JPS63234159A - フロ−サイトメ−タ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野ｊ 本発明はフローサイトメータに係り、特に細胞データ検
出部での細胞流下速度を自動調節するようにしたフロー
サイトメータに関する。

［従来の技術］ フローサイトメータでは、細胞を含んだサンプル液及び
このサンプル液を囲むシース液をフローセル内へ注入し
、フローセルから流下する細胞に光線束を照射して散乱
光強度や蛍光強度を測定し、細胞の特性をするようにな
っている。

この光強度信号のパルス幅は、細胞の大きさのみならず
、細胞の流下速度にも依存する。

七たがって、細胞の大きさについて正確なデータを得る
には、細胞の流下速度が所定値になるよう、フローセル
へのシース液注入速度を調節する必要がある。

そこで、従来では、接近した２点で細胞を検出し、その
検出信号をオシロスコープ等で観測して、２点通過時間
を１ｊｌｌｌ定し、この時間が所定値になるよう、フロ
ーセルへのシース液注入速度を手動で調節していた。

［発明が解決しようとする問題点］ しかし、シース液注入機構の精度やフローセル下部の流
下路内壁への物質付着等により、細胞の流下速度にバラ
ツキがあるため、かかる手動調節には熟練を要し、容易
でなりかた。

また、このバラツキが特に大きい場合には、たとえ流ド
速度を調節しても、光強度データの解析がｉＥ確に行わ
れなかった。このバラツキは、どの程度まで許容できる
のかを判定することが容易でなく、経験的に判定されて
いたため、操作者により測定データの解析結果が大きく
異なることもあった。

本発明の目的は、上記問題点に鑑み、自動的か−）　Ｉ
Ｅ　＠（に、細胞の流下速度を調節することが可能な）
【１−サイトメータを提供することにある。

また、本発明の他の［１的は、細胞の流下速度のバラツ
キが大きいためデータ解析に支障が生ずるかどうかを、
自動的かつ正確に判定して、操作者にこれを報知するこ
とが可能なフローサイトメータを提供することにある。

Ｆ問題点を解決するための手段］ 本第１発明に係るフローサイトメータでは、第。

１図に示す如く、 個々の細胞が接近した２点を通過するように該細胞を送
出させる細胞送出手段と、 該細胞が該２点を通過するのを検出する細胞検出手段ど
、 該細胞検出手段の検出信号を用いて該２点間の通過時間
を計測する通過時間計測手段と、複数個の細胞について
、該通過時間の平均値τを算出する平均通過時間算出手
段と、 基準通過時間τｏを設定する基準値設定手段と、該平均
通過時間でと該基準通過時間τｏとの差が無くなるよう
に該細胞送出手段の細胞送出速度を調節する細胞送出速
度調節手段と、 を有することを特徴としている。

また、本第２発明に係るフローサイトメータでは、第２
図に示す如く、 個々の細胞が接近した２点を通過するように該細胞を送
出させる細胞送出手段と、 該細胞が該２点を通過するのを検出する細胞検出手段と
、 該細胞検出手段の検出信号を用いて該２点間の通過時間
を計測する通過時間計測手段と、複数個の細胞について
、該通過時間の平均値τ及び標準偏差σを算出する平均
値・標準偏差算出Ｌ段と、 Ｊｌ（準通過時間τｏを設定する基ダ値設定手段と、平
均通過時間でと基部通過時間τｏとの差及び標準偏差σ
の値により、該細胞送出手段の細胞送出速度を調節する
必要があるかどうか及びフローサイトメータが使用可１
走であるかどうかを判別する判別手段と、 該判別結果に応じて、平均通過時間τと基準連通時間τ
ｏと゛の差を無くするように該細胞送出手段の細胞送出
速度を調節する細胞送出速度調節手段と、 該判別結果に応じて、フローサイトメータが使用不能で
あることを報知する異常報知手段と、をイアすることを
特徴としている。

