感度及び速度を制限する。 (問題点を解決するための手段) 本発明によれば、流体(または液体)サンプル、特に生
物から採取した体液の成分を検出するための検定装置及
び方法が提供される。本装置は、可変容量のチャンバを
画成する容器を含む。好ましくは、本体に対して進入及
び後退移動自在に、できればネジ係合で装着されたピス
トンを用い、“チャンバの容量を変化させる手段が設け
られる。チャンバは、入口からチャンバに至る流体路を
横切って配設された流体透過膜を除き、実質上密閉され
ている。チャンバに対し膜の外側に置かれた液体サンプ
ルは、チャンバの容量を増すことによって発生される吸
引作用により、膜を通ってチャンバ内に引き寄せられる
。逆に、チャンバ内の液体は、チャンバの容量を減じる
ことによって生じる内圧により、膜を通ってチャンバ外
に引き出される。好ましくは、膜手段が膜層を含み、こ
の膜層上に免疫試薬が固定され、多孔性の支持体が膜に
隣接して配置される。橿織対は免疫成分など、分析すべ
き液体サンプル中に可溶な別の免疫試薬も、多孔性の支
持体上に被覆される。試薬は、液体サンプルが支持体を
通過するときに溶解する。 液体サンプルの成分は、好ましくは上記のHaを用いて
、周囲から密閉されたチャンバ内へ至る間口を横切って
配置された透過膜の片側にサンプルを接触させることに
より、膜上に検出可能な反応生成物を形成して検定され
る。チャンバの容量は、膜手段を通してサンプルを選択
的に移動させるように変化される。 サンドイッチ検定
の実施例において、液体サンプルは生物から採取された
もので(尿や血清など)、検定すべき抗原または抗体を
含む。 抗原の分析の場合、その抗原が結合する膜上に1つの試
薬捕獲抗体が固定される。可溶な[織対は抗体である別
の試薬が結合した抗原と反応し、膜上に検出可能な反応
生成物を形成する。 好ましい実施例において、チャンバの容量は何回も増減
されてサンプルを膜を通して逆及び順方向にサイクル循
環さき、混合効率を改善することによって、反応時間を
減少させるとともに検定感度を高める。サイクルを始め
るには、最初のサンプルを所望に応し膜手段の外表面上
におくか、あるいはチャンバ内に満たせばよい。 別の好ましい実施例では、1つの試薬が膜上のドツトな
ど少なくとも1つの限定領域上に集中され、検出可能な
反応生成物がそのドツトで形成される。例えば、抗原の
サンドイッチ検定の場合、捕5i抗体が膜上のドツト位
置に保持され、同じ場所で1識付は抗体と免疫的に反応
する抗原を捕獲する。サンプル中の異なった抗原を同時
に検定するため、異なプた抗原と固有に反応する抗体を
含む複数のドツトを用いてもよい。 (実施例) 次にまず、図示した本発明の装置を、該装置を用いて実
施可能な各種検定法の幾つかに基づいて説明する。 図面を参照すると、番号lOで表した検定装置が、可変
容量の中空内部空間つまりチャンバ12を画成する容器
手段の形で示しである。容器手段は中空本体14とピス
トン手段16を備え、ピストン手段16は中空本体14
との間での相対的な移動に応じ中空本体に対して進入及
び後退自在に装着されている。ピストン手段16は容器
手段の一部を形成する可動な壁手段として機能し、チャ
ンバ12の容量を変化させる。図示のごとく、中空本体
14はほぼU字状の垂直断面と円形の水平断面を有する
。0字体の側壁14aが、そのアームの上部に位置する
ほぼ矩形断面のリム状把持面を画成する。また図示のご
とく、0字体のベース部は、アームの高さよりかなり大
きい直径を有する。中空本体14の内壁はラセン溝14
1)を含み、ここに後述するようにピストン手段16の
ネジ山が噛み合う。中空本体14は所望に応じ°、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビ
ニル等の使い捨てプラスチック材、あるいは装置lOの
再使用を可能とする金属(例えばアルミ)等の耐久材で
形成される。 ピストン手段16は、外部からアクセス可能な把持面1
8aを含むピストン部材1日を備える。 ピストン部材18は、本体14と協働してチャンバ12
を画成する円形の直立壁部18bを含む。 壁部18aがチャンバ12内に液体を閉じ込めるための
リムを形成する。ピストン部材16は更に内側に突き出
た円形突部18cを含み、該突部18Cが隣接する環状
保持挿入体20の内側に突き出た凸状内壁をそこに着座
させる。またピストン部材18は0リング満186を含
み、そこにゴムから成るのが好ましい柔軟な0リングが
着座されろ。更にピストン部材18は、本体14のラセ
ン状114bと噛み合うラセン状の雄ネジ山18eを有
する。 膜手段24が、挿入体内u 2 Oa内に圧力嵌めされ
ることによって、ピストン部材18の開放中心部内に保
持される。図示のごとく膜手段24は、外部から目視可
能な上面を備えた膜ディスク24aの形をした多孔性膜
と、線膜24aの内側に隣接して位置し、同じく挿入体
内壁20aで保持された独立の多孔性支持ディスク24
bとを含む。 第3a図を参照すると、本装置は容量可変のチャンバ1
2がほぼ最小容量にある状態で示しである。両1f!持
面14a、18alt掴むことによって、ピストン部材
18を本体14に対して旋回させ、ピストン部材を本体
から外側−こ移動してチャンバ12の容量を増大させる
ことができる。チャンバ12は膜手段24に対応する面
を除き、環境から実質上密閉されている。ピストン部材
18が移動するとき、0リング22が本体のない璧に対
して圧力密閉を保持する。従って、ピストン部材18が
第3a図に示した状態にあるとき液体を膜の外表面上に
おき、ピストン部材を旋回して第3b図に示した位置へ
とチャンバ12を増大させると、チャンバ容量の増大に
伴う吸引作用によって液体がチャンバ内に引き込まれる
。逆に、ピストン部材18が第3a図に示した位置へ戻
るときは、発生する内圧の作用で液体は反対方向に膜を
通過する。 膜ディスク24aの膜は、試薬とサンプル成分の反応生
成物を反応に悪影響を及ぼさずに固定でき、また過度な
圧力降下を生ぜずに液体サンプルの残りあるいは洗浄液
を通過可能とする任意の物とし得る。適切な膜はニトロ
セルロースまたはナイロンで形成されるが、上記の特性
を備えた別の種類の膜も使える。膜の細孔は、約0.
2〜12ミクロンの範囲で変(ヒするのが好ましい。 代表的な方式では、後述するように、まず免疫試薬が膜
上に固定される。試薬は、検出すべき液体サンプルの所
定成分と免疫的に反応してこれを捕獲する。一般に抗体
や抗原なとのタンパク質であるこのような免疫試薬は、
吸着や共有結合によってニトロセルロースなと所定の膜
上に直接固定できる。 膜の深さつまり厚さは、サンプル成分を捕S呈するのに
適量の免疫試薬が固定可能なように選定される。但し、
膜を通した液体サンプルの通過によって過度な圧力降下
を生じるほど厚さを大きくしてはならない。この目的上
、膜の適切な厚さは200〜300ミクロンである。 上記の厚さの膜は、本装置によって加わる圧力にさらさ
れると、チャンバ12内へと引き裂けたり潰れるのに抵
抗できる強度を持ち合わせていない。そこで、膜24a
とチャンバ120間に多孔性の支持ディスク24bを含
めるのが好ましい。 支持ディヌクは所望に応じ、膜から分離してもよいしあ
るいは膜に接合してもよい。支持ティスフ24bは、G
lassrock辻から市販されているポリエステルや
ガラスファイバ等の可どう性プラス1ツク材で形成でき
、膜24aより高い剛性を持つのが好ましい。また1l
X24 aより厚く、一般に1〜2mmの範囲であるの
が好ましい。さらに支持ディスクは、液体サンプルがチ
ャンバに対して人出するとき過度な圧力降下を生しない
ように、充分に多孔性である。 支持ディスク24bは、液体サンプル内で可溶な乾燥試
薬を支持し得る。液体サンプルが支持ディスク24bを
通って流れるとき、試薬が膜24aへと流れサンプル成
分と反応する。これは、別の成分を独立に追加するステ
ップを節約可能とする。例えば、抗原のサンドイッチ検
定の場合、1つの抗体が膜24a上に固定され、可溶な
標織対は抗体が直接凍結乾燥するなとして、支持ディス
ク24b上に乾燥状慈で被着される。支持ディスクを通
る液体サンプルの通過は、それど共に内部に存在する対
応サンプルとサンドイッチを形成する可溶な標識何は抗
体を移動させる。所望なら、可溶な乾燥試薬を、チャン
バ12に露出され従って液体サンプルと接触する池の部
分に被着してもよい。 動作時、本方式の検定装置は広く液体サンプルの所定成
分を、サンプル中にその成分が存在することの支持とし
て膜ディスク24a上に検出可能な生成物を形成する少
なくとも1つの試薬によって求めるのに使える。液体サ
ンプルか膜手段24aの片面に接触され、チャンバの容
量が変化されて、液体サンプルを膜手段を通しチャンバ
内及び外へと選択的にサイクル循環させる。完全なサイ
クルを可能とするため、チャンバは吸収物質を実質土倉
まない。 本方式は持;こ、サンプル成分が抗原、抗体、またはハ
ブテン(付着体)を含む免疫対の一成分であるような免
疫検定ここ適用可能である。免疫対は、相互ξこ免疫的
に結合する2つの成分を含む。特定の免疫対には抗原と
その抗体(単クローン性抗体あるいは多クローン性抗体
)、生物学的に官能なハブテンとその抗体、酵素とその
基質、t3ルモンとそのレセプタ(受容体)、ビタミン
とそのし七ブタ、ビオチンとアビジンまたはビオチン抗
体、及びレクチンとそれと固有に結合するモノ、ジまた
はトリ糖類が含まれる。 説明を簡単にするため、抗原−抗体免疫対を用いた免疫
検定に関連して本方式を説明する。液体サンプルは生物
から採取され(尿や血清など)、1つの試薬が標織対は
抗原または抗体から成る。 まず抗原検出のためのサンドイッチ検定についてみると
、1つの試薬がサンプル中の所定抗原zコ。 固有な標織対は抗体である。本方式ではざらに別の試薬
、つまり同じく所定の抗原に固有ノJか、装置に液体サ
ンプルを加える前に膜ディスク24 ill上に固定さ
れる捕獲抗体を用いる7 甲ノア1コーン性あるいは多
クローン性抗体等のタンパク質を、不活性化を生じるこ
となく膜ディスク24,1ち゛との固体表面に固定する
方法は周知てあ% e b!Iえ;J、5chuur
sの米国特許第3+551,555号及び )Iend
ry(也の論文、 J、 1mmun、 Mett
+ods、 35 HfB2.235 G参照の
こと。ナイロン等のプラスチック材の場合には、例えば
米国特許第3,720.7’60号に記されているよう
なタンパク質が共有結合によって結合可能である。ナイ
ロンの単位面積当りに固定されるタンパク質の量は、ニ
トロセルロースの場合より多い。 サンドイッチ検定で使われる標識骨は抗体または抗原は
、抗体に対して共役な放射性標識、酵素標識、あるいは
金属複合標識を含む任意の通常のものとし得る。 この
ような免疫基質と標識間における共役関係の形成は周知
である;例えば(a)放射性標識−米国特許第3,64
6,348号、Hunter他の論文、Nature
142 (+962)、 945; (b )酵素標
識−米国特許第3.654,090号、第3,791,
931号及び第3,817,838号、Wilson他
著、免疫蛍光と関連染色法、 Knapp、、 W、
et at、 Eds、 L、 5evie
r−NorthHolland、 Bio−Medic
al PreSS+ Nev York−Amster
−dan、 !978. pp、215−224: (
c )蛍光消滅標識−米国特許第3,996.345号
; (d)放射性標識−米国特許第4 、062 、7
33号: (e)蛍光または酵素標識−米国特許第4,
067.959号; (f)化学ルミネセッセンス標識
−米国特許第4,104,029号; (g)非酵素触
媒標識−米国特許第4,160,645号;(h)酵素
対標識−米国特許第4,233,402号、化学的に誘
起される蛍光標識−米国特許第4,720,450号;
及び(i)酵素非イオン化電荷標識−米国特許第4.2
87,300号。更に、米国特許第4,366.241
号に開示された標識も使える。また、コロイド金標識に
ついては後で詳述する。 酵素を標識として用いる場合、膜表面上の反応生成物中
における酵素標識の存在は、酵素と反応して発色する溶
液中の基質に酵素が接触することによって検出される。 本手順では、液体サンプルの所定回数のサイクル後、液
体サンプルを廃棄してから、基質が膜上の反応生成物と
接触させられる。液体サンプルと同しく、基質溶液を膜
の外表面上に被着し、チャンバ12の容量を増すことに
よって生じる吸引作用で膜に通してもよい。あるいは、
基質溶液を初めにチャンバ内にいれ、チャンバ容tを減
じることによってチャンバから押し出すようにしてもよ
い。いずれにせよ、基質によって形成された色を、膜の
外側露出面から見て取ることができる。 細胞化学マーカ等のプローブ用として使えるコロイド金
共役体は、顕微鏡検査の分野で周知である。例えば、S
canning Electron Microsco
py。 1981、 II、 pp、 9−31. r免疫細
胞化学J Ecls。 Po1ak、 J、N、、 et at、、
Br1stol 、 London、 Boston
(+982) pp、82−112.及びJourna
l of NeuroscienceMethods、
74(1983)、 pp、 l−18を参照のこと
。コロイド金粒子マーカは、他の通常のマーカと比へ使
用が簡単である。例えば、放射性同位体なと他のマーカ
の検出て必要な測定機器を必要としない。 また酵素の場合と異なり、基質を加える追加のステップ
を必要としない。しかしコロイド金粒子マーカは、おそ
らく反応物を混合するのに従来の方法を用いており可視
度が低いことが理由で、市販の免疫検定キットでは広く
使われていない。ウリえば、貫流枚方式てコロイド金共
役体を用いた検定の感度は、所望レヘルの感度を与える
のに不十分である。液体サンプルと試薬を膜を通してサ
イクル循環させると、高価な顕微鏡を使わなくてもコロ
イド金粒子共役体を免疫検定キット用の試薬として使え
るように、混合が改善されることが見いだされている。 この点において、膜を通して液体サンプルを少なくとも
3回サイクル循環させると検定感度が′4′:JIO倍
以上高まる一方、少なくとも15回のサイクル循環は約
50〜100倍以上感度を高める。 本方式で混合能力を高めても金−免疫試薬共役体の感度
が不十分なときは、Holgate、 C,S、、池の
論文、 J、 Histochem、 Cytoc
hem 31:938 (+9133)とDanch
er、 G、他の論文J、 Histochem、 C
ytochem31:l394 (+983)に開示さ
れているような金趨合棒の感度を更に改善するための方
法を用いることもてきる。この方式は、コロイド金に吸
収される免疫試薬、すなわち免疫グロブリンを用いる「
間接」法である。金粒子が、銀沈澱反応によって顕示さ
れる。要するに、銀の増感が、銀イオンを錫金属に変換
させる写真の物理的現像プロセスを触媒する金の触媒作
