JPS6323899A - ３−メトキシ−４−ヒドロキシフエニルグリコ−ル螢光偏光免疫分析 - Google Patents

３−メトキシ−４−ヒドロキシフエニルグリコ−ル螢光偏光免疫分析

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JPS6323899A JP62168929A JP16892987A JPS6323899A JP S6323899 A JPS6323899 A JP S6323899A JP 62168929 A JP62168929 A JP 62168929A JP 16892987 A JP16892987 A JP 16892987A JP S6323899 A JPS6323899 A JP S6323899A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は尿、血清または血漿のような生物学的流体中の
３−メト＃シー４−ヒドロキシフェニルクリコール（Ｍ
ＨＰＧ）濃度を定量するための螢光偏光免疫分析（ＦＰ
ＩＡ）操作の方法と試剤に関する。この分析はここに使
用する螢光トレーサ用の新規な安定化用マトリックスに
よって、および試料背景と干渉性代謝産物の減少のため
のマグネシウム・シリケート樹脂を利用する改良された
試料調製によって特徴づけられる。
〈従来の技術〉 ＭＨＰＧは中枢神経系中の神経伝達ルピネフリンの主要
な代謝産物である。尿または血液中の予備処理ＭＨＰＧ
濃度は、主要なうつ病のサブグループ間の識別に役立ち
そして特定の抗うつ剤に対する患者の応答を予言するの
に役立ちうる情報を医者に与える。いくつかの研究はＭ
ＨＰＧ代謝産物の相違が主要なうつ病の３つの生物化学
的に識別されるサブグループの仮の同定の基礎を与える
ことを示した。第１のサブグループは二極そう・うつ病
、精神分裂性うつ病およびいくつかのケースの単極内因
性うつ病から成る。このサブグループの患者は低濃度の
ＭＨＰＧ　（Ｘ（１，９〜／２４ｈｒ）ｉ排泄し、そし
て低いルピネフリン出力をもつことがある。内因性うつ
病の症候を示す第２のサブグループの患者は中濃度のＭ
Ｉ（ＰＣ（１，９■／２４ｈｒ＜Ｘ＜２．５η／　２４
　ｈ　ｒ　）を排泄し、そして他の神経化学系における
異常性と共に正常なルピネフリン代謝をもつことができ
る。第３のサブグループは単極内因性うつ病の症候をも
つ患者を包含する。これらの患者は高ＭＨＰＧ濃度（Ｘ
＞２．５■／２４ｈｒ）によって特徴づけられ、高いル
ピネフリン出力をもち、そしてや＼識別される第２層サ
ブグループの場合には尿のコーチゾル（ハイドロコーチ
ボン）を過度に分泌することがある。
第１および第２のサブグループの患者はアンフェタミン
攻撃に対して正の応答を示すが、第３のサブグループの
患者は一般に負の応答を生じる。尿および血液中のＭ）
ＩＰＧ濃度は第１のサブグループの患者の単極内因性う
つ病患者に対してのみ抗うつ剤治療の有効性を予言する
。第２および第３のサブグループのＭＨＰＧ濃度は薬剤
治療の成功に関して予言値をもたず、そして抗うつ剤治
療に対する応答は広範囲に変化することがわかった。２
極そう・うつ病患者の尿および血液中のＭＨＰＧ濃度は
影響を受ける状態の変化につれて変化する。一般に、こ
れらの患者はうつ状態のあいだは低濃度のＭＨＰＧを排
泄し、そう状態もしくは軽いそう状態のあいだは臨床鎮
静期間中よりも高濃度のＭ　ＨＰ　Ｇを排泄する。
ペーパークロマトグラフ、分光光度計または螢光度計に
よる測定、火炎イオン化検出もしくは電子捕捉検出をも
つガスクロマトグラフ、ならびに放射性免疫分析は尿中
のＭＨＰＧ検出について文献中に記載されている。質量
分析を伴なうガスクロマトグラフおよび電気化学的もし
くは螢光の検出器を伴なう高性能液体クロマトグラフを
利用する方法もＭＨＰＧ測定に好適であることが実証さ
れた。
一般に、競合的結合性免疫分析は、試料抽出操作や長い
分析時間を必要とするガスクロマトグラフや高圧液体ク
ロマトグラフのような化学的方法よりも好ましい方法を
提供してきた。これは免疫分析の特殊性を均一法の迅速
および簡便性と組合せて尿または血液中のＭＨＰ（４度
を検知するための正確で信頼性のある方法を提供する本
発明の螢光偏光免疫分析についても真実である。
競合的結合性免疫分析において、測定すべき生物学的物
質（通常「リガンド」と呼ぶ）はリガンドおよびリガン
ド類縁体に特異な抗体上の限られた数の受容体結合性の
場について標識された試剤（「リガンド類縁体」または
「トレーサ」　）と競合する。試料中のリガンドの濃度
は抗体に結合するリガンド類縁体の量を決定する。結合
するリガンド類縁体の量は試料中のリガンドの濃度に逆
比例する。リガンドおよびリガンド類縁体のそれぞれは
それぞれの濃度に比例して抗体に結合するからである。
ＭＨＰＧは尿中で遊離の状態ならびにサルフェート化お
よびグルクロデート化の結合体の状態の双方で見出され
る。
遊離のＭＨＰＧのみがＭＨＰＧに特異の抗体と結合する
。
尿試料からの又は標準溶液からのＭＨＰＧがＭＨＰＧ）
レーザと平衡するとき、抗血清に結合するＭＨＰＧ）レ
ーザの食は試料もしくは標準溶液中の遊離ＭＨＰＧの量
に逆比例する。従って、競合的結合性免疫分析によシ存
在する全ＭＨＰＧの正確な定量を行なおうとするときは
、サルフェート化およびグルコシレート化の結合体をま
ず脱結合して遊離のＭＨＰＧにしなければならない。
螢光偏光は競合的結合性免疫分析において生じるトレー
サ・抗体結合体の量を測定するのに利用しうる１つの方
法である。螢光偏光技術は、螢光標識化合物は平面偏光
によって励起されるときその回転速度に逆比例する偏光
度をもつ螢光を放出するという原理にもとづいている。
従って、螢光標識をもつトレーサ・抗体結合体を平面偏
光で励起させると、光は高度に偏光されたま＼の状態に
とどまる。光が吸収される時間と放出される時間との間
で螢光は回転を拘束されるからである。これとは対照的
に、非結合トレーサを平面偏光で励起させるときは、そ
の回転は対応するトレーサ・抗体結合体の回転よシずつ
と速く、その結果として非結合トレーサ分子から放出さ
れる光は脱偏光される。
螢光偏光免疫分析技術は当業技術において周知であるが
、今日まで尿のＭＨＰＧ濃度の測定のためこのような技
術を使用することは成功裡に試みられたことはなかった
。本発明は尿中のＭＨＰＧの量の高度に正確な測定を従
来の種々の利用可能な分析系に付随する不利益性なしに
簡便性を大きくシ、費用を少なくして達成した点におい
て当業技術に進歩をもたらすものである。
〈発明の要約〉 本発明はＭＨＰＧの螢光偏光免疫分析、この分析に使用
するトレーサ、免疫抗原および抗体、ならびにこの分析
を行なうための分析法に関する。
本発明の第１の面は新規な構造をもつある種のトレーサ
および免疫抗原の発見に関する。このトレーサおよび免
疫抗原は共に次式によって表わすことができる。
Ｒ１ Ｒ２はＲ１がＲ−Ｚ−ＱであるときＨであシ、Ｒ１がＲ
−Ｚ−ＱでないときＲ−Ｚ−Ｑであり； Ｒ３はＨ，ＯＨ，ＣＨ３またはＣ２Ｈ，であυ；Ｒ′は
ｒ−ｑ（ただしｒは７個までのへテロ原子を含み、そし
て直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭素原子と
へテロ原子を配置しており、且つ２個までの環構造体を
含む結合基であシ；ｑはＨ，ＣｏまたはＮＨである）で
あ乞 Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または
別の免疫学的に活性な担体であるか、あるいはフルオレ
セインもしくはフルオレセイン誘導体である：ｚはＱが
フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体であるとき
ＣＯ１■、ＣＨ２ａ”ｔたはＣＳであり、Ｑがポリ〔ア
ミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または別の免疫学的
に活性な担体であるときＮ、　ＮＨｌＳｏ、、Ｐｏ２、
ＰＳＯまたはグルクロニド部分であり；そしてＲはＱが
ポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または別の
免疫学的に活性な担体であるとき７個までのへテロ原子
１含み、Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体であるとき１０個までのへテロ原子を含み、そして直
鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭素原子とへテ
ロ原子を配置しており、且つ２個までの環構造体を含む
結合基である〕 本発明の第２の面は、次式 〔式中、Ｒ１はＯＲ’、Ｆ、　Ｂｒ、　ＣＩ、　ｒ、０
ＰＯ３Ｈ。
Ｒ２はＲ１がＲ−ＹであるときＨであり、Ｒ，がＲ−Ｙ
でないときＲ−Ｙであり； Ｒ３はＨ）　０ＨＸＣＨ３またはＣ２Ｈ，であす；Ｒ′
Ｖｉｒ　−ｑ　Ｉただしｒは７個までのへテロ原子を含
み、セして直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭
素原子とへテロ原子を配置しており、且つ２個までの壌
構造体全含む結合基であシ；ｑはＨ，ＣｏまたはＮＨで