Ｕ実施例］ 図面に基づいて本発明の詳細な説明する。第３図にはフ
ローサイトメータの全体構成が示されている。

フローセル！０の上端面中心部には管１２の一端部が貫
通され、管Ｉ２の他端はシリンダ１４に接続されている
。このシリンダ１４は、ピストンロッド１６の一端がピ
ストン１８の外端面に連結されており、ピストンロッド
１６を軸方向へ移動させると、ピストン１８がシリンダ
２０内を移動し、管１２を介しサンプル液２２がフロー
セルＩＯの液室２４の軸心部に注入される。ピストンロ
ッド１６の他端は移動板２６に連結され、移動板２６に
は送りねじ２８が螺ｖｊされており、送りねじ２８がパ
ルスモータ３０により回転駆動されると、移動板２６が
送りねじ２８の軸方向へ移動する。

パルスモータ３０には、コントローラ３２からドライバ
３４を介して駆動パルスが供給される。この駆動パルス
の周波数は、液室２４内へ注入されるサンプル液２２の
流量に比例する。

フローセル１０の上側部には管４２の一端が接続され、
管４２の他端はシリンダ４４に接続されている。このシ
リンダ４４は、ピストンロッド４６の一端がピストン４
８の外端面に連結されており、ピストンロッド４６を軸
方向へ移動させると、ピストン４８がシリンダ５０内を
移動し、管４２を介しシース液５２がフローセル１０の
液室２４内へ注入される。ピストンロッド４６の他端は
移動板５６に連結され、移動板５６には送りねじ５８が
螺ｖ１されており、送りねじ５８がパルスモータ６０に
より回転駆動されると、移動板５６が送りねじ５８の軸
方向へ移動する。パルスモータ６０には、コントローラ
３２からドライバ６４を介して駆動パルスが供給される
。この駆動パルスの周波数は、液室２４内へ注入される
シース液５２の流！ｄに比例する。

フローセル１０の下端軸心部には流下路６６が形成され
ており、液室２４内のサンプル族２２がシース液５２に
囲まれて流下路６６を通る。流下路６６の軸心の接近し
た２点ａ％ｂには、レーザ発生器６８からのレーザー光
が２光束に分岐されて収束される。

すなわち、レーザ発生器６８から放射されるレーザー光
は、シリンダーレンズ７０により長方形に整形され、そ
の一部がビームスプリッタ−７２を透過して収束レンズ
７４により点すに収束され、この点を通るサンプル液２
２内の細胞に照射される。その前方散乱光は、透過光遮
光板７６を通り、集光レンズ７８により屈折されてその
光強度が光検出器８０により検出され、データ処理装置
８２へ供給される。

シリンダーレンズ７０により整形されたレーザー光の一
部は、ビームスプリッタ−７２により反射され、次いで
平面＃Ｃ１，８４により点ａ側に反射され、収束レンズ
８６により屈折されて点ａに収束され、この点を通る細
胞に照射される。その側方（９０度）散乱光は、集光レ
ンズ８８により屈折され、その一部がビームスプリッタ
−９０を透過し、光検出″Ｊ５９２によりその光強度が
検出され、データ処理装置８２へ供給される。

また、一部がビームスプリッタ−９０により反射され、
特定波長の蛍光のみがフィルター９４を透過し、光検出
器９６によりその蛍光強度が検出されてデータ処理装置
８２へ供給される。

コントローラ３２は、ドライバ３４．６４を介してパル
スモータ３０．６０へ駆動パルスを供給４”るとともに
、データ処理装置８２ヘデータ収集指令を供給する。デ
ータ処理装置８２はこれを受けて、光検出器８０．９２
．９６からそれぞれ前方散乱光強度、側方散乱光強度及
び蛍光強度のデータを収集し、細胞の種類、特性を判別
し、統計的解析を行う。光検出器８０．９２の出力信号
はコントローラ３２へも供給され、接近した２点ａ１ｂ
を細胞が通過する時間が計測される。コントローラ３２
はζこの通過時間が一定になるように、パルスモータ６
０の回転速度を調節する。