用を利用して起きる。適切なコロイド金または金ゾル粒
子のサイズは3nm〜150nmである。この免疫金−
銀染色法は、i!染色を施さない金粒子を用いた場合に
比へ200倍まで感度を高められる。 サイクル循環によって可能な感度の向上は、固定された
免疫試薬とサンプル成分との接触の理論的モデルから明
かとなる。免疫試薬、この例では抗体、は吸着か共有結
合によって膜上に固定される。抗体はチャネルつまり膜
の細孔に露出され、抗体のすぐ近くを通るサンプル中の
抗原だけを捕獲可能である。サンプルをサイクル循環し
て膜の細孔を通って流れる異なったサンプル部分との接
触を可能とすれば、抗原と固定抗体の間で反応が生じる
可能性が大幅に上昇し、検定の感度だけでなくその速度
も高める。 サイクル循環の混合効果は特に、後述するごとく、免疫
試薬が膜上のドツトなと特定の領域に集中される場合に
顕著である。この場合、固定抗体はその1つのドツトに
だけ被着される。従って貫流方式では、ドツト上方の想
像上の円柱内に存在するサンプルの抗原だけが抗体に接
触する。残りのサンプル内の抗原は、抗体と接触せずに
膜を通過する。これに対し、抗原をサイクル循環して異
なったサンプル部分を連続的に混合させれば、著しく多
くの抗原が膜上の固定抗体に露出され、上記の好ましい
結果が得られる。混合効率を高めるというこの原理は、
本方式を使える従来の何れの免疫検定にも適用できる。 また、効率つまり相互作用の上昇は反応物の局部的1度
を上昇させ、更に反応の活動力を増大させる。 標識付は抗体は、サンプルと同時に加えてもよいし、サ
ンプルの追加の前または後に加えてもよい。特に好まし
い実施列において、標識付は抗体は)α体サンプルの追
加前に、多孔性支持ディスク24b上に保持される乾燥
形帖で被着される。次いで、サンプルが膜24bを通っ
て何れかの方向に流れると、標識付は抗体が溶解し、サ
ンプル中に存在する抗原と反応して、膜24aの表面上
に固定抗体・抗原・標識付は抗体のサンドイッチを形成
する。また本方式は、抗原と抗体を逆にし、固定抗原・
抗体・標識付け抗原(または抗抗体)のサンドイッチを
形成して抗体を検出するのにも適用できる。 前述したように、分析の一ステップは、標識付は抗体を
支持ディスク上に予め被着することによって省ける。こ
れは、膜を通して液体サンプルが順及び逆方向にサイク
ル循環されることで可能となる。支持ディスク24bを
不透明材て形成すれば、チャンバ12内に保持された液
体サンプル中の検出可能な標識は膜24aの外側露出面
上で見えず、従ってその上面で発生される信号と干渉し
ない。要するに支持ディスク14bは、チャンバ内の未
反応標識付け試薬によるパックグランド信号と膜上での
標識付は反応生成物との間での視覚マスクとしても機能
する。 また本発明は、共有結合法にも適用可能である。 この方式で液体サンプル中の抗原を検出場合には、免疫
対の対応要素、つまり抗体が膜の表面上に固定される。 サンプル中の検出すべき抗原と同じ免疫特性を持ち前述
したように標識付けされた抗原が、膜上の固定抗体と接
触させられる。固定抗体は制限されて与えられ、サンプ
ル中の抗原と標識付は抗体との間で競合が設定される。 従って、標識から発せられる信号はサンプル中の抗原の
量に反比例する。このような膜を用いた競合結合方法は
、8agshaweの米国特許第3,888,629号
に記されている。 サンドイッチ検定の場合と同じく、競合結合検定は抗原
と抗体の役割を逆にしても行える。この場合、免疫対の
固定要素は、標識付は抗体と競合するサンプル中の抗体
を検出するための抗原である。 またサンドイッチ検定と同様、競合結合検定も本方式を
用いて簡単化できる。つまり、標識付は免疫試薬共役体
、例えば抗原標識を、凍結乾燥状態で多孔性の支持ディ
スク24b上に被覆可能である。抗原を含むと考えられ
る液体サンプルが支持ディスクに接触すると、標識付は
抗原が溶解して膜24aに運ばれ、そこで膜表面におけ
る制限された抗体に対して、サンプルの抗原と標識付け
抗原との間で競合が設定される。 前述した免疫検定は、サンドイッチ検定と競合結合検定
である。本発明の方式は、例えば米国特許第4,3ss
、2u号に記されているようなその他の免疫検定にも使
える。 分析すべき物質には、タンパク質など広い範囲の生物か
ら採取された物質が含まれる。以下にこれらの物質の一
部を列挙する。列挙物質は、免疫反応する抗体及び物質
の両分も含む。
から得たサンプルを試験する装置及び方法に関する。 (従来の技術) 従来広範囲のさまざまな免疫検定が存在し、これらの検
定では免疫対の一方の成分、例えば抗原または抗体が標
識付は抗原または抗体を用いて検出または測定される。 競合的結合法として知られる1つの手法では、検出すべ
き成分と同一免疫(小の標識11け試薬との間で競合が
設定される。1シ1]えば、α体サンプル中における抗
原の検出の場合、サンプルと標識付は抗原がその抗原に
特有な抗体に接触させられる。抗体と結合する標識(寸
は抗原の量が、サンプル中に存在する抗原の量に逆比例
する。 サンドイッチ検定として知られる別の検定法でBl、固
定された捕獲抗体が固体表面に結合され、サンプル中の
抗原が免疫的に抗体と反応する。別の標識付は抗体も抗
原と反応し、固定反応生成物を形成する。反応生成物中
の標識物が、サンプル中の抗原の存在を指示するものと
して検出される。 ここで「標識付け」という用語は、免疫試薬が信号をそ
れ自体で発するか、あるいは信号を発生せしめる標識(
ラヘルまたはタグ)を持った共役体に形成されているこ
とを意味する。各種のは識には、放射性同位体、クロモ
ゲン(色原体)、金属ゾル粒子(特にコロイド金、銀及
びキレート化合)、及び酵素が含まれる。各か1のおい
て、これらの標識は直接的または間接的に検出可能であ
る。 酵素標識は、その酵素が存在するときにだけ可視信号(
光や蛍光など)へと変換される基質と反応する。 サンドイツチ法を用いた抗原の検出または測定の場合、
動物から採取した多クローン性の抗血清つまり抗体が、
標識付は抗体及び表面上の捕S貢抗体として長年使われ
てきている。最近、多クローン性抗体の代わりに、単ク
ローン性抗体が検定で使われるようになった。このよう
な1つの方式はWadaft!!の論文、 Cl1n、
Chem、、 Vol、 28. No、
9゜1982、 I)p、 +862−1866に記
されており、固相の抗体が特定抗原、hCG 、の1サ
ブユニツトに差し向けられる一方、酵素と結合した単ク
ローン性抗体が別のサブユニットに差し向けられる。こ
の→lンドイッチ検定では、サンプルの加えられる試験
管のない部が固体表面で、その上に捕獲抗体が固定され
る。他の固体表面として、計量棒、プラスチックボール
または磁気ボールがあり、これにも浦Sf抗体が担持さ
れろ。 固体表面での反応は、固定または可溶試薬とサンプル成
分との間の接触が制限されるため比較的遅い。抗体分子
が3次元のマトリックスで露出されるように、捕獲抗体
を多孔性膜内に固定することによって検定時間が減じら
れてきた。かかる方式では、抗原を含む液体サンプルが
膜を通り、その下側のサンプルを引き寄せる吸収物質内
へと移動する。競合的結合検定で用いるためのこのよう
な一方式は、Bagshaweの米国特許第3,888
,629号に開示されている。サンドイッチ検定用の別
の方式は、Valkris他の論文、Cl1n、 Ch
em、、 Vol’、3+。 No、 9.1985. l111.1427−143
1に開示されている。 この方式でも、液体サンプルがそこを通って吸収床内へ
と移動する多孔性膜を用いている。反応時間を−i短縮
するため、試薬と液体サンプルがそこを通って吸収物質
内へと移動する膜中で免疫反応が生じるようにした更に
別の方式も、Tom他の米国特許第4,366.241
号に開示されている。 下側に吸収物質を備えた別の膜力式が、Co1e他の米
国特許第4,246,339号に開示されている。この
方式では、初めに液体サンプルが、装置頂部のミクロ多
孔性膜の底壁を持つ試験ウェルのアレイ内に置かれろ。 多孔性吸収物質を含む反応表面膜がアレイの下側に配置
され、両者間に中間チャンバが形成される。反応手順の
開始まで試験ウェルの膜は反応表面膜と接触しないよう
に保たれ、反応手順の開始時点で両膜が相互に接触し、
液体が両膜を通って吸収物質に引き寄せられる。反応生
成物から発せられる信号を、反応表面膜上て観察する。 容量の変化が内圧を左右しないように、空気口が中間子
ャンバに設けられる。 (発明が解決しようとする問題点) 上記の膜装置は全て1貫流(ワンススルー〉」方式で、
膜を通過する液体が吸収物質で吸収され。 反対方向には通過しない。つまり、捕獲抗体が膜上の特
定点に集中すると、その点の真上の想像上の円柱内に存
在する物質だけが線点の抗体と出会うことになる。これ
は混合度、ひいては系の感度及び速度を制限する。 (問題点を解決するための手段) 本発明によれば、流体(または液体)サンプル、特に生
物から採取した体液の成分を検出するための検定装置及
び方法が提供される。本装置は、可変容量のチャンバを
画成する容器を含む。好ましくは、本体に対して進入及
び後退移動自在に、できればネジ係合で装着されたピス
トンを用い、“チャンバの容量を変化させる手段が設け
られる。チャンバは、入口からチャンバに至る流体路を
横切って配設された流体透過膜を除き、実質上密閉され
ている。チャンバに対し膜の外側に置かれた液体サンプ
ルは、チャンバの容量を増すことによって発生される吸
引作用により、膜を通ってチャンバ内に引き寄せられる
。逆に、チャンバ内の液体は、チャンバの容量を減じる
ことによって生じる内圧により、膜を通ってチャンバ外
に引き出される。好ましくは、膜手段が膜層を含み、こ
の膜層上に免疫試薬が固定され、多孔性の支持体が膜に
隣接して配置される。橿織対は免疫成分など、分析すべ
き液体サンプル中に可溶な別の免疫試薬も、多孔性の支
持体上に被覆される。試薬は、液体サンプルが支持体を
通過するときに溶解する。 液体サンプルの成分は、好ましくは上記のHaを用いて
、周囲から密閉されたチャンバ内へ至る間口を横切って
配置された透過膜の片側にサンプルを接触させることに
より、膜上に検出可能な反応生成物を形成して検定され
る。チャンバの容量は、膜手段を通してサンプルを選択
的に移動させるように変化される。 サンドイッチ検定
の実施例において、液体サンプルは生物から採取された
もので(尿や血清など)、検定すべき抗原または抗体を
含む。 抗原の分析の場合、その抗原が結合する膜上に1つの試
薬捕獲抗体が固定される。可溶な[織対は抗体である別
の試薬が結合した抗原と反応し、膜上に検出可能な反応
生成物を形成する。 好ましい実施例において、チャンバの容量は何回も増減
されてサンプルを膜を通して逆及び順方向にサイクル循
環さき、混合効率を改善することによって、反応時間を
減少させるとともに検定感度を高める。サイクルを始め
るには、最初のサンプルを所望に応し膜手段の外表面上
におくか、あるいはチャンバ内に満たせばよい。 別の好ましい実施例では、1つの試薬が膜上のドツトな
ど少なくとも1つの限定領域上に集中され、検出可能な
反応生成物がそのドツトで形成される。例えば、抗原の
サンドイッチ検定の場合、捕5i抗体が膜上のドツト位
置に保持され、同じ場所で1識付は抗体と免疫的に反応
する抗原を捕獲する。サンプル中の異なった抗原を同時
に検定するため、異なプた抗原と固有に反応する抗体を
含む複数のドツトを用いてもよい。 (実施例) 次にまず、図示した本発明の装置を、該装置を用いて実
施可能な各種検定法の幾つかに基づいて説明する。 図面を参照すると、番号lOで表した検定装置が、可変
容量の中空内部空間つまりチャンバ12を画成する容器
手段の形で示しである。容器手段は中空本体14とピス
トン手段16を備え、ピストン手段16は中空本体14
との間での相対的な移動に応じ中空本体に対して進入及
び後退自在に装着されている。ピストン手段16は容器
手段の一部を形成する可動な壁手段として機能し、チャ
ンバ12の容量を変化させる。図示のごとく、中空本体
14はほぼU字状の垂直断面と円形の水平断面を有する
。0字体の側壁14aが、そのアームの上部に位置する
ほぼ矩形断面のリム状把持面を画成する。また図示のご
とく、0字体のベース部は、アームの高さよりかなり大
きい直径を有する。中空本体14の内壁はラセン溝14
1)を含み、ここに後述するようにピストン手段16の
ネジ山が噛み合う。中空本体14は所望に応じ°、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビ
ニル等の使い捨てプラスチック材、あるいは装置lOの
再使用を可能とする金属(例えばアルミ)等の耐久材で
形成される。 ピストン手段16は、外部からアクセス可能な把持面1
8aを含むピストン部材1日を備える。 ピストン部材18は、本体14と協働してチャンバ12
を画成する円形の直立壁部18bを含む。 壁部18aがチャンバ12内に液体を閉じ込めるための
リムを形成する。ピストン部材16は更に内側に突き出
た円形突部18cを含み、該突部18Cが隣接する環状
保持挿入体20の内側に突き出た凸状内壁をそこに着座
させる。またピストン部材18は0リング満186を含
み、そこにゴムから成るのが好ましい柔軟な0リングが
着座されろ。更にピストン部材18は、本体14のラセ
ン状114bと噛み合うラセン状の雄ネジ山18eを有
する。 膜手段24が、挿入体内u 2 Oa内に圧力嵌めされ
ることによって、ピストン部材18の開放中心部内に保
持される。図示のごとく膜手段24は、外部から目視可
能な上面を備えた膜ディスク24aの形をした多孔性膜
と、線膜24aの内側に隣接して位置し、同じく挿入体
内壁20aで保持された独立の多孔性支持ディスク24
bとを含む。 第3a図を参照すると、本装置は容量可変のチャンバ1
2がほぼ最小容量にある状態で示しである。両1f!持
面14a、18alt掴むことによって、ピストン部材
18を本体14に対して旋回させ、ピストン部材を本体
から外側−こ移動してチャンバ12の容量を増大させる
ことができる。チャンバ12は膜手段24に対応する面
を除き、環境から実質上密閉されている。ピストン部材
18が移動するとき、0リング22が本体のない璧に対
して圧力密閉を保持する。従って、ピストン部材18が
第3a図に示した状態にあるとき液体を膜の外表面上に
おき、ピストン部材を旋回して第3b図に示した位置へ
とチャンバ12を増大させると、チャンバ容量の増大に
伴う吸引作用によって液体がチャンバ内に引き込まれる
。逆に、ピストン部材18が第3a図に示した位置へ戻
るときは、発生する内圧の作用で液体は反対方向に膜を
通過する。 膜ディスク24aの膜は、試薬とサンプル成分の反応生
成物を反応に悪影響を及ぼさずに固定でき、また過度な
圧力降下を生ぜずに液体サンプルの残りあるいは洗浄液
を通過可能とする任意の物とし得る。適切な膜はニトロ
セルロースまたはナイロンで形成されるが、上記の特性
を備えた別の種類の膜も使える。膜の細孔は、約0.