ある）であＲは１０個までのへテロ原子を含み、そして
直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭素原子とへ
テロ原子を配置しており、且つ２個までの環構造体を含
む結合基である〕をもつ化合物をフルオレセインまたは
フルオレセイン誘導体と結合させることを特徴とするト
レーサの製造法に関す本発明の第３の面は、次式 〔式中、Ｒ，はＯＲ’、ＦＸＢｒ、　ＣＩ、　Ｉ、　０
ＰＯａＨ。
Ｒ２はＲ１がＲ−ＸであるときＨであり、Ｒ１がＲ−Ｘ
でないときＲ−Ｘであり； Ｒ３はＨ，ＯＨ，ＣＨ３またはＣ２Ｈ５であり；Ｒ′は
ｒ−ｑ（ただしｒは７個までのへテロ原子を含み、そし
て直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭素原子と
へテロ原子を配置しており、且つ２個までの環構造体を
含む結合基であり；ｑはＨ，ＣｏまたはＮＨである）で
あシ； Ｒは７個までのへテロ原子を含み、そして直鎖または枝
分れ鎖中に合計０〜２０個の炭素原子とへテロ原子を配
置しており、且つ２個までの環構造体を含む結合基であ
る〕をもつ化合物をポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸
）誘導体または別の免疫学的に活性な担体と結合させる
ことを特徴とする免疫抗原の製造法に関する。
本発明の第４の面は新規な免疫抗原によって生ずる抗体
に関する。
本発明の第５の面は本発明のトレーサのための新規な安
定化用マトリックスに関する。
本発明の第６の面は試料背景および干渉性代謝産物の減
少のだめの金ｆ［シリケートを使用する改良された試料
調製法に関する。
本発明の第７の面は改良されたＭＨＰＧ測定法に関する
。
試料をＭ）ＩＰＧ抗血清；上記の金属シリケート；およ
びＭＨＰＧ抗血清の存在に対して検出可能な螢光偏光応
答を生じうるフルオレセイン含有ＭＨＰＧ誘導体と接触
させる。
次いで平面偏光をこの溶液中を通過させて螢光偏光応答
を得て、この応答を試料中のＭＨＰＧの全量の戸・匿と
して検出する。本発明のこの面の改良法は、ガスクロマ
トグラフ−電子捕捉および高性能液体クロマトグラフ−
電気化学的検出のような従来技術の方法に比較して、非
常に増大した試料生産を可能にする。
本発明の更なる目的とそれに付随する利点は以下の記述
から更に明らかになるであろう。
〈発明の具体的記述〉 本発明−関与する化合物の構造式を下記の式１〜式１８
で示す。これらの式中においてｌ’−ＦＩＪなる符号は
フルオレセイン部分を表わし、「ＢＳＡ」なる符号は牛
血清アルブミンを表わし、「ＫＬＩ（Ｊなる符号はキイ
ホール・リンペット・ヘモシアニンを表わす。これらの
式中のＭＨＰＧ部分のベルジル基およびヒドロキシ基の
特定の配置はいづれかの可能な対掌体を意図し或いは排
除することを意味するものではない。
式１　　　　　　　　　式２ ラクトン　　　　　　　　　　　　　　酸式３ 式４−１　　　　　　式４−２ −Ｃ（ＮＨ）−洲−Ｆｌ　　−洲−Ｃｏ−ＮＨ−Ｆ１式
４−６　　　　式４−７ −ＮＨ−Ｃ３−、ＮＨ−Ｆｌ　　　−０−Ｃｏ−ＮＨ−
Ｆｌ　　　−０−Ｃ８−ＮＨ−Ｆ１式４−８　　　　式
４−９　　　式４−１Ｏ−８０２−ＮＨ−Ｆｌ　　　　
　−０−Ｃｏ−ＮＨ−８Ｏ２−ＮＨＦ１式４−１１　　
　　　式４−１２ 式４ 式５　　　　　　　　　　式６ 式７　　　　　　　　　　　式８ 式９　　　　　　　　　式１０ 式１１　　　　　　　　式１２ 式１３　　　　　　　　　式１４ 式１５　　　　　　　　式１６ 式１７　　　　　　　　式１８ 式１は本発明により定量的に測定されるべき代謝産物Ｍ
ＨＰＧの一般構造を示す。
式２は本発明のトレーサおよび免疫抗原ならびにそれら
を使用する種々の試剤を包括する一般式を示す。
式３は本発明のトレーサ中に含まれるフルオレセイン部
分の互変構造式とその名称を示す。
式４は式２の化合物がトレーサの前駆体を表わすときの
該前駆体にフルオレセイン部分を結合させる種々の結合
を表わす。（式４−１〜式４〜１２） 式５は本発明のトレーサおよび免疫抗原の双方を合成す
るための出発厚朴であるアセトパニロンの一般構造を示
す。
式６〜式１３は本発明のトレーサおよび免疫抗原の双方
の合成中に生成する前駆体を示す。
式１４および式１５は本発明による免疫抗原を示す。
式１６および式１７はトレーサの合成中に生成する追加
の前駆体を示す。
式１８は好ましいトレーサを示す。
一般的説明 本発明はフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体の
使用を含む。ことに述べるトレーサ化合物の有用性に必
要なフルオレセインおよびフルオレセインの性質はフル
オレセインの螢光である。
フルオレセインは前記式３に示す２つの互変異性体のう
ちのいづれかの形体において存在する。その形体は環境
の酸濃度に依存する。開環（酸）形体においては多数の
共役２重結合が存在し、これらが約４ナノ秒の励起状態
寿命の後にフルオレセイン（およびフルオレセイン部分
を含む化合物）の形体を青色光を吸収し緑色光を放出し
うるものにする。開環形体と閉環形体が共存するとき、
開環形体の分子と閉環形体の分子の相対濃度はｐＨ水準
の調節によって容易に変えられる。一般に、本発明のト
レーサ化合物は溶液中ではナトリウム、カリウム、アン
モニウムなどのような生物学的に許容しうる塩として存
在臥本発明の分析法に使用するとき該化合物を開環の螢
光形体で存在させる。
存在する特定の塩はｐＨ水準を調節するのに使用する緩
衝液に依存する。たとえば、リン酸す）　ＩＪウム緩衝
液の存在下では、本発明の化合物は一般にナトリウム塩
として開環形体で存在する。
ここに使用する「フルオレセイン」なる用語は個々の化
合物として又はよシ大きな化合物の一要素として、螢光
という性質を除けば、特定の分子について存在する場合
、開環および閉環の双方の形体を含むことを意味する。
螢光を生せしめるためには開環の形体が必要である。
フルオレセイン分子の炭素原子の番号つけは分子の開環
形体を考えるか閉環形体を考えるかによって変わる。従
ってフルオレセインおよびその化合物に関する文献は炭
素原子の番号づけについて一様ではない。ここに使用す
る番号つけはフルオレセインのラクトン形体として式３
に示しである。
抗体に結合していない溶液中のトレーサは螢光の吸収と
再放出に必要な時間未満で回転自由である。その結果と
して、再放出光は比較的ランダムに配向されて、抗体に
結合していないトレーサの螢光偏光は低くてはソゼロで
ある。
特定抗体に結合したとき、生成トレーサ・抗体錯体は抗
体分子の回転を呈し、比較的小さいトレーサ分子の回転
よシも遅く、それによって観察される螢光を増大させる
。それ故、抗体の場についてリガンドがトレーサと競合
するとき、遊離トレーサとトレ〜す・抗体錯体との混合
物の螢光の観察される偏光はトレーサの偏光とトレーサ
・抗体錯体の偏光との間の中間の値をとる。試料が高濃
度のリガンドを含んでいると、観察される偏光値は遊離
リガンドの偏光値に近く、すなわち低い。試料が低濃度
のりガントを含んでいると、偏光値は結合リガンドの偏
光値に近く、すなわち高い。免疫分析の反応混合物を垂
直偏光を用い次いで水平偏光を用いて遂次励起させ、そ
して放出光の垂直偏光成分のみを分析することによって
、反応混合物中の螢光偏光を正確に測定しうる。
反応試剤 本発明の免疫抗原およびトレーサの双方はいづれも前記
の式２に示す一般構造式によって表わすことができる。
すなわち、これらの免疫抗原およびトレーサは次式Ｒ２
はＲ１がＲ−Ｚ−ＱであるときＨであり、Ｒ１がＲ−Ｚ
−ＱでないときＲ−Ｚ−Ｑであシ； Ｒ３ばＨ，ＯＦＩ、　ＣＩ（３まだはＣ２Ｈ５であり；
Ｒ′はｒ−ｑ（ただしｒは７個までのへテロ原子を含み
、そして直鎖または枝分れ鎖中°に合計０〜２０個の炭
素原子とヘテロ原子を配置しておシ、且つ２個までの環
構造体を含む結合基であり；ｑばＨ，Ｃｏまたは洲であ
る）であり； Ｑはポリ（アミノ酸）、４１月アミノ酸）誘導体または
別の免疫学的に活性な担体であるか、あるいはフルオレ
セインもしくはフルオレセイン誘導体である；２はＱが
フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体であるとき
Ｃｏ、ＮＨｌＣＨ，ｈ旧またはＣ８であり、Ｑがポリ（
アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または別の免疫学
的に活性な担体であるときＮ％　ＮＨＸＳＯ２、ＰＯ２
、ＰＳＯまたはグルクロニド部分であり；そしてＲはＱ
がポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または別
の免疫学的に活性な担体であるとき７個までのへテロ原
子を含み、Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイン誘
導体であるとき１０個までのへテロ原子を含み、そして
直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭素原子とへ
テロ原子を配置しており、且つ２個までの環構造体を含
む結合基である〕 をもつ化合物として表わされる。