次に、第４図に基づいて、この調節を行うコントローラ
３２の回路構成の一例を説明する。第１Ｉ図にはコント
ローラ３２Ａの主要な信号の波形が示されている。

光検出器９２の出力信号は、モノマルチバイブレーク１
００により整形されて、Ｒｓフリップフ【Ｊツブ１０２
のセット入力端子に供給される。これにより、ＲＳフリ
ップフロップ１０２のＱ出力がハイレベル（Ｈ）になる
と、アンドゲート１０６が開かれ、クロック発生器１０
８からのクロックパルスがアンドゲート１０６を通って
カウンタ１１０によりカウントされる。カウンタ１１０
のカウント値は減算器口２の一方の入力端子に供給され
、減算器１１２の他方の入力端子には設定器１１４から
の設定値が供給される。減算器ＩＩ２は、カウンタ１！
０のカウント値（通過時間）τと設定器！１４の設定値
τｏの差Δτをマイクロコンピュータ＋１６へ供給する
。一方、光検出器８０の出力信号は、モノマルチバイブ
レータｌＯ４により整形されて、ＲＳフリップフロップ
１０２のリセット入力端子に供給されるとともに、遅延
回路１１８を介してマイクロコンピュータＩ！６へ供給
される。マイクロコンピュータ１１６は、遅延回路１１
８からのパルス立ち上がりのタイミングで減算ｎ１１２
の出力値Δτを読み取った後、カウンタ１１０のカウン
ト値をリセットする。このマイクロコンピュータ１１６
は、ＲＯＭ。

ＲＡＭ及び入出力ボートを備えて周知の如く構成されて
いる。

次に、第５図に基づいてマイクロコンピュータ＋１６の
ソフトウェア構成を説明する。

遅延回路＋１８からのパルス立ち上がりのタイミングで
制御偏差Δτが読み込まれると、ブロック２００におい
てＲＡＭ上の格納アドレスが決定され、データエリア２
０２に書き込まれる。データエリア２０２にｎ個の制御
偏差Δτ１、Δτ９、・・・Δτｏが順次書き込まれた
後は、Δτ１、Δτ、・・・が順次更新される。すなわ
ら、最も古いデータから更新され、データエリア２０２
には最新のｎ個の制御偏差Δτが書き込まれている。

データエリア２０２にｎ個の制御偏差Δτが書き込まれ
た後は、ブロック２０４においてその平均値Δτが求め
られ、次にブロック２０６でその・ド均値Δτの正負に
応じてパルス周期が増減され、次にブロック２０８でそ
の周期のパルスが作成されてドライバ６４ヘパルスが供
給される。ブロック２０６における増減値は、平均制御
偏差Δτの正負のみによる一定の値であってもよく、ま
た、平均制御偏差Δτに比例した値であってもよい。

このようにして、細胞の流下速度が常に一定になるよう
に調節される。

次に、第６図に基づいて本第１発明の第２実施例を説明
する。この例では、通過時間τ及び基準通過時間τｏを
アナログ電圧値で表し、その差Δτをデジタル変換して
マイクロコンピュータＩＩ６に供給するようになってい
る。

すなわち、光検出器９２の出力信号はモノマルチバイブ
レーク１００により波形整形され、スタート信号として
積分器１２０へ供給される。積分器１２０はこれを受け
ると、定電圧発生器１２２からの電圧の時間積分を開始
し、その積分電圧値（通過時間）τをサンプルホールド
回路１２４へ供給する。一方、光検出器８０の出力信号
はモノマルチバイブレータ１０４により波形整形され、
制御信号としてサンプルホールド回路＋２４へ供給され
る。サンプルホールド回路１２４はこれを受けて、積分
器１２０からのサンプル値をホールドし、減算器１２６
の非反転入力端子へ供給する。

減算器１２６の反転入力端子には、基準電圧発生″／５
１２８から基準通過時間τｏに対応した電圧が供給され
る。減算器＋２６は、通過時間τと基準通過時間τｏと
の差である制御偏差ΔτをＡ／Ｄ変換器＋３０へ供給す
る。