2〜12ミクロンの範囲で変(ヒするのが好ましい。 代表的な方式では、後述するように、まず免疫試薬が膜
上に固定される。試薬は、検出すべき液体サンプルの所
定成分と免疫的に反応してこれを捕獲する。一般に抗体
や抗原なとのタンパク質であるこのような免疫試薬は、
吸着や共有結合によってニトロセルロースなと所定の膜
上に直接固定できる。 膜の深さつまり厚さは、サンプル成分を捕S呈するのに
適量の免疫試薬が固定可能なように選定される。但し、
膜を通した液体サンプルの通過によって過度な圧力降下
を生じるほど厚さを大きくしてはならない。この目的上
、膜の適切な厚さは200〜300ミクロンである。 上記の厚さの膜は、本装置によって加わる圧力にさらさ
れると、チャンバ12内へと引き裂けたり潰れるのに抵
抗できる強度を持ち合わせていない。そこで、膜24a
とチャンバ120間に多孔性の支持ディスク24bを含
めるのが好ましい。 支持ディヌクは所望に応じ、膜から分離してもよいしあ
るいは膜に接合してもよい。支持ティスフ24bは、G
lassrock辻から市販されているポリエステルや
ガラスファイバ等の可どう性プラス1ツク材で形成でき
、膜24aより高い剛性を持つのが好ましい。また1l
X24 aより厚く、一般に1〜2mmの範囲であるの
が好ましい。さらに支持ディスクは、液体サンプルがチ
ャンバに対して人出するとき過度な圧力降下を生しない
ように、充分に多孔性である。 支持ディスク24bは、液体サンプル内で可溶な乾燥試
薬を支持し得る。液体サンプルが支持ディスク24bを
通って流れるとき、試薬が膜24aへと流れサンプル成
分と反応する。これは、別の成分を独立に追加するステ
ップを節約可能とする。例えば、抗原のサンドイッチ検
定の場合、1つの抗体が膜24a上に固定され、可溶な
標織対は抗体が直接凍結乾燥するなとして、支持ディス
ク24b上に乾燥状慈で被着される。支持ディスクを通
る液体サンプルの通過は、それど共に内部に存在する対
応サンプルとサンドイッチを形成する可溶な標識何は抗
体を移動させる。所望なら、可溶な乾燥試薬を、チャン
バ12に露出され従って液体サンプルと接触する池の部
分に被着してもよい。 動作時、本方式の検定装置は広く液体サンプルの所定成
分を、サンプル中にその成分が存在することの支持とし
て膜ディスク24a上に検出可能な生成物を形成する少
なくとも1つの試薬によって求めるのに使える。液体サ
ンプルか膜手段24aの片面に接触され、チャンバの容
量が変化されて、液体サンプルを膜手段を通しチャンバ
内及び外へと選択的にサイクル循環させる。完全なサイ
クルを可能とするため、チャンバは吸収物質を実質土倉
まない。 本方式は持;こ、サンプル成分が抗原、抗体、またはハ
ブテン(付着体)を含む免疫対の一成分であるような免
疫検定ここ適用可能である。免疫対は、相互ξこ免疫的
に結合する2つの成分を含む。特定の免疫対には抗原と
その抗体(単クローン性抗体あるいは多クローン性抗体
)、生物学的に官能なハブテンとその抗体、酵素とその
基質、t3ルモンとそのレセプタ(受容体)、ビタミン
とそのし七ブタ、ビオチンとアビジンまたはビオチン抗
体、及びレクチンとそれと固有に結合するモノ、ジまた
はトリ糖類が含まれる。 説明を簡単にするため、抗原−抗体免疫対を用いた免疫
検定に関連して本方式を説明する。液体サンプルは生物
から採取され(尿や血清など)、1つの試薬が標織対は
抗原または抗体から成る。 まず抗原検出のためのサンドイッチ検定についてみると
、1つの試薬がサンプル中の所定抗原zコ。 固有な標織対は抗体である。本方式ではざらに別の試薬
、つまり同じく所定の抗原に固有ノJか、装置に液体サ
ンプルを加える前に膜ディスク24 ill上に固定さ
れる捕獲抗体を用いる7 甲ノア1コーン性あるいは多
クローン性抗体等のタンパク質を、不活性化を生じるこ
となく膜ディスク24,1ち゛との固体表面に固定する
方法は周知てあ% e b!Iえ;J、5chuur
sの米国特許第3+551,555号及び )Iend
ry(也の論文、 J、 1mmun、 Mett
+ods、 35 HfB2.235 G参照の
こと。ナイロン等のプラスチック材の場合には、例えば
米国特許第3,720.7’60号に記されているよう
なタンパク質が共有結合によって結合可能である。ナイ
ロンの単位面積当りに固定されるタンパク質の量は、ニ
トロセルロースの場合より多い。 サンドイッチ検定で使われる標識骨は抗体または抗原は
、抗体に対して共役な放射性標識、酵素標識、あるいは
金属複合標識を含む任意の通常のものとし得る。 この
ような免疫基質と標識間における共役関係の形成は周知
である;例えば(a)放射性標識−米国特許第3,64
6,348号、Hunter他の論文、Nature
142 (+962)、 945; (b )酵素標
識−米国特許第3.654,090号、第3,791,
931号及び第3,817,838号、Wilson他
著、免疫蛍光と関連染色法、 Knapp、、 W、
et at、 Eds、 L、 5evie
r−NorthHolland、 Bio−Medic
al PreSS+ Nev York−Amster
−dan、 !978. pp、215−224: (
c )蛍光消滅標識−米国特許第3,996.345号
; (d)放射性標識−米国特許第4 、062 、7
33号: (e)蛍光または酵素標識−米国特許第4,
067.959号; (f)化学ルミネセッセンス標識
−米国特許第4,104,029号; (g)非酵素触
媒標識−米国特許第4,160,645号;(h)酵素
対標識−米国特許第4,233,402号、化学的に誘
起される蛍光標識−米国特許第4,720,450号;
及び(i)酵素非イオン化電荷標識−米国特許第4.2
87,300号。更に、米国特許第4,366.241
号に開示された標識も使える。また、コロイド金標識に
ついては後で詳述する。 酵素を標識として用いる場合、膜表面上の反応生成物中
における酵素標識の存在は、酵素と反応して発色する溶
液中の基質に酵素が接触することによって検出される。 本手順では、液体サンプルの所定回数のサイクル後、液
体サンプルを廃棄してから、基質が膜上の反応生成物と
接触させられる。液体サンプルと同しく、基質溶液を膜
の外表面上に被着し、チャンバ12の容量を増すことに
よって生じる吸引作用で膜に通してもよい。あるいは、
基質溶液を初めにチャンバ内にいれ、チャンバ容tを減
じることによってチャンバから押し出すようにしてもよ
い。いずれにせよ、基質によって形成された色を、膜の
外側露出面から見て取ることができる。 細胞化学マーカ等のプローブ用として使えるコロイド金
共役体は、顕微鏡検査の分野で周知である。例えば、S
canning Electron Microsco
py。 1981、 II、 pp、 9−31. r免疫細
胞化学J Ecls。 Po1ak、 J、N、、 et at、、
Br1stol 、 London、 Boston
(+982) pp、82−112.及びJourna
l of NeuroscienceMethods、
74(1983)、 pp、 l−18を参照のこと
。コロイド金粒子マーカは、他の通常のマーカと比へ使
用が簡単である。例えば、放射性同位体なと他のマーカ
の検出て必要な測定機器を必要としない。 また酵素の場合と異なり、基質を加える追加のステップ
を必要としない。しかしコロイド金粒子マーカは、おそ
らく反応物を混合するのに従来の方法を用いており可視
度が低いことが理由で、市販の免疫検定キットでは広く
使われていない。ウリえば、貫流枚方式てコロイド金共
役体を用いた検定の感度は、所望レヘルの感度を与える
のに不十分である。液体サンプルと試薬を膜を通してサ
イクル循環させると、高価な顕微鏡を使わなくてもコロ
イド金粒子共役体を免疫検定キット用の試薬として使え
るように、混合が改善されることが見いだされている。 この点において、膜を通して液体サンプルを少なくとも
3回サイクル循環させると検定感度が′4′:JIO倍
以上高まる一方、少なくとも15回のサイクル循環は約
50〜100倍以上感度を高める。 本方式で混合能力を高めても金−免疫試薬共役体の感度
が不十分なときは、Holgate、 C,S、、池の
論文、 J、 Histochem、 Cytoc
hem 31:938 (+9133)とDanch
er、 G、他の論文J、 Histochem、 C
ytochem31:l394 (+983)に開示さ
れているような金趨合棒の感度を更に改善するための方
法を用いることもてきる。この方式は、コロイド金に吸
収される免疫試薬、すなわち免疫グロブリンを用いる「
間接」法である。金粒子が、銀沈澱反応によって顕示さ
れる。要するに、銀の増感が、銀イオンを錫金属に変換
させる写真の物理的現像プロセスを触媒する金の触媒作
用を利用して起きる。適切なコロイド金または金ゾル粒
子のサイズは3nm〜150nmである。この免疫金−
銀染色法は、i!染色を施さない金粒子を用いた場合に
比へ200倍まで感度を高められる。 サイクル循環によって可能な感度の向上は、固定された
免疫試薬とサンプル成分との接触の理論的モデルから明
かとなる。免疫試薬、この例では抗体、は吸着か共有結
合によって膜上に固定される。抗体はチャネルつまり膜
の細孔に露出され、抗体のすぐ近くを通るサンプル中の
抗原だけを捕獲可能である。サンプルをサイクル循環し
て膜の細孔を通って流れる異なったサンプル部分との接
触を可能とすれば、抗原と固定抗体の間で反応が生じる
可能性が大幅に上昇し、検定の感度だけでなくその速度
も高める。 サイクル循環の混合効果は特に、後述するごとく、免疫
試薬が膜上のドツトなと特定の領域に集中される場合に
顕著である。この場合、固定抗体はその1つのドツトに
だけ被着される。従って貫流方式では、ドツト上方の想
像上の円柱内に存在するサンプルの抗原だけが抗体に接
触する。残りのサンプル内の抗原は、抗体と接触せずに
膜を通過する。これに対し、抗原をサイクル循環して異
なったサンプル部分を連続的に混合させれば、著しく多
くの抗原が膜上の固定抗体に露出され、上記の好ましい
結果が得られる。混合効率を高めるというこの原理は、
本方式を使える従来の何れの免疫検定にも適用できる。 また、効率つまり相互作用の上昇は反応物の局部的1度
を上昇させ、更に反応の活動力を増大させる。 標識付は抗体は、サンプルと同時に加えてもよいし、サ
ンプルの追加の前または後に加えてもよい。特に好まし
い実施列において、標識付は抗体は)α体サンプルの追
加前に、多孔性支持ディスク24b上に保持される乾燥
形帖で被着される。次いで、サンプルが膜24bを通っ
て何れかの方向に流れると、標識付は抗体が溶解し、サ
ンプル中に存在する抗原と反応して、膜24aの表面上
に固定抗体・抗原・標識付は抗体のサンドイッチを形成
する。また本方式は、抗原と抗体を逆にし、固定抗原・
抗体・標識付け抗原(または抗抗体)のサンドイッチを
形成して抗体を検出するのにも適用できる。 前述したように、分析の一ステップは、標識付は抗体を
支持ディスク上に予め被着することによって省ける。こ
れは、膜を通して液体サンプルが順及び逆方向にサイク
ル循環されることで可能となる。支持ディスク24bを
不透明材て形成すれば、チャンバ12内に保持された液
体サンプル中の検出可能な標識は膜24aの外側露出面
上で見えず、従ってその上面で発生される信号と干渉し
ない。要するに支持ディスク14bは、チャンバ内の未
反応標識付け試薬によるパックグランド信号と膜上での
標識付は反応生成物との間での視覚マスクとしても機能
する。 また本発明は、共有結合法にも適用可能である。 この方式で液体サンプル中の抗原を検出場合には、免疫
対の対応要素、つまり抗体が膜の表面上に固定される。 サンプル中の検出すべき抗原と同じ免疫特性を持ち前述
したように標識付けされた抗原が、膜上の固定抗体と接
触させられる。固定抗体は制限されて与えられ、サンプ
ル中の抗原と標識付は抗体との間で競合が設定される。 従って、標識から発せられる信号はサンプル中の抗原の
量に反比例する。このような膜を用いた競合結合方法は
、8agshaweの米国特許第3,888,629号
に記されている。 サンドイッチ検定の場合と同じく、競合結合検定は抗原
と抗体の役割を逆にしても行える。この場合、免疫対の
固定要素は、標識付は抗体と競合するサンプル中の抗体
を検出するための抗原である。 またサンドイッチ検定と同様、競合結合検定も本方式を
用いて簡単化できる。つまり、標識付は免疫試薬共役体
、例えば抗原標識を、凍結乾燥状態で多孔性の支持ディ
スク24b上に被覆可能である。抗原を含むと考えられ
る液体サンプルが支持ディスクに接触すると、標識付は
抗原が溶解して膜24aに運ばれ、そこで膜表面におけ
る制限された抗体に対して、サンプルの抗原と標識付け
抗原との間で競合が設定される。 前述した免疫検定は、サンドイッチ検定と競合結合検定
である。本発明の方式は、例えば米国特許第4,3ss
、2u号に記されているようなその他の免疫検定にも使
える。 分析すべき物質には、タンパク質など広い範囲の生物か
ら採取された物質が含まれる。以下にこれらの物質の一
部を列挙する。列挙物質は、免疫反応する抗体及び物質
の両分も含む。
【交り旦lユツ
TgE、IgA、IgM、IgD
乱主潰
Aerobacter aerogenes(アエロバ
クタ−属ガス産生菌) Aerobic Spore−ForIIling B
acilli(好気性胞子形成かん菌) Bacillus anthracis (炭そ菌)
Bacillus 5ubtilis (枯草菌)B
acillus cereus Anaerobic Spore−forming
Bacilli(嫌気性胞子形成かん菌) Clostridium botulinum (ボ
ツリヌス菌)Clostridium tetani
(破傷風菌)Clostridium perfri
ngens (ウエルチ菌)Brucellae
(プルセラ属)8rucella melitensi
s (マルタ熱面)Brucella abortu
s (ウシ流産M)Brucella 5uis