これらの対象物は抗体の認識の場についてＭＨＰＧとト
レーサとの間で競合させようとするものである。トレー
サおよびパブテンの構造上の大きな変化はこの目標を達
成させる。（この記述の目的のために、「ハプテン」と
は免疫学的に活性な担体に結合するに適する基をもつ置
換ＭＨＰＧ誘導体から一般的に構成される免疫抗原前駆
体である。）使用しうる抗体は種々のＭＨＰＧ誘導体か
ら製造することができる。本発明は分子上のすべての代
謝活性の場から最も遠い場所である５位に官能基をもつ
ＭＨＰＧ化合物から調製した免疫抗原を使用する。
この免疫抗原は次いで前記式２に示す一般構造から誘導
され、そして合成法に関連して後述するようにこの種の
化合物をポリ（アミノ酸）、ポリアミノ酸誘導体、また
は別の免疫学的に活性な担体と結合させることによって
製造される。
本発明の好ましい形体において、免疫抗原は上記の置換
ＭＨＰＧ化合物を牛抗血清アルブミンと結合させること
によって製造される。種々の他のタンパク担体たとえば
キイホール・リンペット・ヘモシアニン、卵オバルプミ
ン、牛ガンマグロブリン、チロキシン結合性グロブリン
などを使−用して良好な利点２得ることもできる。ある
いはまた、十分な数の有効アミン基をもつ合成ポリ（ア
ミノ酸）を使用することもでき、またＭＨＰＧと反応性
のある官能基をもつ他の合成または天然のポリマー物質
を使用することもできる。
トレーサの構造 本発明のトレーサも前記式２に示す一般構造式から誘導
される。このトレーサは前記式４に示すように、たとえ
ばアミド、アミノアルキル、チオウレア、エーテル、チ
オエーテル、またはオキシモ基によってフルオレセイン
誘導体に結合しているＭＨＰＧ誘導体である。このトレ
ーサは後記の合成法および実施例に関して論じるように
、適当なフルオレセイン誘導体を、アミン、カルボン酸
または他の適当な基を含むＭＨＰＧ誘導体く結合させる
ことによって製造される。例として、次のフルオレセイ
ン誘導体の任意ノものを使用することができる。
Ｆ　ｌ　−ＣＨ２−ＮＨ２アミノメチルフルオレセイン
Ｆ　Ｉ　−ＮＨ２フルオレセインアミンＦ　１−Ｃｏ２
ＨカルボキシフルオレセインＦＩ−ＮＨＣＯＣＨ２１ａ
−ヨート７セトアミドフルオレセインＦｌ−ＮＨＣＯＣ
Ｈ２Ｂｒ　　　Ｑ−ブロモアセトアミドフルオレセイン
Ｆｌ−ＮＣ８フルオレセインチオインシアネート抗体 本発明の抗体は上記の免疫抗原に対するラビットの応答
を誘い出すことによって製造される。免疫抗原を当業者
に周知の方法で一連の接種によ）動物に又は免疫成分細
胞の生体内培養物に投与する。ラビットはここに詳細に
述べる実験におけるＭＨＰＧ免疫抗原に対する好ましい
免疫宿主であるけれども、ここに述べた構造式に対して
抗体を生じうる生体内または試験管内の宿主を使用する
こともできる。
免疫抗原の製造のために１０工程合成ルートを開発した
。
この好ましい面においてこのルートは、アリルブロマイ
ドによるアセトバニロンの４位のＯ−アルキル化；還ｆ
ｌｔ、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン中での４−ヒドロキシ
−３−メトキシ−５−（２−７’ロペニル）−アセトフ
ェノンへのクライゼン転位；ナトリウム・パーヨーデー
ト／オスミウム・テトラオキサイドによる５−ホルミル
メチル−４−ヒドロキシ−３−メトキシアセトフェノン
への酸化；該アルデヒドとトリエチルホスホノアセテー
トとのウイツテイツヒ反応；還流エチルアセテート／ク
ロロホルム中での臭化第２銅による選択的ブロム化；酢
酸カリウム／無水酢酸を用いるジアセトキシ化合物の生
成；ナトリウム・ポロハイドライドによる該ケトンの還
元；およびＩＮ−水酸化ナトリウムによる該エチルエス
テルの加水分解；によって中間体４−（５−（１，２−
ジヒドロキシエタン）−２−ヒドロキシ−３−メトキシ
フェニル）−２−ブテノン酸の製造を含む。
生成した上記の酸のＮ−ヒドロキシサクシニミドエステ
ルを次いで牛血清アルブミンまたはキイホール・リンベ
ット・ヘモシアニンと結合させて免疫抗原を製造する。
トレーサの合成 トレーサは免疫抗原の合成についての上記の合成ルート
のうちの最初の６エ程を使用し、次いでこの生成エステ
ルを加水分解しそしてナトリウム・ボロノ・イドライド
による該ケトンの還元を行なうことによって製造するこ
とができる。このようにして製造した生成酸のＮ−ヒド
ロキシサクシニミドエステルを次いでフルオレセイン誘
導体好ましくはアミノメチルフルオレセインと結合させ
てトレーサを製造する。
この合成ルートはハプテン−フルオレセイン結合手の２
つの２重結合位置異性体の混合物をもたらすことに注目
すべきである。（パブテン−タンパク結合手の２つの２
１Ｎ、結合位置異性体も上記の免疫抗原からもたらされ
る。）異性体′Ａ゛において、２重結合は結合手のカー
ボニル基に共役されることがわかった力木異性体’Ｂ−
においては２重結合はＭＨＰＧの芳香環に共役される。
混合異性体免疫抗原から生じる抗体を用いてこれら２つ
の異性体を試験したところ、異性体“Ａ゛の性能は広が
シの意味で異性体“Ｂ゛の性能よりも著るしく良いこと
がわかった。この点を考慮して、上記のもとの合成ルー
トのうちの２つの工程を変形してトレーサの製造で生じ
る異性体“Ａ゛の量を最大になるようにした。この変形
合成ルートにおいて、該ジアセトキシ化合物を６Ｎ塩酸
で加水分解し、生成ケト酸をナトリウム・ボロハイドラ
イドで還元して５−（カルボキシアリル）−ＭＨＰＧと
する。この活性エステルをアミノメチルフルオレセイン
に結合させると３：２の比で異性体“Ａ゛：異性体“Ｂ
゛が見られた。
免疫分析 本発明の特殊なトレーサ、抗体および追加の試剤は尿中
の全ＭＨＰＧ濃度を正確かつ特異的に測定する。本発明
の分析法すなわち本発明のトレーサ化合物および免疫抗
原を使用する螢光免疫分析法を使用することによるＭＩ
（Ｐ　Ｃの測定法によれば、ＭＨＰＧを含む又はＭＨＰ
Ｇを懸濁させた試料をトレーサの生物学的に許容しうる
塩およびＭＨＰＧとトレーサの双方に特異の抗体と混合
する。
本発明の好ましい具体例において、試剤類はグルスラー
ゼ、加水分解緩衝液、樹脂混合物、および抽出試剤から
成る予備処理試剤の詰合せ；ならびに螢光標識ＭＨＰＧ
（）レープ）、ＭＨＰＧに特異な抗体、および予備処理
試剤から成る試剤試験パックを含む。尿中のＭ）（ＰＣ
をまず酵素で脱結合させて、存在するＭＨＰＧのすべて
をサルフェート化またはグルクロニデート化した結合体
ではなくて遊離のＭＨＰＧの形体にし、そして次にマグ
ネシウム・シリケート樹脂で抽出し、その後に螢光標Ｒ
ＭＨＰＧトレーサを加える。
上記の免疫抗原を使用して製造した抗体を加え、限られ
抗体の場に対して遊離のＭＨＰＧを螢光トレーサと競合
させると錯体が生成する。トレーサと抗体の濃度を一定
に保つことによって、生成するＭＨＰＧ−抗体錯体とト
レーサ・抗体錯体との比が試料中のＭ）（ＰＣの全量に
正比例することを確保することができる。その故、この
混合物を線状に偏光する光で励起させてトレーサおよび
トレーサ・抗体錯体によって放出される螢光の偏光を測
定すると、試料中のＭ）（ＰＣの全量を定量的に測定す
ることができる。
これらの結果は正味のミリ偏光単位、広がり（ミリ偏光
単位で）および相対強度の表示で定量化することができ
る。
ミリ偏光単位の測定は遊離のＭＨＰＧの不在下に最大量
のトレーサが抗体に結合するときの最大偏光を示す。正
味のミリ偏光単位が高いほど、抗体へのトレーサの結合
は良好である。広がりは抗体に結合するトレーサの最大
量の点と最小量の点との間の差の指標である。大きな広
が９はデータの良好な数値分析を与える。強度は背景を
越える信号の強度の、Ｐ度である。すなわち、高い強度
はより正確な測定を与える。強度は（垂直偏光強度）＋
２Ｘ（垂直偏光強度）の合計として、本発明の好ましい
トレーサについて約３００〜５００ナノモルにおいて測
定される。トレーサ信号の強度はトレーサの濃度および
他の分析可変因子に依存して、背景ノイズの約３倍〜約
４倍の範囲にありうる。
本発明の改良された分析の好ましい方法を以下に詳細に
述べる。この分析は「均一分析」である。均一分析とは
端部の偏光の読みが結合トレーサが非結合トレーサから
分離されていない溶液から採取されることを意味する。
これは読みが行なわれる前に結合トレーサを非結合トレ
ーサから分離しなければならない不均一免疫分析法より
も明らかに有利である。
本発明の方法を実施する際のｐＨはトレーサのフルオレ
セイン部分を開環の形体で存在させるに十分なものでな
ければならない。このｐＨは約５〜１０の範囲、更に好
ましくは約６〜９の範囲、そして最も望ましくは約７０
〜７．５の範囲にあることができる。ｐＨの比較的値か
な変化は螢光の強度と特性に著るしく影ｆ＃を与える。
種々の緩衝剤を使用して分析操作中の本発明の均一免疫
分析のｐＨを達成し保持することができる。代表的な緩
衝剤としてポレート、シトレート、アセテート、ホスフ
エ−ト、カーボネート、トリス、バルビタールなどがあ
げられる。使用する特定の緩衝剤は本発明にとって臨界
的ではないが、トリスおよびホスフェート緩衝剤が好ま
しい。緩衝剤のカチオン部分は溶液中のトレーサ塩のカ
チオン部分を一般に決定する。
本発明の螢光偏光分析の試剤はＭＨＰＧとトレーサに特
異な抗体を含む。これに加えて、ＭＨＰＧ予備処理溶液