モノマルチバイブレーク１０４からの制御信号は、遅延
回路＋１８を介してＡ／Ｄ変換器＋３０に６供給され、
これに応答して、Ａ／Ｄ変換器１３０は制御偏差Δτを
デジタル変換し、マイクロコンピュータＩ１６へ供給す
る。マイクロコンピュータｚｓ＋ｉ、Ａ／Ｄ変換Ｗ　Ｉ
　３０力ラ’ｔＪｉｍｌＥＹ信号を受は取ると、そのデ
ジタル変換値を読み取り、これをＩｔ　Ａ　Ｍに古き込
んだ後、積分器１２０ヘリッセト信号を供給してその積
分値をリッセトし、積分を終了させる。

マイクロコンピュータ１１６のソフトウェア構成は第１
実施例と同一になっている。

次に、第７図に基づいて本第１発明の第３実施例を説明
する。この例では、フローセル及び細胞検出手段の構成
が第１実施例と異なっている。

すなわら、外フローセルＩＯＡの外液室２４八に内フロ
ーセルＩＯＢが内設されており、内フローセルＩＯＢに
内液室２４Ｂが形成されている。

外フローセルＩＯＡ、内フローセル１０Ｂの上側部には
、それぞれ管４２Ａ、４２Ｂが接続されており、それぞ
れ種類の異なるシース液が外液室２４Ａ、内液室２４１
３内に注入される。また、管１２の先端部は内液室２４
１１の軸心部に位置している。さらに、外液室２４Ａ及
び内液室２４Ｂにはそれぞれ電極片９８．９９が配設さ
れている。

細胞は、管１２を通って内液室２４Ｂ内に注入され、内
液室２４ｒ３の下部開口Ｅを通過して外液室２４Ａ内に
入る。この通過時には、電極片９８と電極片９９との間
の電気抵抗が減少する。この抵抗値の減少を読み取るこ
とにより、細胞が下部開口Ｅを通過したことを検出でき
る。次にこの細胞が流下路６６内の点すを通過すると、
上記第１実施例と同様の構成により、光検出器８０によ
り検出される。他の点については上記実施例と同一であ
る。

次に、本第２発明の詳細な説明する。第８図には第４図
に示すコントローラ３２Ａに対応したコントローラ３２
Ｃが示されている。

ごの例では、カウンタ１１０の出力値τ及び設定器＋１
４の出力値τｏがマイクロコンピュータ＋１６に供給さ
れており、減算器１１２が用いられていない。他のハー
ドウェア構成については第４図と同一になっており、同
一構成要素に同一符号を付してその説明を省略する。

マイクロコンピュータ＋１６のソフトウェア構成は第９
図乃至第１１図に示されている。第９図には全体フロー
が示されており、第１０図にはステップ３０２で呼ばれ
るサブルーチンのフローが示されており、第１１図には
ステップ４０２．４０４で呼ばれるサブルーチンのフロ
ーが示されている。

ステップ３００では、設定器１１４から通過時間の設定
値τｏを読み込み、ＲＡＭに書き込む。

次にステップ３０２では、遅延回路＋１８からのパルス
立ち上がりのタイミングで、カウンタＮＯから通過時間
τを読み込み、ＲＡＭに書き込む。

ｎ個の通過時間で１、τ２、τ５、・・・τｏを読み込
むと、ステップ３０４へ進み、平均値τ及び標準偏差σ
を算出する。

σ＜Ａ　（Ａは定数）、すなわち、細胞データの解析に
支障がない程度のバラツキであり、１τ−τｏ１　＜ｃ
　（Ｃは定数）、すなわち、平均通過時間τが設定値τ
ｏに略等しくて液室２４内へのシース液注入速度を調節
する必要がない場合には、ステップ３０６〜３１０を経
て処理を終了する。

σくＡであり、Ｂ＞ｌで一τ１≧Ｃ（Ｂは定数であり、
Ｂ＞Ｃ）、すなわち、平均通過時間でか設定値τｏに略
等しくない場合には、ステップ３０６〜３１０からステ
ップ３１２へ進み、パルスモータ６０へ供給する駆動パ
ルスの周波数を目標周波数に変更して平均通過時間を設
定値τｏに一致させる。この調節はオーブンループであ
り、通過時間測定時の該周波数と平均通過時間τとが反
比例する関係から目標周波数が決定される。