(ブタ流産菌)Chlamydia (unclass
ifiable parasites−bacteri
al/viral) (クラミジア属(分類不能寄生
バクテリア/ヴイルス)) Ch!amydia agents Chlamydia trachomatis(トラコ
ーマクラミジア) Corynebacteria (コリネバクテリア
属)Corynebacterium dipther
iae (ジフテリア菌)Escherichia c
oli (大vA菌)Fungi (真菌) Cryptococcus neoformansHi
stoplasma capsulatumCocc
idioides imo+1tisCandida
albicans (カンジダアルビカンス)Mu
cor corymbifer (absidia c
orymbifera)Hemophilus−Por
detella group (ヘモフィルス群)H
emophilus 1nfluenzae (イン
フルエンザ菌)H,ducreyi (デュクレー菌
)H,hemophilus 1、aegypticus (エジプトへモフィルス
)1、parainfluenzae (バラインフ
ルエンザ薗)にeibsiella pneumoni
aeMycobacteria (マイコバクテリア
)Mycobacterium tuberculos
is hominis(大型結核菌) Mycobacterium bovis (ウシ型
結核菌)Mycobacterium avium
(鳥型結+a i >Mycobacterium 1
eprae (らいVJ)Mycobacteriu
m paratuberculosis(バラ結核菌) My(oplasmas (マイコブラスマ属)My
coplasmas pneumoniae(肺炎マイ
コブラスマ) Mycoplasias hominisNeisse
riae (ナイセリア属)Neisseria m
eninHitidis (髄膜炎菌)Neisse
ria 、gonorrheae (淋菌)その他の
病原体 い5teria n+onocytogens (リ
ステリア面)Pasteurellae (パスツレ
ラ属〉Pa5teurella pestis (ペ
スト菌)Pasteurella multocida
Pneumococc 1 Diplococcus pneumoniaePse
udomonas aeruginosa (緑膿菌
)Rickettsiae (リケッチア属)(バクテリア状寄生体)Ricket
tsia prowazekii(発疹チフスリケッチ
ア) Rickettsia mooseriRickett
sia rickettsii (IkI点熱リグッチ
ア)Rickettsia conoriRicke
ttsia australisRickettsi
a tsutsugamushi(ツツガムシ病リケ
ッチア) Rickettsia burnetiiSalmon
ella choleraesus (ブタコレラ菌
)Salmonella typhimurtum
(ネズミチフス菌)Salmonella typho
sa (チフス菌)Shigella arabin
otarcl。 Shigella boydii (ボイド赤痢菌)
Shigella dysenteriae (志賀
赤痢面)Shigella flexneri (フ
レクスナー赤痢菌)Shigella schmitz
iiShigella 5onnei (ソンネ赤痢
菌)Staphylococci (ブドウ球菌属)
Staphylococcus aureus (黄
色ブドウ球菌)Staphylococcus alb
us (白色ブドウ球菌)Streptococci
(連鎖環菌属)Streptococcus py
ogenes (化膿連鎖球菌)Groups 8+
C,D、 F、 GThe 5pirochetes
(スベロヘータ)Treponema palli
clum (梅毒トレボネーマ)Borrelia
recurrentis (回帰熱ボレリア)Lep
tospira icterohemorrhagi
aeしeptospira canicola (イ
ヌレプトスピラ〉Toxoplasma gondii
()キソブラスマ)べ ゛ ンバ ホルモ
ン Corticotropin (ACTH)(actr
enocorticotropic hormone)
(副腎皮質刺激ホルモン) Follicle−stimulatinghormo
ne(卵胞刺激ホルモン) Luteinizing hormone (黄体1
ヒ形成ホルモン〉(interstitial cel
l−stimulatinghormone)Para
thyroicl hormone (上皮小体ホル
モン)Prolaetin (プロラクチン)Cho
rionic Gonadotropin(絨毛膜の性
腺刺激ホルモン) Insulin (インスリン) Glucagon (グレカゴン) Relaxin (レラキシン) Somatropin (成長ホルモン)Triio
dothyronine ()リョウドサイロニン)
Thyrocalcitonin (サイロカルシト
ニン)Thyroxine (サイロキシン)」襞嵐
互天ン Angiotensin l and II (アンギ
オテンシン1.II)Bradykinin (ブラ
ジキニン)1;astrin (ガストリン) )1uman placental lactogen
(胎盤のラクトゲン)Secretin (セクレ
チン) べチ ホルモン 0xytocin (オキシトシン)yasopre
ssin (パップレシン)クー化上ス Adinoviruses (アデノウィルス)Ar
boviruses (アルボウィルス)East
ern Equine Wucephalitis V
irusWestern Equineνucepha
litis ViruSSin〔Ib1s Viru
s Semliki Forest VirusSt、
Louis Encephalitis Vi
rusCalifornia Encephalit
is VirusColorado Tick
Fever Virus’i’ellow Fev
er VirusOengue Virus Hepatitis (肝炎) Hepatitis A Virus (肝炎Aウィ
ルス))1epatitis B Virus (肝
炎Bウィルス)1(erpes viruses
(ヘルペス)Herpes simplex、 丁
ypes I and If(単純ヘルペス 1
. II) Varicella (chicken pox)
(水痘)Cytomegalovirus Myxov i ruses Influen2a (A、 B、 and C)
(インフルエンザ)Parainfluenza (1
4) (パラインフルエンザ)Mumps viru
s ぐおたふくかぜ)Newcastle Dise
ase VirusMeasles\1rus (I
よしか)Can1ne Distemper Viru
s (イヌジステンバ)Respiratory
5yncytial Virus(呼吸シンシチウム
ウィルス) Rubella Virus (m疹)Picorn
aviruses poliovirus (ポリオ) Coxsackievirus EchoviruSes (エコーウィルス)Rhi
noviruses Pox Viruses (痘ウィルス〉Vacci
nia (ワクシニア) Molluscum contagiosum (伝
染性軟属Iり本方式は、未知DNA連鎖の検出なと、免
疫検定として分類されない池の検定方式にも適用可能で
ある。例えば、未知DNA連鎖を含む液体サンプルが膜
に通され、その膜に前もって固定されたDNAと接触す
ることにより膜上に固定される。 次いで、標識1寸けDNAプローブが膜を通って液体中
へと通過される。ハイブリダイゼーションが生じると、
標識付けDNAプローブが膜表面上に検出可能な形で保
持される。この方式は、Po1sky−Cynkin、
R,、他の論文、 Cl1n、 Chem、 3
1/9. 1438(1985)。 前述したように、特に有効な検定では、ドツトと見える
が実F7にはそのドツトとほぼ等り、い直径の円柱上で
膜中を通って延びる膜上の少なくとも1つの限定領域に
免疫試薬が集中される。サンドイッチまたは競合結合方
式においてこの点は、抗原または抗体等の捕獲免疫試薬
を、膜厚全体を通じて固定されるように流すことによっ
て限定領域にだけ固定することで達成される。サンプル
成分及び標識付は試薬との反応は、その領域内でのみ生
じる。 ドツト手法は、以下に述べる1つの装置で複数の同時検
定を実行できるなといくつかの利点を有する。またドツ
ト手法は、1つの領域に集中されるので、より特徴的な
最終生成物信号も与える。 サンプルを膜を通してサイクル循環させる能力は、サン
プルと固定免疫試薬の混合効率を大幅に増大する。これ
に対し、従来の貫流方式では、ドツトに露出されるサン
プル中の免疫成分が、ドツト真上の憾像上の液体円柱だ
けである。膜を通したサイクル循環は、残りの液体サン
プル中の免疫成分が固定試薬と接触し、サンプルと標識
付は試薬を集中させるのを可能とする。この結果、測定
機器なしては検出できなかったコロイド金なとの標識が
、機器なしで検出可能となる。 ドツト手法の別の利点は、サンプル中の多成分の同時検
出を可能とすることである。例えば、1つの検定装置に
おいて、所定の異なった抗原に固有の2つの異なった抗
体を、膜上の別々のスポット位置に固定できる。次いて
何れか1つの抗原を含むと思われるサンプルを、膜及び
2つの異なった抗原に固有な標識付は抗体に接触させる
。一方または他方のドツト泣賀の標識によって発せられ
る信号が、1つまたは両方の抗原の存否を指示する。各
ドツトはそれらの位置、あるいは各固定抗体ドツト近く
における識別によって区別できる。 つまり例えば、発色が第1ドツトで生じ第2ドツトで生
しないと、第1抗原は存在するが、第2抗原は存在しな
い。両ドツトども発色すると、両抗原とも存在し、どち
らのドツトも発色しないと、何れの抗原も存在しない。 あるいは、各々のドツトで異なった色を発するように標
識を選択してもよい。 本方式は、対応した数の免疫試薬を膜上に固定すること
によって、液体サンプル中の2より多い成分の同時検出
にも拡張できろ。一部の例においては、第1抗体が多数
の異なった抗原の特定のサブユニットと反応する。第2
抗体が1つの抗原のサブユニットにだけ固有であれば、
そのような第2抗体が固定抗体として使え、1つの第1
標識1すけ抗体が対象抗原用の汎用標識例は抗体として
使える。 従来の免疫検定用の標準手順か、本発明でも使える。例
えば、サンドイッチ検定りこおいて、サンプル及び標識
付は試薬の追加順序1.i同時でもあるいは逐次でもよ
い。 多クローン抗体より単り1コ一ン抗体の方が有f11で
純粋なことが知ら4″Lでいるが、どちらの種類の免疫
試薬も本発明によって使用できる。 上記装置の動作において、膜を通る液体の流量はチャン
バ12内の圧力によって制御される。つまり、液体が膜
の外表面上にあれば、チャンバの空容量の増加速度が、
それに応・して膜を通る流量を増大させる。逆に液体が
チャンバ中にあれば、膜を通る液体流量はチャンバの容
量を減じる速度によって制御される。本装置を用いた膜
を通る一般的な流量は、膜の多孔性及び流体の粘度に応
して約0.5ml/秒である。 例示した特定装置は、膜が可変容量チャンバに問いた開
口を横切って実質上密閉され、且つチャンバの容量を容
易に変1ヒさせられる手段が設けられてさえいれば、本
発明に基づいて変更可能である。例えば所望なら、ピス
トンを本体内にスライド可能に受は入れられるプランジ
ャとし、ピストンまたは本体に旋回しない押出し及び引
出し力を加えてチャンバの容量を変えてもよい。この種
の装置あるいは図面に示した1つの装置において、液体
の正常なサイクル循環中本体とピストンの分離を防ぐた
めのストッパを設けることもできる。 一方、チャンバ中の液体を膜を通さず容易に排出させた
り、もしくは最初の例で液体サンプルをチャンバ内にお
けるように、ピストンと本体の容易な分離を可能とする
のにも一定の利点がある。また、チャンバの容量を変化
させるのに、その池もっと精巧な手段を設けてもよい。 第4.5及び6図を参照すると、番号30で表したスラ
イド可能なプランジャまたはピストン検定装置の一実施
例が示しである。この実施例では、第1〜3図の実施例
のネジ噛み合いピストンの代わりにスライド可能なピス
トンが使われる。この装置は、動作中一体状に係合され
る3つの別々の機能部分を含む。 1つの機能部分はピストンハウジング34を含むピスト
ン手段32から成り、ピストンプランジャ36がハウジ
ング34内にスライド可能に受は入れられる。ハウジン
グ34は先端34bを含む。 プランジャ36はその一端のハンドル部36a。 ピストンロッド36b1 及び同町状ハウジング36の
内壁とスライド可能なシールを形成する可どう性のゴム
周速を備えたスライド可能なピストンヘッド36cを含
む。図示のごとく、ピストン手段32は皮下注射器の形
をしている。ハウジング34の内壁とピストンヘッド3
6cの前面が、出口34bを介してを除き外部から密閉
された可変容量のチャンバ37を画成する。 この実施例では、膜手段38がピストン手段32と独立
に形成された自立式のハウジング40内に配置される。 この構成の1つの利点は、通常の皮下注射器を簡単な圧
入によって、膜手段と朝み合わせて使えることである。 あるいは、2つの構成部品を一体状に形成してもよい。 ハウジング40は人口42と出口44を含む。 図示のごとくハウジング40は、それぞれ人口42と出
口44がそこから突き出た直立壁50.52間を横切る
ように一体的に結合された支持壁46.48で形成され
ている。フラットな両支持壁46と48の間に膜54が
挟持されている。支持壁46.48の一方、好ましくは
両方が、装置の外部から膜54を見れるように、完全に
透明であるかあるいは透明な窓を含む。両支持壁46.