、希釈用緩衝液、ＭＨＰＧキャリブレータおよびＭＨＰ
Ｇ対照標準を包含する通常の溶液類も望ましく調製され
る。これらの試剤の代表的な溶液類は米国イリノイ州ア
ボット・ラボラトリーズから分析キットとして商業的に
入手することができ、それらのうちの若干をここに述べ
る。
すべてのチは他に特別の記載のない限り重量／容量チで
ある。好ましいトレーサ処方は２５％ジメチルスルホキ
サイド（容量／容量）、７５％エチレングリコールＣ容
量／容量）、１チ塩化ナトリウム、０．１％メタ重亜硫
酸ナトリウムおよび０．１％アジ化ナトリウム中の４３
０ナノモルのトレーサである。抗血清処方はり／酸塩緩
衝食塩水中の１チの加水分解オパルミンおよび０．１％
のアジ化ナトリウムの溶液で希釈したラビット血清から
成る。予備処理処方はｐＨ７，５で０．１％アジ化ナト
リウムを含む０．０５　Ｍ　トリス中のナトリウム・ド
デシルサルフェートから成る。キャリブレータは人工尿
マトリックス（保存剤として０．１％アジ化ナトリウム
を含む）中の０．０．０．３８．０．７５．１．５．３
．０および６．０の濃度のＭＨＰＧから成る。対照標準
は人工尿マトリックス（保存布として０．１％アジ化ナ
トリウムを含む）中の０．５．１．０および２０の濃度
のＭＨＰＧから成る。
ＭＨＰＧ結合体を加水分解して背景の強度と妨害を減少
させるのに好ましい予備処理試剤はアセテート緩衝液、
グルサラーゼ、塩酸／塩化ナトリウム溶液およびマグネ
シウム・シリケートである。アセテート緩衝液はｐＨ６
，０の酢酸アンモニウム中のＥＤＴＡジナトリウム塩、
牛ガンマグロブリンおよびアジ化ナトリウムから成る。
ヘリックス・ボマテイアから入手することができサルフ
ェ−トとグルクロニダーゼ添加物の双方を含む粗酵素処
方であるグルスラーゼは米国ミズリー州セントルイスの
シグマ・ケミカルスから入手した。この酵素は保存剤と
してアジ化ナトリウムを含んでいる。試料の背景は塩化
ナトリウムで８０チ飽和させた３Ｍ塩酸を使用して減少
させる。樹脂は米国ペンシルバニア州ピッツバーグのフ
ロリジンから入手した１００〜２００メツシユのケイ酸
マグネシウムである。
好ましい方法はテキサス州アービングのアボット・ラボ
ラトリーズから入手されるアボットＴＤ（Ｒ）偏光分析
器と組合せて使用するように特に設計されている。４０
０ｐｔの尿が必要である。キャリブレータ、対照標準ま
ｆＣ＃ｉ未知試料をマイクロ遠心分離管にピペットで入
れ、次いでアセテート緩衝液およびグルスラーゼを入れ
た。培養後に樹脂および酸溶液をマイクロ遠心分離管に
加え、次いで旋回および遠心分離する。少なくとも３４
０μｔの上澄液をＴＤＰ）試料カートリッジの試料井戸
に移す。ＴＤｘ″ＭＨＰＧ分析キッドをＴＤＸｌｌＦＯ
分析器と共に使用する場合、試料カートリッジを試料カ
ローセル中に直接おき、キット中の３つの試剤容器のそ
れぞれからキャップを除き、そして試剤パックをＴＤｘ
（８）分析器の内側の指定の井戸に入れる。この時点か
ら操作は完全自動化される。
それぞれのキャリブレータ、対照標準または試料の螢光
偏光値を測定し、アボットＴＤｘ（ＦＱのような機器の
出力テープ上にプリントする。それぞれのキャリブレー
タの偏光を非線状回帰分析を使用してその濃度に対して
プロットすることによって標準曲線を機器中で作成する
。それぞれの対照標準または試料の濃度を貯蔵キャリブ
レーション曲線から読みとり出力テープ上にプリントす
る。
手動による分析を行なう場合には、試料を予備処理溶液
、抗血清の一部、および希釈用緩衝液と混合し、背景の
読みを取る。残りの抗血清を次いで試料と混合する。次
いでトレーサを試験溶液に加える。培養後に螢光偏光の
読みをとる。
上記の好ましい方法に関して、トレーサ、抗体、予備処
理溶液、キャリブレータおよび対照標準は約２〜８℃の
温度で貯蔵すべきであるが希釈用緩衝液は室温で貯蔵す
べきであるということに注目すべきである。標準曲線お
よび対照標準は２週間毎に操作すべきであり、それぞれ
のキャリブレータおよび対照標準は２回行なうべきであ
る。対照標準は毎日操作すべきであり、すべての試料は
所望ならばくシかえして操作することができる。
上記の詳細な記述および下記の実施例は説明のためのも
のであシ、本発明の範囲を限定するものと解すべきでは
ない。種々の変形は当業者にとって明らかであり、本発
明の範囲は特許請求の範囲および法律上それと均等と見
做される範囲によってのみ限定されるものと解すべきで
ある。
〈実施例〉 下記の実施例１〜２３は本発明の概念に従って行なった
実験を述べたものである。実施例１〜１２は免疫抗原の
前駆体の合成に関し；実施例９および１０は抗体の製造
に有用な免疫抗原の製造に関し；実施例１〜６および１
１〜１３はトレーサ前駆体の合成に関し；そして実施例
１４および１５はトレーサの製造に関する。実施例１６
は１つの好ましい免疫分析を述べたものである。実施例
１７〜１８は本発明の方法の正確さを他の方法と比較し
て説明するものである。実施例１５は改良された試料調
製工程を述べたものである。
実施例１ この実施例は前記の式６で表わされる３−メトキシ−４
−（１−プロペニルオキシ）−アセトフェノンの合成に
関する。
５００ｄの３ツロ丸底フラスコにストッパー、ジメチル
ホルムアミド８０−中に２０．（１（１１８ミリモル）
のアセトパニロンをとかした溶液を含む１２５ｍ１の滴
下ロート、ゴム隔壁、および磁気かくはん棒をとりつけ
た。この系を窒素パージした後、４．７２５’（１当り
の水素化ナトリウムをこのボッ）Ｋ加え、ヘキサン（３
Ｘ５０＋＋＋／！；３Ａふるい上で乾燥）で洗浄した。
注射器でヘキサンを除いた後、１２０−のジメチルホル
ムアミドを注入し、生成する水素化ナトリウム懸濁液を
かくはんした。アセトバニロン溶液を１５分間にわたっ
て滴下状に加え、生成溶液を更ＫＩＯ分間かくはんした
。次いで正味のアリルブロマイド（２１，４０Ｐ；１．
５当量）を注入して反応混合物を窒素下に室温で２４時
間かくはんした。この反応混合物を薄層クロマトグラフ
で監視した。
次いで反応混合物をヘキサン（１ｔ）で希釈し、水（３
×２００　ｍｌ　）、ＩＮ水酸化ナトリウム（２ｘ２０
０ｍ／）および飽和ＮａＣ４溶液（２Ｘ１００ｍ／）で
洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空濾過お
よび回転真空蒸発を行なって黄色油状物をえた。高真空
で溶媒を更に除いて１２．２４Ｆ（５９，３ミｌＪモル
）の所望物質をえた。
実施例２ この実施例は前記の式７で表わされる４−ヒドロキシ−
３−メトキシ−５−（１−プロペニル）−アセトフェノ
ンの合成に関する。
６．０２Ｆ（２９，２ミリモル）の４−〇−アリルアセ
トバ二ｏン（実施例１で製造）および２５０ｄのＮ、Ｎ
−ジメチルアニリ／ヲコンデンサ付き５００ゴ丸底フラ
スコ中で混合し、窒素下で６時間還流させた。反応混合
物を室温に冷却してからヘキサン（５００ｍ）で希釈し
、ｌＮ−Ｎａ０Ｈ（４Ｘ１００＋＋／）で抽出し、濃塩
酸でｐＨＯ〜１に酸性化し、ヘキサン／ジエチルエーテ
ル（３：１容量／容量；３×２００ば）で抽出した。有
機層を３Ｎ塩酸（３Ｘ１００−）および飽和Ｎａ（、ａ
（２ｘ１００＋ｔ）で洗浄してから、無水硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、真空濾過し、そして回転真空蒸発させた
。高真空で更に溶媒を除去して５．２３ｆ（２５，３ミ
リモル）の所望のベージュ粉末（８７％収率）をえた。
実施例３ この実施例は前記の弐８で表わされる５−ホルミルメチ
ル−４−ヒドロキシ−３−メトキシアセトフェノンの合
成に関する。
１、Ｏｆ　（４，８５ミリモル）の４−ヒトａキシ−３
−メトキシ−５−（１−プロペニル）アセトフ二ノン（
実施例２で製造）を２５−のテトラヒドロフランおよび
２０−の蒸留水にとかした。１．１７Ｆの固体の過沃素
酸ナトリウムと２５−のオスミウムテトラオキサイド／
テトラヒドロフラン溶液（ＩＰオスミウムテトラオキサ
イド７５０１１Ｌｔテトラヒドロフラン）を加え、生成
混合物を１００−丸底フラスコ中で窒素下に室温で３０
分間かくはんした。次いで別の当量の過沃素酸す）　Ｉ
Ｊウムを加え、混合物を１時間かくはんした。
生成した黄金赤色混合物を３００ｍ／のジエチルエーテ
ルと１５０−の蒸留水で希釈して層分離を生ぜしめ、水
性層をジエチルエーテル（１５０ｍ／）およびエチルア
セテート（２×２００ｍ）で抽出した。有機層を集め、
飽和ＮａＣｔ（２×１００ｍ／）で洗浄し、無水硫酸マ
グネシウム上で乾燥した。混合物を真空濾過し、回転真
空蒸発（室温浴）させた。
生成した暗橙色油状物をエチルアセテートにとかし、シ
リカゲルクロマトグラフのカラムに入れ、砂でおおい、
５０：５０のエチルアセテート／ヘキサインを用い１−
７分の速度で溶離させた。生成物含有留分を薄層クロマ
トグラフで同定し、集めて回転真空蒸発させて合計６６
０■の淡灰黄色油状物（３，２ミＩＪモル；収率６６％
）をえた。上記の反応は好ましくは１．０？以下の規模
で行なわれることに注目すべきである。また、このアル
デヒドは特に不安定であシ、製造した同じ日に次のウイ
ツテイツヒ反応に使用するか又は酸化を避けて高真空で
保存すべきである。
実施例４ この実施例は前記の式９で表わされるエチル−４−（５