σ≧Ａ１すなわち、細胞データの統計的解析に支障が生
ずる程度にバラツキが大きい場合には、ステップ３０６
からステップ３１４へ進み、図示しないランプを点滅し
てブザー等を鳴らし、操作者にフローサイトメータが使
用不能であることを表示する。操作者は異常原因を探し
、例えばフローセルのｔ＋’？掃や交換等を行う。

σくＡであっても、１τ−τｏ１≧Ｂ１すなわら平均通
過時間でか設定値τｏから極端に離れている場合には、
ステップ３０６．３０８からステップ３１４へ進み、前
記異常処理を行う。

次に、ステップ３０４における処理の詳細を第１０図及
び第１Ｉ図に基づいて説明する。

ステップ４００では、ステップ４０２における処理の初
期設定を行う。すなわち、明らかに偏差の大きいデータ
を除去するために、Ｘの値を下限値で、ア、Ｙの値を上
限値で、、８とする。ステップ４０２では、第１１図に
示すサブルーチンの処理−汀つ。

ス子−Ｉブ５００で通過時間累積値Ｔの値を０とし、通
過時間のデータを区別するｉの値を１とする。次にステ
ップ５０２で、τ、１１〈τ、くτ、□であるかどうか
を判定する。肯定判定された場合には、ステップ５０４
でＴにτ、を加えたらのを新たなＴとする。次にステッ
プ５０Ｇで、ｉをインクリメントする。次にステップ５
０８でｉ≦ｎと判定された場合には、ステップ５０２へ
戻り以上の処理を繰り返す。

ステップ５０２で否定判定された場合には、すなわら通
過時間τ１の偏差が明らかに大きい場合には、ステップ
５１０でデータの全個数ｎをデクリメントする。次にス
テップ５０６へ進み、ステップ５０４″の処理を行わな
い。すなわら、明らかに偏差の大きいデータを除去する
。

ステップ５０８でｉ＝ｎ＋１と判定された場合には、す
なわち総てのデータについて上記処理が終了した場合に
は、ステップ５！２で通過時間での平均値τを算出する
。次にステップ５１４で標準偏差σを求め、処理を終了
する。

次にステップ４０４で、ステップ４０６における処理の
初期設定を行う。すなわち、Ｘをτ−ασとし、Ｙをτ
＋ασとする。ここにαは定数であり、例えばα冨２で
ある。

次にステップ４０６で第１１図に示す前記処理を行う。

すなわち、通過時間τの内、Ｉτ皿−τ１≧ασとなる
データを除去した後、通過時間の平均値及び標準偏差を
算出する。

このように、偏差の大きい異常なデータを除去し、通常
状態での通過時ｕ■の平均値を求めることにより、シー
ス液の流速調整をより正確に行うことができる。

［発明の効゛果〕 本第１発明に係るフローサイトメータでは、個々の細胞
について、接近した２点を通過する時間を計測し、この
通過時間の平均値τを算出し、平均通過時間でと基準通
過時間τｏとの差が無くなるように細胞送出速度を調節
するようになっており、細胞の流下速度にバラツキがあ
っても、自動的かつ正確に、細胞の流下速度を調節する
ことができるという優れた効果がある。

また、本第２発明に係るフローサイトメータでは、該平
均通過時間τのみならず標準偏差σをも算出し、平均通
過時間τと基準通過時間τｏとの差及び標準偏差σの値
により細胞送出速度を調節する必要があるかどうかを判
別し、該判別結果に応じて、平均通過時間でと基準通過
時間τｏとの差を無くするように該細胞送出手段の細胞
送出速度を調節するようになっており、細胞の流下速度
にある程度のバラツキがあっても、自動的かつ正確に、
細胞の流下速度を調節することができるという優れた効
果がある。