4日にはそれぞれ平行なチャネル46a、48aを画成
する隣接した突起及び溝が形成され、これらのチャネル
は注射器から人口42へと入る流体の流れ方向と一致し
ている。各チャネルは隣接する当接壁52に終端してお
り、入口42に入る流体路だけが膜54を介し出口44
へと通じている。 出口44から出る液体は、試験管56など適切な受は器
で集められる。あるいは図示してないが、出口44を別
の密閉容器の口に係合し、後述するようにピストン手段
34による吸引力を加えて流体の回収を容易にしてもよ
い。 第4〜6図の検定装置の機能は、第1〜3図の装置の機
能と同様である。膜54が膜24aに対応する。前述し
たのと同じ種類の反応が、ドツト法の使用も含め、膜5
4について可能である。支持u46及び/又は48が透
明なので、検出可能な標識を含む反応生成物が透明な壁
を介して目視される。 動作の一モードでは、初めに液体サンプルが受は器56
ないに入れられ、先端34bがその中に漬けられる。プ
ランジャ36をハウジング34内にいっばいに挿入し、
チャンバ37を最少の容量とする。次に、プランジャ3
6を引き出してチャンバ37の容量を増大させ、これに
伴う吸引作用で液を受は器56から出口44及びチャネ
ル48aを介し、膜54を通過させてチャネル46a及
び入口42から可変チャンバ37内へと至らしめる。 あるいは、初めに液体サンプルをチャンバ内にいれ、そ
の後圧力下で先端口34bから入口44チヤネル46a
内に液を進め、膜54を通過させてチャネル48a及び
出口44から受は器46内へと至らしめてもよい。 自立式の膜ハウジングを注射器と組み合わせて使うこと
は、濾過の分野で従来知られている。第4〜6図に示し
たのと同様な自立式の膜ハウジングは、米国マサチュセ
ッツ州ケンブリッジ所在のCo5tar辻から販売され
ている。しかしながら、この様な濾過装置を本発明の検
定方式、つまり膜を通じた)α体サンプルのサイクル循
環に用いることは何ら示唆されていない。 第7図を参照すると、発明の別の実施例が示してあり、
この例ではピストン部材が旋回自在でなくスライド自在
なように、第1図の装置が変更されている。すなわち検
定装置は、可変容量の中空空間つまりチャンバ62を画
成する容器手段60の形で示しである。容器手段60は
中空本体64とピストン手段66を備え、ピストン手段
66は中空本体64との間での相対的なスライド移動に
応じ中空本体に対して進入及び後退自在に装着されてい
る。第1図の実施例と同じく、中空本体64はほぼU字
状の垂直断面と円形の水平断面を有する。中空本体64
は第1図の中空本体14と同じ材料で形成し得る。 ピストン手段66は、外側直立壁部70aと0リング7
2用の環状凹部とを備えた円形のピストン部材70を含
み、ピストン部材70が移動するとき、0リング72が
本体64の内壁に対する圧力密閉を保持する。ピストン
部材70は、本体64の水平底部と協働してチャンバ6
2を画成する内壁70cも含む。さらにピストン部材7
0は別の環状凹部70dを含み、第7図ではいっばいに
圧縮されているコイルバネ74の形のバネ手段が環状凹
部7Od内にはめ込まれている。圧力が解放されると、
バネ74がピストン部tオフ0を上方に本体64外へと
移動させ、チャンバ62を膨張させる。 オプションのトップ76が、本体64の対応する肩に対
して着座する下向き突起リムを備え、ピストン部材70
の本体64に向けての押圧をし易くしている。 膜手段78が、ピストン壁部分70eの下方突出部に対
し圧力嵌めすることによって、ピストン部材64の開放
中心に保持されている。図示のごとく、膜手段78は膜
ディスクの形の円形多孔性膜を含み、外側から見える上
面と下11の独立の支持体が1薩ねっている。膜78は
図示のように別体でもあるいは一体でもよく、膜24に
関連して面述したような形を持つ。 第7図の装置は、チャンバ62が最小の容量にある状態
で示しである。バネ74に加わる圧力が開放されると、
バネの作用でチャンバ62の容量が所望に応じ膨張する
。本方式は、第1図の装置に関連して述べたのとほぼ同
様に動作する。 第8図を参照すると、同じく前述した可変容量原理に基
づいて機能する押ボタン式装置80が示しである。装置
80は、ピボット点として機能するロッド86を中心に
下側ハウジング84に対して旋回する上側ハウジング8
2含む。下側ハウジング84はロッド86に圧力嵌めな
どによって永久固定される一方、上側ハウジング86は
回転自在で、所望に応し水平位置から垂直位置へと回転
し液体の装置内への流入を可能とする。 上側ハウジング82は、ゴム等の弾性でへこませ可能な
財科て形成され、溶接等で上側ハウジング82の残部;
こ取り付けられた押ボタンつまり球状部88を含む。球
状部88が可変容量チャンバ90f;:画成する。球状
部88は溶接等により、上側ハウジング82の残部に対
し適切に密閉されている。上側ハウジング82はまた、
剛性で、固定容量チャンバ94を画成し、且つ過剰圧力
を解放させる開口96を備えたドーム部92も含む。チ
ャンバ94の下方に、ガスケツ)100て所定位置に保
持された膜手段98が装着されている。反応生成物はド
ーム部92の頂部を介し膜手段98上にあるところを目
視されるので、ドーム頂部は透明か、あるいは少なくと
も半透明でなければならない。更に上側ハウジング82
は、下側ハウジング84の対応リム84aと嵌合し、再
び開けようとするまで装置を閉状態に保持する可どう性
のL字状ロック部102も含む。本方式では、ロック部
】02を旋回して肩84aから外した後上側ハウジング
82を旋回することによって、容易に密閉を解ける。 両チャンバ90.94の間は、チャンバ9oと膜手段9
日の下部との間を連通する円形孔等の形を成し上下ハウ
ジング間に形成された流れチャネルつまり孔】04て接
続されている。 動作時には、装置を閉じる前に、チャンバ90または9
4何れかが液体サンプルで部分的に満たされる。チャン
バ90が満たされ、)夜をチャンバ90から膜手段98
を介してチャンバ94へ移動させるべきときは、球状部
8日が下方に押され、チャンバ90の容量を減少せしめ
て液をそこから膜手段98を通しチャンバ94内へと流
す。反対方向に液を流したいときは、球状部88に加わ
っている圧力を解放すれば、それにともなって生じる減
圧の作用で液はチャンバ90内へと戻される。 このように当初液がチャンバ90内にある場合、液は初
めに真空でなく正の圧力下で押されて膜手段98を通過
し、次いて球状部88の解放へミよって生じる減圧下で
のみチャンバ90内へと引き戻される。第7図の装置に
関連して説明したのと同様な検定を実施できる。 第9図の装置は、駆動力が第4図の装置と一体でもある
いは着脱自在でもよい通常のまたは改造した注射器で与
えられる点で、第4図の装置と類似している。番号11
0て全体を表したこの装置は、境界面なとての融着によ
って一体構造に保持された上側ハウジング部112と下
側ハウジング部114とを含む。装置は、注射器118
と密閉係合する開放端116を画成する。注射器118
はピストンハウジング120を含み、この内部にピスト
ンプランジャ122がスライド可能に受は入れられてい
る。図示のごとく、ピストンプランジャ122はリング
122aを含み、片手で装置を14んて、ピストンをピ
ストンハウジング120に対して進入及び後退移動させ
易くしである。また、ピストンロッド122とスライド
可能なピストンヘッド122cも備わっている。ピスト
ンハウジング120は、壁画成開口116と協働して取
り除き可能なシールを形成する先′I*120 aを含
む。 膜手段124が、それぞれガスケット128を介して上
側及び下側ハウジング112.114の開に装着される
。2つの固定チャンバ130.132が膜手段124を
挟んで相互に連通ずる。 装置110の動作時に:ま、ピストンヘット122Cの
前面に対して画成されたチャンバ120b内に初めに入
れられた液が、圧力の作用下でチャネル134を経てチ
ャンバ130内へと押され、下向きに膜手段124を通
ってチャンバ132内に至る。液を反対方向に移動させ
るには、リング122aを掴んてピストンプランジャ1
22を反対方向に引っ張り、チャンバ12Ob内に減圧
を発生して、液を上向きに膜手段を通過させチャンバ1
30を経て引き戻す。反応生成物は膜手段124の上面
で目視されるので、上側ハウシング112のうち膜手段
上方の部分は透明とする。 第10図の装置を参照すると、第9図に示した装置と類
似しており、第9図に示したような外部注射器と組み合
わせて使われる別の一体状ハウシングが示しである。従
って、第10図さらにその後で説明する第11〜】3図
の注射器と装置については、第9図と同じ番号を用いる
。装置140は開口142を含み、この間口142が注
射器の先端120 aに対して密閉を生じるとともに、
上側チャンバ】44を摸146を通り下側チャンバ14
8から開放チャネル146へと連通する。動作時には、
チャネル150が試験管内に挿入され、リング122a
を左方向に引っ張りチャンバ120b内に減圧を発生す
ることによって、液が試験管から引き込まれる。この結
果、1夜はチャネル150、チャンバ148、膜手段1
4G、チャンバ144、開口142を通ってチャンバ1
2C1b内へと流入する。ハウジングのうちチャンバ1
44上方の部分は、目視のため透明とする。ピストンロ
ツ)” 122 bを反対方向に移動させれば、液は逆
方向に流れる。 番号160て示した第11図の装置も、着脱自在な注射
器で動作可能である。図示のごとく、この装置は試験管
162内に配され、そこから以下述べるように液を引き
込む。装置160は、下側本体164、上側本体166
、及び上下両本体間に1呆持された膜手段168を含む
。下側本体164が、注射器の先端120aと膜手段1
68の下面との間にチャネル170を形成する。下側本
体164が外形はぼ円筒状である一方、上側本体166
はほぼ円形のプラグ状で中心に開放円形領域を有し、そ
こを通じて膜の上部を目視てきる。 装置の動作時には、初めに液体サンプルを注射器かまた
は試験管162内に入れた後、前述したのと同様に膜手
段168を通して何れかの方向に流通させられる。 第12図の実施例を参照すると、装置の外側容器でシー
ルを形成するようにした第11図の装置の変形が示しで
ある。 装置180は、内側寸法が段階的に変1ヒする中空管状
部材182を含む。注射器の先端120aが圧力嵌めさ
れて装置の一部分内でシールを形成するように、わずか
なテーバが設けられている。 管状部を才182は、膜手段188下方の下側チャンバ
186へと続く狭いチャネル184を画成する。第11
図の上側部片166と同様な構造の上側円形部片190
が設けられ、膜手段18日を所定の着座密閉位置に保持
する。管状部材182の外面は段階状の外径を有し、外
側の透明管192と着脱自在に密閉係合するように圧入
される。 第12図の装置の動作時、初めに液体サンプルがチャン
バ182内にあれば、液は注射器からの圧力でチャネル
184を通ってチャンバ186内に入り、膜手段188
を上向きに通過して上側部片190て形成された凹部内
に進み、液が充分に存在すると、外側管192と管状部
材1820間に画成された管状空間】94内へと至る。 ピストン122を引き出せば、液は膜手段188を通っ
て反対方向に流れる。 番号200て全体を示した第13及び14図の装置は、
上側ハウジング部202とした側ハウジング部204を
含み、両ハウジング部間に中央孔206が画成されてい
る。上側ハウジングブ202にテーパ状の円形孔20B
が形成され、その内部に注射器の先端120bが圧入さ
れて密閉係合する。 膜手段210が環状のプラスチック保持リング2】2に
よって、上側ハウジング部202内の水平(立置に正大
設定されろ。リング212が内部に対し開放空間を画成
しているので、膜手段の表面を外部から見ることができ
る。この実施例において、膜手段は3つの層、すなわち
紙で裏打ちしたニトロセルロース、ポリエステルで裏打
ちしたニトロセルロース、ナイロン、または変態ナイロ
ンで形成し得る上方N 210 aと、同一材料で形成
し得るフィルタの中間1210bと、多孔性プラスチッ
ク、ガラスファイバ等で形成し得る下方支持ディスク2
10cとを含む。あるいは、単一層を用いることもでき
る。何れの層も、コロイド金共役体なとの凍結乾燥試薬
で含浸し得る。 動作時、第13及び14図の装置;よ注射器から中央孔
206を経て上向きに膜手段210を通過させることに
よって動作する。注射器のピストンを引き出せば、液は
反対方向に移動する。 上記の方式は有無の定性的テストについて説明したが、
分析すべき成分の異なった既知濃度で発せされる色なと
適切な信号を用いた半定量的テストにも使えることが理
解されるべきである。例えば、サンドイツチ法による抗
原の分析の場合、本方式を連続漸進希釈で実行し、特定
希釈て見込まれる色の近似を得ることができる。抗原の
未知濃度がそれらの色と比較され、サンプル中に存在す
る抗原濃度の近似を与える。 本発明の方法の特性の更なる開示は、以下の持定例によ
って与えられる。尚、ここに開示するデータは例示に過
ぎ−ず、発明の範囲を制限するものでない。 別−−1 この例では、既知量のヒト絨毛性ゴナドトロピン(hC
G)を含む尿サンプル中に存在する抗原hGCについて
のサンドイッチ免疫検定を示す。 固定試薬及びは織対は試薬として単クローン性抗体を用
いた。標識付は共役体は、Faulk、 W、P、、池
の論文、1mmunochem、 8:1081 (+
971)の手順に基づいた金ゾルから成る。要約すれは
、0.01%のクロ口金酸溶液を含む100m1の希釈
水を、4mlの1%第3クエン酸ナトリウムに混合した
後、15分間煮沸した。溶液は、520nmにおける約
1の光学密度で黄から赤に変色する。 他方の免疫試薬;よ、Medix Biot、ech社
から市販されている抗アルファ連鎖hCG単りローン性
抗体とした。膜ディスク24 b (Schleich
er andSchere11社から市販、細孔0,4
5ミクロンで厚さ140ミクロン)を用いた。抗アルフ
ァ単りローン性抗体(1μm)を直径約203mmの限
定領域内に、1 m g / m lの濃度て膜ディス
クに施した。次いで、植え付は後の膜ディスクをリン酸
塩緩衝塩溶液内てBSAによって培養し、上記の装置内
に設置した。 hCGのベータ連鎖に対する単クローン性抗体(旧le
s Laboratoriesから市販)が上記金ゾル
と共役であり、多孔性支持ディスク24b上に被覆し、
温度−50’ F (10℃)の浴内で凍結した。 その後、凍結乾燥した。 500μmの尿サンプルを、第3a図に示したチャンバ
12が最小容量にある状態で膜の頂面に置いた。次ぎに
ピストンを本体に対して回し、チャンバを第3b図に示
すように膨張させた。そしてサンプル液を、膜24aと
乾燥凍結された標識付は抗体を含む多孔性支持ディスク
24bとを通して引いた。膜ディスク24aの通過中、
標識付は抗体が尿中に溶解した。次いで、ピストン部材
16を反対方向に回し、尿サンプルを膜を通してチャン
バから引き戻した。このサイクルを何回も繰り返したと
ころ、各サイクル毎に発色が増した。 こうして、検定の感度はサンプル液を膜を通してサイク
ル循環することによって高められた。この結果、通常読
み取り不可能である抗原濃度のコロイド金粒子を用いて
も、膜上の赤色ドツトの目視読み取りが可能となった。 異なる膜の多孔度、b CG抗原濃度、及び通過回数を
用い、コロイド金によって赤色が発色するまで上記の手
順を繰り返した。これらの結果を以下の表に示す。 ; ′ミ0.−1ユニm h CG 41度 (mllJ/ml) 3.5 10 20 10
3 206赤色か観測される まての通過回数 7 753 1腺jヒ孔庁:
畑 ゛又12ミーク」と之hCGi!1度 (mltJ/1) 3.5 10 20 1
03 206赤色が観測される までの通過回数 151073涯−2 この例では、抗原が膜上に固定され、分析するのは血清
サンプルの抗体成分で、プラスチック製支持ディスク上
の凍結乾燥される標識付は抗体が上記のようにして形成
されたコロイド全て標識付けされたサンプル抗体に刻す
る抗抗体の兵役体であるようなサンドイッチ検定を行っ
た。またこの例では・ 抗原門、neumO旧aeを例
1て述べたようなニトロセルロース製膜ディスク上に含
浸した。 抗原に対する抗体を含むと思われる血清を、上記したよ
うにポンプ吸引によって5回、膜を通してサイクル循環
した。次ぎに、リン酸塩瑳衝塩溶渣て洗浄した。その後
、標識付は抗抗体(2次抗体)を、ポンプ吸引によって
数回膜を通過させた。この例においては、2次抗体が1
5nmのコロイド金(OD s2!!= 3. 0 )
にリンクされた。膜上の顕著な赤色ドツトによフて確実
な反応が指示された。 皿−一旦 この例では、一方が門、 neumoniae抗原を有
し、他方がアデノウィルス抗原を有する2つの異なるド
ツトを膜ディスクに含めた点を除き、例2の手順を踏襲
した。血清サンプルがM、 neumoniaeだけに