−アセチル−２−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）
−２−ブタノエートの合成に関する。
１１４１９（１当量）の水素化ナトリウム（６０％才イ
ル分散液）を２５ｍ１の滴下ロートおよび窒素パージ用
の入ロバルプを備えた５０ｄ丸底フラスコ中でテトラヒ
ドロフラン（１０＋／）に懸濁させた。滴下ロートは１
５ｍ１のテトラヒドロフランにとかした５９３．６ｎｉ
（Ｚ８５ミリモル）の５−ホルミルメチル−４−ヒドロ
キシ−３−メトキシアセトフェノン（実施例３で製造）
を含んでいた。この溶液をかくはん水素化ナトリウム懸
濁液中に１０分間にわたって滴下し、次いで窒素下で３
０分間かくはんした。追加の当量の水素化ナトリウムお
よび６７１η（１，０５当量）の正味のトリエチルホス
ホノアセテートを加え、１５分間力くはんした。レンガ
赤色混合物を次いで酢酸ｔ３ｏｏｔ）で急冷した。
次いで反応混合物を１００−のジエチルエーテルと２０
０−の蒸留水で希釈し、層を分離して水性層をメチレン
クロライド（２Ｘ１００ｍ）で抽出した。有機層を集め
て飽和ＮａＨＣＯｔ　（２Ｘｌ　００　ｍｌ　）および
飽和ＮａＣ１（２００ｍｌ　）で洗浄し、無水硫酸マグ
ネシウム上で乾燥し、真空濾過し、回転真空蒸発して黄
色油状物をえた。
この油状物をメチレンクロライドにとかしてシリカゲル
・クロマトグラフカラムに入れ、砂でおおい、４０：６
０エチルアセテート／ヘキサンで溶離した。生成物含有
留分を薄層クロマトグラフによって同定し、これらを集
めて回転真空蒸発して無色油状物をえた。高真空で溶媒
を更に除去して所望の物質をえた。この反応では異性体
Ａおよび異性体Ｂと呼ぶ２重結合位置異性体が生成する
ことに注目すべきである。
実施例５ この実施例は前記の式１０で表わされるエチル−４−（
５−ブロモアセチル−２−ヒドロキシ−３−メトキシフ
ェニル）−２−ブテノエートの合成に関する。
７．４３ミリモルのエチル−４−（５−アセチル−２−
ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２−ブテノエー
ト（実施例４で製造）、３．２５ｙ（２当量）の臭化第
２銅、４０ｍ１のクロロホルム、および４０ｍ１のエチ
ルアセテートをコンデンサ付き２５０　ｍｌ丸底フラス
コ中で混合し、１時間還流させた。反応混合物を薄層ク
ロマトグラフで監視した。次いでこの反応混合物を室温
に冷却し、遠心分離管に移して遠心分離して上澄液をデ
カンテーションした。沈殿物をメチレンクロライドで洗
浄した。洗浄溶液を集めて回転真空乾燥して黄色油状物
を得た。
この油状物をメチレンクロライドにとかし、シリカゲル
・クロマトグラフカラムに入れ、砂でおおい、４０＋６
０のエチルアセテート／ヘキサンで溶離した。生成物含
有留分を集めて回転真空蒸発して２．１０３Ｆ（５，９
ミ！Ｊモル）の所望生成物をえた（収率７９％）。
実施例に の実施例は前記の式１１で表わされるエチル−４−（５
−アセトキシアセチル−２−アセトキシ−３−メトキシ
フェニル）−２−ブテノエートの合成に関する。
２．１０６５５’（５，９ミリモル）のエチル−４−（
５−ブロモアセチル−２−ヒドロキシ−３−メトキシフ
ェニル）−２−ブテノエート（実施例５で製造）、６０
７．８〜（１，０５当量）の酢酸カリウム、および３０
−の無水酢酸をストッパー付き１ｏｏｍｇフラスコ中で
混合し、油浴（９０℃）中でかくはんした。反応混合物
をシリカゲル薄層クロマトグラフで監視した。代表的に
は、この反応は６０分後に完了する。
反応混合物を回転真空蒸発し、メチレンクロライド（３
００ゴ）に再びとかし、そして飽和ＮａＣ４（２ｘ２０
０　ｍｌ　）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウ
ム上で乾燥し、真空濾過し、回転真空蒸発して小容量に
濃縮した。高真空で溶媒を更に除去して所望の固体生成
物をえた（収率ばはｙ定量的）。
実施例７ この実施例は前記の式１２で表わされるエチル−４−（
５−（Ｌ２−ジヒドロキシエタン）−２−ヒドロキシ−
３−メトキシフェニル）−２−ブテノエートの合成に関
する。
８２８．８■（２，１９ミリモル）のエチル−４−（５
−アセトキシアセチル−２−アセトキシ−３−メトキシ
フェニル）−２−ブテノエート（実施例６で製造）ｔ４
＊のテトラヒドロフランにとかした。これに７．７ｄ（
０，３５当量）のナトリウム・ボロハイドライド溶液（
イソプロピルアルコール中ｏ、　Ｉ　Ｍ　）およびイン
プロピルアルコール（６，４ｍ）を加えた。見られた混
合物を室温で２０〜３０分間かくはんした。反応の進行
を薄層クロマトグラフ（シリカゲル；５０：５０のエチ
ルアセテート／ヘキサン；反応スポットをアセトンで急
冷）で追跡した。反応が完了したとき、３０ｍ１のアセ
トンを加えて反応を停止させた。１５分のかくはん後、
混合物を回転真空乾燥して暗橙色油状物をえた。
必要があるときまでこの物質を高真空に保った。
実施例８ この実施例は前記の式１３で表わされる４−（５−（１
゜２−ジヒドロキシエタン）−２−ヒドロキシ−３−メ
トキシフェニル）−２−ブテノン酸の合成に関スル。
２．１９ミリモルのエチル−４−（５−（１，２−ジヒ
ドロキシエタン）−２−ヒドロキシ−３−メトキシフェ
ニル）＝２−ブテノエート（実施例７で製造）を３０ｍ
１のｐ−ジオキサンにとかした。１２ゴ（５，５当量）
のＩ　Ｍ　−ＮａＯＨを加え、室温で１，５時間かくは
んした。反応の進行を薄層クロマトグラフ（シリカゲル
；１５：８５のメタノール／メチレンクロライド＋０，
５％酢酸）で追跡した。
反応が完了したとき３Ｎ塩酸でｐＨ２〜３に酸性化した
。
飽和ＮａＣＬ　（２００ｍｌ　）で希釈した後、反応混
合物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空濾過し、
回転真空蒸発した。粗生成物を高真空においた。
６５４．４■の粗生成物（発泡物）をメチレンクロライ
ド（少量のメタノールを含む）にとかし、シリカゲル−
クロマトグラフカラム（２３０〜４００メツシュ；１５
：８５のメタノール／メチレンクロライド）に入れ、砂
でおおい、１５：８５のメタノール／メチレンクロライ
ド＋０．５チ酢酸で溶離した。３ｄの留分を集めた後、
生成物含有留分を薄層クロマトグラフで同定し、収集し
、回転真空蒸発し１００＋＋／のトルエンでストリッピ
ングして酢酸を共沸物として除いた。生成した黄白色固
体を高真空において３８９．５！（１１，４５ミｌＪモ
ル）の所望生成物をえた（収率６６％）。
実施例９ この実施例は前記の式１４で表わされる４−（５（１，
２−ジヒドロキシエタン）−２−ヒドロキシ−３−メト
キシフェニル）−２−ブテノン酸／牛血清アルブミン（
ＢＳＡ）結合体の製造に関する。
１２７．８■（０，４８ミリモル）の４−（５−（１，
２−ジヒドロキシエタン）−２−ヒドロキシ−３−メト
キシフェニル）−２−ブテノン酸（実施例８で製造）を
３．８−のジメチルホルムアミドにとかした。１０９．
２■（１，１当量）のＬ３−ジシクロへキシルカルボジ
イミドおよび６４．２１１Ｐ（１，２当量）のＮ−ヒド
ロキシサクシニミドを加え、窒素下に室温で一夜かくは
んして活性エステルを製造した。
１８２．８■の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を４ｍｌの
蒸留水および１．８　ｍｌのｐ−ジオキサンにとかした
。２：１の飽和ＮａＨＣＯ３：　５　％ＮａＣ０３（容
量で２＝１）でｐＨを８〜９に調製した。上記の活性エ
ステル溶液を綿をつめたピペットを通して濾過してこの
Ｂ　Ｓ　Ａ溶液に加え、ジオキサン（９００ｔ）、ジメ
チルホルムアミド＋　６００６）および蒸留水（２，７
＋＋ｔ）で洗浄した。ｐＨを再び８〜９に調整し、キャ
ップ付きの２０ｍ／シンチレーションびん中で一夜かく
はんした。１２時間後に、反応混合物を透析袋（直径１
５．９ｍｔ：１２〜１４０００Ｍ、Ｗ、カットオフ）に
移し、４ｔの蒸留水に対して５日間透析した（水は毎日
とりかえた）。透析袋の内容物を次いで３００　ｍｌの
凍結乾燥びんに移し、イソプロパツール／ドライアイス
浴中で凍結させ、そして凍結乾燥器に３日問おいた。こ
れによって１４＆２■の免疫抗原を得た。
この結合体を次のようにしてトリニトロベンゼンスルホ
ン酸（ＴＮＢＳ）滴定により分析した。１ｄの４％Ｎａ
ＨＣＯ３，１ゴの水、および１ゴの０．１　％　ＴＮＢ
Ｓを混合することによってブランク浴液を製造した。０
．５　ｍｌの４％ＮａＨＣＯ３，０，５−〇ＢＳＡ浴液
（４％ＮａＨＣＯ３ｆｇ液中Ｉ　Ｒｉ／ｍＱＢＳＡを含
む）およびＱ、　５　ｍｌの０．１％ＴＮＢＳ−ｉ混合
することによって標準ｍ　？ＸｋｊＪＩ造した。０．５
−の４　％　ＮａＨＣＯ３，０，５ｄの免疫抗原溶液（
４％ＮａＨＣＯ３溶液中Ｉ　Ｗ／ｍｌの免疫抗原を含ム
）オヨび０．５　ｍｌの０１％ＴＮＢＳを混合すること
によって免疫抗原溶液を製造した。これら３ｆｌの溶液
を４０℃の水浴中で２時間培養した。１０％のす）　Ｉ
Ｊウム・ドデシルサルフエー）（０，５ｄ）およびＩＮ
塩酸（ｏ、２ｓｙ）を用いて反応を停止させた。（注ニ
ブ２ンク溶液については２倍容量を使用した。）　３３
５　ｎｍにおけるｕｖ吸収をＢＳＡについては１．６０