また、フローサイトメータが使用可能であるかどうかを
も判別し、該判別結果に応じて、使用不能であることを
操作者に報知するようになっており、細胞の流下速度の
バラツキが大きいためデータ解析に支障が生ずるかどう
かが、自動的に、短時間で、かつ正確に判定され、誤っ
たデータ解析が行われることがないという優れた効果も
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本第１発明の構成を示すブロック図、第２図は
本第２９明の構成を示すブロック図である。第３図乃至
第７図は本第１発明の実施例に係り、第３図はフローサ
イトメータの全体構成図、第４図は第３図のコントロー
ラ３２のうちパルスモータ６０を制御する部分の具体的
構成を示すブロック図、第５図はマイクロコンピュータ
夕１１６のソフトウェア構成を示す機能ブロック図、第
６図は第２実施例のコントローラ３２［３の構成を示す
、第４図に対応したブロック図、第７図は第３、実施例
の細胞検出手段の構成を示す図である。第８図乃至第１
！図は本第２発明の実施例に係り、第８図は第４図に対
応したコントローラのブロック図、第９図乃至第１１図
はマイクロコンピュータ＋１６のソフトウェア構成を示
すフローチャートである。第１２図は第４図における信
号のタイミングチャートである。 ＩＯ：フローセル １４．４４：シリンジ ２２：サンプル液 ２４：液室 ５２：シース液 ３０．６０：パルスモータ ９８．９９：電極片 ６６：流下路 ６８：レーザ発生器 ８０．９６二光検出器 １００．１０４：モノマルチバイブレーク１０２：ＲＳ
フリップフロップ １０８：クロック発生器 １２４：サンプルホールド回路 代理人　　弁理士　松　本　眞　吉 （ほか１名） 第１０図　　　第１１図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）個々の細胞が接近した２点を通過するように該細
   胞を送出させる細胞送出手段と、 該細胞が該２点を通過するのを検出する細胞検出手段と
   、 該細胞検出手段の検出信号を用いて該２点間の通過時間
   を計測する通過時間計測手段と、 複数個の細胞について、該通過時間の平均値τを算出す
   る平均通過時間算出手段と、 基準通過時間τ＿ｏを設定する基準値設定手段と、該平
   均通過時間τと該基準通過時間τ＿ｏとの差が無くなる
   ように該細胞送出手段の細胞送出速度を調節する細胞送
   出速度調節手段と、 を有することを特徴とするフローサイトメータ。
2. （２）個々の細胞が接近した２点を通過するように該細
   胞を送出させる細胞送出手段と、 該細胞が該２点を通過するのを検出する細胞検出手段と
   、 該細胞検出手段の検出信号を用いて該２点間の通過時間
   を計測する通過時間計測手段と、 複数個の細胞について、該通過時間の平均値τ及び標準
   偏差σを算出する平均値・標準偏差算出手段と、 基準通過時間τ＿ｏを設定する基準値設定手段と、平均
   通過時間τと基準通過時間τ＿ｏとの差及び標準偏差σ
   の値により、該細胞送出手段の細胞送出速度を調節する
   必要があるかどうか及びフローサイトメータが使用可能
   であるかどうかを判別する判別手段と、 該判別結果に応じて、平均通過時間τと基準通過時間τ
   ＿ｏとの差を無くするように該細胞送出手段の細胞送出
   速度を調節する細胞送出速度調節手段と、 該判別結果に応じて、フローサイトメータが使用不能で
   あることを報知する異常報知手段と、を有することを特
   徴とするフローサイトメータ。
3. （３）前記平均値・標準偏差算出手段は、前記通過時間
   のうち、上限値以上及び下限値以下のものを除き、該通
   過時間について平均値τ及び標準偏差σを算出すること
   を特徴とする特許請求の範囲第２項記載のフローサイト
   メータ。
4. （４）前記平均値・標準偏差算出手段は、前記通過時間
   のうち、上限値以上及び下限値以下のものを除き、該通
   過時間について平均値τ＿（＿ｍ＿）及び標準偏差σ＿
   （＿ｍ＿）を算出し、該通過時間のうち、τ＿（＿ｍ＿
   ）＋ασ以上（αは定数）およびτ＿（＿ｍ＿）−ασ
   以下のものをさらに除いて、該通過時間の平均値τ及び
   標準偏差σを算出することを特徴とする特許請求の範囲
   第２項記載のフローサイトメータ。