対する抗体を含むと、所定位置で1つのドツトが同様に
得られる。血清サンプルがアデノウィルスだけに対する
抗体を含むと、別の所定位置で1つのドツトが指示され
る。また血清サンプルが門、nCu1lO旧aeとアデ
ノウィルス両方に対する抗体を含むときは、2つのドツ
トが現れる。どちらに対する抗体も含まないと、何れの
ドツトも現れない。 汎−」。 この例では、競合結合検定をチロキシン抗原に対して実
施した。チロキシンつまりハブテンは、チロキシンを含
むと考えられるサンプルとの競合で用いるコロイド金共
役体に形成した。この共役体は、セイヨウワサビペルオ
キシダーゼで形成されたスペーサアームを介し、チロキ
シンをコロイド金共役体と反応させることによって形成
された。 つまり、pH9,5の0.1M重炭酸ソーダ溶液(10
ml)におけるチロキシンナトリウム塩飽和溶液を、N
akane P、に、の論文、J、 Histoche
mCytochem、 14:929 (+966)の
手順を用いセイヨウワサビペルオキシダーゼを介して共
役させた。この例では、Nakaneの論文に記された
タンパク質の代わりにチロキシ溶液を用いた。 共役後、その溶液を希釈水に対して透析し過剰のチロキ
シンを取り除いた。チロキシン−セイヨウワサビペルオ
キシダーゼの共役体を10nmのコロイド金粒子にリン
クさせた後遠心分離し、共役されなかった過剰で目出の
チロキシン−セイヨウワサビペルオキシダーゼを取り除
いた。残留物は緩衝液内に再懸濁化された。 抗チロキシン抗体は、次のようにして膜上に固定した:
pH7,4,0,OIMのリン酸塩緩衝塩溶液中の親和
力で純化されたウサギ抗チロキシン抗体を、例1に記し
たニトロセルロース膜の1スポツト上に被覆した。抗体
濃度は100μg/mlとした。 テスト手順においては、0.1μlの標織対はチロキシ
ンと異なる既知濃度(1,5,10及び20ng/ml
>のチロキシンを含むサンプルとを、第1図の膜24a
の頂面上に施した。異なる濃度のチロキシンで異なる色
が発生し、チロキシンの濃度が低いほと色は強かった。 次いで、未知のサンプルを分析し、上記した既知濃度で
の発色と比較した。
クタ−属ガス産生菌) Aerobic Spore−ForIIling B
acilli(好気性胞子形成かん菌) Bacillus anthracis (炭そ菌)
Bacillus 5ubtilis (枯草菌)B
acillus cereus Anaerobic Spore−forming
Bacilli(嫌気性胞子形成かん菌) Clostridium botulinum (ボ
ツリヌス菌)Clostridium tetani
(破傷風菌)Clostridium perfri
ngens (ウエルチ菌)Brucellae
(プルセラ属)8rucella melitensi
s (マルタ熱面)Brucella abortu
s (ウシ流産M)Brucella 5uis
(ブタ流産菌)Chlamydia (unclass
ifiable parasites−bacteri
al/viral) (クラミジア属(分類不能寄生
バクテリア/ヴイルス)) Ch!amydia agents Chlamydia trachomatis(トラコ
ーマクラミジア) Corynebacteria (コリネバクテリア
属)Corynebacterium dipther
iae (ジフテリア菌)Escherichia c
oli (大vA菌)Fungi (真菌) Cryptococcus neoformansHi
stoplasma capsulatumCocc
idioides imo+1tisCandida
albicans (カンジダアルビカンス)Mu
cor corymbifer (absidia c
orymbifera)Hemophilus−Por
detella group (ヘモフィルス群)H
emophilus 1nfluenzae (イン
フルエンザ菌)H,ducreyi (デュクレー菌
)H,hemophilus 1、aegypticus (エジプトへモフィルス
)1、parainfluenzae (バラインフ
ルエンザ薗)にeibsiella pneumoni
aeMycobacteria (マイコバクテリア
)Mycobacterium tuberculos
is hominis(大型結核菌) Mycobacterium bovis (ウシ型
結核菌)Mycobacterium avium
(鳥型結+a i >Mycobacterium 1
eprae (らいVJ)Mycobacteriu
m paratuberculosis(バラ結核菌) My(oplasmas (マイコブラスマ属)My
coplasmas pneumoniae(肺炎マイ
コブラスマ) Mycoplasias hominisNeisse
riae (ナイセリア属)Neisseria m
eninHitidis (髄膜炎菌)Neisse
ria 、gonorrheae (淋菌)その他の
病原体 い5teria n+onocytogens (リ
ステリア面)Pasteurellae (パスツレ
ラ属〉Pa5teurella pestis (ペ
スト菌)Pasteurella multocida
Pneumococc 1 Diplococcus pneumoniaePse
udomonas aeruginosa (緑膿菌
)Rickettsiae (リケッチア属)(バクテリア状寄生体)Ricket
tsia prowazekii(発疹チフスリケッチ
ア) Rickettsia mooseriRickett
sia rickettsii (IkI点熱リグッチ
ア)Rickettsia conoriRicke
ttsia australisRickettsi
a tsutsugamushi(ツツガムシ病リケ
ッチア) Rickettsia burnetiiSalmon
ella choleraesus (ブタコレラ菌
)Salmonella typhimurtum
(ネズミチフス菌)Salmonella typho
sa (チフス菌)Shigella arabin
otarcl。 Shigella boydii (ボイド赤痢菌)
Shigella dysenteriae (志賀
赤痢面)Shigella flexneri (フ
レクスナー赤痢菌)Shigella schmitz
iiShigella 5onnei (ソンネ赤痢
菌)Staphylococci (ブドウ球菌属)
Staphylococcus aureus (黄
色ブドウ球菌)Staphylococcus alb
us (白色ブドウ球菌)Streptococci
(連鎖環菌属)Streptococcus py
ogenes (化膿連鎖球菌)Groups 8+
C,D、 F、 GThe 5pirochetes
(スベロヘータ)Treponema palli
clum (梅毒トレボネーマ)Borrelia
recurrentis (回帰熱ボレリア)Lep
tospira icterohemorrhagi
aeしeptospira canicola (イ
ヌレプトスピラ〉Toxoplasma gondii
()キソブラスマ)べ ゛ ンバ ホルモ
ン Corticotropin (ACTH)(actr
enocorticotropic hormone)
(副腎皮質刺激ホルモン) Follicle−stimulatinghormo
ne(卵胞刺激ホルモン) Luteinizing hormone (黄体1
ヒ形成ホルモン〉(interstitial cel
l−stimulatinghormone)Para
thyroicl hormone (上皮小体ホル
モン)Prolaetin (プロラクチン)Cho
rionic Gonadotropin(絨毛膜の性
腺刺激ホルモン) Insulin (インスリン) Glucagon (グレカゴン) Relaxin (レラキシン) Somatropin (成長ホルモン)Triio
dothyronine ()リョウドサイロニン)
Thyrocalcitonin (サイロカルシト
ニン)Thyroxine (サイロキシン)」襞嵐
互天ン Angiotensin l and II (アンギ
オテンシン1.II)Bradykinin (ブラ
ジキニン)1;astrin (ガストリン) )1uman placental lactogen
(胎盤のラクトゲン)Secretin (セクレ
チン) べチ ホルモン 0xytocin (オキシトシン)yasopre
ssin (パップレシン)クー化上ス Adinoviruses (アデノウィルス)Ar
boviruses (アルボウィルス)East
ern Equine Wucephalitis V
irusWestern Equineνucepha
litis ViruSSin〔Ib1s Viru
s Semliki Forest VirusSt、
Louis Encephalitis Vi
rusCalifornia Encephalit
is VirusColorado Tick
Fever Virus’i’ellow Fev
er VirusOengue Virus Hepatitis (肝炎) Hepatitis A Virus (肝炎Aウィ
ルス))1epatitis B Virus (肝
炎Bウィルス)1(erpes viruses
(ヘルペス)Herpes simplex、 丁
ypes I and If(単純ヘルペス 1
. II) Varicella (chicken pox)
(水痘)Cytomegalovirus Myxov i ruses Influen2a (A、 B、 and C)
(インフルエンザ)Parainfluenza (1
4) (パラインフルエンザ)Mumps viru
s ぐおたふくかぜ)Newcastle Dise
ase VirusMeasles\1rus (I
よしか)Can1ne Distemper Viru
s (イヌジステンバ)Respiratory
5yncytial Virus(呼吸シンシチウム
ウィルス) Rubella Virus (m疹)Picorn
aviruses poliovirus (ポリオ) Coxsackievirus EchoviruSes (エコーウィルス)Rhi
noviruses Pox Viruses (痘ウィルス〉Vacci
nia (ワクシニア) Molluscum contagiosum (伝
染性軟属Iり本方式は、未知DNA連鎖の検出なと、免
疫検定として分類されない池の検定方式にも適用可能で
ある。例えば、未知DNA連鎖を含む液体サンプルが膜
に通され、その膜に前もって固定されたDNAと接触す
ることにより膜上に固定される。 次いで、標識1寸けDNAプローブが膜を通って液体中
へと通過される。ハイブリダイゼーションが生じると、
標識付けDNAプローブが膜表面上に検出可能な形で保
持される。この方式は、Po1sky−Cynkin、
R,、他の論文、 Cl1n、 Chem、 3
1/9. 1438(1985)。 前述したように、特に有効な検定では、ドツトと見える
が実F7にはそのドツトとほぼ等り、い直径の円柱上で
膜中を通って延びる膜上の少なくとも1つの限定領域に
免疫試薬が集中される。サンドイッチまたは競合結合方
式においてこの点は、抗原または抗体等の捕獲免疫試薬
を、膜厚全体を通じて固定されるように流すことによっ
て限定領域にだけ固定することで達成される。サンプル
成分及び標識付は試薬との反応は、その領域内でのみ生
じる。 ドツト手法は、以下に述べる1つの装置で複数の同時検
定を実行できるなといくつかの利点を有する。またドツ
ト手法は、1つの領域に集中されるので、より特徴的な
最終生成物信号も与える。 サンプルを膜を通してサイクル循環させる能力は、サン
プルと固定免疫試薬の混合効率を大幅に増大する。これ
に対し、従来の貫流方式では、ドツトに露出されるサン
プル中の免疫成分が、ドツト真上の憾像上の液体円柱だ
けである。膜を通したサイクル循環は、残りの液体サン
プル中の免疫成分が固定試薬と接触し、サンプルと標識
付は試薬を集中させるのを可能とする。この結果、測定
機器なしては検出できなかったコロイド金なとの標識が
、機器なしで検出可能となる。 ドツト手法の別の利点は、サンプル中の多成分の同時検
出を可能とすることである。例えば、1つの検定装置に
おいて、所定の異なった抗原に固有の2つの異なった抗
体を、膜上の別々のスポット位置に固定できる。次いて
何れか1つの抗原を含むと思われるサンプルを、膜及び
2つの異なった抗原に固有な標識付は抗体に接触させる
。一方または他方のドツト泣賀の標識によって発せられ
る信号が、1つまたは両方の抗原の存否を指示する。各
ドツトはそれらの位置、あるいは各固定抗体ドツト近く
における識別によって区別できる。 つまり例えば、発色が第1ドツトで生じ第2ドツトで生
しないと、第1抗原は存在するが、第2抗原は存在しな
い。両ドツトども発色すると、両抗原とも存在し、どち
らのドツトも発色しないと、何れの抗原も存在しない。 あるいは、各々のドツトで異なった色を発するように標
識を選択してもよい。 本方式は、対応した数の免疫試薬を膜上に固定すること
によって、液体サンプル中の2より多い成分の同時検出
にも拡張できろ。一部の例においては、第1抗体が多数
の異なった抗原の特定のサブユニットと反応する。第2
抗体が1つの抗原のサブユニットにだけ固有であれば、
そのような第2抗体が固定抗体として使え、1つの第1
標識1すけ抗体が対象抗原用の汎用標識例は抗体として
使える。 従来の免疫検定用の標準手順か、本発明でも使える。例
えば、サンドイッチ検定りこおいて、サンプル及び標識
付は試薬の追加順序1.i同時でもあるいは逐次でもよ
い。 多クローン抗体より単り1コ一ン抗体の方が有f11で
純粋なことが知ら4″Lでいるが、どちらの種類の免疫
試薬も本発明によって使用できる。 上記装置の動作において、膜を通る液体の流量はチャン
バ12内の圧力によって制御される。つまり、液体が膜
の外表面上にあれば、チャンバの空容量の増加速度が、
それに応・して膜を通る流量を増大させる。逆に液体が
チャンバ中にあれば、膜を通る液体流量はチャンバの容
量を減じる速度によって制御される。本装置を用いた膜
を通る一般的な流量は、膜の多孔性及び流体の粘度に応
して約0.5ml/秒である。 例示した特定装置は、膜が可変容量チャンバに問いた開
口を横切って実質上密閉され、且つチャンバの容量を容
易に変1ヒさせられる手段が設けられてさえいれば、本
発明に基づいて変更可能である。例えば所望なら、ピス
トンを本体内にスライド可能に受は入れられるプランジ
ャとし、ピストンまたは本体に旋回しない押出し及び引
出し力を加えてチャンバの容量を変えてもよい。この種
の装置あるいは図面に示した1つの装置において、液体
の正常なサイクル循環中本体とピストンの分離を防ぐた
めのストッパを設けることもできる。 一方、チャンバ中の液体を膜を通さず容易に排出させた
り、もしくは最初の例で液体サンプルをチャンバ内にお
けるように、ピストンと本体の容易な分離を可能とする
のにも一定の利点がある。また、チャンバの容量を変化
させるのに、その池もっと精巧な手段を設けてもよい。 第4.5及び6図を参照すると、番号30で表したスラ
イド可能なプランジャまたはピストン検定装置の一実施
例が示しである。この実施例では、第1〜3図の実施例
のネジ噛み合いピストンの代わりにスライド可能なピス
トンが使われる。この装置は、動作中一体状に係合され
る3つの別々の機能部分を含む。 1つの機能部分はピストンハウジング34を含むピスト
ン手段32から成り、ピストンプランジャ36がハウジ
ング34内にスライド可能に受は入れられる。ハウジン
グ34は先端34bを含む。 プランジャ36はその一端のハンドル部36a。 ピストンロッド36b1 及び同町状ハウジング36の
内壁とスライド可能なシールを形成する可どう性のゴム
周速を備えたスライド可能なピストンヘッド36cを含
む。図示のごとく、ピストン手段32は皮下注射器の形
をしている。ハウジング34の内壁とピストンヘッド3
6cの前面が、出口34bを介してを除き外部から密閉
された可変容量のチャンバ37を画成する。 この実施例では、膜手段38がピストン手段32と独立
に形成された自立式のハウジング40内に配置される。 この構成の1つの利点は、通常の皮下注射器を簡単な圧
入によって、膜手段と朝み合わせて使えることである。 あるいは、2つの構成部品を一体状に形成してもよい。 ハウジング40は人口42と出口44を含む。 図示のごとくハウジング40は、それぞれ人口42と出
口44がそこから突き出た直立壁50.52間を横切る
ように一体的に結合された支持壁46.48で形成され
ている。フラットな両支持壁46と48の間に膜54が
挟持されている。支持壁46.48の一方、好ましくは
両方が、装置の外部から膜54を見れるように、完全に
透明であるかあるいは透明な窓を含む。両支持壁46.