として（３溶液の平均）、免疫抗原については０．２６
４として読みとり、免疫抗原のＢＳＡ上のアミン基のパ
ブテンによる８３．５％置換値をえた。
実施例１０ この実施例は式１５で表わされる４−（５−ＩＬ２−ジ
ヒドロキシエタン）−２−ヒドロキシ−３−メトキシフ
ェニル）−２−ブテノン酸／キイホール・リンペット・
ヘモシアニン（ＫＬＨ）結合体の製造に関する。
８８■（０，３３ミリモル）の４−（５−（１，２−ジ
ヒドロキシエタン）−２−ヒドロキシ−３−メトキシフ
ェニル）−２−ブテノン酸（実施例７で製造）を２．８
ｍｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドにとかした。４５
．３■（１，２当量）のＮ−ヒドロキシサクシニミドお
よび７５．２■（１，１当量）のＬ３−ジシクロへキシ
ルカルボジイミドを加えて窒素下に室温で一夜かくはん
してＮ−ヒドロキシサクシニミド活性エステルを生成さ
せた。１２５ＩｏＰのキイボール・リンペット・ヘモシ
アニン（ＫＬＨ）を２．８　ａｔの蒸留水および１．３
−のｐ−ジオキサンにとかした。２：１（容ｔ／容量）
の飽和ＮａＨＣＯ３：　５％Ｎａ２ＣＯ３を用いてＩ）
Ｈを８．５に調整した。上記の活性エステル密液を綿を
つめたピペットを通して濾過してＫＬＨ溶液中に加え、
蒸留水（１，９ｍ１）およびｐ−ジオキサンで洗浄した
。ｐＨを８．５に再び調整し、窒素下に一夜かくはんし
た。反応混合物を透析袋（直径１４．６ａｘ　；　１２
〜１夷０００Ｍ、Ｗ、カットオフ）に移し、４ｔの蒸留
水に対して４日間透析した（水を毎日変えた）。
透析袋の内容物を次いで３００　ｍｌの凍結乾燥びんに
移し、インプロパツール／ドライアイス浴中で凍結させ
、そして凍結乾燥器に３日問おいた。これによシ免疫抗
原を淡ベージュ色粉末（１１４，６η）としてえた。こ
の免疫抗原を紫外スペクトルで分析した。
実施例１１ この実施例は前記の式１６で表わされる４−（５−ヒド
ロキシアセチル−２−ヒドロキシ−３−メトキシフェニ
ル）−２−ブテノン酸の合成に関する。
１１１６５Ｆ（２，９５ミリモル）のエチル−４−（５
−アセトキシアセチル−２−アセトキシ−３−メトキシ
フェニル）−２−ブテノエート（実施例６で製造）を２
５ｍ１のｐ−ジオキサンにとかした。１２．５−の６Ｎ
塩酸を加え、この反応混合物を１００℃の還流コンデン
サのもとてかくはんした。反応を薄層クロマトグラフ（
シリカゲル；１５：８５のメタノール／メチレンクロラ
イド＋０．５％酢酸）で監視した。反応ば１，５〜２時
間後に実質的に完了した。
反応混合物を次いで室温に冷却し、飽和ＮａＣ１（３０
０ｍｌ　）で希釈し、そしてエチルアセテート（３Ｘ１
５０ｍ／）で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウム
上で乾燥し、真空濾過し、そして回転真空蒸発した。
油状物をメチレンクロライドにとかし、シリカゲル・ク
ロマトグラフカラム（２３０〜４００メツシュ；１５０
Ｆのシリカを４０カラムに充てん；７：９３のメタノー
ル／メチレンクロライド）に入れ、砂でおおい、そして
７：９３のメタノール／メチレンクロライド＋０．５チ
酢酸で溶離した。生成物含有留分を集め、回転真空蒸発
し、そしてトルエンと共沸蒸留した。高真空で乾燥して
、主として所望の異性体から成る所望の黄色固体をえた
（２９７．６Ｆ９；１．１２ミリモル；収率３８％）。
実施例１２ この実施例は前記の式１３で表わされる４−（５−１，
２−ジヒドロキシエタン）−２−ヒドロキシ−３−メト
キシフェニル）−２−ブテノン酸の合成に関する。
２９０．８Ｆ（１，０９ミリモルンの４−（５−ヒドロ
キシアセチル−２−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル
）−２−ブテノエート（実施例６で製造）を６．３　ｍ
ｌのテトラヒドロフランにとかした。１０．９ｍ／（ｌ
当ｇｋ）のナトリウムボロハイドライドの０．１Ｍイン
プロパツール溶液を加え、見られた混合物を乾燥管のも
とでかくはんした。反応を薄層クロマトグラフ（シリカ
ゲル；１５：８５のメタノール／メチレンクロライド＋
０．５％酢酸）で監視した。１時間後、追加当量のナト
リウムポロハイドライドを加えた。４時間後にｐＨ約１
までＩＮ塩酸を加えて反応を停止させた。
次いで反応混合物を２５０ｍｇの飽和ＮａＣ１で希釈し
、エチルアセテ−［８Ｘ１００ｒｎｔ）で抽出した。有
機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空濾過し、
そして回転真空蒸発して油状物をえた。
この油状物を１５：８５のメタノール／メチレンクロラ
イドにとかし、シリカゲル・クロマトグラフカラムに入
れ、砂でおおい、１５：８５のメタノール／メチレンク
ロライド＋０．５％酢酸によりＱ、　９　ｍｌ　７分（
１０ｄ／留分）で溶離した。生成物含有浴液を薄層クロ
マトグラフで同定し、収集して回転真空蒸発し、トルエ
ンにより酢酸を共沸蒸留により除去した。高真空で処理
して１９ａ７■（０，７４１Ｎ？）の所望物質をえた（
収率６８％）。
実施例１３ との実施例は４−（５−（１，２−ジヒドロキシエタン
）−２−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２−ブ
テノン酸（実施例１２で製造）のＮ−ヒドロキシサクシ
ニミド活性エステルの合成に関する。この活性エステル
は前記の式１７によって表わされる。
実施例１２で製造した化合物１９８．７ＴＩｑ（０，７
４ミリモル）を７．５　ｒｄのジメチルホルムアミドに
とかした。１６９．８■（１，１当量）のＬ３−ジシク
ロへキシルカルボジイミドおよび１０Ｚ３η（１，２当
量）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを加え、反応混合物
を窒素下に１７時間かくはんした。
この溶液を次の実施例で使用した。
実施例１４ この実施例は前記の式１８で表わされるＮ−Ｃ４−（５
−（Ｌ２−ジヒドロキシエタン）−２−ヒドロキシ−３
−メトキシフェニル）−２−ブテノイル）　−４’−ア
ミノメチルフルオレセイン・トレーサの合成に関する。
２９４Ｗｑ（１当量）のアミノメチルフルオレセイン塩
酸塩を２−２ｍ１のジメチルホルムアミドにとかした。
この溶液に実施例１３で製造した活性エステル溶液（２
Ｘ２５０μｔのジメチルホルムアミドで洗浄しなから濾
過しだもの）を加えた。トリエチルアミンでｐｉ（を約
８〜８５に調整してレンガ赤色溶液をえた。反応混合物
を窒素下に室温でかくはんし、薄層クロマトグラフ（シ
リカゲル；１０：９０のメタノール／メチレンクロライ
ド＋０．５％酢酸）を使用して反応を監視した。２重結
合位置異性体から生ずる「Ａ」トレーサおよび「Ｂ」ト
レーサを分離するために２つの溶離を行なった。あまり
望ましくない「Ｂ」トレーサの生成は始めに観察されだ
が、１時間後にはＡ：Ｂの比は約５０：５０であった。
７時間後にＡ：Ｂの比が約６０：４０になったとき、酢
酸で溶液のｐＨを約４にして反応を停止させた。
次いでこの溶液を高真空下に回転真空蒸発してジメチル
ホルムアミドを除き、真空に２時間おいた。
生成油状物をメタノール（１，５ｍ／）にとかした。２
５０μｔを６枚の厚さ２Ｕのシリカゲル・プレパーレー
テイブ薄層りロマトグラフ板のそれぞれに加えた。これ
らの板は真空オープン（加熱なし；高真空）中で１．５
時間乾燥し、次いで１０：９０のメタノール／メチレン
クロライド＋０．５チ酢酸の中で展開させた。トレーサ
帯（Ａ＋Ｂ）をそれぞれの板からかきとって乳ばちに入
れ、粉砕し、メチレンクロライド中に懸濁させ、そして
内径４０のクロマトグラフカラム（綿をつめである）に
入れた。メチレンクロライドを空気圧で押し出した後、
吸収剤を１０：９０のメタノール／メチレンクロライド
＋０．５％酢酸（２５０ｍ／）で洗浄して５００ｍ／丸
底フラスコに入れた。次いでこの吸収剤を回転真空蒸発
し、酢酸をトルエンとの共沸蒸留で除き、そして生成し
た黄橙色扮末を高真空においた。粗重量は３０５■であ
った。
実施例１５ この実施例は上記実施例１４で製造したトレーサ異性体
ＡすなわちＮ−（４−５−（１，２−ジヒドロキシエタ
ン）−２−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２−
ブテノイルヨー４’−アミノメチルフルオレセインとト
レーサ異性体Ｂｆな−ｂちＮ−Ｃ４−５−（１，２−ジ
ヒドロキシエタン）−２−ヒドロキシメトキシフェニル
）−３−ブテノイル〕−４′−アミノメチルフルオレセ
インとを高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分離す
る方法に関する。
使用したＨＰＬＣ系は５０αの高さの１０ミクロン粒径
シリカゲルのカラム、薄膜状シリカゲル充てんのガード
カラム、ポンプ、２４０ナノメートルの波長にセットし
た紫外検知器、および２００μｔの注入ループから成る
ものであった。２５ｍ１当り１滴の酢酸を含む１０：９
０のメタノール：メチレンクロライド中の粗トレーサの
０５〜１．５／１０Ｍ溶液を上記のカラムに注入しく注
入量２００μｔ）、４：９６のメタノール：メチレンク
ロライド＋０．５チ酢酸を用い４ｄ／分で溶離した。こ
の系は２種の異性体に対して次の値を与えた：リテンシ
ョンータイムｔｏ＝４３．５分（Ｋ’ａ＝７．４）、リ
テンション・タイムｔ　ｏ　＝　５０．７分（Ｋ’ｂ＝
ａ８）、分割Ｒｓ＝１．６〜１．７゜それぞれの異性体
を含む留出物を回転真空蒸発して溶媒を除き、そしてト
ルエンとの共沸蒸留で酢酸を除いた。それぞれの異性体
を高真空で乾燥してから凍結型中で窒素下に貯蔵した。
実施例１に の実施例は本発明による１つの好ましい免疫分析法の具
体例を説明するものである。
上記の実施例１４および１５に述べたようにしてＭＨＰ
Ｇ−ＡＭＦ’を合成した。このトレーサをメタノールに
とかした。２００μｔのストック溶液を１０ｄのＤＭＳ
Ｏ／エチレングリコール・マトリックスに加えた。１．
６　ｍｌの生成ストック溶液をＤＭＳＯ／エチレングリ
コール・マトリックスで希釈して４３０ナノモルのトレ
ーサ０度をえた。１部の抗面清１７２９を１７部の１％
オバルブミン含有リン酸塩緩衝食塩水溶液で希釈した。
４０μｔのそれぞれのキャリブレータを１５０μｔの酢
酸塩緩衝液および３０μｔのグルスラーゼを用い５６℃
で３時間培養した。約０，１？のマグネシウム・シリケ
ート樹脂を加え、次いで１００μｔの８０％ＮａＣＬ飽
和３Ｍ塩酸を加えた。この試料を１分間旋回して遠心分
離した。
上澄液をキュベツト中で抗血清および予備処理試剤と混
合した。４分後に螢光試料背景の読みをとった。
残υの上澄液抗血清およびトレーサをキュベツトに移し
た。培養期間後に最終の読みをとｐ、ＭＨＰＧ濃度を標
準曲線として貯蔵した。
これらの結果を第１図に示すつ 実施例１７ この実施例は、現在主として使用されている電子捕捉検
知付きガスクロマトグラフ（ＧＣ−ＥＣ）と比較しての
本発萌の方法（ＴＤｘ）の精密性を説明するものである
。
ＧＣ−ＥＣ対ＴＤＸ　（ｎ＝２０　） 切　　片＝０．０７ スロープ＝１．０１ 補正係数＝０．７９６ 実施例１８ この実施例は、電子捕捉検知付き高性能液体クロマトグ
ラフ（ＨＰＬＣ−ＥＣ）と比較しての本発明の方法（Ｔ
ＤＸ）の精密性を説明するものである。
切　　片＝０．４４ スロープ＝０．８０ 補正係数＝０．７８８ 実施例１９ この実施例は５種の尿試料にＭＨＰＧを加え、それぞれ
の場合に回収したＭＨＰＧのチを測定することによって
本発明の分析精度を更に評価したものである。
３００〜６００μｙ７ｔのＭＨＰＧの濃厚ストックを使
用して、それぞれの尿試料の分別量に６０μＰＭＨＰＧ
／ｄを加えた。次の添加ＭＨＰＧ濃度３．０．１．５．
０．７５．０．３８μ２／−がえられるまで上記の試料
を同じ試料の分別量で次々に希釈した。酵素による加水
分解および予備処理を実施例１６に述べたように行なっ
た。これらの試料と同様に処理した人工尿中のＭＨＰＧ
から成るキャリブレータを使用して標準曲線を作成した
。標準曲線を機器中に貯蔵し、試料をこの曲線から読み
とった。
回収した添加ＭＩ（ＰＧの％を次のようにして測定した
。
内因性ＭＨＰＧ（０■／　ｍｌ添加）を尿添加濃度から
差し引き、ＭＨＰＧ添加の目標値で割る。
調整濃度＝測定濃度−内因性ＭＨＰＧ これらの結果を次表に示す。
０．３８■／ｍｌ　　　　１０４ ０．７５ｊ９／ｄ　　　　１０５ １．５０キ／ａｔ　　　　１０４ ３．００η／ｒｔｔｌ　　　　１０３ 実施例２０ この実施例は尿試料予備処理中のマグネシウム・シリケ
ートの機能を説明するものである。尿およびグルスラー
ゼは共に螢光化合物を含んでおり、該化合物は除去され
ない限りＦＰＩＡを妨害する。１００〜２００メツシユ
のマグネシウム・シリケートと８０％ＮａＣ１ｆｊ３和
３Ｍ塩酸との組合せは背景の螢光を有効に減少させる。
１６個のレプリカを次のようにして調整した。リン酸塩
緩衝液（ｐＨ７＋　０．５　）、酢酸塩緩衝液および酵
素を混合して５６℃で３０分間培養した。これらの試料
を各４試料の４グループに分けた。それぞれのグループ
を異なった寸法のマグネシウム・シリケート（１６〜３
０．３０〜６０゜６０〜１００および１００〜２００メ
ツシユ）で処理し、次いで８０％ＮａＣＬ飽和塩酸で処
理した。固定した容量のマグネシウム・シリケートを使
用するとき、メツシュが微細なほど試料の螢光の減少は
大きい。これは次に示すとおりである。
実施例２１ この実施例は有機マトリックスによるＭ　ＨＰ　Ｇ−フ
ルオレセイン・トレーサの安定化を説明するものである
。
ＭＨＰＧ−フルオレセイン・トレーサを種々のマトリッ
クスにとかして企〜８℃および４５℃で１週間貯蔵した
。
トレーサ処方物の安定性を４５℃熱応力後のミリ偏光の
変化をもとＫして評価４つのマトリックスの結果を下記
に要約する。
＃１　　　　　２００．５　　　　　　１８４．１　　
　１６．４＃２　　　　　２２１２　　　　　　１４７
．３　　　７４．９＃３　　　　　２０７．９　　　　
　　１８８．１　　　１９．８＃４　　　　　２０６．
１　　　　　　１７５．８　　　３０．３すべてのチは
他に特別のない限ダ重量／容量基準である。
＃１２５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキサイド、７５％
（ｖ／ｖ　）エチレングリコール、１％ＮａＣ４，０，
１％アジ化ナトリウム、０．１４メタ亜硫酸ナトリウム
。
＄　２　０．１　Ｍ　！Ｊン酸塩緩衝液中０．５％チオ
硫酸ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウム、０．０１
％牛ガンマグロブリン。
＃３９５％ＣＩＭのＮａＣ１中４５％（ｖ／ｖ）ジメチ
ルスルホキサイド〕　５％エチレングリコール。
＃４２５％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキサイド、２５％
（ｖ／ｖ）エチレングリコール、５０％（ｖ／ｙ　）　
［：０．９％（ｗ／ｖ　）水中ＮａＣｔ、　　Ｉ　Ｌｙ
６テオ硫酸ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウム、０
．０１％牛ガンマグロブリン、０１％エチレンジアミン
四酢酸塩。
マ）　ＩＪソクス＃１は、４５℃での７日間にわたる貯
蔵中における比較的小さい偏光低下によって実証される
ように、トレーサに対して最も大きい安定性を与える。
実施例２２ この実施例は多数のラビット中での望ましい抗血清の発
達を説明するものである。
２匹のラビットに前記の免疫抗原を接種し増殖した。そ
れぞれのラビットからの抗血清を使用して作成した代表
的な標準曲線を第２図に示す。
実施例２３ この実施例は相互反応性に関するＭＨＰＧ抗血清の特異
性を実証するものである。下肥の種々の化合物をリン酸
塩緩衝液にとかし、次の濃度に希釈した：０．００１．
０．０１．０．１、および１．０Ｐ／ｍｌ、それぞれの
溶液を加水分解し、抽出し、そして試料として試験した
。相互反応性チを次のように決定した。
上記の４水準の濃度のすべてにおいてこれら化合物のす
べての相互反応性チは０．１係未満であった。
Ｌ　−ドーノｆ Ｄ　−ドーノ寸 トノ１°ミン （−）アルテレノール エピネフリン Ｄ、Ｌ　−３，４−ジヒドロキシンエニルグリコールノ
ルメタネフリン バニリルマンデル酸 ホモバニリン酸 り、Ｌ−３，４−ジヒドロキシマンデル酸Ｌ−Ｂ−３４
−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステル
【図面の簡単な説明】
第４図は本発明による３−メトキシ−４−ヒドロキシフ
ェニルグリコール（ＭＨＰＧ）含量の螢光偏光免疫分析
法に従い実施例１６記載の操作法によって作成したＭＨ
ＰＧ含量（横軸：単位μり／ｍｌ）とミＩＪ偏光（縦軸
）との関係を示す標準曲線である。 第２図は第１図と同様の趣旨の標準曲線であるが実施例
２２記載の２種の抗血清のそれぞれを使用した場合の結
果を対比して示し、両者のいづれの場合にもはソ同一の
すぐれた結果がえられることを示すものである。 これらの図中において：！−１７２９および＃７７１は
２匹のラビットからそれぞれ見られた抗血清を表わし、
５ＰＡＮは該抗血清を使用して行なった螢光偏光免疫分
析におけるミＩＪ偏光（ｍｐ　）の広がりを表わす。 廿１狐 ［ｈ１ｈｐＧ］　　　　ｕｇ／ｍｌ 、　　　、ｉ！　１７２９　　（ＳＰＡＮ　＝　１０５
　ｍＰ）升、２肥

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１はＯＲ′、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＯＰＯ
    ＿３Ｈ、ＯＰＯ＿３Ｒ′、ＯＳＯ＿２Ｒ′、▲数式、化
    学式、表等があります▼またはＲ−Ｚ−Ｑであり；Ｒ＿
    ２はＲ＿１がＲ−Ｚ−ＱであるときＨであり、Ｒ＿１が
    Ｒ−Ｚ−ＱでないときＲ−Ｚ−Ｑであり； Ｒ＿３はＨ、ＯＨ、ＣＨ＿３またはＣ＿２Ｈ＿５であり
    ；Ｒ′はｒ−ｑ（ただしｒは７個までのヘテロ原子を含
    み、そして直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭
    素原子とヘテロ原子を配置しており、且つ２個までの環
    構造体を含む結合基であり；ｑはＨ、ＣＯまたはＮＨで