4日にはそれぞれ平行なチャネル46a、48aを画成
する隣接した突起及び溝が形成され、これらのチャネル
は注射器から人口42へと入る流体の流れ方向と一致し
ている。各チャネルは隣接する当接壁52に終端してお
り、入口42に入る流体路だけが膜54を介し出口44
へと通じている。 出口44から出る液体は、試験管56など適切な受は器
で集められる。あるいは図示してないが、出口44を別
の密閉容器の口に係合し、後述するようにピストン手段
34による吸引力を加えて流体の回収を容易にしてもよ
い。 第4〜6図の検定装置の機能は、第1〜3図の装置の機
能と同様である。膜54が膜24aに対応する。前述し
たのと同じ種類の反応が、ドツト法の使用も含め、膜5
4について可能である。支持u46及び/又は48が透
明なので、検出可能な標識を含む反応生成物が透明な壁
を介して目視される。 動作の一モードでは、初めに液体サンプルが受は器56
ないに入れられ、先端34bがその中に漬けられる。プ
ランジャ36をハウジング34内にいっばいに挿入し、
チャンバ37を最少の容量とする。次に、プランジャ3
6を引き出してチャンバ37の容量を増大させ、これに
伴う吸引作用で液を受は器56から出口44及びチャネ
ル48aを介し、膜54を通過させてチャネル46a及
び入口42から可変チャンバ37内へと至らしめる。 あるいは、初めに液体サンプルをチャンバ内にいれ、そ
の後圧力下で先端口34bから入口44チヤネル46a
内に液を進め、膜54を通過させてチャネル48a及び
出口44から受は器46内へと至らしめてもよい。 自立式の膜ハウジングを注射器と組み合わせて使うこと
は、濾過の分野で従来知られている。第4〜6図に示し
たのと同様な自立式の膜ハウジングは、米国マサチュセ
ッツ州ケンブリッジ所在のCo5tar辻から販売され
ている。しかしながら、この様な濾過装置を本発明の検
定方式、つまり膜を通じた)α体サンプルのサイクル循
環に用いることは何ら示唆されていない。 第7図を参照すると、発明の別の実施例が示してあり、
この例ではピストン部材が旋回自在でなくスライド自在
なように、第1図の装置が変更されている。すなわち検
定装置は、可変容量の中空空間つまりチャンバ62を画
成する容器手段60の形で示しである。容器手段60は
中空本体64とピストン手段66を備え、ピストン手段
66は中空本体64との間での相対的なスライド移動に
応じ中空本体に対して進入及び後退自在に装着されてい
る。第1図の実施例と同じく、中空本体64はほぼU字
状の垂直断面と円形の水平断面を有する。中空本体64
は第1図の中空本体14と同じ材料で形成し得る。 ピストン手段66は、外側直立壁部70aと0リング7
2用の環状凹部とを備えた円形のピストン部材70を含
み、ピストン部材70が移動するとき、0リング72が
本体64の内壁に対する圧力密閉を保持する。ピストン
部材70は、本体64の水平底部と協働してチャンバ6
2を画成する内壁70cも含む。さらにピストン部材7
0は別の環状凹部70dを含み、第7図ではいっばいに
圧縮されているコイルバネ74の形のバネ手段が環状凹
部7Od内にはめ込まれている。圧力が解放されると、
バネ74がピストン部tオフ0を上方に本体64外へと
移動させ、チャンバ62を膨張させる。 オプションのトップ76が、本体64の対応する肩に対
して着座する下向き突起リムを備え、ピストン部材70
の本体64に向けての押圧をし易くしている。 膜手段78が、ピストン壁部分70eの下方突出部に対
し圧力嵌めすることによって、ピストン部材64の開放
中心に保持されている。図示のごとく、膜手段78は膜
ディスクの形の円形多孔性膜を含み、外側から見える上
面と下11の独立の支持体が1薩ねっている。膜78は
図示のように別体でもあるいは一体でもよく、膜24に
関連して面述したような形を持つ。 第7図の装置は、チャンバ62が最小の容量にある状態
で示しである。バネ74に加わる圧力が開放されると、
バネの作用でチャンバ62の容量が所望に応じ膨張する
。本方式は、第1図の装置に関連して述べたのとほぼ同
様に動作する。 第8図を参照すると、同じく前述した可変容量原理に基
づいて機能する押ボタン式装置80が示しである。装置
80は、ピボット点として機能するロッド86を中心に
下側ハウジング84に対して旋回する上側ハウジング8
2含む。下側ハウジング84はロッド86に圧力嵌めな
どによって永久固定される一方、上側ハウジング86は
回転自在で、所望に応し水平位置から垂直位置へと回転
し液体の装置内への流入を可能とする。 上側ハウジング82は、ゴム等の弾性でへこませ可能な
財科て形成され、溶接等で上側ハウジング82の残部;
こ取り付けられた押ボタンつまり球状部88を含む。球
状部88が可変容量チャンバ90f;:画成する。球状
部88は溶接等により、上側ハウジング82の残部に対
し適切に密閉されている。上側ハウジング82はまた、
剛性で、固定容量チャンバ94を画成し、且つ過剰圧力
を解放させる開口96を備えたドーム部92も含む。チ
ャンバ94の下方に、ガスケツ)100て所定位置に保
持された膜手段98が装着されている。反応生成物はド
ーム部92の頂部を介し膜手段98上にあるところを目
視されるので、ドーム頂部は透明か、あるいは少なくと
も半透明でなければならない。更に上側ハウジング82
は、下側ハウジング84の対応リム84aと嵌合し、再
び開けようとするまで装置を閉状態に保持する可どう性
のL字状ロック部102も含む。本方式では、ロック部
】02を旋回して肩84aから外した後上側ハウジング
82を旋回することによって、容易に密閉を解ける。 両チャンバ90.94の間は、チャンバ9oと膜手段9
日の下部との間を連通する円形孔等の形を成し上下ハウ
ジング間に形成された流れチャネルつまり孔】04て接
続されている。 動作時には、装置を閉じる前に、チャンバ90または9
4何れかが液体サンプルで部分的に満たされる。チャン
バ90が満たされ、)夜をチャンバ90から膜手段98
を介してチャンバ94へ移動させるべきときは、球状部
8日が下方に押され、チャンバ90の容量を減少せしめ
て液をそこから膜手段98を通しチャンバ94内へと流
す。反対方向に液を流したいときは、球状部88に加わ
っている圧力を解放すれば、それにともなって生じる減
圧の作用で液はチャンバ90内へと戻される。 このように当初液がチャンバ90内にある場合、液は初
めに真空でなく正の圧力下で押されて膜手段98を通過
し、次いて球状部88の解放へミよって生じる減圧下で
のみチャンバ90内へと引き戻される。第7図の装置に
関連して説明したのと同様な検定を実施できる。 第9図の装置は、駆動力が第4図の装置と一体でもある
いは着脱自在でもよい通常のまたは改造した注射器で与
えられる点で、第4図の装置と類似している。番号11
0て全体を表したこの装置は、境界面なとての融着によ
って一体構造に保持された上側ハウジング部112と下
側ハウジング部114とを含む。装置は、注射器118
と密閉係合する開放端116を画成する。注射器118
はピストンハウジング120を含み、この内部にピスト
ンプランジャ122がスライド可能に受は入れられてい
る。図示のごとく、ピストンプランジャ122はリング
122aを含み、片手で装置を14んて、ピストンをピ
ストンハウジング120に対して進入及び後退移動させ
易くしである。また、ピストンロッド122とスライド
可能なピストンヘッド122cも備わっている。ピスト
ンハウジング120は、壁画成開口116と協働して取
り除き可能なシールを形成する先′I*120 aを含
む。 膜手段124が、それぞれガスケット128を介して上
側及び下側ハウジング112.114の開に装着される
。2つの固定チャンバ130.132が膜手段124を
挟んで相互に連通ずる。 装置110の動作時に:ま、ピストンヘット122Cの
前面に対して画成されたチャンバ120b内に初めに入
れられた液が、圧力の作用下でチャネル134を経てチ
ャンバ130内へと押され、下向きに膜手段124を通
ってチャンバ132内に至る。液を反対方向に移動させ
るには、リング122aを掴んてピストンプランジャ1
22を反対方向に引っ張り、チャンバ12Ob内に減圧
を発生して、液を上向きに膜手段を通過させチャンバ1
30を経て引き戻す。反応生成物は膜手段124の上面
で目視されるので、上側ハウシング112のうち膜手段
上方の部分は透明とする。 第10図の装置を参照すると、第9図に示した装置と類
似しており、第9図に示したような外部注射器と組み合
わせて使われる別の一体状ハウシングが示しである。従
って、第10図さらにその後で説明する第11〜】3図
の注射器と装置については、第9図と同じ番号を用いる
。装置140は開口142を含み、この間口142が注
射器の先端120 aに対して密閉を生じるとともに、
上側チャンバ】44を摸146を通り下側チャンバ14
8から開放チャネル146へと連通する。動作時には、
チャネル150が試験管内に挿入され、リング122a
を左方向に引っ張りチャンバ120b内に減圧を発生す
ることによって、液が試験管から引き込まれる。この結
果、1夜はチャネル150、チャンバ148、膜手段1
4G、チャンバ144、開口142を通ってチャンバ1
2C1b内へと流入する。ハウジングのうちチャンバ1
44上方の部分は、目視のため透明とする。ピストンロ
ツ)” 122 bを反対方向に移動させれば、液は逆
方向に流れる。 番号160て示した第11図の装置も、着脱自在な注射
器で動作可能である。図示のごとく、この装置は試験管
162内に配され、そこから以下述べるように液を引き
込む。装置160は、下側本体164、上側本体166
、及び上下両本体間に1呆持された膜手段168を含む
。下側本体164が、注射器の先端120aと膜手段1
68の下面との間にチャネル170を形成する。下側本
体164が外形はぼ円筒状である一方、上側本体166
はほぼ円形のプラグ状で中心に開放円形領域を有し、そ
こを通じて膜の上部を目視てきる。 装置の動作時には、初めに液体サンプルを注射器かまた
は試験管162内に入れた後、前述したのと同様に膜手
段168を通して何れかの方向に流通させられる。 第12図の実施例を参照すると、装置の外側容器でシー
ルを形成するようにした第11図の装置の変形が示しで
ある。 装置180は、内側寸法が段階的に変1ヒする中空管状
部材182を含む。注射器の先端120aが圧力嵌めさ
れて装置の一部分内でシールを形成するように、わずか
なテーバが設けられている。 管状部を才182は、膜手段188下方の下側チャンバ
186へと続く狭いチャネル184を画成する。第11
図の上側部片166と同様な構造の上側円形部片190
が設けられ、膜手段18日を所定の着座密閉位置に保持
する。管状部材182の外面は段階状の外径を有し、外
側の透明管192と着脱自在に密閉係合するように圧入
される。 第12図の装置の動作時、初めに液体サンプルがチャン
バ182内にあれば、液は注射器からの圧力でチャネル
184を通ってチャンバ186内に入り、膜手段188
を上向きに通過して上側部片190て形成された凹部内
に進み、液が充分に存在すると、外側管192と管状部
材1820間に画成された管状空間】94内へと至る。 ピストン122を引き出せば、液は膜手段188を通っ
て反対方向に流れる。 番号200て全体を示した第13及び14図の装置は、
上側ハウジング部202とした側ハウジング部204を
含み、両ハウジング部間に中央孔206が画成されてい
る。上側ハウジングブ202にテーパ状の円形孔20B
が形成され、その内部に注射器の先端120bが圧入さ
れて密閉係合する。 膜手段210が環状のプラスチック保持リング2】2に
よって、上側ハウジング部202内の水平(立置に正大
設定されろ。リング212が内部に対し開放空間を画成
しているので、膜手段の表面を外部から見ることができ
る。この実施例において、膜手段は3つの層、すなわち
紙で裏打ちしたニトロセルロース、ポリエステルで裏打
ちしたニトロセルロース、ナイロン、または変態ナイロ
ンで形成し得る上方N 210 aと、同一材料で形成
し得るフィルタの中間1210bと、多孔性プラスチッ
ク、ガラスファイバ等で形成し得る下方支持ディスク2
10cとを含む。あるいは、単一層を用いることもでき
る。何れの層も、コロイド金共役体なとの凍結乾燥試薬
で含浸し得る。 動作時、第13及び14図の装置;よ注射器から中央孔
206を経て上向きに膜手段210を通過させることに
よって動作する。注射器のピストンを引き出せば、液は
反対方向に移動する。 上記の方式は有無の定性的テストについて説明したが、
分析すべき成分の異なった既知濃度で発せされる色なと
適切な信号を用いた半定量的テストにも使えることが理
解されるべきである。例えば、サンドイツチ法による抗
原の分析の場合、本方式を連続漸進希釈で実行し、特定
希釈て見込まれる色の近似を得ることができる。抗原の
未知濃度がそれらの色と比較され、サンプル中に存在す
る抗原濃度の近似を与える。 本発明の方法の特性の更なる開示は、以下の持定例によ
って与えられる。尚、ここに開示するデータは例示に過
ぎ−ず、発明の範囲を制限するものでない。 別−−1 この例では、既知量のヒト絨毛性ゴナドトロピン(hC
G)を含む尿サンプル中に存在する抗原hGCについて
のサンドイッチ免疫検定を示す。 固定試薬及びは織対は試薬として単クローン性抗体を用
いた。標識付は共役体は、Faulk、 W、P、、池
の論文、1mmunochem、 8:1081 (+
971)の手順に基づいた金ゾルから成る。要約すれは
、0.01%のクロ口金酸溶液を含む100m1の希釈
水を、4mlの1%第3クエン酸ナトリウムに混合した
後、15分間煮沸した。溶液は、520nmにおける約
1の光学密度で黄から赤に変色する。 他方の免疫試薬;よ、Medix Biot、ech社
から市販されている抗アルファ連鎖hCG単りローン性
抗体とした。膜ディスク24 b (Schleich
er andSchere11社から市販、細孔0,4
5ミクロンで厚さ140ミクロン)を用いた。抗アルフ
ァ単りローン性抗体(1μm)を直径約203mmの限
定領域内に、1 m g / m lの濃度て膜ディス
クに施した。次いで、植え付は後の膜ディスクをリン酸
塩緩衝塩溶液内てBSAによって培養し、上記の装置内
に設置した。 hCGのベータ連鎖に対する単クローン性抗体(旧le
s Laboratoriesから市販)が上記金ゾル
と共役であり、多孔性支持ディスク24b上に被覆し、
温度−50’ F (10℃)の浴内で凍結した。 その後、凍結乾燥した。 500μmの尿サンプルを、第3a図に示したチャンバ
12が最小容量にある状態で膜の頂面に置いた。次ぎに
ピストンを本体に対して回し、チャンバを第3b図に示
すように膨張させた。そしてサンプル液を、膜24aと
乾燥凍結された標識付は抗体を含む多孔性支持ディスク
24bとを通して引いた。膜ディスク24aの通過中、
標識付は抗体が尿中に溶解した。次いで、ピストン部材
16を反対方向に回し、尿サンプルを膜を通してチャン
バから引き戻した。このサイクルを何回も繰り返したと
ころ、各サイクル毎に発色が増した。 こうして、検定の感度はサンプル液を膜を通してサイク
ル循環することによって高められた。この結果、通常読
み取り不可能である抗原濃度のコロイド金粒子を用いて
も、膜上の赤色ドツトの目視読み取りが可能となった。 異なる膜の多孔度、b CG抗原濃度、及び通過回数を
用い、コロイド金によって赤色が発色するまで上記の手