    ある）であり； Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または
    別の免疫学的に活性な担体であるか、あるいはフルオレ
    セインもしくはフルオレセイン誘導体である；ＺはＱが
    フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体であるとき
    ＣＯ、ＮＨ、ＣＨ＿２ＮＨまたはＣＳであり、Ｑがポリ
    （アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または別の免疫
    学的に活性な担体であるときＮ、ＮＨ、ＳＯ＿２、ＰＯ
    ＿２、ＰＳＯまたはグルクロニド部分であり；そして ＲはＱがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体ま
    たは別の免疫学的に活性な担体であるとき７個までのヘ
    テロ原子を含み、Ｑがフルオレセインまたはフルオレセ
    イン誘導体であるとき１０個までのヘテロ原子を含み、
    そして直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭素原
    子とヘテロ原子を配置しており、且つ２個までの環構造
    体を含む結合基である〕 をもつ化合物。 ２、Ｑが４′−アミノメチルフルオレセイン誘導体であ
    る特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ３、Ｒ＿１がＯＳＯ＿２Ｒ′である特許請求の範囲第１
    項記載の化合物。 ４、Ｒ＿１が▲数式、化学式、表等があります▼である
    特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ５、Ｒ＿１がＯＨであり、Ｒ＿３がＯＨであり、Ｒ＿３
    がＲ−Ｚ−Ｑであり、ＢがＣＨ＿２ＣＨ＝ＣＨであり、
    ＺがＣＯであり、そしてＱが牛血清アルブミンまたは４
    ′−アミノメチルフルオレセインである特許請求の範囲
    第１項記載の化合物。 ６、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１はＯＲ′、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＯＰＯ
    ＿３Ｈ、ＯＰＯ３Ｒ′、ＯＳＯ＿２Ｒ′、▲数式、化学
    式、表等があります▼またはＲ−Ｚ−Ｑであり； Ｒ＿２はＲ＿１がＲ−Ｚ−ＱであるときＨであり、Ｒ＿
    １がＲ−Ｚ−ＱでないときＲ−Ｚ−Ｑであり； Ｒ＿３はＨ、ＯＨ、ＣＨ＿３またはＣ＿２Ｈ＿５であり
    ；Ｒ′はｒ−ｑ（ただしｒは７個までのヘテロ原子を含
    み、そして直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭
    素原子とヘテロ原子を配置しており、且つ２個までの環
    構造体を含む結合基であり；ｑはＨ、ＣＯまたはＮＨで
    ある）であり； Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または
    別の免疫学的に活性な担体であり； ＺはＮ、ＮＨ、ＳＯ＿２、ＰＯ＿２、ＰＳＯまたはグル
    クロニド部分であり；そして Ｒは７個までのヘテロ原子を含み、そして直鎖または枝
    分れ鎖中に合計０〜２０個の炭素原子とヘテロ原子を配
    置しており、且つ２個までの環構造体を含む結合基であ
    る〕をもつ化合物に対する抗体。 ７、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１はＯＲ′、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＯＰＯ
    ＿３Ｈ、ＯＰＯ＿３Ｒ′、ＯＳＯ＿２Ｒ′、▲数式、化
    学式、表等があります▼またはＲ−Ｙであり；Ｒ＿２は
    Ｒ＿１がＲ−ＹであるときＨであり、Ｒ＿１がＲ−Ｙで
    ないときＲ−Ｙであり； Ｒ＿３はＨ、ＯＨ、ＣＨ＿３またはＣ＿２Ｈ＿５であり
    ；Ｒ′はｒ−ｑ（ただしｒは７個までのヘテロ原子を含
    み、そして直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭
    素原子とヘテロ原子を配置しており、且つ２個までの環
    構造体を含む結合基であり；ｑはＨ、ＣＯまたはＮＨで
    ある）であり； ＹはＮＨ＿３、ＣＯＯＨ、ＰＯ＿３Ｈ、ＰＳＯ＿２Ｈ、
    また▲数式、化学式、表等があります▼Ｒは１０個まで
    のヘテロ原子を含み、そして直鎖または枝分れ鎖中に合
    計０〜２０個の炭素原子とヘテロ原子を配置しており、
    且つ２個までの環構造体を含む結合基である〕をもつ前
    駆体化合物をフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
    体と結合させることを特徴とするトレーサの製造法。 ８、次の（ａ）〜（ｄ）の工程から成ることを特徴とす
    る流体試料の３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルグ
    リコール含量の測定法： （ａ）流体試料を１種またはそれ以上のサルフアターゼ
    およびグルクロニダーゼ活性をもつ酵素と接触させ；（
    ２）この流体試料を３−メトキシ−４−ヒドロキシフエ
    ニルグリコール抗血清；金属シリケート；および３−メ
    トキシ−４−ヒドロキシフェニルグリコール抗血清の存
    在に対して検知可能な螢光偏光応答を生じうる次式の化
    合物と接触させ； ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１はＯＲ′、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＯＰＯ
    ＿３Ｈ、ＯＰＯ＿３Ｒ′、ＯＳＯ＿２Ｒ′、▲数式、化
    学式、表等があります▼またはＲ−Ｚ−Ｑであり； Ｒ＿２はＲ＿１がＲ−Ｚ−ＱであるときＨであり、Ｒ＿
    １がＲ−Ｚ−ＱでないときＲ−Ｚ−Ｑであり； Ｒ＿３はＨ、ＯＨ、ＣＨ＿３またはＣ＿２Ｈ＿５であり
    ；Ｒ′はｒ−ｑ（ただしには７個までのヘテロ原子を含
    み、そして直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭
    素原子とヘテロ原子を配置しており、且つ２個までの環
    構造体を含む結合基であり；ｑはＨ、ＣＯまたはＮＨで
    ある）であり； Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または
    別の免疫学的に活性な担体であるか、あるいはフルオレ
    セインもしくはフルオレセイン誘導体である；ＺはＱが
    フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体であるとき
    ＣＯ、ＮＨ、ＣＨ＿２ＮＨまたはＣＳであり、Ｑがポリ
    （アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または別の免疫
    学的に活性な担体であるときＮ、ＮＨ、ＳＯ＿２、ＰＯ
    ＿２、ＰＳＯまたはグルクロニド部分であり；そしてＲ
    はＱがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体また
    は別の免疫学的に活性な担体であるとき７個までのヘテ
    ロ原子を含み、Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイ
    ン誘導体であるとき１０個までのヘテロ原子を含み、そ
    して直鎖または枝分れ鎖中に合計０〜２０個の炭素原子
    とヘテロ原子を配置しており、且つ２個までの環構造体
    を含む結合基である〕； （ｃ）工程（ｂ）からの生成溶液に平面偏光を通過させ
    て螢光偏光応答を取得し：そして （ｄ）工程（ｃ）の溶液の螢光偏光応答を試料の３−メ
    トキシ−４−ヒドロキシフェニルグリコール含量の尺度
    として測定する。 ９、サルフアターゼおよびグルクロニダーゼ活性を有す
    る酵素がグルサラーゼである特許請求の範囲第８項記載
    の方法。 １０、金属シリケートがマグネシウム・シリケート樹脂
    である特許請求の範囲第８項記載の方法。
JP62168929A 1986-07-09 1987-07-08 ３−メトキシ−４−ヒドロキシフエニルグリコ−ル螢光偏光免疫分析 Pending JPS6323899A (ja)

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JPH02227667A (ja) * 1989-02-28 1990-09-10 Daiichi Rajio Isotope Kenkyusho:Kk Ｍｈｐｇに対する抗体の製造法

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