順を繰り返した。これらの結果を以下の表に示す。 ; ′ミ0.−1ユニm h CG 41度 (mllJ/ml) 3.5 10 20 10
3 206赤色か観測される まての通過回数 7 753 1腺jヒ孔庁:
畑 ゛又12ミーク」と之hCGi!1度 (mltJ/1) 3.5 10 20 1
03 206赤色が観測される までの通過回数 151073涯−2 この例では、抗原が膜上に固定され、分析するのは血清
サンプルの抗体成分で、プラスチック製支持ディスク上
の凍結乾燥される標識付は抗体が上記のようにして形成
されたコロイド全て標識付けされたサンプル抗体に刻す
る抗抗体の兵役体であるようなサンドイッチ検定を行っ
た。またこの例では・ 抗原門、neumO旧aeを例
1て述べたようなニトロセルロース製膜ディスク上に含
浸した。 抗原に対する抗体を含むと思われる血清を、上記したよ
うにポンプ吸引によって5回、膜を通してサイクル循環
した。次ぎに、リン酸塩瑳衝塩溶渣て洗浄した。その後
、標識付は抗抗体(2次抗体)を、ポンプ吸引によって
数回膜を通過させた。この例においては、2次抗体が1
5nmのコロイド金(OD s2!!= 3. 0 )
にリンクされた。膜上の顕著な赤色ドツトによフて確実
な反応が指示された。 皿−一旦 この例では、一方が門、 neumoniae抗原を有
し、他方がアデノウィルス抗原を有する2つの異なるド
ツトを膜ディスクに含めた点を除き、例2の手順を踏襲
した。血清サンプルがM、 neumoniaeだけに
対する抗体を含むと、所定位置で1つのドツトが同様に
得られる。血清サンプルがアデノウィルスだけに対する
抗体を含むと、別の所定位置で1つのドツトが指示され
る。また血清サンプルが門、nCu1lO旧aeとアデ
ノウィルス両方に対する抗体を含むときは、2つのドツ
トが現れる。どちらに対する抗体も含まないと、何れの
ドツトも現れない。 汎−」。 この例では、競合結合検定をチロキシン抗原に対して実
施した。チロキシンつまりハブテンは、チロキシンを含
むと考えられるサンプルとの競合で用いるコロイド金共
役体に形成した。この共役体は、セイヨウワサビペルオ
キシダーゼで形成されたスペーサアームを介し、チロキ
シンをコロイド金共役体と反応させることによって形成
された。 つまり、pH9,5の0.1M重炭酸ソーダ溶液(10
ml)におけるチロキシンナトリウム塩飽和溶液を、N
akane P、に、の論文、J、 Histoche
mCytochem、 14:929 (+966)の
手順を用いセイヨウワサビペルオキシダーゼを介して共
役させた。この例では、Nakaneの論文に記された
タンパク質の代わりにチロキシ溶液を用いた。 共役後、その溶液を希釈水に対して透析し過剰のチロキ
シンを取り除いた。チロキシン−セイヨウワサビペルオ
キシダーゼの共役体を10nmのコロイド金粒子にリン
クさせた後遠心分離し、共役されなかった過剰で目出の
チロキシン−セイヨウワサビペルオキシダーゼを取り除
いた。残留物は緩衝液内に再懸濁化された。 抗チロキシン抗体は、次のようにして膜上に固定した:
pH7,4,0,OIMのリン酸塩緩衝塩溶液中の親和
力で純化されたウサギ抗チロキシン抗体を、例1に記し
たニトロセルロース膜の1スポツト上に被覆した。抗体
濃度は100μg/mlとした。 テスト手順においては、0.1μlの標織対はチロキシ
ンと異なる既知濃度(1,5,10及び20ng/ml
>のチロキシンを含むサンプルとを、第1図の膜24a
の頂面上に施した。異なる濃度のチロキシンで異なる色
が発生し、チロキシンの濃度が低いほと色は強かった。 次いで、未知のサンプルを分析し、上記した既知濃度で
の発色と比較した。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明による検定装置の平面図;第2図は第1
図の検定装置の側面図: 第3a及び3bは第1図の検定装置の3−3線に沿った
断面図で、それぞれ閉及び開状態位置を示す; 第4図は本発明で使われる装置の別の実施例の側面図: 第5及び6図はそれぞれ第4図の5−5及び6−6線に
沿った断面図; 第7〜12図は本発明の池の実施例の断面図;及び 第13図は第12図の膜部分の13−13線に沿った拡
大図である。 10.30.60.80.110,140.160.1
80.200・・・検出装置(容器手段)、12.37
.62.90.120b・・・チャンバ、14.64・
・・中空本体、16.32.66.118・・・容量可
変手段(ピストン手段、16.66;可動壁手段、32
.118;注射器)、14a、18a・・・把持表面、
24.38.78.9B、124、】46.168.1
88、210・ ・ ・膜手段、 24a、210a
・・・膜、24b、2 ] Ob・・・支持プレート、
88・・・弾性で凹まぜ可能璧。 ゛手続補正書
く方式) 1.事件の表示 昭和62年特許願第101688
号2、発明の名称 可変容量検定装置及び方法3、
補正をする者 事件との関係 出願人 4、代理人
図の検定装置の側面図: 第3a及び3bは第1図の検定装置の3−3線に沿った
断面図で、それぞれ閉及び開状態位置を示す; 第4図は本発明で使われる装置の別の実施例の側面図: 第5及び6図はそれぞれ第4図の5−5及び6−6線に
沿った断面図; 第7〜12図は本発明の池の実施例の断面図;及び 第13図は第12図の膜部分の13−13線に沿った拡
大図である。 10.30.60.80.110,140.160.1
80.200・・・検出装置(容器手段)、12.37
.62.90.120b・・・チャンバ、14.64・
・・中空本体、16.32.66.118・・・容量可
変手段(ピストン手段、16.66;可動壁手段、32
.118;注射器)、14a、18a・・・把持表面、
24.38.78.9B、124、】46.168.1
88、210・ ・ ・膜手段、 24a、210a
・・・膜、24b、2 ] Ob・・・支持プレート、
88・・・弾性で凹まぜ可能璧。 ゛手続補正書
く方式) 1.事件の表示 昭和62年特許願第101688
号2、発明の名称 可変容量検定装置及び方法3、
補正をする者 事件との関係 出願人 4、代理人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、液体サンプルの1つ以上の所定成分を 検出する検定装置であって、可変容量のチャンバを画成
する容器手段と、上記チャンバの容量を変化させる手段
と、上記チャンバと流体連通する入口と、該入口を通る
流体路を横切って配設された流体を透過可能な膜手段と
、該膜手段内に保持された上記サンプル成分と反応する
試薬とを備え、上記チャンバが膜手段を通じてを除き容
器手段の外部から実質上流体密閉されていることにより
、上記チャンバの外側にある膜手段上の液体サンプルが
、上記容量可変手段のチャンバ容量を増大させる作動に
応じて発生する吸引作用によって膜手段を通りチャンバ
内に引き込まれ、またチャンバ内の液体サンプルが、上
記容量可変手段のチャンバ容量を減少させる作動に応じ
て発生する内圧の作用下でチャンバから押し出される検
定装置。 2、前記容量可変手段が容器手段の一部を 形成する可動壁手段から成る特許請求の範囲第1項の検
定装置。 3、前記チャンバが中空本体と、該中空本 体との間の相対移動に応じ中空本体に対して進入及び後
退移動自在に中空本体内に装着されたピストン手段とに
よって形成された特許請求の範囲第1項の検定装置。 4、前記ピストン手段が、該ピストン手段 と中空本体との間の相対回転に応じ中空本体に対して進
入及び後退移動自在にネジ噛み合わせ装着された特許請
求の範囲第3項の検定装置。 5、前記中空本体とピストン手段が外部か らアクセス可能な把持表面を有し、該把持表面を介して
中空本体とピストン手段を手で掴んで旋回させ、チャン
バの容量を変化可能である特許請求の範囲第4項の検定
装置。 6、前記ピストン手段が中空本体から取り 外し可能である特許請求の範囲第3項の検定装置。 7、前記ピストン手段が中空本体に対して 進入及び後退スライド移動自在に装着された特許請求の
範囲第3項の検定装置。 8、前記容量可変手段が、チャンバの一部 を形成し装置の外部からアクセス可能な弾性で凹ませ可
能な壁から成る特許請求の範囲第1項の検定装置。 9、前記液体サンプルが生物から採取され、前記サンプ
ル成分が免疫対の一方の要素から成り、前記試薬が免疫
対の他方の要素から成る特許請求の範囲第1項の検定装
置。 10、前記試薬が膜手段上に固定された抗原または抗体
から成る特許請求の範囲第9項の検定装置。 11、前記膜手段周囲のリムと共同で液体サンプルを保
持する特許請求の範囲第1項の検定装置。 12、前記膜手段が外部から目視可能な表面に終端する
特許請求の範囲第1項の検定装置。 13、前記膜手段が膜と隣接する多孔性支持プレートと
から成る特許請求の範囲第1項の検定装置。 14、液体サンプルに可溶な乾燥標識付け試薬が前記支
持プレート上に配置されている特許請求の範囲第12項
の検定装置。 15、液体サンプルに可溶な乾燥標識付け試薬が前記チ
ャンバと流体連通した表面上に配置されている特許請求
の範囲第1項の検定装置。 16、前記チャンバが吸収性物質を実質上含まない特許
請求の範囲第1項の検定装置。 17、前記膜手段が環境に露出されるチャンバ外の表面
を含む特許請求の範囲第1項の検定装置。 18、前記膜手段が透明な壁で覆われたチャンバ外の表
面を含む特許請求の範囲第1項の検定装置。 19、液体サンプル中の少なくとも1つの所定成分を検
出する方法であって: (a)上記液体サンプルを、そこ以外では周囲から実質
上密閉されたチャンバに続く開口を横切って配設された
流体を透過可能な膜の片面に接触させるステップで、上
記チャンバが容量可変である; (b)チャンバの容量を変え、液体サンプルを上記膜を
通してチャンバに流入またはそこから流出させるステッ
プ;及び (c)上記1つのサンプル成分を少なくとも1つの試薬
と反応させ、該一成分が液体サンプル中に存在すること
の指示として、上記膜上に検出可能な反応生成物を形成
するステップ; を含んで成る方法。 20、前記液体サンプルが生物から採取され、前記一成
分が免疫物質で、前記一試薬が標識付け免疫試薬から成
る特許請求の範囲第19項記載の方法。 21、前記標識付け免疫試薬が免疫物質の金粒子標識と
の共役体から成る特許請求の範囲第20項記載の方法。 22、液体サンプルとの接触前に別の試薬が前記膜上に
固定され、該固定試薬が前記一サンプル成分と免疫的に
反応する特許請求の範囲第20項記載の方法。 23、前記標識付け試薬が前記一サンプル成分と免疫的
に反応するが前記固定試薬とは反応せず、前記膜上の検
出可能なサンドイッチ型反応生成物が、前記別の試薬と
結合した前記一成分に対する前記標識付け試薬の結合に
よって形成される特許請求の範囲第22項記載の方法。 24、前記標識付け試薬が前記一サンプル成分と同じ免
疫種で、前記固定試薬と免疫的に反応するが前記標識付
け試薬とは反応せず、前記膜上で競合結合検定が生じる
ように成す特許請求の範囲第22項記載の方法。 25、前記標識付け試薬がチャンバに露出される装置の
表面上に乾燥した可溶形態で被着され、前記膜を通る通
過時に液体サンプル中に溶解する特許請求の範囲第20
項記載の方法。 26、前記ステップ(a)で液体サンプルが初めにチャ
ンバ内に入れられ、また前記ステップ(b)で液体サン
プルがチャンバの容量を減じることによって前記膜を通
りチャンバ外へと移動される特許請求の範囲第20項記
載の方法。 27、前記液体サンプルが膜の外表面に保持される特許
請求の範囲第26項記載の方法。 28、(d)その後チャンバの容量を増大させ、液体サ
ンプルを前記膜の外表面からチャンバ内へ再び引き込む
ステップ;を更に含む特許請求の範囲第25項記載の方
法。 29、前記ステップ(a)で液体サンプルが初めに前記
膜の外面上に置かれ、また前記ステップ(b)で液体サ
ンプルがチャンバの容量を減じることに伴う吸引作用に
よって前記膜を通りチャンバ内へと引き込まれる特許請
求の範囲第20項記載の方法。 30、(d)その後チャンバの容量を減少させ、液体サ
ンプルを前記膜を通しチャンバ外へと戻すステップ;を
更に含む特許請求の範囲第29項記載の方法。 31、前記一試薬が膜の少なくとも1つの限定領域上に
集中され、前記検出可能な反応生成物が該一限定領域に
形成される特許請求の範囲第20項記載の方法。 32、前記液体サンプルが第2の所定成分も含み、前記
膜が前記第1限定領域から離れた少なくとも第2限定領
域に集中された第2試薬も含み、該第2試薬が液体サン
プル中の第2成分とそれが存在するなら反応して、第2
の検出可能な反応生成物領域を形成する特許請求の範囲
第31項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US855730 | 1977-11-29 | ||
US85573086A | 1986-04-24 | 1986-04-24 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6324156A true JPS6324156A (ja) | 1988-02-01 |
Family
ID=25321945
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62101688A Pending JPS6324156A (ja) | 1986-04-24 | 1987-04-24 | 可変容量検定装置及び方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0246760B1 (ja) |
JP (1) | JPS6324156A (ja) |
AT (1) | ATE78099T1 (ja) |
CA (1) | CA1291948C (ja) |
DE (1) | DE3780213D1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2012211914A (ja) * | 2000-04-06 | 2012-11-01 | Caliper Life Sciences Inc | 保護層を組み込んだミクロ流体装置及びシステム |
JP2013512448A (ja) * | 2009-12-01 | 2013-04-11 | ヘルス プロテクション エージェンシー | 分析方法および装置 |
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-
1987
- 1987-04-23 CA CA000535386A patent/CA1291948C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-24 DE DE8787303647T patent/DE3780213D1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1987-04-24 EP EP87303647A patent/EP0246760B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-24 JP JP62101688A patent/JPS6324156A/ja active Pending
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